ES2960872T3 - Un método para diagnosticar cánceres de las vías genitourinarias - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para diagnosticar cánceres del tracto genitourinario, así como a métodos de tratamiento de pacientes diagnosticados utilizando el método. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Un método para diagnosticar cánceres de las vías genitourinarias
La presente invención se refiere a un método para detectar o monitorear cánceres de riñón, vejiga y/o próstata. También comprende el desarrollo de regímenes de tratamiento para pacientes seleccionados, basados en la determinación, y en ordenadores y dispositivos programados para llevar a cabo la determinación.
Antecedentes de la invención
Los cánceres de las vías genitourinarias que incluyen los cánceres de próstata, vejiga y riñón, representan una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. El cáncer de vejiga es el 5to cáncer más común en Europa, con más de 123 000 casos nuevos cada año que provocan 40 000 muertes. En Europa el cáncer de próstata ocupa el primer lugar entre los cánceres diagnosticados con mayor frecuencia entre los hombres, con aproximadamente 345000 casos nuevos al año. Hay aproximadamente 88400 casos nuevos de cáncer de riñón por año lo que lo convierte en el 10mo cáncer más común.
La hematuria es uno de los hallazgos más comunes en el análisis de orina en pacientes que encuentran los médicos generales con una incidencia de 4 por 1000 pacientes por año; y representa aproximadamente 6 % de los nuevos pacientes atendidos por urólogos. La hematuria o la micción irritativa son ambos síntomas del carcinoma de células de transición temprano. Sin embargo, menos de 1 de cada 10 personas con hematuria en realidad tienen un cáncer de las vías genitourinarias. La hematuria o micción irritativa se relaciona con mayor frecuencia con enfermedades menos graves tales como infecciones de las vías urinarias o hiperplasia prostática benigna. Sin embargo, los pacientes con estos síntomas inespecíficos pueden someterse a investigaciones urológicas extensas, aunque solo un pequeño porcentaje de ellos en realidad tenga tumores malignos. En relación con esto, el estudio y el cribado de pacientes con hematuria a menudo requieren una cistoscopía. La cistoscopía es la prueba diagnóstica estándar de oro para el cáncer de vejiga porque permite la visualización directa y la biopsia del urotelio de la vejiga.
Dado que la cistoscopía es invasiva y también costosa, tanto los pacientes como los médicos se beneficiarían enormemente del desarrollo de una plataforma de prueba no invasiva rentable para la detección de cánceres de las vías genitourinarias. Además, el diagnóstico de cánceres de las vías genitourinarias en una etapa temprana mejora enormemente los resultados después de intervenciones de tratamiento tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapias/inmunoterapias moleculares dirigidas.
Hasta la fecha, las pruebas de orina para detectar el cáncer de vejiga se centraron en la detección de uno o más biomarcadores proteicos mediante el uso de técnicas de inmunoensayo (ver por ejemplo Kelly y otros, PLoS ONE 7(7): e40305). Un biomarcador particular detectado es el MCM5.
La expresión de la proteína Mcm2-7 en el epitelio normal se restringe a los compartimentos amplificadores de tránsito/tronco basal y está ausente de las capas superficiales ya que las células adoptan un fenotipo completamente diferenciado. Por lo tanto, las células superficiales obtenidas mediante exfoliación o mediante muestreo superficial deben ser negativas para las proteínas Mcm2-7. En las lesiones epiteliales premalignas (displásicas) y en las neoplasias malignas hay una expansión del compartimento proliferativo acoplada con una diferenciación detenida, lo que da como resultado la aparición de células positivas para MCM en proliferación en las capas superficiales. La inmunodetección de la proteína Mcm2-7 en células exfoliadas o muestreadas en la superficie es, por lo tanto, indicativa de una lesión o malignidad premaligna/displásica subyacente.
Una de estas proteínas reguladas por el ciclo celular es Mcm5, que representa un componente del ADN helicasa y, por lo tanto, es un biomarcador potencial para la detección del cáncer. Se demostró mediante métodos inmunocitoquímicos para la detección de Mcm5 o alternativamente la aplicación de un inmunoensayo tipo sándwich 12A7-4B4 de Mcm5, que este enfoque puede usarse para la detección de un amplio intervalo de cánceres, que incluyen los de cuello uterino, esófago, próstata y vejiga, cánceres de riñón y pancreático que incluyen el colangiocarcinoma.
Sin embargo, la detección de uno o más biomarcadores proteicos de este tipo mediante el uso de inmunoensayo puede dar lugar a resultados erróneos y, en particular, a falsos positivos.
Las pruebas de orina pueden usarse en tales inmunoensayos, ya que la interrupción del proceso normal de diferenciación durante la formación del cáncer da como resultado que las células tumorales se bloqueen en el ciclo celular proliferativo. Esto da como resultado la elevación de un intervalo de proteínas reguladas por el ciclo celular en las células tumorales que se derraman en los fluidos corporales tales como la orina.
Wang y otros, American Association for Cancer Research vol 78, núm. 13, Suplemento 1, 1 de julio de 2018 describe una prueba multiplex basada en secuenciación de próxima generación para cáncer de próstata, vejiga y riñón junto con perfiles genómicos de cfADN y cfARN en muestras de sangre y orina de pacientes con tales cánceres.
Resumen de la invención
De acuerdo con la presente invención se proporciona un método para detectar o monitorear el cáncer de riñón, vejiga y/o próstata, dicho método comprende analizar el ácido nucleico obtenido de una muestra de orina de un sujeto, detectar la presencia de una aberración seleccionada de una variante de nucleótido única, indel, eliminación, amplificación y/o fusión en una secuencia de codificación, o aumento o disminución de la expresión génica de una secuencia de codificación, de al menos un biomarcador de cada una de las Tablas 1 a 7, así como también la carga mutacional del tumor (TMB), y relacionar la presencia de dichos biomarcadores con la presencia de malignidad en donde se aplica un algoritmo indicativo de la presencia o nivel de malignidad a los resultados obtenidos en donde se aplica una puntuación de '0' a los resultados que no muestran cambios sobre el tipo salvaje o perfiles de expresión normales de los diversos biomarcadores;
se aplica una puntuación de '1' en caso de presencia de una mutación oncogénica en un gen biomarcador, o para la presencia de 2 a 3 copias adicionales de un gen biomarcador, o por la presencia de una fusión de gen oncogénico, o un cambio de hasta 500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de <10 mutaciones/Megabase;
se aplica una puntuación de '2' en el caso de la presencia de 4 a 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de 500 a 1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador;
se aplica una puntuación de '3' en el caso de la presencia de más de 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de >1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de >10 mutaciones/Megabase;
en donde una puntuación global de 0 es indicativa de ausencia de malignidad, una puntuación de 1 a 2 es indicativa de una malignidad con especificidad intermedia y alta sensibilidad, una puntuación de 3 a 5 es indicativa de una malignidad con alta especificidad y alta sensibilidad, y una puntuación superior a 6 es indicativa de malignidad con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta.
Preferentemente, la muestra es una muestra fijada con formalina.
Preferentemente como etapa previa, extraer el ácido nucleico de la muestra.
Preferentemente, los resultados obtenidos también se usan para identificar la susceptibilidad de un sujeto a la terapia o tratamiento dirigido a PD-1 o PD-L1.
Preferentemente, se detectan al menos 10 de los biomarcadores de las Tablas 1 a 7.
Preferentemente, se detectan todos los biomarcadores enumerados en las Tablas 1 a 7.
Preferentemente, el sujeto es un individuo aparentemente sano.
Preferentemente, el sujeto se ha diagnosticado previamente con cáncer de riñón, vejiga y/o próstata y está bajo tratamiento o terapia para ello, y en donde el método se lleva a cabo repetidamente en el tiempo, para monitorear la eficacia del tratamiento o terapia.
Preferentemente, los resultados se usan para decidir modificar o ampliar dicho tratamiento o terapia.
Preferentemente, el sujeto sufre de hematuria.
Preferentemente, el método se lleva a cabo mediante el uso de una plataforma de ensayo de alto rendimiento. Preferentemente, los resultados se analizan para producir una recomendación personalizada para el tratamiento del cáncer.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema para detectar o monitorear el cáncer de riñón, vejiga y/o próstata, dicho sistema comprende:
un procesador; y
una memoria que almacena el código de un algoritmo que, cuando se ejecuta por el procesador, hace que el sistema informático:
reciba niveles de entrada de los biomarcadores del método;
reciba un nivel de entrada adicional con relación a la carga mutacional tumoral de ácido nucleico en la muestra de orina;
analice y transforme los niveles de entrada a través de un algoritmo para proporcionar una salida que indique la presencia o el nivel de malignidad presente;
muestre la salida en una interfaz gráfica del procesador
en donde el algoritmo aplicado es:
se aplica una puntuación de '0' a los resultados que no muestran cambios sobre los perfiles de expresión normales o de tipo salvaje de los diversos biomarcadores;
se aplica una puntuación de '1' en caso de presencia de una mutación oncogénica en un gen biomarcador, o para la presencia de 2 a 3 copias adicionales de un gen biomarcador, o por la presencia de una fusión de gen oncogénico, o un cambio de hasta 500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de <10 mutaciones/Megabase;
se aplica una puntuación de '2' en el caso de la presencia de 4 a 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de 500 a 1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador; se aplica una puntuación de '3' en el caso de la presencia de más de 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o cambio >1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de >10 mutaciones/Megabase;
en donde una puntuación global de 0 es indicativa de ausencia de malignidad, una puntuación de 1 a 2 es indicativa de una malignidad con especificidad intermedia y alta sensibilidad, una puntuación de 3 a 5 es indicativa de una malignidad con alta especificidad y alta sensibilidad, y una puntuación superior a 6 es indicativa de malignidad con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta.
Preferentemente, la memoria también comprende un código para proporcionar una recomendación personalizada para el tratamiento del sujeto, en base a los niveles de entrada.
Preferentemente, la recomendación personalizada se muestra en una interfaz gráfica del procesador. De acuerdo con la presente invención, se proporciona un medio legible por ordenador no transitorio que almacena instrucciones que, cuando son ejecutadas por un procesador, hacen que un sistema informático detecte o monitoree el nivel de cáncer de riñón, vejiga y/o próstata en una muestra de orina de un sujeto, por:
recibir los niveles de entrada de los biomarcadores del método y
recibir un nivel de entrada adicional con relación a la carga mutacional tumoral de ácido nucleico en la muestra de orina;
analizar y transformar los niveles de entrada a través de un algoritmo para proporcionar una salida que indique la presencia o el nivel de malignidad presente;
mostrar la salida en una interfaz gráfica del procesador
en donde el algoritmo aplicado es:
se aplica una puntuación de '0' a los resultados que no muestran cambios sobre los perfiles de expresión normales o de tipo salvaje de los diversos biomarcadores;
se aplica una puntuación de '1' en caso de presencia de una mutación oncogénica en un gen biomarcador, o para la presencia de 2 a 3 copias adicionales de un gen biomarcador, o por la presencia de una fusión de gen oncogénico, o un cambio de hasta 500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de <10 mutaciones/Megabase;
se aplica una puntuación de '2' en el caso de la presencia de 4 a 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de 500 a 1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador;
se aplica una puntuación de '3' en el caso de la presencia de más de 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o cambio >1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de >10 mutaciones/Megabase;
en donde una puntuación global de 0 es indicativa de ausencia de malignidad, una puntuación de 1 a 2 es indicativa de una malignidad con especificidad intermedia y alta sensibilidad, una puntuación de 3 a 5 es indicativa de una malignidad con alta especificidad y alta sensibilidad, y una puntuación superior a 6 es indicativa de malignidad con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta.
Preferentemente, el medio legible por ordenador no transitorio también comprende almacenar instrucciones para desarrollar una recomendación personalizada para el tratamiento del sujeto en base a los niveles de entrada y mostrar la recomendación personalizada en una interfaz gráfica del procesador.
En la Figura 1 se muestra una ilustración del método.
Los niveles de cualquier ARN específico que se consideraría elevado en comparación con lo normal y, por lo tanto, indicativo de un biomarcador positivo se muestran en la Tabla 5, donde se enumeran los valores de corte de expresión.
Se analiza el ADN de dicha muestra de orina y se detecta una mutación en un gen que codifica un biomarcador que impacta en la expresión o función del gen o producto del gen. En las Tablas 2 y 7 más abajo se encuentran ejemplos particulares en los que se produce una mutación procesable, por ejemplo, a través de una mutación de punto crítico de SNV. En la Figura 4 se muestra un ejemplo de detección de SNV. En particular, estos biomarcadores pueden encontrarse en genes seleccionados del grupo que consiste en ALK (gen de la quinasa del linfoma anaplásico), BRAF (gen B-Raf), CD274 (gen PD-L1), EGFR (gen del receptor del factor de crecimiento epidérmico), ERBB2 (receptor tirosina-proteína quinasa erbB-2 o gen del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano), FGFR (gen del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos), KIT (gen del receptor de tirosina quinasa del protooncogén KIT), KRAS (gen K-ras gtpasa), MET (protooncogén MET, receptor tirosina quinasa) o NRAS (protooncogén N-ras, gen GTPasa). Las mutaciones específicas de estos genes que son indicativas de una mutación oncogénica se exponen en las Tablas 2 y 7 más abajo. Estas mutaciones pueden detectarse mediante el uso de técnicas convencionales, como se ilustra a continuación.
Pueden detectarse biomarcadores resultantes del reordenamiento de genes que conduce a fusiones de genes aberrantes, y estos se enumeran en las Tablas 3 y 5 más abajo. En la Figura 5 se muestra un ejemplo de detección de una fusión de genes. Por ejemplo, se reconoce que el gen ALK puede fusionarse con porciones del gen similar a la proteína 4 (EML4) asociada a microtúbulos de equinodermo en algunos cánceres, que los genes FGFR pueden formar fusiones, por ejemplo, con quinasas en otros, y que el gen MET puede fusionarse con otros genes, que incluyen, por ejemplo, TFG, CLIP2 o PTRZ1. La detección de tales genes/proteínas de fusión proporcionará una indicación de biomarcador positiva.
El análisis puede identificar la presencia de variantes del número de copias que pueden conducir a una expresión aumentada. El ADN de dicha muestra puede analizarse y puede detectarse la presencia de una variación en el número de copias de un gen que codifica un biomarcador. Los biomarcadores adecuados en este caso se enumeran en las Tablas 4 y 6 más abajo e incluyen, por ejemplo, ERBB2, FGFR, FGFR1, FCFR2, FGFR3, FGFR4, CD273 (gen PD-L2) o CD273. En tales casos, por ejemplo, un aumento en el número de copias puede dar como resultado una amplificación o un aumento de la expresión y es indicativo de malignidad. En la Figura 6 se muestra un ejemplo de detección de CNV. En tales casos, cuanto mayor sea el aumento en el número de copias, mayor será la susceptibilidad a las terapias que se dirigen a dichos genes.
A diferencia de los biomarcadores basados en proteínas, TMB es una medida cuantitativa del número total de mutaciones por área de codificación de un genoma tumoral.
Dado que solo una fracción de las mutaciones somáticas da lugar a neoantígenos, la medición del número total de mutaciones somáticas (o TMB) dentro de un área de codificación en particular actúa como un indicador de la carga de neoantígenos. La TMB puede medirse mediante el uso de secuenciación del exoma mediante el uso de equipo de secuencia de próxima generación en particular de 409 genes que cubren una región de codificación de 1,7 Mb (Tabla 8). De todas las variantes detectadas, que incluyen las mutaciones somáticas no sinonómicas (SNV e indel), todos los polimorfismos de la línea germinal probables y los factores oncogénicos previstos se eliminan del análisis. Este último se realiza para evitar el sesgo de determinación de la secuenciación de genes cancerosos conocidos. Después la carga mutacional del tumor se calcula como mutaciones por Mb de ADN secuenciado (mut/Mb). El análisis de TMB es tanto cuantitativo como cualitativo y se informa como una métrica (mut/Mb) y así como también como estado. El estado de Alto se clasifica como >10 mut/Mb y Bajo <10 mut/Mb. Un ejemplo de medición de TMB se muestra en la Figura 2.
Se reconoció que TMB es un predictor de la respuesta a, por ejemplo, los inhibidores del punto de control anti-PD-1/PD-L1/PD-L2 y, por lo tanto, proporcionará un posible biomarcador útil en el método de la invención. En la Figura 7 se muestra un ejemplo del algoritmo de la presente invención. En ese caso, un puntaje de 0 es indicativo de malignidad presente, un puntaje de 1-2 es indicativo de malignidad, con especificidad intermedia y alta sensibilidad, un puntaje de 3-5 es indicativo de malignidad, con alta especificidad y una sensibilidad alta y una puntuación superior a 6 es indicativa de una malignidad, con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta. Las puntuaciones de la A a la E pueden no estar presentes en dependencia del análisis que se realice. Por ejemplo, el análisis de la expresión de SNV CNV ARN puede tener lugar de modo que A B E conduzca a la puntuación de detección de poligenes.
El método de la presente invención puede realizarse mediante la extracción de ADN/ARN de, por ejemplo, una muestra de orina. Después las muestras de ADN/ARN se pasan por un equipo de secuenciación de próxima generación, por ejemplo, un ThermoFisher Ion Torrent mediante el uso del método de la presente invención que se conoce como OncoUro DX ™. Los diversos métodos analíticos y técnicas para la determinación de los biomarcadores se llevan a cabo adecuadamente en una plataforma de ensayo de alto rendimiento en la medida de lo posible. Los resultados de estos pueden usarse en la detección de cáncer de riñón, vejiga y/o próstata, cribado de cáncer de riñón, vejiga y/o próstata, análisis de hematuria, monitorización de respuestas terapéuticas, vigilancia, selección de terapia oncológica de precisión.
El análisis de una muestra de orina no es invasivo y la muestra la puede obtener el propio paciente.
El ácido nucleico, específicamente el ARN y el ADN, se extraen de la muestra y, convenientemente, esta extracción forma una etapa preliminar en el método de la invención. La muestra puede ser una muestra fresca, pero el método también puede llevarse a cabo mediante el uso de muestras almacenadas, por ejemplo, en muestras fijadas con formalina, o muestras que se conservaron en formalina tamponada neutra al 10 %, solución salina formal o alcohol y formalina. soluciones tamponadas basadas, por ejemplo, Cytolyt®, preservCyt o ColliPee. Esto significa que las muestras pueden prepararse en un entorno, tal como una clínica u hospital, y después transferirse fácilmente a un laboratorio apropiado para su análisis de acuerdo con el método de la presente invención.
Como se usa en la presente descripción, el término "biomarcador" se refiere a cualquier molécula, gen, mutación de secuencia o característica tal como una expresión génica aumentada o disminuida a partir de una secuencia codificante de genes ligados a la proliferación. Los biomarcadores usados en la presente invención se identifican en las Tablas 1 a 7. Estos pueden incluir mutaciones en la secuencia del gen, en particular mutaciones de 'punto crítico' que se sabe que dan lugar a resultados oncológicos, variaciones en el número de copias de genes, fusiones de genes anómalos o aumento o disminución de la expresión de ARN, así como también a la carga mutacional del tumor.
Mediante la determinación de un intervalo, en particular un amplio intervalo de biomarcadores, asociados con un amplio espectro de oncogenes, mutaciones de genes impulsores, inestabilidad genómica medida por la carga mutacional del tumor, estado de proliferación y regulación del punto de control inmunitario, un diagnóstico confiable o monitorización de malignidad, tal como un cáncer, puede hacerse con un alto grado de sensibilidad y también de especificidad (es decir, con una baja frecuencia de falsos positivos).
Los biomarcadores detectados en el método de la invención se seleccionan de cada una de las Tablas 1 a 7 y pueden estar implicados en genes regulados por el ciclo celular, variantes genéticas procesables, biomarcadores asociados con redes de señalización y puntos de control del ciclo celular.
Ejemplos particulares de genes regulados por el ciclo celular son marcadores de proliferación y ejemplos particulares de estos se exponen en la Tabla 1. La detección de niveles aumentados de tales marcadores puede ser indicativa de la presencia de cánceres de riñón, vejiga y/o próstata. En general, estos biomarcadores se detectan mediante el análisis del ARN que se encuentra en la muestra, como se entendería en la técnica.
Las variantes genéticas procesables que pueden usarse como biomarcadores de acuerdo con la invención incluyen mutaciones de puntos críticos como las que se muestran en las Tablas 2 y 7 a continuación, fusiones de genes aberrantes como las que se muestran en las Tablas 3 y 5 a continuación, y variantes del número de copias, como como los establecidos en las Tablas 4 y 6 a continuación.
Preferentemente, se determinarán al menos 8 biomarcadores de las Tablas 1 a 7. Convenientemente, se determinarán al menos 10, 20, 30 o 40 de los biomarcadores de las Tablas 1 a 7. Preferentemente, todos los biomarcadores de las Tablas 1 a 7. Cuanto mayor sea el número de biomarcadores usados, mayor será la probabilidad de que se identifiquen genes desregulados, de modo que se eviten los falsos negativos.
Al menos algunos de los biomarcadores detectados se asocian con redes de señalización, en particular los asociados con el punto de control inmunológico PD-L1. Tales biomarcadores se enumeran en las Tablas 5, 6 y 7 más abajo. Al analizar estos biomarcadores en particular, puede evaluarse la susceptibilidad de un paciente particular a la terapia o inmunoterapia dirigida contra PD-1/PD-L1.
Las inmunoterapias dirigidas anti-PD-1/PD-L1 se convirtieron en uno de los grupos de agentes más importantes usados en inmunoterapia. La vía PD-1/PD-L1 normalmente participa en la promoción de la tolerancia y la prevención del daño tisular en el contexto de la inflamación crónica. La muerte programada 1 (PD-1) y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, suministran señales inhibitorias que regulan el equilibrio entre la activación, la tolerancia y la inmunopatología de los linfocitos T. La PD-L1 es una proteína transmembrana que se une al receptor PD-1 durante la modulación del sistema inmunitario. Esta interacción PD-1/PD-L1 protege a las células normales del reconocimiento inmunitario al inhibir la acción de los linfocitos T, lo que evita de esta manera el daño tisular mediado por el sistema inmunitario.
Aprovechar el sistema inmunológico en la lucha contra el cáncer se convirtió en un tema de gran interés. La inmunoterapia para el tratamiento del cáncer es un campo en rápida evolución desde terapias que estimulan el sistema inmunitario de manera global y no específica hasta enfoques más específicos. La vía PD-1/PD-L1 se convirtió en un objetivo poderoso para la inmunoterapia. Se demostró que una variedad de tipos de cáncer expresa PD-L1, que se une a PD-1 expresado por las células inmunitarias, lo que produce efectos inmunosupresores que permiten que estos cánceres evadan la destrucción tumoral. La interacción PD-1/PD-L1 inhibe la activación de los linfocitos T y aumenta la proliferación de linfocitos T reguladores (T-regs), lo que suprime aún más la respuesta inmunitaria efectora contra el tumor. Esto imita el enfoque usado por las células normales para evitar el reconocimiento inmunológico. Por lo tanto, dirigirse a PD-1/PD-L1 surgió como un enfoque nuevo y poderoso para las terapias dirigidas por inmunoterapia.
Dirigirse a la vía PD-1/PD-L1 con anticuerpos terapéuticos dirigidos a PD-1 y PD-L1 surgió como una terapia poderosa en aquellos tipos de cáncer que muestran características de evasión inmune. La interrupción de la vía PD-1/PD-L1 con anticuerpos terapéuticos dirigidos contra PD-1 o PD-L1 (agentes anti-PD-L1 o anti-PD-1) da como resultado la restauración de las respuestas inmunitarias efectoras con activación preferencial de linfocitos T dirigidas contra el tumor.
Hay muchos medicamentos en desarrollo dirigidos a la vía PD-1/PD-L1, que incluyen pembrolizumab, atezolizumab, avelumab, nivolumab, durvalumab, PDR-001, BGB-A317, REG W2810,<s>H<r>-1210
El tratamiento con tales agentes o mediante el uso de un enfoque de inmunoterapia adecuado puede indicarse para pacientes que se determine que son susceptibles a este tipo de terapia como resultado de la presencia de uno o más de los biomarcadores enumerados en las Tablas 5, 6 y 7 a continuación.
Al menos algunos de los biomarcadores detectados se asocian directamente con la vía PD-1/PD-L1, al igual que un biomarcador de un gen seleccionado entre CD279 (PD1), CD274 (PD1) o CD273 (PD2). En una modalidad particular, tanto PD-L1 como PD-1 se evalúan juntos y proporcionan una evaluación mucho más potente del eje de señalización PD-1/PD-L1.
El método puede usarse para medir la amplificación del gen PD-L1 y PD-L2 (variante del número de copias; CNV) que se relaciona con la sobreexpresión de ARNm y puede representar un parámetro mucho más fiable para predecir la respuesta a inhibidores de PD-1/PD-L1.
Puede seleccionarse una gama de biomarcadores asociados con diferentes funciones. En relación con esto, se identificó que la elección de una gama de biomarcadores proporciona una mejor indicación de la susceptibilidad al tratamiento que se dirige a una vía inmunitaria y, en particular, a la de PD-1/PD-L1. Es probable que las mutaciones en otros genes, en particular las mutaciones oncogénicas, den lugar a los llamados 'neoantígenos'. Los neoantígenos son antígenos recién formados que no se reconocieron previamente por el sistema inmunitario. Cuando los neoantígenos son antígenos específicos del cáncer, esto puede dar como resultado la activación de los linfocitos T contra las células cancerosas si el sistema inmunitario es efectivo y no está sujeto a supresión. Por lo tanto, cuando están presentes los neoantígenos, los pacientes pueden mostrar una respuesta más eficiente y duradera a los agentes que actúan sobre las vías inmunitarias, tal como la vía PD-1/PD-L1.
El método de la invención puede usarse en métodos de cribado para cáncer de riñón, vejiga y/o próstata. En consecuencia, los sujetos pueden ser individuos aparentemente sanos, y el cribado puede tener lugar en un gran número de sujetos. Dado que se usa una muestra de orina, la naturaleza no invasiva del método de la invención lo hace particularmente adecuado para este tipo de proceso de cribado a gran escala. Esto puede ser ventajoso para permitir la detección en etapa temprana de cánceres de riñón, vejiga y/o próstata en sujetos que no mostraron ningún síntoma.
Sin embargo, el método de la invención también puede usarse para monitorear el progreso de una neoplasia maligna en un sujeto al que se le diagnosticó previamente cáncer de riñón, vejiga y/o próstata. En tales casos, el método puede llevarse a cabo repetidamente durante un período de tiempo, por ejemplo, durante un período de semanas, meses o incluso años, mientras se administra un tratamiento o terapia particular, tal como quimioterapia, inmunoterapia o radioterapia, y los resultados usados para monitorear la eficacia de un tratamiento o terapia en particular sobre el progreso de la enfermedad. En particular, el método de la invención puede usarse para medir una respuesta terapéutica, por ejemplo, mediante la detección de una disminución de biomarcadores particulares tales como proteínas reguladas por el ciclo celular, o una disminución de mutaciones asociadas con oncogenes o tumores.
Después los resultados pueden usarse para dirigir el tratamiento continuo, por ejemplo, mediante la modificación o ampliación del tratamiento existente. Preferentemente, el método de la invención, mediante la identificación de biomarcadores específicos, que incluyen mutaciones procesables y reguladores de puntos de control inmunitarios, permite el desarrollo de terapias dirigidas e inmunoterapias que son específicas para el cáncer particular de un sujeto, tal como terapias anti PD-1 o PD-L1 como se discutió anteriormente.
Convenientemente, el sujeto sufre de hematuria. Mediante el uso del método de la invención, sería posible identificar el porcentaje muy bajo de pacientes con hematuria que albergan un cáncer de riñón, vejiga y/o próstata. Esto evitará el procedimiento costoso e invasivo de la cistoscopía para pacientes con hematuria benigna.
Los biomarcadores de las Tablas 1 a 7 se identificaron mediante el uso de un análisis de ADN o ARN o una de sus combinaciones. Los ácidos nucleicos (ADN y/o ARN) extraídos de una muestra cómo se describe anteriormente se usan para construir una biblioteca, mediante el uso de métodos convencionales, por ejemplo, como se describe más abajo. La biblioteca se enriquece según sea necesario y después se usa como plantilla para el enriquecimiento, nuevamente mediante el uso de métodos convencionales como se describe más abajo. Después se lleva a cabo el análisis de esto mediante el uso de un equipo de secuenciación de próxima generación de semiconductores tal como el vendido por ThermoFisher con la marca comercial Ion Torrent mediante el uso del método establecido en la presente invención.
Preferentemente, el método de la invención usa secuenciación de semiconductores dirigida para cubrir las regiones de codificación completas de los biomarcadores de interés. Los amplicones pueden diseñarse para que se superpongan para la redundancia de la cobertura de la secuencia y para poder amplificar las plantillas de ADN fragmentadas obtenidas de las muestras. Por lo tanto, el método puede identificar una amplia variedad de variantes genéticas accionables, que incluyen mutaciones puntuales, eliminaciones, duplicaciones e inserciones.
Por lo tanto, convenientemente, el método de la invención utiliza tecnología de secuenciación de próxima generación para cuantificar biomarcadores presentes en una muestra de orina. De esta forma, el método de la invención puede llevarse a cabo mediante el uso de sólo una pequeña cantidad de muestra, tal como la que puede encontrarse en una muestra de orina, y puede optimizarse para el análisis de ADN/ARN degradado. También, una prueba cuantitativa proporciona un método mucho más preciso que la inmunohistoquímica.
Los biomarcadores identificados en las Tablas 1 y 5 más abajo pueden identificarse más fácilmente mediante un análisis de la expresión génica, por ejemplo, mediante el uso de la medición cuantitativa de los transcritos de ARN (es decir, se analizan los niveles de ARN, en donde se observa un cambio en el nivel de expresión en comparación con el tipo salvaje es indicativo de malignidad. Convenientemente, en tumores en los que se implica el punto de control de PD-L1, pueden detectarse niveles elevados de ARN de CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1) y CD279 (PD-1). Preferentemente, se lleva a cabo la expresión génica en múltiples loci de exón-intrón a través de ARNm tales como los ARNm de PD-L1 y PD-1, que después se acopla a un programa bioinformático que normaliza la expresión génica en todo el gen, lo que permite una medición cuantitativa muy precisa de los niveles de expresión de ARN. La validación analítica de la expresión del ARNm de PD-L1 se muestra en la Figura 3.
En adición, los niveles elevados de ARN de NFATC1 (factor nuclear de linfocitos T activados 1), PIK3CA (subunidad alfa catalítica de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinasa), PIK3CD (subunidad delta catalítica de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 3-quinasa), PRDM1 (proteína 1 con dedos de zinc del dominio PR), PTEN, (homólogo de fosfatasa y tensina), PTPN11 (no receptor de tirosina-proteína fosfatasa tipo 11), MTOR (diana mecanicista de la rapamicina), HIF1a (factor inducible por hipoxia 1 -alfa) y FOXOlm (mutante clase 01 de caja de forkhead) pueden cuantificarse. En adición, el método de la invención puede detectar la pérdida de expresión génica de los genes de reparación de errores de emparejamiento MLH1, PMS2, MSH6 y MLH2. La pérdida de la función de uno de estos genes da como resultado una inestabilidad genómica que conduce a una mayor expresión de neoantígenos de la superficie tumoral y de esta manera aumenta las velocidades de respuesta a las inmunoterapias dirigidas contra el cáncer.
Adecuadamente, el algoritmo se integra en un sistema de alto rendimiento usado para derivar los datos de biomarcadores, de modo que se generen los resultados. Tales sistemas comprenderán un procesador y una memoria que almacena instrucciones para recibir los datos obtenidos mediante el uso del método de la invención, analizarlos y transformarlos para producir una 'puntuación' indicativa de la presencia y especificidad de malignidad mediante el uso del algoritmo descrito anteriormente. Estos resultados pueden entonces mostrarse adecuadamente en una interfaz gráfica. En algunos casos, la memoria comprenderá un medio legible por ordenador no transitorio. Tales sistemas y medios forman un aspecto de la invención.
Las variantes genéticas detectadas mediante el uso del método de la invención pueden vincularse a través de una plataforma bioinformática adecuada a una amplia gama de inhibidores potenciales de componentes de la ruta de inicio de la replicación del ADN, que incluyen los inhibidores de Cdc7 de los que se encuentran en ensayos clínicos hasta las terapias aprobadas por la FDA/EMA.
Una vez identificados de esta manera, los sujetos que tienen o se identificaron con cáncer de riñón, vejiga y/o próstata pueden clasificarse en dependencia de su susceptibilidad aparente a un determinado tipo de terapia y pueden tratarse en consecuencia, mediante el uso de agentes adecuados. Estos se administrarán de acuerdo con la práctica clínica habitual. Así, convenientemente, el método de la invención también comprende generar una recomendación personalizada para el tratamiento, en base a los resultados obtenidos.
El método de la invención aborda los problemas y las graves limitaciones de los diagnósticos actuales basados en ELISA. En particular, el método es susceptible de automatización completa. Puede ser cuantitativo en particular cuando se usa el algoritmo descrito anteriormente, y no requiere interpretación humana subjetiva por parte de un patólogo. En modalidades particulares, el método de la invención no requiere la entrada de un patólogo para la evaluación manual de biomarcadores. Toda la prueba está completamente automatizada y, por lo tanto, no está sujeta a la variabilidad interobservador o intraobservador.
Convenientemente, el método de la invención proporciona una lectura completa e integrada de todos los biomarcadores enumerados en las Tablas 1 a 7 que están asociados con el cáncer de riñón, vejiga y/o próstata. El algoritmo, como se describe anteriormente, puede usarse para integrar todos estos biomarcadores predictivos en una puntuación de detección poligénica (PDS), como se ilustra esquemáticamente en la Figura 7 a continuación. Esta naturaleza cuantitativa del ensayo significa que pueden identificarse puntos de corte precisos que predicen la respuesta a terapias específicas, tales como las inmunoterapias dirigidas contra PD-1/PD-L1/PD-L2. Al proporcionar un resultado cuantitativo claro, se evita cualquier interpretación asociada con la subjetividad y la variabilidad interobservador de los ensayos convencionales.
El método de la invención es capaz, por ejemplo, de evaluar el eje de señalización PD-1/PD-L1 completo en un enfoque integrado que no puede lograrse mediante el uso de un único biomarcador IHC. Mediante el uso del método de la invención, la activación/aumento de la expresión de muchos elementos en el eje de señalización PD-1/PD-L1, que incluyen PD-1, PD-L1, PD-L2, NFATC1, PIK3CA, PIK3CD, PRDM1, PTEN, PTPN11, MTOR, HIF1A, IFN-gamma y FOXO1 puede evaluarse.
Preferentemente, el método de la invención incluye la evaluación de mutaciones oncogénicas que se enlazan a la respuesta a inmunoterapias dirigidas anti-PD-1/PD-L1/PD-L2. Se evalúa un amplio intervalo de oncogenes para detectar aberraciones, mutaciones, fusiones y amplificaciones genéticas (Tablas 5, 6 y 7) con enlace a inmunoterapias dirigidas contra PD-1/PD-L1. Muchos de estos genes son componentes de las redes de señalización del crecimiento. La activación oncogénica de estas redes de señalización de crecimiento conduce a la inducción de los ligandos PD-1, PD-L1 y PD-L2.
Por lo tanto, convenientemente, el método de la invención puede proporcionar una prueba totalmente automatizada que se diseñó para analizar todos los componentes implicados en la respuesta inmunorreguladora de cáncer de próstata, vejiga y/o riñón de PD-1/PD-L1, que incluyen las células tumorales, linfocitos T inmunitarios y células presentadoras de antígenos (APS). Esto proporciona una imagen cuantitativa integrada de todos los componentes implicados en la respuesta inmunorreguladora del cáncer PD-1/PD-L1/PD-L2 en términos de todos los tipos de células (células tumorales y células inmunitarias) y en todos los niveles del eje de señalización PD-1/PD-L1.
En adición a un análisis completo tal como el del eje de señalización PD-1/PD-L1/PD-L2, el método de la invención se diseñó para detectar todas las mutaciones oncogénicas que son indicativas de cáncer de riñón, vejiga y/o próstata. La integración de la información derivada de tales mutaciones permite preparar una recomendación personalizada para la terapia. En particular, la asociación del eje de señalización PD-1/PD-L1/PD-L2 con predictores oncogénicos proporciona el predictor más potente de respuesta a las inmunoterapias dirigidas anti-PD-1/PD-L1/PD-L2. Por ejemplo, la detección de (i) PD-L1 mutado y (ii) amplificado también se enlaza con (iii) una expresión aumentada de PD-L1. Esto proporciona tres predictores de respuesta independientes pero enlazados a las inmunoterapias dirigidas anti-PD-1/PD-L1/PD-L2. Al integrar información del eje de señalización PD-1/PD-L1/PD-L2 con la activación oncogénica de las redes de señalización del crecimiento, el algoritmo descrito en la presente descripción puede identificar con precisión a los pacientes con mayor probabilidad de responder a inmunoterapias dirigidas anti-PD-1/PD-L1/PD-L2.
El método de la presente invención puede usar plataformas analíticas de alto rendimiento para hacer coincidir los tumores del paciente con terapias dirigidas específicas, de las referencias de las directrices ESMO/NCCN aprobadas por la FDA/EMA y en todas las fases de los ensayos clínicos en todo el mundo. En las Figuras 2, 4, 5 y 6 se muestran ejemplos de vínculos entre variantes genéticas y terapias dirigidas.
La plataforma Thermo Fisher Ion Torrent ™ se utilizó para desarrollar el ensayo de la invención. El objetivo era, por las razones explicadas anteriormente, proporcionar un medio no solo para detectar cánceres genitourinarios, sino también para proporcionar una imagen completa de los tumores, para permitir la prescripción de terapias adecuadas.
El uso de una sola prueba integrada como se describió en la presente descripción y el uso de conjuntos de cebadores (ver el Ejemplo 1, 1.1) que abarcan los límites de exón/intrón de ambos genes inmunorreguladores en múltiples loci en ambos genes y se diseñó de tal manera que son capaces de amplificar el material de ARN degradado extraído de muestras de orina fijadas con formalina de rutina. La medición exacta y precisa de estos múltiples componentes, como los del eje de señalización PD-1/PD-L1/PD-L2, permite proporcionar un perfil integrado cuantitativo de esta vía inmunorreguladora. El resultado de esta plataforma de ensayo puede usarse para proporcionar puntos de corte precisos para estos biomarcadores inmunorreguladores que predicen la respuesta terapéutica a diferentes terapias, que incluyen en particular, las terapias dirigidas contra PD-1/PD-L1/PD-L2.
El análisis de ADN se diseñó para detectar mutaciones oncogénicas y aberraciones de copia de genes que se identificaron no solo como indicadores de malignidad sino también como predictores de respuesta a terapias específicas como las inmunoterapias dirigidas contra PD-1/PD-L1/PD-L2. En adición al análisis de expresión de ARN de las moléculas de señalización de PD-1/PD-L1/PD-L2, puede realizarse un análisis de expresión de ARN para detectar transcritos de fusión oncogénicos identificados como predictores de respuesta a inmunoterapias dirigidas a anti-PD-1/PD-L1/PD-L2.
Los kits adecuados para llevar a cabo el método de la invención pueden comprender combinaciones de cebadores de amplificación necesarios para detectar 3 o más de los biomarcadores enumerados en las Tablas 1 a 7 y/o la TMB. Los kits no se reivindicanper se,pero pueden usarse en la práctica de la invención. Además, los aparatos dispuestos para llevar a cabo el método descrito anteriormente también son nuevos y forman otro aspecto de la invención. En particular, el aparato comprenderá medios para llevar a cabo análisis de ADN y/o ARN como se describió anteriormente, asociados a un ordenador programado para implementar el algoritmo como se describió anteriormente. Un ordenador o un casete legible por máquina programado de esta manera constituye otro aspecto más de la invención.
Descripción detallada de la invención
La invención se describirá ahora, a manera de ejemplo, con referencia a las figuras esquemáticas acompañantes en las cuales:
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático que ilustra el método de la invención. Las células tumorales y/o el ADN/ARN libre de células se aíslan de la orina. Después el ADN y el ARN se analizan mediante el uso de perfiles de secuenciación de próxima generación que cubren específicamente los genes del cáncer enlazados a terapias e inmunoterapias dirigidas. Estos genes del cáncer representan diagnósticos complementarios (CDx) para las terapias/inmunoterapias dirigidas correspondientes. En adición a proporcionar medicina personalizada con respecto a la selección del tratamiento, el análisis multiparamétrico integrado de estos diagnósticos complementarios, las mutaciones genéticas procesables también pueden usarse en la detección del cáncer, cribado, análisis de pacientes con hematuria, vigilancia y monitorización de la respuesta terapéutica.
La Figura 2 muestra un ejemplo de medición de la carga mutacional tumoral (TMB). Panel A: muestra la lectura de TMB y Panel B muestra la vinculación bioinformática con inmunoterapias anti-PD-L1/PD-1 afines basadas en evidencia relevante.
La Figura 3 muestra la validación analítica de las mediciones cuantitativas de los niveles de ARNm por NGS en muestras FFPE mediante el uso de la expresión de PD-L1 como ejemplo. Los recuentos de lecturas por millón (RPM) se usan como una medida sustituta de la expresión génica del ARNm. Se seleccionaron cuatro controles de líneas celulares que expresaban de forma estable niveles variables de PD-L1 evaluados por proteína PD-L1 que representaban una puntuación de proporciones tumorales de 0 %, 25 %, 75 % y 100 % según lo evaluado en el nivel de proteína por inmunocitoquímica. Los recuentos de RPM se muestran para dos conjuntos de cebadores que abarcan los límites de exón/intrón para el gen PD-L1.
A) muestra los recuentos de RPM de los dos amplicones diferentes dirigidos al gen PD-L1.
B) muestra los recuentos de RPM (ARNm) de PD-L1 generados por el método de la presente invención en comparación con la expresión de la proteína PD-L1 evaluada por iHc .
C) muestra fotomicrografías de cuatro controles de líneas celulares teñidos inmunohistoquímicamente con un anticuerpo contra PD-L1 y que expresan diferentes niveles de proteína PD-L1. Los datos muestran que el método de la presente invención proporciona una evaluación cuantitativa precisa de la expresión de ARNm cuando se aplica a muestras rutinarias fijadas con formalina e incluidas en cera de parafina. En particular, RPM muestra un rápido aumento en paralelo con la expresión de proteínas medida por ICC en valores de punto de corte de 1 %, 10 %, 25 % y 50 %. Estos son los puntos de corte clínicamente importantes definidos por varios ensayos ICC Cdx PD-L1 aprobados para la identificación de respondedores a inmunoterapias dirigidas anti-PD-L1/PD-1 (por ejemplo, ensayo VENTANA PD-L1 (SP263), ensayo VENTANA p D-L1 (SP142), Dako PD-L1 IHC 28-8 pharmDx, Dako PD-L1 IHC 22C3 pharmDx). La aplicación de este método mediante el uso de múltiples conjuntos de cebadores que abarcan los límites de exón/intrón en todos los genes sujetos a análisis de expresión (ver las Tablas 1, 3 y 5) se incorpora al método de la presente invención.
La Figura 4 muestra la detección de variantes de nucleótido único (SNV) y terapias dirigidas afines vinculadas. En esta muestra de tumor, se detectaron dos SNV procesables en el oncogén PIK3CA y el gen supresor de tumores p53 (Panel A). El Panel B muestra los detalles de las variantes identificadas y las terapias dirigidas afines vinculadas a la bioinformática se muestran en el Panel C.
La Figura 5 muestra la detección de genes de fusión oncogénicos y terapias dirigidas afines vinculadas. En esta muestra de tumor se detectó una fusión oncogénica que implicaba el gen BRAF y el gen ribosómico mitocondrial MRPS33 (Panel A). Las terapias dirigidas afines vinculadas a la bioinformática se muestran en el Panel B (la misma clave que la Figura 4).
La Figura 6 muestra la detección de variantes de amplificación génica y terapias dirigidas afines vinculadas. En esta muestra de tumor, se detectó amplificación génica en relación con dos genes impulsores del cáncer AKT2 y CCNE1 (Panel A y B). Las terapias dirigidas afines vinculadas a la bioinformática se muestran en el Panel C (la misma clave que la Figura 4).
La Figura 7 es un diagrama esquemático que ilustra un método que incorpora la invención que incluye un algoritmo de puntuación de predicción poligénica usado para interpretar los resultados y proporcionar una indicación de malignidad (la misma clave que la Figura 4).
Ejemplo 1
Detección de biomarcadores genéticos
1.1 Descripción general del diseño de cebadores:
Los cebadores para detectar cada uno de los biomarcadores enumerados en las Tablas 1 a 7 se diseñaron de acuerdo con la práctica convencional mediante el uso de técnicas conocidas por los expertos en la técnica. En general, los cebadores de 18-30 nucleótidos de longitud son óptimos con una temperatura de fusión (Tm) entre 65 °C y 75 °C. El contenido de GC de los cebadores debe estar entre el 40 y el 60 %, con el extremo 3' del cebador terminado en C o G para promover la unión. La formación de estructuras secundarias dentro del propio cebador se minimiza al garantizar una distribución equilibrada de dominios ricos en GC y ricos en AT. Debe evitarse la homología intra/inter- cebador para un rendimiento óptimo del cebador.
1.1.1 Cebadores para la detección del número de copias:
Los cebadores se diseñaron, como se explica en 1.1, para abarcar regiones en los genes enumerados en las Tablas 4 y 6. Se diseñaron varios amplicones por gen. La profundidad de cobertura se mide para cada uno de estos amplicones. El algoritmo de amplificación y eliminación del número de copias se basa en un modelo oculto de Markov (HMM). Antes de la determinación del número de copias, la cobertura de lectura se corrige en cuanto al sesgo de GC y se compara con una línea de base preconfigurada.
1.1.2 Cebador para la detección de puntos críticos:
Los cebadores se diseñaron, como se explica en 1.1, para apuntar a regiones específicas propensas a mutaciones somáticas oncogénicas, como se indica en la Tabla 2 y al tener en cuenta los puntos generales discutidos anteriormente.
1.1.3 Cebadores para análisis de expresión de ARN:
El ARN extraído se procesa a través de RT-PCR para crear ADN complementario (ADNc) que después se amplifica mediante el uso de cebadores diseñados, como se explica en 1.1. Se diseñaron varios conjuntos de cebadores para abarcar los límites de exón/intrón en todos los genes sujetos a análisis de expresión, como se indica en las Tablas 1 y5
1.1.4 Cebadores para detección de fusión de ARN:
Se diseñaron un par de cebadores de ensayo de punto de ruptura exón-exón específicos, como se describe en 1.1, para cada fusión enumerada en las Tablas 3 y 5. Los cebadores que flanquean el punto de ruptura de la fusión generan amplicones de fusión específicos que se alinean con la secuencia de referencia, lo que permite la identificación de los genes de fusión. Los ensayos de desequilibrio de expresión permiten monitorear los niveles de expresión equivalentes en muestras normales, con un desequilibrio entre los ensayos 5' y 3' que indican que las muestras tienen un punto de ruptura de fusión.
1.2 Extracción de ADN y ARN
El ADN y el ARN se extrajeron de una muestra de orina fijada con formalina. Se realizaron dos lavados con xileno mediante la mezcla de 1 ml de xileno con la muestra. Las muestras se centrifugaron y se eliminó el xileno. Esto se siguió por 2 lavados con 1 ml de alcohol etílico puro. Después de que las muestras se secaron al aire, se adicionaron a cada muestra 25 pl de tampón de digestión, 75 pl de agua libre de nucleasas y 4 pl de proteasa. Después las muestras se digirieron a 55 °C durante 3 horas, seguido de una digestión de 1 hora a 90 °C.
Se mezclaron 120 pl de aditivo de aislamiento con cada muestra y las muestras se adicionaron a cartuchos de filtro en tubos de recolección y se centrifugaron. Los filtros se movieron a nuevos tubos de recolección y se mantuvieron en el refrigerador para la extracción de ADN en una etapa posterior. El flujo continuo se mantuvo para la extracción de ARN y se adicionaron 275 pl de alcohol etílico puro y la muestra se trasladó a un nuevo filtro en un tubo de recolección y se centrifugó. Después de un lavado de 700 pl de tampón de lavado 1, el ARN se trató con ADNasa como sigue; se preparó una mezcla maestra de ADNasa mediante el uso de 6 pl de tampón de ADNasa 10X, 50 pl de agua libre de nucleasas y 4 pl de ADNasa por muestra. Esto se adicionó al centro de cada filtro y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de la incubación, se realizaron 3 lavados mediante el uso del Lavado 1, después Lavado 2/3, con eliminación del tampón de lavado de los tubos de recolección después de cada centrifugación. Los filtros se movieron a un nuevo tubo de recolección y la solución de elución (calentada a 95 °C) se adicionó a cada filtro y se incubó durante 1 minuto. Después de centrifugar la muestra, se descartó el filtro y el ARN recolectado en el flujo se trasladó a un nuevo tubo de unión baja.
El ADN de los filtros se lavó con tampón de lavado 1, se centrifugó y se descartó por flujo. El ADN se trató con RNasa (50 pl de agua nucleasa y 10 pl de RNasa) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Como anteriormente con el ARN, se completaron tres lavados y las muestras se eluyeron en solución de elución calentada a 95 °C.
1.3 Medición de ADN y ARN
La cantidad de ADN y ARN de las muestras extraídas se midió mediante el uso del Qubit® fluorómetro 3.0 y el Qubit® kit de ensayo de alta sensibilidad de ARN (CAT: Q32855) y Qubit® kit de ensayo de alta sensibilidad de ADNbc (Cat: Q32854). Se usaron 1 |jl de ARN/ADN combinado con 199 |jl de tampón HS combinado y reactivo en tubos de ensayo Qubit® para la medición. Se combinaron 10 j l del estándar 1 o 2 con 190 j l de solución tampón y reactivo para los controles.
1.4 Preparación de la biblioteca
Las muestras de ARN se diluyeron a 5 ng/jl si era necesario y se transcribieron de forma inversa a ADNc en una placa de 96 pocillos mediante el uso del kit de síntesis de ADNc SuperScript VILO (CAT 11754250). Se preparó una mezcla maestra de 2 j l de VILO, 1 j l de mezcla de enzimas 10 X SuperScript III y 5 j l de agua libre de nucleasas para todas las muestras. Se usaron 8 j l de mezcla maestra junto con 2 j l de ARN en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se ejecutó el siguiente programa:
Después se realizó la amplificación del ADNc mediante el uso de 4 j l de 6 cebadores de ARN que cubrían múltiples loci exón-intrón en todo el gen, 4 j l de AmpliSeq HiFi*1y 2 j l de agua libre de nucleasas en cada pocillo de muestra. La placa se ejecutó en el termociclador durante 30 ciclos mediante el uso del siguiente programa:
Las muestras de ADN se diluyeron a 5 ng/jl y se adicionaron a AmpliSeq Hifi*1, agua libre de nucleasas y se configuraron mediante el uso de dos conjuntos de cebadores de ADN (5 j l del conjunto 1 y 5 j l del conjunto 2) en una placa de 96 pocillos. El siguiente programa se ejecutó en el termociclador:
Después de la amplificación, los amplicones se digirieron parcialmente con 2 j l de LIB Fupa*1, se mezclaron bien y se colocaron en el termociclador en el siguiente programa:
4 j l de solución de cambio*1, 2 j l de códigos de barras Ion XPRESS 1-16 diluidos (CAT: 4471250) y 2 j l de LIB ADN ligasa*1se adicionaron a cada muestra, mediante mezclado completo entre la adición de cada componente. El siguiente programa se ejecutó en el termociclador:
Después las bibliotecas se purificaron mediante el uso de 30 j l de Agencourt AMPure XP (Biomeck Coulter cat: A63881) y se incubaron durante 5 minutos. Mediante el uso de un imán de placa, se realizaron 2 lavados con etanol al 70 %. Después las muestras se eluyeron en 50 j l de TE.
1.5 qPCR
La cantidad de biblioteca se midió mediante el uso del kit de cuantificación Ion Library TaqMan (cat: 4468802). Se usaron cuatro diluciones seriadas de 10 veces de la biblioteca de control deE. coliDH10B Ion (6,8 pmol, 0,68 pmol, 0,068 pmol y 0,0068 pmol) para crear la curva estándar. Cada muestra se diluyó 1/2000 y cada muestra, estándar y control negativo se analizaron por duplicado. Se combinaron 10 |jl de la mezcla maestra 2X TaqMan y 1 |jl del ensayo 20X TaqMan en un pocillo de una placa de ciclo térmico rápido de 96 pocillos para cada muestra. Se adicionaron a la placa 9 j l de la muestra diluida 1/2000, estándar o agua libre de nucleasas (control negativo) y se ejecutó la qPCR en la máquina ABI StepOnePlus™ (Cat: 4376600) mediante el uso del siguiente programa:
Las muestras se diluyeron hasta 100 pmol mediante el uso de TE y 10 j l de cada muestra se agruparon en un tubo de ADN o en un tubo de ARN. Para combinar las muestras de ADN y a Rn , se usó una relación de 80:20 ADN:ARN.
1.6 Preparación de plantillas
El Ion One Touch™ 2 se inicializó mediante el uso de las soluciones y suministros Ion S5 OT2*2y se suministraron 150 j l de solución de ruptura*2 a cada tubo de recuperación. Las muestras de ARN combinadas se diluyeron aún más en agua libre de nucleasas (8 j l de muestra combinada con 92 j l de agua) y se preparó una mezcla maestra de amplificación mediante el uso de la mezcla de reactivos Ion S5*2 junto con agua libre de nucleasas, mezcla de enzimas ION S5*2, partículas de esfera de iones (ISP) *2 y la biblioteca diluida. La mezcla maestra se cargó en el adaptador junto con el aceite de reacción*2. El instrumento se cargó con la placa de amplificación, los tubos de recuperación, el enrutador y el adaptador de amplificación cargados con la muestra y la mezcla maestra de amplificación.
1.7 Enriquecimiento
Para el proceso de enriquecimiento se realizó el fundido mediante el uso de 280jl de Tween*2 y 40 j l de Hidróxido de Sodio 1 M. Las microesferas de estreptavidina C1 Dynabeads® MyOne™ (CAT:65001) se lavaron con la solución de lavado OneTouch*2 mediante el uso de un imán. Las perlas se suspendieron en 130 j l de solución de captura de perlas MyOne*2. Los ISP se recuperaron mediante la eliminación del sobrenadante, y se transfirieron a un nuevo tubo de unión baja y subsecuentemente se lavaron en 800 j l de agua libre de nucleasas. Después de centrifugar la muestra y eliminar el sobrenadante de agua, quedaron 20 j l de ISP positivos para la plantilla. 80 j l de solución de resuspensión de ISP*2se adicionaron hasta un volumen final de 100 jl.
Se cargó una punta nueva, un tubo de 0,2 ml y una tira de 8 pocillos en la máquina OneTouch™ ES con lo siguiente:
Pocillo 1: 100 j l de ISP positiva de plantilla
Pocillo 2: 130 j l de microesferas lavadas de estreptavidina C1 Dynabeads® MyONE™, resuspendidas en captura de microesferas MyOne
Pocillo 3: 300 j l de solución lavado Ion OneTouch ES*2
Pocillo 4: 300 j l de solución lavado Ion OneTouch ES
Pocillo 5: 300 j l de solución lavado Ion OneTouch ES
Pocillo 6: Vacío
Pocillo 7: 300 j l de fundido
Pocillo 8: Vacío
Después de la ejecución, que dura aproximadamente 35 minutos, se centrifugaron los ISP enriquecidos, se eliminó el sobrenadante y se lavó con 200 j l de agua libre de nucleasas. Después de otra etapa de centrifugado y de la eliminación del sobrenadante, quedaron 10 j l de ISP. Se adicionaron 90 j l de agua libre de nucleasas y se resuspendieron las microesferas.
1.8 Secuenciación
El sistema Ion S5™ (Cat: A27212) se inicializó mediante el uso del cartucho de reactivo Ion S5, la solución de limpieza Ion S5 y las soluciones de lavado Ion S5*2.
5 j l de ISP de control*2 se adicionaron a la muestra enriquecida y se mezclaron bien. Se centrifugó el tubo y se eliminó el sobrenadante para dejar la muestra y los ISP de control. 15 j l de tampón de hibridación Ion S5*2 y 20 j l de cebador de secuenciación*2 se adicionaron a la muestra. La muestra se cargó en el termociclador para la hibridación del cebador a 95 °C durante 2 minutos y 37 °C durante 2 minutos. Después del ciclo térmico, 10 j l de tampón de carga Ion S5*2 se adicionó y la muestra se mezcló.
El tampón de hibridación al 50 % se preparó mediante el uso de 500 j l de tampón de hibridación Ion S5*2 y 500 j l de agua libre de nucleasas*2.
Después se cargó toda la muestra en el puerto de carga de un chip Ion 540™ (Cat: A27766) y se centrifugó en una centrífuga de chip durante 10 minutos.
Seguido a esto, 100 |jl de espuma (preparada mediante el uso de 49 |jl de tampón de hibridación al 50 % y 1 |jl de solución espumante*2) se inyectó en el puerto seguido de 55 j l de tampón de hibridación al 50 % en el pozo del chip, con eliminación del exceso de líquido del pocillo de salida. El chip se centrifugó durante 30 segundos con la muesca del chip hacia afuera. Esta etapa de formación de espuma se repitió.
El chip se enjuagó dos veces con 100 j l de solución de lavado (preparada con 250 j l de isopropanol y 250 j l de tampón de recocido Ion S5) en el puerto de carga, y se eliminó el exceso de líquido del pocillo de salida. Después se realizaron 3 lavados con tampón de hibridación al 50 % en el puerto de carga. Se combinaron 60 j l de tampón de hibridación al 50 % con 6 j l de polimerasa de secuenciación Ion S5*2. Después se cargaron 65 j l de la mezcla de polimerasa en el puerto, se incubaron durante 5 minutos y se cargaron en el instrumento S5 para la secuenciación, que tarda aproximadamente 3 horas y 16 horas para la transferencia de datos.
*1 de la biblioteca 2.0 Ion Ampliseq™ (Cat:4480441)
*2 del kit Ion 540™ OT2 (Cat: A27753)
1.9 Análisis de datos
1.9.1 Análisis de CNVdeADN:
Las variaciones del número de copias (CNV) representan una clase de variación en la que se duplican (ganancias) o eliminan (pérdidas) segmentos del genoma. Los grandes desequilibrios en el número de copias genómicas pueden variar desde regiones subcromosómicas hasta cromosomas completos.
Los datos sin procesar se procesaron en el sistema Ion S5 y se transfirieron al servidor Torrent para el análisis de datos primarios realizado mediante el uso de Oncomine Comprehensive Assay Baseline v2.0. Este complemento se incluye en el software Torrent Suite, que viene con cada secuenciador Ion Torrent™. La amplificación del número de copias y la detección de eliminaciones se realizaron mediante el uso de un algoritmo basado en un modelo oculto de Markov (HMM). El algoritmo usa la cobertura de lectura en todo el genoma para predecir el número de copias. Antes de la determinación del número de copias, la cobertura de lectura se corrige en cuanto al sesgo de GC y se compara con una línea de base preconfigurada.
La mediana de los valores absolutos de la puntuación de todas las diferencias por pares (MAPD) se informa por muestra y se usa para evaluar la variabilidad de la muestra y definir si los datos son útiles para el análisis del número de copias. MAPD es una estimación de ejecución por secuenciación de la variabilidad del número de copias, como la desviación estándar (SD). Si se supone que las relaciones log2 se distribuyen normalmente con media 0 frente a una referencia SD constante, entonces MAPD/0,67 es igual a SD. Sin embargo, a diferencia de SD, el uso de MAPD es robusto frente a la alta variabilidad biológica en relaciones log2 inducidas por condiciones conocidas tales como el cáncer. Las muestras con una puntuación MAPD superior a 0,5 deben revisarse cuidadosamente antes de validar la llamada CNV.
Los resultados del análisis del número de copias después de la normalización pueden visualizarse a partir de los datos sin procesar.
La detección de CNV somática proporciona límites de confianza para cada segmento de número de copias. La confianza es la probabilidad porcentual estimada de que el número de copia sea menor que el límite del número de copia dado. Para cada CNV se proporciona un porcentaje inferior y superior y el límite de valor del número de copia respectivo. También se indican los intervalos de confianza para cada CNV, y las amplificaciones de un número de copias > 6 con un valor de confianza del 5 % de > 4 después de la normalización y las deleciones con un 95 % de IC < 1 se clasifican como presentes.
1.9.2 Análisis de puntos críticos de ADN:
Los datos sin procesar se procesaron en el sistema Ion S5 y se transfirieron al servidor Torrent para el análisis de datos primarios realizado mediante el flujo de trabajo personalizado. Se realiza el mapeo y la alineación de los datos sin procesar con un genoma de referencia y después se anotan las variantes de puntos críticos de acuerdo con el archivo BED. Las estadísticas de cobertura y otros criterios de control de calidad relacionados se definen en un archivo vcf que incluye anotaciones mediante el uso de un amplio conjunto de fuentes públicas. Los parámetros de filtrado pueden aplicarse para identificar aquellas variantes que superan los umbrales de control de calidad y estas variantes pueden visualizarse en IGV. En general, la regla de clasificar las variantes con >10 % de lecturas de alelos alternativos y >10 lecturas únicas se clasifican como 'detectadas'.
Se utilizan varias herramientas in-silico para evaluar la patogenicidad de las variantes identificadas, que incluyen PhyloP, SIFT, Grantham, COSMIC y PolyPhen-2.
1.9.3 Análisis de expresión de ARN:
Los datos sin procesar se procesaron en el sistema Ion S5 y se transfirieron al servidor Torrent para el análisis de datos primarios realizado mediante el uso del complemento AmpliSeqRNA. Este complemento se incluye en el software Torrent Suite, que viene con cada secuenciador Ion Torrent™. El complemento AmpliSeqRNA usa el Programa de alineación de mapeo de torrents (TMAP). TMAP se optimizó para los datos de secuenciación de Ion Torrent™ para alinear las lecturas de secuenciación sin procesar con un conjunto de secuencias de referencia personalizado que contiene todas las transcripciones a las que se dirige el kit AmpliSeq. La información específica del ensayo se incluye en un archivo BED personalizado. Para mantener la especificidad y la sensibilidad, TMAP implementa un enfoque de mapeo de dos etapas. En primer lugar, empleamos cuatro algoritmos de alineación, BWA-corto, BWA-largo, SSAHA y Super-maximal Exact Matching para identificar una lista de ubicaciones de mapeo candidatas (CML). Se realiza un proceso de alineación adicional mediante el uso del algoritmo de Smith Waterman para encontrar el mejor mapeo final. Como parte del complemento ampliSeqRNA, los recuentos de lectura sin procesar de los genes diana se realizan mediante el uso de samtools (samtools vista -c -F 4 -L bed_file bam_file). El complemento calcula automáticamente la normalización de ARN de Ion AmpliSeq para una muestra determinada como el número de lecturas asignadas por gen por millón de lecturas asignadas o RPM. Después esta cifra se transforma en lecturas normalizadas transformadas por log2 por millón, (nRPM).
El archivo BED personalizado tiene un formato que contiene las posiciones de nucleótidos de cada amplicón por transcripción en la referencia de mapeo. Las lecturas que se alinean con las ubicaciones de amplicón esperadas y cumplen los criterios de filtrado tales como la longitud mínima de alineación, se notifican como porcentaje de lecturas "válidas". "Dianas detectadas" se definen como el número de amplicones detectados (>10 recuentos de lectura) como porcentaje del número total de dianas.
Después del mapeo, alineación y normalización, el complemento AmpliSeqRNA proporciona datos sobre métricas de control de calidad, gráficos de visualización y recuentos normalizados por gen que corresponden a la información de expresión génica que incluye un enlace a un archivo descargable que detalla los recuentos de lectura por gen en una pestaña. archivo de texto delimitado. El número de lecturas que se alinean con una diana genética determinada representa un valor de expresión denominado "recuentos". Estos análisis complementarios adicionales incluyen la salida para cada código de barras del número de genes (amplicones) con al menos 1, 10, 100, 1000 y 10 000 conteos para permitir la determinación del intervalo dinámico y la sensibilidad por muestra.
Una tabla de resumen de la información anterior, que incluye las estadísticas de mapeo por código de barras del total de lecturas mapeadas, el porcentaje en el objetivo y el porcentaje de genes del panel detectados ("Objetivos detectados"), puede verse en el software Torrent Suite para evaluar rápidamente el rendimiento de la ejecución y la biblioteca.
Ejemplo 2
Análisis de la carga mutacional tumoral.
2.0 Medición de ADN
El ADN de una muestra de orina se cuantificó después de la extracción mediante el seguimiento del protocolo de la sección 1.3 anterior.
2.1 Preparación de la biblioteca
Las muestras de ADN se diluyeron a 5 ng/pl y se adicionaron a 5X Ion AmpliSeq Hifi (del kit de biblioteca plus Ion AmpliSeq™ (4488990), agua libre de nucleasas y se configuraron mediante el uso de dos conjuntos de cebadores de ADN (5 pl del conjunto 1 y 5 pl del conjunto 2) en una placa de 96 pocillos. El siguiente programa se ejecutó en el termociclador:
Después de la amplificación, los amplicones se digirieron parcialmente mediante el uso de 2 pl de LIB FuPa (del kit OT2 Ion 540™ (Cat: A27753)), se mezclaron bien y se colocaron en el termociclador con el siguiente programa:
4 |jl de solución de cambio*3, 2 |jl de códigos de barras Ion XPRESS 1-16 diluidos (Cat: 4471250) y 2 |jl de LIB ADN ligasa (de biblioteca kit plus Ion Ampliseq™ (4488990)) se adicionaron a cada muestra, mediante el mezclado completamente entre la adición de cada componente. El siguiente programa se ejecutó en el termociclador:
2.3 Purificación
Las bibliotecas se purificaron como en la sección 1.3 mediante el uso de 45 j l de Agencourt AMPure XP (Biomeck Coulter cat: A63881).
2.4 q-PCR
La cantidad de biblioteca se midió mediante el uso del kit de cuantificación Ion Library TaqMan (cat: 4468802). Se usaron tres diluciones en serie de 10 veces de la biblioteca de control deE. coliDH10B Ion (6,8 pmol, 0,68 pmol y 0,068 pmol) para crear la curva estándar. Cada muestra se diluyó 1/500 y cada muestra, estándar y control negativo se analizaron por duplicado. Se combinaron 10 j l de la mezcla maestra 2X TaqMan y 1 j l del ensayo 20X TaqMan en un pocillo de una placa de ciclo térmico rápido de 96 pocillos para cada muestra. Se adicionaron a la placa 9 j l de la muestra diluida 1/500, estándar o agua libre de nucleasas (control negativo) y se ejecutó la qPCR en la máquina ABI StepOnePlus™ (Cat: 4376600) mediante el uso del programa listado en la sección 1.5.
Las muestras se diluyeron a 100 pMol mediante el uso de los resultados de la q-PCR y se agruparon listas para la preparación de la plantilla. Después de esto, se realizaron la preparación de la plantilla, el enriquecimiento de la muestra y la secuenciación como se describe en las secciones 1.6, 1.7 y 1.8 respectivamente.
Ejemplo 3
Aplicación del algoritmo de puntuación de detección poligénica (PDS) a los resultados
Caso 1. Resultados obtenidos a partir de una muestra de un paciente con hematuria macroscópica.
Resultados del ensayo:
A. Mutación de punto crítico de SNV: BRAF (PDS= 1)
B. CNV: Amplificación de PD-L1T, amplificación de jAk2 (PDS= 2+2=4)
C. TMB= 5mut/MB (PDS=1)
D. Fusiones de genes: no se detecta fusión (PDS= 0)
E. La expresión génica
a. Alta expresión de PD-L1 (PDS= 3)
b. Firma de proliferación: alto MCM2-3-5, alto GEMININ, alto PLK1, alto FOXM1, alto BUB1 (PDS= 2) Puntuación del algoritmo PDS = 11
Indicativo de malignidad y posible respuesta a los inhibidores anti-PD-L1 (por ejemplo, durvalumab, pembrolizumab) e inhibidores de BRAF.
Genes regulados por el ciclo celular - Tabla 1
La detección de una mayor expresión de estos genes vinculados a la proliferación es indicativa de la presencia de cáncer de las vías genitourinarias
Mutaciones procesables en oncogenes y supresores de tumores, que incluyen los genes de fusión (Tabla 2, 3 y 4) Tabla 2: Variantes genéticas procesables: mutaciones puntuales en puntos críticos oncogénicos específicos y ni i n n r r m r lni ml .
continuación
continuación
Tabla 3: Variantes enéticas procesables - Fusiones.
Fusión de ABL1 Fusión de FGFR2-PLPP Fusión de ABL1-B Fusión de FGFR2-SLC4 Fusión de ALK Fusión de FGFR2-TAC Fusión de ALK-CLI Fusión de FGFR2-UBQ Fusión de ALK-CL Fusión de FGFR2-VCL Fusión de ALK-EM Fusión de FGFR3 Fusión de ALK-KIF Fusión de FGFR3-BAIA Fusión de ALK-NP Fusión de FGFR3-NSD Fusión de ALK-RA Fusión de FGFR3-TAC Fusión de ALK-ST Amplificación de FLT3 Fusión de ALK-TF Fusión de FLT3
Fusión de AXL Fusión de KRAS
Fusión de BRAF Mutación de exón 14 de Fusión de BRCA1 Mutación de omisión del exón 14 de MET Fusión de BRCA2 Fusión de MET
EGFR vIII Fusión de NTRK Fusión de FGFR Fusión de NTRK1 Fusión de FGFR1 Fusión de NTRK2 Fusión de FGFR1- Fusión de NTRK3 Fusión de FGFR2 Fusión de NUTM1 Fusión de FGFR2- Fusión de PDGFR Fusión de FGFR2- Fusión de PDGFR Fusión de FGFR2- Fusión de RAF1 Fusión de FGFR2- Fusión de RET Fusión de FGFR2- Fusión de RET-KI Fusión de FGFR2- Fusión de ROS1 Fusión de FGFR2- Fusión de RSPO3
Fusión de FGFR2-
Tabla 4: Variantes enéticas procesables - cambios en el número de copias.
Amplificación de AKT1 Amplificación de FGFR2 Amplificación de AKT2 Amplificación de FGFR3 Amplificación de ALK Amplificación de FGFR4 Eliminación de ATM Amplificación de KIT Amplificación de AXL Amplificación de KRAS Amplificación de BRAF Amplificación de MET Eliminación de BRCA1 Amplificación de MYC Eliminación de BRCA2 Amplificación de MYCL Amplificación de CCND Amplificación de MYCN Amplificación de CCN Amplificación de NTRK Amplificación de CCN Amplificación de PDGFR
Amplificación de CCNE Amplificación de PDGFR
continuación
Redes de señalización enlazadas al punto de control inmunológico de PD-L1 Tabla 5, 6 y 7 Tabla 5: Análisis de ARN - dianas de ex resión fusión
Tabla 6: Dianas genéticas del número de co ias
Tabla 7: Punto crítico de ADN y dianas de secuenciación de genes completos
T l . L n i n vir n l nlii l r m i nl mr l TMB.
continuación
Claims (17)
1. Un método para detectar o monitorear el cáncer de riñón, vejiga y/o próstata, dicho método comprende analizar el ácido nucleico obtenido de una muestra de orina de un sujeto, detectar la presencia de una aberración seleccionada de una variante de un nucleótido único, indel, eliminación, amplificación y/o fusión en una secuencia codificante, o aumento o disminución de la expresión génica a partir de una secuencia codificante, de al menos un biomarcador de cada una de las Tablas 1 a 7, así como también,
la carga mutacional tumoral (TMB), y relacionar la presencia de dichos biomarcadores con la presencia de malignidad en donde a los resultados obtenidos se les aplica un algoritmo indicativo de la presencia o nivel de malignidad en donde
se aplica una puntuación de '0' a los resultados que no muestran cambios sobre los perfiles de expresión normales o de tipo salvaje de los diversos biomarcadores;
se aplica una puntuación de '1' en caso de presencia de una mutación oncogénica en un gen biomarcador, o para la presencia de 2 a 3 copias adicionales de un gen biomarcador, o por la presencia de una fusión de gen oncogénico, o un cambio de hasta 500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de <10 mutaciones/Megabase;
se aplica una puntuación de '2' en el caso de la presencia de 4 a 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de 500 a 1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador;
se aplica una puntuación de '3' en el caso de la presencia de más de 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de >1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de >10 mutaciones/Megabase;
en donde una puntuación global de 0 es indicativa de ausencia de malignidad, una puntuación de 1 a 2 es indicativa de una malignidad con especificidad intermedia y alta sensibilidad, una puntuación de 3 a 5 es indicativa de una malignidad con alta especificidad y alta sensibilidad, y una puntuación superior a 6 es indicativa de malignidad con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra es una muestra fijada con formalina.
3. Un método de acuerdo con ya sea la reivindicación 1 o 2 que comprende, como etapa preliminar, extraer el ácido nucleico de la muestra.
4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde los resultados obtenidos también se usan para identificar la susceptibilidad de un sujeto a la terapia o tratamiento dirigido a PD-1 o PD-L1.
5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior en donde se detectan al menos 10 de los biomarcadores de las Tablas 1 a 7.
6. Un método de acuerdo con la reivindicación 5 en donde se detectan todos los biomarcadores enumerados en las Tablas 1 a 7.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el sujeto es un individuo aparentemente sano.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sujeto se ha diagnosticado previamente con cáncer de riñón, vejiga y/o próstata y está bajo tratamiento o terapia para el mismo, y en donde el método se lleva a cabo repetidamente en el tiempo, para monitorear la eficacia del tratamiento o terapia.
9. Un método de acuerdo con la reivindicación 8 en donde los resultados se usan para decidir modificar o ampliar dicho tratamiento o terapia.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el sujeto sufre de hematuria.
11. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se lleva a cabo mediante el uso de una plataforma de ensayo de alto rendimiento.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde los resultados se analizan para producir una recomendación personalizada para el tratamiento del cáncer.
13. Un sistema para la detección o monitorización del cáncer de riñón, vejiga y/o próstata, dicho sistema comprende:
un procesador; y
una memoria que almacena el código de un algoritmo que, cuando se ejecuta por el procesador, hace que el sistema informático:
reciba niveles de entrada de los biomarcadores de acuerdo con la reivindicación 1;
reciba un nivel de entrada adicional con relación a la carga mutacional tumoral de ácido nucleico en la muestra de orina;
analice y transforme los niveles de entrada a través de un algoritmo para proporcionar una salida que indique la presencia o el nivel de malignidad presente;
muestre la salida en una interfaz gráfica del procesador
en donde el algoritmo aplicado es:
se aplica una puntuación de '0' a los resultados que no muestran cambios sobre los perfiles de expresión normales o de tipo salvaje de los diversos biomarcadores;
se aplica una puntuación de '1' en caso de presencia de una mutación oncogénica en un gen biomarcador, o para la presencia de 2 a 3 copias adicionales de un gen biomarcador, o por la presencia de una fusión de gen oncogénico, o un cambio de hasta 500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de <10 mutaciones/Megabase;
se aplica una puntuación de '2' en el caso de la presencia de 4 a 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de 500 a 1500 nRPM en la expresión de a Rn de un gen biomarcador; se aplica una puntuación de '3' en el caso de la presencia de más de 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o cambio >1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de >10 mutaciones/Megabase;
en donde una puntuación global de 0 es indicativa de ausencia de malignidad, una puntuación de 1 a 2 es indicativa de una malignidad con especificidad intermedia y alta sensibilidad, una puntuación de 3 a 5 es indicativa de una malignidad con alta especificidad y alta sensibilidad, y una puntuación superior a 6 es indicativa de malignidad con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta.
14. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 13 en donde la memoria también comprende un código para proporcionar una recomendación personalizada para el tratamiento del sujeto, en base a los niveles de entrada.
15. Un sistema de acuerdo con la reivindicación 14 en donde la recomendación personalizada se muestra en una interfaz gráfica del procesador.
16. Un medio legible por ordenador no transitorio que almacena instrucciones que, cuando son ejecutadas por un procesador, hacen que un sistema informático detecte o monitorice el nivel de cáncer de riñón, vejiga y/o próstata en una muestra de orina de un sujeto, al:
recibir niveles de entrada de los biomarcadores de acuerdo con la reivindicación 1 y
recibir un nivel de entrada adicional con relación a la carga mutacional tumoral de ácido nucleico en la muestra de orina;
analizar y transformar los niveles de entrada a través de un algoritmo para proporcionar una salida que indique la presencia o el nivel de malignidad presente;
mostrar la salida en una interfaz gráfica del procesador
en donde el algoritmo aplicado es:
se aplica una puntuación de '0' a los resultados que no muestran cambios sobre los perfiles de expresión normales o de tipo salvaje de los diversos biomarcadores;
se aplica una puntuación de '1' en caso de presencia de una mutación oncogénica en un gen biomarcador, o para la presencia de 2 a 3 copias adicionales de un gen biomarcador, o por la presencia de una fusión de gen oncogénico, o un cambio de hasta 500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de <10 mutaciones/Megabase;
se aplica una puntuación de '2' en el caso de la presencia de 4 a 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o para un cambio de 500 a 1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador; se aplica una puntuación de '3' en el caso de la presencia de más de 8 copias adicionales de un gen biomarcador; o cambio >1500 nRPM en la expresión de ARN de un gen biomarcador, o por una TMB de >10 mutaciones/Megabase;
en donde una puntuación global de 0 es indicativa de ausencia de malignidad, una puntuación de 1 a 2 es indicativa de una malignidad con especificidad intermedia y alta sensibilidad, una puntuación de 3 a 5 es indicativa de una malignidad con alta especificidad y alta sensibilidad, y una puntuación superior a 6 es indicativa de malignidad con una especificidad muy alta y una sensibilidad muy alta.
17. Un medio legible por ordenador no transitorio de acuerdo con la reivindicación 16 que también almacena instrucciones para desarrollar una recomendación personalizada para el tratamiento del sujeto en base a los niveles de entrada y muestra la recomendación personalizada en una interfaz gráfica del procesador.
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