ES2957959T3 - Métodos de aislamiento de secuencias de receptores de células T específicos de neoantígenos - Google Patents
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Abstract
Se describen métodos para aislar secuencias de cadenas alfa y beta del receptor de células T (TCR) emparejadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas. También se describen métodos para identificar automáticamente las secuencias del segmento V de las cadenas alfa y beta de TCR y las secuencias de CDR3 de un TCR que tiene especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer. También se describen métodos para preparar una población de células que expresan secuencias de cadenas alfa y beta de TCR emparejadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas. También se describen pares aislados de secuencias de cadenas alfa y beta de TCR y poblaciones aisladas de células preparadas mediante los métodos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos de aislamiento de secuencias de receptores de células T específicos de neoantígenosReferencia cruzada a la solicitud relacionada
Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/479.398, presentada el 31 de marzo de 2017.
Declaración sobre investigación y desarrollo patrocinado federalmente
Esta invención se realizó con apoyo del gobierno bajo el número de proyecto ZIABC010985 otorgado por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.
Material presentado electrónicamente
Junto con el presente documento se presenta simultáneamente una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador e identificada tal como sigue: Un archivo ASCII (texto) de 5.530 bytes denominado “737921SeqUsting_ST25.txt”, con fecha del 22 de marzo de 2018.
Antecedentes de la invención
La terapia celular adoptiva (ACT) usando células que se han modificado genéticamente para expresar un receptor de células T (TCR) específico de un antígeno de cáncer (por ejemplo, neoantígeno) puede producir respuestas clínicas positivas en algunos pacientes con cáncer. El documento WO 2016/053338 A1 da a conocer métodos de aislamiento de receptores de células T que tienen especificidad antigénica para una mutación específica de cáncer. Guoet al.,Mol Ther Methods Clin Dev., 27 de enero de 2016;3 dan a conocer la clonación, expresión y caracterización funcional rápidas de cadenas de receptores de células T ap y y8 a partir de análisis de células individuales. No obstante, sigue habiendo obstáculos para el uso exitoso de células modificadas genéticamente con TCR para el tratamiento generalizado de cáncer y otras enfermedades. Por ejemplo, los TCR que reconocen específicamente antígenos de cáncer (por ejemplo, neoantígenos) pueden ser difíciles de identificar y/o aislar de un paciente. Por consiguiente, existe la necesidad de métodos mejorados de obtención de TCR reactivos con cáncer (por ejemplo, reactivos con neoantígenos).
Breve sumario de la invención
Una realización de la invención proporciona un método de aislamiento de secuencias de cadenas alfa y beta de receptores de células T (TCR) apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, comprendiendo el método: (a) aislar, a partir de una muestra biológica, células T que tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer; (b) cocultivar las células T aisladas con células presentadoras de antígenos (APC) que presentan la secuencia de aminoácidos mutada de modo que las células T expresan uno o más marcadores de activación de células T; (c) clasificar las células T cocultivadas en muestras de células T individuales separadas; (d) aislar ARNm de cada muestra de células T individuales separada; (e) secuenciar el ARNm de cada muestra de células T individuales separada, en donde la secuenciación comprende: (i) producir ADNc a partir del ARNm y amplificar el ADNc; (ii) producir múltiples fragmentos del ADNc amplificado y etiquetar los múltiples fragmentos; (iii) amplificar los múltiples fragmentos etiquetados del ADNc; y (iv) secuenciar los múltiples fragmentos etiquetados y amplificados del ADNc; en donde la secuenciación identifica las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc; (f) alinear las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una secuencia conocida del uno o más marcadores de activación de células T para identificar qué muestra de células T individuales contenía una única célula T que expresaba el uno o más marcadores de activación de células T; (g) alinear las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de segmento variable (V) de cadena alfa de TCR y secuencias de segmento V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc de cada muestra de células T individuales separada que se identificó en (f) que expresaba uno o más marcadores de activación de células T; (h) identificar secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas en (g) y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas en (g); (i) contar el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta; (j) recoger el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, en donde la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc, para identificar las secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR; (k) identificar la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j), la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR; y (l) ensamblar una o más secuencias de nucleótidos que codifican para: una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida en (j) y una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida en (j), opcionalmente ensamblar una o más segundas secuencias de nucleótidos que codifican para: una segunda cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc identificados en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) y la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida en (j) para producir secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o una porción de unión a antígeno de las mismas.
Otra realización de la invención proporciona un método de identificación automática de las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de receptor de células T (TCR) y secuencias de CDR3 de un TCR que tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer, comprendiendo el método: (a) recibir, en un dispositivo informático de usuario, secuencias de múltiples fragmentos de ADNc, en donde el ADNc está codificado por ARNm producido por una única célula T tras el cocultivo de la célula T con células presentadoras de antígenos (APC) que presentan la secuencia de aminoácidos mutada de modo que la célula T expresa uno o más marcadores de activación de células T; (b) realizar una alineación computarizada de las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de segmento variable (V) de cadena alfa de TCR y secuencias de segmento V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc; (c) realizar una identificación computarizada de secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas en (b) y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas en (b); (d) realizar un recuento computarizado del número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta; (e) realizar una recogida computarizada del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, en donde la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc para identificar las secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR; y (f) realizar una identificación computarizada de la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e), la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e) y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e) para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR.
Otra realización de la invención proporciona un método de preparación de una población de células que expresa secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, comprendiendo el método: aislar secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, según cualquiera de los métodos de la invención descritos en el presente documento, e introducir una secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en células huésped para obtener células que expresan las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o la porción de unión a antígeno de las mismas.
Se definen realizaciones específicas adicionales en las reivindicaciones 2-8, 10-11 y 13-15.
Breve descripción de las varias vistas del/de los dibujo(s)
La figura 1 es un esquema que ilustra un método de identificación de TIL reactivos con neoantígenos.
La figura 2 es un esquema que ilustra un método de identificación de TCR específicos de neoantígenos.
La figura 3A y figura 3B son gráficos que muestran el porcentaje de lecturas de IFN-y (A) e IL-2 (B) dentro de las lecturas R1 totales medidas en células T 4090 F7 que se cocultivaron con DC autólogas pulsadas con TMG-5 durante 4 h y luego se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales.
La figura 3C es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T del donante que no se transdujeron (barras no sombreadas) o se transdujeron con el 4090 TCR (barras sombreadas) tras el cocultivo con DC pulsadas con TMG-5 o TMG-6. DC no pulsadas con TMG (“sin”) sirvieron como control negativo.
La figura 3D es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por 4090 células T transducidas con TCR tras el cocultivo con 4090 DC que se habían pulsado con un péptido de 25 meros mutado correspondiente a uno de los minigenes indicados de TMG-5.
La figura 3E es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T transducidas con 4090 TCR tras el cocultivo con 4090 DC que se habían pulsado con la concentración indicada (conc.) (|iM) de péptido USP8 de 25 meros purificado WT (círculos blancos) o mutado (círculos negros).
La figura 4A y figura 4B son gráficos que muestran el porcentaje de lecturas de IFN-y (A) e IL-2 (B) dentro de las lecturas R1 totales medidas en células T 4095 F5 que se cocultivaron con DC autólogas pulsadas con TMG-1 durante 4 h y luego se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales.
La figura 4C es un gráfico que muestra el porcentaje de lecturas de IFN-y e IL-2 dentro de las lecturas R1 totales medidas en la célula individual que expresaba lecturas de IL-2 detectables en la figura 4B.
La figura 4D es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T del donante que no se transdujeron (barras no sombreadas) o se transdujeron con el 4095 TCR (barras sombreadas) tras el cocultivo con DC pulsadas con ARNm de KRAS WT de longitud completa o mutado. DC no pulsadas con péptido (“sin”) sirvieron como control negativo.
La figura 4E es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T transducidas con 4095 TCR tras el cocultivo con 4095 DC que se habían pulsado con las concentraciones indicadas (|iM) de un péptido KRAS de 9 meros purificado WT (círculos blancos) o mutado (círculos negros).
La figura 5A y figura 5B son gráficos que muestran el porcentaje de lecturas de IFN-y (A) e IL-2 (B) dentro de las lecturas R1 totales medidas en células T 4112 F5 que se cocultivaron con DC autólogas pulsadas con TMG-9 durante 4 h y luego se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales.
La figura 5C es un gráfico que muestra el porcentaje de lecturas de IFN-y e IL-2 dentro de las lecturas R1 totales medidas en las 8 células individuales que expresaban lecturas de IL-2 detectables en la figura 5B.
La figura 5D es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T del donante que no se transdujeron (barras no sombreadas) o se transdujeron con las 4112 TCR (barras sombreadas) tras el cocultivo con DC pulsadas con TMG-9 o TMG-10. DC no pulsadas con péptido (“sin”) sirvieron como control negativo.
La figura 5E es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T transducidas con 4112 TCR tras el cocultivo con células B transformadas con EBV pulsadas con uno de los conjuntos indicados (SPP-1 a SPP-10) de péptidos cortos. Células B transformadas con EBV no pulsadas con péptido (“sin”) sirvieron como control negativo.
La figura 5F es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T transducidas con 4112 TCR tras el cocultivo con células B transformadas con EBV pulsadas con SPP-9 o uno de los péptidos cortos indicados VWDALFADGLSLCL (SEQ ID NO: 18; WRRVAWSYDSTLL (SEQ ID NO: 19 WSYDSTLL (SEQ ID NO: 20; WSYDSTLLA (SEQ ID NO: 21; WSYDSTLLAY (SEQ ID NO: 22; ILALVDKNIIGY (SEQ ID NO: 23; o YSEPDVSGK (SEQ ID NO: 24. Células B transformadas con EBV no pulsadas con péptido (“sin”) sirvieron como control negativo.
La figura 5G es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) secretada por células T transducidas con 4112 TCR tras el cocultivo con células B transformadas con EBV pulsadas con el péptido de NBAS mutado purificado (círculos negros) WSYDSTLLAY (C>S) (SEQ ID NO: 4) o su homólogo WT (círculos blancos).
La figura 6 es un diagrama de bloques que ilustra un sistema que puede usarse según algunas realizaciones de la invención.
La figura 7 es un diagrama de bloques que ilustra componentes de un dispositivo informático que puede usarse según una realización de la invención.
La figura 8 es un diagrama de flujo de etapas del método para identificar automáticamente las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de receptor de células T (TCR) y secuencias de CDR3 de un TCR que tiene especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer, según una realización de la invención.
La figura 9A es un gráfico que muestra el número de puntos positivos para IFN-y detectados después de examinar células T TII,4171F6 frente a una biblioteca de conjuntos de péptidos de 25 meros de longitud (PP) que codifican para mutaciones en un ensayo ELISPOT. Células T tratadas con anticuerpo OKT3 sirvieron como control positivo. Células T no cultivadas con el conjunto de péptidos (sin) sirvieron como control negativo.
Las figuras 9B y 9C son gráficos que muestran la expresión de IFN-y (FPKM (fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas)) (figura 9B) e IL-2 (figura 9C) por células T TIL 4171 F6 tras el cocultivo con DC autólogas pulsadas con PP-3.
La figura 9D es un gráfico de dispersión bidimensional que combina los datos de las figuras 9B y 9C que muestra la relación de la expresión de IFN-y e IL-2 en cada célula individual (cada punto representa una única célula).
La figura 9E es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) producida tras el cocultivo de células no transducidas (barras no sombreadas) o transducidas con 4171TCR (barras sombreadas) con DC pulsadas con PP. Células T no cultivadas con el conjunto de péptidos (sin) sirvieron como control negativo.
La figura 9F es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) producida tras el cocultivo de células T transducidas con 4171 TCR con DC pulsadas con los péptidos indicados. Células T no cultivadas con el conjunto de péptidos (sin) sirvieron como control negativo.
La figura 9G es un gráfico que muestra la cantidad de IFN-y (μg/ml) producida tras el cocultivo de células T transducidas con 4171 TCR con DC pulsadas con la concentración indicada (|iM) de péptido SIN3A WT (círculos blancos) o mutado (círculos negros).
Descripción detallada de la invención
Una realización de la invención proporciona un método de aislamiento de secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas.
Los métodos de la invención pueden abordar cualquiera de una variedad de diferentes desafíos para la identificación y el aislamiento de TCR funcionales que tienen la especificidad antigénica deseada. Estos desafíos pueden incluir, por ejemplo, la gran diversidad de secuencias de TCR, la necesidad de que las cadenas de TCRa y p se apareen correctamente con el fin de proporcionar la especificidad antigénica deseada, y que hasta aproximadamente un tercio de las células T maduras pueden expresar dos cadenas TCRa funcionales, mientras que solo una de las cadenas de TCRa probablemente tenga la especificidad deseada.
Los métodos de la invención pueden proporcionar cualquiera de una variedad de ventajas. Por ejemplo, los métodos de la invención pueden reducir significativamente el tiempo y/o coste que es necesario para aislar e identificar la secuencia de a TCR que tiene especificidad antigénica por un antígeno de cáncer (por ejemplo, un neoantígeno) después de que se retire una muestra biológica (por ejemplo, muestra tumoral) de un paciente. Después de que la secuencia de TCR se aísle y se identifique, pueden transducirse células huésped (por ejemplo, células T autólogas) con la secuencia de TCR, pueden ampliarse los números de células transducidas y los números expandidos de células transducidas pueden administrarse al paciente para el tratamiento y/o la prevención de cáncer. Los métodos de la invención pueden (i) identificar tanto el antígeno de cáncer como y la secuencia del TCR que reconoce el antígeno de cáncer y/o (ii) facilitar una terapia con TCR sumamente personalizada que selecciona como diana antígenos de cáncer (por ejemplo, neoantígenos). Además, los métodos de la invención pueden, ventajosamente, requerir menos tiempo, ser menos laboriosos y tener una tasa de éxito superior en comparación con métodos de aislamientos de secuencias de TCRa/p apareadas usando clonación de células T mediante dilución limitante. Los métodos de la invención también pueden hacer posible identificar eficientemente el par correcto de cadenas alfa y beta de TCR en las células T que tienen más de un gen de TCRa funcional. Los métodos de la invención pueden también identificar y aislar secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas (que tienen la especificidad de antígeno deseada) a partir de una a población de células T sumamente diversa.
El TCR ap es un heterodímero que se compone de cadenas de proteínas a y p. Cada cadena incluye dos dominios extracelulares, la región variable (V) y la región constante (C), seguido por una región transmembrana y una cola citoplasmática corta. El dominio variable de cada una de la cadena a y cadena p de TCR tienen tres “regiones determinantes de complementariedad” (CDR1, CDR2 y CDR3) que entran en contacto con y reconocen complejos de péptido-MHC. En particular, las CDR3 de a y p son responsables de reconocer el antígeno procesado. De una célula T a otra, existe un grado extremadamente alto de polimorfismo en las secuencias de aminoácidos la CDR3a y CDR3p. Este nivel de polimorfismo es necesario para que las células T reconozcan el amplio alcance de antígenos con los que se enfrente el sistema inmunitario. El polimorfismo en las secuencias de aminoácidos de la CDR3a y CDR3p resultan de reordenamientos del ADN dentro de los genes de TCR a y p que se producen durante la maturación de una célula T.
Los genes que codifican para el TCR están constituidos por casetes de una secuencia codificante denominados “segmento V” y “segmento J” en el gen de TCR a y un “segmento V”, un “segmento D” y a “segmento J” en la cadena de TCR p. El reordenamiento estocástico en el ADN genómico da como resultado la yuxtaposición de estos segmentos de ADN dando como resultado un gen de TCR funcional. Estos reordenamientos pueden ser imprecisos y las uniones de los segmentos Va-Ja y Vp-Dc-Jp puede ser sumamente variable. La CDR3 de la cadena alfa está codificada por una porción del segmento V y la totalidad del segmento J. La CDR3 de la cadena beta está codificada por una porción del segmento V, la totalidad del segmento J y la totalidad del segmento D.
El método comprende aislar, a partir de una muestra biológica, células T que tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer. Puede usarse cualquier muestra biológica adecuada. En una realización de la invención, la muestra biológica es una muestra de tumor o una muestra de sangre periférica. Los ejemplos de muestras biológicas que pueden usarse según la invención incluyen, sin limitación, tejido de tumores primarios, tejido del sito de tumores metastásicos, exudados, derrames, ascitis, células de sangre periférica fraccionada, médula ósea, capa leucocitaria de sangre periférica y líquido cefalorraquídeo. Como tal, la muestra biológica puede haberse obtenido por cualquier medio adecuado, incluidos, sin limitación, aspiración, biopsia, resección, punción venosa, punción arterial, punción espinal lumbar, derivaciones, cateterización o la colocación de un drenaje.
Las células T que se aíslan de la muestra biológica tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer. La frase “especificidad antigénica”, tal como se usa en el presente documento, significa que un TCR, o la porción de unión a antígeno del mismo, puede unirse específicamente a y reconocer inmunológicamente la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer. La mutación específica de cáncer puede ser cualquier mutación en cualquier gen que codifique para una secuencia de aminoácidos mutada (también denominada “mutación no silenciosa”) y que se expresa en una célula cancerosa pero no en una célula normal no cancerosa. Se describen métodos de aislamiento de células T que tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer en, por ejemplo, los documentos WO 2016/053338 y WO 2016/053339. Por ejemplo, el aislamiento de células T que tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer puede comprender: identificar uno o más genes en el ácido nucleico de una célula cancerosa de un paciente, conteniendo cada gen una mutación específica de cáncer que codifica para una secuencia de aminoácidos mutada; inducir a células presentadoras de antígenos (APC) autólogas del paciente para que presenten la secuencia de aminoácidos mutada; cocultivar células T autólogas del paciente con las APC autólogas que presentan la secuencia de aminoácidos mutada; y seleccionar las células T autólogas que (a) se cocultivaron con las APC autólogas que presentan la secuencia de aminoácidos mutada y (b) tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada presentada en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) expresada por el paciente para proporcionar células T aisladas que tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer.
Una vez aisladas las células T que tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer, el método de la invención comprende además cocultivar esas células T aisladas con APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada de modo que las células T expresen uno o más marcadores de activación de células T. Las APC pueden incluir cualquier célula que presente fragmentos peptídicos de proteínas en asociación con moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en su superficie celular. Las APC pueden incluir, por ejemplo, uno cualquiera o más de macrófagos, células dendríticas (DC), células de Langerhans, linfocitos B y células T. Preferiblemente, las APC son DC. Puede usarse uno cualquiera o más de una variedad de marcadores de activación de células T para identificar las células T que tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada. Los ejemplos de marcadores de activación de células T incluyen, pero no se limitan a, uno cualquiera o más de muerte celular programada 1 (PD-1), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3), dominio de mucina e inmunoglobulina de células T 3 (TIM-3), 4-1BB, OX40, CD107a, granzima B, interferón (IFN)-y, interleucina (IL)-2, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-17 e IL-22.
El método comprende además clasificar las células T cocultivadas en muestras de células T individuales separadas y aislar ARNm de cada muestra de células T individuales separada. La clasificación en muestras de células T individuales separadas y el aislamiento de ARNm pueden estar automatizados. Por ejemplo, la clasificación en muestras de células T individuales separadas y el aislamiento del ARNm pueden llevarse a cabo usando un sistema de aislamiento y preparación de células individuales automatizado FLUIDIGM C1 (disponible de Fluidigm, South San Francisco, CA). El método de la invención puede proporcionar, ventajosamente, cualquier número de muestras de ARNm de células individuales separadas (por ejemplo, aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 11, aproximadamente 12, aproximadamente 13, aproximadamente 14, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 25, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000 o más, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores). En una realización de la invención, el método comprende preparar aproximadamente 96 muestras de ARNm de células individuales separadas.
En una realización de la invención, el método puede comprender además marcar el ARNm de cada muestra de células T individuales separada con una etiqueta diferente (por ejemplo, código de barras) para cada muestra de células T individuales separada. Por ejemplo, el ARNm de cada muestra de células T individuales separada puede marcarse usando el kit de preparación de biblioteca de ADN ILLUMINA NEXTERA XT (disponible en Illumina, San Diego, CA).
El método de la invención comprende además secuenciar el ARNm de cada muestra de células T individuales separada. Los ejemplos preferidos de técnicas de secuenciación que pueden ser útiles en los métodos de la invención incluyen secuenciación de última generación (NGS) (también denominada “tecnología de secuenciación masiva paralela” o “secuenciación profunda”) o secuenciación de tercera generación. NGS se refiere a tecnologías de secuenciación de ADN de alto rendimiento no basadas en Sanger. Con NGS, pueden secuenciarse millones o miles de millones de cadenas de ADN en paralelo, produciendo un rendimiento sustancialmente mayor y minimizando la necesidad de métodos de clonación de fragmentos que a menudo se usan en la secuenciación de genomas de Sanger. En NGS, pueden leerse moldes de ácido nucleico aleatoriamente en paralelo a lo largo de todo el genoma rompiendo todo el genoma en pequeños trozos. Ventajosamente, la NGS puede proporcionar información de secuencia de ácido nucleico de cada muestra de ARNm de células T individuales separada en períodos de tiempo muy cortos, por ejemplo, en el plazo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas, preferiblemente en el plazo de aproximadamente 1 a aproximadamente 7 días, o más preferiblemente, en el plazo de menos de aproximadamente 24 horas. Pueden usarse múltiples plataformas de NGS que están disponibles comercialmente o que se describen en la bibliografía en el contexto de los métodos de la invención, por ejemplo, las descritas en Zhanget al.,J. Genet. Genomics, 38(3): 95-109 (2011) y Voelkerdinget al.,Clinical Chemistry, 55: 641-658 (2009).
Los ejemplos no limitativos de tecnologías y plataformas de NGS incluyen secuenciación por síntesis (también conocida como “pirosecuenciación”) (tal como se implementa, por ejemplo, usando el secuenciador de genoma GS-FLX 454, 454 Life Sciences (Branford, CT), el analizador del genoma ILLUMINA SOLEXA (Illumina Inc., San Diego, CA), el analizador del genoma ILLUMINA HISEQ 2000 (Illumina) o el sistema ILLUMINA MISEQ (Illumina) o tal como se describe, por ejemplo, en Ronaghiet al.,Science, 281(5375): 363-365 (1998)), secuenciación por ligación (tal como se implementa, por ejemplo, usando la plataforma SOLID (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA) o la plataforma POLONATOR G.007 (Dover Systems, Salem, NH)), secuenciación de una sola molécula (tal como se implementa, por ejemplo, usando el sistema PACBIO RS (Pacific Biosciences (Menlo Park, CA) o la plataforma HELISCOPE (Helicos Biosciences (Cambridge, MA)), nanotecnología para secuenciación de una sola molécula (tal como se implementa, por ejemplo, usando la plataforma GRIDON de Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido), las plataformas de secuenciación de nanoporos asistida por hibridación (HANS) desarrolladas por Nabsys (Providence, RI) y la plataforma de secuenciación de ADN basada en ligasa con tecnología de nanobolas de ADN (DNB) denominada sonda-ligación de anclaje (cPAL)), tecnología basada en microscopía electrónica para la secuenciación de una sola molécula y secuenciación por semiconductores de iones.
A este respecto, la secuenciación del ARNm de cada muestra de células T individuales separada comprende producir ADNc a partir del ARNm y amplificar el ADNc, producir múltiples fragmentos del ADNc amplificado y etiquetar los múltiples fragmentos, amplificar los múltiples fragmentos etiquetados del ADNc y secuenciar los múltiples fragmentos amplificados y etiquetados del ADNc. El etiquetado puede comprender añadir una secuencia de nucleótidos a cada fragmento múltiple de modo que los múltiples fragmentos puedan distinguirse entre sí. La secuenciación identifica las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc. La secuencia de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc también se denomina “lectura”. La secuenciación del ARNm puede generar cualquier número de lecturas. Por ejemplo, la secuenciación del ARNm puede generar aproximadamente 1.000.000 de lecturas, aproximadamente 900.000 lecturas, aproximadamente 800.000 lecturas, aproximadamente 700.000 lecturas, aproximadamente 600.000 lecturas, aproximadamente 500.000 lecturas, aproximadamente 400.000 lecturas, aproximadamente 300.000 lecturas, aproximadamente 200.000 lecturas, aproximadamente 100.000 lecturas, o más, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores, para cada muestra de células T individuales. En muchas plataformas de NGS, puede haber dos direcciones de lectura: una es lectura directa (también denominada “lectura 1” o “R1”) y la otra es lectura inversa (también denominada “lectura 2” o “R2”). Para un fragmento de ADNc, R1 y R2 pueden complementarse entre sí. En una realización de la invención, el método comprende medir solo lecturas R1, solo lecturas R2 o tanto lecturas R1 como R2. R1 puede tener una calidad de secuenciación mayor que R2. Preferiblemente, el método comprende medir solo lecturas R1.
El método comprende además alinear las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una secuencia conocida de uno o más marcadores de activación de células T para identificar qué muestra de células T individuales contenía una única célula T que expresaba uno o más marcadores de activación de células T. La una o más células T individuales que expresaban uno o más marcadores de activación de células T después del cocultivo con las APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer se identifican como que expresan un TCR que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer.
El método comprende además alinear las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de región variable (V) de cadena alfa de TCR y secuencias de región V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc de cada muestra de células T individuales separada que se identificó que expresaba uno o más marcadores de activación de células T. En este sentido, las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc se alinean frente a secuencias de segmento variable de TCR conocidas con el fin de identificar qué fragmentos de ADNc contienen la totalidad o una porción de la secuencia de segmento variable y localizar la posición aproximada del extremo 3' de la secuencia de segmento variable en el/los fragmento(s) de ADNc. El extremo 3' de la secuencia de segmento variable indica la ubicación aproximada de la CDR3.
La base de datos de secuencias de TCR de referencia puede ser cualquier base de datos de secuencias de TCR de referencia adecuada. Un ejemplo de una base de datos de secuencias de TCR de referencia puede incluir secuencias obtenidas de la base de datos del sistema de información internacional IMMUNOGENETICS (IMGT) (//www.imgt.org), descrita en Lefrancet al.,Nucleic Acids Res., 43: D413-422 (2015). La alineación de las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con la base de datos de secuencias de TCR de referencia puede llevarse a cabo, por ejemplo, usando el paquete de software Burrows-Wheeler Aligner (BWA) (//bio-bwa.sourceforge.net/), descrito en Liet al.,Bioinformatics, 25: 1754-60 (2009) y Liet al.,Bioinformatics, 26(5): 589-95 (2010).
El método comprende además identificar secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas. La secuencia de región CDR3 puede identificarse de cualquier manera adecuada. En una realización de la invención, la identificación de secuencias de CDR3 de TCR se lleva a cabo identificando secuencias de ADNc que codifican para residuos de aminoácido conservados situados cerca del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que está codificada por el segmento V de las cadenas alfa y beta. Por ejemplo, la identificación de una secuencia de CDR3 de TCR puede llevarse a cabo identificando cualquier secuencia de ADNc que codifique para el motivo de secuencia de aminoácidos de YX<1>CX<2>X<3>X<4>X<5>X<6>X<7>X<8>X<9>X<10>X<11>X<12>X<13>X<14>X<15>X<16>X<17>X<18>X<19>X<20>X<21>X<22>(SEQ ID NO: 5), en donde cada uno de X<1>-X<9>es cualquier aminoácido que se produzca de manera natural, cada uno de X<10>-X<21>no es un aminoácido o es cualquier aminoácido que se produzca de manera natural y X<22>es fenilalanina o triptófano. El motivo de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 es un motivo de secuencia de aminoácidos conservado situado cerca del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos codificada por el segmento V.
En una realización de la invención, el método comprende además identificar la secuencia de región constante (C) de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos y la secuencia de región C de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos. Opcionalmente, el método comprende además identificar la secuencia de región C de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos. Una cadena alfa de TCR tiene una secuencia de aminoácidos de región constante posible. Una cadena beta de TCR tiene una de dos secuencias de aminoácidos de región constante posibles.
El método comprende además contar el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta.
El método comprende además recoger el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa para identificar secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR. La secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc. Las secuencias de CDR3 identificadas pueden incluir la secuencia de CDR3 de cadena beta y la secuencia de CDR3 de cadena alfa del TCR que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer y, opcionalmente, una secuencia de CDR3 de cadena alfa adicional expresada por la célula T pero que no se aparea con la secuencia de CDR3 de cadena beta para formar el TCR que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer. Se estima que aproximadamente un tercio de las células T maduras pueden expresar dos cadenas alfa de TCR. Solo una de las cadenas alfa expresadas se apareará con la cadena beta de TCR expresada para proporcionar una TCR que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos codificada por la mutación específica de cáncer.
El método comprende además identificar la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos, la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos para identificar secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR. El número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la secuencia de CDR3 del TCR dominante expresado por una única célula T activada superará en número al número de fragmentos de ADNc que codifican para cualquier otra secuencia de CDR3 de TCR que puede presentarse debido a contaminación en un factor de aproximadamente 10 a aproximadamente 100. La fuente de la contaminación puede ser muestras de células individuales cercanas o fuentes desconocidas. El TCR dominante expresado por la única célula T, que expresaba uno o más marcadores de activación de células T en respuesta al cocultivo con APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada, es un TCR que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer.
El método comprende además ensamblar una o más secuencias de nucleótidos que codifican para una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida y una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida. Los diversos múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 pueden ser de diversas longitudes y pueden solaparse entre sí. Al alinear los diversos múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa de diversas longitudes entre sí, puede determinarse la secuencia de todo el segmento V, segmento J y, opcionalmente, la región constante, de la cadena alfa de TCR dominante. Al alinear los diversos múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta de diversas longitudes entre sí, puede determinarse la secuencia de todo el segmento V, segmento J, segmento D y, opcionalmente, la región constante, de la cadena beta de TCR dominante. Una secuencia de nucleótidos que codifica para todo el segmento V, segmento J y, opcionalmente, la región constante, de la cadena alfa de TCR dominante y una secuencia de nucleótidos que codifica para todo el segmento V, segmento J, segmento D y, opcionalmente, la región constante, de la cadena beta de TCR dominante pueden ensamblarse usando técnicas de rutina. Pueden producirse secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o una porción de unión a antígeno de las mismas.
En una realización de la invención, el ensamblaje de una o más secuencias de nucleótidos comprende ensamblar una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada en la muestra, la secuencia de región C de cadena alfa de TCR identificada en la muestra y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida y ensamblar una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en la muestra, la secuencia de región C de cadena beta de TCR identificada en la muestra y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida. En este sentido, las secuencias de nucleótidos ensambladas pueden comprender una secuencia de región C endógena.
En una realización de la invención, el ensamblaje de una o más secuencias de nucleótidos comprende ensamblar una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada en la muestra, una secuencia de región C de cadena alfa de TCR exógena y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida y ensamblar una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en la muestra, una secuencia de región C de cadena beta de TCR exógena y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida. Una secuencia de región C exógena es una secuencia de región C que no es nativa para (que no se produce de manera natural en) la célula T. En este sentido, la secuencia de cadena alfa y beta de TCR apareada aislada, o una porción de unión a antígeno de la misma, producida mediante el método puede ser un TCR quimérico híbrido compuesto por secuencias de aminoácidos derivadas de TCR de dos especies de mamífero diferentes. Por ejemplo, el TCR puede comprender una región variable derivada de un TCR humano y una región constante de un t Cr de ratón de manera que el TCR esté “murinizado”. Se describen métodos de preparación de TCR quiméricos o híbridos en, por ejemplo, Cohenet al.,Cancer Res., 66: 8878-8886 (2006); Cohenet al.,Cancer Res., 67: 3898-3903 (2007); y Haga-Friedmanet al.,J. Immunol., 188: 5538-5546 (2012)).
Una única célula T normalmente expresa una cadena beta de TCR y una o dos cadenas alfa de TCR. La presencia de más de una cadena beta de TCR en una única muestra puede ser el resultado de la clasificación imperfecta de las células T en muestras de células T separadas. La clasificación imperfecta puede dar como resultado que dos o más células T inadvertidamente en una muestra. Si se encuentra que una única muestra expresa más de una cadena beta de TCR, esa muestra puede eliminarse del análisis posterior.
Tal como se comentó anteriormente, se estima que aproximadamente un tercio de las células T maduras pueden expresar dos cadenas alfa de TCR. Solo una de las cadenas alfa expresadas se apareará con la cadena beta de TCR expresada para proporcionar un TCR que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos codificada por la mutación específica de cáncer. Con el fin de determine qué cadena alfa de TCR se aparea con la cadena beta de TCR para proporcionar la especificidad deseada, el método puede comprender ensamblar una primera secuencia de nucleótidos que codifica para una primera cadena alfa de TCR que comprende la primera secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc identificada tal como se describe en el presente documento y la primera secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida tal como se describe en el presente documento y una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada tal como se describe en el presente documento y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida tal como se describe en el presente documento. El método pude comprender además opcionalmente ensamblar una o más segundas secuencias de nucleótidos que codifican para: una segunda cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc identificada y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogida y la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida.
El método puede comprender además independientemente introducir las secuencias de nucleótidos primera y segunda en poblaciones primera y segunda de células huésped, respectivamente, y cocultivar independientemente las poblaciones primera y segunda de células huésped con APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer. El método puede comprender además seleccionar la población de células huésped que (a) se cocultivaron con las APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada y (b) tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada. La población cocultivada de células huésped que tiene especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada expresará la cadena alfa de TCR que, junto con la cadena beta de TCR, proporciona la especificidad deseada.
Pueden identificarse células que tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada por cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, pueden identificarse células que tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada basándose en la expresión de uno o más marcadores de activación de células T y/o una o más citocinas, tal como se describe en, por ejemplo, los documentos WO 2016/053338 y WO 2016/053339. Los marcadores de activación de células T pueden ser tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. La citocina puede comprender cualquier citocina cuya secreción por una célula T es característica de la activación de células T (por ejemplo, un TCR expresado por las células T que se une específicamente a y que reconoce inmunológicamente la secuencia de aminoácidos mutada). Los ejemplos no limitativos de citocinas, cuya secreción es característica de la activación de células T, incluyen IFN-y, IL-2, granzima B y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-17 e IL-22.
En algunas realizaciones, una o más etapas de los métodos de la invención se llevan a cabo usando un sistema de software. En este sentido, una realización de la invención proporciona un método de identificar automáticamente las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR y secuencias de CDR3 de un TCR que tiene especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer.
La figura 6 es un diagrama de bloques de un sistema no reivindicado 100 que puede usarse según determinadas realizaciones de la invención. El sistema 100 puede incluir una o más dispositivos informáticos secuenciadores 101, un dispositivo informático de usuario 103 y una conexión de red 102 entre el dispositivo informático de usuario 103 y el dispositivo informático secuenciador 101. El dispositivo informático secuenciador 101 puede ser cualquier sistema que sea capaz de secuenciar el ARNm de cada muestra de células T individuales separada. Los ejemplos de dispositivos informáticos secuenciadores 101 pueden incluir cualquiera de las tecnologías y plataformas de NGS descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.
El dispositivo informático de usuario 101 puede ser cualquier tipo de dispositivo de comunicación que soporte comunicación en red, incluido un ordenador personal, un ordenador portátil o un asistente digital personal (PDA), etc. En algunas realizaciones, el dispositivo informático de usuario 101 puede soportar múltiples tipos de redes. Por ejemplo, el dispositivo informático de usuario 101 puede tener conectividad de red cableada o inalámbrica usando IP (protocolo de Internet) o puede tener conectividad de red móvil que permita redes celulares y de datos.
Tal como se describe con mayor detalle en el presente documento, el dispositivo informático de usuario 103 se usa para capturar las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc proporcionados por el dispositivo informático secuenciador 101. Las secuencias pueden transmitirse a través de una conexión de red 102. Un ejemplo de una conexión de red 102 es un espacio de disco compartido.
La figura 7 es un diagrama de bloques de componentes funcionales básicos para un dispositivo informático no reivindicado 103 que puede usarse según algunos aspectos de la invención. En la realización ilustrada de la figura 7, el dispositivo informático 103 incluye uno o más procesadores 202, memoria 204, interfaces de red 206, dispositivos de almacenamiento 208, fuente de alimentación 210, uno o más dispositivos de salida 212, uno o más dispositivos de entrada 214 y módulos de software - sistema operativo 216 y una aplicación de secuencia 218 - almacenados en la memoria 204. Los módulos de software se proporcionan contenidos en la memoria 204, pero, en determinadas realizaciones, los módulos de software están contenidos en dispositivos de almacenamiento 208 o una combinación de memoria 204 y dispositivos de almacenamiento 208. Cada uno de los componentes incluidos el procesador 202, la memoria 204, las interfaces de red 206, los dispositivos de almacenamiento 208, la fuente de alimentación 210, los dispositivos de salida 212, los dispositivos de entrada 214, el sistema operativo 216 y la aplicación de secuencia 218, están interconectados de manera física, comunicativa y/u operativa para comunicaciones entre componentes.
Tal como se ilustra, el procesador 202 está configurado para implementar funcionalidad y/o procesar instrucciones para su ejecución dentro del dispositivo cliente 103. Por ejemplo, el procesador 202 ejecuta instrucciones almacenadas en la memoria 204 o instrucciones almacenadas en un dispositivo de almacenamiento 208. La memoria 204, que puede ser una memoria de almacenamiento no transitoria, legible por ordenador, está configurado para almacenar información dentro del dispositivo cliente 103 durante la operación. En algunas realizaciones, la memoria 204 incluye una memoria temporal, un área para que la información no se mantenga cuando el dispositivo cliente 103 está apagado. Los ejemplos de tal memoria temporal incluyen memorias volátiles tales como memorias de acceso aleatorio (RAM), memorias dinámicas de acceso aleatorio (DRAM) y memorias estáticas de acceso aleatorio (SRAM). La memoria 204 también mantiene instrucciones de programa para su ejecución por el procesador 202.
El dispositivo de almacenamiento 208 también incluye uno o más medios de almacenamiento no transitorios legibles por ordenador. El dispositivo de almacenamiento 208 generalmente está configurado para almacenar mayores cantidades de información que la memoria 204. El dispositivo de almacenamiento 208 puede configurarse además para el almacenamiento de información a largo plazo. En algunas realizaciones no reivindicadas, el dispositivo de almacenamiento 208 incluye elementos de almacenamiento no volátiles. Los ejemplos no limitativos de elementos de almacenamiento no volátiles incluyen discos duros magnéticos, discos ópticos, disquetes, memorias flash o formas de memorias eléctricamente programables (EPROM) o memorias eléctricamente borrables y programables (EEPROM).
El dispositivo informático de usuario 103 puede usar la interfaz de red 206 para comunicarse con dispositivos informáticos secuenciadores externos 101 por medio de una o más redes 102 (véase la figura 6), y otros tipos de redes a través de las cuales puede establecerse una comunicación con el dispositivo informático de usuario 103. La interfaz de red 206 puede ser una tarjeta de interfaz de red, tal como una tarjeta Ethernet, un transceptor óptico, un transceptor de radiofrecuencia o cualquier otro tipo de dispositivo que pueda enviar y recibir información. Otros ejemplos no limitativos de interfaces de red incluyen Bluetooth®, radios 3G y Wi-Fi en dispositivos informáticos clientes y bus serie universal (USB).
El dispositivo informático de usuario 103 incluye una o más fuentes de alimentación 210 para proporcionar energía al dispositivo. Los ejemplos no limitativos de la fuente de alimentación 210 incluyen fuentes de alimentación de un solo uso, fuentes de alimentación recargables y/o fuentes de alimentación desarrolladas a partir de níquel-cadmio, iones de litio u otro material adecuado.
También se incluyen uno o más dispositivos de salida 212 en el dispositivo informático de usuario 103. Los dispositivos de salida 212 están configurados para proporcionar salida a un usuario usando estímulos táctiles, de audio y/o de vídeo. El dispositivo de salida 212 puede incluir una pantalla de visualización (parte de la pantalla sensible a la presencia), una tarjeta de sonido, una tarjeta adaptadora de gráficos de vídeo o cualquier otro tipo de dispositivo para convertir una señal en una forma apropiada comprensible por seres humanos o máquinas. Los ejemplos adicionales del dispositivo de salida 212 incluyen un altavoz tal como auriculares, un monitor de tubo de rayos catódicos (CRT), una pantalla de cristal líquido (LCD) o cualquier otro tipo de dispositivo que pueda generar una salida inteligible para un usuario.
El dispositivo informático de usuario incluye uno o más dispositivos de entrada 214. Los dispositivos de entrada 214 están configurados para recibir entradas de un usuario o de un entorno circundante del usuario a través de retroalimentación táctil, de audio y/o de vídeo. Los ejemplos no limitativos del dispositivo de entrada 214 incluyen una cámara de fotografía y video, una pantalla sensible a la presencia, un ratón, un teclado, un sistema de respuesta de voz, un micrófono o cualquier otro tipo de dispositivo de entrada. En algunos ejemplos, una pantalla sensible a la presencia incluye una pantalla sensible al tacto.
El dispositivo cliente 103 incluye un sistema operativo 216. El sistema operativo 216 controla las operaciones de los componentes del dispositivo cliente 103. Por ejemplo, el sistema operativo 216 facilita la interacción del/de los procesador(es) 202, la memoria 204, la interfaz de red 206, el/los dispositivo(s) de almacenamiento 208, el dispositivo de entrada 214, el dispositivo de salida 212 y la fuente de alimentación 210.
Tal como se describe en mayor detalle en el presente documento, el dispositivo informático de usuario puede usar una aplicación de secuencia 218 para capturar las secuencias de los múltiples fragmentos de ADNc de la(s) célula(s) T individual(es) que se identificó que expresa(n) uno o más marcadores de activación de células T tras el cocultivo con APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada. En algunas realizaciones, la aplicación de secuencia 218 puede interconectarse con y recibir entradas de un dispositivo informático secuenciador. En algunas realizaciones no reivindicadas, el usuario puede descargar las secuencias de los múltiples fragmentos de ADNc de una única célula T identificada del dispositivo informático secuenciador 101 a un disco extraíble tal como, por ejemplo, una unidad flash USB. El dispositivo informático de usuario puede obtener las secuencias de los múltiples fragmentos de ADNc de una única célula T identificada a partir del disco extraíble.
El dispositivo informático de usuario 103 puede incluir software almacenado en una memoria y ejecutado por un procesador para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR y las secuencias de CDR3 de un TCR que tiene especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer, tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.
La figura 8 es un diagrama de flujo de etapas del método para identificar automáticamente las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR y las secuencias de CDR3 de un TCR que tiene especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer. Tal como se muestra, el método 400 comienza en la etapa 402, donde un dispositivo informático de usuario 103 recibe las secuencias de los múltiples fragmentos de ADNc de la(s) célula(s) T individual(es) que se identificó que expresa(n) uno o más marcadores de activación de células T tras el cocultivo con APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer. El método puede comprender recibir las secuencias de los múltiples fragmentos de ADNc en el dispositivo informático a través de una red electrónica o por medio de un disco extraíble (por ejemplo, unidad USB).
En la etapa 403, el dispositivo informático de usuario 103 realiza una alineación computarizada de las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR y secuencias de segmento V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc de la célula T individual que se identificó que expresa uno o más marcadores de activación de células T tras el cocultivo con APC que presentan la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer.
En la etapa 404, el dispositivo informático de usuario 103 realiza una identificación computarizada de secuencias de CDR3 de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas.
En la etapa 405, el dispositivo informático de usuario 103 realiza un recuento computarizado del número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta.
En la etapa 406, el dispositivo informático de usuario realiza una recogida computarizada del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, en donde la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc para identificar las secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR.
En la etapa 407, el dispositivo informático de usuario 103 realiza una identificación computarizada de la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos, la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR de el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR.
Otra realización de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada proporciona un par de secuencias de cadena alfa y beta de TCR, o una porción de unión a antígeno de las mismas, aisladas según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Una realización de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada proporciona un TCR aislado que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tales como una cadena alfa (a) de un TCR y una cadena beta (P) de un TCR. Los polipéptidos de los pares aislados de secuencias de cadena alfa y beta de TCR (también denominados en el presente documento “el/los TCR”), o la porción de unión a antígeno de los mismos, puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos, siempre que el TCR, o la porción de unión a antígeno de los mismos, tenga especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer.
La “porción de unión a antígeno” del par aislado de secuencias de cadena alfa y beta de TCR, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier porción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR del cual forma parte, siempre que la porción de unión a antígeno se una específicamente a la secuencia de aminoácidos mutada codificada por la mutación específica de cáncer tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. El término “porción de unión a antígeno” se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR aislado mediante los métodos de la invención, parte o fragmento que conserva la actividad biológica del TCR del cual forma parte (el TCR original). Las porciones de unión a antígeno abarcan, por ejemplo, las partes de un TCR que conservan la capacidad para unirse específicamente a la secuencia de aminoácidos mutada, o detectar, tratar o prevenir el cáncer, en un grado similar, el mismo grado o en un mayor grado, en comparación con el TCR original. En referencia al TCR original, la porción de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10 %, 25 %, 30 %, 50 %, 68 %, 80 %, 90 %, 95 %, o más, del TCR original.
La porción de unión a antígeno puede comprender una porción de unión a antígeno de cualquier o ambas de las cadenas a y p del TCR aislado mediante los métodos de la invención, tal como una porción que comprende una o más de la región determinante de complementariedad (CDR)1, CDR2 y CDR3 de la(s) región/regiones variable(s) de la cadena a y/o cadena p del TCR aislado mediante los métodos de la invención. En una realización de la invención, la porción de unión a antígeno puede comprender la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadenaa(CDR1a), la CDR2 de la cadenaa(CDR2a), la CDR3 de la cadenaa(CDR3a), la CDR1 de la cadena p (CDR1p), la CDR2 de la cadena p (CDR2p), la CDR3 de la cadena p (CDR3p), o cualquier combinación de las mismas. Preferiblemente, la porción de unión a antígeno comprende las secuencias de aminoácidos de CDR1a, CDR2a y CDR3a; las secuencias de aminoácidos de CDR1p, CDR2p y CDR3P; o las secuencias de aminoácidos de todas de CDR1a, CDR2a, CDR3a, CDR1p, CDR2p y CDR3p del TCR aislado mediante los métodos de la invención.
En una realización de la invención, la porción de unión a antígeno puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR aislado mediante los métodos de la invención que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente, por ejemplo, las seis regiones<c>D<r>expuestas anteriormente. En este sentido, la porción de unión a antígeno puede comprender la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena a (Va), la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena p (Vp) o las secuencias de aminoácidos de tanto Va como Vp del TCR aislado mediante los métodos de la invención.
En una realización de la invención, la porción de unión a antígeno puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. En este sentido, la porción de unión a antígeno puede comprender toda la longitud de la cadena a o p, o ambas de las cadenas a y p, del TCR aislado mediante los métodos de la invención.
Las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, aisladas mediante los métodos de la invención, pueden ser útiles para preparar células para terapias celulares adoptivas. En este sentido, otra realización del método proporciona un método de preparación de una población de células que expresa secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas. El método comprende aislar secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.
El método comprende además introducir la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en células huésped para obtener células que expresan las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o la porción de unión a antígeno de las mismas. En este sentido, el método puede comprender clonar la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en un vector de expresión recombinante usando técnicas de clonación molecular establecidas tal como se describe en, por ejemplo, Greenet al.(Eds.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4a ed. (2012). Para los fines en el presente documento, el término “vector de expresión recombinante” significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido modificado genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula huésped, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para hacer que la célula exprese el ARNm, proteína, polipéptido o péptido. Los vectores no se producen de manera natural en su totalidad. Sin embargo, partes de los vectores pueden producirse de manera natural. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluidos, pero sin limitarse a, ADN y ARN, que pueden ser mono o bicatenarios, sintetizar u obtenerse en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender uniones internudeotídicas que se producen de manera natural, que no se producen de manera natural o ambos tipos de uniones. Preferiblemente, las uniones internucleotídicas o nucleótidos alterados o que no se producen de manera natural no obstaculizan la transcripción o replicación del vector.
El vector de expresión recombinante de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula huésped adecuada. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en transposón/transposasa, la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). Pueden usarse también vectores de bacteriófagos, tales como XGT10, XGT11, XZapII (Stratagene), XEMBL4 y XNM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pB1101.2, pB1101.3, pB1121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral.
La introducción de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, un vector de expresión recombinante) que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en células huésped, puede llevarse a cabo de cualquiera de una variedad de modos diferentes conocidos en la técnica tal como se describe en, por ejemplo, Greenet al.citado anteriormente. Los ejemplos no limitativos de técnicas que son útiles para introducir una secuencia de nucleótidos en células huésped incluyen transformación, transducción, transfección y electroporación.
En una realización de la invención, el método comprende introducir la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en células huésped que son autólogas para el paciente que proporcionó la muestra biológica. En este sentido, los TCR, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, identificados y aislados mediante los métodos de la invención, pueden personalizarse para cada paciente. Sin embargo, en otra realización, los métodos de la invención pueden identificar y aislar TCR, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, que tienen especificidad antigénica contra una secuencia de aminoácidos mutada que está codificada por una mutación específica de cáncer recurrente (también denominada “punto caliente”). En este sentido, el método puede comprender introducir la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en células huésped que son alogénicas para el paciente. Por ejemplo, el método puede comprender introducir la secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en las células huésped de otro paciente cuyos tumores expresan la misma mutación en el contexto de la misma molécula de MHC que el paciente que expresó originalmente el TCR.
En una realización de la invención, las células huésped son células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Las PBMC pueden incluir células T. Pueden obtenerse células T de numerosas fuentes del paciente, incluidos, pero sin limitarse a, tumor, sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, el timo u otros tejidos o fluidos. Las células T pueden incluir cualquier tipo de célula T y pueden estar en cualquier etapa de desarrollo, incluidas, pero sin limitarse a, células T CD4+/CD8+ doblemente positivas, células T auxiliares CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, células T CD8+ (por ejemplo, células T citotóxicas), células infiltrantes de tumores (por ejemplo, linfocitos infiltrantes de tumores (TIL)), células T de sangre periférica, células T de memoria, células T vírgenes, y similares. Las células T pueden ser células T CD8+, células T CD4+ o células T tanto CD4+ como CD8+.
Sin querer estar ligado a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que las células T “más jóvenes” menos diferenciadas pueden estar asociadas con uno cualquiera o más de mayor persistenciain vivo,proliferación y actividad antitumoral en comparación con células T “más antiguas” más diferenciadas. Por consiguiente, los métodos de la invención, ventajosamente, pueden identificar y aislar secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, que tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada e introducir las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, en células T “más jóvenes” que pueden proporcionar uno cualquiera o más de mayor persistenciain vivo,proliferación y actividad antitumoral en comparación con células T “más antiguas” (por ejemplo, células efectoras en el tumor de un paciente) a partir de las cuales puede haberse aislado el TCR, o la porción de unión a antígeno del mismo.
En una realización de la invención, el método comprende además expandir los números de células huésped en las que se ha introducido el TCR, o la porción de unión a antígeno del mismo. La expansión de los números de células puede lograrse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica tal como se describen en, por ejemplo, la patente estadounidense 8.034.334; patente estadounidense 8.383.099; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0244133; Dudleyet al.,J. Immunother., 26:332-42 (2003); y Riddellet al.,J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990). En una realización, la expansión de los números de células se lleva a cabo cultivando las células T con anticuerpo OKT3, IL-2 y PBMC alimentadoras (por ejemplo, PBMC alogénicas irradiadas).
Otra realización no reivindicada proporciona una población aislada de células preparadas según cualquiera de los métodos descritos en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende las células huésped que expresan el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, una PBMC), que no expresa el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo, o una célula distinta de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente (por ejemplo, consiste esencialmente en) células huésped que expresan el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo. La población puede ser también una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única PBMC que expresa el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo, de manera que todas las células de la población expresan el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo. En una realización de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que expresan el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo, tal como se describe en el presente documento. Al introducir la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR aislado, o la porción de unión a antígeno del mismo, en células huésped, los métodos de la invención, ventajosamente, pueden proporcionar una población de células que comprende una alta proporción de células huésped que expresan el TCR aislado y tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada. En una realización de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada, de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 100 %, por ejemplo, aproximadamente el 1 %, aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 15 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 25 %, aproximadamente el 30 %, aproximadamente el 35 %, aproximadamente el 40 %, aproximadamente el 45 %, aproximadamente el 50 %, aproximadamente el 55 %, aproximadamente el 60 %, aproximadamente el 65 %, aproximadamente el 70 %, aproximadamente el 75 %, aproximadamente el 80 %, aproximadamente el 85 %, aproximadamente el 90 %, aproximadamente el 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente el 98 %, aproximadamente el 99 % o aproximadamente el 100 %, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores, de la población de células, comprende células huésped que expresan el TCR aislado y tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada. Sin querer estar ligado a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que poblaciones de células que comprenden una alta proporción de células huésped que expresan el TCR aislado y tienen especificidad antigénica por la secuencia de aminoácidos mutada tienen una menor proporción de células irrelevantes que puedan obstaculizar función de las células huésped, por ejemplo, la capacidad de las células huésped para seleccionar como diana la destrucción de células cancerosas y/o tratar o prevenir el cáncer.
Los TCR no reivindicados dados a conocer, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, y las poblaciones de células pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. En este sentido, la divulgación proporciona una composición farmacéutica no reivindicada que comprende cualquiera de los TCR, o porciones de unión a antígeno de los mismos, o poblaciones de células y un portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender un TCR, o una porción de unión a antígeno del mismo, o una población de células en combinación con otro(s) agente(s) o fármaco(s) farmacéuticamente activo(s), tal como agentes quimioterápicos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorubicina, doxorubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.
Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para el TCR particular, o la porción de unión al antígeno del mismo, o la población de células en consideración. Tales portadores farmacéuticamente aceptables los conocen bien los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.
La elección del portador estará determinada en parte por el TCR particular, la porción de unión a antígeno del mismo o la población de células, así como por el método particular usado para administrar el TCR, la porción de unión a antígeno del mismo o la población de células. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica no reivindicada. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o interperitoneal. Puede usarse más de una vía para administrar el TCR o la población de células y, en ciertos casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.
Preferiblemente, el TCR no reivindicado dado a conocer, la porción de unión a antígeno del mismo o la población de células se administra mediante inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando va a administrarse la población de células, el portador farmacéuticamente aceptable para las células para inyección puede incluir cualquier portador isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente el 0,90%p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), disolución de electrolitos NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), aproximadamente el 5% de dextrosa en agua o lactato de Ringer. En una realización no reivindicada, el portador farmacéuticamente aceptable se complementa con albúmina sérica humana.
Se contempla que los TCR no reivindicados, las porciones de unión a antígeno de los mismos, las poblaciones de células y las composiciones farmacéuticas puedan usarse en métodos de tratamiento o prevención del cáncer. Sin querer estar ligado a ninguna teoría o mecanismos particular, se cree que los TCR, o las porciones de unión a antígeno de los mismos, se unen específicamente a una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer, de manera que el TCR, o la porción de unión a antígeno del mismo, cuando se expresan por una célula, es capaz de mediar en una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa la secuencia de aminoácidos mutada. En este sentido, una realización de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada proporciona un método de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de las composiciones farmacéuticas, pares aislados de secuencias de cadena alfa y beta de TCR, porciones de unión a antígeno de las mismas, o poblaciones de células descritas en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.
Otra realización de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada proporciona cualquiera de los TCR o porciones de unión a antígeno de los mismos, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero.
Los términos “tratar” y “prevenir”, así como las palabras que se derivan de ellos, tal como se usan en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o prevención del 100 % o completo. Más bien, existen grados variables de tratamiento o prevención que un experto en la técnica reconoce que tienen un posible beneficio o efecto terapéutico. En este sentido, los métodos no reivindicados dados a conocer pueden proporcionar cualquier cantidad o nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionado por el método dado a conocer y no reivindicado puede incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas del cáncer que está tratándose o previniéndose. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención pueden incluir promover la regresión de un tumor. Además, para los fines del presente documento, “prevención” puede abarcar retrasar la aparición del cáncer, o un síntoma o afección del mismo.
Para fines de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada, la cantidad o dosis del TCR, la porción de unión al antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica administrada (por ejemplo, el número de células cuando se administra la población de células) debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el mamífero a lo largo de un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del TCR, la porción de unión al antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica debe ser suficientes para unirse a una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica del cáncer, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período de desde aproximadamente 2 horas o más, por ejemplo, de 12 a 24 horas o más, desde el momento de la administración. En determinadas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis estará determinada por la eficacia del TCR particular, la porción de unión al antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica administrada y la afección del mamífero (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del mamífero (por ejemplo, ser humano) que va a tratarse.
En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la divulgación que no forma parte de la invención reivindicada, podría usarse un ensayo, que comprende comparar el grado en el que se lisan células diana o se secreta IFN-y por las células T que expresan el TCR, o la porción de unión al antígeno del mismo, tras la administración de una dosis dada de tales células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos a los que se les administra a cada uno una dosis diferente de células T, para determinar una dosis inicial que se administrará a un mamífero. El grado en que se lisan células diana o se secreta IFN-y tras la administración de una determinada dosis puede analizarse mediante métodos conocidos en la técnica.
La dosis del TCR, la porción de unión al antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica también estarán determinadas por la existencia, naturaleza y alcance de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un TCR particular, la porción de unión al antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica. Normalmente, el médico encargado decidirá la dosificación del TCR, la porción de unión a antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el TCR, la porción de unión a antígeno del mismo, la población de células o la composición farmacéutica que va a administrarse, la vía de administración y la gravedad de la afección que está tratándose.
En una realización no reivindicada en la que va a administrarse la población de células no reivindicada dada a conocer, el número de células administradas por infusión puede variar, por ejemplo, en el intervalo de un millón a 100 mil millones de células; sin embargo, cantidades por debajo o por encima de este intervalo a modo de ejemplo están dentro del alcance de la divulgación no reivindicada. Por ejemplo, la dosis diaria de células huésped puede ser de aproximadamente 1 millón a aproximadamente 150 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente mil millones de células, aproximadamente 5 mil millones de células, aproximadamente 20 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 40 mil millones de células, aproximadamente 60 mil millones de células, aproximadamente 80 mil millones de células, aproximadamente 100 mil millones de células, aproximadamente 120 mil millones de células, aproximadamente 130 mil millones de células, aproximadamente 150 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), preferiblemente de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 130 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10 mil millones de células, aproximadamente 25 mil millones de células, aproximadamente 50 mil millones de células, aproximadamente 75 mil millones de células, aproximadamente 90 mil millones de células, aproximadamente 100 mil millones de células, aproximadamente 110 mil millones de células, aproximadamente 120 mil millones de células, aproximadamente 130 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores), más preferiblemente de aproximadamente 100 millones de células a aproximadamente 130 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3 mil millones de células, aproximadamente 30 mil millones de células, aproximadamente 45 mil millones de células, aproximadamente 50 mil millones de células, aproximadamente 75 mil millones de células, aproximadamente 90 mil millones de células, aproximadamente 100 mil millones de células, aproximadamente 110 mil millones de células, aproximadamente 120 mil millones de células, aproximadamente 130 mil millones de células, o un intervalo definido por dos cualesquiera de los valores anteriores).
Para los fines de los métodos dados a conocer que no forman parte de la invención reivindicada, en donde se administran poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas para el mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas para el mamífero.
Otra realización que no forma parte de la invención reivindicada proporciona cualquiera de los TCR, las porciones de unión a antígeno de los mismos, poblaciones aisladas de células o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero.
Ventajosamente, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluido cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, del canal anal o del anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, la vesícula biliar o la pleura, cáncer de la nariz, la cavidad nasal o el αdo medio, cáncer de la cavidad bucal, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, colangiocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe, cáncer de ovario, cáncer del pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer del útero, cáncer de uréter, cáncer de vejiga urinaria, tumores sólidos y tumores líquidos. Preferiblemente, el cáncer es un cáncer epitelial. En una realización no reivindicada, el cáncer es colangiocarcinoma, melanoma, cáncer de colon o cáncer de recto.
El mamífero al que se hace referencia en los métodos de la invención puede ser cualquier mamífero. Tal como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluidos, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluidos felinos (gatos) y caninos (perros). Preferiblemente, los mamíferos son del orden Artiodactyla, incluidos bovinos (vacas) y porcinos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluidos equinos (caballos). Preferiblemente, los mamíferos son del orden Primates, Ceboides o Simoides (monos) o del orden Antropoides (seres humanos y simios). Un mamífero más preferido es el ser humano. En una realización especialmente preferida, el mamífero es el paciente que expresa la mutación específica de cáncer.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero, por supuesto, no deben interpretarse de ninguna manera como limitativos de su alcance.
Ejemplos 1-5
Los siguientes materiales y métodos se emplearon para los experimentos descritos en los ejemplos 1-5.
Cribado de TIL reactivos con neoantígenos
Todos los materiales de pacientes se obtuvieron de un ensayo clínico aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Instituto Nacional del Cáncer (ID de registro del ensayo: NCT01174121). El método de identificación de neoantígenos y poblaciones de TIL reactivos con neoantígenos se ha descrito en el documento WO 2016/053338. En resumen, se cortaron fragmentos de tumores y se cultivaron en medios que contenían IL-2 (6000 UI/ml) durante de 3 a 6 semanas (Dudleyet al.,J. Immunother., 26: 332-342 (2003)). Los cultivos de TIL con números expandidos de células se cribaron para el reconocimiento de neoantígenos. Para cribar los cultivos de TIL expandidos para el reconocimiento de neoantígenos, se identificaron mutaciones no sinónimas en tumores mediante secuenciación del exoma completo y ARN (RNA-seq). Se sintetizaron bibliotecas de minigenes en tándem (TMG) que abarcaban las mutaciones no sinónimas. Se cribaron células dendríticas (DC) autólogas que expresan los TMG para identificar el/los neoantígeno(s) reconocido(s) por los TIL (Luet al.,Clin. Cancer Res., 20: 3401-3410 (2014)) (véase la figura 1).
Identificación de secuencias de TCR específicas de neoantígeno a partir de datos de RNA-seq de células individuales
Se resume un método de identificación secuencias de TCR específicas de neoantígeno a partir de datos de secuenciación de ARN de células individuales (RNA-seq) en el esquema mostrado en la figura 2. Después de que se identificaran los cultivos de TIL reactivos con neoantígenos, se cocultivaron 1 * 106 TIL con 1 * 106 DC pulsadas con TMG durante cuatro (4) horas (h). Después del cocultivo, las células T se resuspendieron y se lavaron extensamente. Entonces, las células T se sometieron a clasificación de células individuales y preparación de muestras de RNA-seq según las instrucciones del fabricante (Fluidigm (San Francisco, CA) y Clontech (Mountain View, CA)). Las 96 muestras de RNA-seq de células individuales se codificaron con códigos de barras usando el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEXTERA XT (Illumina (San Diego, CA)) y luego se secuenciaron usando el sistema ILLUMINA MISEQ usando el kit de reactivos V3 (2 * 250 pares de bases (p.b.)).
Los datos de RNA-seq de células individuales se alinearon mediante Burrows-Wheeler Aligner (BWA) (Liet al.,Bioinformatics, 25: 1754-60 (2009); Liet al.,Bioinformatics, 26(5): 589-95 (2010)) usando secuencias de región variable (V) de TCRa/p de la base de datos del sistema internacional de información inmunogenética (IMGT) (Lefrancet al.,Nucleic Acids Res., 43: D413-422 (2015)). Se identificaron secuencias de región CD<r>3 basándose en los residuos de aminoácido conservados (C...HW) cerca del extremo C-terminal de la región V, se analizaron y se notificaron mediante el software. Algunos TCR con secuencias no productivas (fuera de marco) se eliminaron del análisis. Adicionalmente, algunas muestras pueden haber contenido más de una célula T debido al mecanismo de clasificación imperfecto del sistema de secuenciación de ARNm de células individuales FLUIDIGM C1. Como resultado, muestras con más un TCRp se eliminaron del análisis posterior. Por separado, se alinearon datos de RNA-seq con la secuencia de IFN-y, IL-2 u otros posibles marcadores de activación de células T. Se extrajeron fragmentos de TCR alineados que estaban asociados con células individuales con alto contenido de IFN-y, y se identificaron las regiones V, CDR3 y constante (C) de TCR. Para ensamblar secuencias de TCR de longitud completa apareadas, se ensamblaron secuencias de región V en 5' incompletas con las secuencias de región V de TCR de longitud completa humanas identificadas a partir de la base de datos de IMGT. Para potenciar el apareamiento y evitar el apareamiento erróneo de TCRa/p, las secuencias de región C en 3' se reemplazaron con secuencias de región constante de ratón modificadas (Cohenet al.,Cancer Res., 66: 8878-8886 (2006); Cohenet al.,Cancer Res., 67: 3898-3903 (2007); Haga-Friedmanet al.,J. Immunol., 188: 5538-5546 (2012)) (Figura 2).
Validación de TCR específicos de neoantígenos
El protocolo detallado se ha descrito en Morganet al.,Science, 314: 126-129 (2006), con algunas modificaciones menores descritas en el presente documento. Se sintetizaron secuencias de TCRa y TCRp de longitud completa con regiones constantes de ratón modificadas, unidas mediante un enlazador de furina SGSGP2A (RAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP) (SEQ ID NO: 1), y se clonaron en un vector de expresión retroviral MSGV8 (Wargoet al.,Cancer Immunol. Immunother., 58: 383-394 (2009)). El plásmido MSGV8-TCR (1,5 |ig) y 0,75 |ig de plásmido VSV-G (RD114) se cotransfectaron en 1 * 106 células 293GP en cada 6 pocillos usando el reactivo de transfección LIPOFECTAMINE 2000 (Thermo Fisher Scientific). Después de 48 h, se recogió el sobrenadante y se centrifugó a 3000 revoluciones por minuto (rpm) durante 10 minutos (min) para eliminar los residuos. El sobrenadante de retrovirus se cargó en placas de 6 pocillos recubiertas con reactivo RETRONECTIN (Takara, Otsu, Japón) mediante centrifugación a 2000 g durante 2 h.
Por separado, se estimularon 1 * 106/ml PBMC de donantes sanos con 50 ng/ml de AcM anti-CD3 OKT3 y 300 Ul/ml de IL-2 en medio AIM V que contenía un 5 % de suero humano. Después de 2 días, se recogieron las células estimuladas y se resuspendieron en el mismo medio sin OKT3. Se añadieron PBMC estimuladas a cada pocilio cargado con retrovirus a 2 x 106 células/pocillo y se centrifugaron a 1000 g durante 10 min. Se incubaron las placas durante la noche a 37 °C. Al día siguiente, las PBMC se transfirieron a nuevos pocillos cargados con retrovirus, y se repitió el procedimiento de transducción. Se cultivaron de manera continua células T transducidas con TCR en medio AIM V con 300 Ul/ml de IL-2 y un 5 % de suero humano durante 5 días más antes de los experimentos.
Para someter a prueba la especificidad de células T transducidas con TCR, se pulsaron DC autólogas o células B transformadas con EBV con ARN de TMG, ARNm de longitud completa o péptidos durante 24 h. Entonces se cocultivaron 1 X 105 células T con 1 x 105 DC o células B transformadas con EBV durante la noche en placas con fondo en U de 96 pocillos. Se recogió el sobrenadante, y se determinó la secreción de IFN-y a partir de células T mediante ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (Thermo Fisher Scientific).
EJEMPLO 1
Este ejemplo demuestra un método de aislamiento de las secuencias de cadena alfa y beta apareadas de un TCR específico de neoantígeno a partir del cultivo de TIL 4090.
Se hicieron crecer cultivos de TIL 4090 de una lesión pulmonar metastásica resecada de un paciente con cáncer colorrectal. Uno de los cultivos, TIL 4090 F7, reconocía TMG-5 basándose en los resultados del cribado de la biblioteca de TMG. Para aislar el TCR específico de neoantígeno, se cocultivaron células TIL 4090 F7 con DC autólogas pulsadas con TMG-5 durante 4 h y se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales. Entre todas las lecturas de secuencia en los datos de RNA-seq de células individuales, dos células individuales expresaron altos porcentajes de lecturas de IFN-y (el 6,42 % y el 12,25 % de las lecturas R1 totales) (figura 3A). El resto de las células individuales solo expresaron el 0-0,16 % de lecturas de IFN-y (figura 3A). Ninguna de las células individuales expresó IL-2 detectable usando este enfoque (figura 3B). Estos datos sugirieron que estas dos células T reaccionaron específicamente con neoantígenos presentados por DC. A continuación, se identificaron las regiones variables de TCRa/p y las secuencias de CDR3 a partir de los datos de RNA-seq de células individuales de estas dos células T, y la secuencia de TCR de ambas células T eran idénticas (tabla 1). TABLA 1
EJEMPLO 2
Este ejemplo demuestra que células T transducidas con las secuencias de cadena alfa y beta de TCR aisladas en el ejemplo 1 reconocen específicamente un neoantígeno expresado por el cáncer del paciente del ejemplo 1. Para validar el TCR aislado de TIL 4090 F7, se sintetizaron las secuencias de TCRa y TCRp de longitud completa con regiones constantes de ratón modificadas, unidas mediante un enlazador de furina SGSGP2A, y se clonaron en un vector de expresión retroviral MSGV8. Se transdujeron células T de sangre periférica con el 4090 TCR y se cocultivaron con 4090 DC pulsadas con TMG-5 durante la noche. Basándose en la secreción de IFN-y por células T, células T transducidas con 4090 TCR reconocieron DC pulsadas con TMG-5, pero no DC pulsadas con TMG irrelevante (figura 3C).
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para someter a prueba la especificidad del 4090 TCR. TMG-5 contenía un total de 12 minigenes. Se sintetizaron péptidos largos mutados de 25 meros correspondientes a cada minigen y se pulsaron sobre 4090 DC durante 24 h. Después de lavar, se cocultivaron las DC pulsadas con péptidos con las células T transducidas con 4090 TCR durante la noche. Las células T transducidas con 4090 TCR solo reaccionaron con las DC pulsadas con el péptido USP8 mutado (peptidasa específica de ubiquitina 8) WAKFLDPITGTFHYYHSPTNTVHMY (R>H) (SEQ ID NO: 2), lo que sugiere que el 4090 TCR reconoció USP8 mutado (figura 3D). Por último, se pulsaron el péptido largo USP8 mutado purificado por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y el homólogo de tipo natural (WT) sobre 4090 DC durante 24 h. Entonces, se cocultivaron DC pulsadas con péptidos con células T transducidas con 4090 TCR durante la noche. Las células T transducidas con 4090 TCR reaccionaron con el péptido USP8 mutado a una concentración mínima de 0,01 |j,M, pero no mostraron reconocimiento significativo del péptido USP8 WT (figura 3E).
EJEMPLO 3
Este ejemplo demuestra un método de aislamiento de las secuencias de cadena alfa y beta apareadas de un TCR específico de neoantígeno a partir del cultivo de TIL 4095.
Se hicieron crecer cultivos de TIL 4095 de lesiones pulmonares matastásicas resecadas de un paciente con cáncer colorrectal. TIL 4095 F5 reconocía TMG-1 basándose en los resultados del cribado de la biblioteca de TMG. Para aislar el TCR específico de neoantígeno, se cocultivaron células TIL 4095 F5 con DC autólogas pulsadas con TMG-1 durante 4 h y se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales. Se identificaron todas las células individuales con altos niveles de lecturas de IFN-y (0,79 % - 3,74 %) (figura 4A). Estas células T contenían todas exactamente las mismas secuencias variables de TCRa/p y de CDR3 (tabla 2). Solo una célula individual expresó lecturas de IL-2 detectables (0,03 %) (figura 4B), y esta célula individual coexpresaba IFN-y a un alto nivel (1,07 %) (figura 4C).
TABLA 2
EJEMPLO 4
Este ejemplo demuestra que células T transducidas con las secuencias de cadena alfa y beta de TCR aisladas en el ejemplo 3 reconocen específicamente un neoantígeno expresado por el cáncer del paciente del ejemplo 3.
Para validar el TCR aislado de TIL 4095 F5 del ejemplo 3, se sintetizaron las secuencias de TCRa y TCRp de longitud completa con regiones constantes de ratón modificadas y se contaron en un vector de expresión retroviral MSGV8, y luego se transdujeron en células T del donante. En un estudio previo, se identificó un TCR que reconoce un péptido KRAS(G12D) mutado de una manera restringida por HLA-C0802 (Tranet al.,Science, 350: 1387-1390 (2015)). Debido a que se encontró que el paciente 4095 era positivo para HLA-C0802 y KRAS(G12D), y debido a que TMG-1 codificaba para KRAS(G12D), se sometió a prueba si este 4095 T<c>R también reconocía KRAS restringido por HLA-C0802 (G12D). Tal como se muestra en la figura 4D, se cocultivaron células T transducidas con 4095 TCR con DC autólogas pulsadas con ARNm de G12D o KRAS WT de longitud completa durante la noche. Las células T transducidas con 4095 TCR reconocieron DC pulsadas con KRAS(G12D), pero no DC pulsadas con KRAS WT. Por último, se pulsaron DC autólogas con el epítopo mínimo GADGVGKSA (SEQ ID NO: 3) del antígeno KRAS(G12D) restringido por HLA-C0802 durante 2 horas. Las células T transducidas con 4095 TCR reconocieron el epítopo KRAS(G12D) a una concentración mínima de 0,01 |aM y no reconocieron el homólogo WT (figura 4E).
EJEMPLO 5
Este ejemplo demuestra un método de aislamiento de las secuencias de cadena alfa y beta apareadas de un TCR específico de neoantígeno a partir del cultivo de TIL 4112.
Se hicieron crecer cultivos de TIL 4112 de una lesión hepática metastásica resecada de un paciente con colangiocarcinoma. Se encontró que uno de los cultivos, TIL 4112 F5, reconocía TMG-9 basándose en los resultados del cribado de la biblioteca de TMG. Para identificar el TCR específico de neoantígeno, se cocultivaron células TIL 4112 F5 con DC autólogas pulsadas con TMG-9 durante 4 h y se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales. Veintidós (22) células individuales con altos niveles de lecturas de IFN-y (>2 %) contenían exactamente las mismas secuencias de TCR (figura 5A, figura 5C y tabla 3). Sin embargo, 13 de 22 células individuales no contenían TCRa detectable debido al bajo nivel de expresión de TCRa en este clonotipo. Ocho (8) células individuales expresaron lecturas de IL-2 detectables, que oscilaban entre el 0,01 % -0,1 % (figura 5B y figura 5C). Entre ellas, 6 células individuales expresaron las mismas secuencias de TCRa/p. Una sola célula individual expresó la secuencia de TCRp idéntica, pero no pudo detectarse TCRa. Además, una única célula no expresó ninguna secuencia de TCRa/p detectable (figuras 5A-5C).
Para validar el TCR identificado a partir de TIL 4112 F5, se sintetizaron las secuencias de TCRa y TCRp de longitud completa con regiones constantes de ratón modificadas y luego se transdujeron en células T del donante. Las células T transducidas con 4112 TCR reconocieron DC pulsadas con TMG-9, pero no DC pulsadas con TMG irrelevante (figura 5D). A continuación, la secuencia de aminoácidos de TMG-9 se envió al sitio web Immune Epitope Database (IEDB) And Analysis Resource (iedb.org) y al sitio web Center for Biological Sequence (CBS) Analysis NetMHC (cbs.dtu.dk/services/NetMHC/) para predecir péptidos con alta afinidad por los 6 HLA del paciente 4112. Se sintetizaron un total de 67 péptidos de alta afinidad predichos de IEDB (clasificación <1 %) y NetilHC (clasificación <2 %) y se combinaron en 10 conjuntos. Las células T transducidas con 4112 TCR reconocieron el conjunto de péptidos cortos (SPP)-9 pulsados en células B autólogas transformadas con EBV (figura 5E). En experimentos posteriores, se identificó el péptido NBAS mutado (secuencia amplificada de neuroblastoma) WSYDSTLLAY (C>S) (SEQ ID NO: 4) como el epítopo mínimo reconocido por células T transducidas con 4112 TCR (figuras 5F, 5g ).
EJEMPLO 6
Este ejemplo demuestra un método de aislamiento de las secuencias de cadena alfa y beta apareadas de un TCR específico de neoantígeno del cultivo de TIL 4171.
Se hicieron crecer cultivos de TIL 4171 de una lesión pulmonar metastásica resecada de un paciente con cáncer colorrectal. Se sintetizaron 128 péptidos largos (25 meros), y cada péptido contenía una mutación no sinónima flanqueada en ambos lados por 12 aminoácidos normales. Los cultivos de TIL 4171 se cribaron frente a la biblioteca de péptidos, y uno de los cultivos, TIL4171F6, reconoció el conjunto de péptidos 3 (PP-3) (figura 9A). Entonces se cocultivaron células TIL4171F6 con DC autólogas pulsadas con PP-3 durante 4 h, y se sometieron a análisis de RNA-seq de células individuales. Se midió la expresión de IFN-y e IL-2 (figuras 9B-9D). Nueve muestras contenían altos niveles de ARNm IFN-y (2209 - 24845 FPKM (fragmentos por kilobase de transcrito por millón de lecturas mapeadas)) (figura 9B). Entre ellas, seis muestras tenían la misma secuencia de CDR3 de TCRp. Dos muestras no contenían ningún TCRp detectable, y una muestra contenía dos secuencias de CDR3 de TCRp diferente, lo que probablemente resultaba de la contaminación por otra célula T. Sin embargo, ninguna de estas muestras contenía ninguna secuencia de TCRa detectable. De manera similar, cuatro muestras contenían ARNm de IL-2 detectable (331,2-1497 FPKM). Estas muestras contenían toda la secuencia de CDR3 de TCRp idéntica, pero ninguna de las muestras tenía ninguna secuencia de cadena de TCRa detectable.
En un intento por descubrir la cadena TCRa que faltaba, se investigaron adicionalmente los datos de RNA-seq de células individuales obtenidos en este experimento. Se encontró que cuatro células individuales IFN-y+ y dos células individuales IL-2+ expresaban una cadena de TCR única, que incluía un segmento génico V DV3, un segmento génico J AJ56 y un segmento génico C AC. Se comparten varios segmentos génicos V entre las cadenas TCRa y TCRS, incluidos AV14/DV4, AV23/DV6, AV29/DV5, AV36/DV7 y AV38-2/DV8 (Lefranc, Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., págs. A.1O.1-A.1O.23 (2001)). Se ha encontrado que estos segmentos génicos V se reordenan en segmentos génicos de unión AJ para TCRa, y que se reordenan en segmentos génicos de diversidad de DD y segmentos génicos de unión DJ para TCRS. Notablemente, la orientación de la transcripción de DV3 está invertida. Hasta ahora, no se ha notificado que una cadena TCRa pueda utilizar un segmento de gen DV3.
Para someter a prueba la función de esta cadena de TCR única, se unió esta cadena de TCR a la cadena TCRp identificada y luego se clonó en un vector retroviral vector. Las células T transducidas con 4171 TCR eran fuertemente reactivas con PP-3 (figura 9E). Este conjunto de péptidos PP-3 contenía 14 péptidos de 25 meros mutados.
A continuación, se pulsaron DC autólogas con péptidos individuales del conjunto de péptidos PP-3 durante 24 horas. Se cocultivaron DC pulsadas con péptidos con células T transducidas con 4171 TCR. 4171 TCR reconoció DC pulsadas con péptido SIN3A mutado (miembro A de la familia del regulador de la transcripción SIN3) (figura 9F).
Por último, se pulsó péptido SIN3A mutado o WT de 25 meros purificado (LGKFPELFNWFKIFLGYKESVBLET (SEQ ID NO: 25), N>I) sobre DC autólogas durante 24 h. Se cocultivaron dC pulsadas con péptidos con células T transducidas. Se determinó la secreción de IFN-y a partir de células T mediante ELISA. Se mostró que células T transducidas con 4171 TCR reconocían específicamente el péptido SIN3A mutado, pero no el homólogo de tipo natural (figura 9G).
Por tanto, este TCR único era funcional, y podía reconocer específicamente SIN3A mutado. Similar a otros segmentos de gen V, estos datos sugirieron que el segmento del gen DV3 podría compartirse entre las cadenas TCRa y TCR8.
El uso de los términos “un” y “una” y “el/la” y “al menos uno” y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) debe interpretarse que cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso del término “al menos uno” seguido por una lista de uno o más elementos (por ejemplo, “al menos uno de A y B”) debe interpretarse que significa un elemento seleccionado de los elementos enumerados (A o B) o cualquier combinación de dos o más de los elementos enumerados (A y B), a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. Los términos “que comprende”, “que tiene”, “que incluye” y “que contiene” deben interpretarse como términos abiertos (es decir, que significan “que incluye, pero sin limitarse a”), a menos que se indique lo contrario. La mención de intervalos de valores en el presente documento simplemente pretende servir como método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o expresiones a modo de ejemplo (por ejemplo, “tal como”) proporcionados en el presente documento, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención a menos que se reivindique lo contrario. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido de que indique que algún elemento no reivindicado sea esencial para la práctica de la invención.
Claims (15)
1. Método de aislamiento de secuencias de cadena alfa y beta de receptor de células T (TCR) apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, comprendiendo el método:
(a) aislar, a partir de una muestra biológica, células T que tienen especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer;
(b) cocultivar las células T aisladas con células presentadoras de antígenos (APC) que presentan la secuencia de aminoácidos mutada de modo que las células T expresan uno o más marcadores de activación de células T; (c) clasificar las células T cocultivadas en muestras de células T individuales separadas;
(d) aislar ARNm de cada muestra de células T individuales separada;
(e) secuenciar el ARNm de cada muestra de células T individuales separada, en donde la secuenciación comprende:
(i) producir ADNc a partir del ARNm y amplificar el ADNc;
(ii) producir múltiples fragmentos del ADNc amplificado y etiquetar los múltiples fragmentos;
(iii) amplificar los múltiples fragmentos etiquetados del ADNc; y
(iv) secuenciar los múltiples fragmentos etiquetados y amplificados del ADNc;
en donde la secuenciación identifica las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc;
(f) alinear las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una secuencia conocida del uno o más marcadores de activación de células T para identificar qué muestra de células T individuales contenía una única célula T que expresaba el uno o más marcadores de activación de células T;
(g) alinear las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de segmento variable (V) de cadena alfa de TCR y secuencias de segmento V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc de cada muestra de células T individuales separada que se identificó en (f) que expresaba uno o más marcadores de activación de células T;
(h) identificar secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas en (g) y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas en (g);
(i) contar el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta;
(j) recoger el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, en donde la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc
para identificar las secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR;
(k) identificar la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j), la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j)
para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR; y
(l) ensamblar una o más secuencias de nucleótidos que codifican para:
una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida en (j) y
una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida en (j),
opcionalmente ensamblar una o más segundas secuencias de nucleótidos que codifican para:
una segunda cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc identificados en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) y
la cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida en (j)
para producir secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o una porción de unión a antígeno de las mismas.
2. Método según la reivindicación 1, en donde el uno o más marcadores de activación de células T comprenden uno o más de interferón (IFN)-y, interleucina (IL)-2, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), muerte celular programada 1 (PD-1), gen de activación de linfocitos 3 (LAG-3), dominio de mucina e inmunoglobulina de células T 3 (TIM-3), 4-1BB, OX40, CD107a, granzima B, factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF), IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-17 e IL-22.
3. Método según la reivindicación 1 o 2, que comprende además marcar el ARNm de cada muestra de células T individuales separada con una etiqueta diferente para cada muestra de células T individuales separada.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde (h) comprende identificar secuencias de CDR3 de TCR identificando secuencias de ADNc que codifican para residuos de aminoácido conservados situados cerca del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que está codificada por el segmento V de las cadenas alfa y beta.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde (k) comprende además identificar la secuencia de región constante (C) de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) y la secuencia de región C de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j).
6. Método según la reivindicación 5, en donde (l) comprende ensamblar una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada en (k), la secuencia de región C de cadena alfa de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida en (j) y ensamblar una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en (k), la secuencia de región C de cadena beta de TCR identificada en (k) y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida en (j).
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde (l) comprende ensamblar una cadena alfa de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR identificada en (k), una secuencia de región C de cadena alfa de TCR exógena y la secuencia de CDR3 de cadena alfa de TCR recogida en (j) y ensamblar una cadena beta de TCR que comprende la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR identificada en (k), una secuencia de región C de cadena beta de TCR exógena y la secuencia de CDR3 de cadena beta de TCR recogida en (j).
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende además recibir, en un dispositivo informático de usuario, las secuencias de los múltiples fragmentos de ADNc de la célula T individual identificada en (f);
en donde (g) comprende realizar una alineación computarizada de las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de segmento variable (V) de cadena alfa de TCR y secuencias de segmento V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc de la célula T individual identificada en (f);
en donde (h) comprende realizar una identificación computarizada de secuencias de CDR3 de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas en (g) y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas en (g);
en donde (i) comprende realizar un recuento computarizado del número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta;
en donde (j) comprende realizar una recogida computarizada del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, en donde la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc
para identificar las secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR; y
en donde (k) comprende realizar una identificación computarizada de la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j), la secuencia de segmento V de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j) y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (j)
para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR.
9. Método de preparación de una población de células que expresan secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, comprendiendo el método:
aislar secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, según el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, e
introducir una secuencia de nucleótidos que codifica para las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas aisladas, o la porción de unión a antígeno de las mismas, en células huésped para obtener células que expresan las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o la porción de unión a antígeno de las mismas.
10. Método según la reivindicación 9, que comprende además expandir los números de células huésped que expresan las secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o la porción de unión a antígeno de las mismas.
11. Método de fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de cáncer en un mamífero, comprendiendo el método:
(i) aislar secuencias de cadena alfa y beta de receptor de células T (TCR) apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, según el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 o (ii) preparar una población de células que expresan secuencias de cadena alfa y beta de TCR apareadas, o una porción de unión a antígeno de las mismas, según el método según la reivindicación 10, opcionalmente en donde las células de la población son autólogas para el mamífero.
12. Método de identificación automática de las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de receptor de células T (TCR) y secuencias de CDR3 de un TCR que tiene especificidad antigénica por una secuencia de aminoácidos mutada codificada por una mutación específica de cáncer, comprendiendo el método:
(a) recibir, en un dispositivo informático de usuario, secuencias de múltiples fragmentos de ADNc, en donde el ADNc está codificado por ARNm producido por una única célula T tras el cocultivo de la célula T con células presentadoras de antígenos (APC) que presentan la secuencia de aminoácidos mutada de modo que la célula T expresa uno o más marcadores de activación de células T;
(b) realizar una alineación computarizada de las secuencias de cada uno de los múltiples fragmentos de ADNc con una base de datos de secuencias de TCR de referencia para identificar secuencias de segmento variable (V) de cadena alfa de TCR y secuencias de segmento V de cadena beta de TCR de los múltiples fragmentos de ADNc;
(c) realizar una identificación computarizada de secuencias de región determinante de complementariedad 3 (CDR3) de TCR en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena alfa de TCR identificadas en (b) y en los múltiples fragmentos de ADNc que contienen las secuencias de segmento V de cadena beta de TCR identificadas en (b);
(d) realizar un recuento computarizado del número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena alfa y el número de múltiples fragmentos de ADNc que comparten la misma secuencia de aminoácidos de CDR3 de cadena beta;
(e) realizar una recogida computarizada del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena beta y, opcionalmente, el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc que codifican para la misma secuencia de CDR3 de cadena alfa, en donde la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc es diferente de la secuencia de CDR3 de cadena alfa codificada por el mayor número de múltiples fragmentos de ADNc para identificar las secuencias de CDR3 de cadena alfa y beta de TCR; y
(f) realizar una identificación computarizada de la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e), la secuencia de segmento V de cadena beta de t Cr del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e) y, opcionalmente, la secuencia de segmento V de cadena alfa de TCR del segundo mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e)
para identificar las secuencias de segmento V de cadena alfa y beta de TCR.
13. Método según la reivindicación 12, en donde (c) comprende identificar secuencias de CDR3 de TCR identificando secuencias de ADNc que codifican para residuos de aminoácido conservados situados cerca del extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que está codificada por segmento V de las cadenas alfa y beta.
14. Método según la reivindicación 13, en donde los residuos de aminoácido conservados comprenden la secuencia de aminoácidos de YX1CX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21X22 (SEQ ID NO: 5), en donde:
cada uno de X1-X9 es cualquier aminoácido que se produce de manera natural,
cada uno de X10-X21 no es un aminoácido o es cualquier aminoácido que se produce de manera natural, y X22 es fenilalanina o triptófano.
15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde (f) comprende además realizar una identificación computarizada de la secuencia de región constante (C) de cadena alfa de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e) y la secuencia de región C de cadena beta de TCR del mayor número de múltiples fragmentos de ADNc recogidos en (e).
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