ES2955377T3 - Esteras de nanofibras ultraporosas y usos de las mismas - Google Patents

Abstract

Un medio de filtración de líquidos de nanofibras poliméricas electrohiladas porosas, como esteras electrohiladas, utilizadas para la eliminación de partículas virales (por ejemplo, parvovirus) y otras partículas en el rango de tamaño de 18 nm a 30 nm de corrientes de fluido, que tiene un punto de burbuja de flujo medio medido. con perfluorohexano por encima de 100 psi. El medio electrohilado incluye nanofibras que tienen un diámetro de fibra promedio de aproximadamente 6 nm a aproximadamente 13 nm, y el medio de filtración de líquido de nanofibras tiene un tamaño de poro medio que varía de aproximadamente 0,01 um a aproximadamente 0,03 um, una porosidad que varía de aproximadamente 80 % a aproximadamente 95 %, un espesor que varía de aproximadamente 1 um a aproximadamente 100 um, y una permeabilidad al líquido mayor que aproximadamente 10 LMH/psi. La alta porosidad de las esteras electrohiladas permite flujos de agua mucho mayores, lo que reduce el tiempo necesario para completar los pasos de filtración de virus en una corriente de fluido. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Esteras de nanofibras ultraporosas y usos de las mismas

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a medios de filtración de líquidos. La invención proporciona métodos para preparar materiales poliméricos de nanofibras que tengan diámetros de fibra extremadamente pequeños, ensamblar estas fibras en esteras muy consistentes y utilizar de dichas esteras para la eliminación de virus de corrientes de fluido.

Antecedentes de la invención

Las agencias reguladoras de todo el mundo imponen requisitos estrictos a los fabricantes comerciales de compuestos biofarmacéuticos para que proporcionen una garantía de bioseguridad de sus medicamentos. Los fabricantes tienen que incorporar y validar al menos dos etapas ortogonales (que funcionen por dos mecanismos distintos) de eliminación de virus en sus procesos, uno de los cuales es normalmente la filtración basada en tamaño. El LRV (valor de reducción logarítmica) esperado de la filtración es al menos 4.

Las estrategias actuales en la filtración vírica se proporcionan en Meltzer, T., y Jornitz, M., eds., “ Filtration and Purification in the Biopharmaceutical Industry” , 2da ed., Informa Healthcare. 2008, Capítulo 20, “ Ensuring Safety of Biopharmaceuticals: Virus and Prion Safety Considerations” , H. Aranha.

Los parvovirus, partículas icosaédricas no encapsuladas con un tamaño comprendido entre 18 y 26 nm, son algunos de los virus conocidos más pequeños (Leppard, Keith; Nigel Dimmock: Easton, Andrew (2007). Introduction to Modem Virology. Blackwell Publishing Limited, p. 450). Los fabricantes de membranas de retención de virus se basan habitualmente en mediciones de la retención de parvovirus para la validación de la garantía de eliminación de virus de sus membranas.

Hay numerosas membranas disponibles en el mercado validadas para la eliminación de parvovirus. Una membrana de eliminación de parvovirus ilustrativa, Viresolve® Pro, comercializada por EMD Millipore Corporation, Billerica, MA EE.UU., tiene una estructura de poros asimétrica, con un lado de eliminación de virus estrecho y un lado de “ soporte” microporoso. Se fabrica mediante un proceso de inversión de fase utilizado para hacer una amplia gama de membranas de ultrafiltración y microfiltración. Una limitación inherente con el proceso de fabricación por de inversión de fase es que la porosidad de la membrana disminuye significativamente con el tamaño de poro.

Por ejemplo, una membrana microporosa con un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0,5 micrómetros puede tener una porosidad de aproximadamente 75 % a 80 %, mientras que una membrana de ultrafiltración o de eliminación de virus con un tamaño de poro promedio de aproximadamente 0,01 micrómetros a 0,02 micrómetros será solo 5 % menos porosa en su región de tamaño de poro más estrecho. Por lo tanto, las membranas de eliminación de parvovirus tienen tradicionalmente baja porosidad y, por tanto, un flujo de agua más bajo.

A medida que la fabricación biofarmacéutica madura, la industria busca constantemente formas de racionalizar las operaciones, combinar y eliminar etapas, y reducir el tiempo necesario para procesar cada lote del medicamento. Al mismo tiempo, existen presiones regulatorias y del mercado que requieren que los fabricantes reduzcan sus costes. Dado que la filtración de virus supone un porcentaje importante del coste total de la purificación de medicamentos, cualquier enfoque que aumente el rendimiento de las membranas y reduzca el tiempo de procesamiento del fármaco sería valioso. Con la introducción de nuevos medios de prefiltración y el aumento correspondiente en el rendimiento de los filtros de virus, la filtración de más y más corrientes de alimentación se está viendo limitada por el flujo. Por lo tanto, mejoras en la permeabilidad de los filtros de virus, al tiempo que se mantienen las propiedades de retención del virus, tendrán un efecto directo sobre el coste de la etapa de filtración de virus.

Las esteras de nanofibras electrohiladas son materiales poliméricos muy porosos, en donde el tamaño de “ poro” de la estera es linealmente proporcional al diámetro de la nanofibra electrohilada, mientras que la porosidad de la estera es relativamente independiente del diámetro de la fibra y normalmente cae en el estrecho intervalo de 85-90 %. Dicha alta porosidad es responsable de la mejora sustancial de la permeabilidad proporcionada en las esteras de nanofibras electrohiladas en comparación con la porosidad de las membranas coladas por inmersión de espesor y tamaño de poro similares. Además, esta ventaja se amplifica en el intervalo de tamaño de poro más pequeño, como los requeridos para la filtración de virus, debido a la porosidad reducida de las membranas de ultrafiltración descritas anteriormente.

La naturaleza aleatoria de la formación de esteras electrohiladas ha llevado a la suposición general de que no son adecuadas para una filtración crítica de corrientes líquidas. Han comenzado recientemente a aparecer en la bibliografía solicitudes de materiales electrohilados para la eliminación fiable de partículas relativamente grandes (tales como bacterias) de soluciones (véanse, por ejemplo, la publicación internacional N.° WO 2010/107503 A1, de EMD Millipore Corporation, titulada “ Removal of Microorganisms from Fluid Samples Using Nanofiber Filtration Media” , y Wang y col., “ Electrospun nanofibrous membranes for high flux microfiltración” , Journal of Membrane Science, 392-393 (2012) 167-174). Al mismo tiempo, no se han publicado informes sobre el uso de nanofibras electrohiladas para la filtración basada en tamaño de partículas extremadamente pequeñas, tales como parvovirus. US-2012/0125847 A1 describe un método para eliminar patógenos de una composición plaquetaria de calidad para transfusión. US-2006/0016748A1 describe una membrana microporosa hidrófila que comprende una resina termoplástica. US-2012/0061332A1 describe un método para eliminar retrovirus de muestras líquidas y un medio de filtración líquida que contiene nanofibras. Ma y col. J.Mater. Chem., 2011, 21, 7507-7510 describe nanofibras de celulosa ultrafinas para purificación de agua.

Pueden describirse tres categorías de la técnica anterior pertenecientes a la eliminación de virus y a las nanofibras electrohiladas generalmente como sigue: Categoría 1. Eliminación de virus utilizando materiales electrohilados mediante adsorción o inactivación

La Solicitud de patente publicada de los Estados Unidos N.° US-2008/0J64214 A1 concedida a Advanced Powder Technologies describe un material de filtro no tejido para purificación y desinfección de líquidos caracterizado por la sorción electrostática de contaminantes, incluyendo partículas electronegativas, por ejemplo, bacterias, virus, partículas coloidales, etc.

La patente US-6.770.204 concedida a Koslow Technologies Corporation describe un medio filtrante de material compuesto que tiene un material que altera el pH que puede elevar el pH de un afluente de forma que los contaminantes microbiológicos del afluente quedan sustancialmente cargados negativamente, de modo que un medio cargado positivamente dentro del medio filtrante de material compuesto pueda capturar más eficazmente los contaminantes microbiológicos.

US-7.927.885 concedida a Fujifilm Corp. proporciona material de soporte electrohilado que transporta anticuerpos para la eliminación de virus.

La Solicitud de patente publicada de los Estados Unidos N.° US-2008/0264259, concedida a la Hong Kong Polytechnic University y titulada “ Nanofiber filter facemasks and cabin filters” , describe un medio de filtración que incluye una capa de filtro fina que tiene una pluralidad de nanofibras y una capa de filtro gruesa que tiene una pluralidad de microfibras unidas a la capa de filtro fina, en donde las nanofibras comprenden una carga eléctrica o agente antimicrobiano.

La publicación internacional N.° WO 2008/073507 concedida a Argonide Corp. describe una estructura fibrosa para corrientes de fluido que comprende una mezcla de fibras de nanoalúmina y fibras adicionales fabricadas a partir de microvidrio, celulosa, celulosa fibrilada y lyocel, y dispuestas en una matriz para crear poros asimétricos y a la que se adhieren partículas finas, ultrafinas o nanométricas, como carbón activado en polvo, sin utilizar aglutinantes. La estructura fibrosa que contiene carbón activado en polvo intercepta contaminantes (tales como virus) de corrientes de fluido.

Los materiales de filtro comprendidos en la Categoría 1 parecen aprovechar determinados efectos superficiales del medio electrohilado, ya sea adsorbiendo o inactivando virus, Categoría 2. Eliminación de microorganismos mediante materiales electrohilados utilizando mecanismos de tamizado.

La publicación internacional N.° WO 2010/107503 concedida a EMD Millipore Corporation describe un método para la eliminación muy eficiente basada en el tamaño de bacterias y micoplasmas de muestras líquidas utilizando nanofibras electrohiladas.

La publicación internacional N.° WO 2012/021308 concedida a EMD Millipore Corporation describe la eliminación basada en el tamaño de retrovirus (que tienen 80-130 nm) con LRV >6 utilizando esteras de nanofibras electrohiladas.

La Solicitud de patente publicada de los Estados Unidos N.° US-2011/0198282 concedida a la State University of New York Research Foundation, titulada “ High Flux High Efficiency Nanofiber Membranes and Methods of Production Thereof” , describe membranas de materiales compuestos de nanofibras que comprenden un sustrato electrohilado revestido con nanofibras de celulosa, producidas a partir de una capa de microfibras de celulosa oxidada, aplicada a la misma.

La Solicitud de patente publicada de los Estados Unidos N.°US-2008/0264258 de Elmarco SRO describe un filtro para eliminar las impurezas físicas y/o biológicas que comprende un filtro de nanofibras “ activo” que supuestamente destruye/debilita las impurezas, mientras que una capa de filtración de nanofibras captura las impurezas.

Una serie de solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas con númerosUS-2004/0038014. US-2005/0163955, y US-2004/0038013, cada una concedida a Donaldson, Inc. describen medios que contienen fibras y esteras de fibras que tienen fibras de 30 nm tratadas con temperatura y presión.

Una presentación la conferencia Nanocon 2010, de Lev y col., describe el uso de telas de nanofibras comerciales con diámetros de fibra entre ~100 nm y 155 nm para retener bacterias E. coli (1,1-1,5 x 2 micrómetros a 6 micrómetros) con una eficiencia de 72,25 % a 99,83 % (0,6 a 2,8 LRV).

La publicación internacional N.° WO 2009/071909, concedida a Munro Technology Ltd., describe un dispositivo de matriz ordenada espacialmente de fibras nanométricas con huecos de tamaño nanométrico, adecuado para la filtración de partículas, en particular partículas en el intervalo de tamaño nanométrico, tales como virus. Sin embargo, no se proporcionan ejemplos que muestren una filtración exitosa.

Ninguno de los materiales de filtro de la Categoría 2 parece permitir la eliminación basada en tamaño de virus o de partículas de tamaño inferior a 30 nm.

Categoría 3. Intentos de reducir el diámetro de la fibra por debajo de 20 nm.

Huang y col., Nanotechnology 17 (2006) 1558-1563, describe nanofibras de polímero electrohiladas que tienen un diámetro pequeño y proporcionan observaciones microscópicas de las fibras individuales de hasta 2 nm, producidas utilizando 2 % de nailon al 4,6 con piridina añadida,

La patente US-7.790.135 concedida a Physical Sciences, Inc. describe un método de electrohilado de fibras de poliacrilonitrilo de hasta 15 nm y la posterior pirólisis para producir una estera de nanotubos de carbono fuera de las mismas.

Tan y col., Polymer 46, (2005) 6128-6134, presenta un estudio de parámetros sistemáticos para la fabricación de fibras ultrafinas mediante un proceso de electrohilado, que incluye la fabricación de una estera que tiene diámetros de fibra promedio de 19 ± 6 nm.

Hou y col., Macromolecules 2002, 35, 2429-2431, describen nanotubos de poli(p-xilileno) mediante el recubrimiento y la eliminación de una plantilla polimérica ultrafina. Fibras individuales observadas con diámetros de 5-7 nm.

Duan y col., 20082a IEEE International Nanoelectronics Conference (INEC 2008), 33-38, describen la preparación de nanocintas de grafito a partir de nanofibras ultrafinas de PMMA (polimetacrilato de metilo) electrohiladas mediante irradiación con haz de electrones, en donde las fibras individuales de PMMA debían tener diámetros medios observados de aproximadamente 10 nm.

Cada una de las descripciones de nanofibras electrohiladas de la Categoría 3 intenta reducir el diámetro de la fibra de los materiales electrohilados. Si bien determinadas descripciones de nanofibras electrohiladas en la Categoría 3 alegan fibras individuales tan pequeñas como 10 nm de diámetro o menos, en el mejor de los casos estas descripciones proporcionan imágenes microscópicas de una sola fibra de longitud desconocida, y no proporcionan ningún dato sobre la obtención o el intento sistemático de obtener esteras de fibra consistentes con el tamaño promedio de todas las fibras en las esteras en el intervalo de 6 nm a 13 nm. En particular, no se ha comunicado que dichas esteras indiquen alguna capacidad de retención de virus de las membranas actualmente conocidas.

La presente invención proporciona un método basado en electrohilatura para fabricar esteras de nanofibras muy finas con una uniformidad excepcionalmente alta y para su uso en la eliminación fiable y eficiente de partículas virales de corrientes de fluido. Como se proporciona en la presente descripción, se logra una alta retención de parvovirus modelo (>3 LRV) con una estera de filtración de líquido porosa electrohilada de nanofibras poliméricas. Estas esteras de nanofibras electrohiladas pueden utilizarse para la eliminación de virus de soluciones acuosas en la fabricación biofarmacéutica, donde estas esteras de nanofibras electrohiladas tienen una ventaja de alta permeabilidad y alta capacidad en comparación con los productos de filtración de eliminación de virus actuales de la técnica.

Resumen de la invención

La presente invención describe membranas de filtración electrohiladas muy porosas que tienen tamaños de poro muy pequeños que pueden utilizarse para la retención de parvovirus y otras partículas en el intervalo de tamaños de 18 nm a 30 nm. Las membranas de filtración electrohiladas de alta porosidad proporcionadas en la presente descripción permiten que flujos de agua más altos, reduciendo notablemente la cantidad de tiempo requerido para las etapas de filtración de virus. Con esta mayor velocidad de filtración del virus o, de forma alternativa, presiones más bajas según se requiera para la misma operación, los filtros electrohilados de parvovirus tales como los descritos en la presente descripción permiten la aplicación de filtración del virus que se cree no eran conocidas anteriormente.

Por ejemplo, un requisito de presión más bajo puede permitir el uso de filtros de eliminación de virus con equipos más simples, menos costosos y complicados, tales como soportes de flujo por gravedad, y bombas de vacío y peristálticas. Además, la mayor permeabilidad permite la filtración económica de grandes volúmenes de fluido durante los procesos de purificación de proteínas, como el volumen completo de un biorreactor y de la solución tampón del proceso, creando de este modo una “ barrera” de virus alrededor de todo el proceso de purificación de proteínas.

La presente invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que una combinación previamente desconocida de parámetros de solución de hilado y condiciones ambientales da lugar a la fabricación de esteras electrohiladas muy consistentes que tienen tamaños de poro efectivo extremadamente pequeños. El término “ tamaño de poro efectivo” , como se utiliza en la presente descripción, describe una propiedad estructural de un material poroso evaluado con un método funcional, en vez de un método visual. Para comparar materiales porosos con estructuras drásticamente diferentes, tales como membranas moldeadas en solución y esteras de nanofibras, métodos visuales como la microscopía son poco adecuados para predecir si estos materiales se comportarían de forma similar en la misma aplicación. Por el contrario, métodos funcionales tales como mediciones del punto de burbuja, porosimetría líquido-líquido, porosimetría de intrusión, tamizado de macromoléculas y/o partículas de tamaños dados, permiten comparar las propiedades de distintos materiales. Por lo tanto, son posibles comparaciones entre distintos materiales, que pueden describirse como teniendo tamaños de poro efectivos “ más pequeños” , “ más grandes” o “ similares” dependiendo de cómo funcionan en una prueba funcional.

En algunas realizaciones de la presente invención se producen nanofibras electrohiladas que tienen un diámetro promedio entre 6 nm y 13 nm.

En otras realizaciones, las nanofibras se ensamblan en alfombrillas consistentes que tienen un punto de burbuja de flujo medio medido con perfluorohexano fluido por encima de 100 psi, o por encima de 120 psi o por encima de 130 psi (1 psi = 6,89 kPa).

En algunas realizaciones, las esteras de nanofibras pueden ensamblarse en dispositivos de una o varias capas para la filtración de líquidos.

En algunas realizaciones, según los diversos aspectos de la presente invención, una solución de alimentación acuosa que contiene un modelo o un parvovirus real puede filtrarse con un dispositivo que contiene esteras de nanofibras electrohiladas como se describe en la presente descripción, de modo que en una realización el filtrado contendrá menos de 0,1 % de virus presentes en la solución de alimentación; en otras realizaciones, el filtrado contendrá menos de 0,01 % de virus presentes en la solución de alimentación; o en otras realizaciones, menos de 0,001 % de virus presentes en la solución de alimentación; o en otras realizaciones, el filtrado contendrá menos de 0,0001 % de virus presentes en la solución de alimentación.

En algunas realizaciones, las soluciones previstas para filtración de virus contienen un producto biofarmacéutico de interés, tal como proteína terapéutica, anticuerpo, hormona o similares.

En otras realizaciones, las soluciones previstas para filtración de virus son soluciones tampón acuosas.

En otras realizaciones más, las soluciones previstas para filtración del virus son medios líquidos para un biorreactor de cultivo celular.

En algunas realizaciones según los diversos aspectos de la presente invención, los métodos y/o composiciones de la presente invención pueden utilizarse junto con una o más etapas de filtración, clarificación y prefiltración.

Las características y ventajas adicionales de la invención se establecerán en la descripción detallada y en las reivindicaciones, que siguen. Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Se debe entender que la descripción general anterior y la siguiente descripción detallada, las reivindicaciones, así como también los dibujos adjuntos son solo ilustrativos y explicativos, y pretenden proporcionar una explicación de varias modalidades de las presentes enseñanzas. Las modalidades específicas que se describen en la presente descripción se ofrecen solo a modo de ejemplo y no pretenden ser limitantes de ninguna manera.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de esta descripción, ilustran las modalidades de la invención contempladas en la presente y, junto con la descripción, sirven para explicar los principios de la invención.

La Figura I muestra una micrografía SEM de una estera electrohilada obtenida con nailon 6 al 8 %.2,2,2-trifluoroetanol (TFE) al 40 % y formiato de amonio al 0,7 % en la mezcla según una realización de esta invención.

Cada una de las Figuras 2A y 2B muestra micrografías SEM de esteras electrohiladas producidas con la misma solución a un punto de rocío de 4 °C (izquierda, diámetro de fibra 23 nm) y punto de rocío 17 °C (derecha, diámetro de fibra 9 nm) según otras realizaciones de esta invención.

Cada una de las Figuras 3A y 3B representa micrografías SEM de mejoras en la calidad de las esteras electrohiladas de nailon cuando se añade 2,2,2-trifiuroetanol (TFE) a la mezcla de hilado (derecha), según los Ejemplos 2A y 2B, según otras realizaciones de esta invención.

Cada una de las Figuras 4A, 4B, 4C y 4D representa micrografías SEM de esteras electrohiladas en donde la concentración de nailon 6 en la solución de hilado según el Ejemplo 3 se reduce de 14 % en peso al 8 % en peso, lo que da lugar a la formación de esteras muy irregulares.

La Figura 5 representa micrografías SEM de esteras electrohiladas obtenidas con una mezcla estándar de nailon 6 al 8 % y con una mezcla de nailon 6 al 7 %.

La Figura 6 es una representación gráfica del LRV PhiX-174 frente al rendimiento de tres (3) dispositivos de capas fabricados según el Ejemplo 3, promedio de dos (2) dispositivos. El límite de ensayo es aproximadamente 6,3 LRV.

La Figura 7 es una representación gráfica de las curvas de retención de dextrano para la membrana Viresolve™ Pro y una estera electrohilada según otras realizaciones de esta invención.

La Figura 8 representa la retención de PhiX-174 (símbolos blancos y líneas punteadas) y la disminución del flujo (símbolos sólidos y líneas continuas) para una (1) capa de membrana Viresolve® Pro (triángulos) y tres (3) capas de materiales compuestos electrohilados (cuadrados) según otras realizaciones de esta invención, a una presión de 30 psi.

Descripción detallada de realizaciones de la invención

Antes de describir la presente invención con más detalle, se definirán varios términos. El uso de estos términos no limita el alcance de la invención, sino que solo sirve para facilitar la descripción de la invención. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

I. Definiciones

Como se usa en la presente descripción, las formas singulares “ un” , “ una” , y “ el/la” incluyen los referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera.

Como se utiliza en la presente descripción, el término “ nanofibras” se refiere a fibras que tienen diámetros que varían de unos pocos nanómetros hasta varios cientos de nanómetros.

Como se utiliza en la presente descripción, los términos “ medio filtrante” o “ medios filtrantes” se refieren a un material, o recopilación de material, a través del cual pasa un líquido que transporta un microorganismo contaminante, en donde el microorganismo se deposita en o sobre el material o recopilación de materiales.

Como se utiliza en la presente descripción, el término “ permeabilidad” se refiere a la velocidad a la que un volumen de fluido pasa a través de un medio de filtración de un área dada a una caída de presión dada a través de la membrana. Las unidades comunes de permeabilidad son litros por metro cuadrado por hora para cada psi de caída de presión, abreviado como LMH/psi donde 1 psi=6,89 kPa.

El término “ electrohilado” , como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un proceso de hilado electrostático para producir nanofibras a partir de una solución de polímero o fundido aplicando un potencial eléctrico a dicha solución. El proceso de hilado electrostático para preparar una estera de nanofibras electrohiladas para un medio de filtración, que incluye un aparato adecuado para realizar el proceso de hilado electrostático, se describe en las publicaciones internacionales N.°s. WO 2005/024101, WO 2006/131081, y WO 2008/106903, cada una concedida a Elmarco S.R.O, de Liberec, República Checa.

El término “ estera de nanofibras” como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un conjunto de múltiples nanofibras, de forma que el espesor de dicha estera es al menos aproximadamente 10 veces mayor que el diámetro de una sola fibra en la estera. La nanofibra puede disponerse aleatoriamente en dicha estera, o alinearse a lo largo de uno o múltiples ejes.

El término “virus” como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un pequeño agente infeccioso que puede replicarse solo dentro de las células vivas de un organismo. Los virus pueden infectar tanto células eucariotas como bacterianas. Si bien los primeros son relevantes para asegurar la seguridad de las formulaciones terapéuticas, los últimos son un sustituto común utilizado para evaluar las propiedades de retención de los filtros de eliminación de virus.

Como se utiliza en la presente descripción, el término “ parvovirus” se refiere a una clase de algunas de las partículas icosaédricas sin envoltura más pequeñas de 18 nm a 26 nm de tamaño (Lepard, Keit; Nigel Dimmock; Easton, Andrew (2007). Introduction to Modern Virology. Blackwell Publishing Limited p. 450).

El término “ LRV” o “valor de reducción logarítmica” , como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un logaritmo común (base 10) de la relación de concentración de partículas en la alimentación a la del filtrado, medido en condiciones normalizadas.

Los términos “ inmunoglobulina” , “ Ig” o “ anticuerpo” (utilizados indistintamente en la presente descripción) se refieren a una proteína que tiene una estructura básica de cuatro cadenas polipeptídicas que consta de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, dichas cadenas estabilizadas, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro intercatenarios, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno.

Como se utiliza en la presente descripción, las inmunoglobulinas o anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica o polimérica. Los anticuerpos IgM existen en forma pentamérica y/o los anticuerpos IgA existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. El término “ fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse a través del tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos también pueden obtenerse por medios recombinantes. Fragmentos ilustrativos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')₂, Fc y/o Fv.

El término “ preparación biofarmacéutica” , como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier composición que contiene un producto de interés (por ejemplo, una proteína terapéutica o un anticuerpo, que es generalmente un monómero) y componentes no deseados, tales como agregados de proteínas (por ejemplo, agregados de alto peso molecular del producto de interés).

II. Medio de filtración ilustrativo

Una realización de la presente invención incluye una estera porosa de nanofibras electrohiladas para la filtración de líquidos.

Una realización adicional de la invención incluye un medio de filtración de líquidos que tiene nanofibras con un diámetro medio de fibra de 6 nm a 13 nm, en donde el medio de filtración tiene un tamaño medio de poro que varía de 0,01 |jm a 0,03 jm , una porosidad que varía de 80 % a 95 %, un espesor que varía de 1 jm a 100 jm , o un espesor de aproximadamente 2 jm y aproximadamente 30 jm , y una permeabilidad a los líquidos superior a 1,45 LMH/kPa (10 LMH/psi).

III. Materiales poliméricos de nanofibra ilustrativos

Polímeros adecuados para su uso en las nanofibras de la invención incluyen polímeros termoplásticos y termoendurecibles. Polímeros adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, nailon, poliimida, poliamida alifática, poliamida aromática, polisulfona, celulosa, acetato de celulosa, polietersulfona, poliuretano, poli(urea uretano), polibencimidazol, polieterimida, poliacrilonitrilo, poli(tereftalato de etileno), polipropileno, polianilina, poli(óxido de etileno), poli(naftalato de etileno), poli(tereftalato de butileno), caucho de estireno butadieno, poliestireno, poli(cloruro de vinilo), poli(alcohol vinílico), poli(acetato de vinilo), poli(fluoruro de vinilideno), poli(vinil butileno), copolímeros, compuestos derivados y las mezclas y combinaciones de los mismos. Los polímeros de condensación de poliamida adecuados, que caen en el ámbito de las reivindicaciones, incluyen nailon-6; nailon-6,6;nailon 6,6-6,10; copolímeros de los mismos.

El término “ nailon” como se utiliza en la presente descripción incluye nailon-6, nailon-6,6, nailon 6,6-6,10 y copolímeros, mezclas y combinaciones de los mismos.

IV. Métodos ilustrativos para formar una estera fibrosa

En una realización de la invención, se obtiene una estera fibrosa al depositar nanofibra(s) a partir de una solución de nailon. La estera de nanofibras tiene un gramaje de entre aproximadamente 0,1 g/m2 y aproximadamente 10 g/m2, medido con respecto a la sustancia seca, (es decir, después de que el disolvente residual se haya evaporado o eliminado de otra forma).

En otra realización de la invención, el nailon se disolvió en una mezcla de disolventes que incluyen, aunque no de forma limitativa, ácido fórmico, ácido sulfúrico, ácido acético. 2,2,2-trifluoroetanol, 2,2,2,3,3,3-hexafluoropropanol y agua.

En otra realización de la invención, la solución de nailon se preparó disolviendo polímero de nailon seco en un grupo de disolventes, es decir, preparando primero una solución madre, y luego añadiendo otros disolventes para asegurar que la disolución esté lista para el electrohilado.

En otra realización de la invención, el polímero de nailon (es decir, el material inicial) se hidrolizó parcialmente en el transcurso de la preparación de la solución, de modo que el peso molecular promedio del polímero de nailon parcialmente hidrolizado (es decir, el material final) es menor que el peso molecular promedio del polímero de nailon inicial.

En una realización adicional de la invención, la conductividad de la solución de nailon se ajusta con un compuesto ionizable adecuado en un disolvente dado. Ejemplos de dichos compuestos ionizables adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, sales, ácidos y bases orgánicas e inorgánicas. Un ejemplo de un compuesto preferido utilizado para ajustar la conductividad de una solución de nailon es formiato de amonio.

En otra realización de la invención, el entorno en el interior de la cámara de electrohilado se controla para asegurar que la humedad ambiental se mantenga en un punto de rocío por encima de aproximadamente 12 °C.

En una realización de la invención, cualquiera de una variedad de sustratos o soportes porosos de una o varias capas se disponen en una cinta de recogida en movimiento o estacionaria para recoger y combinar con el medio de estera de nanofibras electrohiladas, formando un dispositivo para la filtración compuesto.

V. Sustratos ilustrativos para recoger las nanofibras

Ejemplos de sustratos o soportes porosos de una o varias capas incluyen, aunque no de forma limitativa, materiales no tejidos unidos por hilatura, materiales no tejidos por fusión, materiales no tejidos perforadas con aguja, materiales no tejidos de unión por hilatura, materiales no tejidos tendidos en húmedo, materiales no tejidos unidos por resina, telas tejidas, telas de punto, papel y combinaciones de los mismos así como otras esteras de electrohilado con fibras de diámetro similar o mayor a las nanofibras electrohiladas recogidas en la misma.

En una realización de la invención, cuando la capa de sustrato es una estera de nanofibras, el diámetro medio de fibra del sustrato puede variar de 10 nm a 500 nm.

En otra realización, el diámetro medio de fibra del sustrato puede variar de 50 nm a 200 nm.

En otra realización, el diámetro medio de fibra del sustrato puede variar de 10 nm a 50 nm.

Una consideración importante para elegir una capa de sustrato es la suavidad de la superficie, en otras palabras, el diámetro de las fibras de sustrato con respecto al diámetro de las fibras que forman la capa de nanofibras activas. Como se describe en WO 2013/013241de EMD Millipore Corporation, las propiedades de filtración de las nanofibras pueden depender fuertemente de las propiedades de la capa de soporte subyacente.

Si bien el medio de filtración se utiliza a menudo en una configuración de capa única, a veces es ventajoso proporcionar más de una capa de medio de filtración adyacentes entre sí. La estratificación de filtros de membrana para mejorar la retención de partículas se utiliza comúnmente en la filtración de virus y se practica comercialmente en las líneas de productos Viresolve® NFP y Viresolve Pro® de EMD Millipore Corporation. Los medios para la filtración en capas de la misma o diferente composición también se usan para mejorar el rendimiento del filtro. Ejemplos de dichos filtros en capas incluyen las líneas de productos Express® SHC y SHRP de EMD Millipore Corporation.

Otras consideraciones para elegir un producto de filtración de varias capas incluyen la economía y la conveniencia de la fabricación de medios y dispositivos, la facilidad de esterilización y la validación. Los medios de filtración fibrosos de la presente invención pueden utilizarse en una configuración de una sola capa o de múltiples capas.

La configuración de capa preferida para el medio de filtración se selecciona con frecuencia basándose en consideraciones prácticas. Estas consideraciones tienen en cuenta la relación conocida entre el LRV y el grosor, de manera que el LRV generalmente aumenta con el grosor. Un profesional puede seleccionar múltiples formas de lograr los niveles deseados de LRV, por ejemplo, utilizando menos capas de mayor grosor o un mayor número de capas más delgadas.

VI. Métodos de ensayo ilustrativos

Se determinó el “ gramaje” según la norma ASTM D-3776, informado en g/m2

Se determinó la distribución de pesos moleculares del polímero de nailon utilizando un sistema de HPLC-SEC provisto de una columna Jordi xStream 500A de Jordi Labs, Mansfield, MA, EE.UU., y un Detector de IR (índice de refracción) diferencial Waters 410, de Waters Corps., Milford, MA, EE.UU., utilizando un disolvente hexafluoroisopropanol con trifluoracetato de sodio 0,01 M. La calibración se realizó con once (11) patrones de PMMA (polimetilmetacrilato), que tenían un peso molecular de 202 a 903.000.

Se calculó la porosidad dividiendo el gramaje de la muestra en g/m2 por la densidad del polímero en g/cm3, por el espesor de la muestra en micrómetros y multiplicando por 100 y restando el número resultante de 100, es decir, porosidad=100-[gramaje/(densidad.por.espesor).por.100].

Se determinó el diámetro de la fibra de la siguiente forma: Se tomó una imagen de microscopio electrónico de barrido (SEM) con un aumento de 60.000 veces de cada lado de la muestra de la estera de nanofibras. Se midió el diámetro de diez (10) nanofibras claramente distinguibles de cada imagen SEM y se registró. No se incluyeron defectos (es decir, grumos de nanofibras, gotas de polímero, intersecciones de nanofibras). Se calculó el diámetro promedio de las fibras de cada lado de la muestra de estera de nanofibras. Los diámetros medidos también incluyen un recubrimiento metálico aplicado durante las preparaciones de las muestras para SEM. Se estableció que dicho recubrimiento añade aproximadamente de 4 a 5 nm al diámetro medido. Los diámetros comunicados aquí se han corregido para esta diferencia restando 5 nm del diámetro medido.

Se determinó el espesor según la norma ASTM D1777-64 y se informó en micrómetros (o micrómetros) y se representa por el símbolo “ pm” .

Se midió el punto medio de burbuja de flujo según la norma ASTM E1294-89, “ Standard Test Method for Pore Size Characteristics of Membrane Filters Using Automated Liquid Porosimeter” . Utilizando un método de punto de burbuja automatizado según ASTM F316 utilizando un porosímetro de flujo capilar a medida, en principio similar a un aparato comercial de Porus Material, Inc. (PMI), Ithaca, NY, EE.UU. Las muestras individuales de 25 mm de diámetro se humedecieron con perfluorohexano, comercializado por 3M, St. Paul, MN, EE.UU como Fluorinert™ FC-72. Cada muestra se colocó en un soporte, y se aplicó una presión diferencial de aire y el líquido se retiró de la muestra. La presión diferencial a la que el flujo húmedo es igual a la mitad del flujo seco (flujo sin disolvente humectante) se usa para calcular el tamaño de poro del flujo medio mediante el uso de un software suministrado.

La “ permeabilidad” es la velocidad a la que el fluido pasa a través de la muestra de un área determinada a una disminución de presión dada, y se midió haciendo pasar agua desionizada a través de muestras de medio filtrante con un diámetro de 47 (9,6 cm2 de área de filtración) mm. El agua se hizo pasar a través de las muestras mediante presión hidráulica (presión en la cabeza del agua) o neumática (presión del aire sobre el agua).

El tamaño de poro efectivo de una esterilla electrohilada puede medirse utilizando técnicas de membrana convencionales tales como punto de burbuja, porometría líquido-líquido y test de exposición con partículas de determinado tamaño. Se sabe que el tamaño de poro efectivo de una esterilla fibrosa generalmente aumenta con el diámetro de fibra y disminuye con la porosidad.

El ensayo del “ punto de burbuja” proporciona una forma cómoda de medir el tamaño efectivo de los poros. Se calcula a partir de la siguiente ecuación:

, donde P es la presión del punto de burbuja, y es la tensión superficial del líquido de la sonda, r es el radio de poro y 0 es el ángulo de contacto líquido-sólido. Los fabricantes de membranas asignan clasificaciones nominales del tamaño de los poros a los filtros de membrana comerciales, lo que normalmente indica que cumplen determinados criterios de retención para partículas o microorganismos más que el tamaño geométrico de los poros reales.

VII. Determinación ilustrativa de la retención de parvovirus

Se sometió a ensayo la retención de parvovirus siguiendo un método de ensayo de EMD Millipore Corporation, en donde la corriente de exposición al bacteriófago PhiX-174 se preparó con un título mínimo de 1,0 x 106 ufp/ml en una solución de tampón acetato 50 mM, pH 5,0, que contenía NaCl 100 mM. Los medios porosos a ensayar se cortaron en discos de 25 mm y se sellaron en dispositivos de polipropileno sobremoldeado. A continuación, estos dispositivos fueron expuestos mediante la corriente de exposición al bacteriófago PhiX-174 a 15 psi de presión después de humedecerse con agua a 30 psi. Se descartaron los 5 ml iniciales de efluente para eliminar los efectos de la dilución con el volumen de retención. Se recogieron fracciones de 4 ml, inmediatamente después de descartar 5 ml (LRVa) así como al final de la carrera después de 200 ml de efluente (LRVr/na/). La cuantificación del bacteriófago en la introducción inicial y final se llevó a cabo en placas incubadas durante la noche utilizando una caja de luz y un contador de colonias. Se calcularon los valores de retención logarítmica (LRV) correspondientes.

Los siguientes ejemplos de diferentes realizaciones de la presente invención demostrarán que una estera de nanofibras electrohiladas puede poseer simultáneamente alta permeabilidad y alta retención de bacterias.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de solución madre de nailon para electrohilado

Este ejemplo proporciona un procedimiento ilustrativo para preparar una solución de nailon para electrohilado según una realización de esta invención.

El nailon 6 fue suministrado por BASF Corp., Florham Park. NJ, EE.UU. bajo la marca comercial Ultramid 1124; se preparó una solución al 15 % en peso en una mezcla de tres disolventes: ácido fórmico, ácido acético y agua, presentes en una relación en peso 2:2:1. La solución se preparó agitando vigorosamente la mezcla de disolventes y polímero en un reactor de vidrio durante 5 a 6 horas a 80 °C. Posteriormente se enfrió a temperatura ambiente. El peso molecular del polímero final se analizó mediante SEC y se encontró que se reducía como resultado del calentamiento en este sistema disolvente (Tabla 1). Además, también se redujo la distribución de pesos moleculares (Mw/Mn).

Tabla 1. Análisis de peso molecular de nailon 6 antes de la preparación de la solución madre y como resultado de la hidrólisis.

Se encontró que la reducción del peso molecular del polímero (por ejemplo, nailon) a través de la hidrólisis da lugar a la formación de nanofibras que tienen un diámetro más pequeño.

Ejemplo 2. Preparación de solución de nailon lista para electrohilado según una realización de esta invención.

La solución madre preparada en el Ejemplo 1 se diluyó al 8 % en peso de polímero con 2,2,2-trifluroetanol (TFE), ácido fórmico y agua. Se añadió formiato de amonio a la concentración del 1 % en peso. La composición de la solución de hilado se especifica en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición de la solución de hilado.

La viscosidad de la solución final fue de 30 a 35 cP a 25 °C y la conductividad fue de 1,0 a 1,5 mS/cm.

Ejemplo 3. Preparación de una estera de retención de parvovirus según una realización de esta invención.

La solución del Ejemplo 2 se centrifugó inmediatamente utilizando un aparato de electrohilado sin boquilla Nanospider™, comercializado por Elmarco, Inc., Morrisville, NC EE.UU. El electrodo giratorio de 6 hilos está provisto de un hilo de acero de calibre 33, la distancia entre la bandeja de la solución y el colector es de 140 mm, la velocidad de rotación del electrodo es de 60 Hz, la humedad se mantiene entre el punto de rocío de 10° y 16° utilizando un sistema de humidificación externo. El tiempo de hilado es de 30 min. En esta realización, el material de soporte utilizado para recoger las nanofibras también es una estera de nailon 6 electrohilado con un diámetro medio de fibra de aproximadamente 100 nm. En esta realización, el material electrohilado de soporte se produce mediante electrohilado del nailon 6 a partir de una solución al 12 % en peso en una mezcla de ácidos acético y fórmico, siendo la relación en peso entre los ácidos 2: 1, utilizando el mismo equipo de electrohilado y parámetros proporcionados anteriormente, sin embargo, de forma general sin controlar la humedad.

La Tabla 3 describe las propiedades de la estera electrohilada producida, que incluye una medida clave del tamaño de poro como se indica por el punto de burbuja de flujo medio, medido con un fluido de baja tensión superficial (-10 dinas/cm). Fluorinert™ FC-72, comercializado por 3M.

La Figura 1 muestra una micrografía de SEM de una estera electrohilada según una realización de la invención, que tiene un diámetro medio de fibra medido, después de la corrección para la capa de recubrimiento SEM, de aproximadamente 9-12 nm. Los valores del punto de burbuja para esta realización de la invención indican claramente que las esteras electrohiladas presentan tamaños de poro muy pequeños, en el intervalo de las membranas de retención de parvovirus tradicionales, que normalmente se encuentran en el intervalo de entre 120 psi y 180 psi.

Tabla 3.

Ejemplo comparativo 1, efecto de la humedad sobre la calidad de la estera de nanofibras

El Ejemplo comparativo I demuestra que mantener la humedad por encima de aproximadamente 10 °C del punto de rocío es ventajoso para producir esteras de nanofibras de diámetro más pequeño. Se preparó una solución al 12 % de nailon 6 en una mezcla de ácido fórmico, ácido acético y agua, presentes en una relación en peso de 2:2:1 calentando la mezcla a 80 °C durante 10 horas. La solución se enfrió y las esteras de nanofibras se centrifugaron utilizando el aparato de electrohilado sin boquilla Nanospider™ de Elmarco Lab utilizado en el Ejemplo 3.

Puede observarse en la Figura 2 que aumentar la humedad del punto de rocío de 4 °C al punto de rocío a 17 °C reduce el diámetro de la fibra de 23 nm a 9 nm en promedio. Sin embargo, la estera electrohilada producida a una humedad más alta no puede utilizarse en filtración debido a su evidente ribeteado. La formación de ribetes crea defectos significativos en la estructura de la estera de nanofibras, dando lugar a una mala resistencia mecánica y una amplia distribución de tamaños de poro. Por lo tanto, en vez de utilizar una mayor humedad para producir esteras de nanofibras de diámetro más pequeño, son necesarias otras mejoras para crear una estera de nanofibras de calidad con diámetros pequeños.

Ejemplo 2.

El Ejemplo 2 demuestra que la adición de 2,2,2-triflutoetanol (TFE) a una solución de hilado mejora sustancialmente la calidad de las esteras de nanofibras producidas. Se preparó una solución madre de electrohilado según el Ejemplo 1. Se tomaron dos fracciones iguales de la solución madre.

La fracción A se diluyó adicionalmente a una concentración de polímero en 8 % en peso (es decir, nailon 6) con la misma mezcla de disolventes utilizada para la solución madre (ácido fórmico, ácido acético, agua).

La fracción B se diluyó con una mezcla de cuatro disolventes: ácido fórmico, ácido acético, agua y TFE, hasta una concentración final de TFE de 25 % en peso.

Se añadió formiato de amonio a ambas disoluciones a una concentración de 0,5 % en peso.

Solución A: viscosidad 32 cP, conductividad 3,4 mS/cm.

Solución 13: Viscosidad 35 cP, conductividad 2,6 mS/cm. En la Figura 3 se muestran las micrografías SEM de las esteras producidas con estas soluciones. Puede observarse que la estera producida con TFE tiene una consistencia mucho mayor de fibras y menor rotura de fibras.

Ejemplo comparativo 2. Reducción de la concentración de nailon 6 en solución de hilado

El Ejemplo comparativo 2 demuestra que la reducción de la concentración de nailon 6 al 8 % sin utilizar formiato de amonio o TFE en la mezcla no da lugar a la formación de una estera electrohilada consistente con un diámetro de fibra pequeño.

Se preparó una solución madre de nailon 6 según el Ejemplo 1, y posteriormente se diluyó con la misma mezcla de disolventes (ácido fórmico, ácido acético y agua) y se utilizó para electrohilado. La Tabla 4 enumera las propiedades de las soluciones y los diámetros promedio de las fibras de las esteras electrohiladas.

La Figura 4 demuestra que las concentraciones más bajas de nailon dan como resultado esteras muy irregulares. Tabla 4. Propiedades de solución de nailon 6 y propiedades de las esteras electrohiladas resultantes

Ejemplo comparativo 3. Optimización de la solución de hilado.

Las propiedades de la solución se optimizaron adicionalmente para dar lugar a una estera de nanofibras electrohiladas con las fibras más pequeñas, que también es homogénea e íntegra. La Tabla 5 muestra las propiedades de solución optimizadas y la Figura 5 presenta la comparación SEM de las fibras de 6 nm con las fibras de 10 nm. La solución de polímero descrita a continuación tuvo una viscosidad de 24 cP y una conductividad de 3,68 mS/cm.

Tabla 5. Composición de la solución de hilado

Ejemplo 4. Retención de parvovirus modelo en solución tampón

Dispositivos OptiScale-25. EMD Millipore Corporation, Billerica, MA EE.UU., se fabricaron conteniendo tres (3) capas de materiales compuestos electrohilados que tenían un área de filtración de 3,5 cm2. Las capas se intercalaron con una tela no tejida de polipropileno.

Se ensayaron la permeabilidad al agua y la retención de virus en una configuración de presión constante provista de una celda de carga. El virus modelo, el bacteriófago PhiX-174, se añadió a tampón acetato a pH 5, conductividad 13,5 mS/cm, a una concentración de 1,4*107 UFP/ml. Los dispositivos se lavaron con tampón durante 10 min, se cambió la alimentación al recipiente con virus añadido, y se hicieron fluir 200 ml de tampón enriquecido a través de cada dispositivo. Después, se recogieron muestras para ensayos de virus de 5 ml, 60 ml, 130 ml y 200 ml.

La Tabla 6 enumera la permeabilidad del tampón de los dispositivos, y la Figura 5 muestra el LRV como un promedio de dos (2) dispositivos.

Tabla 6. Caudales del dispositivo y permeabilidades con flujos de tampón.

Como se representa en la Figura 6, ambos dispositivos demuestran una alta retención del parvovirus modelo PhiX-174, que no se redujo significativamente en el transcurso del experimento de filtración. Estos datos, junto con los puntos de burbuja y los diámetros de las fibras, demuestran claramente que pueden prepararse esteras electrohiladas con retención de parvovirus. Las permeabilidades medidas superan el valor de Viresolve™ Pro.

Ejemplo comparativo 4. Este ejemplo demuestra que hilar la capa activa sobre un sustrato de diámetro de fibra más suave y más pequeño da lugar a propiedades de filtración superiores como una mayor retención lograda con espesores menores, dando lugar a una mayor permeabilidad. Una solución similar a la descrita en el Ejemplo 2 se hiló durante 15 minutos a un punto de rocío de 14 °C, dando lugar a una estera de nanofibras que tenía aproximadamente 4 um de espesor, con un diámetro de fibra promedio de 10 nm. El sustrato utilizado fue también una estera de nanofibras hilada durante 15 minutos sobre un sustrato no tejido de Hirose suave (Hirose Paper Manufacturing Co., Ltd, Tosa-City, Kuchi, Japón, número de pieza n.° HOP-60HCL), utilizando un 13 % en peso de mezcla de Nailon 6 de calidad B24 en 2:2:1/ácido fórmico: Ácido acético: Agua. El sustrato de nanofibras tenía aproximadamente 10 um de espesor con un diámetro de fibra promedio de 23 nm. Esta estructura de nanofibras extremadamente delgada mostró propiedades de filtración superiores en un formato de capa única en comparación con los dispositivos producidos utilizando la configuración de tres capas descrita en el Ejemplo 4. Se ensayaron el punto de burbuja, la permeabilidad al agua y la retención de virus en tampón, como se describe en el texto, y los resultados se muestran en la Tabla 7.

Tabla 7. Propiedades físicas y de filtración de las esteras electrohiladas basadas en las propiedades de la capa de sustrato.

Ejemplo 5. Retención de parvovirus modelo en una solución que contiene proteínas

En una realización de la invención, las esteras de nanofibras se producen según el Ejemplo 3 y están modificadas superficialmente para reducir la unión potencial de proteínas no específicas. Se prepara una solución acuosa que contiene 3,25 % en peso de triacrilato de trimetilolpropano etoxilado (20), comercializado como SR415 por Sartomer Co. Exton. PA. EE.UU. y 10 % en peso de 2-metil-2, 4-pentanodiol (MPD). Se humedeció una lámina de nanofibras con esta solución y se expuso a radiación de haz de electrones hasta una dosis total de 2 MRad en una atmósfera de nitrógeno. La lámina se aclaró en agua. Se cortaron nueve (9) discos de 25 mM de la hoja húmeda y se sellaron en tres (3) soportes de acero inoxidable, tres (3) capas por soporte, disponibles de EMD Millipore Corporation, Billerica, MA E^e .UU., N.° de catálogo. XX4502500. Se utiliza un prefiltro de tres (3) capas fabricado con 0,1 pm de Durapore™ también comercializado por EMD Millipore Corporation. Billerica, MA EE.UU. en la parte frontal del dispositivo de nanofibras.

La IgG policlonal, adquirida en SeraCare Life Science, Milford, MA, EE.UU., se disolvió en un tampón de acetato 25 mM, que tenía un pH 4,0, y una conductividad de 2,5 mS/cm. Se añadió a la solución bacteriófago PhiX-174 hasta una concentración final de 2,5*107 ufp/ml. Se tomó una muestra de LRV inicial después de filtrar los primeros 5 ml, y se tomó una muestra de LRV final al 75 % de taponamiento del filtro. En la Tabla 8 se muestran los resultados.

Tabla 8. Permeabilidad del tampón, rendimiento de la proteína y LRV de virus para los dispositivos de nanofibras según las realizaciones de la invención, y Viresolve™ Pro. Los datos son el promedio de tres (3) dispositivos de nanofibras y los dos (2) dispositivos Viresolve™ Pro.

Ejemplo 6. Escalado de producción de esteras de electrohilado

La solución de nailon 6 se preparó según el Ejemplo 2. Se produjo una estera de nanofibras en un aparato de electrohilado a escala piloto de Elmarco, provisto de tres electrodos giratorios, cada uno de 50 cm de ancho. El electrodo giratorio de 6 hilos está provisto de un hilo de acero de calibre 33, la distancia entre la bandeja de solución y el colector tiene 140 mm, la velocidad de rotación del electrodo es de 60 Hz, humedad ambiental entre 10° y 16° de punto de rocío. La tasa de centrifugado del electrodo fue de 6,7 a 6,9 rpm. Las varillas de mezcla se ajustaron para girar a 58 rpm a 60 rpm para asegurar una buena mezcla de la solución de nailon 6. La tensión superior e inferior fue de 20 kV y 60 kV, respectivamente. El material de soporte utilizado para recoger las nanofibras es un nailon 6 de malla electrohilada con un diámetro de fibra promedio de 100 nm. El material de soporte se produjo mediante electrohilado de nailon 6 de un 12 % en peso. en solución en una mezcla de ácidos acético y fórmico, siendo la relación en peso entre los ácidos 2:1 utilizando el mismo equipo de electrohilado. Para una mayor productividad, la solución de nailon 6 se vertió en las 3 bandejas. La velocidad de la línea se fijó en 2 cm/min. Al comienzo de la ejecución, sólo la bandeja más cercana al comienzo de la línea estaba activa. Después de 15 minutos (correspondientes a 30 cm de longitud de la estera), el instrumento se apagó para cargar la segunda bandeja. El instrumento se encendió a continuación con un primer y un segundo panel activo. Después de otros 15 min de funcionamiento, el instrumento se apagó para cargar la tercera bandeja. El instrumento se encendió con las tres bandejas activas. La ejecución continuó durante otros 45 minutos (tiempo total 75 min) para crear una lámina con un área activa de 0,9 m de longitud por 0,57 m de ancho. Cuando las bandejas no estaban en uso, se cubrieron con una tapa para evitar cambios en la solución debido a una alta volatilidad del EPF. Se cortaron discos de 20 mm de las cuatro (4) esquinas, cuatro (4) bordes en el centro y uno (1) desde el medio. Estos discos se ensayaron para el punto de burbuja

La Tabla 9 describe las propiedades de las esteras electrohiladas producidas según las realizaciones de la invención, en base al ensayo de las muestras de disco representativas.

En la Tabla 9, se midió una medida clave del tamaño de poro como se indica por el punto de burbuja de flujo medio con un fluido de baja tensión superficial (10 dinas/cm), Fluorinert™ FC-72 comercializado por 3M, St. Paul, MN EE.UU. Los valores del punto de burbuja indican que las esteras electrohiladas producidas según las realizaciones de la invención, presentan tamaños de poro muy pequeños, en el intervalo de membranas de retención de parvovirus, que normalmente caen en el intervalo de entre 120 y 180 psi.

Tabla 9

Ejemplo 7.

Caracterización mediante mediciones de tamizado con dextrano

Las esteras de nanofibras producidas según el Ejemplo 6 se caracterizaron utilizando un ensayo de retención de dextrano. Para este estudio, se cortaron de la estera dos (2) discos de nanofibras de 44,5 mm de diámetro (junto con el soporte no tejido utilizado para centrifugar la estera). Se utilizaron como controles dos (2) discos de 44,5 mm de Viresolve™ Pro. Los discos se sumergieron en agua, y a continuación se pusieron en una celda agitada comercializada por EMD Millipore (n.° catálogo 5122). Se vertieron 40 ml de una mezcla de diversos tamaños de dextrano en la celda agitada. Se puso una mosca de agitación magnética convencional en la celda. La celda agitada se puso luego sobre una placa de agitación magnética. El tubo de PVC de 1/16" ID (Fisher scientific n.° de catálogo 14-190-118) unido a una bomba peristáltica se conectó al lado del permeado para extraer líquido a un caudal constante.

El otro extremo del tubo se puso en la celda agitada para permitir la recirculación. Después, se vertió en la célula agitada una solución de dextrano que comprendía diversos pesos moleculares. La bomba peristáltica se encendió y se puso a funcionar a 0,8 ml/min. Se descartaron los primeros 2 a 3 ml antes de la recirculación para evitar cualquier contaminación de la solución de alimentación de dextrano. La bomba se hizo funcionar durante dos (2) h para permitir el equilibrio. Tras dos (2) horas de funcionamiento, la bomba se apagó, y se recogió la muestra en el tubo para su posterior análisis utilizando cromatografía de permeación en gel (GPC).

A partir de los resultados de la GPC, se generó la curva de retención del dextrano para el VireSolve™ Pro y las esteras de nanofibras según la invención (Figura 7). El R90 promedio (90 % de rechazo de dextrano) de dos (2) discos para cada VireSolve™ Pro y las esteras de nanofibras fueron 100 KDa y 500 KDa, respectivamente. Aunque la estera de nanofibras no parece ser tan apretada como VireSolve™ Pro, la estera de nanofibras según la invención demuestra, sin embargo, una buena retención en el intervalo de la membrana de ultrafiltración.

Ejemplo 8. Medición de la capacidad de filtración y retención con una solución que contiene medio de cultivo celular de biorreactor

Para estudios de capacidad de filtración con medios de cultivo celular. Se fabricaron dispositivos OptieScale-25 que contenían tres (3) capas de materiales compuestos electrohilados producidos según el Ejemplo 6, con un área de filtración de 3,5 cm2. Se utilizó aguas abajo una capa (1) de una tela no tejida de polipropileno. La permeabilidad al agua y la capacidad de filtración de los medios de cultivo celular se ensayaron en una configuración de presión constante provista de una celda de carga. Para estos estudios, se utilizó medio CD CHO (n.° de catálogo 10743-029) de Life Technologies. El medio CD CHO es un medio exento de proteínas, sin suero, de composición química definida, optimizado para el crecimiento de células de ovario de hámster chino (CHO) y la expresión de proteínas recombinantes en cultivos en suspensión.

Para los estudios de retención de virus con medio de cultivo celular, se prepararon los dispositivos OptiScale-25 que contenían tres (3) capas de materiales compuestos electrohilados producidos según el Ejemplo 6, con un área de filtración de 3,5 cm2. Se utilizó una (1) capa de tela no tejida de polipropileno en la parte inferior lateral (de salida) del dispositivo. Se ensayaron la permeabilidad al agua, y la retención de virus en una configuración de presión constante provista de una celda de carga. El virus modelo, bacteriófago PhiX-174, se añadió al medio de cultivo celular CD CHO a la concentración de 1,4*107 UFP/ml. Los dispositivos se enjuagaron con agua durante 10 min, la alimentación se cambió al recipiente con virus añadido y el medio enriquecido con virus se hizo fluir a través de cada dispositivo. Se recogieron muestras para ensayos de virus a diversas capacidades de filtración (15, 250 y 500 L/m2). La Figura 8 muestra el LRV y la disminución del flujo como un promedio de dos (2) dispositivos. También se muestra una (1) capa de la membrana Viresolve™ Pro. Todos los dispositivos se sometieron al ensayo de integridad después de su uso para detectar fugas macroscópicas monitorizando las burbujas de aire aguas abajo de los dispositivos presurizando los dispositivos a 50 psi. Se eligieron solo como íntegros los dispositivos que tenían ≤5 burbujas por minuto. El compuesto de nanofibras proporciona >3 LRV de retención hasta 500 l/m2 con 2X la permeabilidad de una capa de (1) de membrana Viresolve™ Pro. Si es necesaria una mayor retención del virus, es posible aumentar el número de capas para proporcionar una retención adicional del virus. Este ejemplo indica que los materiales compuestos de nanofibras pueden utilizarse para la eliminación de virus de los medios de cultivo celular.

Salvo que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivos celulares, condiciones de tratamiento, etc., utilizados en la descripción descriptiva, incluidas las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el término “ aproximadamente” . Por tanto, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos que se establecen en la siguiente descripción descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretende obtener mediante la presente invención. A menos que se indique lo contrario, el término “ al menos” que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie.

Pueden realizarse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Las modalidades específicas que se describen en la presente descripción se ofrecen solo a modo de ejemplo y no pretenden ser limitantes de ninguna manera. Se pretende que la descripción descriptiva y los ejemplos se consideren únicamente ilustrativos, indicándose el verdadero ámbito de la invención mediante las reivindicaciones que siguen.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un medio poroso electrohilado fibroso para eliminar partículas víricas y otras partículas en el intervalo de tamaño de 18 nm a 30 nm de una corriente de fluido acuosa que comprende nanofibras electrohiladas formadas a partir de nailon-6, nailon-6,6, nailon 6,6-6,10, copolímeros de nailon-6, copolímeros de nailon-6,6, copolímeros de nailon 6,6-6,10 o mezclas de los mismos y que tienen un diámetro de fibra promedio de 6 nm a 13 nm, teniendo el medio un tamaño de poro de flujo medio que varía de 0,01 pm a 0,03 pm, en donde el tamaño de poro de flujo medio se mide por el método descrito en la presente descripción, un espesor promedio de 1 pm a 100 pm según lo determinado por la norma ASTM D1777-64, una permeabilidad al líquido superior a 10 LMH/psi y una porosidad que varía de 80 % a 95 %;

en donde el medio es una estera de filtración de líquidos;

en donde la porosidad se calcula mediante el método descrito en la presente descripción;

en donde el diámetro de la fibra se calcula mediante el método descrito en la presente descripción; y

en donde el tamaño de poro se mide utilizando la ecuación

, donde P es la presión del punto de burbuja, y es la tensión superficial del fluido de la sonda, r es el radio de poro y 9 es el ángulo de contacto líquido-sólido.

2. El medio según la reivindicación 1, variando el espesor de 2 pm a 30 pm.

3. El medio según la reivindicación 1, en donde el medio poroso electrohilado tiene un punto de burbuja de flujo medio medido con perfluorohexano que es superior a 120 psi (827 kPa).

4. Un dispositivo de filtración de líquido para eliminar partículas víricas en el intervalo de tamaño de 18 nm a 30 nm de una solución de alimentación acuosa, comprendiendo el dispositivo:

un medio poroso electrohilado fibroso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un soporte poroso,

en donde los medios porosos de electrohilado fibroso se disponen sobre el soporte poroso.

5. El dispositivo según la reivindicación 4, en donde el soporte poroso es una capa de soporte de nanofibra con un diámetro medio de fibra entre 10 nm y 500 nm.

6. El dispositivo según la reivindicación 4, en donde el soporte poroso es una capa de soporte de nanofibra que tiene diámetros de fibra promedio entre 50 nm y 200 nm.

7. El dispositivo según la reivindicación 4, en donde el soporte poroso es una capa de soporte de nanofibra que tiene diámetros de fibra promedio entre 10 nm y 50 nm.

8. Un método para eliminar contaminantes de virus y otras partículas en el intervalo de tamaño de 18 nm a 30 nm de una solución de alimentación de fluido acuosa que comprende las etapas de:

proporcionar un medio poroso electrohilado fibroso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y un soporte poroso, en donde el medio poroso electrohilado fibroso se dispone en el soporte poroso;

poner en contacto la solución acuosa de alimentación de fluido contaminado con virus con el medio poroso electrohilado fibroso y el soporte poroso; y

obtener un filtrado que tiene menos de 0,01 % de contaminantes del virus presentes en la solución acuosa de alimentación de fluido.

9. El método según la reivindicación 8, en donde el filtrado tiene:

a) menos de 0,001 % de virus presentes en la solución de alimentación; o preferiblemente b) menos de 0,0001 % de virus presentes en la solución de alimentación.

10. El método según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en donde el analito objetivo es un parvovirus.