ES2955285T3 - Nuevos usos de una saponina y método para su aislamiento - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere al nuevo uso de saponinas que comprenden residuos acetilo en uno de sus residuos de azúcar. Estas saponinas son capaces de mejorar la eficacia de la transfección en un grado sorprendentemente mucho mayor que las saponinas ya conocidas e incluso que la lipofectamina. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Nuevos usos de una saponina y método para su aislamiento
[0001] La presente invención se refiere al uso in vitro de una saponina según el preámbulo de la reivindicación 1, al uso in vivo de dicha saponina según el preámbulo de la reivindicación 3, a una composición de transfección según el preámbulo de la reivindicación 7, a un método para una transfección in vitro según el preámbulo de la reivindicación 10, y a un método para aislar dicha saponina según el preámbulo de la reivindicación 15.
[0002] En el pasado se han descrito muchas saponinas. A modo de ejemplo, se hace referencia a Weng, Alexander, et al. "A simple method for isolation of Gypsophila saponins for the combined application of targeted toxins and saponins in tumor therapy". Planta medica 75 (13) (2009): 1421-1422; Weng, Alexander, et al. "A convenient method for saponin isolation in tumour therapy”. Journal of Chromatography 6878 (7) (2010): 713 718; Weng, Alexander, et al. "The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins." Molecular oncology 6 (3) (2012): 323-332; y Weng, Alexander, et al. "Saponins modulate the intracellular trafficking of protein toxins". Journal of controlled release 164 (1) (2012): 74-86.
[0003] Se describen más saponinas en las siguientes publicaciones: Thakur, Mayank, et al. "Highspeed countercurrent chromatographic recovery and off-line electrospray ionization mass spectrometry profiling of bisdesmodic saponins from Saponaria officinalis possessing synergistic toxicity enhancing properties on targeted antitumor toxins”. Journal of Chromatography B 955 (2014): 1-9; Jia, Zhonghua, Kazuo Koike, y Tamotsu Nikaido. "Major triterpenoid saponins from Saponaria officinalis”. Journal of natural products 61 (11) (1998): 1368-1373; Haddad, Mohamed, et al. "New triterpene saponins from Acanthophyllum pachystegium". Helvetica chimica acta 87 (1) (2004): 73-81; Fu, Hongzheng et al. "Silenorubicosides A-D, Triterpenoid Saponins from Silene rubicunda". Journal of Natural Products 68 (5) (2005): 754-758; Moniuszko-Szajwaj, Barbara, et al. "Highly Polar Triterpenoid Saponins from the Roots of Saponaria officinalis L". Helvetica Chimica Acta 99 (5) (2016): 347-354; Fuchs, Hendrik, et al. "Glycosylated Triterpenoids as Endosomal Escape Enhancers in Targeted Tumor Therapies". Biomedicines 5 (2) (2017): 14.
[0004] También se ha descrito que una saponina específica (SO1861, también llamada Sapofectosid) puede mediar en una mejor administración intracelular de nanopartículas de péptidos y lípidos (Weng, Alexander, et al. "Improved intracellular delivery of peptide- and lipid-nanoplexes by natural glycosides". Journal of Controlled Release 206 (2015) 75-90), o de a Dn y ARN (Sama, Simko, et al. "Sapofectosid - Ensuring non-toxic and effective DNA and RNA delivery" International Journal of Pharmaceutics 534 (2017): 195-205).
[0005] Un objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto que tenga propiedades incluso mejores con respecto a la administración intracelular de compuestos pequeños tales como péptidos y ácidos nucleicos que la saponina SO1861.
[0006] Sorprendentemente, una saponina que puede aislarse de Gypsophila elegans M. Bieb tiene efectos superiores en cuanto a la administración de moléculas pequeñas, en particular en cuanto a la administración de ácidos nucleicos a las células. Una saponina de este tipo corresponde a la fórmula (I):
[0007] Por lo tanto, R1 es un residuo de xilosa o un residuo de arabinosa unido con su átomo C1 al correspondiente residuo de xilosa de fórmula (I); y R2 es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula H o un residuo acetilo, con la condición de que haya presentes al menos dos residuos de acetilo en la saponina.
[0008] La saponina tiene una estructura central de saponina común y no comprende ningún enlace inusual. Más bien, se diferencia de otras saponinas solo por sus residuos de azúcar y/o sus residuos de acetilo.
[0009] Para una mejor identificación de los residuos de azúcar individuales en la fórmula (I), están marcados con una abreviatura correspondiente en la representación anterior de la fórmula (I). Por tanto, las abreviaturas tienen el siguiente significado:
[0010] La estructura de la arabinosa (Ara) corresponde a la fórmula (II):
[0011] Un compuesto según la fórmula (I) mostró una eficiencia de transfección que era aproximadamente el doble de alta que la eficiencia de transfección de SO1861. Este es un resultado completamente inesperado y sorprendente, ya que uno esperaría solo ligeros aumentos en la eficiencia de transfección con respecto a SO1861. Debido al elevado número de saponinas ya existentes, los inventores no podían esperar que los compuestos y el uso de los cuales se reivindica en el presente documento mostraran una eficiencia de transfección tan alta, incluso si estos compuestos son conocidos per se. Las saponinas no se pueden sintetizar y, por lo general, no se pueden comprar simplemente a un proveedor de productos químicos. Más bien, es necesario aislarlas de plantas o partes de plantas. Esto hace que sea particularmente difícil investigar las propiedades de las saponinas.
[0012] Los inventores descubrieron sorprendentemente que las saponinas según la fórmula general (I) se pueden aislar a partir de Gypsophila elegans M. Bieb, que muestran una inesperada eficiencia de transfección alta. No se ha descrito antes que tales saponinas puedan extraerse de Gypsophila elegans M. Bieb. En su lugar, solo se ha descrito por Haddad et al. (ver arriba para más detalles) que una saponina incluida en la fórmula general (I) ha sido aislada de una planta completamente diferente (Acanthophyllum pachystegium) sin dar, sin embargo, ninguna indicación de que esta saponina (denominada en el presente documento GE1471) podría aumentar la eficiencia de transfección.
[0013] Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de una saponina según la fórmula general (I) en la administración in vitro de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a una célula. Por tanto, la administración in vitro de ácido nucleico es un uso particularmente apropiado de la saponina. Los ácidos nucleicos apropiados que se van a administrar son ADN, tal como ADN plasmídico o ADN minicírculo, y ARN, tal como ARN de interferencia pequeño (ARNip). El ácido nucleico u otra molécula que se va a administrar puede estar presente en forma de nanoplex. Los nanoplex suelen estar formados por péptidos o lípidos que pueden unirse a la pequeña molécula que se va a administrar. Por tanto, un ácido nucleico que administra nanoplex comprende un vehículo lipídico o no lipídico al que está unido un ácido nucleico. Los nanoplex también pueden denominarse nanopartículas. En una forma de realización, el ácido nucleico que se va a administrar es un ADN minicírculo. En una forma de realización, la molécula que se va a administrar es una partícula de ADN minicírculo de péptido.
[0014] En una forma de realización, la célula a la que se va a administrar el ácido nucleico, el lípido, el péptido y/o la proteína es una célula eucariota. Para su uso como células, son especialmente apropiadas células
humanas, células animales (tales como células de roedores) o células vegetales. También se pueden utilizar células de levadura.
[0015] En un aspecto, la invención se refiere a una saponina según la fórmula general (I) para su uso en terapia o diagnóstico. De este modo, la saponina es para su uso en una administración in vivo de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a un ser humano o animal.
[0016] En una forma de realización, el animal es un mamífero, en particular un roedor.
[0017] En un aspecto, se usa una mezcla de al menos dos saponinas, en particular de exactamente dos saponinas, donde el residuo R1 denota xilosa en una primera saponina y arabinosa en una segunda saponina.
[0018] En una forma de realización, todos los azúcares están presentes en su forma estereoisomérica D.
[0019] En una forma de realización, R1 es un residuo de xilosa. Por lo tanto, la saponina corresponde a la siguiente fórmula (III):
[0020] En una forma de realización, R1 es un residuo de arabinosa. Por lo tanto, la saponina corresponde a la siguiente fórmula (IV):
[0021] En una forma de realización, la saponina está presente en una forma estereoisomérica según la fórmula general (V). Asimismo, el residuo de xilosa y el residuo de arabinosa están presentes, en una forma de realización, en forma estereoisomérica según las fórmulas (VI) o (VII):
[0022] En una forma de realización, la saponina lleva exactamente dos grupos acetilo, es decir, dos de los residuos R2 son residuos de acetilo y el residuo R2 restante es un hidrógeno.
[0023] En una forma de realización, los grupos acetilo están unidos a los átomos de oxígeno en la posición C3 y C4 del correspondiente residuo de quinovosa, dando como resultado una saponina de fórmula (VIII):
[0024] En una forma de realización, los tres residuos R2 son residuos de acetilo, dando como resultado una saponina de fórmula (IX):
[0025] Sorprendentemente, los inventores descubrieron que una saponina según la fórmula general (I) no sólo aumenta la eficiencia de la transfección cuando se usa sola, sino que es particularmente apropiada para mejorar la eficiencia de transfección de los reactivos de transfección clásicos. Por tanto, se puede utilizar como refuerzo para dichos reactivos de transfección. Los usos descritos anteriormente abarcan el uso de dicha saponina como refuerzo para reactivos de transfección clásicos. En una forma de realización, la saponina se usa in vivo o in vitro en combinación con al menos un reactivo de transfección seleccionado del grupo que consiste en reactivos de transfección basados en liposomas y reactivos de transfección basados en polímeros. A continuación, se enumeran ejemplos de tales reactivos de transfección.
[0026] El concepto inventivo general entre las reivindicaciones independientes se observa en la mejora significativa de la eficiencia de transfección de las saponinas según la fórmula general (I) que fue descubierta por los inventores por primera vez.
[0027] En un aspecto, la invención se refiere a una composición de transfección, que comprende un reactivo de transfección clásico y al menos una saponina según la fórmula (I), donde los residuos R1 y R2 tienen los significados descritos anteriormente. Los reactivos de transfección clásicos se pueden dividir en dos subgrupos, a saber, reactivos de transfección basados en liposomas y reactivos de transfección basados en polímeros. Los reactivos de transfección de base liposomal consisten principalmente en lípidos cargados catiónicos con cadenas de ácidos grasos hidrófobos unidas a grupos de cabeza polares, como el trimetilamonio propano. Los reactivos de transfección a base de polímeros consisten en polímeros orgánicos que contienen un grupo de cabeza cargado, como la polietilenimina (PEl).
[0028] Ejemplos de reactivos de transfección clásicos a base de liposomas disponibles comercialmente son MEtAfEcTENE; TransFast; Stemfect; y TransFectin.
[0029] Ejemplos de reactivos de transfección a base de polímeros clásicos disponibles comercialmente son GeneCellin; reactivos de transfección X-tremeGene tales como el reactivo de transfección de ADN X-tremeGene 9, el reactivo de transfección de ADN X-tremeGene HP, y el reactivo de transfección de ARNip X-tremeGene; reactivos de transfección TransIT tales como el sistema de administración dinámica TranslT-X2, reactivo TransIT-LT1, reactivo TransIT-2020, reactivo TransIT-PRO, reactivo TransIT-VirusGEN, reactivo TransIT-Lenti, reactivo TransIT-Insect, reactivo TransIT-293, reactivo TransIT-BrCa, reactivo de transfección TransIT-CHO, reactivo de transfección TransIT-HeLaMONSTER, reactivo TransIT-Jurkat, reactivo TransIT-Keratinocyte, reactivo de transfección TransIT-mRNA, reactivo TransIT-TKO, reactivo TransIT-siQUEST, y reactivo TransIT-Oligo; Viafect; FuGENE; Xfect; TurboFect; y GenJet.
[0030] En una forma de realización, R1 de la saponina en la composición de transfección es un residuo de xilosa.
[0031] En una forma de realización, la saponina en la composición de transfección lleva exactamente dos grupos acetilo.
[0032] En una forma de realización, los grupos acetilo están unidos a los átomos de oxígeno en la posición C3 y C4 del correspondiente residuo de quinovosa.
[0033] En una forma de realización, el reactivo de transfección es un reactivo de transfección a base de liposomas.
[0034] En una forma de realización, el reactivo de transfección es un reactivo de transfección a base de polímeros.
[0035] En una forma de realización, el reactivo de transfección se selecciona del grupo que consiste en reactivos de transfección TransIT, reactivos de transfección X-tremeGene y GeneCellin.
[0036] En una forma de realización, el reactivo de transfección es GeneCellin.
[0037] En un aspecto, la invención se refiere a una saponina o una mezcla de al menos dos saponinas según las explicaciones anteriores para su uso en un método para administrar un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a un ser humano o animal que lo necesite.
[0038] En un aspecto, la invención se refiere a un método para una transfección in vitro de una célula. Este método comprende la etapa de incubar una célula con un ácido nucleico en presencia de una saponina o una mezcla de al menos dos saponinas según las explicaciones anteriores. La transfección puede ser una transfección transitoria o una transfección estable. El ADN y el ARN son ácidos nucleicos apropiados, donde el ADN es particularmente apropiado. En una forma de realización, el ácido nucleico que se va a administrar es un ADN minicírculo.
[0039] En una forma de realización, la célula es una célula eucariota. Para su uso como células, son especialmente apropiadas células humanas, células animales (tales como células de roedores) o células vegetales. También se pueden utilizar células de levadura.
[0040] En una forma de realización, el ácido nucleico forma parte de una nanopartícula. Por ejemplo, se puede utilizar una nanopartícula de ADN. Otros ejemplos apropiados son partículas de ADN de minicírculo peptídico o partículas que comprenden un péptido unido a a Dn . Asimismo, las nanopartículas de ARN son entidades apropiadas para realizar la transfección.
[0041] En una forma de realización, la saponina se usa en una concentración que se encuentra en un intervalo entre 1 μg/ml y 25 μg/ml, en particular entre 1,5 μg/ml y 20 μg/ml, en particular entre 2 μg/ml y 15 μg/ml, en particular entre 2,5 μg/ml y 12,5 μg/ml, en particular entre 3 μg/ml y 10 μg/ml, en particular entre 4 μg/ml y 9 μg/ml, en particular entre 5 μg/ml y 8 μg/ml, en particular entre 6 μg/ml y 7 μg/ml.
[0042] En una forma de realización, la saponina se usa en el método reivindicado en combinación con al menos un reactivo de transfección seleccionado del grupo que consiste en reactivos de transfección a base de liposomas y reactivos de transfección a base de polímeros. Anteriormente se han enumerado ejemplos de dichos reactivos de transfección.
[0043] En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para aislar una saponina o una mezcla de al menos dos saponinas según las explicaciones anteriores de Gypsophila elegans M. Bieb. Este método comprende las etapas que se explican a continuación. Por lo tanto, no es necesario realizar las etapas en el orden indicado. Más bien, se puede aplicar también cualquier otro orden sensato de etapas del método.
[0044] En una primera etapa, se cortan las raíces de Gypsophila elegans M. Bieb. Opcionalmente, se lavan las raíces cortadas. Posteriormente, las raíces cortadas se liofilizan y se muelen. De esta manera, se obtiene un polvo de raíz.
[0045] El polvo de raíz se extrae con un disolvente orgánico altamente concentrado para obtener un extracto de raíz. El término "disolvente orgánico altamente concentrado" se refiere a un disolvente orgánico que tiene una concentración superior al 50 % (v/v). El metanol o cualquier otro alcohol orgánico de cadena corta es un disolvente orgánico adecuado. Por ejemplo, una concentración de disolvente del 70 al 100 %, en particular del 75 al 95 %, en particular del 80 al 90 %, es una concentración alta apropiada. Si el disolvente orgánico es miscible con agua, se puede utilizar agua como codisolvente.
[0046] Posteriormente, se elimina el disolvente orgánico altamente concentrado de los extractos de raíz para obtener un extracto seco. Esta eliminación se puede realizar, por ejemplo, mediante destilación al vacío.
[0047] Luego, el extracto seco se disuelve en un disolvente orgánico de baja concentración para obtener una solución de extracto. El término "disolvente orgánico de baja concentración" se refiere a un disolvente orgánico que tiene una concentración inferior al 50 % (v/v). Por ejemplo, una concentración del 10 % al 50 %, en particular del 15 % al 45 %, en particular del 20 % al 40 %, en particular del 25 % al 30 %, es un intervalo de concentración adecuado para el disolvente orgánico de baja concentración. Una vez más, el metanol o cualquier otro alcohol orgánico de cadena corta es un disolvente orgánico adecuado. Asimismo, se puede utilizar agua como codisolvente, si el disolvente orgánico de baja concentración es miscible con agua.
[0048] Luego, la solución del extracto se somete a al menos una etapa de separación cromatográfica. De este modo, se obtiene una solución de saponina purificada. La separación cromatográfica se puede implementar mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Normalmente, es aconsejable realizar más de una etapa de separación cromatográfica para mejorar la pureza de la solución de saponina purificada. Por lo tanto, es posible someter la solución de saponina purificada obtenida después de la primera etapa de separación cromatográfica a al menos una etapa de separación cromatográfica posterior. De este modo, se pueden utilizar diferentes columnas en las etapas individuales de separación cromatográfica.
[0049] Es posible realizar las etapas de separación cromatográfica individuales (si se realiza más de una etapa de separación cromatográfica) en diferentes fases estacionarias y/o móviles. Por tanto, es posible cambiar los disolventes utilizados en las etapas de separación cromatográfica individuales entre estas etapas.
[0050] Finalmente, el disolvente se elimina de la solución de saponina purificada después de la al menos una etapa de separación cromatográfica. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante destilación al vacío o mediante liofilización. Se obtiene un polvo de saponina purificada.
[0051] Todas las formas de realización descritas en el presente documento se pueden combinar de cualquier forma deseada. Además, las formas de realización de los usos y métodos explicados se pueden transferir a los otros métodos y usos descritos de cualquier forma deseada. La composición de transfección descrita también puede hacer uso de cualquiera de las formas de realización descritas.
[0052] Se explicarán más detalles de aspectos de la presente invención con respecto a un ejemplo de forma de realización y las figuras adjuntas. En las figuras:
la figura 1 muestra un cromatograma HPLC de extracto crudo seco de las raíces de Gypsophila elegans M. Bieb; la figura 2 muestra un cromatograma LC-ESI-MS de la sustancia presente en el pico P2 del cromatograma de la figura 1 después de una purificación adicional mediante HPLC semipreparativa;
la figura 3 muestra un cromatograma LC-ESI-MS de la saponina aislada GE1741;
la figura 4 muestra un espectro MS/MS de la saponina aislada GE1741;
la figura 5 muestra los resultados de las mediciones de citometría de flujo;
la figura 6 muestra la eficiencia de transfección de nanoplex ± saponinas triterpénicas en células Neuro2a; la figura 7 muestra la estructura química de GE1741 dilucidada por espectrometría de masas y espectroscopia de RMN;
la figura 8 muestra un gráfico de la eficiencia de transfección de diferentes potenciadores de la transfección; la figura 9 muestra el impacto de GE1741 en la eficiencia de transfección de diferentes métodos de transfección comerciales;
la figura 10 muestra los resultados de un primer experimento para examinar la toxicidad de GE1741 en células Neuro2a;
la figura 11 muestra los resultados de un segundo experimento para examinar la toxicidad de GE1741 en células Neuro2a y
la figura 12 muestra los resultados de una terapia génica suicida dirigida.
Ejemplo de forma de realización: Aislamiento de la saponina GE1741 de Gyposphila elegans M.Bieb
[0053] Se sembraron semillas de Gypsophila elegans M. Bieb en un campo en el estado de Brandeburgo, Alemania. Se cosecharon las plantas maduras y se cortaron las raíces. Las raíces se lavaron, se liofilizaron y se trituraron hasta convertirlas en polvo. El polvo se extrajo con metanol al 90 % en agua. Después de la filtración, el metanol se eliminó mediante destilación al vacío. El extracto acuoso restante finalmente se liofilizó (extracto seco). El extracto seco se disolvió en metanol al 30 % a una concentración de 60 mg/ml.
[0054] La solución (cada 0,5 ml) se sometió a HPLC semipreparativa utilizando un equipo Kinetex® 5 |_im C18100 A, columna LC 250 x 10,0 mm. Se usó un gradiente de metanol(A)/agua, TFA al 0,01 % (B) del 30 % al 90 % (A) durante 20 min y luego al 30 % (A) durante 10 min. El caudal fue de 4 ml/min. La longitud de onda de detección fue de 210 y 300 nm. En la figura 1 se representa un cromatograma correspondiente, en el que la curva superior muestra la señal del detector a 210 nm y la curva inferior la señal del detector a 300 nm. Se recogió el pico a un tiempo de retención (RT) ~ 18 a 20 (~ 19) min (marcado como P2). Se repitió un gran número de ciclos de aislamiento y finalmente se agruparon los picos recogidos. El metanol se evaporó mediante centrifugación al vacío y el agua restante se eliminó mediante liofilización.
[0055] El material seco se disolvió en acetonitrilo al 50 % a una concentración de 4 mg/ml. La solución (cada 0,5 ml) se sometió a HPLC semipreparativa utilizando un equipo Kinetex® 5 |_im C18 100 A, columna LC 250 x 10,0 mm. Se usó un gradiente de acetonitrilo (A)/agua, TFA al 0,01 % (B) del 30 % al 50 % (A) durante 24 min y luego al 30 % (A) durante 1 min. La longitud de onda de detección fue de 210 nm. El caudal fue de 4 ml/min. Se recogió el pico a temperatura ambiente ~ 18 min. Se repitieron varios ciclos. El acetonitrilo se evaporó mediante centrifugación al vacío y el agua restante se eliminó mediante liofilización.
[0056] Las muestras se analizaron utilizando un sistema Q-TOF LC-ESI-MS/MS Agilent Serie 6200. Para el análisis LC-ESI-MS de las fracciones recuperadas, se utilizó una columna de HPLC Kinetex® C18 (2,6 |_im, 100 A, (150 x 4,6 mm) y gradiente de acetonitrilo (A)/agua (B), se usó ácido fórmico al 0,01 % comenzando con 30 % a 70 % (A) durante 30 min usando un caudal de 0,7 ml/min. En la figura 2 se muestra el cromatograma correspondiente. Se detectaron dos picos prominentes. Se asignó una masa de 1538,67 a la sustancia del primer pico, y una masa de 1741,73 a la sustancia del segundo pico. El segundo pico se eligió para una purificación adicional.
[0057] El material seco del segundo pico se disolvió en acetonitrilo al 50 % a una concentración de 4 mg/ml. La solución (cada 0,5 ml) se sometió a HPLC semipreparativa utilizando la columna semipreparativa Kinetex® C-18 (ver arriba). Se usó un gradiente de acetonitrilo (A)/agua, TFA al 0,01 % (B) del 30 % al 50 % (A) durante 24 min y luego al 30 % (A) durante 1 min usando un caudal de 4,0 ml/min. La longitud de onda de detección fue de 210 nm. El pico a temperatura ambiente ~ 18 min se recogió en varios ciclos repetidos. El acetonitrilo se evaporó mediante centrifugación al vacío y el agua restante se eliminó mediante liofilización.
[0058] El material seco se disolvió en acetonitrilo al 50 % y se sometió (0,5 ml por análisis) a HPLC usando una columna LC Ultrasep ES PEO, 250 x 4 mm, 5 |_im. La columna se acondicionó con acetonitrilo al 5 %. La polaridad del disolvente se cambió abruptamente aplicando un gradiente de acetonitrilo (A)/agua, 0,01 % de TFA (B), comenzando con 100 % a 5 % (A) de 1,25 a 21 min. La longitud de onda de detección fue de 210 nm y el caudal fue de 1 ml/min. El producto (GE1741; también denominado gypsophilosid A) se recogió a temperatura ambiente durante 4-6 min. El acetonitrilo se eliminó mediante centrifugación al vacío. Después de la liofilización, se obtuvo GE1741 como un polvo blanco.
[0059] El producto se analizó una vez más mediante LC-ESI-MS como se ha descrito anteriormente. El cromatograma correspondiente se muestra en la figura 3. Solo se detectó un pico prominente, lo que indica una purificación exitosa. A la sustancia de este pico se le asignó una masa de 1741,73. Esta masa dio al producto su nombre, GE1741.
[0060] Para dilucidar la estructura química de GE1471, se realizaron mediciones de LC-ESI-MS/MS. En la figura 4 se muestra un espectro correspondiente.
[0061] Basándose en estos datos de espectrometría de masas y otros datos obtenidos por espectroscopia de RMN (ver más abajo para más detalles), se podría establecer que la estructura de esta saponina corresponde a la fórmula (VIII), donde R1 es un residuo de xilosa. Sin embargo, se supone que la función biológica de GE1741 probablemente no dependerá de la estructura concreta del residuo R1. Más bien, la presencia de al menos un residuo de acetilo en el residuo de quinovosa de GE1741 se considera un factor relevante para las propiedades de GE1741 que se explicarán a continuación con más detalle. Si bien GE1741 comprende dos residuos de acetilo (uno en la posición C3 y otro en la posición C4), los datos preliminares sugieren que la cantidad y posición de los residuos de acetilo pueden variar dentro de los límites indicados sin cambiar significativamente las propiedades de la saponina respectiva.
Análisis de las propiedades de GE1741
Cultivo celular
[0062] Se cultivaron células de neuroblastoma murino (células Neuro2a, ATTC CCL-131™) y células de carcinoma colorrectal humano (HTC-116, (ATCC® CCL-247™) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), que contenía 1 g/l de D-glucosa, FBS al 10 % y glutamina estable. Las células Neuro-2A se incubaron a 37 °C y 5 % de CO2. Luego, estas células se incubaron con nanopartículas de ADN (YD) con o sin la nueva saponina GE1741.
[0063] Las nanopartículas de ADN utilizadas para los experimentos de transfección contenían ADN que codifica la proteína verde fluorescente (GFP). De este modo, la eficiencia de transfección podría monitorizarse muy fácilmente detectando la fluorescencia de las células que han sido incubadas con las correspondientes nanopartículas de ADN. En el presente caso, se seleccionó un período de incubación correspondiente de 48 horas.
[0064] Como control negativo (panel izquierdo de la figura 5), no se ha añadido ninguna nanopartícula de ADN a las células Neuro2a. Se pudo observar una fluorescencia que indica una aparente eficiencia de transfección del 0,37 %. Este valor representa el error de medición.
[0065] Si se han añadido partículas de ADN (PM) de minicírculo peptídico a las células Neuro2a sin ningún potenciador de transfección, se podría observar una eficiencia de transfección de solo un 1,35 % según la fluorescencia detectada (panel central de la figura 5). Sin embargo, si se añaden las mismas partículas de ADN de minicírculo peptídico junto con GE1741 (la nueva saponina), se podría observar una eficiencia de transfección del 98,65 % en función de la fluorescencia detectada (panel derecho de la figura 5). Estas mediciones de citometría de flujo que detectan células fluorescentes ya indican una alta mejora de la eficiencia de transfección por parte de GE1741.
Formulación de PD/YD - nanoplex
[0066] Se adquirieron de Genecust 20 mg de péptidos de polilisina cargados positivamente con (Y) y sin (P) una secuencia de aminoácidos dirigida al receptor de integrina. El vector de p-EGFP-N3, que codifica la proteína verde fluorescente (GFP), se obtuvo y se propagó con células DH5a - E. Coli (1,645 mg/ml). Como ácidos nucleicos adicionales, se utilizaron StemMACS™ eGFP ARNm (20 jg ) y ADN minicírculo que codifica GFP (acceso al banco de genes: U55761). Para realizar la transfección, se formularon nanoplex de la siguiente manera: los péptidos de polilisina (P o Y) y el vector p-EGFP-N3 (D), ARNm (m) o minicírculo (M) se diluyeron en agua (cada 50 jl) y se mezclaron completamente mediante pipeteo rápido en una proporción de 4:1. Se permitió que los nanoplex se formaran en una etapa de incubación de 30 minutos. Posteriormente, la suspensión de nanoplex se diluyó con OptiMEM hasta un volumen total de 1 ml. Los reactivos de transfección comerciales sistema de administración dinámica TransIT-X2®, reactivo de transfección Xtreme GENE™ HP, genecelina y lipofectamina® se formularon según lo descrito por el fabricante.
Sapofección (transfección con saponinas triterpénicas)
[0067] Se sembraron células Neuro2a o células HTC-116 (15000 células/pocillo) en una placa de 24 pocillos con un volumen de pocillo de 400 jl de medio de cultivo y se incubaron durante 24 h. Los reactivos de transfección se formularon según lo descrito anteriormente y se mezclaron con solución de saponina, en caso necesario. El medio de cultivo se reemplazó por el medio de transfección con una cantidad final de 500 ng de ADN/ARN. Después de un período de incubación de 48 h (transfecciones de ADN) o 24 h (transfecciones de ARN), se eliminó el medio de transfección, las células se tripsinizaron y se transfirieron a un tubo de poliestireno para citometría de flujo (Cytoflex). Para cada medición se adquirieron 10000 células. La eficiencia de transfección se determinó mediante el software de análisis Cyflogic (mediante comparación de las parcelas de muestreo con el control negativo en términos de fluorescencia).
Mediciones de impedancia celular
[0068] Para mediciones de toxicidad en tiempo real, se empleó el dispositivo de medición de impedancia iCELLigence® . Se sembraron 8000 células Neuro2a por pocillo en dos placas E L8 de 8 pocillos y se incubaron durante 24 h en un volumen de 800 jl. Para estudios de toxicidad por transfección, se añadieron 50 jl de reactivo después de retirar el volumen respectivo de medio de cultivo. Se aplicó una concentración no tóxica de 2 jg/ml de GE1741. Para los estudios de permeabilidad se aplicaron a las células concentraciones crecientes de GE1741 de 2,5 jg/ml a 60 jg/ml. Cada 10 minutos se midió la impedancia/viabilidad. Los resultados fueron analizados y representados con el software de análisis de datos RTCA.
Espectroscopia de RMN
[0069] Las muestras para espectroscopía de RMN se prepararon disolviendo 2 mg de GE 1741 en 600 j l de d4-metanol (99,95 % de contenido de deuterio, Deutero, Kastellaun, Alemania) y disolviendo 4 mg de GE 1741 en 600 j l de d5-piridina (99,9 % de contenido de deuterio, Deutero, Kastellaun, Alemania) para obtener una concentración de 1,9 y 3,8 mM/I, respectivamente. Las soluciones se transfirieron a tubos de muestra de 5 mm que se sellaron para evitar la evaporación del disolvente o la acumulación de agua.
[0070] Los espectros de RMN se registraron a 300 K a 600 (frecuencia 1H) en espectrómetros Bruker AV-III (Bruker Biospin, Rheinstetten, Alemania) utilizando una sonda de resonancia triple TCI de 5 mm enfriada criogénicamente equipada con gradientes autoprotegidos de un eje. El software utilizado para controlar el espectrómetro fue topspin 3,5 μl6. La temperatura había sido calibrada usando d4-metanol y la fórmula de Findeisen et al. (Findeisen 2007).
[0071] Experimentos utilizando la muestra en metanol: Se registraron espectros unidimensionales 1H y 13C a 600 MHz utilizando 32 y 18 432 escaneos, respectivamente. En el caso del espectro de carbono, se aplicó el desacoplamiento de banda ancha de protones. Espectros homonucleares: se registraron un DQF-COSY (Piantini et al., 1982), un TOCSY (Braunschweiler y Ernst, 1983; Bax y Davis, 1985a) y un NOESY (Jeener et al., 1979)
utilizando puntos de datos complejos de 2048 x 512 y tiempos de adquisición de 204 y 61 ms en F2 y F1, respectivamente. Se registraron dQf-COSY y TOCSY (tiempo de mezcla 80 ms) usando 8 escaneos, utilizando el NOESY 64 escaneos con un tiempo de mezcla de 80 ms.
[0072] Los espectros heteronucleares se registraron de la siguiente manera: un 13C-HSQC (Bodenhausen y Ruben, 1980), 13C-HSQC-TOCSY, 13C-HSQC-CLIP-COSY y 13C-HSQC-NOESY se registraron utilizando 512 x 1024 puntos de datos complejos, tiempos de adquisición de 51 y 45 ms en F2 y F1, respectivamente, y 48, 96, 96 y 288 escaneos, respectivamente. Un 13C DEpT-HMQC (Kessler et al., 1989), y un 13C-HQQC (Kessler et al., 1991) se registraron utilizando 512 x 512 puntos de datos complejos, tiempos de adquisición de 51 y 23 ms en F2 y F1, respectivamente, y 64 y 60 escaneos, respectivamente. Para la determinación del 1J HC y el 3JHH, se registró un 13C-HSQC sin reenfoque ni desacoplamiento de carbono utilizando 16384 x 512 puntos de datos complejos, tiempos de adquisición de 1638 y 73 ms en F2 y F1, respectivamente, y utilizando 32 escaneos. Todos los espectros heteronucleares anteriores se registraron utilizando un pulso BIRD para la supresión de protones unidos a 12C (Bax y Subramanian, 1986). Un 13C-HMBC de gradiente mejorado (Bax y Summers, 1986; Cicero et al., 2001) se registró utilizando 2048 x 1024 puntos de datos complejos, tiempos de adquisición de 204 y 33 ms en F2 y F1, respectivamente, y 128 escaneos.
[0073] Experimentos utilizando la muestra en piridina.: se registraron espectros unidimensionales 1H y 13C a 600 MHz utilizando 32 y 14 349 escaneos, respectivamente. En el caso del espectro de carbono, se aplicó el desacoplamiento de banda ancha de protones. Se registró un DQF-COSY (Piantini et al., 1982) utilizando 2048 x 512 puntos de datos complejos, 8 escaneos y tiempos de adquisición de 204 y 61 ms en F2 y F1, respectivamente. Se registró un 13C-HSQC (Bodenhausen y Ruben, 1980) utilizando 512 x 1024 puntos de datos complejos, 32 escaneos y tiempos de adquisición de 51 y 45 ms en F2 y F1, respectivamente. Se registró un 13C-Hm Bc de gradiente mejorado (Bax y Summers, 1986; Cicero et al., 2001) utilizando 2048 x 1024 puntos de datos complejos, tiempos de adquisición de 204 y 33 ms en F2 y F1, respectivamente, y 64 escaneos.
[0074] Los datos se procesaron usando topspin3.2, normalmente se usó una campana sinusoidal cuadrada desplazada 90° en ambas dimensiones, en el caso del HMBC se usó una campana sinusoidal en F2. Los conjuntos de datos se procesaron para obtener una matriz de datos de 4096 por 2048 puntos.
Aislamiento y caracterización de GE1741
[0075] Inicialmente, se analizó el extracto de semilla y raíz en relación con la actividad potenciadora de la transfección. Los resultados se muestran en la figura 6. Se analizó el cromatograma de HPLC del extracto de raíz seca (ver figura 1), se recogieron los picos P2, P3 y P4 y se probó su actividad biológica. Estos resultados también se muestran en la figura 6. Posteriormente, P2 se sometió a una purificación adicional por HPLC, como se ha explicado anteriormente. Las etapas posteriores de purificación semipreparativa guiadas por LC-ESI-MS (véanse las figuras 2 y 3) condujeron a un aislamiento de un pico, cuya actividad se probó repetidamente. Las mediciones de LC-ESl-MS/MS detectaron en el modo de ionización negativa la señal de ion molecular desprotonado [M-H] - a m/z 1741 (ver figura 4). La señal iónica del fragmento MS/MS a m/z 955 se asignó a la saponina después de la secesión de la cadena de diacetil-pentasacárido unida al C-28 del ácido quillaico, y dio como resultado m/z 460 después de la escisión adicional de la unidad de trisacárido en C-3. Se determinó que la fórmula molecular era C79H122O42 (calculada: 1741,73325) a partir de la masa medida del ion cargado negativamente (HR-ESI-MS m/z 1741,7336). Esto corresponde a una diferencia de masa de solo 0,2 ppm.
Espectroscopia de RMN 1D y 2D de GE1741
[0076] La estructura de la saponina GE1741 de tipo ácido quillaico bisdesmosídico se esclareció completamente mediante experimentos espectroscópicos de Rm N 1D y 2D, que incluyen 1H, 13C y HSQC, HMBC, hQq C, DQF-COSY, TOCSY, HSQC-TOCSY y NOESY usando d4-metanol. Entre las señales del espectro RMN de 13C de GE174, dos resonancias de doble intensidad (5C 75,33, 71,43 ppm) indicaron una superposición completa de los átomos de C. Como unidades estructurales parciales, se observó un resto triterpénico y la existencia de 8 azúcares con dos puntos de acetilación. Utilizando experimentos de HSQC y HQQC, se reconocieron seis resonancias con hibridación sp3 (5C 10,9, 16,4, 17,7, 24,8, 27,1, 33,3 ppm) como grupos metilo en el resto triterpénico y, además, se asignaron tres grupos metilo a los desoxiazúcares (5C 17,0, 17,6, 18,3). La RMN 1H proporcionó resonancias singlete (5H 0,74, 0,87, 0,94, 1,00, 1,16, 1,38 ppm) para las funciones triterpénicas metilo, y dobletes (5H 1,16, 1,23, 1,31) para las funciones desoxi.
[0077] El cuerpo C30 mostró dos grupos metilo menos de lo esperado, lo que se explica por la aparición de una función aldehido (5C 211,5 ppm, 5H 9,47 ppm) y una función ácida (5C 175,9 ppm). Junto con las resonancias para un doble enlace en 5C 123,2 (CH), 144,8 ppm (C cuaternario), una señal triplete amplia (5H 5,31 ppm), una función oximetina sustituida en C-3 (5C 86,4, 5h dd 3,86) combinada con los datos de correlación de HMBC dilucidaron un esqueleto de tipo hidroxi-oleanan-12-eno. Los resultados correspondientes se muestran en la figura 7 y se explicarán con más detalle a continuación.
Las correlaciones 2,3 J CH del protón aldehido 59,47 ppm a C-4 (56,3 ppm), CH3-24 (510,9) y C-5. La correlación de largo alcance de H-3 (53,86) a la posición cuaternaria C-4 y C-24 sugirió que la función CHO estaba en C-23.
La segunda hidroxilación en C-16 (5C 74,5) se observó mediante señales 2,3/-CH de protones de H-18 (52,94), CH2-22 (51,93, 1,16). Se detectó un número total de ocho monosacáridos en la estructura de GE1741 mediante espectroscopia RMN de 1H y 13C mediante la observación de cambios químicos característicos de resonancias de anómeros. La nomenclatura de GE1741 es la siguiente: 3-O-(P-D-Galactopiranosil-(1^-2)-[P-D-xilopiranosil-(1^3)]-p-D-glucuronopiranosil)-28-O-(P-D-xilopiranosil-(1^3)-[P-D-xilopiranosil-(1^4)]-a-L-ramnopiranosil-(1^2)-[3,4-di-(O-acetil)-p-D-quinovopiranosil]-(1^4)-p-D-fupiranosil)-ácido quillaico.
[0078] Una unidad de trisacárido está unida al C-3 y un hexasacárido al C-28 en esta saponina de tipo ácido quillaico bisdesmosídico. Las identidades de los azúcares y los enlaces con las respectivas conectividades 1H/13C se identificaron inequívocamente mediante una combinación de HMBC (ver figura 7), HSQC (alta resolución), HSQC-DEPT, HQQC, HSQC-TOCSY y DQF-COSY, 1H/1H-TOCSY, 1H/1H-NOESY, y HSQC no desacoplado. Las conectividades CH de 1J de todos los átomos de metino del azúcar se derivaron claramente mediante HSQC registrado con alta resolución en la dimensión indirecta (TD: F21024, F12048).
[0079] El trisacárido unido al C-3 consiste en un ácido glucurónico donde la función del ácido carboxílico libre en C-6 no se detectó mediante 13C ni mediante HMBC, una galactosa, y una xilosa con resonancias anoméricas a 5H/5C en [ppm] y 3J HH/1/ CH en [Hz]: 0-GlcA-1 (54,42, 104,6; d, 7,4, 161), P-Gal-1 (54,80, 103,7; d, 7,8, 163), 0-Xyl-1 (54,57, 104,9; d, 7,8, 162). La unidad de pentasacárido en C-28 consiste en 0-Fuc-1 (55,29, 94,8; d, 7,8, 166), a-Rha-1 (55,36, 101,5; d, 1,4, 171), 0-Xyl'-1 (54,49, 107,0; d, 7,2, 159), 0-Qui-1 (54,61, 105,8; d, 8,2, 161), P-Xyl"-1 (54,51, 105,6; d, 7,0, 162).
[0080] Las propiedades estereoquímicas de los enlaces glucosídicos se determinaron mediante valores característicos de las constantes de acoplamiento J (Hz) de 3J HH y 1J CH, respectivamente. Un gran acoplamiento transdiaxial (3J HH: 7-8 Hz) para H-1/H-2 en el caso de azúcares de tipo glucosa y galactosa definen una configuración p. Los valores de acoplamiento característicos 1J CH indican la configuración anomérica de las hexopiranosas con ~170 Hz para una configuración a, y ~160 Hz para una configuración p. Los valores detectados coincidieron absolutamente con estos datos de la literatura y también se pueden aplicar para la quinovosa (6-desoxi-glc), la fucosa (6-desoxigal) y la ramnosa (6-desoxi-manosa).
[0081] Los valores de acoplamiento J en [Hz] 1J CH para los anómeros se derivaron directamente del HMBC. En la RMN 1H de GE1741, la denominada "área primaria" con protones no anoméricos se produjo en el intervalo de 3,15-3,95 ppm, parcialmente superpuesta entre cuatro y cinco señales de protones de azúcar. El patrón de acoplamiento de protones de metino 3J HH en los diferentes sistemas de anillos de azúcar se detectó y se extrajo mediante un experimento HSQC no desacoplado medido en el intervalo de señal altamente poblado (1H: 53,15 -3,95 ppm, y 13C: 5 60-90 ppm, donde las constantes de acoplamiento 1J CH y casi todas las 3J HH se visualizaron y determinaron con precisión. El HSQC no desacoplado distinguió y dilucidó claramente GlcA de una posible GalA unida a C-3 vista por un gran patrón de acoplamiento transdiaxial de J 8,0 Hz (triplete) de GlcA-H-4 (5 3,55 ppm) a H-3 y H-5. Además, la señal TOCSY GlcA-H-1 (4,42 ppm) (tiempo de bloqueo de giro: 50 ms), y la HSQC-TOCSY detectaron la posición GlcA-5 que indica grandes constantes de acoplamiento en este sistema de giro.
[0082] Las señales del anómero 1H identificadas se utilizaron como 'grupos informadores estructurales' (Vliegenthart, 2006), (Bubb, 2003), (Duus et al., 2000)). Todos los sistemas de giro independientes con acoplamientos escalares en la 'región primaria' existente (5H: 3,15-4,7 ppm) en las cadenas de oligosacáridos de GE1741 se dilucidaron mediante una combinación de DQF-COSY, 1H/1H-TOCSY, y se confirmaron mediante un experimento HSQC-TOCSY. Las señales de correlación HMBC de largo alcance (ver figura 7) identificaron claramente los puntos de conexión interglucosídicos, por ejemplo, conexión a C-28 (5177,1) vista por Fuc-H-1 (5 5,29), y la secuencia y enlaces de las unidades de pentasacárido ramificado con la unidad central de azúcar Fucosa: Fuc-H-4 (53,76) a Qui-C-1 (5105,8), Fuc-H-2 (53,79) a Rha-C-1 (5101,5), Rha-H-4 (53,51) a Xyl'-C-1 (5107,0), y Xyl'-H-4 (53,52) a Xyl"-C-1 (5105,6).
[0083] Los dos cambios de acetilación significativos observados para Qui-H-3 (5 5,01) y Qui-H-4 (5 4,63) indicaron claramente la acetilación en la quinovosa y sacó las resonancias del azúcar metino de la "región principal de protones". Los dos puntos de acetilación fueron claramente dilucidados mediante señales cruzadas de largo alcance 2,3 J CH en el HMBC (véase la figura 7 de Qui-H-3 y Qui-H-4 a las funciones acetato carbonilo (5 172,1, 171,6). Esta doble acetilación en la unidad de quinovosa de GE1741 fue inesperada y puede considerarse como una característica estructural relevante y posiblemente como un factor importante para la alta actividad de esta saponina en los ensayos realizados.
[0084] La conexión de la unidad de trisacárido ramificado que comienza en el ácido glucurónico se observa mediante el 2,3J CH de GlcA-H-1 (54,42) a C-3 (586,4), y viceversa de H-3 (53,86) a GlcA-H-1. La galactosa está vinculada a GlcA observada mediante 2,3J CH de GlcA-H-2 (53,64) a Gal-C-1 (5103,7) y viceversa por Gal-H-1 (54,80) a Fuc-C-2 (575,1). La xilosa está unida a GlcA-C-3 observada mediante 2,3J CH de Xyl-H-1 (54,57) a GlcA-C-3 (586,6), y en dirección inversa de Glc-H-3 a Xyl-C-1. Las conectividades interglucosídicas también se observaron parcialmente en el NOESY, que muestra la interacción a través del espacio sobre los enlaces
glicosídicos. Todas las señales de largo alcance 2,3 J CH de estructura relevante en las unidades de azúcar se presentan en la figura 7.
Eficiencias de transfección de saponinas de Gypsophila elegans M.bieb
[0085] Se determinó la eficiencia de transfección a partir de extractos crudos, mediante varias etapas de purificación, hasta que se aisló la saponina GE1741. Todas las saponinas analizadas aumentaron significativamente la eficiencia de la transfección en comparación con una aplicación exclusiva de nanoplex de PD. El extracto de semilla y raíz produjo eficiencias de transfección comparables (~40 %). Sin embargo, se utilizó una concentración más baja para el extracto de raíz (5 μg/ml). P2 implicó un potencial de mejora de la transfección significativamente mayor (72 %) en comparación con P3 (29 %) y P4 (27 %). GE1741, que se aisló de P2, logró una eficiencia notable con un 60 % de células transfectadas.
[0086] Estos resultados se muestran en la figura 6, que representa la eficiencia de transfección de nanoplex ± saponinas triterpénicas en células Neuro2a. Se investigaron las actividades biológicas de diferentes etapas de purificación hasta el aislamiento final de GE1741. P2, que se obtuvo después de la purificación por HPLC del extracto crudo, logró la mayor eficiencia, superando incluso al GE1741 aislado. Un asterisco (*) indica que los resultados son significativos para el método de transfección sin la aplicación conjunta de GE1741, según lo determinado mediante una prueba t con p < 0,05 y n > 3.
Administración de ácidos nucleicos
[0087] La figura 8 compara la mejora de la eficiencia de transfección mediante GE1741 ("nueva saponina") con la mejora de la eficiencia de transfección mediante una saponina de la técnica anterior (SO1861), así como el “estándar de referencia” actual lipofectamina.
[0088] Como control negativo, se incubaron células Neuro2a sin adición de partículas que comprendieran un ácido nucleico.
[0089] Al agregar partículas que comprenden un péptido unido a ARNm (ARNPm), se pudo observar una eficiencia de transfección en el intervalo de un solo dígito. Después de añadir una saponina como potenciador a la suspensión celular respectiva, la eficiencia de transfección pudo aumentarse hasta aproximadamente un 15 % cuando se utiliza SO1861, pero incluso hasta un 35 % cuando se utiliza GE1741.
[0090] Al incubar células Neuro2a con partículas que comprenden un péptido unido al ADN (PD), se pudo observar una vez más una eficiencia de transfección en el intervalo de un solo dígito. Cuando se añadió SO1861 a la solución correspondiente, la eficiencia de transfección aumentó hasta aproximadamente un 35 %. Si se utilizó GE1741 en lugar de SO1861, se pudo observar una eficiencia de transfección de casi el 60 %.
[0091] Al incubar células Neuro2a con nanopartículas que comprenden un péptido unido a un ADN minicírculo (PM), se pudo observar una vez más una eficiencia de transfección en el área de un solo dígito. Después de agregar SO1861 a la suspensión celular correspondiente, la eficiencia de la transfección pudo aumentarse a más del 40 %. Si, por el contrario, se añadió GE1741 a la suspensión celular, la eficiencia de transfección aumentó hasta casi el 80 %.
[0092] Una eficiencia de transfección de casi el 80 % cuando se utilizan nanopartículas de ADN minicírculo peptídico es incluso mejor que una eficiencia de transfección de aproximadamente el 70 % observada para el “estándar de referencia” lipofectamina. Por lo tanto, GE1741 no sólo es mejor que las saponinas previamente aisladas, sino que muestra una mejora aún mayor de la eficiencia de transfección que el estándar de referencia que se encuentra actualmente en el mercado.
[0093] Los asteriscos en la figura 8 indican una diferencia significativa con el método de transfección sin coaplicación de saponina mediante la aplicación de una prueba t (p <0,05, n > 3).
Combinación de GE1741 con métodos de transfección comerciales
[0094] Se transfectaron células HCT-116 con reactivos de transfección comerciales para examinar el impacto de GE1741 en la eficiencia de la transfección. Los resultados se muestran en la figura 9. La adición de GE1741 condujo a un aumento en la eficiencia de transfección de cada método de transfección. Mientras que la eficiencia de transfección con TransIT solo aumentó ligeramente en 3 puntos porcentuales y la de Xtreme Gene en 8 puntos porcentuales, GE1741 aumentó la eficiencia de transfección de genecelina en 30 puntos porcentuales del 12 % (sin GE1741) al 42 % (con GE1741).
Toxicidad celular y permeabilidad de GE1741
[0095] Se investigó la impedancia, que muestra una correlación directa con la viabilidad celular, para determinar la toxicidad y las propiedades permeabilizantes de GE1741.
[0096] GE1741 no muestra efectos tóxicos para las células cuando se usa en una concentración que es totalmente suficiente para mejorar la eficiencia de transfección. Para probar los efectos tóxicos de GE1741, esta saponina se aplicó en diferentes concentraciones a células Neuro2a y se incubó durante un período de 50 horas. En concentraciones de 2,5 μg/ml y 6,25 μg/ml, un índice celular normalizado es (dentro del error de medición) idéntico al índice celular normalizado observado para el control negativo que se ha sometido a un proceso de transfección sin adición de GE1741. Esto se indica en la figura 10 mediante otras tres curvas superpuestas 1. Si la concentración de GE1741 se aumenta a 12,5 μg/ml, se podría observar una ligera disminución del índice celular normalizado (curva 2). El índice celular normalizado disminuyó aún más ligeramente al aumentar la concentración de GE1741 a 25 μg/ml (curva 3).
[0097] Sólo se pudo observar un efecto significativo en la viabilidad celular a una concentración de GE1741 de 50 μg/ml (curva 4). En este caso, el índice celular normalizado disminuyó notablemente aproximadamente 12 horas después de la transfección.
[0098] Puesto que ya se pudo observar una mejora de la eficiencia de transfección a una concentración de GE1741 de 2 μg/ml (esta concentración se usó en los experimentos cuyos resultados se muestran, por ejemplo, en las figuras 5 y 8), se puede concluir que GE1741 no presenta efectos citotóxicos en el intervalo de concentración relevante.
[0099] En otro experimento de toxicidad, se añadieron nanopartículas de ADN (curva 9), nanopartículas de ADN con 2 μg/ml de GE1741 (GE1741; curva 10) o 2 μg/ml de GE1741 solo (curva 11) a las células Neuro2a. De este modo, las nanopartículas de ADN comprendían ADN que codificaba la proteína fluorescente verde (GFP). Se utilizó tampón como control negativo (curva 12). Después de añadir las respectivas sustancias a las células en el momento marcado con una flecha y la palabra "transfección", no se pudo observar ninguna diferencia significativa en la viabilidad celular. Por lo tanto, no se revelaron efectos tóxicos para ninguna de las sustancias analizadas.
Eficiencia de transfección
[0100] También se examinó la eficiencia de transfección de GE1741 transfectando células con ADN que codifica saporina. La saporina es una proteína citotóxica. Si la transfección tiene éxito, las células transfectadas morirán. Los resultados correspondientes se muestran en la figura 12. El control negativo (curva 5) se refiere a células Neuro2a incubadas sin ninguna nanopartícula de ADN peptídico. La curva 6 se refiere a un experimento de transfección de células Neuro2a con nanopartículas que comprenden ADN que codifica saporina. El índice celular normalizado para esta configuración corresponde aproximadamente al índice celular normalizado del control negativo, lo que indica una eficiencia de transfección muy baja. Se pudo observar un índice celular normalizado igualmente alto si se añadieron nanopartículas de ADN peptídico que comprenden ADN que codifica la proteína fluorescente verde a las células junto con 2 μg/ml de GE1741. Como se muestra en las figuras anteriores, dicha combinación de nanopartículas de ADN peptídico y GE1741 sirve para una transfección altamente eficiente. Puesto que GFP no es tóxica para las células Neuro2a, el índice celular normalizado de esta configuración experimental (curva 7) corresponde aproximadamente al índice celular normalizado del control negativo (curva 5).
[0101] Sin embargo, si se añaden nanopartículas de ADN peptídico que comprenden ADN que codifica saporina junto con 2 μg/ml de GE1741 a células Neuro2a, no se podría observar más crecimiento celular aproximadamente 15 horas después de la transfección (curva 8). En cambio, el índice celular normalizado permanece en un valor inferior a 3, que es considerablemente más bajo que en el caso del control negativo. Esto muestra claramente la transfección altamente eficiente de las células Neuro2a con ADN que codifica la proteína citotóxica saporina.
[0102] En resumen, se podrían identificar nuevos compuestos que mejoren la transfección mediante el uso de una estrategia de aislamiento guiada por bioensayo en la planta, en su mayoría inexplorada, Gypsophila elegans M.Bieb. Con esta estrategia, se realizó un enfoque alternativo de pruebas de purificación y actividad para hallar el compuesto activo más alto para experimentos bioquímicos avanzados. El cromatograma de HPLC del extracto de raíz crudo reveló una serie de picos a un tiempo de retención notable, que se probaron directamente en un método de transfección a base de péptidos. El distinto efecto potenciador de la transfección de P2, en comparación con niveles más bajos de P3 y P4, condujo a la suposición de un compuesto altamente activo en la fracción específica. La purificación y el aislamiento adicionales mediante LC/MS y la identificación de GE1741 mediante Ms/MS proporcionaron un compuesto cuya fuerte actividad fue confirmada. La menor eficiencia de GE1741 hacia P2 podría explicarse por la presencia de una mezcla de saponinas en P2 que comprende, además de GE1741, una saponina cuyo residuo de xilosa terminal está sustituido por arabinosa.
[0103] Se investigó la aplicabilidad universal de GE1741 en experimentos de transfección. Se podría aumentar considerablemente la administración de diferentes ácidos nucleicos, incorporados en nanoplex. Las
transfecciones de ARNm fueron menos efectivas que las transfecciones de ADN debido a una degradación más rápida por parte de las enzimas celulares. Sin embargo, la falta de una etapa de transcripción permitió la mayor eficiencia incluso después de un tiempo de incubación de 24 h y, por lo tanto, representó un método de transfección rápido. La transfección en minicírculo produjo la mayor eficiencia, probablemente debido al tamaño más pequeño del minicírculo en comparación con el ADN plasmídico.
[0104] Se evaluó el impacto de GE1741 en los métodos de transfección comerciales para subrayar la aplicabilidad universal y simple. Se podría lograr un aumento de la eficiencia de la transfección para cada método. Se podría lograr un aumento particularmente significativo para las transfecciones de genecelina.
[0105] Un problema común y una limitación para el uso de reactivos de transfección en experimentos específicos in vitro e in vivo son los efectos tóxicos, que a menudo van acompañados de una alta eficiencia. Al realizar mediciones de impedancia, que representan la viabilidad celular, se analizaron las transfecciones mediadas por GE1741 en términos de toxicidad. Los resultados revelaron que las células transfectadas con una combinación de nanoplex y GE1741 eran tan viables como el control negativo no tratado. La aplicación de diferentes concentraciones de GE1741 mostró una toxicidad a partir de una concentración de 6,25 μg/ml y los primeros efectos líticos a una concentración de 50 μg/ml, indicados por una caída considerable de la impedancia. Como las mediciones de eficiencia de las transfecciones se realizaron en una concentración de 2 μg/ml, en última instancia, se puede confirmar una alta actividad sin toxicidad para GE1741.
[0106] GE1741 es un compuesto novedoso y valioso para su uso en el proceso de transfección mediada por saponinas, la denominada sapofección.
Lista de publicaciones citadas en las secciones anteriores:
[0107]
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Claims (15)
1. Uso de una saponina según la fórmula (I) en la administración in vitro de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a una célula:
donde
R1 es un residuo de xilosa o un residuo de arabinosa unido con su átomo C1 al correspondiente residuo de xilosa de fórmula (I); y
R2 es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula H o un residuo de acetilo,
con la condición de que al menos dos residuos acetilo estén presentes en la saponina.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por que la célula es una célula eucariota.
3. Saponina según la fórmula (I) para su uso en terapia o diagnóstico mediante una administración in vivo de un ácido nucleico, un lípido, un péptido y/o una proteína a un ser humano o animal:
donde
R1 es un residuo de xilosa o un residuo de arabinosa unido con su átomo C1 al correspondiente residuo de xilosa de fórmula (I); y
R2 es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula H o un residuo de acetilo,
con la condición de que al menos dos residuos acetilo estén presentes en la saponina.
4. Uso según la reivindicación 1 o 2 o saponina para su uso según la reivindicación 3, caracterizado por que R1 es un residuo de xilosa y/o por que la saponina lleva exactamente dos grupos acetilo.
5. Uso según la reivindicación 4 o saponina para su uso según la reivindicación 4, caracterizado por que los grupos acetilo están unidos a los átomos de oxígeno en la posición C3 y C4 del correspondiente residuo de quinovosa.
6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 4 o 5, o saponina para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizado por que la saponina se aplica en combinación con al menos un reactivo de transfección seleccionado del grupo que consiste en reactivos de transfección basados en liposomas y reactivos de transfección basados en polímeros.
7. Composición de transfección, que comprende al menos un reactivo de transfección seleccionado del grupo que consiste en reactivos de transfección de base liposomal y reactivos de transfección de base polimérica, así como una saponina según la fórmula (I):
donde
R1 es un residuo de xilosa o un residuo de arabinosa unido con su átomo C1 al correspondiente residuo de xilosa de fórmula (I); y
R2 es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula H o un residuo de acetilo,
con la condición de que al menos dos residuos de acetilo estén presentes en la saponina.
8. Composición de transfección según la reivindicación 7, caracterizado por que R1 es un residuo de xilosa y/o por que la saponina lleva exactamente dos grupos acetilo.
9. Composición de transfección según la reivindicación 8, caracterizado por que los grupos acetilo están unidos a los átomos de oxígeno en la posición C3 y C4 del correspondiente residuo de quinovosa.
10. Método para una transfección in vitro, que comprende la etapa de incubar una célula con un ácido nucleico en presencia de una saponina según la fórmula (I):
donde
R1 es un residuo de xilosa o un residuo de arabinosa unido con su átomo C1 al correspondiente residuo de xilosa de fórmula (I); y
R2 es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula H o un residuo de acetilo,
con la condición de que al menos dos residuos de acetilo estén presentes en la saponina.
11. Método según la reivindicación 10, caracterizado por que la célula es una célula eucariota.
12. Método según la reivindicación 10 u 11, caracterizado por que el ácido nucleico forma parte de una nanopartícula.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado por que la saponina se utiliza en una concentración comprendida en un intervalo de 1 |jg/ml a 25 |jg/ml.
14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado por que la saponina se usa en combinación con al menos un reactivo de transfección seleccionado del grupo que consiste en reactivos de transfección basados en liposomas y reactivos de transfección basados en polímeros.
15. Método para aislar una saponina según la fórmula (I):
donde
R1 es un residuo de xilosa o un residuo de arabinosa unido con su átomo C1 al correspondiente residuo de xilosa de fórmula (I); y
R2 es independiente de otros residuos R2 en la misma molécula H o un residuo de acetilo,
con la condición de que al menos dos residuos de acetilo estén presentes en la saponina de Gypsophila elegans M. Bieb, que comprende las siguientes etapas:
• cortar raíces de Gypsophila elegans M. Bieb,
• liofilizar y triturar las raíces cortadas para obtener un polvo de raíz,
• extraer el polvo de raíz con un disolvente orgánico altamente concentrado para obtener un extracto de raíz, • retirar el disolvente orgánico altamente concentrado del extracto de raíz para obtener un extracto seco, • disolver el extracto seco en un disolvente orgánico de baja concentración para obtener una solución de extracto,
• someter la solución de extracto a al menos una etapa de separación cromatográfica para obtener una solución de saponina purificada, y
• retirar cualquier disolvente de la solución de saponina purificada para obtener un polvo de saponina purificada;
donde el disolvente orgánico de alta concentración es un disolvente orgánico que tiene una concentración de más del 50 % (v/v) y donde el disolvente orgánico de baja concentración es un disolvente orgánico que tiene una concentración de menos del 50 % (v/v).
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