ES2954986T3 - Método y sistema para atraer insectos lepidópteros - Google Patents

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Abstract

La invención se refiere a una composición para atraer insectos lepidópteros que comprende una mezcla de vapor de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula (I), (I) en la que R se selecciona del grupo que comprende -CH2OH, -CN, -NC y - OH; y a métodos de uso de la composición para atraer, detectar, estudiar, monitorear y/o controlar insectos lepidópteros. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método y sistema para atraer insectos lepidópteros
1. Campo de la invención
La invención proporciona sistemas y métodos que pueden usarse para atraer insectos lepidópteros objetivo, en particular, insectos de las familias Tortricidae, Geometridae y Noctuidae.
2. Antecedentes de la invención
El orden Lepidópteros incluye polillas y mariposas que son participantes esenciales en el ecosistema natural como polinizadores y alimento para otros animales.
Sin embargo, muchas especies causan problemas en la agricultura, ya que sus larvas pueden consumir grandes cantidades de materia vegetal viva en poco tiempo, causando daños masivos a los cultivos.
Los enrolladores de hojas son una familia de polillas cuyas larvas se atan las hojas con hilos de seda y comen hojas y frutos dentro de este refugio protector. Esto provoca imperfecciones antiestéticas en la fruta y puede provocar enfermedades secundarias, por ejemplo, provocar pudrición en cultivos como la uva. Los enrolladores de hojas se encuentran en una amplia gama de frutas y arbustos y árboles ornamentales.
El enrollador de hojas, polilla marrón clara de la manzana (LBAM), Epiphyas postvittana (Lepidópteros: Tortricidae) es una plaga hortícola importante tanto en su hábitat nativo como en el introducido en Australia, Nueva Zelanda, Estados Unidos y el Reino Unido. LBAM es mejor conocido como un insecto plaga para los árboles frutales, incluyendo manzanas, peras, cítricos, melocotones, nectarinas, albaricoques, plantas de la vid, frutos rojos y, en menor medida, para la silvicultura, cultivos de hortalizas y flores.
El hábitat del LBAM continúa expandiéndose, con insectos ahora confirmados en California y Europa. Se necesitan métodos para atrapar y/o matar el LBAM y otros insectos enrolladores de hojas para reducir el daño causado a cultivos importantes.
Para la mayoría de las especies de lepidópteros, el comportamiento reproductor consiste en que la hembra libera una feromona sexual volátil que provoca el vuelo contra el viento en los machos de la misma especie. Los machos se orientan hacia la fuente para efectuar la cópula. Dado que la mayoría de las especies de lepidópteros utilizan muchos de los mismos compuestos de feromonas para la comunicación sexual, las mezclas de múltiples componentes pueden ser cruciales para la especificidad de las especies.
Las feromonas sexuales se utilizan ampliamente como atrayentes de insectos, a menudo en combinación con un agente letal, tal como un insecticida. Sin embargo, la mayoría de las feromonas sexuales atraen sólo a los insectos machos, por lo que su efectividad es limitada. Un solo insecto hembra puede poner huevos suficientes para infestar un área grande, por lo que sería ventajoso proporcionar un atrayente para insectos lepidópteros que atrajera a ambos sexos.
Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar sistemas y métodos para atraer insectos lepidópteros, en particular, insectos de las familias Tortricidae, Geometridae y Noctuidae, o al menos ofrecer al público una opción útil.
3. Sumario de la invención
En un primer aspecto, la invención proporciona un sistema para detectar, explorar, monitorizar y/o controlar insectos lepidópteros, que comprende:
(a) un dispensador que dispensa una mezcla de vapores de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula I,
Figure imgf000002_0001
en donde R se selecciona entre el grupo que comprende -CN
y -NC; y
(b) un dispositivo de captura.
En una realización, el sistema comprende un agente letal.
En un segundo aspecto, la invención proporciona un método para atraer insectos lepidópteros a un lugar, comprendiendo el método colocar en el lugar una composición que comprende una mezcla de vapor de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula I, como se ha mostrado anteriormente, en donde R se selecciona entre el grupo que comprende -CN, -NC, -CH2OH y -OH.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método para detectar, explorar, monitorizar y/o controlar poblaciones de insectos lepidópteros en un área, que comprende: colocar en el área, un sistema del primer aspecto de la invención. En una realización, el sistema comprende un agente letal.
En los aspectos anteriores:
En una realización, el insecto lepidóptero es un insecto de una de las familias seleccionadas entre Tortricidae, Geometridae y Noctuidae.
En una realización, el insecto lepidóptero es un insecto de la familia Tortricidae, preferentemente un insecto enrollador de hojas, más preferentemente, la LBAM.
En una realización, el insecto lepidóptero es hembra.
En esta memoria descriptiva cuando se ha hecho referencia a memorias descriptivas de patentes, otros documentos externos, u otras fuentes de información, generalmente tiene como objetivo proporcionar un contexto para analizar las características de la invención. A menos que se indique específicamente otra cosa, la referencia a dichos documentos externos no debe interpretarse como una admisión de que dichos documentos, o dichas fuentes de información, en cualquier jurisdicción, son técnica anterior o forman parte del conocimiento general común en la técnica.
Además, cuando las características o aspectos de la invención se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la materia apreciarán que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo Markush.
Como se usa en el presente documento, el término "(s)" que sigue a un sustantivo significa la forma plural y/o singular de ese sustantivo.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "y/o" significa "y" o "o" o ambos.
4. Breve descripción de las figuras
La invención se describe ahora con referencia a las figuras en las que:
la Figura 1 es un gráfico que muestra la atracción de LBAM machos y hembras, a seis compuestos volátiles específicos probados en huertos de manzanos, como se describe en el Ejemplo 1A. La carga de los primeros cinco compuestos está en mg, mientras que la carga de ácido acético está en ml. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de LBAM, ESBM y OBLR machos y hembras capturados en trampas cebadas con seis compuestos en huertos de manzanos, como se describe en el Ejemplo 1B. La carga de los primeros cinco compuestos está en mg, mientras que la carga de ácido acético está en ml. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La figura 3 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de LBAM machos y hembras capturados en trampas cebadas con mezclas de dos componentes que contienen 100 mg de cada compuesto más 3 ml de ácido acético, como se describe en el Ejemplo 2a . Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de LBAM, ESBM y OBLR machos y hembras capturados en trampas cebadas con mezclas binarias que contienen 10 mg de cada compuesto 0,3 ml de ácido acético, como se describe en el Ejemplo 2B. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de LBAM machos y hembras capturados en trampas cebadas con diversas composiciones como se divulga en el presente documento (cantidad de los compuestos en mg, mientras que la del ácido acético en ml), como se describe en el Ejemplo 3A. Los tratamientos marcados con las mismas letras no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 6 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de LBAM, ESBM y OBLR machos y hembras capturados en trampas cebadas con composiciones como se divulga en el presente documento (una mezcla cuaternaria y tres mezclas binarias), como se describe en el Ejemplo 3B. La carga de los primeros tres compuestos está en mg, mientras que la carga de ácido acético está en ml. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La Figura 7 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de ESBM, OBLR y ETLR machos y hembras capturados en trampas cebadas con composiciones como se divulga en el presente documento (tres mezclas binarias que contienen 100 mg de los tres compuestos de la invención más 3 ml de ácido acético), como se describe en el ejemplo 4. Como control se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético y trampas en blanco. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La Figura 8 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de ESBM y TLLR machos y hembras capturados en trampas cebadas con composiciones como se divulga en el presente documento que comprenden uno o dos compuestos de fórmula I y ácido acético, como se describe en el ejemplo 5. Como control se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético y trampas en blanco. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La Figura 9 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de ESBM y OBLR machos y hembras, atrapados en trampas cebadas con: 1) 100 mg de bencilnitrilo; 2) 3 ml de ácido acético; 3) una mezcla binaria de 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético, como se describe en el Ejemplo 6A. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La Figura 10 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de ESBM y OBLR machos y hembras, atrapados en trampas cebadas con: 1) 10 mg de bencilnitrilo; 2) 0,3 ml de ácido acético; y 3) una mezcla binaria de 10 mg de bencilnitrilo 0,3 ml de ácido acético, como se describe en el Ejemplo 6B. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La Figura 11 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de ESBM machos y hembras capturados en trampas cebadas con una mezcla binaria que contiene una cantidad constante (3 ml) de ácido acético y cantidades variables de bencilnitrilo (1, 10, 100 mg ), como se describe en el Ejemplo 7A. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La Figura 12 es un gráfico que muestra la media (±SE) de ESBM y LBAM machos y hembras, capturados en trampas cebadas con una mezcla binaria que contiene tres dosis de bencilnitrilo ácido acético (1:0,03, 10:0,3, 100:3 mg:ml), como se describe en el Ejemplo 7B. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05).
La figura 13 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de ESBM machos y hembras capturados en trampas cebadas con mezcla binaria que contiene 100 mg de cada compuesto más 3 ml de ácido acético, como se describe en el ejemplo 8. Los tratamientos marcados con las mismas letras no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La figura 14 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de la polilla de la vid europea (Lobesia botrana) machos y hembras capturados en trampas cebadas con mezclas de dos componentes que contienen 100 mg de cada compuesto HIPV más 3 ml de ácido acético, como se describe en el ejemplo 9. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 15 es un gráfico que muestra la media (±SE) del número total de Planotortrix octo (A), Ctenopseustis obliquana (B) y Ctenopseustis herana (C) machos y hembras capturados en trampas cebadas con mezclas binarias que contienen 10 mg de cada compuesto HIPV 0,3 ml de ácido acético. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 16 es un gráfico que muestra la media del número total de Graphania spp. (A) y Tmetolophota spp. (B) machos y hembras capturados en trampas cebadas con mezclas binarias que contienen 10 mg de cada compuesto HIPV 0,3 ml de ácido acético. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 17 es un gráfico que muestra la media del número total de machos y hembras de la polilla enrolladora de hojas pandemis, Pandemis pyrusana (A), el enrollador de tres líneas, Pandemis limtata (B), el enrollador de hojas europeo, Archips rosanus (C) y la polilla enrolladora de las hojas de los árboles frutales, Archips argyrospila (D) capturados en trampas cebadas con mezclas binarias que contienen 10 mg de cada compuesto HIPV 0,3 ml de ácido acético. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 18 es un gráfico que muestra la media del número total de machos y hembras de Abagrotis spp. (A), Euxoa spp. (B), Agrotis spp. (C) y Anavitrinella spp. (D) capturados en trampas cebadas con mezclas binarias que contienen 10 mg de cada compuesto HIPV 0,3 ml de ácido acético. Los tratamientos marcados con las mismas letras en mayúscula o minúscula no son significativamente diferentes (P > 0,05). Los tratamientos que no capturaron polillas no se incluyeron en los análisis.
La Figura 19 es una fotografía que muestra las hembras de enrollador atrapadas en trampas cebadas con la composición como se divulga en el presente documento.
La Figura 20 es un diagrama de cajas de la captura por trampa por día de tres insectos lepidópteros de ambos sexos.
5. Descripción detallada de la invención
Como se usa en el presente documento, el término "feromona" o "feromona sexual" significa una molécula de señal intraespecífica, típicamente en lepidópteros, producida y liberada por los insectos hembra en el momento o antes del apareamiento, que atrae a los machos.
La expresión "que comprende" tal como se usa en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones significa "que consiste al menos en parte en". Al interpretar las afirmaciones en la presente memoria descriptiva y reivindicaciones que incluyen la expresión "que comprende", también pueden estar presentes otras características además de las características precedidas por este término en cada afirmación. Los términos y expresiones relacionados tales como "comprende" y "comprendido/a" deben interpretarse de manera similar.
Los inventores han descubierto sorprendentemente que una mezcla de vapor de ácido acético y uno o más compuestos seleccionados entre el grupo que comprende bencilnitrilo, 2-feniletanol y alcohol bencílico, atrae sinérgicamente a los insectos lepidópteros.
En consecuencia, en el presente documento se divulga una composición para atraer insectos lepidópteros que comprende una mezcla de vapor de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula I
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en donde R se selecciona entre el grupo: -CH2OH, -CN, -NC y -OH.
Todos los compuestos de la composición (2-fenilalcohol, alcohol bencílico, bencilnitrilo y bencilisonitrilo) son volátiles. Si bien los compuestos de fórmula I son atrayentes por sí mismos, combinándolos con ácido acético, mejora enormemente el efecto.
Como se ve en los Ejemplos 1A y 1B, lo compuestos de fórmula I y el ácido acético son atrayentes débiles para muchas polillas enrolladoras, demostrando con ácido acético aproximadamente la misma o mejor actividad atrayente. Sin embargo, cuando se combinan con ácido acético, cada uno de los tres compuestos de fórmula I mostró una actividad enormemente mejorada (véanse los Ejemplos 2A y 2B). Este efecto atrayente sinérgico se observó en relación con varios insectos lepidópteros, LBAM, ESBM y o BlR. En algunos casos, la combinación de dos o tres compuestos de fórmula I con ácido acético proporcionó un efecto atrayente aún mayor, tal como se describe en los Ejemplos 3a, 3B y 5.
La composición puede proporcionar una mezcla de vapor de 2-fenilalcohol y ácido acético.
Como alternativa, la composición puede proporcionar una mezcla de vapor de alcohol bencílico y ácido acético. Como alternativa, la composición puede proporcionar una mezcla de vapor de bencilnitrilo y ácido acético.
Como alternativa, la composición puede proporcionar una mezcla de vapor de bencilisonitrilo y ácido acético.
La composición puede proporcionar una mezcla de vapor de dos compuestos de fórmula I y ácido acético.
La composición puede proporcionar una mezcla de vapor de tres compuestos de fórmula I y ácido acético.
La composición puede proporcionar una mezcla de vapor de los cuatro compuestos de fórmula I y ácido acético. Se encontró que los compuestos de fórmula I eran liberados por plántulas de manzana cuando estaban infestadas por las larvas de LBAM. En lugar de repeler a las polillas adultas como se esperaba, se descubrió inesperadamente que estos compuestos los atraían. Se descubrió que otros compuestos liberados, tales como indol y (E)-nerolidol, tenían cierta actividad atrayente contra algunos insectos, pero los resultados fueron inconsistentes.
El Ejemplo 6A compara directamente el efecto de combinar un compuesto de fórmula I (bencilnitrilo) con ácido acético, en relación con el uso de cada compuesto individualmente.
El vapor de ácido acético puede ser proporcionado por cualquier compuesto o combinación de compuestos que produzca ácido acético volatilizado, por ejemplo, ácido acético acuoso, ácido acético glacial, anhídrido acético o acetato de amonio.
La composición divulgada en el presente documento se utiliza para atraer insectos lepidópteros a un lugar, colocando la composición en ese lugar.
El insecto Lepidoptous puede seleccionarse entre insectos de las familias Tortricidae, Geometridae y Noctuidae. Preferentemente, el insecto lepidóptero es de la familia Tortricidae, más preferentemente, un insecto enrollador de hojas.
El insecto lepidóptero puede seleccionarse entre el grupo que comprende:
(a) la polilla de la manzana de color marrón claro: Epiphyas postvittana (LBAM);
(b) la polilla de las yemas: Spilonota ocellana (ESBM);
(c) el enrollador de hojas de bandas oblicuas: Choristoneura rosaceana (OBLR);
(d) el enrollador pandemis: Pandemis pyrusana (PLR);
(e) el enrollador de hojas europeo: Archips rosanus (ETLR);
(f) el enrollador de hojas de tres líneas: Pandemis limtata (TLLR);
(g) el enrollador de cabeza verde: Planotortrix octo
(h) los enrolladores de cabeza parda: Ctenopseustis obliquana y Ctenopseustis herana;
(i) el enrollador de hojas de árboles frutales: Archips argyrospila;
(j) la polilla europea de la vid: Lobesia botrana;
(k) el gusano del cogollo del abeto oriental: Choristoneura fumiferana; y
(l) gusano del cogollo del abeto occidental: Choristoneura occidentalis.
También se divulga en el presente documento un sistema para detectar, explorar, monitorizar y/o controlar poblaciones de insectos lepidópteros, que comprende: (a) un dispensador que dispensa una mezcla de vapor de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula I como se ha definido anteriormente cuando R es -CN o NC y (b) un dispositivo de captura.
El sistema incluye un dispensador que contiene o retiene los compuestos no volatilizados utilizados para producir la mezcla de vapor y también dispensa la mezcla de vapor. El dispensador puede contener y liberar los compuestos no volatilizados por separado, que luego forman una mezcla de vapor cuando se encuentran en el momento de la liberación. Como alternativa, el dispensador puede contener ambos o todos los compuestos juntos, liberándolos para formar una mezcla de vapor.
El dispensador puede adoptar muchas formas diferentes. Puede constituir un material absorbente que retiene y libera el producto químico, por ejemplo, algodón, papel, textiles y matrices poliméricas en forma de tapones o gránulos. Como alternativa, el dispensador puede constituir una membrana o pared impermeable que incluye una pequeña porción de membrana permeable o una o más aberturas pequeñas. El ácido acético y los compuestos de fórmula I están contenidos dentro de la membrana o pared impermeable y entran a la atmósfera a través de la membrana permeable o de pequeñas aberturas.
Ejemplos de dispensadores adecuados se describen en Leonhardt et al. (Insect Pheromone Technology: Chemistry and Applications, ACS Symposium Series 90, 1982).
En los ensayos descritos en los Ejemplos, los compuestos de fórmula I se colocaron dentro de una bolsa de polietileno permeable. El ácido acético se aplicó a una bola de algodón dentro de un vial de polietileno de 5 ml que contenía un orificio de 1 mm. La bolsa y el vial se colocaron en el centro de una trampa adhesiva.
Además de la velocidad a la que se libera la mezcla de vapor, factores tales como la densidad de población de insectos, la distribución por edades de la población, la temperatura y la velocidad del viento pueden influir en la cantidad de insectos atrapados. Por consiguiente, la velocidad de liberación se puede ajustar para tener en cuenta estos factores externos.
La velocidad de liberación de los compuestos se puede ajustar ajustando el dispensador, por ejemplo, al permitir que una mayor superficie quede expuesta a la atmósfera. Factores tales como la temperatura y la velocidad del viento influirán en la velocidad de liberación. La configuración del rango del sistema se puede determinar fácilmente mediante una prueba de campo de respuesta a la dosis.
Siempre que haya una cantidad suficiente de cada uno de ácido acético y el compuesto de fórmula I para contribuir eficazmente a la mezcla de vapores, la cantidad real de cada compuesto presente es menos importante que la velocidad a la que se liberan los compuestos.
Se pueden añadir otros compuestos y materiales a la composición y al sistema divulgados en el presente documento, siempre que no interfieran sustancialmente con la liberación de la mezcla de vapor o sus propiedades atrayentes. Si esto ocurre o no, puede determinarse mediante formatos de prueba estándar que comparen la eficacia de la composición o sistema con y sin el compuesto o material añadido.
El sistema divulgado en el presente documento también puede incluir una feromona sexual o kairomona. La feromona sexual o kairomona puede estar presente en el dispensador o podría liberarse desde otra parte del sistema.
El sistema divulgada en el presente documento incluye un dispositivo de captura. El dispositivo de captura puede ser cualquier dispositivo adecuado que incluye, entre otros, una trampa pegajosa, unitrap, trampa de cubo y similares. El dispositivo de captura puede ser una trampa pegajosa, tal como una trampa Delta.
Los sistemas divulgados en el presente documento son útiles para detectar, explorar, monitorizar y/o controlar insectos lepidópteros. Durante el uso, los sistemas atraen a los insectos, que están atrapados en el componente del dispositivo de captura del sistema, permitiendo su recuento. Los insectos atrapados se pueden eliminar, si todavía están vivos, cuando se verifica el sistema, o el sistema puede incluir un agente letal. En algunos casos, el dispositivo de captura constituirá un agente letal.
Los agentes letales incluyen, pero sin limitación, insecticidas, agua con jabón y similares.
El agente letal puede ser un carbonato, compuesto organofosforado, nitrofenol, nitrometileno, fenilbenzoilurea, piretroide, hidrocarburo clorado o insecticida microbiano. Preferentemente, el agente letal es un insecticida piretroide. Los sistemas divulgados en el presente documento pueden distribuirse ampliamente para detectar la presencia de insectos en un área particular. Las poblaciones de insectos se pueden estudiar aplicando análisis matemáticos a los resultados. Los cambios en las poblaciones a lo largo del tiempo también se pueden monitorizar comparando los resultados con datos anteriores. Si los resultados iniciales lo justifican, se pueden iniciar programas de captura masiva, para controlar las cifras de población.
El medio actual para monitorizar la aparición y los niveles de insectos lepidópteros es mediante el uso de trampas cebadas con feromonas. Sin embargo, esto sólo atrae a los insectos macho. Las composiciones y sistemas divulgados en el presente documento también atraen a insectos lepidópteros hembra, lo que permite el desarrollo de nuevas medidas de seguimiento y control.
Aunque la presente invención es en términos generales como se ha definido anteriormente, los expertos en la técnica apreciarán que la invención no se limita a esto y que la invención también incluye realizaciones de las cuales la siguiente descripción da ejemplos.
6. Ejemplos
6.1. Materiales y métodos
Productos químicos
La pureza química de los patrones utilizados en los experimentos de campo fue la siguiente: ácido acético glacial (99 %), alcohol bencílico (99 %), bencilnitrilo (99 %) y 2-feniletanol (99 %). El ácido acético glacial se almacenó a temperatura ambiente, mientras que todos los demás compuestos se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Todos los productos químicos se adquirieron en Sigma Aldrich (MO, EE. UU.).
Colonia de LBAM
Se estableció y mantuvo una colonia de LBAM en el Centro de Investigación Mt. Albert (Auckland). Los lotes de huevos de E. postvittana se dejaron emerger en el laboratorio. Las plántulas de manzana (var. Royal Gala) se infestaron con aproximadamente 30 larvas de 1er o 2° estadio por plántula y se dejaron durante 24 horas en el laboratorio para permitir que las larvas se asienten. Al hacer contacto con la superficie adaxial de la hoja, las larvas se orientaron hacia una posición en la superficie abaxial donde se entrelazaron a lo largo de la nervadura central y comenzaron a alimentarse del tejido epidérmico. Los signos visibles de alimentación larvaria fueron evidentes después de 24 horas. Se utilizaron plántulas de manzano infestadas y no infestadas para proporcionar perfiles de olores volátiles mediante arrastre de aire y en las pruebas de invernadero. Se sexaron las pupas de la colonia y se permitió que los machos adultos emergieran aislados de las hembras. Se utilizaron adultos emergentes para producir hembras apareadas para el bioensayo en el umbráculo. Se confinó a una hembra y tres machos en un recipiente de plástico durante una noche y se les monitorizó con un sistema de vídeo de lapso de tiempo. Se consideró que hembras y machos se habían apareado cuando se les había observado en cópula durante más de un minuto. Los adultos se mantuvieron a 22 ±2 °C, 18L:6D, se les proporcionó agua y tenían entre 2 y 3 días de edad en el momento de la prueba.
Protocolo experimental de campo para los ensayos con LBAM, ESBM y OBLR
Todos los experimentos de campo dirigidos a LBAM se realizaron en un huerto de manzanos "Red Delicious" (43°38'55.39"S, 172°27'17.57"E) en Canterbury, the South Island, Nueva Zelanda.
Todos estos experimentos dirigidos a ESBM y OBLR se realizaron en una variedad mixta de manzanas o acelgas orgánicas (49o10'43.98°N, 119°45'16.8"W) en Karamus, British Columbia, Canadá, a menos que se indique lo contrario.
En los ensayos con LBAM se utilizaron trampas delta rojas hechas de corflute plástico con una base recubierta de adhesivo (Suckling y Shaw, 1992), mientras que para los ensayos con ESBM y OBLR se usaron trampas delta blanca grandes (Pherocan VI, Aprobar, Adair, OK).
Las trampas fueron cebadas con la composición descrita en el presente documento y se colocaron en 5 hileras, con cinco repeticiones de cada tratamiento en un diseño de bloques al azar. Las trampas se colocaron a 1,7 m del suelo en cada árbol trampa y se separaron 20 m entre sí en cada hilera. Cada tratamiento fue asignado aleatoriamente a un árbol trampa dentro de cada hilera de árboles. Tanto la bolsita de polietileno que contenía el compuesto de fórmula I como el vial de ácido acético se colocaron en el centro de la base pegajosa en los ensayos de LBAm . En los ensayos ESBM y OBLR se fijaron al costado de las trampas usando cinta de velcro. Las bases pegajosas se revisaron y contaron semanalmente durante el período experimental.
Análisis de los datos
La varianza de las capturas medias obtenidas con cada compuesto o cada mezcla de compuestos se estabilizó usando la transformación (x 1) de los recuentos y la importancia de los efectos del tratamiento se probaron usando ANOVA. Se identificaron medias de tratamiento significativamente diferentes utilizando la prueba de diferencia mínima significativa protegida de Fisher (SAS Institute Inc, 1998).
6.2 Ejemplo 1A: Prueba de compuestos individuales como atrayentes para LBAM
Este experimento se llevó a cabo desde el período comprendido entre el 15 de noviembre de 2013 y el 8 de diciembre de 2013 para investigar la actividad biológica de los compuestos orgánicos volátiles individuales. Se probaron alcohol bencílico, bencilnitrilo, indol, 2-fenietanol y (E)-nerolidol dispensando 100 mg de cada compuesto en una bolsa de polietileno permeable con un espesor de pared de 150 μm (45 mm x 50 mm), con un trozo de fieltro (15 mm x 45 mm) insertado. como sustrato portador.
Se fabricó un señuelo de ácido acético colocando un trozo de bola de algodón de 2 cm en un vial de polietileno de 5 ml (JUST Plastics Ltd, Reino Unido) con un orificio de 1 mm perforado en el cable. Se aplicaron 3 ml de ácido acético a la bola de algodón dentro del vial de polietileno. Como control se utilizó una trampa con un señuelo blanco. Se colocaron cinco trampas cebadas con feromona sexual LBAM en las proximidades (>30 m) del ensayo para asegurar la presencia del insecto.
Resultados: Cuando los seis compuestos se probaron individualmente para determinar la atracción del LBAM adulto, el número de machos o hembras de LBAM capturados no fue significativamente diferente de los tratamientos que se sabe que atraen polillas (véase la Figura 1; Tratamiento, F i5,24 = 1,3, P > 0,3 para machos y F i5,24 = 0,67, P > 0,67). Las trampas de feromonas sexuales colocadas en las proximidades del ensayo, capturaron un promedio de 26 machos por trampa, lo que indica la presencia de LBAM en el huerto durante el transcurso del ensayo.
6.3 Ejemplo 1B: Prueba de compuestos individuales como atrayentes para LBAM, ESBM y OBLR
Este experimento se realizó del 28 de noviembre al 12 de diciembre de 2013 para LBAM y del 3 al 10 de junio de 2015 para ESBM y OBLR para investigar la actividad biológica de los compuestos orgánicos volátiles individuales. Los señuelos de alcohol bencílico, bencilnitrilo, indol, 2-fenietanol, (E)-nerolidol y 0,3 ml de ácido acético se realizaron dispensando 10 mg de cada compuesto en un filtro de acetato de celulosa regular Boomerang (7,5 mm de diámetro x 10 mm, Moss Packaging Co. Ltd., Wellington, Nueva Zelanda) dentro de una bolsa de polietileno permeable (espesor de pared de 100 μm, 20 mm x 20 mm, Masterton, Nueva Zelanda) que luego se termoselló. Como control negativo se utilizó una trampa con señuelo sin producto químico.
Resultados: Cuando los seis compuestos se probaron individualmente para determinar la atracción del LBAM adulto, solo bencilnitrilo, alcohol bencílico, 2-feniletanol y ácido acético atrajeron a machos y hembras a las trampas, pero sin diferencias significativas entre los tratamientos (véase la Figura 2 Tratamiento, F3,16 = 0,16, P = 0,92 para machos, F3,16 = 0,37, P = 0,78 para hembras). Ninguna polilla quedó atrapada en trampas ciegas. Para ESBM, sólo el bencilnitrilo y el ácido acético atrajeron a machos y hembras a las trampas sin diferencias significativas entre los tratamientos. (F-ie = 5,6, P = 0,046 para machos y F18 = 0,8, P = 0,40 para hembras, figura 2). Ninguna polilla de ESBM quedó atrapada en trampas ciegas. Para OBLR, sólo las trampas cebadas con 2-feniletanol atrajeron a machos y hembras, sin embargo no hubo diferencias significativas entre los tratamientos y el control en blanco en la atracción de hembras OBLR (£2,12 = 1,16, P = 0,35 para hembras, figura 2).
6.4 Ejemplo 2A: Prueba de mezclas binarias de compuestos como atrayentes para LBAM
Este experimento se realizó entre el 10 de diciembre de 2013 y el 24 de enero de 2014 investigando mezclas binarias de los compuestos probados en el Ejemplo 2. Las cargas de mezclas fueron las siguientes: 1) 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético; 2) 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético; 3) 100 mg de indol y 3ml de ácido acético; 100 mg de 2-fenietanol y 3 ml de ácido acético; y 100 mg de (E)-nerolidol y 3 ml de ácido acético. Se utilizó una trampa con un señuelo blanco como control y se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético para cuantificar el papel del ácido acético. Se colocaron cinco trampas cebadas con feromona sexual en las proximidades del ensayo para garantizar la presencia del insecto.
Resultados: La composición de las mezclas binarias afectó significativamente al número de machos y hembras LBAM capturados (Tratamiento, F420 = 3,8, P < 0,02 para machos y £3,16 = 3,02, P < 0,05 para hembras). La mayor cantidad de polillas adultas fueron capturadas en trampas cebadas con bencilnitrilo/ácido acético (véase la Figura 3). Las trampas de E)-nerolidol/ácido acético y las trampas de blanco no capturaron polillas.
6.5 Ejemplo 2B: Prueba de mezclas binarias de compuestos como atrayentes para LBAM, ESBM y OBLR
Se realizó un segundo experimento de campo entre el 15 de diciembre de 2014 y el 13 de enero de 2015 para LBAM y del 12 al 23 de junio de 2105 para ESBM y OBLR para investigar mezclas binarias de los compuestos más atractivos obtenidos en la primera prueba. Las cargas de los cinco compuestos se prepararon de manera similar al primer experimento de la siguiente manera: 1) 10 mg de alcohol bencílico 0,3 ml de ácido acético; 2) 10 mg de bencilnitrilo y 0,3ml de ácido acético; 3) 10 mg de indol 0,3 ml de ácido acético; 4) 10 mg de 2-feniletanol 0,3 ml de ácido acético; y 5) 10 mg de (E)-nerolidol y 0,3 ml de ácido acético. Se utilizaron como controles una trampa cebada con 0,3 ml de ácido acético solo y un señuelo blanco.
La composición de las mezclas binarias aumentó significativamente el número de machos y hembras LBAM, ESBM y OBLR capturados (LBAM: Tratamiento, £4,20 = 9,2, P < 0,001 para machos y £4,20 = 8,32, P = 0,004 para hembras; ESBM: Tratamiento, £3,16 = 10,4, P < 0,001 para machos y £5,24 = 16,29, P < 0,001 para hembras; 0BlR: Tratamiento, F524 = 19,6, P < 0,001 para machos y £3,16 = 15,33, P < 0,001 para hembras), como se muestra en la Figura 4. El mayor número de polillas adultas LBAM y ESBM fueron capturadas en trampas cebadas con bencilnitrilo ácido acético, mientras que la mayor cantidad de polillas adultas OBLR fueron capturadas en trampas cebadas con 2-feniletanol ácido acético (Figura 4). Para LBAm , las capturas en trampas cebadas con las dos mezclas binarias que incluyen 2-feniletanol ácido acético y alcohol bencílico ácido acético fueron significativamente diferentes de las trampas cebadas solo con ácido acético (Figura 4, P <0,001). Las capturas en trampas cebadas con indol ácido acético no fueron significativamente diferentes de las trampas cebadas solo con ácido acético (Figura 4). Las trampas cebadas con (E)-nerolidol ácido acético no capturaron polillas. Para ESBM, las capturas con las cuatro mezclas binarias, incluidas 2-feniletanol ácido acético, alcohol bencílico ácido acético, indol ácido acético y (E)-nerolidol acético no fueron significativamente diferentes de las trampas cebadas con ácido acético solo (Figura 4). Para OBLR, las capturas en trampas cebadas con la mezcla binaria que contenía bencilnitrilo ácido acético fueron significativamente diferentes de las trampas cebadas solo con ácido acético (Figura 4, P < 0,001). Las capturas de polillas adultas en trampas cebadas con alcohol bencílico ácido acético, indol ácido acético y (E)-nerolidol acético no fueron significativamente diferentes de las trampas cebadas con ácido acético solo (Figura 4, P >0,05).
6.6 Ejemplo 3A: Prueba de varias mezclas de compuestos como atrayentes para LBAM
Este experimento se realizó entre el 27 de enero de 2014 y el 18 de febrero de 2014 investigando las diversas mezclas en función de los resultados obtenidos en el Ejemplo 2. Las cargas de las cinco mezclas volátiles fueron: 1) 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético; 2) 100 mg de 2-feniletanol y 3 ml de ácido acético; 3) 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético; 4) 100 mg de bencilnitrilo, 100 mg de 2-feniletanol y 3 ml de ácido acético; 5) 100 mg de bencilnitrilo, 100 mg de 2-fenilmetanol y 3 ml de ácido acético; 6) 100 mg de 2-feniletanol, 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético; 7) bencilnitrilo, 100 mg de 2-feniletanol, 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético. Se utilizó una trampa con un señuelo en blanco como control negativo mientras que se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético para cuantificar el papel del ácido acético.
Resultados: La composición de las mezclas afectó significativamente al número de LBAM machos y hembras adultos atraídos por la fuente de olor (Tratamiento, F732 = 2,97, P < 0,02 para machos y F732 = 4,36, P < 0,02 para hembras). Las cuatro mezclas que contenían bencilnitrilo (binario, ternario y cuaternario) atrajeron significativamente más polillas adultas que las dos mezclas binarias (2-feniletanol/ácido acético, alcohol bencílico/ácido acético) o la mezcla ternaria (2-feniletanol/alcohol bencílico/ácido acético; véase la Figura 5). Por otro lado, no hubo diferencias significativas entre las cuatro mezclas que contenían bencilnitrilo (Figura 5).
6.7 Ejemplo 3B: Pruebas de varias mezclas de compuestos como atrayentes para LBAM, ESBM y OBLR
Este experimento se realizó entre el 15 y el 28 de enero de 2015 para LBAM y del 26 de junio al 6 de julio de 2105 para ESBM y OBLR. Las cuatro mezclas volátiles fueron: 1) 3,33 mg de bencilnitrilo, 3,33 mg de 2-feniletanol, 3,33 mg de alcohol bencílico 0,3 ml de ácido acético; 2) 10 mg de bencilnitrilo 0,3 ml de ácido acético; 3) 10 mg de 2-feniletanol 0,3 ml de ácido acético; 4) 10 mg de alcohol bencílico 0,3 ml de ácido acético. Como control negativo se utilizó una trampa con señuelo blanco, mientras que las trampas cebadas con la feromona sexual de ESBM (Trece Inc, Adair, OK) se utilizaron como control positivo.
Resultados: La composición de las mezclas afectó significativamente al número de LBAM adultos, machos y hembras, atraídos por las fuentes de olor, como se muestra en la Figura 6 (LBAM: Tratamiento, F316 = 4,3, P = 0,021 para machos y F3,16 = 9,12, P < 0,001 para hembras; ESBM: Tratamiento, F4,20 = 4,5, P = 0,009 para machos y F3,16 = 4,4, P = 0,019 para hembras; OBLR: Tratamiento, F3,16 = 6,5, P = 0,004 para machos y F3,16 = 5,1, P = 0,012 para hembras). Las cuatro mezclas que contenían bencilnitrilo (binario, ternario y cuaternario) atrajeron significativamente más polillas adultas que las dos mezclas binarias (2-feniletanol ácido acético, alcohol bencílico ácido acético) o la mezcla ternaria (2-feniletanol alcohol bencílico ácido acético (Figura 6). Por otro lado, no hubo diferencias significativas entre las cuatro mezclas que contenían bencilnitrilo (Figura 6). Tanto la mezcla cuaternaria como la mezcla binaria que contenía bencilnitrilo ácido acético atrajeron significativamente más machos ESBM que las trampas cebadas con feromona sexual (P < 0,05, figura 6).
6.8 Ejemplo 4: Prueba de mezclas binarias de compuestos como atrayentes para ESBM, OBLR y ETLR
Este experimento se llevó a cabo entre el 11 y el 22 de julio de 2014 en un huerto de manzanas orgánicas de variedades mixtas en Summerland, British Columbia, Canadá. Se utilizaron trampas delta blancas grandes (Trece Inc). Las cargas de mezclas fueron las siguientes: 1) 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético; 2) 100 mg de 2-fenietanol y 3 ml de ácido acético; 3) 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético. Se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético para cuantificar el papel del ácido acético. Como control negativo se utilizó una trampa con un señuelo blanco. Las trampas se cebaron con el compuesto de fórmula I y se colocaron en 5 hileras, con cinco repeticiones de cada tratamiento en un diseño de bloques al azar. Las trampas se colocaron a 1,5 m del suelo en cada árbol trampa y se separaron 20 m entre sí en cada hilera. Cada tratamiento fue asignado aleatoriamente a un árbol trampa dentro de cada hilera de árboles. La bolsita de polietileno y el vial de ácido acético se fijaron al costado de las trampas usando cinta de velcro. Las bases pegajosas se revisaron semanalmente durante el período experimental.
Resultados: La mezcla binaria de bencilnitrilo/ácido acético atrajo significativamente más hembras ESBM que una mezcla binaria de 2-feniletanol/ácido acético o alcohol bencílico/ácido acético (véase la Figura 7). Por otro lado, las mezclas de bencilnitrilo/ácido acético o 2-feniletanol/ácido acético atrajeron significativamente más machos ESBM que alcohol bencílico/ácido acético.
La respuesta de OBLR a las mismas mezclas binarias difirió de la respuesta de ESBM. Las dos mezclas binarias de bencilnitrilo/ácido acético y 2-feniletanol/ácido acético atrajeron significativamente más hembras OBLR que alcohol bencílico/ácido acético. Los machos OBLR respondieron igualmente a las tres mezclas binarias probadas.
Además de ESBM y OBLR, las composiciones también atrajeron ETLR. Las tres mezclas binarias capturaron significativamente más machos y hembras de ETLR que el ácido acético solo (véase la Figura 7).
6.9 Ejemplo 5: Prueba de mezclas binarias y ternarias de compuestos como atrayentes para ESBM y TLLR
Este ensayo se realizó en un huerto de manzanos de variedades mixtas en Summerland, British Columbia, Canadá del 28 de julio al 11 de agosto de 2014, apuntando a ESBM y enrolladores de hojas de tres líneas (TLLR). Se probaron los siguientes tratamientos: 1) 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético; 2) 100 mg de 2-feniletanol y 3 ml de ácido acético; 3) 100 mg de bencilnitrilo, 100 mg de 2-feniletanol y 3 ml de ácido acético. Se utilizó una trampa con un señuelo en blanco como control negativo mientras que se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético para cuantificar la función del ácido acético. Las trampas fueron cebadas con la composición descrita en el presente documento y se colocaron en 5 hileras, con cinco repeticiones de cada tratamiento en un diseño de bloques al azar. Las trampas se colocaron a 1,5-2 m del suelo en cada árbol trampa y se separaron 20-30 m entre sí en cada hilera. Cada tratamiento fue asignado aleatoriamente a un árbol trampa dentro de cada hilera de árboles. Se utilizaron trampas delta blancas (Trece Inc).
Resultados: La adición de 2-feniletanol a una mezcla binaria de bencilnitrilo/ácido acético no dio como resultado un aumento significativo en el número de machos y hembras en ninguna de las especies (véase la Figura 8). Ambas mezclas binarias de bencilnitrilo/acético y 2-feniletanol/ácido acético capturaron un número similar de machos y hembras de TLLR. Por el contrario, las mezclas que contenían bencilnitrilo capturaron más ESBM machos y hembras que las mezclas de 2-feniletanol/ácido acético.
6.10 Ejemplo 6A: Prueba de sinergia entre bencilnitrilo y ácido acético para ESBM y OBLR
Este experimento se llevó a cabo entre el 3 de julio y el 17 de julio de 2014 en un huerto de manzanas orgánicas de variedades mixtas en Summerland, British Columbia, Canadá, utilizó el mismo protocolo experimental que en el Ejemplo 4. El ensayo se centró tanto en ESBM como en OBLR. Se investigó el atractivo relativo de los siguientes tratamientos: 1) 100 mg de bencilnitrilo solo; 2) 3 ml de ácido acético solo; y 3) 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético. Como control negativo se utilizó una trampa con un señuelo blanco.
Resultados: La composición de las mezclas afectó significativamente al número de ESBM OBLR machos y hembras adultos atraídos por la fuente de olor (Tratamiento, f^-ia = 18,64, P <0,001 para ESBM machos; F2,12 = 18,52, P <0,001 para ESBM hembras). El bencilnitrilo por sí solo no resultó atractivo para los adultos ESBM u OBLR (véase la Figura 9). En cambio, el ácido acético solo atrajo significativamente a más machos y hembras que las trampas cebadas solo con bencilnitrilo. Para ESBM, la adición de bencilnitrilo al ácido acético dio como resultado un aumento de 4 y 3 veces en el número de machos y hembras capturados, respectivamente. Para OBLR, la adición de bencilnitrilo al acético dio como resultado un aumento de 2 y 9 veces en el número de machos y hembras capturados, respectivamente.
6.11 Ejemplo 6B: Prueba de sinergia entre bencilnitrilo y ácido acético para ESBM y OBLR
Este experimento se realizó del 21 de junio al 2 de julio de 2015 solo para ESBM y OBLR en un huerto de manzanos de variedades mixtas en Summerland, British Columbia, Canadá (49°34'50.02"N, 119°38'16.57"W). Se investigó el atractivo relativo de los siguientes tratamientos: 1) 10 mg de bencilnitrilo solo; 2) 0,3 ml de ácido acético solo; y 3) 10 mg de bencilnitrilo 0,3 ml de ácido acético. Como control negativo se utilizó una trampa con un señuelo blanco. El protocolo experimental fue similar al Ejemplo 1.
Resultados: En el ensayo para investigar la sinergia entre el bencilnitrilo y el ácido acético, la composición de las mezclas de HIPV afectó significativamente al número de ESBM y OBLR machos y hembras adultos, atraídos por las fuentes de olor, como se muestra en la Figura 10 (ESBM: Tratamiento, F212 = 23,4, P < 0,001 para machos y F212 = 12,49, P = 0,001 para hembras; OBLR: Tratamiento, F2,18 = 6,6, P = 0,007 para machos y F2,18 = 16,7, P < 0,001 para hembras). El bencilnitrilo y el ácido acético atrajeron un número similar de machos y hembras de ambas especies (Figura 10). La adición de bencilnitrilo al acético dio como resultado aumentos significativos en el número de machos y hembras capturados en ambas especies (P <0,05, figura 10). El bencilnitrilo y el ácido acético por sí solos atrajeron un número similar de machos y hembras ESBM u OBLR (Figura 10).
6.12 Ejemplo 7A: Prueba de varias dosis de bencilnitrilo y ácido acético en ESBM
Este experimento se realizó entre el 8 de julio y el 22 de julio de 2014 en un huerto de manzanas orgánicas de variedades mixtas en Summerland, British Columbia, Canadá. Este ensayo se centró en ESBM. Se investigó el atractivo relativo de tres mezclas binarias que contenían una cantidad constante de ácido acético (3 ml) más cantidades variables de bencilnitrilo (1, 10 y 100 mg). Como control negativo se utilizaron trampas cebadas con un señuelo blanco, mientras que para cuantificar el papel del ácido acético se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético. El protocolo experimental fue similar al Ejemplo 4.
Resultados: Variar la cantidad de bencilnitrilo mientras se mantenía una cantidad constante de ácido acético en la mezcla binaria afectó significativamente al número de ESBM machos y hembras capturados (Tratamiento, F316 = 5,1, P < 0,01 para machos y F316 = 13,48, P < 0,001 para hembras). El aumento de la dosis de bencilnitrilo de 1 mg a 10 mg dio como resultado un aumento significativo en el número de machos y hembras capturados (véase la Figura 11). Sin embargo, un aumento adicional de bencilnitrilo de 10 mg a 100 mg no dio como resultado un aumento significativo en el número de machos y hembras. La respuesta de los machos a una mezcla binaria que contenía 1 mg de bencilnitrilo no fue significativa para el ácido acético solo, mientras que esta dosis atrajo significativamente más hembras en comparación con el ácido acético solo.
6.13 Ejemplo 7B: Prueba de varias dosis de bencilnitrilo y ácido acético en LBAM, ESBM y OBLR
Este experimento se realizó entre el 30 de enero y el 16 de febrero de 2014 para LBAM y del 15 al 28 de julio de 2105 para ESBM y OBLR. Se investigó el atractivo relativo de tres dosis de mezclas binarias que contienen (1 0,03; 10+0,3; y 100 mg 3 ml) bencilnitrilo ácido acético. Como control negativo se utilizaron trampas cebadas con un señuelo blanco. El protocolo experimental fue similar al Ejemplo 1.
Resultados: La variación de la cantidad de bencilnitrilo ácido acético en la mezcla binaria afectó significativamente al número de machos y hembras de LBAM y ESBM capturados (LBAM: Tratamiento, F212 = 14,8, P < 0,001 para machos y F2,12 = 12,7, P = 0,001 para hembras; ESBM: Tratamiento, F2,12 = 18,1, P < 0,001 para machos y F2,12 = 10,9, P = 0,002 para hembras). El aumento de la dosis de bencilnitrilo de 1 mg 0,03 ml a 10 mg 0,3 ml no dio como resultado un aumento significativo en el número de machos y hembras capturados (Figura 12). Sin embargo, un aumento adicional de bencilnitrilo ácido acético a 100 mg 3 ml dio como resultado un aumento significativo en el número de machos y hembras ESBM y OBLR capturados en comparación con las dos dosis más bajas (Figura 12).
6.14 Ejemplo 8: Comparación de las propiedades de atracción de las composiciones divulgadas en el presente documento con otros compuestos
Este experimento se llevó a cabo entre el 28 de julio y el 11 de agosto de 2014 en un huerto de manzanas orgánicas de variedades mixtas en Summerland, British Columbia, Canadá. Se utilizaron trampas delta blancas grandes (Trece Inc). Además de los compuestos biológicamente activos de fórmula I - bencilnitrilo, 2-fenietanol y alcohol bencílico, cuatro compuestos estructuralmente relacionados; se analizó la actividad biológica de benzonitrilo, fenilacetaldehído, benzaldehído y fenol (Figura 13). Se probaron las siguientes mezclas binarias: 1) 100 mg de bencilnitrilo 3 ml de ácido acético; 2) 100 mg de benzonitrilo 3 ml de ácido acético; 3) 100 mg de fenilacetaldehído ácido acético; 4) 100 mg de benzaldehído 3 ml de ácido acético; 5) 100 mg de 2-fenietanol 3 ml de ácido acético; 6) 100 mg de alcohol bencílico 3ml de ácido acético; 7) 100 mg de fenol 3 ml de ácido acético. Se utilizaron trampas cebadas con 3 ml de ácido acético para cuantificar el papel del ácido acético mientras que se utilizó una trampa con un señuelo blanco como control negativo. Las trampas fueron cebadas con los compuestos volátiles y colocadas en 5 hileras, con cinco repeticiones de cada tratamiento en un diseño de bloques al azar. Las trampas se colocaron a 1,5 m del suelo en cada árbol trampa y se separaron 20 m entre sí en cada hilera. Cada tratamiento fue asignado aleatoriamente a un árbol trampa dentro de cada hilera de árboles. La bolsita de polietileno y el vial de ácido acético se fijaron al costado de las trampas usando cinta de velcro. Las bases pegajosas se revisaron semanalmente durante el período experimental.
Resultados: El mayor número de machos y hembras de ESBM fueron capturados en trampas cebadas con 100 mg de bencilnitrilo 3 ml de ácido acético. La segunda mezcla más atractiva fue 100 mg-2-feniletanol 3 ml de ácido acético. Las mezclas binarias (100 mg de fenilacetaldehído o 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético) capturaron un número similar de polillas adultas (Figura 13). La captura en trampas cebadas con mezclas binarias que contenían (100 mg de benzonitrilo o benzaldehído o fenol 3 ml de ácido acético) no fue diferente de las trampas cebadas con ácido acético solo (Figura 13).
6.15 Ejemplo 9: Prueba de composiciones binarias de la polilla europea de la vid
Este experimento se realizó entre el 30 de julio de 2013 al 20 de agosto de 2013 en un viñedo (GPS), Verdu, España. Se probó el atractivo relativo de varias mezclas binarias de compuestos de HIPV para depredadores generalistas. Las cargas de mezclas de HIPV fueron las siguientes: 1) 100 mg de bencilnitrilo y 3 ml de ácido acético; 2) 100 mg de indol y 3 ml de ácido acético; 3) 100 mg de (E)-nerolidol y 3 ml de ácido acético; 4) 100 mg de 2-feniletanol y 3 ml de ácido acético; 5) 100 mg de alcohol bencílico y 3 ml de ácido acético. Como control se utilizó una trampa con un señuelo blanco y 3 ml de ácido acético solo.
Resultados: Los resultados se muestran en la Figura 14.
6.16 Ejemplo 10: Otros insectos lepidópteros atraídos por mezclas binarias
En el experimento establecido en el Ejemplo 2B, se contaron insectos distintos de los insectos objetivo LBAM, ESBM y OBLR que fueron capturados en las trampas.
Resultados: Respuesta de otros herbívoros que se alimentan de hojas. En Nueva Zelanda, machos y hembras del enrollador de hojas, Planotortrix octo, así como las polillas enrolladoras de cabeza marrón, Ctenopseustis obliquana y Ctenopseustis herana fueron capturados principalmente en trampas cebadas con bencilnitrilo ácido acético, 2-feniletanol ácido acético y alcohol bencílico ácido acético (Figura 15). En Norteamérica, machos y hembras de otras especies de enrolladores de hojas, incluido el enrollador de tres líneas, Pandemis limtata, la polilla enrolladora de hojas pandemis, Pandemis pyrusana, el enrollador de hojas europeo, Archips rosanus, y la polilla enrolladora de las hojas de árboles frutales, Archips argyrospila, fueron capturados principalmente en trampas cebadas con bencilnitrilo ácido acético y 2-feniletanol ácido acético (Figura 17).
Las polillas del género Pandemis mostró una preferencia hacia 2-feniletanol ácido acético mientras que las polillas del género Archips mostró una preferencia hacia bencilnitrilo ácido acético (Figura 17). El fenómeno de atracción por mezclas binarias de compuestos de fórmula I se encontró también en otras familias de polillas. Por ejemplo, los noctuidos (Noctuidae) pertenecientes al género Graphania y Tmetolophota fueron capturados principalmente en trampas cebadas con bencilnitrilo ácido acético y alcohol bencílico ácido acético (Figura 16). Noctuidos machos y hembras que se alimentan de hojas pertenecientes a los géneros Abagroti, Euxoa y Agrotis fueron capturados principalmente en trampas cebadas con alcohol bencílico ácido acético (Figura 18). Geométridos machos y hembras (Geometridae), Anavitrinella spp. fueron capturados en trampas cebadas con bencilnitrilo ácido acético (Figura 18).
6.17 Ejemplo 11: Mezclas de cinco componentes y restas
Este experimento se llevó a cabo entre el 1 y el 15 de julio de 2015 en orquídeas manzanas en Keremeos, British Columbia.
Los señuelos se prepararon en bolsitas, con ácido acético en un vial de Nalgene (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Los señuelos que contenían bencilnitrilo, bencilisonitrilo, alcohol bencílico y 2-feniletanol se elaboraron dispensando 10 mg de cada compuesto en un filtro de acetato de celulosa regular Boomerang (7,5 mm de diámetro x 10 mm, Moss Packaging Co. Ltd., Wellington, Nueva Zelanda) dentro de una bolsa de polietileno permeable (espesor de pared de 100 μm, 20 mm x 20 mm, Masterton, Nueva Zelanda) que luego se termoselló. Como control negativo se utilizó una trampa con señuelo sin producto químico.
Los cuatro compuestos de fórmula I (bencilnitrilo, bencilisonitrilo, alcohol 2-fenílico y alcohol bencílico se añadieron en proporciones iguales a la mezcla (25 mg cada uno), con 0,3 ml de ácido acético en un vial de Nalgene separado. Los siguientes cuatro tratamientos se obtuvieron restando cada uno de los cuatro compuestos, de modo que solo tres restantes se agregaron a las bolsitas cargadas cada una con 33,3 mg, faltando un compuesto diferente en cada tratamiento, presente con ácido acético como anteriormente. Se utilizó una trampa sin cebo como control negativo
Resultados: Se realizaron capturas importantes de ESBM de ambos sexos (932), OBLR (96) y TTLR (145) a tratamientos con menos ácido acético que anteriormente (Figura 20).
REFERENCIAS
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Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema para detectar, explorar, monitorizar y/o controlar insectos lepidópteros, que comprende:
(a) un dispensador que dispensa una mezcla de vapores de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula I
Figure imgf000014_0001
en donde R se selecciona entre el grupo que comprende -CN y -NC; y
(b) un dispositivo de captura.
2. Un método para atraer insectos lepidópteros a un lugar, comprendiendo el método colocar en el lugar una composición que comprende una mezcla de vapor de ácido acético y uno o más compuestos de fórmula I,
Figure imgf000014_0002
en donde R se selecciona entre el grupo que comprende -CN, -NC, CH2OH y -OH.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la mezcla de vapor comprende ácido acético y uno o más de bencilnitrilo y bencilisonitrilo.
4. Un método para detectar, explorar, monitorizar y/o controlar poblaciones de insectos lepidópteros en un área, que comprende: colocar en el área, un sistema de la reivindicación 1.
5. Un método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en donde el insecto lepidóptero es un insecto de una de las familias seleccionadas entre Tortricidae, Geometridae y Noctuidae.
6. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde el insecto lepidóptero se selecciona entre el grupo que comprende:
(a) la polilla de la manzana de color marrón claro: Epiphyas postvittana (LBAM);
(b) la polilla de las yemas: Spilonota ocellana (ESBM);
(c) el enrollador de hojas de bandas oblicuas: Choristoneura rosaceana (OBLR);
(d) el enrollador pandemis: Pandemis pyrusana (PLR);
(e) el enrollador de hojas europeo: Archips rosanus (ETLR);
(f) el enrollador de hojas de tres líneas: Pandemis limtata (TLLR);
(g) el enrollador de cabeza verde: Planotortrix octo
(h) los enrolladores de cabeza parda: Ctenopseustis obliquana y Ctenopseustis herana;
(i) el enrollador de hojas de árboles frutales: Archips argyrospila;
(j) la polilla europea de la vid: Lobesia botrana;
(k) el gusano del cogollo del abeto oriental: Choristoneura fumiferana; y
(l) gusano del cogollo del abeto occidental: Choristoneura occidentalis.
7. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en donde el insecto lepidóptero es hembra.
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