ES2950137T3

ES2950137T3 - Análogos de hAM15-52 con potencia mejorada frente al receptor de amilina (hAMY3R)

Info

Publication number: ES2950137T3
Application number: ES21782735T
Authority: ES
Inventors: Jens Nielsen; Kristoffer Rigbolt; Esben Bech; Morten Lundh; Paola Magotti; Borja Ballarin-Gonzales; Søren Pedersen; Niels Vrang
Original assignee: Gubra ApS
Current assignee: Gubra ApS
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2023-10-05
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: SI4021929T1; WO2022063925A1; AU2021350396A1; RS64256B1; US20240101634A1; PT4021929T; JP2023544959A; MX2023002182A; CA3189267A1; HRP20230534T1; KR20230073176A; CN116322741A; FI4021929T3; DK4021929T3; IL300620A; PL4021929T3; HUE062560T2; BR112023002525A2; ZA202301635B; DK4021929T5

Abstract

La presente invención se refiere a análogos de hAM15-52 con potencia mejorada del receptor de amilina (hAMY3R) (hAMY3R-EC50 <= 250 pM) y que se basan en gran medida en la secuencia del fragmento de adrenomedulina humana hAM15-52. La invención se refiere además a análogos de hAM15-52 que son agonistas selectivos del receptor de amilina (hAMY3R) (hAMY3R-EC50 <= 250 pM y un hAM1R-EC50 >= 25 nM) y que se basan en gran medida en la secuencia del fragmento de adrenomedulina humana hAM15-52. . Los análogos de hAM15-52 según la invención mantienen la buena estabilidad física de hAM15-52. La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos polipéptidos y su uso en el tratamiento de una afección médica tal como obesidad, EHNA y/o diabetes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Análogos de hAM_15-52con potencia mejorada frente al receptor de amilina (hAMY3R)

Campo de la invención

La presente invención se refiere a análogos de hAM_15-52con potencia mejorada frente al receptor de amilina (hAMY3R) (hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM) y que se basan en gran medida en la secuencia del fragmento de adrenomedulina humana hAM_15-52. La invención se refiere además a análogos de hAM_15-52que son agonistas selectivos del receptor de amilina (hAMY3R) (hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM y hAM1R-CE₅₀≥ 25 nM). En particular, la presente invención se basa en la observación de que el fragmento de adrenomedulina humana hAM_15-52puede convertirse en agonistas de receptores de amilina altamente selectivos (hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM y hAM1 R-CE⁵⁰s 25 nM) reemplazando el aminoácido en la posición X¹¹en hAM_15-52junto con uno o más de los aminoácidos en las posiciones X⁴, X³⁷y/o X³⁸en hAM_15-52. Por lo tanto, el reemplazo de al menos dos aminoácidos en hAM_15-52da como resultado análogos de hAM_15-52con potencias frente a AMY3R y AM1R comparables a hAMY^1-37(amilina). La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos análogos de hAM_15-52y a su uso médico en el tratamiento de una afección médica, tal como obesidad y/o diabetes.

Antecedentes de la invención

La obesidad es una afección médica en la que el exceso de grasa corporal se acumula hasta el punto de tener un impacto negativo en la salud. Está afectando a un gran número de personas en todo el mundo y está aumentando rápidamente en ciertas partes del mundo. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estimó que, en 2016, aproximadamente 650 millones de personas eran obesas en todo el mundo. La obesidad se define como un índice de masa corporal (IMC) superior a 30. La obesidad se considera un factor de riesgo importante para desarrollar una variedad de afecciones médicas, tales como enfermedades cardiovasculares (p. ej., hipertensión, aterosclerosis, ataques cardíacos o accidentes cerebrovasculares), NASH, trastornos musculoesqueléticos, ciertos tipos de cáncer, depresión y diabetes tipo II, y por lo tanto es perjudicial para la salud humana. Las enfermedades cardiovasculares y la diabetes son dos enfermedades principales asociadas con la obesidad. Se ha realizado una gran cantidad de investigación en el campo de la obesidad en la búsqueda de nuevos tratamientos para la obesidad o enfermedades y trastornos relacionados con la obesidad.

La diabetes es un grupo de trastornos metabólicos caracterizados por un alto nivel de azúcar en la sangre. A partir de 2019, la Federación Internacional de Diabetes estimó que 463 millones de personas padecen de diabetes en todo el mundo, estando diagnosticados aproximadamente la mitad de los individuos . La diabetes se divide en dos tipos, a saber, diabetes tipo I y diabetes tipo II. La diabetes tipo I es el resultado de la incapacidad del páncreas para producir suficiente insulina debido a la pérdida de células beta provocada por una respuesta autoinmune. Por otro lado, la diabetes tipo II es una afección que comienza con la resistencia a la insulina en la que las células no responden a la insulina adecuadamente y, a medida que avanza la enfermedad, también puede dar lugar a una falta de insulina.

La amilina humana (hAMY^1-37o amilina) es una hormona peptídica de 37 residuos que se secreta conjuntamente con la insulina de las células p pancreáticas con la secuencia de aminoácidos Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr con un puente disulfuro entre los residuos 2 y 7. La amilina suprime la liberación de glucagón e inhibe el vaciado gástrico y, por lo tanto, desempeña un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa al disminuir la concentración de azúcar en la sangre. Por lo tanto, la amilina es un candidato potencial para el tratamiento de la diabetes. Además, se ha mostrado que la amilina reduce la ingesta de alimentos y juega un papel importante en la saciedad, lo que también la convierte en una candidata potencial para tratar la obesidad. Sin embargo, la amilina posee algunos inconvenientes tales como una alta tendencia a la fibrilación, una semivida in vivo corta e inestabilidad química a pH 7. Por tanto, la amilina nativa es subóptima para su uso como ingrediente farmacéuticamente activo.

En la técnica anterior, se conoce un gran número de derivados de amilina, tales como aquellos divulgados en WO2016/146739. Estos análogos de amilina intentan resolver algunos de los inconvenientes conocidos que posee la amilina humana. Un ejemplo exitoso es el análogo de amilina Pramlintida, que ha sido aprobado por la FDA para su uso en diabetes tipo I y tipo II. Sin embargo, la Pramlintida se formula a pH 4 ya que fibrila a pH 7. Por lo tanto, todavía existe la necesidad de nuevos análogos de amilina con mayor estabilidad química, mayor estabilidad metabólica y/o menor tendencia a la fibrilación. En particular, son deseables los análogos de amilina que sean estables en un intervalo de pH más amplio. Además, existe la necesidad de nuevos análogos de amilina con mayor eficacia mediante, p. ej., mayor potencia, mayor eficacia y/o semividas más largas para permitir una dosificación menos frecuente y un mayor cumplimiento del paciente. La presente invención pretende resolver uno o más de los problemas conocidos de la técnica anterior mediante la aplicación de una nueva estrategia química.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, la presente divulgación se refiere a análogos de hAM_15-52con potencia mejorada frente al receptor de amilina (hAMY3R) (hAMY3R-CE⁵⁰á 250 pM). Por lo tanto, en un primer aspecto, la divulgación se refiere a análogos de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos que comprenden 38 aminoácidos (X¹-X³⁸), en donde el aminoácido en la posición X¹¹se selecciona de R, W o Cit y en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos un 50% de identidad con hAM ^{i 5-52}(SEQ ID NO: 1), tal como al menos un 60 % de identidad con hAM^{i 5-52}(SEQ ID NO: 1). Los inventores encontraron sorprendentemente que la posición del aminoácido X¹¹era muy importante para aumentar la potencia frente al receptor de amilina de hAM_15-52. Por lo tanto, una única sustitución en X¹¹de K a R, W o Cit fue suficiente para mejorar significativamente la potencia frente al receptor de amilina (hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM) de hAM _15-52mientras se conservaba la potencia frente a adrenomedulina (hAM1 R).

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona análogos selectivos de hAM_15-52(hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM y un hAM1 R-CE⁵⁰> 25 nM), que actúan como agonistas sobre el receptor de amilina hAMY3R pero que, a diferencia de la técnica anterior (p. ej., WO2016/146739), se derivan del esqueleto del fragmento de adrenomedulina hAM_15-52. Los inventores encontraron sorprendentemente que cada una de las posiciones X⁴, X³⁷y X³⁸eran muy importantes para la potencia sobre hAM1 R de hAM_15-52y que la potencia sobre hAM1 R de hAM_15-52podía abolirse o reducirse (hAM1 R-CE⁵⁰> 25 nM) por ciertas sustituciones de aminoácidos en cualquiera de las posiciones X⁴, X³⁷y/o X³⁸. Así, en un segundo aspecto, la invención se refiere a análogos de hAM_15-52que comprenden 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el aminoácido en la posición X¹¹se selecciona de R, W o Cit y en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1), tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) y además en donde X⁴se selecciona como F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona como G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K, con la condición de que en al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no esté el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición. Los inventores encontraron sorprendentemente que el fragmento de adrenomedulina humana hAM_15-52se puede convertir en agonistas altamente selectivos del receptor de amilina (valor de hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM y un hAM1 R-CE⁵⁰> 25 nM) reemplazando el aminoácido en la posición X¹¹en hAM_15-52junto con uno o más de los aminoácidos en las posiciones X⁴, X³⁷y/o X³⁸en hAM_15-52. Por lo tanto, el reemplazo de al menos dos aminoácidos en hAM_15-52dio como resultado análogos de hAM_15-52con potencias sobre hAMY3R y hAM1R comparables a la amilina en lugar de hAM_15-52. Un beneficio de este enfoque es que, a diferencia de la amilina humana, hAM_15-52no es propenso a la fibrilación y, mediante el uso de esta nueva estrategia química, los inventores previeron además que las buenas propiedades de fibrilación de hAM_15-52podrían mantenerse en los nuevos análogos de hAM_15-52. Por lo tanto, los análogos de hAM_15-52según con la invención comprenden una parte significativa del esqueleto presente en hAM_15-52como una parte importante de la secuencia (es decir, al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1)). Así, en el segundo aspecto de la invención, el primer problema resuelto es la provisión de nuevos agonistas potentes de hAMY3R con alta selectividad sobre hAM1 R, que se obtienen modificando la polifarmacología del fragmento hAM_15-52en agonismo de hAMY3R. El segundo problema resuelto por el segundo aspecto es la provisión de nuevos agonistas de hAMY3R que son menos propensos a la fibrilación, superando así un problema inherente a la amilina humana. A diferencia de los derivados de amilina conocidos de la técnica anterior, los análogos de hAM_15-52de la presente invención poseen una secuencia estructuralmente distinta que pertenece al fragmento hAM_15-52. Por lo tanto, los análogos de hAM_15-52de la invención poseen diferentes propiedades físico-químicas en comparación con los derivados de amilina en la técnica anterior, tales como diferente solubilidad, estabilidad química, física y/o metabólica.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a análogos de hAM_15-52según el segundo aspecto para su uso como un medicamento. Más particularmente, el tercer aspecto de la invención se refiere a los análogos de hAM_15-52según el segundo aspecto para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones, tales como, pero no limitados a, la ingesta excesiva de alimentos, exceso de peso corporal, obesidad, trastorno por atracones, síndrome de Prader-Willi, dislipidemia, enfermedades/trastornos metabólicos, diabetes tipo I o II, tolerancia alterada a la glucosa, síndrome de resistencia a la insulina y/o NASH.

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los análogos de hAM_15-52según el segundo aspecto y su(s) uso(s) médico(s) para tratar, prevenir o mejorar una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones según el tercer aspecto. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un portador (vehículo) y/o uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

La invención se explicará ahora con más detalle a partir del alineamiento de la amilina (hAMY^1-37) y el fragmento de adrenomedulina (hAM_15-52) como se muestra en la Tabla 1 a continuación.

Definiciones

En el presente contexto, cuando la divulgación se refiere a posiciones de aminoácidos en los análogos de hAM_15-52(es decir, X¹-X³⁸) que se derivan/seleccionan de hAMY^1-37o se retienen/seleccionan del fragmento hAM_15-52, se aplica el siguiente alineamiento mostrado en la Tabla 1. Así, la posición X¹en los análogos de hAM_15-52según la invención corresponde al primer aminoácido en la amilina humana (hAMY^1-37) y al aminoácido número 15 (hAM¹⁵) en el fragmento hAM_15-52.

hAMYi-37 K C N T A T C A T Q R L A N F L V H S S N N F - G A I L S S T N V G S N T Y

Tabla 1

Según la presente invención, los análogos de hAM^{i 5-52}generalmente están amidados en el extremo C (-CONH²), como los péptidos nativos; la amilina y la adrenomedulina. Sin embargo, los análogos de hAM_15-52de la presente invención también pueden tener un ácido carboxílico libre (-COOH) u otra modificación postraduccional tal como un éster metílico (-COOMe). En una realización altamente preferida de la invención, los análogos de hAM_15-52están amidados en el extremo C. Los análogos de hAM_15-52según la presente invención pueden tener una amina libre (-NH²), estar N-acilados (-NHCOR), N-metilados (-NHCH³o -N(CH³)²) o desaminados en el extremo N. Los análogos de hAM_15-52también pueden estar lipidados, p. ej., en el extremo N como se ejemplifica en la presente memoria, dependiendo de la semivida deseada de los polipéptidos.

Según la presente invención, la lipidación tiene el significado habitual en la técnica. Por lo tanto, la lipidación en el presente contexto se refiere a la unión covalente de un lípido opcionalmente a través de un enlazador a los análogos de hAM _15-52de la invención. La lipidación se realiza típicamente para mejorar el perfil farmacocinético de un polipéptido, p. ej., mejorando la estabilidad metabólica, reduciendo la degradación enzimática, disminuyendo la excreción y el metabolismo, todo lo cual da lugar a una semivida in vivo prolongada (t^1/2) de los análogos de hAM_15-52. Los análogos de hAM _15-52según la invención, pueden estar lipidados o no lipidados. Los análogos de hAM_15-52lipidados ejemplificados en la presente memoria están lipidados con un diácido C²⁰saturado a través de varios enlazadores como se muestra en la tabla 2. Según la presente invención, las abreviaturas Hyp, Cit, Aib, Aad, (NMe)G/Sar, (NMe)I tienen el significado habitual en la técnica. Así, Hyp se refiere a L-hidroxiprolina, Cit se refiere a L-citrulina, Aib se refiere a ácido 2-aminoisobutírico, Aad se refiere a ácido L-homoglutámico, (NMe)G se refiere a N-metilglicina también conocida como Sar o sarcosina y (NMe)I se refiere a N-metil-L-isoleucina.

Según la presente invención, los valores de CE⁵⁰se usan como una medida de la potencia agonista en un receptor dado. Un valor de CE⁵⁰es una medida de la concentración de un compuesto requerida para lograr la mitad de la actividad máxima de ese compuesto en un ensayo particular. Por lo tanto, se considera que un análogo de hAM_15-52según la invención que tiene un hAMY3R-CE⁵⁰menor que el hAMY3R-CE⁵⁰de hAM_15-52en el ensayo dado tiene mayor potencia o actividad en el receptor hAMY3R que el fragmento de adrenomedulina hAM_15-52. Asimismo, un análogo de hAM_15-52según la invención que tiene un hAM1R-CE⁵⁰mayor que el hAM1R-CE⁵⁰de hAM_15-52, en el ensayo dado puede considerarse que tiene menor potencia o actividad en el receptor hAM1R que el fragmento de adrenomedulina hAM_15-52.

Según la presente invención, un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo puede estar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Por lo tanto, se pretende que las sales farmacéuticamente aceptables incluyan cualquier sal que se use comúnmente en formulaciones de péptidos. Dichas sales incluyen tanto sales de adición de ácidos como sales básicas, y se pueden encontrar ejemplos, p. ej., en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17a edición. Asimismo, varios solvatos de los análogos de hAM_15-52o sales farmacéuticamente aceptables d los mismos también están dentro del alcance de la invención.

Según la presente invención, los análogos de hAM_15-52son cadenas cortas de aminoácidos que se han unido mediante enlaces amida. En la realización más preferida de la invención, los análogos de hAM_15-52tienen una longitud de 38 aminoácidos, sin incluir ningunos de los aminoácidos que funciona como espaciador entre un lípido opcional y los polipéptidos híbridos.

En el presente contexto, a no ser que se indique lo contrario, los aminoácidos son todos L-aminoácidos (L-estereoisómero, aminoácidos naturales). Así, la configuración absoluta de los aminoácidos es la configuración (S) con la excepción de L-cisteína y L-selenocisteína que tienen la configuración (R).

En el presente contexto, debe entenderse que los aminoácidos Cys (X²) y Cys (X⁷) en los análogos de hAM_15-52están unidos covalentemente por un puente, preferiblemente un puente disulfuro (-S-S-) tal como el presente en hAMY^1-37y hAM _15-52. La ciclación del puente disulfuro se puede realizar después de la purificación de los polipéptidos híbridos o antes de la escisión de la resina en la síntesis peptídica en fase sólida, opcionalmente en presencia de grupos protectores adecuados. El puente disulfuro puede formarse espontáneamente agitando el polipéptido híbrido en presencia de oxígeno o puede formarse tratando los polipéptidos híbridos con otro oxidante adecuado tal como yodo (I²), opcionalmente en presencia de una base.

En el presente contexto, los análogos de hAM_15-52o derivados de los mismos según el primer o segundo aspecto tienen una potencia frente a hAMY3R (CE⁵⁰) ≤ 250 pM, tal como ≤ 200 pM, preferiblemente hAMY3R-CE⁵⁰≤ 150 pM, tal como ≤ 125 pM, más preferiblemente un hAMY3R-CE⁵⁰≤ 100 pM, tal como ≤ 75 pM, aún más preferiblemente un hAMY3R-CE⁵⁰≤ 50 pM, tal como ≤ 25 pM, más preferiblemente un hAMY3R-CE⁵⁰≤ 15 pM, tal como ≤ 10 pM. Por tanto, los análogos de hAM_15-52más potentes sobre hAMY3R pueden ser más o menos equipotentes con la amilina humana nativa hAMY^1-37. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 3-44 tienen un hAMY3R-CE⁵⁰entre 6,0-10 pM y por lo tanto son más o equipotentes en comparación con hAMY^1-37(hAMY3R-CE⁵⁰= 10 pM) cuando se mide bajo las mismas condiciones de ensayo.

En el presente contexto, los análogos de hAM_15-52o derivados de los mismos según el segundo aspecto tienen una CE⁵⁰suprimida o reducida cuando el valor de CE⁵⁰en hAM1R > 25 nM, tal como el valor de CE⁵⁰en hAM1 R > 50 nM, tal como un hAM1R-CE⁵⁰> 100 nM, preferiblemente un hAM1R-CE⁵⁰> 150 nM, tal como > 200 nM, más preferiblemente hAM1 R-CE⁵⁰> 250 nM, tal como > 300 nM, aún más preferiblemente un hAM1 R-CE⁵⁰> 350 nM, tal como > 400 nM, aún más preferiblemente un hAM1 R-CE⁵⁰> 450 nM, tal como > 500 nM, aún más preferiblemente un hAM1R-CE50 > 600 nM, tal como > 700 nM, aún más preferiblemente un hAM1 R-CE⁵⁰> 800 nM, tal como > 900 nM, aún más preferiblemente un hAM1R-CE50 > 1.000 nM, lo más preferiblemente un hAM1R-CE50 > 5.000 nM. Por lo tanto, en el presente contexto, selectivamente en términos de potencia hacia el receptor de amilina hAMY3R sobre el receptor de adrenomedulina hAM1R (es decir, un agonista selectivo del receptor de amilina) debe entenderse como un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según el segundo aspecto que tiene un valor de hAMY3R-CE50 á 250 pM y un hAM1 R-CE⁵⁰> 25 nM. Por lo tanto, un análogo de hAM_15-52selectivo o un derivado del mismo tiene una relación de selectividad (hAM1R CE5ü/hAMY3R CE⁵⁰) de al menos 100. Preferiblemente, los análogos de hAM_15-52o derivados de los mismos tienen un valor de hAMY3R-CE50 á 250 pM y un hAM1 R -CE⁵⁰> 50 nM y, por lo tanto, una relación de selectividad (hAM1 R CE50/hAMY3R CE⁵⁰) > 200. Más preferiblemente, los análogos de hAM_15-52o derivados de los mismos tienen un hAMY3R-CE50 á 200 pM, un hAM1 R-CE⁵⁰> 100 nM y, por lo tanto, una relación de selectividad (hAM1R CE50/hAMY3R CE⁵⁰) > 500. Más preferiblemente, un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo tiene un hAMY3R-CE50 á 125 pM, un hAM1 R-CE⁵⁰> 200 nM y por lo tanto una relación de selectividad (hAM1 R CE50/hAMY3R CE⁵⁰) > 1.600. Aún más preferiblemente, el análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo tiene un hAMY3R-CE50 á 100 pM, un hAM1 R-CE⁵⁰> 500 nM y, por lo tanto, una relación de selectividad (hAM1 R CE50/hAMY3R CE⁵⁰) > 5.000. Lo más preferiblemente, el análogo hAM_15-52o un derivado del mismo tiene un hAMY3R-CE50 á 50 pM, un hAM1 R-CE⁵⁰> 1.000 nM y, por lo tanto, una relación de selectividad (hAM1 R CE50/hAMY3R CE⁵⁰) > 20.000. Por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 3-42 tiene una relación de selectividad de al menos 6.000 y la mayoría de ellas mucho mayor.

Un experto en la técnica sabe muy bien que los valores de CE⁵⁰dependen del tipo de ensayo y de las condiciones del ensayo. Así, en el presente contexto, cuando la divulgación se refiere a un valor de CE⁵⁰, debe entenderse como un valor de CE⁵⁰obtenido cuando se mide según el procedimiento descrito en los ejemplos bajo protocolos generales para ensayos de AMPc para medir la activación del receptor in vitro. Sin embargo, la variación también puede estar presente dentro del mismo ensayo bajo condiciones de ensayo aparentemente idénticas debido a la variación en, p. ej., la expresión del receptor en las células (es decir, densidad del receptor). Por lo tanto, con el fin de comparar los valores de CE⁵⁰, se han ensayado hAMY1-37 (SEQ ID NO: 2) y hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) como estándares internos para comparar entre diferentes operaciones de ensayos o incluso diferentes ensayos. Se determinó hAMY3R-CE50 y hAM1R-CE50 de hAMY1-37 (SEQ ID NO: 2) a 10 pM y 5.000 nM, respectivamente, usando las mismas condiciones de ensayo y línea celular que los análogos de hAM_15-52(SEQ ID NO: 3-392). Asimismo, se determinó hAMY3R-CE50 y hAM1R-CE50 de hAM _15-52(SEQ ID NO: 1) a 1,3 nM y 1,1 nM, respectivamente, usando las mismas condiciones de ensayo y línea celular que los análogos de hAM_15-52(SEQ ID NO: 3-392). Por lo tanto, se deduce que los análogos de hAM _15-52o derivados del mismo según el primer o segundo aspecto tienen una relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAMY1-37-hAMY3R-CE50) á (250 pM)/(10 pM) á 25. Preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE⁵⁰(hAMY3R-CE50)/(hAMY1-37-hAMY3R-CE50) á 20. Más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM1-37-hAMY3R-CE50) á 12,5. Aún más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAMY1-37-hAMY3R-CE50) á 10. Aún más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAMY1-37-hAMY3R-CE50) á 5. Aún más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAMY1-37-hAMY3R-CE50) á 2. Lo más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/( hAMY1 -³⁷-AMY³R-CE⁵⁰) á 1 de manera que los análogos de hAM_15-52o derivados de los mismos son equipotentes o más potentes que hAMY1-37. Asimismo, los análogos selectivos de hAM_15-52o derivados de los mismos según el segundo aspecto tienen una relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM_15-52-AMY3R-CE50) á (250 pM)/(1.300 pM) á 0,19 y una relación relativa de hAM1R-CE50 (hAM1 R-CE50)/(hAM_15-52-hAM1 R-CE⁵⁰) > (25 nM)/(1,1 nM) > 22,7. Preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM_15-52-hAMY3R-CE50) á (250 pM)/(1.300 pM) á 0,19 y una relación relativa hAM1R-CE50 (hAM1R-CE50)/(hAM15 -52-hAM1R-CE50) > (50 nM)/(1,1 nM) > 45,5. Más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM_15-52-hAMY3R-CE50) á 0,15 y una relación relativa hAM1R-CE50 (hAM1R-CE50)/(hAM_15-52-hAM1R-CE50) > 76,9. Aún más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM_15-52-hAMY3R-CE50) á 0,096 y una relación relativa hAM1R-CE50 (hAM1 R-CE50)/(hAM_15-52-hAM1 R-CE⁵⁰) > 154. Aún más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM_15-52-hAMY3R-CE50) á 0,077 y una relación relativa hAM1R-CE50 (hAM1R-CE50)/(hAM_15-52-hAM1 R-CE⁵⁰) > 384. Aún más preferiblemente, la relación relativa hAMY3R-CE50 (hAMY3R-CE50)/(hAM_15-52-AMY3R-CE50) á 0,038 y una relación relativa hAM1R-CE50 (hAM1R-CE50)/(hAM_15-52-hAM1R-CE50) > 769. Más preferiblemente, la relación relativa hAM1 R-CE⁵⁰(hAM1 R-CE50)/(hAM_15-52-hAM1 R-CE⁵⁰) > 2.000.

Según la presente invención, el término "tratamiento" debe entenderse en el sentido más amplio como prevención, mejora o tratamiento. Por lo tanto, también se pretende que el tratamiento incluya tratamiento profiláctico.

Según la presente invención, del aspecto o aspectos/realización o realizaciones que se refieren a “en donde el análogo de hAMi5-52 tiene (p. ej.) al menos un 50 % de identidad con hAMi5-52 (SEQ ID NO: 1)" o “un derivado del mismo con (p. ej.) al menos un 50 % de identidad con hAMis^-52’, debe entenderse que el análogo de hAM_15-52o derivado del mismo tiene al menos un 50 % de identidad de secuencia con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) cuando se alinea. Como ejemplo, la SEQ ID NO: 169 que se ilustra a continuación difiere en dos aminoácidos (X¹¹y X³⁸) de hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) y, por lo tanto, tiene (38-2)/38 = 94,7 % de identidad de secuencia con hAM_15-52(^sC^eID No: 1).

SEQ ID NO:1 G C R F G T C T V Q K L A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Y

Derivado X: G C R F G T C T V Q R L A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Hyp Descripción detallada de la invención

La familia de péptidos de calcitonina

La familia de péptidos de la calcitonina consiste en los péptidos hormonales calcitonina (CT), el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), el polipéptido amiloide de los islotes (IAPP, amilina o hAMY^1-37) y la adrenomedulina (hAM), así como sus precursores. hAMY^1-37es una hormona peptídica de 37 residuos que se coexcreta con insulina de las células p pancreáticas con la secuencia de aminoácidos Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr. La amilina suprime la liberación de glucagón e inhibe el vaciamiento gástrico y, por lo tanto, juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa al disminuir la concentración de azúcar en la sangre. Además, se ha mostrado que la amilina reduce la ingesta de alimentos y desempeña un papel importante en la saciedad, lo que la convierte en una candidata potencial para tratar, p. ej., la obesidad y/o la diabetes. hAM es una hormona peptídica de 52 residuos expresada en todos los tejidos con la secuencia de aminoácidos Tyr-Arg-Gln-Ser-Met-Asn-Asn-Phe-Gln-Gly-Leu-Arg-Ser-Phe-Gly-Cys-Arg-Phe-Gly-Thr-Cys-Thr-Val-Gln-Lys-Leu-Ala-His-Gln-Ile-Tyr-Gln-Phe-Thr-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asn-Val-Ala-Pro-Arg-Ser-Lys-Ile-Ser-Pro-Gln-Gly-Tyr. Es un potente vasodilatador y ha mostrado influencia positiva en enfermedades cardiovasculares, tales como infarto de miocardio, isquemia de extremidades e hipertensión.

La actividad biológica de la familia de proteínas de la calcitonina generalmente está mediada por la unión al receptor de calcitonina (CTR) y al receptor similar al receptor de calcitonina (CRLR), ambos pertenecientes a la familia 2 de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR). Estos receptores pueden coexpresarse en combinación con diferentes proteínas modificadoras de receptores (RAMP1-3) generando receptores funcionales para los péptidos individuales en la familia de proteínas de la calcitonina. La coexpresión de CTR con RAMP1 conduce a la formación de un receptor para amilina y CGRP (AMY1R), la coexpresión de CTR con RAMP2 conduce al receptor de amilina 2 (AMY2R) y la coexpresión de CTR con RAMP3 conduce al receptor de amilina (AMY3R). La coexpresión de CRLR con RAMP1 conduce a la formación de un receptor para CGRP (CGRP1R), la coexpresión de CRLR con RAMP2 conduce a la formación de un receptor para adrenomedulina (AM1R) y la coexpresión de CRLR con RAMP3 conduce a una formación de un receptor para adrenomedulina y CGRP (AM2R).

Varios de los péptidos nativos de la familia de proteínas de la calcitonina muestran un solapamiento considerable en la farmacología entre los receptores. Por ejemplo, la adrenomedulina es aproximadamente 100 veces menos potente en AMY3R en comparación con hAMY^1-37. El fragmento de adrenomedulina (hAM_15-52) es casi equipotente en AMY3R y AM1R con una CE⁵⁰de 1,3 nM en AMY3R y un valor de CE⁵⁰de 1,1 nM en AM1R (dicho valor de CE⁵⁰se mide según los ejemplos de la presente memoria). hAMY^1-37, por otro lado, tiene un valor CE⁵⁰de 10 pM. en AMY3R mientras es inactivo en AM1R.

Determinación de posiciones de aminoácidos importantes en hAMis^-52

Los inventores plantearon inicialmente la hipótesis de que, dado que hAM_15-52y hAMY^1-37pertenecen a la misma familia de hormonas, la familia Calcitonina/CGRP/IAPP, la potencia en AMY3R de hAM_15-52podría mejorarse o incluso convertirse en agonismo selectivo de AMY3R sobre agonismo de hAM1 R sustituyendo ciertos aminoácidos en hAM^15-52con aminoácidos derivados de la hAMY^1-37, superando así algunos de los inconvenientes que son inherentes a hAMY^{1 -37}. Todos los 37 aminoácidos de hAMY^1-37se sustituyeron sistemáticamente en la hAM_15-52. Además, se seleccionó X³⁸como Hyp (Hidroxiprolina), que no está presente en hAMY^1-37ni en hAM_15-52. Los inventores construyeron modelos de bosque aleatorio (Breiman, L. (2001), Random Forests, Machine Learning 45(1), 5-32.) que describen la relación entre la secuencia de péptidos y hAMY3R y la potencia sobre hAM1R, respectivamente, y sintetizaron y cribaron sistemáticamente secuencias peptídicas. Para cada análogo de hAM_15-52, el aminoácido en cada posición de la secuencia se usó como característica, y los valores de CE⁵⁰del receptor se usaron como respuesta para construir los modelos. Se utilizó el paquete “randomForest” implementado en el lenguaje de programación estadística R para calcular la importancia de cada posición y se identificaron las posiciones más importantes como críticas para la actividad de hAMY3R y/o hAM1R (A. Liaw y M. Wiener (2002). Clasification and Reggression por randomForest. R News 2(3), 18-22.). Basándose en este análisis sistemático, los inventores identificaron que X⁴, X³⁷y X³⁸eran importantes para la actividad de hAM1R, mientras que tenían menos importancia para la actividad de hAMY3R. Los inventores identificaron que X¹¹es crítico para la actividad de hAMY3R, mientras que tiene menos importancia para la actividad de hAM1 R. Finalmente, los inventores identificaron que X¹⁷tiene cierta importancia para la actividad de hAMY3R, mientras que tiene menos importancia para la actividad de hAM1R. Por lo tanto, los inventores identificaron X¹¹como una posición clave para mejorar la potencia sobre hAMY3R en hAM_15-52y X⁴, X³⁷y X³⁸como posiciones clave para eliminar la potencia sobre hAM1 R en hAM_15-52. Dado que X¹⁷solo tenía cierta importancia para la actividad de hAMY3R, esta posición no se consideró una posición clave sino solo una posición preferida para mejorar aún más la potencia sobre AMY3R de los análogos de hAM_15-52.

La investigación sistemática mostró que la potencia sobre hAMY3R de hAM_15-52podría mejorarse sustituyendo el aminoácido K presente en hAM_15-52en la posición X¹¹con el aminoácido R presente en hAMY^1-37. Además, la investigación sistemática mostró que la potencia sobre hAM1R de hAM_15-52podría disminuir sustituyendo los aminoácidos presentes en la posición X⁴, X³⁷y X³⁸en hAM_15-52con los aminoácidos correspondientes que se encuentran presentes en hAMY^1-37.

Investigación más profunda de los aminoácidos en la posición X⁴, X ¹¹, X ¹⁷, X³⁷y X³⁸.

Los inventores sustituyeron sistemáticamente los aminoácidos representativos que cubrían los aminoácidos representativos para todos los aminoácidos conocidos en las 5 posiciones identificadas, una posición cada vez (Tabla 6). Como se muestra en el ejemplo 1, todas (las SEQ ID: 1-360 habían perdido su actividad en el hAM1R, con un grado variable de potencia en AMY3R. Con el fin de calificar los aminoácidos individuales en las 5 posiciones, el valor de CE⁵⁰promedio para los péptidos que contenían un aminoácido dado en una posición dada se comparó con el valor promedio de CE⁵⁰de los análogos de hAM_15-52que contenían el aminoácido de referencia en esa posición. Dado un punto de corte de cambios de potencia de 4 veces, cada aminoácido en cada posición se calificó como dando una potencia aumentada (I), disminuida (D) o sin cambios (U), en relación con el aminoácido de referencia, en hAMY3R. Los resultados se resumen en la Tabla 6. A partir de estos datos, se mostró que cualquiera de los aminoácidos R, W o Cit eran capaces de mantener la potencia sobre AMY3R cuando estaban presentes en la posición X¹¹en comparación con la referencia, mientras que otros aminoácidos representativos disminuyeron la potencia. Se mostró además que cualquiera de los aminoácidos Y, W, T, M, I, F, A o C en X⁴, cualquiera de los aminoácidos Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K en X³⁷y cualquiera de los aminoácidos Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K en X³⁸eran capaces de mantener o mejorar la potencia sobre AMY3R. mientras que permanecen inactivos en hAM1 R.

Aspecto 1: análogos de hAMw^-52con potencia de amilina mejorada

Así, en un primer aspecto, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) con un hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM, en donde el aminoácido en la posición X¹¹se selecciona de R, W o Cit y en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1). Del ejemplo 1 (Tabla 2), se puede ver que casi todos los análogos de hAM_15-52sintetizados tienen al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, que la gran mayoría de los análogos de hAM_15-52sintetizados tienen al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, y que una mayor parte de los análogos de hAM_15-52sintetizados tienen al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52(SE^qID NO: 1). Todos estos análogos de hAM_15-52mantienen las buenas propiedades de fibrilación de hAM_15-52(S^eQ ID NO: 1) en comparación con hAMY^1-37(SEQ ID NO: 2) (véase el ejemplo 2, Tabla 3). P. ej., la SEQ ID NO: 32 muestra que la buena estabilidad física (es decir, baja fibrilación) de hAM_15-52se puede mantener siempre que los análogos de hAM_15-52tengan al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la divulgación se refiere a una forma de mejorar en gran medida la potencia sobre hAMY3R del fragmento hAM_15-52mediante una sola sustitución a R, W o Cit en la posición X¹¹, mientras se mantiene la buena estabilidad física (es decir, buenas propiedades de fibrilación de hAM_15-52). Estos análogos de hAM_15-52serán, por lo tanto, agonistas muy potentes tanto en hAMY3R como en hAM1 R (véanse las SEQ ID NO: 361-392).

En la realización más preferida de la divulgación, X¹¹se selecciona como R. En otra realización, X¹¹se selecciona como W. En otra realización más, X¹¹se selecciona como Cit. Los inventores encontraron que esta sustitución de un único aminoácido en X¹¹proporcionaba una mayor potencia sobre hAMY3R a los análogos de hAM_15-52mientras conservaba la potencia sobre hAM1R. Los inventores encontraron además que la potencia sobre hAMY3R podía mantenerse cuando X¹⁷era Y, T, Q, M, I, F, A, R o K, o incluso mejorarse más seleccionando X¹⁷como W o H. Por lo tanto, en una realización X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K. En una realización preferida, X ¹⁷se selecciona como Y, W o H, más preferiblemente W o H.

En una realización, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52que comprende 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el aminoácido en la posición X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K, preferiblemente X¹⁷se selecciona como W o H y en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM _15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM _15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1).

En una realización más, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52que comprende 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el aminoácido en la posición X¹¹es R; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K, preferiblemente X¹⁷se selecciona como W o H y en donde el análogo de hAM^15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos 85 % de identidad con hAM_15-52, (SE^qID NO: 1).

En una realización más, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52que comprende 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el aminoácido en la posición X¹¹es W; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K, preferiblemente X¹⁷se selecciona como W o H y en donde el análogo de hAM^15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM^{i5 -52}, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM^{i5 -52}, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, (SEQ ID NO: 1).

En una realización más, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52que comprende 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde el aminoácido en la posición X¹¹es Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K, preferiblemente X¹⁷se selecciona como W o H y en donde el análogo de hAM^15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos 85 % de identidad con hAM_15-52, (SEQ ID NO: 1).

En una realización preferida, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K.

En otra realización preferida, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K.

En una realización más preferida, la divulgación se refiere a un análogo de hAM^i5-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K. En una realización más preferida adicional, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K.

En una realización más preferida adicional, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A, o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, o K.

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F.

en donde

X¹¹se selecciona de R;|

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K.

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C, o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F.

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F.

En una realización aún más preferida adicional, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R;

X¹⁷se selecciona como Y, W o H;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, aún más preferiblemente al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R; X¹⁷se selecciona como Y, W o H; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F.

En una realización más preferida adicional, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde, X¹¹se selecciona de R, W o Cit

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, al menos un 60 % de identidad con hAM^15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM^15-52, tal como al menos un

75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52con hAM_15-52, tal como al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit.

En una realización lo más preferida, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52de las SEQ ID NO: 3-392 o un derivado del mismo con al menos un 90 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-392, preferiblemente al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-392, más preferiblemente al menos un 96 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-392, lo más preferiblemente al menos un 97 % de identidad con una cualquiera de SEQ ID NO: 3-392 con la condición de que un derivado del mismo tenga R, W o Cit en la posición X¹¹, preferiblemente R en la posición X¹¹.

En una realización lo más preferida, la divulgación se refiere a un análogo de hAM_15-52de las SEQ ID NO: 3-392 o un derivado del mismo con al menos un 90 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-392, preferiblemente al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-392, más preferiblemente al menos un 96 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-392, lo más preferiblemente al menos un 97 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-278, con la condición de que un derivado del mismo tenga el mismo aminoácido en la posición X¹¹que el respectivo de las SEQ ID NO: 3-392 del que se deriva.

Aspecto 2: Análogos selectivos de hAMi^5-52con potencia de amilina mejorada

Número de posiciones necesarias para suprimir o reducir la potencia sobre AM1R en I¹AM ^15-52.

Los inventores encontraron que la potencia sobre hAM1R podía suprimirse o reducirse en hAM_15-52cambiando al menos un aminoácido en cualquiera de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸, ya que todos ellas eran críticas para la potencia sobre hAM1 R.

Disminución de la potencia sobre hAM1R con aminoácidos en la posición X⁴, X³⁷o X³⁸.

X⁴: Los inventores encontraron que los aminoácidos Y, W, T, M, I, A o C en la posición X⁴eran capaces de disminuir la potencia sobre hAM1R. Por lo tanto, en una realización, X⁴se selecciona de Y, W, T, M, I, A o C. Además, los aminoácidos W, M, I o C en la posición X⁴fueron más efectivos para mejorar la potencia sobre hAMY3R (véanse el ejemplo 5, tabla 6). Por lo tanto, en una realización muy preferida de la invención, X⁴se selecciona como W, M, I o C. Dado que los inventores encontraron que una sola posición elegida entre X⁴, X³⁷o X³⁸ era suficiente para suprimir o reducir la potencia de AM1R, se deduce que, en algunas realizaciones, X⁴es F (es decir, el aminoácido nativo presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición) y la potencia de AM1R se suprime o reduce usando la posición X³⁷y/o X³⁸. Por lo tanto, en cualquiera de las realizaciones anteriores para X⁴, se puede incluir F y suprimir o reducir la potencia sobre AM1R usando la posición X⁷y/o X³⁸.

X³⁷: Asimismo, los inventores encontraron que los aminoácidos Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C en la posición X³⁷eran capaces de disminuir la potencia sobre hAM1 R. Así, en una realización, X³⁷se selecciona de Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C. Además, los aminoácidos Y, W, P, H o F en la posición X³⁷fueron más efectivos para mejorar la potencia de hAMY3R (véanse el ejemplo 5, tabla 6). Por lo tanto, en una realización altamente preferida de la invención, X³⁷se selecciona como Y, W, P, H o F. Dado que los inventores encontraron que una sola posición elegida entre X⁴, X³⁷o X³⁸ era suficiente para suprimir o reducir la potencia de AM1R, se deduce que en algunas realizaciones X³⁷es G (es decir, el amino nativo presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición), y la potencia de AM1R se suprime o reduce usando la posición X⁴y/o X³⁸. Por tanto, en cualquiera de las realizaciones anteriores para X³⁷, se puede incluir G y suprimir o reducir la potencia sobre AM1R usando la posición X⁴y/o X³⁸.

X³⁸: Asimismo, los inventores encontraron que los aminoácidos Hyp, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K en la posición X³⁸eran capaces de disminuir la potencia sobre hAM1 R. Por lo tanto, en una realización, X³⁸se selecciona de Hyp, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K. Además, los aminoácidos Hyp, W, M o F fueron los más efectivos para mejorar la potencia sobre hAMY3R (véanse el ejemplo 5, tabla 6). Por tanto, en una realización muy preferida de la invención, X³⁸se selecciona como Hyp, W, M o F. En la realización más preferida de la invención, X³⁸se selecciona como Hyp. Dado que los inventores encontraron que una sola posición elegida entre X⁴, X³⁷o X³⁶ era suficiente para suprimir o reducir la potencia sobre AM1R, se deduce que en algunas realizaciones X³⁸es Y (es decir, el amino nativo presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición), y se suprime o reduce la potencia AM1R usando la posición X⁴y/o X³⁷. Por lo tanto, en cualquiera de las realizaciones anteriores para X³⁸, se puede incluir Y y suprimir o reducir la potencia sobre AM1R usando la posición X⁴y/o X³⁷.

Puede verse una ilustración simple del aspecto 2 de la invención comparando el alineamiento de hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) y la SEQ ID NO: 169 que se muestra a continuación.

SEQ ID NO:169 G C R F G T C T V Q R L A H Q I Y Q F T D K D K D N V A P R S K I S P Q G Hyp

SEQ ID NO:1 hAMY3R CE⁵⁰1,274 nM y hAM1 R CE⁵⁰1,113 nM

SEQ ID NO:169 hAMY3R CE⁵⁰0,063 nM y hAM1 R CE⁵⁰2.981,0 nM

Como puede verse, la R en la posición X¹¹ha mejorado la potencia en AMY3R aproximadamente 20 veces y la Hyp en la posición X³⁸ha disminuido la potencia en AM1R aproximadamente 2.500 veces. Por lo tanto, solo dos sustituciones han convertido hAM_15-52en un agonista de amilina con el mismo perfil farmacológico que hAMY^1-37. Al mismo tiempo, la SEQ ID NO: 169 ha mantenido la estabilidad física (señal ThT: 2,700 %) de hAM_15-52(señal ThT: 2,600 %) en comparación con hAMY^1-37(señal ThT: 100,0 %) (véanse el ejemplo 2, Tabla 3). Así, en un segundo aspecto, la invención se refiere a una forma de suprimir más o menos completamente la potencia sobre hAM1 R del fragmento hAM_15-52mediante una o más sustituciones en la posición X⁴, X³⁷y/o X³⁸y al mismo tiempo mejorar o mantener la potencia suficiente sobre AMY3R. Estos análogos de hAM_15-52serán, por lo tanto, análogos de hAMY3R muy potentes y selectivos. Al mismo tiempo, estos análogos de hAM_15-52mantienen la estabilidad física de hAM_15-52debido a la identidad de secuencia con hAM_15-52. Como se muestra en el ejemplo 2, Tabla 3, la buena estabilidad física de hAM_15-52se puede mantener o incluso mejorar en los péptidos (debido a una identidad de al menos el 50 % con hAM_15-52), mientras se proporcionan nuevos agonistas de hAMY3R que son tan potentes y selectivos como la amilina humana natural. En otras palabras, el segundo aspecto de la presente invención ha creado un análogo de amilina humana funcional oculto en un esqueleto de adrenomedulina.

Aumento de la potencia sobre hAMY3R con aminoácidos en la posición X ¹⁷.

Los inventores encontraron además que la potencia sobre hAMY3R podía mantenerse cuando X¹⁷era Y, T, Q, M, I, F, A, R o K, o incluso mejorarse aún más cuando X¹⁷era W o H. Así, en una realización, X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K. En una realización preferida, X¹⁷se selecciona como W o H.

Así, en un segundo aspecto, la invención se refiere a análogos de hAM_15-52que comprenden 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) o un sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde el aminoácido en la posición X ¹¹se selecciona de R, W o Cit y en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) y además en donde X⁴se selecciona como F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona como G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K, con la condición de que al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición, más preferiblemente, al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición. En el segundo aspecto, los análogos de hAM_15-52tienen un hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM y un hAM1R-CE⁵⁰s 25 nM.

En una realización, X⁴se selecciona como F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona como G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K, con la condición de que al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición, más preferiblemente, al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no son el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización, X⁴se selecciona como F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona como G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K, con la condición de que al menos una de las posiciones X⁴,

X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición, más preferiblemente, al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no son el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: ¹) en dicha posición.

En una realización, X⁴se selecciona como F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona como G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F,

E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, M o F, con la condición de que al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición, más preferiblemente, al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no son el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: ¹) en dicha posición.

En una realización, X⁴se selecciona como F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona como G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, M o F, con la condición de que al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición, más preferiblemente, al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no son el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización preferida, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R, K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID

NO: 1) en dicha posición;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad, incluso más preferiblemente al menos un 85 % de identidad, tal como al menos un 90 % de identidad, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R, K; X⁴se selecciona de F, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización más preferida adicional, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad, tal como al menos un 85 % de identidad, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En otra realización más preferida, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W, o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R, o K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A, o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H, o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad, tal como al menos un 85 % de identidad, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM^i5-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52) preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad, tal como al menos un 85 % de identidad, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM^{^ - 52}, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM^ ^-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM^ ^-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM^ ^-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad con hAM^ ^-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM^ ^-52, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización preferida de la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52) preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM_15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización más preferida, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, W, M, I o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM^{i 5-52}, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM _15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 85 % de identidad con hAM_15-52, más preferiblemente al menos un 90 % de identidad con hAM_15-52, lo más preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM_15-52, en donde X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, W, M, I o C; X³⁷se selecciona de G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, M o F; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM^15-52(s Eq ID NO: 1) en dicha posición.

En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, X¹¹es lo más preferiblemente R, y/o X¹⁷es lo más preferiblemente Y, W o H. Además, en cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, lo más preferiblemente al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no son los aminoácidos presentes en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización más altamente preferida, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52con la secuencia SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360 o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 55 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 60 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 65 % de identidad con hAM^15-52, preferiblemente al menos un 70 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 75 % de identidad con hAM^15-52, más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52, tal como al menos un 90 % de identidad con hAM _15-52(SEQ ID NO: 1), en donde, en el derivado, X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, Mv, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En una realización más altamente preferida adicional, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52con la secuencia SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360 o un derivado del mismo con al menos un 90 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, preferiblemente al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, lo más preferiblemente al menos un 97 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308 360, con la condición de que en el derivado, X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, X⁴se selecciona preferiblemente como F, W, M, I o C; X¹¹se selecciona preferiblemente como R; X³⁷se selecciona preferiblemente como G, Y, W, P, H o F; X³⁸se selecciona preferiblemente como Hyp, Y, W, M o F; X¹⁷se selecciona preferentemente como W o H. Además, en cualquiera de las realizaciones mencionadas anteriormente, lo más preferiblemente al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no son el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

En la realización más preferida, la invención se refiere a un análogo de hAM_15-52con la secuencia de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81 -92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181 -206, 208-243, 246-305, o 308-360 o un derivado del mismo con al menos un 90 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94 127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, preferiblemente al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181 206, 208-243, 246-305, o 308-360, lo más preferiblemente al menos un

97 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163 179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, con la condición de que un derivado del mismo tiene los mismos aminoácidos en las posiciones X⁴, X¹¹, X³⁷y X³⁸, preferiblemente los mismos aminoácidos en la posición X⁴, X¹¹, X¹⁷, X³⁷y X³⁸, como el respectivo análogo de hAM_15-52de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181 -206, 208-243, 246-305, o 308-360 del que se deriva.

Uso médico

En un tercer aspecto, la invención se refiere a análogos de hAM_15-52según el segundo aspecto para su uso como un medicamento. Más particularmente, el tercer aspecto de la invención se refiere a nálogos de hAM_15-52según el segundo aspecto para su uso en el tratamiento, prevención o mejora de una variedad de enfermedades, trastornos o afecciones, tales como, pero no limitados a, la ingesta excesiva de alimentos, exceso de peso corporal, obesidad, trastorno por atracones, síndrome de Prader-Willi, dislipidemia, enfermedades/trastornos metabólicos, diabetes I o II, tolerancia alterada a la glucosa, síndrome de resistencia a la insulina y/o NASH. Una realización preferida se refiere a uno o más análogos de hAM_15-52para su uso en el tratamiento de la obesidad, diabetes, NASH o combinaciones de las mismas.

Composiciones farmacéuticas

En un cuarto aspecto, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más de los análogos de hAM_15-52según el segundo aspecto y a su(s) uso(s) médico(s) para tratar, prevenir o mejorar una variedad de enfermedades, trastornos o afeccones según el tercer aspecto. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender un portador (vehículo) farmacéuticamente aceptable y/o uno o más excipientes de acuerdo con técnicas convencionales en la técnica, tales como las descritas en 'Remington: Essentials of Pharmaceutics', Ed. por Linda A. Felton, Pharmaceutical press 2012.

Las formulaciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a comprimidos, píldoras, cápsulas, emulsiones, suspensiones, de liberación sostenida o soluciones. Debe apreciarse que pueden usarse diferentes rutas de administración dependiendo de la elección de la formulación y la estabilidad química y/o metabólica de los polipéptidos. Dichas rutas de administración pueden incluir, pero no se limitan a, administración oral, administración parenteral (intravenosa (IV), subcutánea (SC), intradérmica (ID) e intramuscular (IM)), o inhalación. En una realización preferida de la invención, la ruta de administración es la administración parenteral. En una realización aún más preferida, la ruta de administración es subcutánea.

Ejemplos

Protocolos generales para la síntesis de los polipéptidos híbridos

Los péptidos se sintetizaron usando un sintetizador de péptidos en paralelo completamente automatizado SyroII (MultiSynTech GmbH, Alemania), equipado con un bloque calefactor, en Tentagel 5 RAM con una carga de 0,23-0,25 mmoles/g (Rapp Polymer GmbH, Alemania). La desprotección de Na-Fmoc se realizó en dos etapas mediante el tratamiento de la resina con piperidina al

40 %/DMF (HOBt 0,2 M (1-hidroxibenzotriazol)) durante 3 min a 45 °C, seguido de piperidina al 20 %/DMF (HOBt 0,1 M) durante 7-12 min a 75 °C. Excepto los residuos de Asp, Cys e His que fueron desprotecciones de Na-Fmoc a temperatura ambiente; es decir, piperidina al 40 %/DMF (HOBt 0,2 M) durante 3 min seguido de piperidina al 20 %/DMF (HOBt 0,1 M) durante 15 min. La química de acoplamiento fue DIC (N,N'-diisopropil-carbodiimida)/Oxima (acetato de ciano(hidroxiimino) de etilo) en ^dM^fusando soluciones de aminoácidos de 0,5 M en DMF y un exceso molar de 6 veces. Se usaron aminoácidos protegidos con Fmoc estándar. Las condiciones de acoplamiento fueron acoplamientos simples o dobles durante 15 min a 75 °C. Excepto los residuos de His y Cys, que se sometieron a acoplamiento doble durante 15 min a 50 °C. Los aminoácidos Fmoc se disolvieron a 0,5 M en DMF que contenía Oxima 0,5 M, excepto His que se disolvió en NMP. La resina se lavó 4 veces con NMP después de la desprotección con Na-Fmoc y 3 veces después de los acoplamientos.

El puente disulfuro se formó en la resina usando Tritilo (Trt) como grupo protector para la cisteína y tratándolo con yodo al 1 % en HFIP al 75 % (Hexafluoroisopropanol) en DCM durante 1 min. La resina se lavó 3 veces con HFIP al 75 % en DCM seguido de 4 veces con DCM.

Después de la síntesis, la resina se lavó con DCM y se secó, y el polipéptido se escindió de la resina mediante un tratamiento de

35 min con TFA (ácido trifluoroacético)/TES (trietilsilano)/agua (95/2,5/2,5) a 42 °C, seguido de precipitación con 4 volúmenes de éter dietílico frío, lavado adicional con éter dietílico y se dejó secar.

Los péptidos se caracterizaron por LC-MS (Waters, Dinamarca) y se cuantificaron por LC-CAD (ThermoFisher scientific, Dinamarca). Finalmente, los péptidos se liofilizaron para dar un polvo blanco usando un liofilizador de sobremesa Telstar.

Protocolos generales para ensayos de AMPc para medir la activación del receptor in vitro

hAMY3-R:

Se obtuvieron células que sobreexpresaban de forma estable el receptor hAMY3 de Ogeda (ahora Astellas Pharma), se subclonaron y una línea celular monoclonal con una ventana de ensayo apropiada se expandió, alicuotó y congeló. Se descongeló una alícuota y se sembró en placa en DPBS con caseína al 0,05 % e IBMX 0,5 mM como 2.000 células/pocillo en un formato de 384 pocillos. A continuación, las células se estimularon inmediatamente durante 30 min a temperatura ambiente con dosis graduadas del compuesto de ensayo usando amilina humana (Bachem, no. de cat. H-7905) como control positivo. La acumulación de AMPc se midió usando un ensayo Cisbio para receptores acoplados a Gs (no. de cat. 62AM4PEC), donde los reactivos del ensayo se añadieron según las instrucciones del fabricante y la transferencia de energía de fluorescencia en tiempo resuelto se registró después de una hora.

hAM1-R:

Se obtuvieron células que sobreexpresaban de forma estable el receptor hAM1 de Ogeda (ahora Astellas Pharma), se subclonaron y una línea celular monoclonal con una ventana de ensayo apropiada se expandió, alicuotó y congeló. Se descongeló una alícuota y se sembró en placa en DPBS con caseína al 0,05 % e IBMX 0,5 mM como 8.000 células/pocillo en un formato de 384 pocilios. A continuación, las células se estimularon inmediatamente durante 30 min a temperatura ambiente con dosis graduadas del compuesto de ensayo usando adrenomedulina humana 1-52 (Bachem, no. de cat. H-2932) como control positivo. La acumulación de AMPc se midió usando un ensayo Cisbio para receptores acoplados a Gs (no. de cat. 62AM4PEC), donde los reactivos del ensayo se añadieron según las instrucciones del fabricante y la transferencia de energía de fluorescencia en tiempo resuelto se registró después de una hora.

Protocolos generales para la determinación de la estabilidad física de los análogos peptídicos

Los péptidos se disolvieron en tampones (acetato de sodio 50 mM a pH 4 o fosfato de sodio 50 mM a pH 7) y se incubaron durante una hora. A continuación, las muestras se dividieron en dos réplicas de 80 μl en una placa negra de 384 pocillos (p-clear, Greiner Bio-One) y se mezclaron con Tioflavina T (ThT) hasta una concentración final de 4 pM. La placa se selló y se colocó en un lector de placas (CLARIOstar, BMG) donde la temperatura se ajustó a 40 °C durante el transcurso del experimento. Las muestras se tensaron aún más agitando la placa a 700 rpm (lineal) durante cinco minutos antes de cada medición. La fluorescencia se midió cada 10 min durante cuatro días excitando la ThT a 450 nm y midiendo la emisión a 480 nm. Para cada péptido, la señal de ThT a lo largo del tiempo se suavizó usando el ajuste de Regresión Polinomial Local (LOESS) implementado en el entorno de programación estadística R. Para los datos suavizados, la señal de ThT máxima se normalizó en porcentaje entre la señal de ThT máxima para hAMY y el fondo de tampón. Por lo tanto, los valores altos indican propiedades de fibrilación similares a hAMY, mientras que los valores bajos indican que no hay fibrilación.

Protocolos generales para el estudio de ingesta aguda de alimentos

El efecto sobre la ingesta acumulada de alimentos se midió en ratas macho Sprague Dawley (6 semanas de edad, Taconic, Dinamarca) después de una dosis única usando un sistema de monitorización de ingesta de alimentos totalmente automatizado (HM-2; MBROse ApS, Faaborg, Dinamarca), lo que permitió la monitorización avanzada sincrónica en tiempo real del comportamiento de ingesta de alimentos de animales individuales. Los animales se alojaron en grupos de 4 en una habitación con luz, temperatura y humedad controladas (ciclo 12/12 LD, luces encendidas a las 02:00 AM; 22 ± 2 °C; 50 % de humedad relativa). Los ratones tenían acceso ad libitum a una dieta de pienso regular (Altromin 1324, Brogaarden NS, Lynge, Dinamarca) y agua del grifo de calidad doméstica. Los ratones llegaron el día 7 y se permitió un mínimo de 5 días de habituación al sistema antes del comienzo del estudio. Durante estos días, los animales fueron manipulados diariamente para acostumbrarlos al paradigma experimental. El día de la dosificación, los animales se aleatorizaron en grupos según el peso corporal. Los animales se mantuvieron en ayunas durante cuatro horas antes de la dosificación. Los animales recibieron dosis SC 30 o 180 min antes de apagar las luces, y los datos de ingesta de alimentos se recopilaron automáticamente durante un total de 48 h posteriores a la dosificación con registros automáticos de alimentos cada 5 min.

Protocolos generales para el estudio de la obesidad crónica inducida por la dieta (DIO)

Las ratas Sprague-Dawley (Taconic, Dinamarca) llegaron a la edad de 5 semanas. Después de una semana de aclimatación, se agruparon de manera uniforme en función de su peso corporal en la línea base y se les ofreció acceso ad libitum a una dieta de dos opciones que consistía en gránulos de pienso (Altromin #1324, Brogaarden, Lynge, Dinamarca) y una dieta alta en azúcares/grasas de alta palatabilidad (mezcla 1:1:1 de Nutella (Ferrero, Alba, Italia), mantequilla de cacahuete (PCD, Rotterdam, Países Bajos) y pienso estándar en polvo (Altromin #1324, Brogaarden, Lynge, Dinamarca); 29,3 % de grasa, 33,2 % de carbohidratos, y 18 % de proteína) durante hasta 36 semanas. Las ratas se alojaron en parejas durante todo el estudio en condiciones ambientales controladas (ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, luces apagadas a las 15:00; 22 ± 1 °C; 50 ± 10 % de humedad relativa). El peso corporal y la ingesta de alimentos y agua se monitorizaron diariamente durante todo el período del estudio. Un día antes del experimento, las ratas se aleatorizaron según el peso corporal en grupos experimentales (n = 9-10), que recibieron compuesto o vehículo SC. QD (una vez al día) durante 28 días.

Ejemplo 1

Los valores de CE⁵⁰en hAMY3R y hAM1 R se midieron según el protocolo general anterior. Se calculó el porcentaje de identidad para los análogos de hAM^{15 52}en comparación con hAM_15-52. Los resultados se resumen en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2. La Tabla 2 muestra que los análogos de hAM_15-52(SEQ ID NO: 3-392) con potencia sobre hAMY3R mejorada en comparación con hAM_15-52pueden obtenerse cambiando el aminoácido K presente en hAM_15-52en la posición X¹¹en R, W o Cit. La Tabla 2 muestra además que los análogos de hAM_15-52altamente selectivos para hAMY3R (hAMY3R-CE₅₀≤ 250 pM y un hAM1R-CE⁵⁰s 25 nM) (SEQ ID NO: 3-360) pueden obtenerse suprimiendo o reduciendo la potencia sobre hAM1R usando las posiciones X⁴,X³⁷y/o X³⁸. Todas las lipidaciones en la posición 1 se realizaron en el extremo N y la lipidación en las otras posiciones se realizaron en un N épsilon en Lys. AMCHC se refiere al ácido trans-4-(aminometil)ciclohexanocarboxílico. OEG se refiere al ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico u 8Ado.

Ejemplo 2

La fibrilación se determinó según el protocolo general para la determinación de la estabilidad física de los análogos peptídicos de péptidos. Los datos para los análogos de hAM_15-52seleccionados se resumen en la Tabla 3 a continuación.

Tabla 3. La Tabla 3 muestra que los análogos de hAM_15-52según la invención mantienen las buenas propiedades de fibrilación de hAM_15-52. La mayoría de los datos de fibrilación son comparables y algunos incluso mejores que hAM15-⁵²(SEQ ID NO: 1) a pH 7 (señal de ThT del 2,6%). Todos los datos de fibrilación son muy superiores en comparación con la referencia hAMY1-37 (SEQ ID NO: 2) (señal de ThT en 100 %).

Ejemplo 3

Se determinó el efecto de análogos de hAM^{i 5-52}seleccionados sobre la ingesta aguda de alimentos en ratas magras. Los resultados se resumen en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4. La Tabla 4 muestra que los análogos de hAM_15-52tienen potentes efectos anorexígenos hasta 48 horas después de una única inyección SC en ratas sanas magras (n=7-8), proporcionando así una prueba de principio. Modelo lineal de un factor de la prueba de Dunnett***: P < 0,001 en comparación con el vehículo (se realizaron tres operaciones independientes).

Ejemplo 4

Se determinó el efecto del tratamiento crónico de análogos de hAM^{i 5-52}seleccionados según la invención en ratas con obesidad inducida por la dieta (DIO). Los resultados se resumen en la Tabla 5 a continuación.

Tabla 5. La Tabla 5 muestra que las inyecciones SC diarias de SEQ ID NO: 46 o 78 causan una reducción significativa en el peso corporal en ratas con obesidad inducida por la dieta (n = 10) después de un período de tratamiento de 28 días, proporcionando así una prueba de concepto. Modelo lineal de un factor de la prueba de Dunnett***: P < 0,001 en comparación con el vehículo (se realizaron dos operaciones independientes).

Ejemplo 5

Investigación más profunda de los aminoácidos representativos en la posición X⁴, X¹¹, X¹⁷, X³⁷y X³⁸y el correspondiente cambio de potencia. Los resultados se resumen en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6. La Tabla 6 muestra si el cambio de aminoácido provoca un incremento (I) en la potencia sobre hAMY3R, una potencia sin cambios (U) o una potencia disminuida (D) en comparación con el aminoácido de referencia (R). N/A No disponible.

Tabla 7. LISTADO DE SECUENCIAS

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Tabla 7 continuación.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un análogo de hAMi^5-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo que comprende 38 aminoácidos (X¹-X³⁸) con un hAMY3R-CE50 ^ 250 pM y un hAM1 R-CE⁵⁰^ 25 nM, en donde el aminoácido en la posición X⁴se selecciona como F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona como G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; X¹¹es R, W o Cit y en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición y además en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos al menos un 50 % de identidad con hAM_15-52(S^eQ ID NO: 1).

2. Un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, en donde el análogo de hAM_15-52tiene al menos un 60 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², tal como al menos un 70 % de identidad con hAM1⁵-⁵², preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM_15-52(SEQ ID No: 1).

3. Un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de fórmula (I):

en donde

X¹¹se selecciona de R, W o Cit;

X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K;

X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

o un derivado del mismo con al menos un 50 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², tal como al menos un 55 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², tal como al menos un 60 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², tal como al menos un 65 % de identidad con hAM1 emente al menos un 70 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², tal como al menos un 75 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², más preferiblemente al menos un 80 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², tal como al menos un 90 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², preferiblemente al menos un 95 % de identidad con hAM¹⁵-⁵², en donde, en el derivado, X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

4. Un análogo de hAM_15-52o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo según la reivindicación 1 con la secuencia de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81 -92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181 -206, 208-243, 246-305 o 308 360 o un derivado de cualquiera de las mismas con al menos un 90 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, preferiblemente al menos un 95 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94 127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, lo más preferiblemente al menos un 97 % de identidad con una cualquiera de las SEQ ID NO: 3-57, 60-75, 77-79, 81-92, 94-127, 129-147, 150-161, 163-179, 181-206, 208-243, 246-305, o 308-360, con la condición de que en el derivado, X¹¹se selecciona de R, W o Cit; X¹⁷se selecciona como Y, W, T, Q, M, I, H, F, A, R o K; X⁴se selecciona de F, Y, W, T, M, I, A o C; X³⁷se selecciona de G, Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K; X³⁸se selecciona de Hyp, Y, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K; y además en donde al menos una de las posiciones X⁴, X³⁷o X³⁸no es el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

5. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde al menos dos de las posiciones X⁴, X³⁷y X³⁸no son el aminoácido presente en hAM_15-52(SEQ ID NO: 1) en dicha posición.

6. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde todas las posiciones X⁴, X³⁷y X³⁸se seleccionan de la siguiente manera:

X⁴se selecciona de Y, W, T, M, I, A o C;

X³⁷se selecciona de Y, S, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R, C o K;

X³⁸se selecciona de Hyp, W, T, Q, P, M, I, H, F, E, A, R o K;

7. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X⁴se selecciona como F, W, M, I o C.

8. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X³⁷se selecciona como G, Y, W, P, H o F.

9. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X³⁸se selecciona como Hyp, Y, W, M o F.

10. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X¹⁷se selecciona como W o H.

11. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde X¹¹es R.

12. Un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 -11 para su uso como un medicamento.

13. Una composición farmacéutica que comprende un análogo de hAM_15-52o un derivado del mismo según las reivindicaciones 1-11, un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, uno o más excipientes.