ES2949932T3 - Método de calibración autoparativo de un sensor de aptámero - Google Patents
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Abstract
Un método para usar un biosensor para determinar la concentración de un analito objetivo, que no requiere un paso de calibración previo a la prueba. Pequeñas variaciones entre electrodos en diferentes biosensores, incluso cuando los biosensores están diseñados para ser idénticos y fabricados de la manera más parecida posible, pueden provocar variaciones significativas en la producción cuando se aplica el método electroquímico. Por lo tanto, los biosensores existentes se calibran antes de su uso, ya sea durante la fabricación o justo antes de su uso. La calibración previa no es factible para aplicaciones desechables y aumenta la complejidad del uso si es necesario que la realice el usuario final. Se describe un método de calibración autoparativa en el que se determinan ciertas constantes durante la prueba del biosensor y luego se aplican a todos los usos del biosensor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método de calibración autoparativo de un sensor de aptámero
REFERENCIA CRUZADA A APLICACIONES RELACIONADAS
[0001] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los EE. UU. N.° 62/769,038, presentada el 19 de noviembre de 2018.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0002] Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de los EE. UU. 62/769,038 se encuentra en el campo de los biosensores aptámeros, sus métodos de uso y específicamente su calibración.
ANTECEDENTES
[0003] El principio del sensor electroquímico basado en aptámero se basa en el acoplamiento de cambios conformacionales inducidos por el objetivo de un biorreceptor aptámero con detección electroquímica de la tasa de transferencia de carga alterada resultante entre la molécula redox y la superficie del electrodo. El sensor está constituido por el sustrato de soporte y la capa superficial modificada. El sustrato de soporte se produce a partir de materiales conductores que incluyen, entre otros, oro, plata, carbono, polímero conductor o partículas metálicas. La calidad y la composición del material del sustrato pueden afectar significativamente la salida del sensor.
[0004] Los métodos electroquímicos permiten obtener una señal de salida, que se convierte en la entrada a partir de la cual se puede calcular la concentración del analito. La dependencia de la señal de la concentración del analito se puede representar mediante una cura de calibración que existe para cada sensor. El método de calibración más utilizado es un proceso mediante el cual se analizan una solución en blanco y una serie de soluciones objetivo estándar para establecer una cura de concentración frente al cambio de señal. Por ejemplo: para obtener la cura de calibración del sensor, el primer paso es probar la solución en blanco estándar (la misma solución que la muestra objetivo pero que no contiene el objetivo), luego obtener la señal en blanco inicial, S0. El segundo paso es probar una serie de soluciones objetivo estándar (1, 2, 3, 4, 5...), y luego obtener igualmente una serie de señales objetivo St (S 1 , S 2 , S 3 ...Sn). El tercer paso es calcular el cambio de señal entre cada solución objetivo y la señal inicial, St- S0 o St/Sa-1. Usando los datos experimentales, la cura de calibración del cambio de señal frente a la concentración objetivo, como se muestra en la FIG. 1, se puede determinar. Posteriormente, una vez que el cambio de señal sale del método electroquímico, la concentración del analito se puede calcular de acuerdo con la cura de calibración.
[0005] Entonces, en teoría, para obtener el cambio de señal, hay que medir o conocer al menos dos parámetros necesarios, uno es S0, también llamado señal en blanco, otro es señal objetivo, llamado S t. Sin embargo, en el proceso de producción en masa práctica, es imposible establecer una cura de calibración estándar para cada sensor individual y medir el S0 para cada sensor. Si bien en teoría, los sensores ideales del mismo tipo tienen el mismo rendimiento porque usan el mismo diseño, materiales, modificación y tecnología de producción y pueden compartir una cura de calibración unificada, la realidad es que la producción de sensores no puede evitar absolutamente la existencia de electrodo a variaciones de electrodos. Las pequeñas variaciones pueden tener una influencia significativa en la precisión del resultado de la prueba si se utiliza la misma cura de calibración para todos los sensores, incluso cuando se fabrican en el mismo lote. Por ejemplo, la FIG. 2 muestra el resultado de una prueba de voltamperometría de onda cuadrada (SW) en dos sensores de la misma clase que han sido fabricados de la manera más idéntica posible con las técnicas de fabricación actuales y probados en las mismas condiciones ambientales con la misma concentración objetivo, solución de muestra y dispositivo electrónico. La altura del pico del voltamograma es casi un 50 % más alta en la Tira de prueba 2 en comparación con la tira de prueba 1, y el potencial al que se produce el pico es diferente. La cura para la tira de prueba 2 es más alta que la tira de prueba 1 porque las mediciones actuales son más altas en todos los potenciales para la tira de prueba 2.
[0006] Por lo tanto, para mejorar la precisión de los resultados, a menudo se consideran dos métodos, uno es reducir las variaciones entre electrodos mejorando la técnica de producción tanto como sea posible, el otro es hacer una prueba en blanco para cada sensor individual antes de la detección del objetivo. Dado que las variaciones de electrodo a electrodo son imposibles de eliminar por completo durante la fabricación, lo que se practica actualmente en entornos comerciales es la activación de una primera prueba en blanco o de control que se almacena dentro de un depósito separado y/o sensor separado dentro del dispositivo. La desventaja de este método es que se requiere espacio adicional dentro del dispositivo para una solución en blanco y/o electrodos adicionales y mayores costos de fabricación y tiras reactivas. Además, una prueba de control en el punto de uso reduce la escalabilidad del producto, particularmente porque el usuario debe realizar o esperar a que se complete la prueba en blanco, lo que aumenta la posibilidad de error del usuario y, en general, aumenta la complejidad de la experiencia del usuario. Una prueba de solución en blanco hace que las aplicaciones desechables de una sola prueba no sean factibles.
[0007] Otra solución es la calibración con una solución en blanco o de control que debe probar el fabricante del cartucho antes del envío. Sin embargo, realizar la prueba en blanco en la fábrica aumenta los costos de producción y no necesariamente resulta en precisión, debido al deterioro de la ida útil y la posibilidad significativa de condiciones muy
diferentes en el punto de uso. Por lo tanto, los métodos de calibración generalmente se aplican poco antes del uso del sensor.
[0008] Actualmente, el método de calibración más avanzado conocido en la industria es un método 'sin calibración' propuesto de Plaxco et al., WO 2018/223024 A2 ("Plaxco"). La innovación de Plaxco se basa en el descubrimiento de que para algunos aptámeros existe una frecuencia particular llamada frecuencia de no respuesta, por lo que cuando se utiliza el método electroquímico en la frecuencia de no respuesta, la diferencia de señal del aptámero en los estados ligado y no ligado es, de hecho, cero. Esto significa que la corriente de descarga farádica es la misma cuando el aptámero está unido y no unido y que la señal medida es independiente de la concentración del objetivo. Este fenómeno ayuda a la calibración de un sensor electroquímico de aptámero porque el sensor se puede probar una vez a la frecuencia de no respuesta y, en segundo lugar, a una frecuencia para maximizar la diferencia de señal del aptámero en estados unidos y no unidos. El cambio de señal directamente desde la adición del objetivo se puede calcular in situ sin necesidad de realizar primero una prueba en blanco en las tiras reactivas en el proceso de fabricación.
[0009] El método se basa en la suposición de que la frecuencia de no respuesta característica del aptámero, la frecuencia a la que la señal de corriente medida es independiente de la concentración objetivo, permanece en una frecuencia constante y se puede determinar con precisión. En realidad, la experimentación muestra que la frecuencia de falta de respuesta del aptámero cambia significativamente en un amplio rango de frecuencias (50 Hz-100 Hz como se muestra en la FIG. 3) y no es completamente independiente de la concentración objetivo. Por lo tanto, cada tira de prueba debe probarse varias veces para identificar primero la frecuencia de falta de respuesta, lo que hace que el método no sea mejor que el método de prueba en blanco original que busca reemplazar y, por lo tanto, es inútil en aplicaciones comerciales a gran escala.
[0010] Esencialmente, el método de Plaxco implica determinar experimentalmente la cura de respuesta a la dosis del cambio de señal frente a la concentración objetivo. Para cualquier sensor E-AB, esta cura será no lineal independientemente del baroreceptor; sin embargo, el método sin calibración requiere la identificación de una sección estrecha de la cura de modo que se le pueda aplicar una línea lineal de mejor ajuste y utilizarla como la ecuación de calibración utilizada en futuras pruebas de concentraciones objetivo desconocidas. Ajustar una cura lineal a un conjunto de datos no lineal significará que el error en los alores de concentración estimados es bastante grande y, por lo tanto, solo se puede medir un rango estrecho de concentraciones para producir una concentración estimada con una precisión del 20 %, el mayor error total aceptable del sistema. para cualquier producto de diagnóstico comercial - de la concentración objetivo. Este rango de concentraciones que el sensor puede medir está típicamente dentro de 1 orden de magnitud de la constante de disociación Kd (que se determina en el método sin calibración ajustando globalmente su ecuación de calibración a un conjunto de datos de múltiples sensores de la misma clase).
[0011] Por lo tanto, hasta la fecha no existen métodos de calibración adecuados para productos sensores electroquímicos aptámeros comercializados a gran escala.
RESUMEN DE LA INENCIÓN
[0012] Como se muestra en la FIG. 4, los inventores han identificado que la relación no unida/no unida imin 1 /imin 2 para dos frecuencias seleccionadas cualesquiera permanece constante en todos los sensores de una clase de sensor, independientemente de las variaciones de sensor a sensor que se espera que ocurran durante la fabricación. Los inventores han identificado además que la relación de señal de una solución rica en objetivos para dos frecuencias seleccionadas, h/Í 2 , también permanece constante en todos los sensores de una clase de sensor. Los inventores han identificado además una relación lineal Y=(1/Kd)*[T] entre la concentración objetivo [T] y la función de relación de señal Y (basada en h/Í 2 ) que puede determinarse matemáticamente para producir resultados muy precisos sin la necesidad de aplicar una línea lineal de mejor ajuste a un conjunto de datos no lineal. La relación no ligada/no ligada z = imin 1 /i min 2 se puede determinar durante el desarrollo de una nueva clase de sensor o la fabricación, y se puede usar para derivar una ecuación de concentración tal que cuando se prueba in situ, la solución objetivo se puede medir en las dos frecuencias designadas y la ecuación produce resultados de concentración precisos y confiables en el punto de uso. Esta ecuación de concentración derivada se puede usar en un método de prueba de analito que no requiere ningún paso adicional para calibrar el sensor, lo que permite un sensor adecuado para cualquier uso comercial. El nombre del método de calibración basado en esta relación es Método de calibración autoparativo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0013]
FIG. 1 muestra varios gráficos que muestran el cambio de señal de diferentes sensores representados frente a la concentración objetivo.
FIG. 2 es un gráfico de la salida cuando el método electroquímico se realiza en dos tiras reactivas de aptámero que se han fabricado de la manera más similar posible con las técnicas de fabricación actuales.
FIG.3 es un gráfico del cambio de altura del pico de voltamperometría cuando se realiza el método electroquímico en cada frecuencia para diferentes concentraciones objetivo (0 mM a 200 mM), que muestra la "frecuencia de no
respuesta" de Plaxco que abarca frecuencias de 100 a 180 Hz.
FIG.4 es un gráfico que traza las tres constantes Y1 = imax1/imin1,Y2 = imax2 /i min 2 y z = imin 1 /imin 2 , que son constantes a través de biosensores en la misma clase de sensor.
FIG. 5 es la ecuación de deformación o curva de calibración del cambio de señal frente a la concentración [T].
FIG. 6 es un ejemplo de una instancia de un sensor que representa una clase de sensor.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0014] El método se aplica a un sensor modificado con un aptámero como biorreceptor. Los aptámeros son oligonucleótidos o moléculas peptídicas que se unen a una molécula diana específica con alta afinidad por las moléculas diana en base a conformaciones tridimensionales que interactúan con las moléculas diana complementarias. Cuanto más objetivo presente en una muestra, más aptámeros se unen y mayor es la señal medida promedio (corriente de descarga farádica) a través de la superficie del electrodo cuando se aplica un método electroquímico. El método electroquímico es preferiblemente un método de voltamperometría pulsada, como la voltamperometría de onda cuadrada (SWV) o la voltamperometría diferencial de pulso (DPV). En estos métodos, la respuesta actual se mide cuando se aplica potencial a través de los electrodos de trabajo, de referencia y contraelectrodo del sensor.
[0015] Tras la unión, algunos aptámeros experimentan cambios conformacionales. Los aptámeros para el analito objetivo pueden desarrollarse utilizando el método SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial), donde se seleccionan para una alta afinidad de unión y un cambio conformacional del aptámero mediante el cual se pliega (o se abre más) después de unirse al objetivo. Los ejemplos de aptámeros adecuados para el trifosfato de adenosina y la tobramicina se encuentran en la bibliografía en Liu et al., "Achieving Reproducible Performance of Electrochemical, Folding Aptamer-Based Sensors on Microelectrodes: Challenges and Prospects", Analytical Chemistry 2014, 86, 11417 - 11424. La secuencia del aptámero se puede modificar aún más para producir un cambio de estructura mayor al: 1) truncar el aptámero para acortarlo realizando experimentos para aproximar la región del aptámero que se une al objetivo y luego eliminar bases de ADN que no están en la región de unión; y 2) bases no coincidentes en la estructura del aptámero para hacerlo menos estable, por lo que cuando el aptámero se une al objetivo, el cambio conformacional es más significativo. El proceso de desarrollo de los aptámeros puede requerir varias rondas de pruebas con el objetivo para determinar si el aptámero muestra un cambio de señal debido al cambio de estructura.
[0016] Los aptámeros que muestran el cambio conformacional se modifican adicionalmente con una molécula redox activa, como azul de metileno (MB) o ferroceno (Fc), en el extremo libre. Por lo tanto, un aptámero con una molécula con actividad redox en el extremo libre cambiará la proximidad de la molécula con actividad redox al sustrato dependiendo de si está en un estado unido o no unido. Esto da como resultado una descarga farádica que se puede muestrear utilizando el método electroquímico.
[0017] Una clase de sensor se define aquí como el conjunto de sensores que tienen características de diseño suficientemente comunes de modo que todos los sensores del diseño seleccionado responderán de manera similar cuando se utilicen dentro de un conjunto seleccionado de condiciones de ensayo seleccionadas. Por ejemplo, los sensores que pertenecen a la misma clase de sensor tendrán una estructura de electrodos, composición de sustrato, aptámeros, composición de aptámeros, tipo de indicador redox idénticos y se fabricarán de acuerdo con el mismo proceso. Como ejemplo, en la figura 1 se representa una instancia representativa de un sensor 31 en una clase de sensor. FIG 6. Esta clase de sensor representa todos los sensores que tienen un electrodo de referencia 310, un contraelectrodo 311 y electrodos de trabajo 312 a 318 colocados como se muestra. El sensor 31 es un sensor multiplex que puede tener siete aptámeros diferentes, cada uno inmovilizado en un electrodo de trabajo diferente, pero los aptámeros y su ubicación asignada a cada electrodo de trabajo es idéntica en toda la clase de sensor. Las únicas variaciones dentro de una clase de sensor son las variaciones que se manifiestan debido a las diferencias en la fabricación y las condiciones ambientales, pero todos los sensores de la misma clase de sensor se fabrican según el mismo proceso.
[0018] Los métodos de fabricación de biosensores existentes en el momento de escribir este artículo incluyen la fabricación de placas de circuito impreso, serigrafía y pulverización catódica. La pulverización catódica y la pulverización catódica con magnetrón utilizan procesos de depósito de película delgada. El equipo requiere una aspiradora para funcionar, por lo general se usa nitrógeno para llenar y limpiar la superficie del sustrato, y el equipo es físicamente grande. Se debe aplicar un pretratamiento al sustrato del biosensor antes de que se pueda aplicar el material del electrodo al sustrato. La conexión entre el sustrato y el material del electrodo se basa en la adsorción física y, por lo tanto, no es una conexión fuerte. La serigrafía es el único proceso de fabricación disponible para aplicaciones comerciales. En esta técnica el material de soporte puede ser un material blando o flexible como el plástico. El material del electrodo no es un material sólido, sino que es un material en polvo y también se mezcla con un material adhesivo o solvente. La fabricación de PCB implica el depósito químico del material conductor con una capa superficial modificada sobre la que se unen los aptámeros. Si bien existe una infraestructura global existente que respalda este método de fabricación, hasta la fecha solo se han intentado algunos casos de uso de PCB para producir una plataforma de electrodos de biosensores con fines de investigación, porque no se han podido lograr mediciones de biosensores de alta calidad con este método de fabricación. Los electrodos de PCB muestran una señal más pobre que los electrodos serigrafiados y generalmente no se consideran
adecuados para su uso.
[0019] Los materiales y combinaciones de materiales tales como, entre otros, oro, plata, platino, cobre, níquel, carbono, polímero conductor, partículas metálicas y otros materiales conductores se pueden usar como sustrato sobre el cual se puede modificar la bioquímica para constituyen el electrodo. El oro es el material de superficie más utilizado para la unión de aptámeros. Los aptámeros se inmovilizan en la capa superficial modificada mediante la unión covalente del aptámero a la capa superficial de oro con un grupo activo como tiol (-SH), carboxilo (-COOH), hidroxilo (-OH) en el extremo (5' o 3'). Modificación de la superficie de trabajo del electrodo se puede lograr a través de una reacción de acoplamiento bioquímico como la modificación del grupo de amina primaria NHS/EDC o la modificación de tiol-oro basada en diferentes materiales del electrodo.
[0020] En el caso de un biorreceptor con unión reversible con estequiometría 1:1, una formulación conocida de la concentración de analito [T] en un método electroquímico que produce una salida i puede formularse como:
donde imin es la altura del pico sin el objetivo de unión y imax es la altura del pico si las moléculas del sensor están totalmente unidas con el objetivo, y Kd es la medida conocida de la afinidad de unión del aptámero y el objetivo, conocida en la técnica como la constante de disociación. P. ej. Alexander P. Demchenko, "The problem of self-calibration of fluorescence signal in microscale sensor systems," Lab Chip, 2005, 5, 1210-1223. Esta ecuación de calibración solo es efectiva si i, imin e imax se miden en la misma prueba y exactamente en las mismas condiciones experimentales, pero como se discutió en Antecedentes, el problema de la calibración es que no es factible para todas estas mediciones. realizarse en el mismo ensayo o en el punto de uso.
[0021] Los inventores han identificado que la relación no unida/no unida imin 1 /imin 2 para dos frecuencias seleccionadas permanece constante en todos los sensores de una clase de sensor, independientemente de las variaciones de sensor a sensor que se espera que ocurran durante la fabricación. Los inventores han identificado además que la relación de la señal obtenida de una solución rica en objetivos para dos frecuencias seleccionadas, i 1 /i 2 , también permanece constante en todos los sensores de una clase de sensor. Estos resultados se muestran a continuación en las Tablas 1 y 2 a continuación, así como en la FIG. 4.
Tabla 1 La constante de z (en leche blanca)
Tabla 2 La variable de i1/i2 a una concentración dada (78uM tobramicina en leche)
[0022] Estos resultados experimentales impulsan la derivación de una fórmula para la concentración de analito [T] de la
siguiente manera:
[0023] Debido a que la proporción de imax/imin, registrada como y, es constante para un sensor y una condición determinados, puede expresar la concentración [T] en cada frecuencia de trabajo como:
[0024] En la misma muestra de prueba, la concentración es constante, por lo tanto:
donde y1 y Y2 son la relación de imaxi/i mini e imax 2 /imin 2 respectivamente. Los inventores han identificado además que estas relaciones son constantes en dos frecuencias cualesquiera, como se muestra en la FIG. 4. Dado que imini/imin 2 , denotado como z, también se ha encontrado que es constante (FIG. 4), tenemos:
[0025] A través del cálculo, la fórmula final se puede escribir como:
[0026] A partir de esto fórmula, i 1 e i 2 son las únicas variables que deben probarse in situ, ya que todas las demás variables son constantes y se pueden calcular para la misma clase de sensor durante el desarrollo inicial del producto antes de la fabricación en masa.
[0027] Todos los sensores E-AB que utilizan una ecuación de calibración desarrollada sobre la Ecuación 1 darán como resultado una relación no lineal entre el cambio de señal (i/i min) y la concentración objetivo. En lugar de ajustar una línea lineal de mejor ajuste a un conjunto de datos no lineales, los inventores han identificado que la Ecuación 8 se puede manipular mediante la sustitución de la Ecuación 9 para producir la Ecuación 10, una relación lineal entre la concentración
objetivo [T] y la función de relación de señal Y (que solo requiere entradas para ii/i 2 ) que se pueden determinar matemáticamente para producir resultados muy precisos.
[0028] Por lo tanto, la ecuación de deformación de la Ecuación 10 se puede calcular y el gráfico de concentración de Y frente a la concentración [T] se puede visualizar con un error de variación muy bajo (R 2 = 0,9986) como se muestra en la FIG. 5. La ecuación 10 permite la detección de un rango de concentraciones más amplio que el que normalmente se logra con los métodos de calibración existentes. Además, Kd se puede calcular directamente a partir del gradiente de la pendiente de este gráfico, que es un enfoque más simple.
[0029] En el punto de uso, el (los) electrodo (s) de trabajo del sensor solo necesitan ser muestreados en las dos frecuencias, y estos valores se ingresan en la Ecuación 8 para determinar un valor exacto para la concentración de analito. Las dos frecuencias, junto con la constante de disociación Kd, Y1 Y2 y z, pueden determinarse durante una etapa inicial de prueba del sensor. Las dos frecuencias son dos frecuencias cualesquiera que muestran un cambio de señal en presencia del analito, y preferiblemente dos frecuencias que muestran la máxima cantidad de cambio de señal. Se pueden usar dos frecuencias cualesquiera siempre que las alturas de los picos para una concentración objetivo no sean las mismas para las dos frecuencias. Esta es una ventaja sobre el método sin calibración ya que no es necesario determinar o utilizar la frecuencia de falta de respuesta y ofrece más opciones con respecto a las frecuencias de trabajo que se pueden usar en un sensor comercial. Por ejemplo, si se determina que la frecuencia de falta de respuesta característica del aptámero es de 40 Hz, esta frecuencia más lenta requerirá más tiempo para que se complete la prueba electroquímica, especialmente en una plataforma de sensores multiplex donde se utilizan muchos electrodos. El método autoparativa permite utilizar dos frecuencias altas, lo que puede reducir significativamente el tiempo de prueba.
[0030] En la práctica, las constantes y la información sobre las frecuencias seleccionadas se pueden almacenar en una base de datos que contiene una identificación de cada sensor y sus frecuencias y constantes asociadas. Se puede fijar físicamente una identificación de sensor 32 al sensor 31 para facilitar el escaneo y la recuperación de las constantes antes de la operación de la prueba. Por lo tanto, un ejemplo de aplicación del método de calibración autoparativa es el siguiente:
[0031] Paso 1: el sensor se inserta o se conecta operativamente de otro modo a un dispositivo electrónico configurado para activar una prueba voltamperométrica pulsada para muestrear la corriente en cada electrodo de trabajo.
[0032] Paso 2: la muestra se deposita sobre los electrodos de trabajo y se deja pasar algún tiempo para que los aptámeros se unan al objetivo presente en la muestra.
[0033] Paso 3: Al recibir una instrucción de inicio, el dispositivo electrónico realiza la prueba de voltamperometría a la primera frecuencia asociada al sensor, obteniendo un primer valor de corriente ii.
[0034] Paso 4: El dispositivo electrónico realiza la prueba de voltamperometría a la segunda frecuencia asociada al sensor, obteniendo un segundo valor de corriente i 2 .
[0035] Paso 5: Los valores actuales ii e i 2 se ingresan en la Ecuación 9, junto con las constantes asociadas con el sensor para encontrar Y, que se puede ingresar en la Ecuación 10, mediante la cual se calcula la concentración de analito [T].
[0036] Por lo tanto, la concentración del analito se puede medir en el punto de uso sin una prueba en blanco adicional y engorrosa. Además, el tiempo de fabricación del sensor no se ve afectado significativamente por las pruebas en blanco para cada sensor, que además pueden no resultar fiables una vez que se han tenido en cuenta el deterioro y la vida útil, y que no serían apropiados para sensores de un solo uso.
Claims (7)
1. Un método para medir la concentración de un analito en una muestra presentada a un sensor modificado con un aptámero como biorreceptor, el sensor pertenece a una clase de sensor, el método comprende los pasos de:
aplicar un método electroquímico voltamperométrico pulsado a una primera frecuencia para obtener una primer valor actual ii ; aplicando el método electroquímico a una segunda frecuencia para obtener un segundo valor de corriente i 2 , donde la primera frecuencia y la segunda frecuencia generan una primera y una segunda respuesta de corriente, respectivamente, cuando el método electroquímico se aplica a cualquier sensor de la clase de sensor que se modifica con el aptámero, y dicha primera y segunda respuesta de corriente son distintas de cero y no iguales;
calculando la concentración del analito [T] mediante la ecuación
en la que Kd es una constante de disociación para cualquier sensor de la clase de sensor que se modifica con el aptámero, Yi es igual a una relación de una respuesta actual de objetivo saturado a muestra libre de objetivo cuando el método electroquímico se aplica en la primera frecuencia para cualquier sensor de la clase de sensor que se modifica con el aptámero, Y2 es igual a una relación de una respuesta de corriente de muestra saturada de objetivo a muestra libre de objetivo cuando el método electroquímico se aplica a la segunda frecuencia para cualquier sensor de la clase de sensor que se modifica con el aptámero, y z es igual a la relación de una respuesta de corriente de una muestra sin objetivo cuando el método electroquímico se aplica a la primera frecuencia a una respuesta de corriente de muestra sin objetivo cuando se aplica el método electroquímico a la segunda frecuencia para cualquier sensor de la clase de sensor que se modifica con el aptámero.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la clase de sensor se compone de una disposición de sensor multiplex que tiene un contraelectrodo, un electrodo de referencia y una pluralidad de electrodos de trabajo.
3. El método de la reivindicación 1, en el que la clase de sensor se compone de electrodos impresos en PCB.
4. El método de la reivindicación 2, en el que la clase de sensor se compone de electrodos impresos en PCB.
5. El método de la reivindicación 1, en el que el aptámero se selecciona para exhibir un cambio conformacional, es decir, cambiar la proximidad del aptámero al sensor, en presencia de un analito.
6. El método de la reivindicación 2, en el que el aptámero se selecciona para exhibir un cambio conformacional, es decir, cambiar la proximidad del aptámero al sensor, en presencia de un analito.
7. El método de la reivindicación 3, en el que el aptámero se selecciona para exhibir un cambio conformacional, es decir, cambiar la proximidad del aptámero al sensor, en presencia de un analito.
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