ES2949696T3 - Liposomas cargados positivamente como portadores de moléculas lipofílicas - Google Patents
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Abstract
Un método para producir vesículas de liposomas cargadas positivamente para usar como portadores de moléculas lipófilas. Una mezcla de fosfolípidos hidrogenados, un excipiente catiónico y una molécula lipófila se disuelven en un disolvente para formar una composición. La composición se seca para eliminar el disolvente. La composición seca se hidrata para formar vesículas de liposomas y opcionalmente las vesículas de liposomas se homogeneizan para formar vesículas más pequeñas. Las vesículas son útiles para administrar moléculas lipófilas, tales como, entre otras, luteína y zeaxantina, a tejidos oculares usando iontoforesis. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Liposomas cargados positivamente como portadores de moléculas lipofílicas
Solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad para la solicitud de patente de Estados Unidos núm. de serie 62/295,253 presentada el 15 de febrero de 2016.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere generalmente a liposomas bioactivos adecuados para el suministro a tejidos y a un método para su producción y, más específicamente, a liposomas cargados positivamente útiles como portadores de moléculas lipofílicas y particularmente para su aplicación para suministrar moléculas lipofílicas, tales como carotenoides, a través de iontoforesis a los tejidos oculares mediante el uso de iontoforesis.
La luteína se asocia con la reducción del riesgo de desarrollar AMD (degeneración macular relacionada con la edad) y extracción de cataratas debido a sus efectos antioxidantes y fotoprotectores, y su distribución exclusiva en la mácula ocular [Kijlstra A., Tian Y., Kelly E. R., Berendschot T. T. 2012. Lutein: more than just a filter for blue light. Prog Retin Eye Res. 31:303-315]. La luteína se ha usado ampliamente a través de la suplementación oral con el fundamento de que la circulación sistémica puede llevar la luteína a la circulación coroidea para su absorción en la mácula, a través de la proteína de unión a xantofila [Yemelyanov A. Y., Katz N. B., Bernstein P. S. 2001. Ligandbinding characterization of xanthophyll carotenoids to solubilized membrane proteins derived from human retina. Exp Eye Res. 72:381-392]. Sin embargo, varios informes demuestran que solo un pequeño porcentaje de luteína llega a la mácula [Bone R. A., Landrum J. T., Guerra L. H., Ruiz C. A. 2003. Lutein and zeaxanthin dietary supplements raise macular pigment density and serum concentrations of these carotenoids in humans. J Nutr. 133:992-998; Landrum J. T., Bone R. A., Joa H., Kilburn M. D., Moore L. L., Sprague K. E. 1997. A one year study of the macular pigment: the effect of 140 days of a lutein supplement. Exp Eye Res. 65:57-62; Ma L., Lin X. M. 2010. Effects of lutein and zeaxanthin on aspects of eye health. J Sci Food Agric. 90:2-12]. Además, debido a los límites de la barrera ocular, los tratamientos terapéuticos en el segmento posterior del ojo son difíciles. Dado que el ojo está protegido por la película lagrimal, las barreras corneal, vítrea, hematorretiniana y hematoacuosa, es muy difícil suministrar medicamentos al ojo, particularmente a la retina, en concentraciones suficientes y con efectos secundarios mínimos [Barar J., Javadzadeh A. R., Omidi Y. 2008. Ocular novel drug delivery: impacts of membranes and barriers. Expert Opin Drug Deliv. 5:567-581; de la Fuente M., Ravina M., Paolicelli P., Sanchez A., Seijo B., Alonso M. J. 2010. Chitosan-based nanostructures: a delivery platform for ocular therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 62:100-117]. Se han usado aplicaciones in-situ para superar este problema; sin embargo, los sistemas de suministro lento, tales como los implantes, son muy invasivos y costosos. Recientemente, se han usado inyecciones intravítreas de luteína/zeaxantina para teñir membranas prerretinianas específicas y otras estructuras oculares [Sousa-Martins D., Maia M., Moraes M., Lima-Filho A. A., Rodrigues E. B., Chen J., Farah M. E., Santos L. B., Belfort R., Jr. 2012. Use of lutein and zeaxanthin alone or combined with Brilliant Blue to identify intraocular structures intraoperatively. Retina.
32:1328-1336; Rodrigues E. B., Costa E. F., Penha F. M., Melo G. B., Bottos J., Dib E., Furlani B., Lima V. C., Maia M., Meyer C. H., Hofling-Lima A. L., Farah M. E. 2009. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol.
54:576-617; Maia M., Furlani B. A., Souza-Lima A. A., Martins D. S., Navarro R. M., Belfort R., Jr. 2014. Lutein: a new dye for chromovitrectomy. Retina. 34:262-272; Badaro E., Furlani B., Prazeres J., Maia M., Lima A. A., Souza-Martins D., Muccioli C., Lucatto L. F., Belfort R., Jr. 2014. Soluble lutein in combination with brilliant blue as a new dye for chromovitrectomy. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 252:1071-1078]. Estos han sido los primeros datos sobre el suministro in-situ de luteína hacia la mácula, al aprovechar el efecto de tinción intrínseco de la luteína. El potencial de la luteína/zeaxantina de retrasar la progresión de la AMD y la supuesta acción neuroprotectora mostrada en diferentes ensayos aún no se ha demostrado mediante aplicación in-situ después del suministro intraocular. La inyección intravítrea de luteína con fines preventivos puede ser una forma demasiado invasiva de suministrar luteína hacia la mácula, con la desventaja de una mala aceptación por parte del paciente.
La iontoforesis es una tecnología que utiliza energía eléctrica controlada de bajo nivel para transportar fármacos ionizados a través de una membrana biológica [Eljarrat-Binstock E., Domb A. J. 2006. Iontophoresis: a non-invasive ocular drug delivery. J Control Release. 110:479-489]. Se han creado diferentes sistemas de suministro de iontoforesis para uso oftálmico y se han usado para suministrar medicamentos de manera segura y efectiva a los segmentos anterior y posterior del ojo humano [Eljarrat-Binstock E., Domb A. J. 2006. Iontophoresis: a non-invasive ocular drug delivery. J Control Release. 110:479-489]. Con esta tecnología, es posible suministrar cantidades significativas de macromoléculas, a través de la córnea y la esclerótica. Lo que se necesita es una forma novedosa y estable de luteína/zeaxantina que esté cargada, de modo que el dispositivo de iontoforesis pueda impulsar altas concentraciones de las partículas cargadas de luteína/zeaxantina por vía transcleral y/o transcorneal. Otras sustancias lipófilas, tales como carotenoides, moléculas antiinflamatorias o compuestos antiangiogénicos, también pueden suministrarse al ojo mediante iontoforesis mediante el uso del mismo vehículo descrito en la presente descripción.
El documento WO 2016/100972 (publicado después de la fecha de prioridad de la presente invención) describe el suministro intraocular de moléculas bioactivas mediante el uso de iontoforesis.
Resumen de la invención
Debido a que la luteína/zeaxantina son moléculas de gran peso molecular, lipofílicas e insolubles en agua, el suministro de estos carotenoides a través de la iontoforesis sin modificaciones es casi imposible. Para superar eso, desarrollamos una formulación con vesículas liposomales cargadas positivamente que se comportan como portadores de moléculas de luteína/zeaxantina, con el objetivo de facilitar el suministro de luteína al ojo. Este nuevo producto se usará como ingrediente activo en aplicaciones iontoforéticas oculares. La estructura liposomal se formó mediante el uso de fosfatidilcolina hidrogenada en combinación con un excipiente catiónico (octadecilamina) y luteína/zeaxantina cristalina, mientras se generaba una partícula cargada positivamente, lo que crea de esta manera una estructura capaz de transportar luteína/zeaxantina, u otras moléculas lipofílicas, para pasar a través de las células de la córnea y la esclerótica.
El objetivo de este trabajo fue desarrollar una nueva formulación de luteína liposómica cargada (en lo sucesivo denominada Lipo+) que tuviera una alta concentración de luteína. En particular, analizamos la estabilidad y el perfil toxicológico de esta nueva formulación.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un diagrama esquemático de la producción de liposomas a través de la hidratación de lípidos seguida de homogeneización y reducción del tamaño de las vesículas; MLV - vesículas multilamelares, LUV -vesículas unilamelares grandes, SUV -vesículas unilamelares pequeñas (adaptado de Lopes y otros 13).
La figura 2 es un gráfico de la distribución de tamaños de la formulación A1 después de la esterilización; el diámetro medio de los liposomas en la formulación A1 fue 222,2 nm, desviación estándar 180,9 nm (81,40 %). La figura 3 es un gráfico de la historia del potencial zeta de la formulación A1 después de la esterilización; el potencial zeta promedio de la formulación A1 fue de -8,10 mV, el cambio de fase promedio fue de 6,74 rad/s y la movilidad promedio fue de -0,60 M.U.
La figura 4 es un gráfico de la distribución de tamaños de la formulación A2 después de la esterilización; el diámetro medio de los liposomas en la formulación A2 fue 622,1 nm, desviación estándar 424,3 nm (68,20 %). La figura 5 es un gráfico de la historia del potencial zeta de la formulación A2 después de la esterilización; el potencial zeta promedio de la formulación a 2 fue de -6,34 mV, el cambio de fase promedio fue de 5,21 rad/s y la movilidad promedio fue de -0,47 M.U.
La figura 6 es un gráfico de la distribución de tamaños de la formulación B1 después de la esterilización; el diámetro medio de los liposomas en la formulación B1 fue 194,4 nm, desviación estándar 142,5 nm (73,30 %). La figura 7 es un gráfico de la historia del potencial zeta de la formulación B1 después de la esterilización; el potencial zeta promedio de la formulación B1 fue 36,93 mV, el cambio de fase promedio fue -37,87 rad/s y la movilidad promedio fue 2,75 M.U.
La figura 8 es un gráfico de la distribución de tamaños de la formulación B2 después de la esterilización; el diámetro medio de los liposomas en la formulación B2 fue 2481,7 nm, desviación estándar 1516,3 nm (61,10 %). La figura 9 es un gráfico de la historia del potencial zeta de la formulación B2 después de la esterilización; el potencial zeta promedio de la formulación B2 fue 3,64 mV, el cambio de fase promedio fue -3,16 rad/s y la movilidad promedio fue 0,27 M.U.
Las figuras 10A y 10B son gráficos de las variaciones de pH y osmolalidad, respectivamente, de muestras de Lipo+ durante 6 meses a temperatura ambiente; los errores estándar de dos réplicas se muestran como barras de error.
Las figuras 11A y 11B son gráficos de las variaciones de pH y osmolalidad, respectivamente, de muestras de Lipo+ durante 6 meses a temperatura ambiente; los errores estándar de dos réplicas se muestran como barras de error.
Las figuras 12A y 12B son gráficos de las variaciones de pH y osmolalidad, respectivamente, después del experimento de fotoestabilidad; el pH y la osmolalidad de Lipo+ no han cambiado después de la exposición a la luz cuando la emulsión se mantuvo en viales ámbar o transparentes; los errores estándar de dos réplicas se muestran como barras de error.
La figura 13 es un gráfico de viabilidad celular después de 30 y 120 min de incubación con diluciones Lipo+; el medio con SDS al 0,02 % y PBS 100 mM se usó como control positivo y negativo respectivamente; los errores estándar de los experimentos por triplicado se muestran como barras de error.
Descripción detallada de las modalidades preferidas
El término "molécula lipofílica", como se usa en la presente descripción, se refiere a compuestos que se disuelven en lípidos, grasas, aceites y solventes no polares. La molécula lipofílica puede ser un agente farmacéuticamente activo, un fármaco, un agente de formación de imágenes, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, un compuesto o una composición. Un ejemplo no limitante de una molécula lipofílica es la luteína. La molécula lipofílica puede comprender entre aproximadamente el 0,001 % y el 10 % en peso de la composición de liposomas. Dicho de otra manera, la molécula lipofílica puede comprender entre aproximadamente b.cde % y ab % en peso de la composición
de liposomas, en donde a es 0 o 1 y b, c, d y e se seleccionan de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 con la excepción de que todo b, c, d y e son 0 cuando a es 1 y no todos a, b, c, d y e son 0.
El término "liposomas", como se usa en la presente descripción, se refiere a bicapas lipídicas concéntricas únicas o múltiples que encapsulan un compartimento acuoso. El liposoma puede incluir lípidos y tensioactivos naturales y/o sintéticos. Los liposomas atrapan la molécula lipofílica en la membrana lipídica. El tamaño de estas vesículas lipídicas casi esféricas de la presente invención puede estar en el intervalo entre 50 y 450 nm. Expresado de otra manera, el tamaño de los liposomas de la presente invención está en el intervalo entre aproximadamente ab nm a aproximadamente cde nm, en donde a se selecciona de 5, 6, 7, 8 y 9, b se selecciona de 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, c se selecciona entre 0, 1, 2, 3 y 4, d se selecciona entre 0, 1, 2, 3, 4 y 5 y e se selecciona entre 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9 excepto cuando c es 4 y d es 5 en cuyo caso es 0. Por supuesto, no todos los de a, b, c, d y e pueden ser 0. El término "líquido formador de película lipídica" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier líquido que contiene lípidos que forma una película al secarse. Los ejemplos no limitantes de líquidos formadores de películas lipídicas incluyen fosfolípidos solubilizados, que incluyen lecitina y lisolecitina.
El término "solvente", tal como se usa en la presente descripción, se refiere a solventes en los que la molécula lipofílica es soluble y que pueden eliminarse por evaporación. Ejemplos no limitantes de solventes son cloroformo, metanol y tetrahidrofurano.
El término "excipientes catiónicos", como se usa en la presente descripción, se refiere a lípidos catiónicos con cadenas hidrocarbonadas que tienen longitudes de entre aproximadamente 8 y 18 carbonos, ya sea saturado o monosaturado y monovalente o multivalente. Un ejemplo de excipiente catiónico es la octadecilamina.
Ejemplos
Materiales y métodos
Químicos y reactivos. La película lipídica se preparó mediante el uso de fosfolipón 90H (Lipoid GmbH), octadecilamina (Sigma-Aldrich) y luteína cristalina (Kemin Health, FloraGLO® luteína cristalina) disuelta en cloroformo (CHCh) (Sigma-Aldrich) y metanol (MeOH) (Sigma-Aldrich). La hidratación de los lípidos se realizó mediante la adición de i) agua destilada (Water Ultrapure - MilliQ-by AquaMax - conductividad 0,054 uS/cm); ii) una solución tampón de fosfato compuesta por fosfato de sodio monobásico dihidratado (Sigma-Aldrich) y fosfato de sodio dibásico dihidratado (Sigma-Aldrich) o iii) estas soluciones complementadas con Tween 80 (Sigma-Aldrich). Formulación de liposomas de luteína. En este trabajo se prepararon cinco formulaciones diferentes de luteína encapsulada en liposomas (enumeradas en las tablas 1, 2 y 3). La película lipídica se preparó mediante el uso de fosfolipón 90H, octadecilamina y luteína disueltos en CHCh/MeOH (2:1 v/v). Los solventes se eliminaron al vacío mediante evaporación rotatoria; la solución se secó al vacío a 40 °C mediante un rotavapor Heidolph. La velocidad del rotavapor se moduló para reducir la formación de burbujas y chorros que podrían causar pérdida de producto, y se obtuvo una película fina y seca después de 1-2 horas. Para eliminar cualquier traza de solventes, la película fina se dejó al vacío durante al menos 16 horas a temperatura ambiente. La hidratación de la película lipídica se realizó mediante la adición de diferentes solventes (agua, tampón de fosfato o tampón de fosfato con Tween 80) a 40-45 °C a la película de lípidos para formar grandes vesículas liposomales. La homogeneización de las vesículas liposomales grandes se logró mediante el uso del homogeneizador digital Ika Works ULTRA-TURRAX T 25 (Staufen, Alemania), y la reducción de las vesículas liposomales a un intervalo de tamaño nanométrico se realizó por extrusión mediante el uso de un procesador de alto fluido Microfluidizer® M-110EH a 50- 60 °C y 1200 bar. Este proceso se repitió 5 veces. La esterilización de la emulsión se realizó a 121 °C durante 20 minutos a 1 atm. Las diferentes etapas del proceso de producción de liposomas se representan en la figura 1. Después de la esterilización, se registraron las características de las diferentes vesículas liposomales: pH
(mediante el uso de un instrumento Mettler Toledo S20), osmolalidad (mediante el uso de un Osmomat 3000), tamaño de partícula y potencial zeta (mediante el uso de dispersión dinámica de luz (DLS), también conocida como técnica de espectroscopía de correlación de fotones - Nicomp 380 DLS).
Tabla 1. Composición de emulsiones de liposomas de luteína (mediante el uso de octadecilamina al 0,001 %).
Tabla 2. Composición de emulsiones de liposomas de luteína (mediante el uso de octadecilamina al 0,005 %).
Tabla 3. Composición de emulsiones de liposomas de luteína (mediante el uso de octadecilamina al 0,007 %).
Estudios de termoestabilidad. Varios parámetros determinan la termoestabilidad de una formulación: apariencia, color, olor, osmolalidad y pH. Todos estos parámetros se evaluaron para la emulsión preparada en dos estudios: un estudio de estabilidad de 6 meses realizado a temperatura ambiente (21 °C ± 2) con 3 puntos de tiempo diferentes: 1 mes, 3 meses y 6 meses; y un estudio acelerado de 6 meses a 52 °C con 2 puntos de tiempo diferentes: 3 meses y 6 meses. Este estudio acelerado se implementó bajo condiciones de almacenamiento exageradas para simular el almacenamiento por un período mucho más largo que 6 meses.
Estudios de fotoestabilidad. El propósito de este estudio fue determinar si la emulsión Lipo+ era sensible a la luz del día, mediante la evaluación de los mismos parámetros usados en la prueba de termoestabilidad (aspecto, color, olor, osmolalidad y pH) de acuerdo con la Guía ICH Q1B [GUIA TRIPARTITA ARMONIZADA DE ICH. 1996. PRUEBA DE ESTABILIDAD: PRUEBAS DE FOTOESTABILIDAD DE NUEVOS FÁRMACOS Y PRODUCTOS]. En este estudio, se simuló la degradación de la luz del día mediante la irradiación de muestras con luz UV y luz visible durante 48 h, mediante el uso de una muestra no irradiada como control. La formulación de Lipo+ se expuso, tanto en viales de vidrio ámbar y transparente como por triplicado, a luz UV/Vis durante 48h en una cámara de fotoestabilidad (Industrial Laborum, Ibérica) (iluminación global >1,2 klux/h). De acuerdo con la directriz, las muestras deben exponerse una al lado de la otra con un sistema actinométrico químico validado para garantizar que se alcance la exposición mínima a la luz, o durante el tiempo adecuado cuando las condiciones se hayan monitoreado mediante el uso de radiómetros/luxómetros calibrados. Se usaron dos soluciones al 2 % (p/v) de Quinina-HCl (Acros Organics lote A0311764) como controles actinométricos y se expusieron a condiciones de luz o sin luz, esta última envuelta en papel de aluminio. Con esta prueba, es posible determinar si el tiempo de exposición fue suficiente para causar una posible degradación mediante la medición de Abs400nm. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de Excel de Microsoft y se calculó la desviación estándar para cada condición. Estudios de citotoxicidad. Mediante el uso de un modelo in vitro, evaluamos el perfil de seguridad de la emulsión Lipo+. Estos experimentos de citotoxicidad in vitro se realizaron mediante el uso de una línea celular del epitelio pigmentario de la retina humana
(ARPE-19, CRL-2302, ATCC, Manassas, VA), ya que se trata de una línea celular establecida que corresponde al mismo tipo de células diana en las que estará el producto final en contacto con. La toxicidad celular se evaluó con el ensayo colorimétrico WST-1 (Cell Proliferation Reagent WST-1, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las células ARPE-19 se sembraron a 12 * 103 células/cm2 en placas de 96 pocillos. Después de 12 h de crecimiento, se aplicaron 4 diluciones de Lipo+ (1/15; 1/30; 1/60; 1/120) durante 30 y 120 min. Posteriormente, las células se lavaron con medio basal y se incubaron durante 24, 48 y 72 h. Después de este período de recuperación, los cultivos celulares se lavaron 4 veces con medio basal y se añadió medio completo nuevo que contenía un 10 % de reactivo (WST-1). Después de 3-4 h de incubación, se midió la absorbancia a 450 nm mediante el uso de un lector de placas TECAN. Se usó cultivo celular que contenía SDS al 0,02 % como control positivo para citotoxicidad y medio de cultivo completo con PBS 100 mM como control negativo. Para las muestras de prueba, los experimentos se realizaron por triplicado y para los controles se evaluaron 6 réplicas. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de Excel de Microsoft y se calculó la desviación estándar para cada condición de prueba.
Resultados
Formulación A1. Después de la esterilización, se investigó el perfil de la formulación A1. Se analizó el tamaño de partícula y el diámetro medio de los liposomas en esta formulación fue de 222,2 nm (Figura 2). El potencial zeta promedio, que es la carga que se desarrolla en la interfaz entre una superficie sólida y su medio líquido, fue de -8,10 mV, lo que significa que la formulación A1 es una emulsión aniónica (Figura 3). La tabla 4 resume las características de esta formulación.
Tabla 4. Resumen de las características de la formulación A1 después de la esterilización.
Formulación A2. La tabla 5 resume las características de la formulación A2 después de la esterilización. Se analizó el tamaño de partícula y el diámetro medio de los liposomas en esta formulación fue de 622,1 nm (Figura 4). El análisis del potencial zeta reveló que la formulación a 2 es una emulsión aniónica (-6,34 mV) (Figura 5).
Tabla 5. Resumen de las características de la formulación A2 después de la esterilización.
Formulación B1. Las características de la formulación B1 también se analizaron después de la esterilización. El diámetro medio de los liposomas en esta formulación fue de 194,4 nm (Figura 6). La figura 7 muestra el análisis del potencial zeta que revela que la formulación B1 es una emulsión catiónica (+36,93 mV). La tabla 6 revisa el perfil de la formulación B1.
Tabla 6. Resumen de las características de la formulación B 1 después de la esterilización.
Formulación B2. La tabla 7 resume las características de la formulación B2 después de la esterilización. La figura 8 representa el diámetro medio de los liposomas; esta formulación fue la de mayor tamaño de partícula, con un promedio de 2481,7 nm. El análisis del potencial zeta reveló que la formulación B2, al igual que la formulación B1, también es una emulsión catiónica (+3,64 mV) (Figura 9).
Tabla 7. Resumen de las características de la formulación B2 después de la esterilización.
Formulación C1. Después de la esterilización, se caracterizó el perfil de Lipo+. Se analizó el tamaño de partícula y el diámetro medio de los liposomas en la formulación fue de 337 nm. El potencial zeta promedio, que es la carga que se desarrolla en la interfaz entre una superficie sólida y su medio líquido, fue de 3,45 mV, lo que significa que es una emulsión catiónica. La tabla 8 resume las características de la formulación
Tabla 8. Resumen de las características de la formulación C1 después de la esterilización.
La tabla 9 revisa las características después de la esterilización de las 4 formulaciones.
Tabla 9. Resumen de las características de todas las formulaciones liposomales después de la esterilización.
Estudios de termoestabilidad. Los estudios de estabilidad evaluaron si las características de la emulsión cambiaron con el tiempo cuando se sometieron a diferentes condiciones de temperatura. Las características de Lipo+ tales como apariencia, color, olor, pH y osmolalidad se evaluaron durante 6 meses en dos estudios independientes realizados a temperatura ambiente (“ 20 °C) y 52 °C (estudio acelerado).
Las características de Lipo+ después de 1, 3 y 6 meses a temperatura ambiente se resumen en la tabla 10 y la figura 10. Durante los primeros 3 meses, se mantuvo el pH inicial y se detectaron cambios menores después de 6 meses. Para la osmolalidad, los cambios fueron más pronunciados, lo que sugiere que podrían ser necesarias mejoras en la formulación para estabilizar la osmolalidad.
Tabla 10. Características Lipo+ al inicio del estudio (tiempo cero) y después de 1, 3 y 6 meses a temperatura ambiente.
Para el estudio de estabilidad a 52 °C, los resultados se presentan en la tabla 11 y la figura 11, para los puntos temporales de 3 y 6 meses. En este estudio, la formulación mostró ser inestable a temperaturas más altas ya que el color y la apariencia cambiaron después de 3 meses a 52 °C. Una vez más, el pH mostró menos variación a lo largo del tiempo que la osmolalidad, lo que indica que este parámetro debe mejorarse.
Tabla 11. Características Lipo+ al inicio del estudio (tiempo cero) y después de 3 y 6 meses a 52 °C.
Estudios de fotoestabilidad. Las muestras de Lipo+ y de control se sometieron a luz (UV/Vis) en una cámara de fotoestabilidad. Después de 48 horas de exposición, se evaluó la degradación de Quinina-HCl mediante la medición de Abs400nm. Este parámetro estuvo por encima de 0,5 (Abs400nm = 0,596) lo que indica que el tiempo de exposición fue suficiente para causar degradación en las muestras expuestas a las mismas condiciones que el control actinométrico.
Se evaluó la apariencia, el color y el olor de Lipo+ y se reveló que la formulación era estable después de la exposición con mantenimiento de las características iniciales (aspecto: solución homogénea viscosa; color: naranja, olor: herbal) cuando se mantuvo en viales ámbar o transparentes (Tabla 12). Asimismo, los valores de pH no cambiaron significativamente para viales transparentes expuestos o no a la luz. Para los viales ámbar, se observó un cambio en el pH entre los viales expuestos y los no expuestos. En cuanto a los valores de osmolalidad, los cambios fueron más visibles entre los viales de exposición con luz y sin luz, para ámbar o transparente. Los resultados se muestran en la figura 12.
Tabla 12. Características de Lipo+ después de estudios de fotoestabilidad: comparación entre muestras expuestas a la luz y no expuestas a la luz en viales de vidrio ámbar o transparente.
Estudios de citotoxicidad. La prueba de citotoxicidad in vitro se realizó en Lipo+ mediante el uso del método de contacto directo en líneas de cultivo de células epiteliales del pigmento retinal humano (ARPE-19). La citotoxicidad se midió mediante el uso del método WST-1. Este ensayo identifica cambios en la respuesta metabólica celular de acuerdo con la actividad mitocondrial, lo que brinda una evaluación muy aproximada de la citotoxicidad in vitro de este tipo de soluciones. Las células se lavaron y se dejaron recuperar durante 24, 48 y 72 horas después del contacto con diluciones de Lipo+ durante 30 y 120 min, así como también con controles positivos y negativos. Las diluciones usadas se eligieron teniendo en cuenta el volumen de líquido dentro del ojo (4 ml) e infiriendo la cantidad de solución que penetrará en el ojo del paciente después de la aplicación iontoforética [Molokhia S. A., Jeong E. K., Higuchi W. I., Li S. K. 2009. Transscleral iontophoretic and intravitreal delivery of a macromolecule: study of ocular distribution in vivo and postmortem with MRI. Exp Eye Res. 88:418-425].
Como se muestra en la figura 13, los resultados no revelan ningún efecto citotóxico de Lipo+ ya que la viabilidad celular no se redujo con ninguna de las diluciones probadas en contacto directo con las células, en comparación con los controles. Las muestras analizadas fueron diluciones de la emulsión esterilizada final que se pretende usar para los experimentos posteriores en el proyecto de iontoforesis.
Discusión
Nuestro objetivo es desarrollar una nueva forma de suministrar una alta concentración de luteína/zeaxantina a la retina para que su presencia en la mácula pueda mejorar significativamente, con el objetivo de prevenir la aparición y/o progresión de AMD y también para proteger el células endoteliales de la retina. Para ello usaremos la iontoforesis ocular, que es una técnica basada en el principio general de que cargas similares se repelen entre sí y cargas diferentes se atraen entre sí.
La emulsión Lipo+ se produjo teniendo en cuenta que se ha demostrado que las partículas positivas son mejores candidatas para la aplicación iontoforética como portadores de fármacos que las partículas cargadas negativamente debido a una mayor penetración en los tejidos oculares [Eljarrat-Binstock E., Orucov F., Aldouby Y., Frucht-Pery J., Domb A. J. 2008. Charged nanoparticles delivery to the eye using hydrogel iontophoresis. J Control Release.
126:156-161]. Además, el campo eléctrico obliga a las moléculas cargadas positivamente a moverse hacia las membranas oculares que están cargadas negativamente [Nicoli S., Ferrari G., Quarta M., Macaluso C., Santi P.
2009. In vitro transscleral iontophoresis of high molecular weight neutral compounds. Eur J Pharm Sci. 36:486-492]. Para superar la dificultad del suministro de luteína a través de la iontoforesis (ya que esta molécula no tiene carga) hemos producido vesículas liposomales con carga positiva (potencial zeta = 3,45 mV) que se comportan como portadores de moléculas de luteína. Estudios previos han demostrado que a pH 3, el transporte en la dirección de cátodo a ánodo fue significativamente mayor que el de ánodo a cátodo [Gungor S., Delgado-Charro M. B., Ruiz-Perez B., Schubert W., Isom P., Moslemy P., Patane M. A., Guy R. H. 2010. Trans-scleral iontophoretic delivery of low molecular weight therapeutics. J Control Release. 147:225-231], lo que sugiere que Lipo+ (pH = 4,3) tiene las características indicadas para usarse en el suministro iontoforético de luteína.
Para comprender mejor las características de la nueva formulación, así como también inferir la vida útil del producto, se realizaron dos estudios de estabilidad durante 6 meses. Además, también se realizó un estudio de fotoestabilidad de la formulación final. De todas las características estudiadas, solo la osmolalidad se mostró muy afectada por la temperatura y/o la luz. Estos resultados indican la necesidad de estabilizar la osmolaridad de esta formulación. Dado que esta nueva formulación se usará como ingrediente activo en aplicaciones iontoforéticas oculares, es muy importante evaluar el perfil de seguridad de Lipo+ cuando entra en contacto con las células diana del ojo humano. Se realizaron experimentos in vitro de citotoxicidad in vitro, mediante el uso de una línea de células epiteliales pigmentadas de retina humana incubadas con diferentes diluciones de Lipo+. Los resultados no mostraron ningún efecto citotóxico en la línea celular estudiada para diferentes tiempos de incubación y diluciones, lo que demuestra que Lipo+ tiene un perfil seguro en modelos de cultivo celular. Estos resultados sugieren que esta formulación de Lipo+ es una candidata prometedora para usarla en el suministro intraocular de luteína/zeaxantina.
Claims (4)
1. Un método para producir vesículas liposomales cargadas positivamente para su uso como portadores de carotenoides, que comprende las etapas de:
(a) disolver en un solvente una mezcla de fosfolípidos hidrogenados, un excipiente catiónico y un carotenoide para formar una composición, en donde el excipiente catiónico es octadecilamina;
(b) secar la composición para eliminar el solvente;
(c) hidratar la composición seca mediante el uso de una solución tampón de fosfato que comprende fosfato de sodio monobásico dihidratado y fosfato de sodio dibásico dihidratado para formar vesículas liposomales y, opcionalmente, homogeneizar las vesículas liposomales; y
(d) esterilizar las vesículas.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el carotenoide se selecciona del grupo que consiste en luteína y zeaxantina.
3. Una formulación de vesículas liposomales cargadas positivamente preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 para su uso en un método de tratamiento de enfermedades oculares mediante el suministro de la formulación a los tejidos oculares por iontoforesis.
4. Una formulación de vesículas liposomales cargadas positivamente para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el carotenoide es luteína cristalina y en donde las vesículas se transportan a través de las células de la córnea y la esclerótica.
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