ES2940189T3

ES2940189T3 - Método para hibridar una molécula de ácido nucleico

Info

Publication number: ES2940189T3
Application number: ES16722806T
Authority: ES
Inventors: Christian Korfhage; Evelyn Fricke
Original assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Current assignee: Miltenyi Biotec GmbH
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-25
Publication date: 2023-05-04
Anticipated expiration: 2036-04-25
Also published as: EP3286331A1; WO2016170181A1; EP3286331B1; US20180087099A1

Abstract

La presente invención se refiere a un método para hibridar una molécula de ácido nucleico con otra molécula de ácido nucleico y al uso de una molécula de ácido nucleico para reducir y/o evitar la formación de estructuras en horquilla de una molécula diana de ácido nucleico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para hibridar una molécula de ácido nucleico

La presente invención se refiere a un método para hibridar una molécula de ácido nucleico con otra molécula de ácido nucleico y al uso de una molécula de ácido nucleico para reducir y/o evitar la formación de estructuras de horquilla de una molécula diana de ácido nucleico.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la biología molecular, más particularmente a la hibridación de moléculas de ácido nucleico.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

En el campo de la biología molecular o recombinante, para muchas tareas es necesario hibridar moléculas de ácido nucleico entre sí.

La hibridación de nucleótidos (en lo sucesivo "hibridación") es una reacción bimolecular en la que moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) monocatenario de secuencias de nucleótidos complementarias o al menos parcialmente complementarias se hibridan entre sí. Tanto la replicación del ADN como la transcripción de ADN en ARN se basan en la hibridación, al igual que las técnicas de biología molecular, incluyendo las transferencias Southern y las transferencias Northern, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la mayoría de los enfoques para la secuenciación del ADN. En otras técnicas, las secuencias cortas de ADN se hibridan con los mARNs celulares para identificar los genes expresados. El ARN antisentido también se usa para unirse al mARN no deseado, evitando que el ribosoma traduzca el mARN en proteína.

Los métodos para hibridar una molécula de ácido nucleico se conocen a partir de los documentos de Patente US 2015/045254, US 2007/190548, US 2004/132067, y Yi et al. (2006 Nucleic Acid Research Vol. 34, No. 11 p. 1-5, y Malhotra et al. (2014) J. Mol. Genet. Med. vol. 4 ls. 4 p. 1-9.

Sin embargo, cada una de las moléculas de ácido nucleico monocatenario implicadas en la reacción de hibridación puede formar estructuras secundarias tales como tallo-bucle u horquillas, respectivamente, por apareamiento de bases intramolecular. Se produce cuando dos regiones de la misma cadena, generalmente complementarias en la secuencia de nucleótidos cuando se leen en direcciones opuestas, se aparean para formar una doble hélice que termina en un bucle no apareado. La estructura resultante es un bloque de construcción clave de muchas estructuras secundarias de ARN.

La formación de una estructura de horquilla depende de la estabilidad de las regiones de hélice y bucle resultantes. El primer requisito previo para la formación de una estructura de horquilla es la presencia de una secuencia que pueda plegarse sobre sí misma dando como resultado una doble hélice emparejada. La estabilidad de esta hélice está determinada por su longitud, el número de desajustes o protuberancias que contiene y la composición de bases de la región emparejada. Los emparejamientos entre guanina y citosina tienen tres enlaces de hidrógeno y son más estables en comparación con los emparejamientos de adenina-uracilo, que tienen solo dos. En el ARN, los emparejamientos de adenina-uracilo que presentan dos enlaces de hidrógeno son iguales a un enlace adenina-timina del ADN.

Las estructuras de horquilla del ADN circular se estabilizan mediante el llamado superenrollamiento. El superenrollamiento se refiere al enrollamiento excesivo o insuficiente de una cadena de ácido nucleico y es una expresión de la tensión en esa cadena.

La formación de estructuras secundarias intramoleculares, tales como estructuras de horquilla, influye negativamente en la eficacia de los procesos de hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico individuales. Cuantas más estructuras de horquilla estables se forman en una molécula de ácido nucleico, más lenta se produce la formación de híbridos entre dicha molécula de ácido nucleico y otra molécula de ácido nucleico.

La formación de estructuras secundarias intramoleculares es un problema particular en las reacciones de hibridación en las que una de las dos moléculas de ácido nucleico implicadas en la reacción de hibridación se inmoviliza sobre un soporte sólido. Gao et al. (2006), Secondary structure effects on ADN hybridization kinetics: a solution versus surface comparison, Nucleic Acids Res. 5,34(11):3370-3377, describen que en diferentes sistemas se puede medir una velocidad de hibridación que se reduce de 20 a 40 veces si una de las cadenas de ácido nucleico que se va a hibridar se inmoviliza sobre un soporte sólido. Si, por ejemplo, oligonucleótidos cortos se inmovilizan sobre un soporte sólido y una molécula de ácido nucleico de cadena sencilla larga que no está inmovilizada en una solución circundante, que debe hibridarse con el oligonucleótido inmovilizado, se puede observar la siguiente situación: la región de hibridación es corta debido a la brevedad de los oligonucleótidos que se inmovilizaron al soporte sólido. Una longitud utilizada frecuentemente de la parte de hibridación de las moléculas de oligonucleótidos inmovilizadas es de aproximadamente 15 a 35 nucleótidos. Por otro lado, las cadenas sencillas largas de ácido nucleico están en solución. Una longitud utilizada frecuentemente de dichas cadenas sencillas de ácido nucleico es de 200 a 500 nucleótidos. Las cadenas sencillas largas de ácidos nucleicos tienen una mayor tendencia a formar estructuras de horquilla que las cadenas sencillas cortas de ácidos nucleicos. Las cadenas sencillas de ácido nucleico que forman estructuras de horquilla ralentizan la velocidad de hibridación y reducen el número de cadenas dobles hibridadas. Si se inmovilizan moléculas largas de ácido nucleico sobre la superficie del soporte sólido, por ejemplo en una matriz BAC, también la cadena sencilla inmovilizada formará estructuras de horquilla que darán como resultado conflictos similares de reducción de la eficacia de la hibridación.

Frente a estos antecedentes, es un objetivo fundamental de la presente invención proporcionar un método para hibridar una molécula de ácido nucleico con otra molécula de ácido nucleico con una mayor eficacia, como es el caso de los métodos actuales en la técnica.

La presente invención satisface estas y otras necesidades.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método para hibridar una molécula de ácido nucleico, que comprende

i) proporcionar una mezcla de reacción que comprende

- al menos una primera molécula de ácido nucleico que comprende al menos otra parcialmente hibridadas entre sí

- una cadena de ácido nucleico sentido que tiene

- al menos una primera secuencia de nucleótidos, y

- al menos una segunda secuencia de nucleótidos;

- una cadena de ácido nucleico antisentido que tiene al menos una tercera secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a dicha al menos segunda secuencia de nucleótidos y que es al menos parcialmente no complementaria a dicha al menos primera secuencia de nucleótidos;

- al menos una segunda molécula de ácido nucleico que tiene una cuarta secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos;

- tampón de hibridación;

ii) incubar dicha mezcla de reacción en condiciones que permitan que dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico se hibride con dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico mediante una reacción de hibridación entre dicha al menos primera secuencia de nucleótidos y dicha al menos cuarta secuencia de nucleótidos,

caracterizado porque dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico se proporciona de la siguiente manera:

- proporcionando dicha cadena de ácido nucleico de sentido,

- hibridando al menos un oligonucleótido de cebador con al menos un primer segmento de dicha segunda secuencia de nucleótidos, dicho al menos primer segmento está localizado antes y/o después de dicha primera secuencia de nucleótidos,

- extendiendo dicho oligonucleótido de cebador mediante una nucleótido polimerasa para generar dicha cadena de ácido nucleico antisentido, y

dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico está unida a un soporte sólido.

Los inventores han desarrollado un método para hibridar una molécula de ácido nucleico con otra molécula de ácido nucleico en el que, sorprendentemente, se reduce significativamente la formación de estructuras secundarias tales como estructuras de horquilla de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar. Esto da como resultado una eficiencia de hibridación considerablemente alta.

Como se usa en la presente memoria, "que hibridan" o "hibridación" se refiere al fenómeno en el que las moléculas de ácido nucleico monocatenario tales como las moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) de una secuencia de nucleótidos particular se hibrida con moléculas de ADN o ARN que comprenden secuencias de nucleótidos complementarias o parcialmente complementarias, formando así un híbrido de las dos secuencias de ácido nucleico monocatenario que da como resultado una molécula de ácido nucleico bicatenario. El proceso de hibridación se basa en la formación de puentes de hidrógeno entre las bases complementarias de los nucleótidos. Las moléculas de ácido nucleico pueden hibridarse perfectamente entre sí en caso de complementariedad perfecta o total, es decir, todos y cada uno de los nucleótidos o bases en la primera molécula se oponen al nucleótido complementario en la segunda molécula. Las moléculas de ácido nucleico pueden hibridarse parcialmente entre sí en caso de complementariedad imperfecta o parcial, es decir, no todos y cada uno de los nucleótidos o bases en la primera molécula se oponen al nucleótido o base complementarios en la segunda molécula, sin embargo, un número suficiente de nucleótidos o bases se oponen a las respectivas parejas complementarias que todavía permiten la formación de un híbrido de ácido nucleico. Además de la complementariedad de las secuencias de nucleótidos, las longitudes de las secuencias de nucleótidos, la movilidad o inmovilidad de las secuencias de nucleótidos, una reacción de hibridación requiere que se cumplan condiciones específicas adicionales determinadas por el valor de pH, la fuerza iónica, la temperatura, el tiempo, etc.

Como se usa en la presente memoria, un "ácido nucleico" o una "molécula de ácido nucleico" puede ser generalmente ADN o ARN, monocatenario o bicatenario, lineal o circular, a menos que se especifique lo contrario.

Como se usa en la presente memoria, el término "nucleótido" se refiere a los monómeros o subunidades de ácidos nucleicos como el ADN y el ARN. Nucleótido puede usarse como sinónimo de nucleósido o (mono-, di-, tri-) fosfato de nucleósido, e incluye los derivados de desoxirribosa, es decir, los dNTPs.

Como se usa en la presente memoria, una "secuencia de nucleótidos" se refiere a una concatenación de nucleótidos mediante puentes fosfodiéster.

Como se usa en la presente memoria, "parcialmente complementario" significa una secuencia de nucleótidos que es suficientemente complementaria a la secuencia de referencia, permitiendo así una reacción de hibridación entre dichas secuencias. Dichas secuencias de nucleótidos parcialmente complementarias pueden ser > 50 %, preferiblemente > 60 %, más preferiblemente > 70 %, más preferiblemente > 80 %, más preferiblemente > 90 %, más preferiblemente > 95 %, más preferiblemente > 99 %, o 100 % complementarias entre sí.

Al menos "parcialmente no complementaria" significa una secuencia de nucleótidos que es suficientemente no complementaria a la secuencia de referencia, no permitiendo así una reacción de hibridación entre dichas secuencias. Dichas secuencias de nucleótidos parcialmente no complementarias pueden ser > 50 %, preferiblemente > 60 %, más preferiblemente > 70 %, más preferiblemente > 80 %, más preferiblemente > 90 %, más preferiblemente > 95 %, más preferiblemente > 99 %, o 100 % no complementarias entre sí.

Como se usa en la presente memoria, dicha "primera molécula de ácido nucleico" es una molécula de ácido nucleico parcialmente bicatenaria y parcialmente monocatenaria. Esto se debe a que la tercera secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido no es complementaria o al menos no lo suficientemente complementaria para hibridarse con la primera secuencia de nucleótidos de la cadena con sentido. Dicha primera molécula de ácido nucleico es, al menos parcialmente, monocatenaria en regiones de la cadena con sentido que comprende o consiste en la primera secuencia de nucleótidos. Dicha primera molécula de ácido nucleico es, al menos parcialmente, bicatenaria en regiones donde dicha segunda secuencia de nucleótidos de la cadena de ácido nucleico con sentido y la tercera secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido son complementarias e hibridadas entre sí. La región monocatenaria determinada por la primera secuencia de nucleótidos se proporciona para la hibridación de la primera molécula de ácido nucleico con la segunda molécula de ácido nucleico debido a la complementariedad al menos parcial de la primera y la cuarta secuencia de nucleótidos. La tercera secuencia de nucleótidos es al menos parcialmente complementaria a dicha al menos segunda secuencia de nucleótidos. Sin embargo, al mismo tiempo, la tercera secuencia de nucleótidos no es complementaria o al menos no lo suficientemente complementaria para hibridarse con la primera secuencia de nucleótidos. Se entenderá que la cadena con sentido y/o antisentido de la primera molécula de ácido nucleico puede comprender secuencias de nucleótidos adicionales además de la primera y la segunda secuencia de nucleótidos. La primera molécula de ácido nucleico tiene preferiblemente, pero no exclusivamente, una configuración circular.

Como se usa en la presente memoria, "al menos parcialmente hibridados entre sí" significa que > 10 %, o > 20 %, o > 30 %, o > 40 %, o > 50 %, o > 60 %, o > 70 %, o > 80 %, o > 90 %, o 100 % de una secuencia de nucleótidos, en particular, la segunda secuencia de nucleótidos de la cadena con sentido de la primera molécula de ácido nucleico, está cubierta por otra secuencia de nucleótidos, en particular, la tercera secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido de la primera molécula de ácido nucleico.

Tal y como se usa en la presente memoria, la "segunda molécula de ácido nucleico" puede ser ADN o ARN monocatenario o al menos parcialmente bicatenario, libre en solución o inmovilizado mediante unión a una superficie de un soporte sólido. La segunda molécula de ácido nucleico comprende una cuarta secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos de la cadena con sentido de la primera molécula de ácido nucleico. La segunda molécula de ácido nucleico puede comprender otras secuencias de nucleótidos además de la cuarta secuencia de nucleótidos. La segunda molécula de ácido nucleico tiene preferiblemente, pero no exclusivamente, una configuración lineal.

La cadena con sentido de la primera molécula de ácido nucleico, es decir, la suma de la primera y la segunda secuencia de nucleótidos, y una cualquiera de las cadenas de la segunda molécula de ácido nucleico, es decir, la suma de la cuarta secuencia de nucleótidos y cualquier secuencia de nucleótidos adicional del segundo ácido nucleico puede comprender, puede tener una longitud de > 15, o > 40, o > 100, o > 200, o > 300, o > 400, o > 500, o > 1000, o > 2000, o > 3000, o > 4000, o > 5000 nucleótidos. De aquí, la primera secuencia de nucleótidos de la primera molécula de ácido nucleico y/o la cuarta secuencia de nucleótidos de la segunda molécula de ácido nucleico pueden tener longitudes de preferiblemente > 5, preferiblemente > 10, más preferiblemente > 15, más preferiblemente > 20, más preferiblemente > 25, más preferiblemente > 30, o > 35, o > 40, o > 50, o > 100, o > 200, o > 300, o > 400 nucleótidos. Las secuencias de nucleótidos primera y cuarta pueden hibridarse entre sí en toda su longitud o solo en una longitud de > 5, o > 10, o > 15, o > 20, o > 25, o > 30, o > 35, o > 40, o > 50, o > 100, o > 200, o > 300, o > 400 nucleótidos.

La primera, segunda, tercera y cuarta y cualquier otra secuencia de nucleótidos de la invención pueden comprender secuencias de mononucleótidos, tal como poliA, poliT, poliC, poliG, poliU, polil, etc., o secuencias de nucleótidos complejas que comprenden dos, tres, cuatro o más tipos diferentes de nucleótidos.

La cadena con sentido de la primera molécula de ácido nucleico y/o una cualquiera de las cadenas de la segunda molécula de ácido nucleico pueden tener la función de sondas o dianas en cualquier disposición molecular a establecer mediante la reacción de hibridación del método según la invención. Una disposición molecular adecuada es una matriz. Ejemplos son matrices de dos colores, NGS, micromatriz, matrices BAC, etc.

La primera y/o segunda molécula de ácido nucleico se puede proporcionar en forma purificada, en forma parcialmente purificada o contenida en un lisado sin procesar.

Como se usa en la presente memoria, "tampón de hibridación" se refiere a una solución que proporciona condiciones, en particular sales y cualquier otros compuestos, en una composición y concentración apropiadas, que permiten la hibridación de secuencias de nucleótidos complementarias o al menos parcialmente complementarias, tal como la primera con la cuarta secuencias de nucleótidos, y la segunda con la tercera secuencia de nucleótidos.

"Al menos uno", como se usa en la presente memoria, se refiere a una entidad como mínimo, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico, una secuencia de nucleótidos, etc. Sin embargo, puede haber más de una entidad, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, cien, mil, diez mil, etc. entidades.

A menos que se especifique lo contrario, las etapas individuales del método según la invención pueden llevarse a cabo secuencialmente o en otra realización simultáneamente/en paralelo, respectivamente. En una realización del método según la invención, dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico circular.

Los inventores se han dado cuenta de que el método según la invención da como resultado una mayor eficiencia de hibridación de una primera molécula de ácido nucleico con una segunda molécula de ácido nucleico a través de la complementariedad al menos parcial de sus secuencias de nucleótidos que es el caso de los métodos de hibridación de la técnica anterior. La cadena de ácido nucleico antisentido de la primera molécula de ácido nucleico cubre o enmascara las regiones de la cadena de ácido nucleico con sentido no implicadas o necesarias para la hibridación con la segunda molécula de ácido nucleico. Mediante esta cobertura o enmascaramiento, las regiones de la cadena de ácido nucleico con sentido no implicadas o no necesarias para la hibridación no son susceptibles de formar reacciones de hibridación interna de la cadena o estructuras secundarias, tal como estructuras de horquilla, que de otro modo podrían impedir o complicar la hibridación de la primera molécula de ácido nucleico con la segunda molécula de ácido nucleico.

Debido a la mayor eficiencia de hibridación, se necesita proporcionar una cantidad menor de la primera molécula de ácido nucleico en la mezcla de reacción que la que se requeriría si la segunda secuencia de nucleótidos no estuviera cubierta por la cadena de ácido nucleico antisentido.

En una realización del método según la invención, dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico circular.

Las moléculas circulares de ácido nucleico son particularmente vulnerables a las estructuras secundarias, tal como las estructuras de horquilla, ya que se estabilizan mediante un proceso de superenrollamiento. Por lo tanto, en la técnica, la hibridación de moléculas circulares de ácido nucleico es particularmente difícil. Sin embargo, el método según la invención viene al rescate. Con esta realización, incluso una primera molécula de ácido nucleico circular puede hibridarse con la segunda molécula de ácido nucleico con alta eficacia.

Tal y como se usa en la presente memoria, "molécula de ácido nucleico circular" se refiere a una molécula de ácido nucleico sin ningún extremo 3' y/o 5' libre o a una molécula de ácido nucleico en la que los extremos intramoleculares 3' y 5' se unieron previamente de forma covalente entre sí, confiriendo así a la plantilla de ácido nucleico una estructura similar de anillo o de tipo bucle.

En el método según la invención, dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico se une a un soporte sólido.

Especialmente para la inmovilización de moléculas de ácido nucleico en soportes sólidos o las superficies de los mismos mediante reacciones de hibridación, la formación de estructuras de horquilla es una barrera particular. Sin embargo, con esta medida de la invención se hace posible una hibridación eficaz incluso con soportes sólidos.

Como se usa en el presente en la presente memoria, un "soporte sólido" se refiere a cualquier soporte que comprende una superficie que puede ser plana o curva y que es capaz de recibir y unir moléculas de ácido nucleico. Se engloban los soportes sólidos de todo tipo típicamente utilizados en el campo de la inmovilización de moléculas de ácido nucleico, tales como chips planos, perlas, capilares, etc. El soporte puede ser de metal, vidrio, sílice, plástico, etc. Puede comprender también una superficie recubierta. El soporte sólido también puede comprender una superficie blanda y/o flexible.

En otra realización del método según la invención antes y/o durante dicha extensión, un oligonucleótido de bloqueo se híbrida con al menos un segundo segmento de dicha segunda secuencia de nucleótidos, dicho segundo segmento está localizado después de dicho primer segmento, preferiblemente adyacente al último, y preferiblemente dicha polimerasa no muestra actividad de desplazamiento de cadena ni actividad de exonucleasa 5'-3'.

Con esta medida se toman precauciones para asegurar que la primera secuencia de nucleótidos de la cadena con sentido permanezca monocatenaria y, por lo tanto, disponible para la hibridación con la cuarta secuencia de nucleótidos de la segunda molécula de ácido nucleico. Esta realización es particularmente preferida si la primera molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico circular.

En esta realización, el oligonucleótido de bloqueo está localizado después de la primera secuencia de nucleótidos, preferiblemente directamente adyacente a la última. El extremo 3' del oligonucleótido de bloqueo se enfrenta al extremo 3' de la primera secuencia de nucleótidos. Debido al bloqueo terminal, la polimerasa no puede extender el oligonucleótido de bloqueo. Debido al uso de una polimerasa sin actividad de desplazamiento de cadena y sin actividad de exonucleasa 5'-3', la reacción de extensión del cebador se detiene tan pronto como la polimerasa alcanza el extremo 5' del oligonucleótido bloqueado terminalmente en 3'.

En otra realización del método según la invención, dicha cuarta secuencia de nucleótidos es más larga que dicha primera secuencia de nucleótidos.

Esta medida tiene la ventaja de que la reacción de hibridación entre la cuarta secuencia de nucleótidos y la primera secuencia de nucleótidos se favorece energéticamente frente a una reacción de hibridación intramolecular dentro de la primera secuencia de nucleótidos y la formación de estructuras de horquilla. La eficacia de la reacción de hibridación entre la cuarta secuencia de nucleótidos y la primera secuencia de nucleótidos vuelve a aumentar de este modo. “Más larga” en este contexto significa que la cuarta secuencia de nucleótidos está compuesta por más nucleótidos que la primera secuencia de nucleótidos.

En otra realización del método según la invención, dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico y dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico son ADN, preferiblemente dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico monocatenario.

Esta medida tiene la ventaja de que el método según la invención se adapta a dicho tipo de moléculas de ácido nucleico que son de la mayor importancia en las reacciones de hibridación.

En otra realización del método según la invención, dicha al menos primera molécula de ácido nucleico se proporciona de la siguiente manera:

- proporcionando una molécula de ácido nucleico bicatenario que comprende

- dicha cadena de ácido nucleico con sentido y dicha cadena de ácido nucleico antisentido hibridadas al menos parcialmente entre sí, y

- una cadena antisentido interpuesta, dicha cadena antisentido interpuesta está al menos parcialmente hibridada con dicha primera secuencia de nucleótidos, y

- degradando dicha cadena antisentido interpuesta por una nucleasa.

Con esta medida se realiza un enfoque alternativo para generar la sección monocatenaria de la primera molécula de ácido nucleico.

La cadena antisentido interpuesta se puede unir covalentemente a la cadena antisentido por medio de enlaces fosfodiéster ordinarios de modo que las cadenas antisentido y antisentido interpuestas estén perfectamente conectadas entre sí. La secuencia de nucleótidos de la cadena antisentido interpuesta puede entonces ser complementaria o al menos parcialmente complementaria a la primera secuencia de nucleótidos. A continuación, la cadena antisentido interpuesta se elimina de la primera molécula de ácido nucleico mediante la actividad de nucleasa, tal como una actividad de exonucleasa, endonucleasa y/o glicosilasa, por ejemplo, ejercida por una N-uracilglicosilasa.

Esta medida tiene la ventaja de que el método según la invención se adapta a dicho tipo de moléculas de ácido nucleico que son de mayor importancia en las reacciones de hibridación.

En otra realización, el método según la invención comprende la siguiente etapa adicional:

iii) eliminar dicha cadena antisentido, preferiblemente por desnaturalización, más preferiblemente usando una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena.

Después de la hibridación de la primera molécula de ácido nucleico con la segunda molécula de ácido nucleico, ya no se favorece energéticamente la formación de estructuras secundarias intramoleculares dentro de la segunda secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, la cadena antisentido ya no es necesaria y se vuelve inoperable.

Por lo tanto, esta medida tiene la ventaja de que la segunda secuencia de nucleótidos de la cadena con sentido se vuelve accesible y, por lo tanto, disponible para cualquier función específica, tal como reacciones de amplificación, reacciones de hibridación posteriores con otras moléculas de ácido nucleico, tal como sondas o cebadores, o para otras reacciones, por ejemplo, con moléculas de captura, anticuerpos, colorantes, marcadores, etc.

La cadena antisentido puede eliminarse por desnaturalización o mediante un desplazamiento de cadena utilizando una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena. Preferiblemente se utiliza una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena si la primera molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico circular. Una vez que la polimerasa ha sintetizado la cadena antisentido y, debido a la configuración circular de la primera molécula de ácido nucleico, se pone en contacto con el extremo 5' del oligonucleótido de cebador, la actividad de desplazamiento de la cadena se quita y, por lo tanto, se elimina la cadena antisentido.

En otra realización del método según la invención, dicho soporte sólido comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: metal, vidrio, sílice, plásticos, y/o preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en: chips, perlas, capilares.

Esta medida tiene la ventaja de que el método según la invención se adapta a cualquier tipo de material que se utilice habitualmente en tareas de inmovilización molecular.

Otro objetivo de la presente invención es el uso de una cadena antisentido de ácido nucleico que tiene una tercera secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una segunda secuencia de nucleótidos y que es al menos parcialmente no complementaria a una primera secuencia de nucleótidos, para reducir y/o evitar la formación de estructuras de horquilla de una molécula diana de ácido nucleico que comprende dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha segunda secuencia de nucleótidos, estando dicha molécula diana de ácido nucleico destinada a hibridarse con una molécula sonda de ácido nucleico que tiene una cuarta secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos mediante una reacción de hibridación entre dicha al menos primera secuencia de nucleótidos y dicha al menos cuarta secuencia de nucleótidos, en donde dicha cadena antisentido de ácido nucleico se proporciona de la siguiente manera:

- proporcionando dicha molécula diana de ácido nucleico,

- extendiendo dicho oligonucleótido de cebador mediante una nucleótido polimerasa para generar dicha cadena de ácido nucleico antisentido, y que

dicha molécula diana de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico circular.

Las funciones, características, ventajas y realizaciones especificadas para el método según la invención se aplican igualmente al uso según la invención.

La invención se explica ahora con más detalle por medio de realizaciones que dan como resultado funciones, características y ventajas adicionales de la invención. Las realizaciones son de naturaleza puramente ilustrativa y no limitan el alcance o rango de la invención. Las características mencionadas en las realizaciones específicas son características de la invención y pueden verse como características generales que no son aplicables en la realización específica sino también de manera aislada en el contexto de cualquier realización de la invención.

La invención ahora se describe y explica con más detalle haciendo referencia a los siguientes ejemplos y dibujos no limitantes:

Figura 1: muestra el equilibrio de reacción de una molécula de ácido nucleico circular entre la forma circular abierta y relajada y la estructura de horquilla intramolecular, así como la estructura de hibridación bimolecular;

Figura 2: muestra el equilibrio de reacción de una molécula de ácido nucleico circular entre la estructura de horquilla y la forma circular abierta, relajada (A) sin y (B) con la molécula de ácido nucleico antisentido hibridada;

Figura 3: muestra la hibridación de una molécula de ácido nucleico circular con una molécula de ácido nucleico no circular hibridada sobre una superficie sólida, y la formación de una estructura de horquilla (A) sin y (B) con la molécula de ácido nucleico antisentido hibridada, e ilustra las secuencias de nucleótidos implicadas;

Figura 4: muestra varias opciones para la producción de la cadena antisentido de la molécula de ácido nucleico circular mediante la síntesis de oligonucleótidos (A), la extensión del cebador (B) y la actividad de exonucleasa (C);

Figura 5: muestra el resultado de una validación experimental del método según la invención.

1. Método según la invención y antecedentes.

La hibridación de moléculas de ácido nucleico solo se produce si se cumplen una serie de condiciones previas, tales como (1) las regiones de hibridación son lo suficientemente complementarias entre sí, (2) la longitud de las regiones de hibridación es lo suficientemente grande en las condiciones de reacción dadas, tales como pH, fuerza iónica, temperatura, etc., (3) la concentración de las moléculas de ácido nucleico es suficientemente alta en las condiciones de reacción dadas, (4) hay suficiente tiempo disponible. También hay diferencias en el comportamiento de hibridación si una pareja de hibridación se fija a una superficie sólida; véase Sekar et al. (2005), Comparative study of sequencedependent hybridization kinetics in solution and on microspheres, Nucleic Acids Res. 14, 33(1):366-375, y Gao et al. (loc.cit.). Otras condiciones previas son conocidas por el experto en la materia.

La hibridación es una reacción bimolecular de dos cadenas sencillas de ácidos nucleicos complementarios. Sin embargo, las cadenas sencillas de ácido nucleico también pueden hibridarse con estructuras de horquilla (Figura 1). Las estructuras de horquilla son estructuras que pueden formarse dentro de una cadena sencilla de ácido nucleico mediante la hibridación de dos regiones complementarias (Figura 1, reacción a).

Las estructuras de horquilla se estabilizan mediante el superenrollamiento del ADN; véase Brázda et al. (2011), Cruciform structures are a common ADN feature important for regulating bilogical processes, BMC Molecular Biology 12:33. El superenrollamiento de moléculas cortas de ADN solo se puede producir en el ADN circular, por lo que las estructuras de horquilla se ven particularmente favorecidas en el ADN circular.

Para la hibridación de dos regiones con una estructura de horquilla se aplican de nuevo las condiciones de hibridación mencionadas anteriormente. Sin embargo, la concentración de la cadena sencilla del ácido nucleico no tiene o tiene una importancia menor, ya que en una cadena sencilla del ácido nucleico están contenidas tanto la secuencia diana como la secuencia complementaria (reacción monomolecular).

Cuanto más cerca se localicen las dos regiones complementarias en una sola cadena, más rápido se produce la formación de la horquilla. La formación de la estructura de horquilla (Figura 1, reacción a) está en equilibrio con la resolución de la estructura de horquilla (Figura 1, reacción b). Sin embargo, la formación de la estructura de horquilla está claramente favorecida, como lo indica la flecha en negrita de la reacción directa a, Figura 1. Por esta razón, la formación de estructuras de horquilla también está cinéticamente favorecida frente a una hibridación bimolecular de dos moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios complementarios (modelo de equilibrio cinético) (compárese la reacción a y la reacción c en la Figura 1).

Las estructuras de horquilla consisten en un tallo de hibridación (Figura 1, (9)) y un bucle no hibridante (Figura, (8)). Si la estructura de tallo en la horquilla es corta y la hibridación de las dos moléculas monocatenarias da como resultado una molécula bicatenaria de ácido nucleico larga como se muestra en la Figura 2B, da como resultado una ganancia de energía significativamente mayor (energía de Gibbs o AG) debido a la hibridación de las dos cadenas sencillas largas de ácido nucleico que con la hibridación de las regiones complementarias en una sola cadena (modelo de equilibrio termodinámico). En otras palabras, a pesar de la rápida formación de la estructura de horquilla, a largo plazo el equilibrio se desplaza hacia las cadenas dobles largas de ácido nucleico bimolecular, es decir, la reacción b se ve favorecida sobre la reacción a en la Figura 2B.

Para resumir, la capacidad de las cadenas sencillas de ácido nucleico para formar estructuras de horquilla tiene consecuencias para la formación de cadenas dobles de ácido nucleico bimolecular: (1.) cuantas más estructuras de horquilla estables se puedan formar, las cadenas sencillas de ácido nucleico más cortas formarán híbridos bimoleculares. (2.) Cuanto menor sea la diferencia entre AG resultante de la formación de la estructura de horquilla y la formación de la doble cadena del ácido nucleico bimolecular, más ineficaz y lenta es la formación de la cadena doble bimolecular. Esto significa que si la región de hibridación en la cadena doble tiene una longitud similar a la de la estructura de horquilla, solo se forman unas pocas cadenas dobles bimoleculares. (3.) Con pequeñas diferencias entre AG de la estructura de horquilla y la doble cadena del ácido nucleico bimolecular, siempre habrá ambas moléculas en la reacción, las cadenas sencillas con estructura de horquilla y las dobles cadenas de ácido nucleico bimolecular. Según el nivel de la diferencia de AG, el porcentaje cambiará a las cadenas sencillas con estructura de horquilla o a las cadenas dobles del ácido nucleico bimolecular. Sin embargo, esto significa en cualquier caso que mediante la formación de la estructura de horquilla se reduce la concentración efectiva de las cadenas sencillas disponibles para la formación de la doble cadena bimolecular y se retrasa la hibridación en un híbrido bimolecular. (4.) Esto da como resultado particularmente problemas si una de las cadenas sencillas del ácido nucleico se inmoviliza en un soporte sólido, por ejemplo, micromatrices, métodos NGS y la otra cadena a hibridar está en solución. Las hibridaciones con ácidos nucleicos que están inmovilizados en un soporte sólido se producen significativamente retrasadas. Gao et al. (loc. cit.) midieron en diferentes sistemas una velocidad de hibridación reducida de 20 a 40 veces si una de las cadenas de ácido nucleico a hibridar se inmovilizaba en un vehículo. Si, por ejemplo, se inmovilizan oligonucleótidos cortos en un soporte sólido y se debe hibridar una sola cadena larga en solución (es decir, matriz, NGS), surge la siguiente situación: la región de hibridación es corta debido a la brevedad de los oligonucleótidos que se inmovilizaron en el vehículo. Frecuentemente, la parte hibridante de los oligonucleótidos inmovilizados tiene una longitud de 15 a 35 nucleótidos. Por otro lado, hay cadenas sencillas de ácido nucleico largas en solución. Tienen normalmente una longitud de aproximadamente 200 a 500 nucleótidos. Las cadenas sencillas de ácidos nucleicos largas tienen una mayor tendencia a formar estructuras de horquilla que las cadenas sencillas de ácidos nucleicos cortas. Las cadenas sencillas de ácido nucleico que forman estructuras de horquilla retrasan la velocidad de hibridación y reducen el número de cadenas dobles hibridantes. Cuando se utilizan matrices en las que se inmovilizan moléculas de ácido nucleico largas, por ejemplo, matrices BAC, también la cadena sencilla inmovilizada se ve afectada por la formación de estructuras de horquilla.

En muchos ejemplos o métodos de aplicación, se utilizan cadenas sencillas de ácido nucleico de longitud significativamente diferente en una reacción de hibridación. Esto tiene como consecuencia que la región de hibridación solo puede ser tan larga como la respectiva pareja de reacción más corta. La cadena más larga respectiva puede, en vista de la capacidad para formar estructuras de horquilla, describirse de la siguiente manera: (1.) Cuanto más larga sea una cadena de ácido nucleico (se excluyen las cadenas sencillas de mononucleótidos tales como poliA, poliC, poliT, poliU, poliG, Polil etc.), mayor será la probabilidad de formar estructuras de horquilla. (2.) Cuanto mayor sea el porcentaje de bases que son complementarias entre sí (por ejemplo, contenido de GC > 50 % o contenido de AT > 50 %), mayor será la probabilidad de formar estructuras de horquilla. (3.) Cuanto mayor sea el contenido de GC de una cadena sencilla de ácido nucleico, mayor será la probabilidad de formar estructuras de horquilla estables. Por esta razón, la formación de estructuras de horquilla por la respectiva cadena sencilla del ácido nucleico más larga puede dar como resultado una hibridación significativamente retrasada o ineficaz.

La presente invención resuelve este problema al prevenir o reducir la formación de estructuras en horquilla en al menos una de las moléculas monocatenarias de ácido nucleico implicadas en la hibridación.

El método según la invención da como resultado una mayor eficiencia de hibridación. La mayor eficiencia de hibridación permite el uso de una menor cantidad de moléculas de ácido nucleico hibridantes y un acortamiento del tiempo de hibridación. El método según la invención es particularmente ventajoso para moléculas de ácido nucleico circulares que tienden a formar estructuras de horquilla que se estabilizan mediante superenrollamiento. En moléculas de ácido nucleico pequeñas (tamaño, por ejemplo, < 5000 nucleótidos), un superenrollamiento estable básicamente solo se produce en moléculas de ácido nucleico circulares. Por esta razón, el riesgo de estructuras estables de horquilla es muy alto en ácidos nucleicos circulares, en los que el método según la invención es especialmente ventajoso.

En la Figura 1, se muestra una primera molécula de ácido nucleico circular (1) que consiste en una cadena con sentido (2) que comprende una primera secuencia de nucleótidos (3) y una segunda secuencia de nucleótidos (4). La primera secuencia de nucleótidos (3) puede hibridarse con una cuarta secuencia de nucleótidos (5) de una segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) inmovilizada sobre un soporte sólido (7). La primera molécula de ácido nucleico circular (1) forma estructuras de horquilla con un bucle (8) y un tallo (9). La primera molécula de ácido nucleico circular (1) está en equilibrio con la forma circular abierta (izquierda) y la forma de estructura de horquilla (derecha). El equilibrio se desplaza a la estructura de horquilla (derecha). La reacción a que da como resultado la estructura de horquilla se ve favorecida sobre la reacción b que da como resultado la forma circular abierta. Como resultado, la concentración de la forma abierta de la primera molécula de ácido nucleico circular (1) se reduce y la hibridación bimolecular con la segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) mediante la reacción ^c se produce con una velocidad de reacción significativamente reducida.

Como se muestra en la Figura 2A, la primera molécula de ácido nucleico circular (1) con la primera secuencia de nucleótidos (3) que puede hibridarse con la segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) forma estructuras de horquilla con un bucle (8) y un tallo (9). Entonces, el equilibrio se desplaza fuertemente hacia el de la estructura de horquilla (derecha) si se dan buenas condiciones de hibridación, por ejemplo, longitud suficiente de la región de hibridación, condiciones apropiadas de sal, pH y temperatura.

En la Figura 2B, la primera molécula de ácido nucleico circular (1) se hibrida con una cadena de ácido nucleico antisentido (10) que tiene una tercera secuencia de nucleótidos (11) de modo que no se puede formar una estructura de horquilla o la formación de la estructura de horquilla se reduce significativamente. Como la cadena doble formada después de la hibridación de la cadena de ácido nucleico antisentido (10) se extiende sobre una región de hibridación significativamente más larga que la región de hibridación dentro de una estructura de horquilla, la estructura de horquilla y la reacción a ya no son la estructura preferida. Por el contrario, ahora se favorece la reacción b.

En la Figura 3A, la primera molécula de ácido nucleico circular (1) está en equilibrio con una estructura de horquilla que consiste en un bucle (8) y un tallo (9). Se reduce la eficacia de la hibridación de la primera molécula de ácido nucleico circular (1) mediante la primera secuencia de nucleótidos (3) con la segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) mediante la cuarta secuencia de nucleótidos (5).

En la Figura 3B, la cadena con sentido (2) de la primera molécula de ácido nucleico circular (1) se hibrida con una cadena de ácido nucleico antisentido (10). La primera secuencia de nucleótidos (3) todavía es accesible ya que no se forma ninguna estructura de horquilla. Como resultado, la primera molécula de ácido nucleico circular (1) se puede hibridar con la segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) de una manera más eficiente.

En la Figura 3B también se muestra a modo de ejemplo las secuencias de nucleótidos de las moléculas de ácido nucleico individuales y las cadenas respectivas. La segunda secuencia de nucleótidos (4) de la cadena con sentido (2) de la primera molécula de ácido nucleico circular (1) es al menos parcialmente complementaria a la tercera secuencia de nucleótidos (11) de la cadena de ácido nucleico antisentido (10) de la primera molécula de ácido nucleico circular (1). La cuarta secuencia de nucleótidos (5) de la segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) es al menos parcialmente complementaria a la primera secuencia de nucleótidos (3) de la primera molécula de ácido nucleico circular (1).

En la Figura 4A, el ácido nucleico antisentido (10) se sintetiza mediante la síntesis de oligonucleótidos y se hibrida con la primera molécula de ácido nucleico circular (1). Un oligonucleótido se sintetiza de manera que la primera secuencia de nucleótidos (3) que sirve para la hibridación con la segunda molécula de ácido nucleico lineal (6) permanezca libre.

En la Figura 4B, dos oligonucleótidos (12, 13) se hibridan con la primera molécula de ácido nucleico circular (1), que enmarca la región del ácido nucleico antisentido posterior (11). El oligonucleótido (12) situado en 5' o anterior sirve como cebador para una extensión de cebador. El oligonucleótido (13) situado en 3' o posterior está bloqueado en su extremo 3' y no puede extenderse mediante una polimerasa. Debido al uso de una polimerasa sin función de desplazamiento de cadena y sin actividad de exonucleasa 5'-3', la reacción de extensión del cebador se bloquea tan pronto como la polimerasa durante la síntesis alcanza el extremo 5' del oligonucleótido terminalmente bloqueado en 3' del oligonucleótido situado después (13).

En la Figura 4C, se proporciona una muestra de la doble cadena del ácido nucleico circular. Se utiliza una exonucleasa, endonucleasa o glicosilasa (14) para eliminar la parte de la cadena antisentido que se hibrida con la primera secuencia de nucleótidos (3).

2. Validación experimental 1

Debe demostrarse que usando un ácido nucleico antisentido, un ADN circular (círculo) puede hibridarse con oligonucleótidos que se inmovilizaron en un material de soporte sólido, de una manera más eficaz. Como control, se usa una hibridación sin ácido nucleico antisentido. Después de la hibridación, se realiza una amplificación por círculo rodante (RCA) y una PCR en tiempo real para cuantificar los sucesos de hibridación.

Se incubaron placas de estreptavidina (tiras StreptaWell, Roche) recubiertas con el cebador 1 directo (biotina -aaaaaaaattcgacctatccttgcgcagctcgag; SEQ ID NO: 1) y el cebador 1 inverso (biotina -aaaaaaaaccatgaacaaaatgtgactcatatc; SEQ ID NO: 2) con 0 o 50 pg de un ADN circular (secuencia: atgacgatatgagtcacattttgttcatgggcatgacattgatacacagttagacga-taggacagtacattcgacctatccttgcgcagctcgagatgacg; SEQ ID NO:3) y de 0 a 200 pg de ácido nucleico antisentido (gtcatcgtcatctcgagctgcgcaaggataggtcgaatgtactgtcctatcgtctaactgtgtatcaatgtc; SEQ ID NO:4) en 50 gl de un tampón adecuado (Tris 50 mM, pH 7,5; MgCl²10 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,0012 %) se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente. Las mezclas que contenían el ADN circular y el ácido nucleico antisentido se hibridaron previamente entre sí. Se utilizaron las siguientes mezclas:

Tabla 1: mezclas de reacción

Después de la hibridación de las muestras con el ADN que se inmovilizó en la superficie, el sobrenadante se eliminó, se lavó y se disolvió en 49 pl de tampón de reacción RCA (Tris 37 mM pH 7,5; KCI 50 mM; MgCl²10 mM, (NH4)2SÜ4 20 mM, mezcla de dNTP 1 mM, polimerasa $29). La reacción se llevó a cabo durante 2 horas a 38°C. Después se eliminó el sobrenadante y se lavó la superficie. La reacción se detuvo después de 1 hora a 37°C con 50 pl de solución de parada (mini kit von REPLI-g). El sobrenadante contiene ADN previamente inmovilizado en la superficie. Este ADN ahora se puede detectar mediante una PCR en tiempo real (kit QuantiFast green) con los cebadores apropiados [cebador 2 directo: 5' ctg tgt atc aat gtc atg cc 3' (SEQ ID NO: 5) y cebador 2 inverso: 5' gtt aga cga tag gac agt aca 3' (SEQ ID NO:6)].

El resultado se muestra en la siguiente tabla 2.

Tabla 2: valores CT medidos después de PCR en tiempo real

La tabla muestra valores de CT significativamente reducidos para las mezclas en presencia de ADN circular y ácido nucleico antisentido. Cuando se utilizan 500 pg de ácido nucleico antisentido en la mezcla, se obtiene un valor de CT 4,2 ciclos inferior al de la mezcla sin ácido nucleico antisentido. Esto indica una eficiencia de hibridación 18 veces mayor. Sin ácido nucleico circular y con 500 pg de ácido nucleico antisentido en la mezcla, se obtiene un valor de CT que es 13,4 ciclos mayor que en una mezcla con ADN circular presente. Esto indica que el propio ácido nucleico antisentido no contribuye a la señal de la PCR en tiempo real.

3. Validación experimental 2

Debe demostrarse que mediante el uso de un ácido nucleico antisentido, un ADN circular (círculo) puede hibridarse con oligonucleótidos que se inmovilizaron en un material de soporte sólido de una manera más eficaz. Como control, se usa una hibridación sin ácido nucleico antisentido. Después de la hibridación, se realiza una amplificación por círculo rodante (RCA) y luego una tinción del ADN amplificado con YOYO1. Una exploración posterior del ADN amplificado da como resultado una evaluación visual de los sucesos de hibridación.

Se incubaron vehículos de vidrio recubiertos de estreptavidina revestidos con el cebador 1 directo (biotina - SEQ ID NO: 1), cebador 1 ref (biotina - SEQ ID NO: 2) y cebador poli A (biotina - aaaaaaaa; SEQ ID NO: 7) durante 15 min a temperatura ambiente con 0 o 50 pg de CNA circular (SEQ ID NO:3) y 0 a 200 pg de ácido nucleico antisentido (SEQ ID NO:4) en 50 pl de un tampón apropiado (Tris 50 mM, pH 7,5, MgCl²10 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,0012%). Las mezclas que contenían el ADN circular y el ácido nucleico antisentido se hibridaron previamente entre sí. Se utilizaron las siguientes mezclas:

Tabla. 3: Mezclas utilizadas en el ensayo

Después de la hibridación de las muestras con el ADN inmovilizado en la superficie, se eliminó el sobrenadante, se lavó y se disolvió en 49 pl de tampón de reacción RCA (Tris 37 mM pH 7,5; KCI 50 mM; MgCl²10 mM, (NH4)2SO420 mM, mezcla de dNTP 1 mM, polimerasa $29). La reacción se llevó a cabo durante 2 horas a 38°C. Después se eliminó el sobrenadante y se lavó la superficie. Después se cubrió la superficie con un YOYO®-1 solución de yoduro 1:10,000 y se incubó durante 30 min. Después de lavar la superficie, se exploró el portaobjetos de vidrio.

Después, el ADN se trató con 50 pl de DLB (del mini kit REPLI-g). El tratamiento se detuvo después de 1 h a 37°C con 50 pl de solución de parada (del mini kit REPLI-g). El sobrenadante ahora contiene ADN previamente inmovilizado en la superficie. Este ADN ahora se puede detectar en una PCR en tiempo real (kit QuantiFast SYBR green) con cebadores apropiados [cebador 2 directo: (SEQ ID NO: 5) y cebador 2 inverso (SEQ ID NO: 6)].

El resultado de la exploración se muestra en la Figura 5 que representa secciones de los portaobjetos de vidrio escaneados. Los sucesos de hibridación se muestran como pequeños puntos. Puede verse claramente que con cantidades crecientes de ácido nucleico antisentido, mientras permanece constante la cantidad de ADN circular, aumenta el número de puntos (sucesos de hibridación). La sola presencia de ácido nucleico circular sin la presencia del ácido nucleico antisentido da como resultado el menor número de puntos (sucesos de hibridación). Sin la presencia del ácido nucleico circular en presencia del ácido nucleico antisentido, no se pueden ver puntos (sucesos de hibridación).

Tabla 4: Resultado de la PCR en tiempo real

La tabla muestra claramente valores de CT más bajos para las mezclas en presencia de ADN circular y ácido nucleico antisentido. Esto indica una mayor eficiencia de hibridación. Sin ácido nucleico circular y con 200 pg de ácido nucleico antisentido, se obtiene un valor de CT significativamente mayor que en presencia de ADN circular. Esto indica que el ácido nucleico antisentido no contribuye a la señal de PCR en tiempo real.

4. Validación experimental 3

Debe demostrarse que utilizando diferentes longitudes de ácidos nucleicos antisentido, un ADN circular (círculo) puede hibridarse con oligonucleótidos, que se inmovilizaron sobre un material de soporte sólido, de una manera más eficaz. Como control se utilizó hibridación con ácido nucleico antisentido. Después de la hibridación, se llevó a cabo una amplificación por círculo rodante (RCA) y una PCR en tiempo real para cuantificar los sucesos de hibridación.

La mezcla de ácido nucleico ya hibridada que consiste en 50 pg de ADN circular (círculo) y 200 pg de ácido nucleico antisentido se hibridó con placas de estreptavidina (tiras StreptaWell, Roche) que estaban recubiertas con el cebador 1 directo (biotina - SEQ ID NO:1) y cebador 1 inverso (biotina - SEQ ID NO:2) utilizando 50 pl de un tampón apropiado (Tris 50 mM, pH 7,5; MgCl²10 mM, NaCl 100 mM, Tween 20 al 0,0012%).

Secuencia del círculo: atgacgatatgagtcacattttgttcatgggcatgacattgatacacagttagacgataggacagtacattcgacctatccttgcgcagctcgagatgacg (SEQ ID NO:3)

Secuencia de los ácidos nucleicos antisentido:

No. 1: gtcatcgtcatctcgagctgcgcaaggataggtcgaatgtactgtcctatcgtctaactgtgtatcaatgtc (SEQ ID NO: 4)

No. 2: tcatctcgagctgcgcaaggataggtcgaatgtactgtcctatcgtctaactgtgta (SEQ ID NO: 8)

No. 3: gagctgcgcaaggataggtcgaatgtactgtcctatcgtctaac (SEQ ID NO: 9)

No. 4: gcaaggataggtcgaatgtactgtcctatc (SEQ ID NO: 10)

Se utilizaron las siguientes mezclas

Tabla 5: Mezclas utilizadas en el ensayo

Después de un período de hibridación de 15 min, donde las muestras se hibridaron con los cebadores de ADN inmovilizados en la superficie, se eliminó el sobrenadante y se disolvió en 50 pl de tampón de reacción RCA (Tris 37 mM pH 7,5; KCI 50 mM; MgCl²10 mM, (NH)2SO420 mM, mezcla de dNTP 1 mM, polimerasa $29). La reacción se llevó a cabo durante 2 horas a 38°C. Después se eliminó el sobrenadante y se lavó la superficie. Después, el ADN se trató con 50 pl de DLB (del mini kit REPLI-g) en la superficie. El tratamiento se detuvo después de 1 h a 37°C con 50 pl de solución de parada (del mini kit REPLI-g). El sobrenadante ahora contiene ADN que se inmovilizó previamente en la superficie. Este ADN ahora se puede detectar en una PCR en tiempo real (kit QuantiFast SYBR green) con los cebadores apropiados [cebador 2 directo (SEQ ID NO: 5) y cebador 2 inverso (SEQ ID NO: 6)].

El resultado se muestra en la siguiente tabla 6

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para hibridar una molécula de ácido nucleico, que comprende

i) proporcionar una mezcla de reacción que comprende

- al menos una primera molécula de ácido nucleico que comprende al menos parcialmente hibridados entre sí - una cadena de ácido nucleico con sentido que tiene

- al menos una primera secuencia de nucleótidos, y

- al menos una segunda secuencia de nucleótidos;

- tampón de hibridación;

caracterizado por que dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico se proporciona de la siguiente manera:

- proporcionando dicha cadena de ácido nucleico con sentido,

- hibridando al menos un oligonucleótido de cebador con al menos un primer segmento de dicha segunda secuencia de nucleótidos, dicho al menos primer segmento está situado antes y/o después de dicha primera secuencia de nucleótidos,

2. Método de la reivindicación 1, caracterizado por que dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico circular.

3. Método de la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que antes y/o durante dicha extensión, un oligonucleótido de bloqueo se hibrida con al menos un segundo segmento de dicha segunda secuencia de nucleótidos, dicho segundo segmento está localizado después de dicha primera secuencia de nucleótidos, preferiblemente dicha polimerasa no muestra actividad de desplazamiento de cadena y no tiene actividad de exonucleasa 5'-3'.

4. Método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha cuarta secuencia de nucleótidos es más larga que dicha primera secuencia de nucleótidos.

5. Método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha al menos una primera molécula de ácido nucleico y dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico son ADN.

6. Método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicha al menos una segunda molécula de ácido nucleico es una molécula de ácido nucleico monocatenario.

7. Método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la siguiente etapa adicional: iii) eliminar dicha cadena antisentido,

8. Método de la reivindicación 7, caracterizado por que la eliminación de dicha cadena antisentido se realiza por desnaturalización y/o mediante un desplazamiento de cadena utilizando una polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena.

9. Método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho soporte sólido comprende un material seleccionado del grupo que consiste en: metal, vidrio, sílice, plásticos, y/o preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en: chips, perlas, capilares.

10. El uso de una cadena antisentido de ácido nucleico que tiene una tercera secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a una segunda secuencia de nucleótidos y que es al menos parcialmente no complementaria a una primera secuencia de nucleótidos, para reducir y/o evitar la formación de estructuras de horquilla de una molécula diana de ácido nucleico que comprende dicha primera secuencia de nucleótidos y dicha segunda secuencia de nucleótidos, siendo dicha molécula diana de ácido nucleico destinada a hibridarse con una molécula sonda de ácido nucleico que tiene una cuarta secuencia de nucleótidos que es al menos parcialmente complementaria a dicha primera secuencia de nucleótidos mediante una reacción de hibridación entre dicha al menos primera secuencia de nucleótidos y dicha al menos cuarta secuencia de nucleótidos,

caracterizado por que dicha cadena antisentido de ácido nucleico se proporciona de la siguiente manera:

- proporcionando dicha molécula diana de ácido nucleico,