ES2935432B2 - In vitro method to diagnose SARS-CoV-2 infection - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
Método in vitro para diagnosticar una infección por SARS-CoV-2In vitro method to diagnose SARS-CoV-2 infection
La presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar enfermedades inflamatorias provocadas por una infección por SARS-CoV-2, basado en el espectro de absorción de la hemoglobina. Por lo tanto, la presente invención pertenece al campo de la biomedicina, en concreto, al campo del diagnóstico de enfermedades.The present invention relates to an in vitro method for diagnosing inflammatory diseases caused by SARS-CoV-2 infection, based on the absorption spectrum of hemoglobin. Therefore, the present invention belongs to the field of biomedicine, specifically, to the field of disease diagnosis.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
La Hemoglobina es una proteína con absorbancia de luz, pudiendo absorber luz dependiendo de su concentración desde los 250 a los 1100 nm aproximadamente. La intensidad de la absorción depende de la concentración de la proteína y de su grado de oxigenación. Presenta tanto en su forma oxigenada como desoxigenada unos máximos y mínimos característicos a lo largo del espectro. Las diferencias entre el patrón de absorción de la forma oxigenada y desoxigenada dependen de su estructura terciaria y cuaternaria. Los hematíes portadores de la hemoglobina viven 120 días y hoy por hoy no se les asume capacidad de biosíntesis de proteínas una vez que llegan a su estado final de diferenciación, de modo que es razonable asumir que la hemoglobina que portan permanece en el hematíe desde el inicio de su “vida útil” hasta el final.Hemoglobin is a protein with light absorbance, being able to absorb light depending on its concentration from approximately 250 to 1100 nm. The intensity of absorption depends on the concentration of the protein and its degree of oxygenation. It presents, both in its oxygenated and deoxygenated form, characteristic maximums and minimums throughout the spectrum. The differences between the absorption pattern of the oxygenated and deoxygenated form depend on their tertiary and quaternary structure. The red blood cells that carry hemoglobin live for 120 days and today they are not assumed to have the capacity for protein biosynthesis once they reach their final state of differentiation, so it is reasonable to assume that the hemoglobin they carry remains in the red blood cell from the moment they reach their final state of differentiation. beginning of its “useful life” to the end.
Un virus denominado 2019 novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) causa síntomas que se clasifican como enfermedad por coronavirus (COVID-19). Las afecciones respiratorias están ampliamente descritas entre los casos más graves de COVID-19, y la aparición del síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA) es una de las características distintivas de los casos críticos de COVID-19. El SDRA puede suponer una amenaza directa para la vida, ya que se asocia a niveles bajos de oxigenación de la sangre y puede provocar un fallo orgánico.A virus called 2019 novel coronavirus (2019-nCoV/SARS-CoV-2) causes symptoms that are classified as coronavirus disease (COVID-19). Respiratory conditions are widely described among the most severe cases of COVID-19, and the onset of acute respiratory distress syndrome (ARDS) is one of the hallmarks of critical COVID-19 cases. ARDS can be directly life-threatening as it is associated with low levels of blood oxygenation and can lead to organ failure.
Las pruebas de diagnóstico para COVID-19 se hacen para saber si un individuo está infectado con SARS-CoV-2, el virus que causa la enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19). Actualmente, existen los siguientes tipos de pruebas para diagnosticar la COVID-19:Diagnostic tests for COVID-19 are done to find out if an individual is infected with SARS-CoV-2, the virus that causes coronavirus disease 2019 (COVID-19). Currently, there are the following types of tests to diagnose COVID-19:
- Prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (de sus siglas en inglés Polymerase Chain Reactiorí). Es una prueba molecular que detecta el material genético del virus que causa la COVID-19 en una muestra procedente de un sujeto, siendo dicha muestra un exudado nasofarínge o un exudado de turbinado medio o una muestra de saliva. Es el más sensible de los métodos disponibles. Para la detección de 5.2 copias tiene una sensibilidad del 95%, pero sin reactividad cruzada con otros virus y coronavirus, su especificidad es de 100%. Sin embargo, esta prueba requiere personal altamente especializado, lo que limita su uso a laboratorios especializados, y en consecuencia, pueden aparecer falsos positivos/negativos debido a una mala técnica de hisopado, mala calidad de transporte y de la toma de la muestra en estadios iniciales, y contaminación cruzada en el laboratorio. Además, el tiempo para obtener los resultados es relativamente largo pues requiere de2 a 5 horas y la prueba relativamente costosa debido al tipo de reactivos empleados como son los cebadores específicos para la detección del virus.- Polymerase Chain Reaction or PCR Test ( Polymerase Chain Reaction). It is a molecular test that detects the material genetic of the virus that causes COVID-19 in a sample from a subject, said sample being a nasopharyngeal exudate or a middle turbinate exudate or a saliva sample. It is the most sensitive of the available methods. For the detection of 5.2 copies it has a sensitivity of 95%, but without cross-reactivity with other viruses and coronaviruses, its specificity is 100%. However, this test requires highly specialized personnel, which limits its use to specialized laboratories, and consequently, false positives/negatives may appear due to poor swabbing technique, poor quality of transport and sample collection in stages. initials, and cross contamination in the laboratory. In addition, the time to obtain the results is relatively long since it requires 2 to 5 hours and the test is relatively expensive due to the type of reagents used such as specific primers for the detection of the virus.
- Prueba de antígenos. Esta prueba está basada en la detección de antígenos virales, es decir, en la detección de proteínas de SARS-CoV-2. Una forma de detectarlos es usar los llamados Test Rápidos de Detección de Antígenos (RADTs, rapid antigen detection tests). Los más habituales se basan en ensayos de flujo lateral o tiras reactivas. Suelen estar fabricados en materiales adsorbentes (como derivados de celulosa) que contienen ya adsorbidos distintos reactivos que cuando entran en contacto con la proteína del SARS-CoV-2 conducen a un cambio detectable a simple vista. En este caso, la detección de lleva a cabo sobre una muestra nasofaríngea del individuo, se mezcla con solución reactiva y se depositan unas gotas de la mezcla en la tira reactiva. La lectura del resultado, generalmente visual, se puede realizar al cabo de pocos minutos en la zona de captura o detección. Sin embargo, esta técnica presenta varias limitaciones, como son su limitada sensibilidad, lo que da lugar a una elevada tasa de falsos positivos y/o falsos negativos, y su respuesta esencialmente cualitativa (tipo sí/no) que no aporta información sobre la carga viral presente.- Antigen test. This test is based on the detection of viral antigens, that is, on the detection of SARS-CoV-2 proteins. One way to detect them is to use the so-called Rapid Antigen Detection Tests (RADTs, rapid antigen detection tests). The most common are based on lateral flow tests or test strips. They are usually made of adsorbent materials (such as cellulose derivatives) that contain different reagents already adsorbed that, when they come into contact with the SARS-CoV-2 protein, lead to a change detectable with the naked eye. In this case, the detection is carried out on a nasopharyngeal sample from the individual, it is mixed with reagent solution and a few drops of the mixture are deposited on the test strip. Reading the result, generally visual, can be done after a few minutes in the capture or detection area. However, this technique has several limitations, such as its limited sensitivity, which gives rise to a high rate of false positives and/or false negatives, and its essentially qualitative response (yes/no type) that does not provide information about the load. viral present.
- Pruebas serológicas. Los test serológicos se basan en la detección indirecta del virus, a través de la medida específica de los anticuerpos generados por el propio organismo de la persona infectada. No es necesario que la infección esté activa, es decir, que el virus esté todavía presente en el organismo infectado, por lo que es útil no solo como método de diagnóstico, sino también en estudios epidemiológicos, pues permite medir los niveles de anticuerpos con el tiempo. Además, se puede diferenciar entre distintos tipos de anticuerpos IgM/IgG que se producen en las distintas etapas de la infección. Esta prueba se realiza sobre una muestra de sangre que se transfiere directamente al test (visual generalmente) y el resultado se obtiene al cabo de pocos minutos en la zona de captura o detección. Es una prueba rápida, realizada a partir de una muestra que implica extracción sencilla mínimamente invasiva (muestra de sangre capilar), bien establecida y que puede ser utilizada directamente en el sitio de toma de muestra, no requiere de instrumentación compleja externa ni de personal especializado para su análisis ni para la lectura de los resultados. Sin embargo, entre sus inconvenientes se encuentran su limitada sensibilidad, dando lugar a una alta tasa de falsos negativos/positivos, sus problemas de reproducibilidad, y su variabilidad inherente a la respuesta inmune de cada individuo.- Serological tests. Serological tests are based on the indirect detection of the virus, through the specific measurement of antibodies generated by the infected person's own body. It is not necessary for the infection to be active, that is, for the virus to still be present in the infected organism, which is why it is useful not only as a diagnostic method, but also in epidemiological studies. as it allows antibody levels to be measured over time. In addition, it is possible to differentiate between different types of IgM/IgG antibodies that are produced at different stages of infection. This test is performed on a blood sample that is transferred directly to the test (generally visual) and the result is obtained after a few minutes in the capture or detection area. It is a rapid test, performed from a sample that involves simple minimally invasive extraction (capillary blood sample), well established and can be used directly at the sampling site, it does not require complex external instrumentation or specialized personnel. for analysis or for reading the results. However, among its drawbacks are its limited sensitivity, leading to a high rate of false negatives/positives, its reproducibility problems, and its inherent variability in the immune response of each individual.
Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar una prueba diagnóstica de COVID-19 que sea rápida, fiable, y esté basada en muestras no invasivas, a la par que tenga una alta sensibilidad y especificidad.Therefore, there is a need in the state of the art to provide a COVID-19 diagnostic test that is rapid, reliable, and based on non-invasive samples, while having high sensitivity and specificity.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
Los inventores han observado que el espectro de absorción de la hemoglobina en sujetos que padecen una infección por SARS-CoV-2 presenta un patrón específico, y que dicho patrón varía con respecto a un sujeto que no sufre ni ha sufrido de dicha infección. Además, resulta destacable que dicha variación en el espectro de la hemoglobina puede observarse hasta 120 días después de la infección por SARS-CoV-2. Así, en la presente invención se presenta el espectro de absorción de la hemoglobina como una nueva herramienta de diagnóstico de aquellas enfermedades producidas por una infección del virus SAR-CoV-2, agente causal de la COVID-19.The inventors have observed that the absorption spectrum of hemoglobin in subjects suffering from a SARS-CoV-2 infection presents a specific pattern, and that said pattern varies with respect to a subject who does not suffer or has not suffered from said infection. Furthermore, it is notable that this variation in the hemoglobin spectrum can be observed up to 120 days after SARS-CoV-2 infection. Thus, in the present invention, the absorption spectrum of hemoglobin is presented as a new diagnostic tool for those diseases caused by an infection with the SAR-CoV-2 virus, the causal agent of COVID-19.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar la COVID-19 en un sujeto dentro de un periodo de 120 días desde la infección por SARS-CoV-2, de aquí en adelante “método de la invención”, que comprendeTherefore, in one aspect, the present invention relates to an in vitro method for diagnosing COVID-19 in a subject within a period of 120 days from SARS-CoV-2 infection, hereinafter "method." of the invention”, which includes
(i) determinar el espectro de absorción de la hemoglobina entre 500 y 1.000 nm en una muestra de sangre aislada del sujeto, y(i) determine the absorption spectrum of hemoglobin between 500 and 1,000 nm in a blood sample isolated from the subject, and
(ii) comparar el espectro de absorción obtenido en la etapa (i) con el espectro de absorción de la hemoglobina entre 500 y 1.000 nm obtenido en una muestra de sangre obtenida de un sujeto control,(ii) compare the absorption spectrum obtained in step (i) with the spectrum of absorption of hemoglobin between 500 and 1,000 nm obtained in a blood sample obtained from a control subject,
en donde:where:
- si el área bajo la curva del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto es menor que el área bajo la curva del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto control, entonces el sujeto sufre de la COVID-19 debido a una infección por SARS-CoV-2, y/o- if the area under the hemoglobin absorption spectrum curve in the subject is less than the area under the hemoglobin absorption spectrum curve in the control subject, then the subject suffers from COVID-19 due to infection by SARS-CoV-2, and/or
- si en el intervalo entre 600 y 700 nm del espectro de absorción de la hemoglobina del sujeto no aparece un máximo relativo en comparación con el espectro de absorción del sujeto control, entonces el sujeto sufre de la COVID-19 debido a una infección por SARS-Cov-2, y/o- if a relative maximum does not appear in the interval between 600 and 700 nm of the absorption spectrum of the subject's hemoglobin compared to the absorption spectrum of the control subject, then the subject suffers from COVID-19 due to SARS infection -Cov-2, and/or
- si en el intervalo entre 930 y 995 nm del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto aparece un máximo después de los 980 nm en comparación con el espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto control, entonces el sujeto sufre de la COVID-19 debido a una infección por SARS-CoV-2.- if in the interval between 930 and 995 nm of the absorption spectrum of hemoglobin in the subject a maximum appears after 980 nm compared to the absorption spectrum of hemoglobin in the control subject, then the subject suffers from COVID -19 due to SARS-CoV-2 infection.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “diagnosticar” o “diagnóstico” hace referencia a la identificación de la naturaleza de una dolencia, enfermedad u otro problema mediante examen de los síntomas, parámetros o biomarcadores en un sujeto. En el contexto de la presente invención, el parámetro usado para el diagnóstico es el espectro de absorción de la hemoglobina entre 500 y 1.000 nm, y la enfermedad es una infección por SARS-CoV-2, también conocida como COVID-19.As used herein, the term “diagnose” or “diagnosis” refers to the identification of the nature of a condition, disease or other problem by examination of symptoms, parameters or biomarkers in a subject. In the context of the present invention, the parameter used for diagnosis is the absorption spectrum of hemoglobin between 500 and 1,000 nm, and the disease is an infection by SARS-CoV-2, also known as COVID-19.
El SARS-CoV-2, o coronavirus 2019-nCoV, es un virus de la familia de los coronavirus cuya infección provoca en el sujeto un síndrome respiratorio agudo grave de tipo 2. Su secuencia de ARN es de aproximadamente treinta mil nucleótidos de longitud. Consta de cuatro genes para las proteínas estructurales características de los coronavirus que se designan con las letras S (homotrímero de glicoproteína cuyo ensanchamiento distal de sus pliegues forma las puntas de la superficie), E (pequeña proteína de la envoltura), M (proteína de la matriz que une la envoltura con el núcleo vírico) y N (fosfoproteína de la nucleocápside), además de los ORFs que codifican proteínas no estructurales incluyendo las enzimas que aparecen durante su ciclo reproductivo intrahospedero.SARS-CoV-2, or coronavirus 2019-nCoV, is a virus from the coronavirus family whose infection causes severe acute respiratory syndrome type 2 in the subject. Its RNA sequence is approximately thirty thousand nucleotides in length. It consists of four genes for the structural proteins characteristic of coronaviruses that are designated by the letters S (glycoprotein homotrimer whose distal widening of its folds forms the tips of the surface), E (small envelope protein), M ( the matrix that joins the envelope to the viral core) and N (nucleocapsid phosphoprotein), in addition to the ORFs that encode non-structural proteins including enzymes that appear during its intra-host reproductive cycle.
La primera etapa del método de la invención comprende determinar el espectro de absorción de la hemoglobina entre 500 y 1.000 nm en una muestra de sangre aislada del sujeto. The first stage of the method of the invention comprises determining the absorption spectrum of hemoglobin between 500 and 1,000 nm in a blood sample isolated from the subject.
El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida (£) a diferentes valores de longitud de onda (A). El espectro de absorción puede medirse por cualquiera de las técnicas e instrumentos conocidos en el estado de técnica. Ejemplo de instrumentos útiles en la medición del espectro de absorción, incluye, sin limitarse a, un espectrofotómetro. En el caso de la presente invención, la molécula cuyo espectro de absorción va a medirse es la hemoglobina.The absorption spectrum is a graphical representation that indicates the amount of light absorbed (£) at different wavelength values (A). The absorption spectrum can be measured by any of the techniques and instruments known in the state of the art. Examples of instruments useful in measuring the absorption spectrum include, but are not limited to, a spectrophotometer. In the case of the present invention, the molecule whose absorption spectrum is to be measured is hemoglobin.
La hemoglobina es una proteína tetramérica transportadora de oxígeno, de aproximadamente una masa molecular de 64.000 g/mol (64 kDa), formada por cuatro cadenas polipeptídicas (globinas) a cada una de las cuales se une un grupo hemo cuyo átomo de hierro es capaz de unir de forma reversible una molécula de dioxígeno.Hemoglobin is a tetrameric oxygen-carrying protein, with approximately a molecular mass of 64,000 g/mol (64 kDa), formed by four polypeptide chains (globins) to each of which is attached a heme group whose iron atom is capable of of reversibly binding a dioxygen molecule.
Para medir el espectro de absorción de la hemoglobina primero hay que aislarla de una muestra de sangre del sujeto o, alternativamente, el espectro de absorción se puede medir directamente en la muestra de sangre aislada del sujeto. La muestra de sangre se puede extraer por punción venosa, o por punción digital (punción en la yema del dedo). Procedimientos para extraer o aislar una muestra de sangre de un sujeto son ampliamente conocidos por el experto en la materia, así como el instrumental que se necesita. Asimismo, técnicas de aislamiento de proteínas, en concreto, técnicas para aislar la hemoglobina presente en una muestra sangre, son ampliamente conocidas en el estado de la técnica, siendo práctica de rutina para el experto en la materia.To measure the absorption spectrum of hemoglobin it must first be isolated from a blood sample from the subject or, alternatively, the absorption spectrum can be measured directly in the blood sample isolated from the subject. The blood sample can be extracted by venipuncture, or by digital puncture (fingertip puncture). Procedures for extracting or isolating a blood sample from a subject are widely known to those skilled in the art, as well as the instruments that are needed. Likewise, protein isolation techniques, specifically, techniques for isolating the hemoglobin present in a blood sample, are widely known in the state of the art, being routine practice for those skilled in the art.
Tal como se utiliza en el presente documento “sujeto” hace referencia a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye, pero no se limita a, animales domésticos y de granja, primates humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto del que se va extraer la muestra sangre para poner en práctica el método de la invención es un mamífero, más preferiblemente un primate o un cánido, todavía más preferiblemente un ser humano de cualquier sexo, edad o raza.As used herein "subject" refers to all animals classified as mammals and includes, but is not limited to, domestic and farm animals, human primates, for example, humans, non-human primates, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents. Preferably, the subject from which the blood sample is to be extracted to practice the method of the invention is a mammal, more preferably a primate or a canid, even more preferably a human being of any sex, age or race.
Una vez extraída la muestra de sangre o, alternativamente, extraída la hemoglobina de la muestra sangre, se procede a medir el espectro de absorción de la hemoglobina y compararlo con el espectro de absorción de la hemoglobina entre 500 y 1.000 nm obtenido en una muestra de sangre obtenido de un sujeto control. En la presente invención se entiende por “sujeto control” a aquel individuo o sujeto que no padece, o sufre de, COVID-19. Once the blood sample has been extracted or, alternatively, the hemoglobin has been extracted from the blood sample, the absorption spectrum of the hemoglobin is measured and compared with the absorption spectrum of hemoglobin between 500 and 1,000 nm obtained in a sample of blood obtained from a control subject. In the present invention, “control subject” is understood to mean that individual or subject who does not suffer from, or suffers from, COVID-19.
Como puede verse en la Figura 1A de la presente descripción, de dicha comparación se derivan las siguientes conclusiones:As can be seen in Figure 1A of the present description, the following conclusions are derived from said comparison:
- Si el área bajo la curva del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto es menor que el área bajo la curva del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto control, entonces el sujeto sufre de la COVID-19 debido a una infección porSARS-CoV-2.- If the area under the hemoglobin absorption spectrum curve in the subject is less than the area under the hemoglobin absorption spectrum curve in the control subject, then the subject suffers from COVID-19 due to infection bySARS-CoV-2.
- Si en el intervalo entre 600 y 700 nm del espectro de absorción de la hemoglobina del sujeto no aparece un máximo relativo en comparación con el espectro de absorción del sujeto control, entonces el sujeto sufre de la COVID-19 debido a una infección por SARS-Cov-2.- If a relative maximum does not appear in the interval between 600 and 700 nm of the absorption spectrum of the subject's hemoglobin compared to the absorption spectrum of the control subject, then the subject suffers from COVID-19 due to SARS infection -Cov-2.
- Si en el intervalo entre 930 y 995 nm del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto aparece un máximo después de los 980 nm en comparación con el espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto control, entonces el sujeto sufre de la COVID-19 debido a una infección por SARS-CoV-2; o alternativamente, si en el intervalo entre 930 y 995 nm del espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto aparece un máximo antes de los 980 nm en comparación con el espectro de absorción de la hemoglobina en el sujeto control, entonces el sujeto no sufre una infección por SARS-CoV-2.- If in the interval between 930 and 995 nm of the absorption spectrum of hemoglobin in the subject a maximum appears after 980 nm compared to the absorption spectrum of hemoglobin in the control subject, then the subject suffers from COVID -19 due to SARS-CoV-2 infection; or alternatively, if in the interval between 930 and 995 nm of the absorption spectrum of hemoglobin in the subject a maximum appears before 980 nm compared to the absorption spectrum of hemoglobin in the control subject, then the subject does not suffer a SARS-CoV-2 infection.
Cualquiera de las tres características mencionadas en párrafos anteriores del espectro de absorción de la hemoglobina en un sujeto que sufre de la COVID-19 (el área bajo la curva, la ausencia de un máximo relativo entre 600 y 700 nm, y un máximo después de los 980 nm en el intervalo entre 930 y 995 nm) puede usarse sola, o en combinación con el resto, para llegar a la conclusión de que el sujeto sufre de la COVID-19 dentro de un periodo de 120 días desde la realización de la prueba diagnóstica.Any of the three characteristics mentioned in previous paragraphs of the absorption spectrum of hemoglobin in a subject suffering from COVID-19 (the area under the curve, the absence of a relative maximum between 600 and 700 nm, and a maximum after 980 nm in the interval between 930 and 995 nm) can be used alone, or in combination with the rest, to reach the conclusion that the subject suffers from COVID-19 within a period of 120 days from the performance of the test. diagnostic test.
Así, de la aplicación del método de la invención, se puede determinar si un sujeto está infectado por SARS-CoV-2 y diagnosticar si sufre la enfermedad COVID-19.Thus, by applying the method of the invention, it can be determined if a subject is infected by SARS-CoV-2 and diagnosed if they suffer from the COVID-19 disease.
A la vista de lo expuesto anteriormente, en otro aspecto la presente invención también contempla el uso del espectro de absorción de la hemoglobina entre 500 y 1000 nm para el diagnóstico in vitro de una infección por SARS-CoV-2 en un sujeto (de aquí en adelante “uso de la invención”).In view of the above, in another aspect the present invention also contemplates the use of the absorption spectrum of hemoglobin between 500 and 1000 nm for the in vitro diagnosis of a SARS-CoV-2 infection in a subject (hereinafter in hereinafter “use of the invention”).
En una realización particular del uso de la invención, el sujeto es un mamífero o un cánido, más en particular, el mamífero es un primate, todavía más particular, el primate es un ser humano.In a particular embodiment of the use of the invention, the subject is a mammal or a canid, more particularly, the mammal is a primate, even more particularly, the primate is a human.
Todos los términos y definiciones explicado para el método de la invención son aplicables al uso de la invención.All terms and definitions explained for the method of the invention are applicable to the use of the invention.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
Figura 1. La Hemoglobina (Hb) en enfermos de COVID. Sobre una muestra de lisado de hematíes de pacientes negativos (CON) y positivos (COVID) para SARS-CoV2. A) Patrón de absorción del espectro de luz entre 500 y 1000 nm. B) Área bajo la curva (AUC) de cada muestra individual ilustrada en el apartado A. C) Concentración de Hb en CON y COVID. D) Media y error de los valores de los espectros de absorción en CON y COVID. Todas las lecturas de absorción son corregidas por la concentración de Hb de cada paciente. B), C) y D) datos expresados como media ± error. Figure 1. Hemoglobin (Hb) in COVID patients. On a sample of red blood cell lysate from patients negative (CON) and positive (COVID) for SARS-CoV2. A) Absorption pattern of the light spectrum between 500 and 1000 nm. B) Area under the curve (AUC) of each individual sample illustrated in section A. C) Hb concentration in CON and COVID. D) Mean and error of the values of the absorption spectra in CON and COVID. All absorption readings are corrected for each patient's Hb concentration. B), C) and D) data expressed as mean ± error.
Testt**** = p-valor <0,0001.Testt**** = p-value <0.0001.
Figura 2. Espectro de absorción de la hemoglobina con protocolo de gota de sangre. Absorbancia de la luz en el rango entre 500-1000 nanómetros de una dilución de 2 gotas de sangre en agua destilada. Se observa un patrón análogo a aquellos descritos para la hemoglobina (Weber, J., Beard, P. & Bohndiek, S. Contrast agents for molecular photoacoustic imaging. Nat Methods 13, 639-650 (2016)) y a aquellos observados en figura 1 para el grupo control. Todas las lecturas de absorción son corregidas por la concentración de Hb de cada paciente. Datos expresados como media ± error. Figure 2. Absorption spectrum of hemoglobin with blood drop protocol. Light absorbance in the range between 500-1000 nanometers from a dilution of 2 drops of blood in distilled water. A pattern analogous to those described for hemoglobin is observed (Weber, J., Beard, P. & Bohndiek, S. Contrast agents for molecular photoacoustic imaging. Nat Methods 13, 639-650 (2016)) and to those observed in figure 1 for the control group. All absorption readings are corrected for each patient's Hb concentration. Data expressed as mean ± error.
EJEMPLOSEXAMPLES
A continuación, se ilustrará la invención mediante un ensayo realizado por los inventores que pone de manifiesto la efectividad del método de la invención.Next, the invention will be illustrated through a test carried out by the inventors that demonstrates the effectiveness of the method of the invention.
La hemoglobina es una proteína que presenta una alta concentración en sangre y que posee unas propiedades ópticas que le permiten absorber luz en el rango espectral desde 300 hasta 1100. Además, la hemoglobina es altamente sensible a cambios en el estado redox y muy reactiva para este tipo de modificaciones químicas que pueden incluso alterar su unión al oxígeno.Hemoglobin is a protein that has a high concentration in the blood and has optical properties that allow it to absorb light in the spectral range from 300 to 1100. In addition, hemoglobin is highly sensitive to changes in the redox state and very reactive for this type of chemical modifications that can even alter its binding to oxygen.
MATERIAL YMÉTODOSMATERIAL AND METHODS
PoblaciónPopulation
Se recabaron muestras de pacientes entre 2018-2019. Los pacientes negativos para COVID-19 fueron recogidos con anterioridad al establecimiento de la pandemia. Las muestras positivas fueron confirmadas por PCR y diagnóstico serológico y corresponden a pacientes graves ingresados en la UCI del Hospital Universitario Central de Asturias. Las características generales de la muestra de pacientes se recogen en la tabla 1.Patient samples were collected between 2018-2019. Patients negative for COVID-19 were collected prior to the establishment of the pandemic. The positive samples were confirmed by PCR and serological diagnosis and correspond to serious patients admitted to the ICU of the Central University Hospital of Asturias. The general characteristics of the patient sample are shown in Table 1.
Tabla 1 - Características generales de la muestra. Table 1 - General characteristics of the sample.
Recogida de la muestraSample collection
Para el análisis sobre 3 mL de sangre. La extracción se realizó mediante punción se sangre venosa media o radial y tubo de vacío con EDTA como coagulante. La muestra se mantuvo a 4 ° C hasta ser procesada.For analysis on 3 mL of blood. The extraction was carried out by puncture of middle or radial venous blood and a vacuum tube with EDTA as a coagulant. The sample was kept at 4 °C until processed.
Para el análisis sobre gota de sangre. Se realizó una punción digital de la que se extrajeron 2 gotas (20 μL) que se recogieron directamente en un tubo de centrifuga de 1,5 mL (tipo Eppendorf) con 980 μl de agua destilada.For blood drop analysis. A finger puncture was performed from which 2 drops (20 μL) were extracted and collected directly in a 1.5 mL centrifuge tube (Eppendorf type) with 980 μL of distilled water.
Procesado de la muestraSample processing
Para el análisis sobre 3 mL de sangre. Se centrifugaron las muestras a 5000 g 10 ’ para depositar los hematíes. Se retiró el plasma con micropipeta y se añadió una cantidad de agua equivalente a la del plasma retirado. Se resuspendió el precipitado de hematíes hasta obtener una suspensión homogénea. La suspensión se sometió a 3 ciclos de congelación descongelación (-80° C 5’- 37° C 10’) y posteriormente se centrifugó a 10.000 g a 4 ° C durante 10’ para eliminar los restos de membranas. For analysis on 3 mL of blood. The samples were centrifuged at 5000 g 10' to deposit the red blood cells. The plasma was removed with a micropipette and an amount of water equivalent to that of the removed plasma was added. The red blood cell pellet was resuspended until a homogeneous suspension was obtained. The suspension was subjected to 3 freeze-thaw cycles (-80° C 5'- 37° C 10') and subsequently centrifuged at 10,000 g at 4°C for 10' to remove membrane debris.
Concentración de hemoglobinaHemoglobin concentration
Para el análisis sobre 3 mL de sangre se realizó una dilución 1/100 en agua destilada, para el análisis sobre gota de sangre se cogió la solución de sangre obtenida en el protocolo de extracción. La concentración de hemoglobina se realiza mediante ensayo colorimétrico (Sigma MAK115) siguiendo instrucciones del fabricante.For the analysis on 3 mL of blood, a 1/100 dilution was carried out in distilled water; for the analysis on a drop of blood, the blood solution obtained in the extraction protocol was taken. Hemoglobin concentration is performed using a colorimetric assay (Sigma MAK115) following the manufacturer's instructions.
Medida del espectro de absorción de las muestrasMeasurement of the absorption spectrum of the samples
Un volumen de 100 μL de una solución 1/100 en agua destilada (análisis 3 mL de sangre) o directamente de la solución de sangre (análisis sobre gota de sangre) se cargaron en placas de 96 pocilios por duplicado. Se realizó una lectura de absorción de luz entre 500 y 1000 nm cada 5 nm en un espectrofotómetro Varian CARY® 50 UV-Vis.A 100 μL volume of a 1/100 solution in distilled water (3 mL blood analysis) or directly from the blood solution (blood drop analysis) was loaded into 96-well plates in duplicate. A light absorption reading between 500 and 1000 nm was performed every 5 nm on a Varian CARY® 50 UV-Vis spectrophotometer.
RESULTADOSRESULTS
Existen diferencias significativas en el espectro de absorción de la Hemoglobina entre enfermos de COVID-19v personas sin la enfermedad.There are significant differences in the absorption spectrum of Hemoglobin between COVID-19 patients and people without the disease.
Se realizó una extracción para obtener una muestra enriquecida en hemoglobina (Hb) y se analizó el espectro de absorción y la concentración. Se pudo observar un cambio sustancial en la absorbancia de la hemoglobina en el rango entre 500 y 1000 nm, concentrándose los cambios más significativos en la franja entre 600 y 900 (Figuras 1A y1D).An extraction was performed to obtain a sample enriched in hemoglobin (Hb) and the absorption spectrum and concentration were analyzed. A substantial change in the absorbance of hemoglobin could be observed in the range between 500 and 1000 nm, with the most significant changes concentrating in the range between 600 and 900 (Figures 1A and 1D).
Dichos cambios no son atribuibles a una diferencia sustancial en la concentración de hemoglobina entre ambos grupos (Figura 1C). Es especialmente reseñable que la diferencia de valores del área bajo la curva (AUC, por sus siglas en inglés) no se solapa entre los grupos (Figura 1B).These changes are not attributable to a substantial difference in hemoglobin concentration between both groups (Figure 1C). It is especially notable that the difference in area under the curve (AUC) values does not overlap between the groups (Figure 1B).
El patrón de absorción de la hemoglobina es detectable en una muestra de gota de sanare.The hemoglobin absorption pattern is detectable in a sanare drop sample.
Dada la poca cantidad necesaria para el estudio anterior se creó un protocolo que permitiera el uso de una punción de sangre digital y volúmenes de sangre del orden micromolar. Tras diferentes pruebas se realizó un protocolo en el que 2 gotas de sangre son diluidas en 980 μL de agua destilada. La presión osmótica rompe la muestra, la dilución obtenida es idónea para medidas de absorbancia espectral y de concentración análogas a las obtenidas en las muestras de 3 mL (Figura 2). Given the small amount necessary for the previous study, a protocol was created that would allow the use of a digital blood puncture and blood volumes of the micromolar order. After different tests, a protocol was carried out in which 2 drops of blood are diluted in 980 μL of distilled water. The osmotic pressure breaks the sample, the dilution obtained is ideal for measurements of spectral absorbance and concentration analogous to those obtained in the 3 mL samples (Figure 2).
CONCLUSIÓNCONCLUSION
El método TEARD (Test Endógeno de Actividad Redox) permite, mediante la observación de los cambios en el espectro de absorción de la hemoglobina, discriminar aquellos pacientes que han padecido un cuadro severo de COVID-19.The TEARD method (Test Endogenous Redox Activity) allows, by observing changes in the absorption spectrum of hemoglobin, to discriminate those patients who have suffered from severe COVID-19.
El protocolo permite la observación del espectro de absorción de la hemoglobina y su concentración mediante una punción digital y 2 gotas de sangre.The protocol allows the observation of the absorption spectrum of hemoglobin and its concentration using a finger prick and 2 drops of blood.
Así este método tiene la potencialidad de diagnosticar COVID de una manera rápida (la medida de la absorbancia, concentración y cálculo del AUC se puede realizar en minutos (10-15)), barata (no requiere reactivos adicionales) y mínimamente invasiva (punción digital). Thus, this method has the potential to diagnose COVID in a rapid way (the measurement of absorbance, concentration and calculation of the AUC can be performed in minutes (10-15)), cheap (does not require additional reagents) and minimally invasive (fingerstick). ).
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