ES2926556B2 - Impregnacion supercritica de productos farmacoactivos en polimeros de acido polilactico (pla) adecuados para su uso en impresion 3d - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

IMPREGNACIÓN SUPERCRÍTICA DE PRODUCTOS FARMACOACTIVOS EN POLÍMEROS DE ÁCIDO POLILÁCTICO (PLA) ADECUADOS PARA SU USO EN IMPRESIÓN 3D

SECTOR DE LA TÉCNICA

Esta invención está relacionada con la producción de Ácido Poliláctico (PLA) impregnado con extractos naturales con propiedades farmacoactivas utilizando la tecnología supercrítica para su uso como implantes farmacoativos en Biomedicina mediante fabricación aditiva en impresoras 3D. El sector que cubre, por tanto, entra dentro de la aplicación de la Ingeniería Química, al analizar un proceso tecnológico de impregnación supercrítica, aplicada a la Biomedicina.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La impresión 3D fue diseñada en un principio con el fin de obtener modelos en tres dimensiones de diseños preliminares de distintos proyectos. Nació pues, como una herramienta para la creación de prototipos, que recibía el nombre de "rapid prototyping”. Con el rápido desarrollo en ingeniería de materiales y el diseño digital, se presentó una nueva perspectiva: se podía utilizar esta tecnología para producir elementos completamente funcionales, y listos para su uso o comercialización, además, podía hacerse de forma personalizada. Llegados a este punto, y considerando el alcance de este tipo de dispositivos, un comité de la "American Society for Testing and Materials” (ASTM) consensuó el término de fabricación aditiva referida a esta tecnología (Ligon, et al. 2017. Polymers for 3D Printing and Customized Additive Manufacturing. Chemical Reviews, 117(15), 10212-10290.).

Existen distintas tecnologías de fabricación aditiva que abarcan desde la impresión láser en resina o el bombeo de electrones sobre un material metálico o cerámico, hasta el más popular y común dispositivo de modelado por deposición fundida, conocido por sus siglas en inglés FDM (Fused Deposition Modeling). Todos ellos presentan grandes ventajas en el ámbito de la medicina desde la posibilidad de crear resistentes prótesis metálicas o cerámicas, hasta soportes blandos, empleando como materia prima polímeros plásticos, ofreciendo estos, distintas funcionalidades, pudiendo ser empleados para el crecimiento de tejidos u órganos, o también con fines protésicos, como es el caso del stent (Singh et al. 2017. Material issues in additive manufacturing: A review. Journal of Manufacturing Processes, 25, 185-200).

En el desarrollo de dispositivos biomédicos lo lógico es buscar un polímero que pueda ofrecer las características mecánicas que se requieren para cumplir su misión, y en algunos casos (como los stents cardiacos o diversos scaffolds) que además sea completamente degradable en el ambiente fisiológico, y cumplir unas condiciones concretas que permitan su fácil manipulación y modelado. Los trabajos de Guerra y col (Guerra et al. 2018. 3D-printed PCL/PLA composite stents: Towards a new solution to cardiovascular problems. Materials, 11(9), 1-13; Guerra et al. (2017). Fabrication of PCL/PLA Composite Tube for Stent Manufacturing. Procedia CIRP, 65, 231-235.) presentan al PLA y la policaprolactona (PCL) como polímeros adecuados para la fabricación de stents cardíacos por ejemplo usando la impresión 3D. El aspecto más importante en ambos materiales es que llegan a degradarse por completo, por hidrólisis en sus enlaces éster, pero ofreciendo una durabilidad, aproximada, de un año en el caso del PLA, y superior a los dos años en el del PCL. Además, la combinación de estos polímeros entre sí, y con otros materiales puede proporcionar una mejora de las características, ofreciendo así mejores rendimientos (Singh et al.

2017. Material issues in additive manufacturing: A review. Journal of Manufacturing Processes, 25, 185-200).

La mayoría de estos implantes requieren de la adición de un fármaco activo que facilite la biocompatibilidad de éste en el cuerpo humano. Es por tanto importante por un lado seleccionar el fármaco más adecuado, y por otro, tener en cuenta el método de integración del producto bioactivo en el polímero biodegradable.

En relación al producto farmacoactivo, muchos implantes incorporan extractos naturales de plantas con propiedades activas tales como las capacidades antioxidantes o antiinflamatorias, de ahí el interés de analizar la viabilidad de extractos de plantas para su integración en implantes biomédicos. Así, la Mangifera indica L., planta perteneciente a la familia Anacardiaceae, cuyo fruto es el mango, tiene atribuida multitud de capacidades terapéuticas desde hace siglos, siendo empleados ampliamente en la medicina tradicional frente a multitud de dolencias (Barreto et al.

2008. Characterization and quantitation of polyphenolic compounds in bark, kernel, leaves, and peel of mango (Mangifera indica L.). Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56(14), 5599-5610; López-Ríos et al. 2020. Central nervous system activities of extract Mangifera indica L. Journal of Ethnopharmacology, 260, 112996; Severi et al. 2009. Polyphenols with antiulcerogenic action from aqueous decoction of mango leaves (Mangifera indica L.). Molecules, 14(3), 1098-1110; Wightman et al.

2020. Acute Effects of a Polyphenol-Rich Leaf Extract of Mangifera indica L. (Zynamite) on Cognitive Function in Healthy Adults: A Double-Blind, Placebo-Controlled Crossover Study. Nutrients, 12(8), 2194). Además, en estos trabajos se le atribuyen capacidades antiviral, antibacteriana, y un elevado carácter de modulador inmunológico.

La mangiferina (figura 1) es uno de los polifenoles de mayor relevancia en el mango, tanto en su proporción como en su bioactividad, destacando sus capacidades antioxidante y antiinflamatoria (Fernández-Ponce et al. 2017. Impregnation of mango leaf extract into a polyester textile using supercritical carbon dioxide. Journal of Supercritical Fluids, 128(May), 208-217; Khumpook et al.2019. Anti-inflammatory and antioxidant activity of Thai mango (Mangifera indica Linn.) leaf extracts. Comparative Clinical Pathology, 28(1), 157-164; Swaroop et al. 2018. Mango (Mangifera indica Linn) and Anti-Inflammatory Benefits: Versatile Roles in Mitochondrial Bio-Energetics and Exercise Physiology. Functional Foods in Health and Disease, 8(5), 267). Multitud de estudios validan estos efectos tanto in vivo como in vitro (Huang et al. 2018. Free Radical-Scavenging, Anti-Inflammatory, and Antibacterial Activities of Water and Ethanol Extracts Prepared from Compressional-Puffing Pretreated Mango (Mangifera indica L.) Peels. Journal of Food Quality, 2018; Khumpook et al. 2019. Antiinflammatory and antioxidant activity of Thai mango (Mangifera indica Linn.) leaf extracts. Comparative Clinical Pathology, 28(1), 157-164; Stohs et al. 2018. A Review on Antioxidant, Anti-Inflammatory and Gastroprotective Abilities of Mango (Magnifera indica) Leaf Extract and Mangiferin. Journal of Nutrition and Health Sciences, 5(3), 1­ 8), y en el caso de la capacidad antiinflamatoria, en concreto, se ha comprobado que la mangiferina es capaz de actuar frente a distintos mecanismos de inflamación. Se conoce la capacidad para inhibir la producción de monóxido de Nitrógeno (NO), que provoca la dilatación de los vasos sanguíneos, característica de la inflamación, cuando se encuentra en una alta proporción. Por otro lado, presenta la capacidad de inhibir la producción de otros factores implicados en los procesos inflamatorios, como pueden ser la interleucina-ip (IL-ip), una de las principales citoquinas implicadas en la activación de los linfocitos y como promotor de algunas moléculas de la fase aguda de la inflamación, además de inducir fiebre (Dinarello, C. A. 2005. Blocking IL-1 in systemic inflammation. Journal of Experimental Medicine, 201(9), 1355-1359; Gabay et al. 2010. IL-1 pathways in inflammation and human diseases. Nature Reviews Rheumatology, 6(4), 232-241; O’Neill et al. 2000. The IL-1 receptor/toll-like receptor superfamily: Crucial receptors for inflammation and host defense. Immunology Today, 21(5), 206-209), o el Factor de Necrosis Tumoral-a, producido principalmente por macrófagos activados, que actúa conjuntamente con la IL-1 p en el desarrollo de la fase aguda de la inflamación (González-Flores et al. 2014. TNFα-induced apoptosis in human myeloid cell lines HL-60 and K562 is dependent of intracellular ROS generation. Molecular and Cellular Biochemistry, 390(1-2), 281-287; Stohs et al., 2018).

Además, recientes estudios han evaluado otro tipo de funciones como es el caso Jiang y su equipo (Jiang et al. 2020. Mangiferin exert cardioprotective and anti-apoptotic effects in heart failure induced rats. Life Sciences, 249(January), 117476), que han probado la capacidad cardioprotectora de la mangiferina. En este estudio inducían un ataque cardíaco a ratones suministrándoles isoproterenol, y les suministraban, además, distintas cantidades de mangiferina, dando como resultado, que la mangiferina evitaba la apoptosis de los cardiomiocitos debida a la acción del isoproterenol.

Por otro lado, en relación al método de adicionar el producto farmacoactivo al polímero, existen diversos métodos, como puede ser empleando la fundición en solvente, o su versión continua, por extrusión del material fundido, o incluso por un simple proceso de inmersión. Sin embargo, estos métodos pueden incluir procesos térmicos que deterioren las sustancias a impregnar, o añaden pasos adicionales para eliminar solventes no deseables en el producto final. Frente a estos métodos se impone la impregnación con fluidos supercríticos (IFSC), en concreto con CO² supercrítico (scCO²) (Champeau et al. 2015. Drug loading of polymer implants by supercritical CO₂ assisted impregnation: A review. Journal of Controlled Release, 209, 248-259.).

Las tecnologías de fluidos supercríticos no son solamente útiles para la extracción de estos agentes bioactivos, sino que permiten, además, la impregnación de estas mismas sustancias en soportes adecuados para su liberación posterior de forma controlada, pudiendo aplicarse a distintos propósitos (Cejudo Bastante et al. 2018. Characterization of olive leaf extract polyphenols loaded by supercritical solvent impregnation into PET/PP food packaging films. Journal of Supercritical Fluids, 140, 196-206).

La IFSC tiene lugar en cuatro etapas, principalmente: (i) La disolución del soluto en el scCO² , (ii) contacto entre el polímero y la disolución supercrítica, (iii) la difusión del compuesto activo hacía la matriz del polímero, que se encuentra hinchado, (iv) y la despresurización, con la cual el CO² es eliminado, quedando el polímero libre del gas y cargado del compuesto de interés (Cejudo Bastante et al.2019. Effect of supercritical CO² and olive leaf extract on the structural, thermal and mechanical properties of an impregnated food packaging film. Journal of Supercritical Fluids, 145, 181-191.; Champeau et al. 2015. Drug Loading of Sutures by Supercritical CO₂ Impregnation: Effect of Polymer/Drug Interactions and Thermal Transitions. Macromolecular Materials and Engineering, 300(6), 596-610).

Entre las ventajas de la IFSC, y en concreto empleando scCO² como disolvente, encontramos (Cabezas et al. 2012. Production of biodegradable porous scaffolds impregnated with indomethacin in supercritical CO 2. Journal of Supercritical Fluids, 63, 155-160; Dias y col. 2013. Wound dressings loaded with an anti-inflammatory jucá (Libidibia ferrea) extract using supercritical carbon dioxide technology. Journal of Supercritical Fluids, 74, 34-45; Villegas et al. 2017. Supercritical impregnation of cinnamaldehyde into polylactic acid as a route to develop antibacterial food packaging materials. Food Research International, 99(June), 650-659):

• Las condiciones de operación, que se muestran favorables para el agente activo, manteniendo sus características físicas y químicas, y evitando su degradación • El alto control sobre la carga de los compuestos bioactivos, ya que permite la selección de las sustancias que se pretenden impregnar, puesto que, de un mismo extracto, variando las condiciones de presión y temperatura podemos modular los compuestos que son disueltos en el scCO² , y por tanto podríamos elegir cuales son impregnados, así como la cantidad de los mismos.

• La operación puede realizarse en un solo paso, pues no se necesitan etapas posteriores para la eliminación de residuos de disolventes, haciendo del proceso una metodología respetuosa con el medio ambiente y segura para el consumidor final.

Sin embargo, hay que destacar una desventaja importante, y es que, debido a las mismas condiciones que resultan favorables para el agente bioactivo, los polímeros pueden sufrir distintas alteraciones (Cejudo Bastante et al., 2019). Estas alteraciones están relacionadas con la modificación de su estructura, porosidad o generando un hinchamiento (aumento del tamaño del diámetro, espesor o tamaño del producto, conocido como “foaming”) que debe controlarse en el proceso de impregnación. El control de este efecto puede realizarse con cambios en las condiciones de presión y temperatura de impregnación, así como optimizando las condiciones de presurización y despresurización.

La IFSC ya ha comenzado a mostrarse como un recurso de gran utilidad en el ámbito médico con la aparición de dispositivos impregnados con sustancias activas, como lentes con fármacos para reducir los efectos negativos de una intervención ocular (Ongkasin et al. 2020. Supercritical fluid technology for the development of innovative ophthalmic medical devices: Drug loaded intraocular lenses to mitigate posterior capsule opacification. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 149, 248-256), vendajes (Dias et al., 2013) y suturas (Champeau et al., 2015) cargados con fármacos o sustancias naturales con capacidades antiinflamatorias, e incluso en el campo de la ingeniería de tejidos se estudia su uso para el desarrollo de scaffolds con propiedades particulares que favorezcan el desarrollo celular (Cabezas et al., 2012).

En estudios previos (Sánchez-Sánchez et al, 2017; Impregnation of mango leaf extract into a polyester textile using supercritical carbon dioxide, J Supercrit. Fluids 128, 208­ 217, y Belizon et al, 2018; Supercritical impregnation of antioxidant mango polyphenols into a multilayer PET/PP food-grade film. J CO² Utiliz. 25, 56-67) ya se ha analizado la impregnación supercrítica del extracto de hoja de Mangifera indica L. en de fibras de poliéster y en un film de PET/PP, respectivamente. El proceso analizado incluye una primera etapa de impregnación de las fibras con extracto de hoja de Mangifera indica L. analizando presiones en el rango 100-400 bar, un rango de temperatura entre 35-55°C, un tiempo de impregnación de 22 horas, con dióxido de carbono supercrítico y etanol (con una relación a la capacidad del recipiente de impregnación de un 5%), seguido de una segunda etapa de despresurización del sistema a una velocidad en un rango de 0,6-25 bar/min, manteniendo éste sus propiedades antiinflamatorias y antioxidantes y presentando aplicación en implantes farmacoactivos.

Por otro lado, la IFSC ya se ha aplicado a muestras de PLA en un estudio previo (Villegas et al; 2017. Supercritical impregnation of cinnamaldehyde into polylactic acid as a route to develop antibacterial food packaging. Food Res. Int. 99-1, 650-659) en el que se estudia la impregnación de cinamaldehído pero en este caso para fines alimentarios. En una primera etapa se impregna el cinamaldehído sobre el PLA bajo unas condiciones de 90-120 bares de presión, temperatura de 40°C, un tiempo de impregnación de 3 horas, con dióxido de carbono supercrítico, seguido de una segunda etapa de despresurización del sistema a una velocidad en un rango de 10-100bar/min.

Finalmente, hay publicada una patente (CN105944147A. 2016-09-21. (USCU) UNIV SICHUAN) en la que se hace referencia a la preparación de material de ingeniería de tejidos óseos con PLA, donde se lleva a cabo primero una impresión de PLA mediante la tecnología de prototipado rápido y a continuación una impregnación del material con propiedades biomédicas en condiciones de CO² supercrítico y finalizando con una despresurización.

Considerando lo expuesto anteriormente, en la presente propuesta de patente se propone utilizar la técnica de impregnación supercrítica para impregnar polímerosde PLA previamente al proceso de impresión 3D, de forma que el producto obtenido tras el proceso de impresión mantenga propiedades bioactivas de interés farmacológico. Se incluyen las pruebas realizadas en las que se determinan las propiedades antioxidantes y antiinflamatorias antes y después del proceso de impresión 3D. Como se ha indicado anteriormente, el proceso de impregnación supercrítica puede degradar la estructura del PLA de forma que no pueda ser utilizado en la impresora 3D. Los trabajos publicados buscan la impregnación del polímero y la generación de una mayor porosidad en el producto final que favorezca la endotelización de la prótesis. Están orientados a la impregnación tras el proceso de generación de la prótesis y no están orientados a generar un material adecuado para usarse en las impresoras convencionales. Para ello hay que orientar el proceso de impregnación a minimizar el daño del polímero de forma que pueda usarse en la impresora y garantizar la correcta distribución del extracto en toda la estructura del polímero.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Entre los nuevos recursos que se están desarrollando actualmente para el tratamiento de diversas dolencias, destaca el desarrollo de prótesis y endoprótesis con productos biodegradables y propiedades farmacoactivas, que nacen de la necesidad de paliar los inconvenientes de la intervención para la colocación de las endoprótesis y prótesis tradicionales. Para generar las propiedades farmacoactivas es necesario adicionar a la prótesis una sustancia o mezcla de sustancias con propiedades bioactivas que trasladen estas propiedades al dispositivo. Muchos de los fármacos utilizados en prótesis son derivados de extractos naturales de plantas con altas propiedades bioactivas. El empleo de derivados naturales como remedio tradicional ha ocupado un importante papel en el tratamiento de múltiples enfermedades, gracias a sus singulares capacidades bioactivas. La preocupación por el medio ambiente y los recursos que nos ofrece ha generado una tendencia hacia la obtención de estos compuestos naturales de manera más segura y eficaz desarrollando tecnologías respetuosas con el medio ambiente y eficientes como las tecnologías con fluidos supercríticos.

La presente invención permite el desarrollo de endoprótesis y prótesis bioabsorbibles con capacidades farmacoactivas proporcionadas por la funcionalización del polímero por adición de un extracto natural obtenido a partir de la hoja de Mangifera indica L., empleando tecnologías de fluidos supercríticos. Para la generación del dispositivo se propone emplear la tecnología de impresión 3D. Con este fin, se estudia el proceso de impregnación asistida por CO² para la deposición del producto farmacoactivo en la matriz de uno de los polímeros más destacados en el campo de la impresión 3D dentro del ámbito de la medicina, el ácido poliláctico, o PLA. Tras el análisis de las variables de operación proporción de soluto, presión y temperatura sobre las capacidades antiinflamatoria y antioxidante, el hinchamiento del filamento y la carga total de soluto, se seleccionan las más adecuadas para la generación de un filamento que pueda ser utilizado en una impresora 3D convencional.

El principal efecto técnico que se obtendría de la configuración concreta reivindicada que hace que este proceso tenga un componente inventivo son las condiciones de presión, temperatura, porcentaje de codisolvente y velocidades de presurización/despresurización orientadas a mantener inalteradas la estructura porosa del PLA, y así evitar un “hinchamiento” excesivo, para que pueda ser utilizado en una impresora 3D convencional. Los estudios previos, tal y como se han descrito en el apartado de antecedentes, centraban sus objetivos en obtener un producto con las mejores propiedades activas posibles, fomentando incluso el proceso de “foaming”. Esto hace que los productos de PLA impregnados de otras sustancias bioactivas o el PET impregnado de extracto de mango conocidos no sean viables para un procesamiento posterior en impresión 3D, mientras que el producto de la invención propuesta sí lo es.

La impregnación supercrítica se lleva a cabo en un proceso discontinuo (batch), con extracto de mango disuelto en etanol, en una concentración de entre 90.000 y 100.000 ppm, y con un volumen de disolución de extracto de entre 1 y 3% en relación a la capacidad del recipiente de impregnación. Por debajo del 1% la cantidad de extracto no es suficiente como para impregnar adecuadamente el polímero, y volúmenessuperiores al 3% generan un hinchamiento excesivo del polímero, no pudiendo ser utilizado en el proceso de impresión 3D. El proceso consiste en introducir en el reactor un volumen concreto de extracto disuelto en etanol, junto con fragmentos de PLA, de características conocidas, cargados en un soporte de acero, para evitar el contacto directo con la sustancia a impregnar y para minimizar el contacto entre los fragmentos introducidos. Una vez ambos componentes de la impregnación han sido depositados en el reactor, encendemos el agitador magnético, nos aseguramos de que no existen interferencias con la estructura de soporte del PLA, y se cierra el reactor.

A continuación, se establecen los valores consigna de presión y temperatura. La presión del sistema durante el proceso de impregnación se selecciona entre un rango de 100-400 bar, siendo el rango óptimo 100-150 bar. A presiones menores a 100 bar la densidad del dióxido de carbono supercrítico no es lo suficientemente elevada y la solubilidad de las sustancias es muy limitada. A presiones superiores de este rango, se produce una adecuada impregnación, pero el polímero se deforma en exceso, no pudiendo ser utilizado en la impresora 3D. En cuanto a la temperatura, se selecciona del intervalo 35-100 °C, siendo el intervalo óptimo 35-45 °C. A temperaturas menos a 35 °C el dióxido de carbono dejaría de estar en condiciones supercríticas (punto crítico de 31°C) y a temperaturas superiores nuevamente se deterioraría el polímero impidiendo su uso en la impresora 3D.

Una vez establecidos los valores de presión y temperatura, se programa el método de despresurización que se llevará a cabo al finalizar el tiempo de operación. Una vez que se alcance la temperatura de operación, se activa la bomba de CO² hasta alcanzar la presión de trabajo. El tiempo de impregnación puede seleccionarse del rango entre 1­ 24 horas, encontrándose el valor óptimo en el rango 12-24 horas. A tiempos menores a 12 horas no se asegura una impregnación homogénea del extracto en el polímero, y a tiempos mayores a 24 horas no se aprecian mejoras en la impregnación. Transcurrido el tiempo designado a la impregnación se desactivan el sistema de calefacción y el suministro de CO² , para dar comienzo al proceso de despresurización a las condiciones programadas. La velocidad de despresurización se selecciona de un rango entre 1 y 100 bar/min, siendo el rango óptimo entre 20 y 40 bar/min. A velocidades menores a 20 bar/min el proceso se ralentiza en exceso, mientras que a velocidades superiores a 40 bar/min el polímero se expande en exceso, no pudiéndose usar en la impresora 3D.

Con el objetivo de evitar el hinchamiento del polímero PLA, que impida su uso en la impresora 3D, es necesario trabajar en unas condiciones determinadas. Si éstas no se controlan, se puede producir el fenómeno de hinchamiento, denominado foaming, o esponjamiento (ya explicado anteriormente)^ que el polímero puede sufrir en condiciones supercríticas. El scCܲ actúa como lubricante para el polímero favoreciendo la movilidad de sus cadenas, de esta manera el CO² y aquellas sustancias disueltas en él penetran en la matriz polimérica. En el proceso de impregnación se mantienen una presión y temperatura constantes, que dan lugar a la saturación de la matriz con el fluido supercrítico, lo que da lugar al ya mencionado hinchamiento del polímero. Sin embargo, cuando acontece una rápida despresurización, o un aumento brusco de la temperatura puede tener lugar la nucleación y la generación de micro-burbujas en el interior de la matriz provocando un sistema hinchado y más poroso, entonces habrá tenido lugar el fenómeno de foaming. Tanto estas alteraciones, como una posible rotura del polímero, deben evitarse para garantizar que no sufra modificaciones estructurales tras el proceso de impregnación.

Del polímero impregnado se toman unas secciones de dimensiones similares a los fragmentos que se extraen del modelo impreso. Estas secciones harán de control, con el que podremos comparar la capacidad antes y después de la impresión. Se analizan la cinética de liberación del extracto antes y después de imprimir, así como las capacidades antioxidantes y antinflamatorias.

Puede observarse una menor tasa de liberación del extracto de mango desde la muestra impresa con respecto al filamento (figura 2). Durante la SSI (impregnación con disolvente supercrítico) el CO² en estado supercrítico (y el extracto disuelto en él) difunde por el interior del polímero aumentando su porosidad. En la fase de despresurización el CO² en estado gaseoso escapa del interior del polímero mientras las partículas de extracto quedan atrapadas en los canales de difusión creados. Durante la fase de liberación, el extracto difunde al medio aprovechando estos canales de difusión. Sin embargo, durante la impresión 3D, el polímero se funde y se vuelve a solidificar modificando su estructura interna y destruyendo la porosidad alcanzada en la impregnación supercrítica, con lo cual al extracto atrapado en el interior del polímero le es más difícil difundir al medio de liberación. Si se considera el uso biomédico del producto, este resultado es muy positivo ya que permite obtener una cinética de liberación mucho más lenta, prolongando el efecto farmacoactivo del extracto durante más tiempo.

Respecto a la actividad antioxidante y antiinflamatoria, el resultado es que el polímero impregnado presenta una alta capacidad antioxidante y antidesnaturalizante, rondando los valores máximos alcanzados en la evaluación de los primeros filamentos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprensión de las características de la invención, se acompaña como parte integrante de dicha descripción, un juego de dibujos en donde con carácter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

- Figura 1: Estructura de la mangiferina (Severi et al., 2009).

- Figura 2: Perfil de liberación del extracto de mango del filamento impregnado y de la muestra impresa con este filamento en función del tiempo.

- Figura 3: Filamento de PLA en el soporte preparado para la impregnación. Se observa el filamento de PLA antes y después del proceso de impregnación a condiciones óptimas. El filamento obtenido es el que se destinada a la prueba de impresión 3D.

- Figura 4: Recta de calibrado para el método espectrofotométrico. Absorbancia de distintas disoluciones de extracto de mango en PBS.

- Figura 5: Curva de calibrado del método de capacidad antidesnaturalizante para distintas concentraciones de extracto de mango en el medio de reacción.

- Figura 6: Curva de calibrado para el método de capacidad antioxidante para distintas concentraciones de extracto de mango en el medio de reacción.

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

El PLA impregnado se puede conseguir realizando la impregnación supercrítica en un proceso discontinuo. Para asegurar que la impresora 3D pudiese integrar la muestra impregnada, se realizó la impregnación de un filamento de 150 cm de longitud. El filamento se enrolló en una estructura de acero tal y como se muestra en la figura 3, de forma que no haya contacto entre el polímero y el extracto u otras partes del filamento o de otros polímeros que se impregnen al mismo tiempo, para que no se produjeran efectos indeseados. Esta estructura de acero con el PLA se introdujo en el reactor de impregnación. Las condiciones de impregnación fueron 3% de proporción de extracto en relación a la capacidad del recipiente de impregnación, 100 bar de presión y 39 °C de temperatura, dejando el proceso de impregnación durante 24 horas para garantizar que la impregnación en el PLA es homogénea. La descompresión tras el proceso de impregnación se realizó a 30 bar/min. Del filamento obtenido de la impregnación se tomaron unas secciones de dimensiones similares a los fragmentos que se extraen del modelo impreso. Estas secciones hicieron de control, con el que poder comparar la capacidad antes y después de la impresión.

Para estudiar la liberación del extracto desde las muestras de filamento impregnado y muestras impresas se introdujeron estas en un recipiente cerrado herméticamente con una disolución tampón fosfato salina (PBS) de pH 6,3 cuya composición se indica en la tabla 1, y se mantuvieron a 37 ±2 °C de temperatura en una incubadora de laboratorio. La cantidad de muestra introducida en cada ensayo fue de aproximadamente 20 mg de PLA impregnado o PLA impregnado e impreso y 10 ml de la disolución de PBS.

Tabla 1. Composición de la disolución tampón fosfato salino (PBS).

Se tomó una alícuota y se analizó por espectrofotometría UV-Vis a una longitud de onda de 275 nm, correspondiente al pico de máxima absorbancia observado en muestras de extracto de mango en base acuosa incluso en pequeña concentración. Teniendo en cuenta la masa inicial de la muestra sólida y el volumen de la disolución se calculó la cantidad de extracto de mango liberada por cada 100 gramos de PLA inicial. La representación de este dato en función del tiempo se muestra en la gráfica de la figura 2.

MÉTODOS PARA DETERMINAR LA BIOACTIVIDAD

1. PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE EXTRACTO DIFUNDIDO

Muestras, tanto de filamento impregnado como impresas tras impregnar, de aproximadamente 0,085 gramos se introdujeron en un recipiente cerrado herméticamente junto con 5 ml de PBS pH 6,3 y se mantuvieron a una temperatura de 37 ± 2 °C en una incubadora de laboratorio durante 9 días, liberándose durante este periodo de tiempo parte del extracto impregnado al medio. De la disolución resultante se destinaron 4,8 ml a la prueba de capacidad antiinflamatoria y 0,2 ml a la prueba de capacidad antioxidante.

2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE EXTRACTO DE MANGO EN LOS ESTUDIOS DE LIBERACIÓN

La concentración de extracto de mango difundida al medio de liberación se calculó en base a la recta de calibrado obtenida previamente con concentraciones conocidas de extracto de mango en base acuosa en la disolución de PBS (Figura 4). Tras cada análisis la alícuota era devuelta al recipiente para mantener el volumen inicial.

El análisis espectrofotométrico se llevó a cabo en un espectrómetro UV-Vis modelo Cary 60 de Agilent Technologies (Santa Clara, California, Estados Unidos).

3. PRUEBA DE CAPACIDAD ANTIINFLAMATORIA

Una de las características de algunos medicamentos antiinflamatorios no esteroideos, como por ejemplo indometacina, ibufenaco, ácido flufenámico o ácido salicílico, es su habilidad para estabilizar (prevenir la desnaturalización) la albúmina sometida a tratamiento térmico a pH fisiológico (pH 6,2-6,5) (Williams, Grant). Igualmente, según reportan bastantes estudios in vitro, la capacidad antiinflamatoria de un extracto está relacionada con su capacidad de inhibición de la desnaturalización de la albúmina por acción térmica.

Se aplicó primero el método para evaluar la capacidad antidesnaturalizante del extracto de hojas de mango usado en la impregnación. Para ello, la mezcla de reacción consistió en 0,2 ml de disolución de albúmina de huevo (preparada mezclando 0,1 g de albúmina de huevo en polvo con 10 ml de agua destilada), 2,8 ml de PBS pH 6,3 y 2 ml de extracto en base acuosa a distintas concentraciones. Esta misma mezcla, sustituyendo los 0,2 ml de la disolución de albúmina por PBS sirvió como blanco de extracto. Como control se usó una mezcla de 0,2 ml de la disolución de albúmina, 2,8 ml de PBS y 2 ml de agua destilada.

Estas muestras se mantuvieron a 37 ± 2 °C en una incubadora de laboratorio durante 15 minutos y después a 70 ± 2 °C en un baño termostático. Las muestras se enfriaron con agua corriente y se midió su absorbancia a una longitud de onda de 660 nm utilizando la disolución de PBS como blanco.

Cuando no existe extracto en el medio (mezcla control) la albúmina se desnaturaliza y precipita. Sin embargo, al añadir el extracto, este inhibe en parte esa desnaturalización. La turbidez generada por la albúmina no desnaturalizada en disolución dará valores de absorbancia más altos que los obtenidos en ausencia de extracto.

La capacidad antidesnaturalizante (% CAD) se calculó en base al porcentaje de inhibición de la desnaturalización (% Inh) con la siguiente ecuación:

Donde Ac es la absorbancia de la mezcla control (sin extracto), Am es la absorbancia de la mezcla con el extracto y Amb es la absorbancia de la mezcla usada como blanco de extracto (sin albúmina). La representación de cada concentración final de extracto en la mezcla de reacción ([EM]real) frente al % CAD sirvió como curva de calibrado de este método (Figura 5).

Para la evaluación de la capacidad antidesnaturalizante de las muestras de filamento impregnado y las muestras impresas con este filamento se procedió de la misma forma sustituyendo los 4,8 ml del volumen de PBS más el extracto por 4,8 ml de la disolución de extracto difundido.

4. PRUEBA DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

La actividad antioxidante del extracto, de los filamentos impregnados con éste y de las muestras impresas con el filamento, se determinó con un protocolo basado en el método desarrollado por Brand-Williams, Cuvelier, & Berset, en 1995 (Cuvelier et al.

1995. Use of a Free Radical Method to Evaluate Antioxidant Activity. The Microflown E-Book, 28, 25-30.), empleando 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical (DPPH), diluido en etanol en una concentración de 6*10"5 mol/L.

Se mezcló un volumen de 0,1 ml de extracto de mango a distintas concentraciones con 3,9 ml de la disolución de DPPH y, tras un periodo de incubación de 2 horas a temperatura ambiente, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 515 nm.

La capacidad antioxidante se calculó en función del DPPH remanente (DPPHr) empleando la ecuación 2, donde A f hace referencia a la absorbancia al final de la incubación, y Ai es la absorbancia inicial de la disolución de DPPH.

La representación de la concentración final del extracto en la mezcla de reacción ([EM]real) respecto al % CAO sirve como curva de calibrado de este método (Figura 6).

Para la evaluación de la capacidad antioxidante de las muestras de filamento impregnado y las muestras impresas con este filamento se procedió de la misma forma sustituyendo los 0,1 ml del extracto por 0,1 ml de la disolución de extracto difundido.

En relación a los valores de actividad, las muestras, mostraron los resultados representados en la tabla 2 para las pruebas de capacidad antiinflamatoria y capacidad antioxidante.

Tabla 2. Resultados de las pruebas de bioactividad

* [EM]: Concentración de extracto de mango liberada al medio calculada siguiendo la metodología explicada en el apartado 1.2. [EM]^rea: Corrección de la concentración de extracto liberada en el medio de reacción para cada prueba de bioactividad.

El resultado es que el filamento impregnado presentó una alta capacidad antioxidante y antidesnaturalizante, rondando los valores máximos alcanzados en la evaluación de los primeros filamentos. El valor más bajo que presentaron es atribuido a la cinética de liberación más lenta de las muestras impresas frente al filamento impregnado. Esto hizo que su bioactividad, por tanto, fuera menor para un mismo tiempo de medición.

APLICACIÓN INDUSTRIAL

La aplicación de la impresión 3D en biomedicina está teniendo un importante auge científico actualmente y sus perspectivas de futuro son enormes. La posibilidad de imprimir en cualquier parte del mundo con una impresora 3D una prótesis que pueda diseñarse a demanda y adaptada a las necesidades del paciente hacen de esta técnica una de las líneas de desarrollo e innovación más importante que está teniendo la biomedicina. No obstante, la prótesis generada requiere de un proceso posterior de impregnación con un producto farmacoactivo que facilite la aceptación por parte del organismo receptor de la prótesis generada. Esto impide que directamente pueda usarse la impresión 3D en un centro hospitalario para esta función. El método que se propone, utilizando la tecnología supercrítica para impregnar PLA con extracto de mango, garantiza que la prótesis se generaría con las propiedades farmacoactivas directamente en la impresora, dado que el proceso de impregnación se realizaría antes directamente sobre la bobina. De esta forma, un hospital que disponga de un servicio de impresión 3D podría adquirir el material previamente impregnado y usarlo directamente en la impresora 3D, obteniendo un producto con propiedades farmacoactivas para su implantación en un organismo receptor.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L. obtenible por un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

i. Impregnación del polímero de PLA con extracto de hoja de Mangifera indica L. bajo condiciones supercríticas a elevada presión y temperatura, con dióxido de carbono y etanol en un recipiente de impregnación. ii. Despresurización del sistema y secado,

donde:

- La presión del sistema durante la etapa de impregnación se selecciona del rango de entre 100 y 150 bar,

- La temperatura del sistema durante la etapa de impregnación se selecciona del rango de entre 35 y 45 °C,

- La cantidad de extracto disuelto en etanol en una concentración de entre 90.000 y 100.000 ppm ocupa entre el 1 y el 3% del recipiente de impregnación. - El tiempo de impregnación es de entre 12 y 24 horas.

- La velocidad del sistema durante la etapa de despresurización es de entre 20 y 40 bar/min.

2. El polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L., obtenido por el procedimiento según reivindicación 1, donde el polímero, cuando se introduce en el recipiente de impregnación en forma de filamento, no debe estar en contacto con el extracto ni con otras partes del filamento o de otros polímeros que se impregnen al mismo tiempo.

3. El polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L., según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso como medicamento.

4. El polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L., según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso como antiinflamatorio.

5. El polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L., según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso como antioxidante.

6. El polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L., según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, para su uso en la obtención de implantes farmacoactivos en biomedicina mediante procesos de impresión 3D.

7. Una prótesis obtenida a partir de un polímero de PLA impregnado con extracto de hoja de Mangifera indica L., según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, mediante procesos de impresión 3D.