ES2925062T3 - Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de falta de perfusión capilar retiniana - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la falta de perfusión capilar retiniana. En particular, la presente invención se refiere a un método para tratar la falta de perfusión de los capilares retinianos en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ROCK. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones farmacéuticas para el tratamiento de falta de perfusión capilar retiniana

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de falta de perfusión capilar retiniana.

Antecedentes de la invención

El desarrollo crónico de un estado de isquemia retiniana en patologías tales como retinopatía diabética, retinopatía generada por radiación y daño como consecuencia de una oclusión venosa da como resultado una perturbación de la despolarización de la membrana celular, lo cual conlleva, a lo largo del tiempo, una destrucción irreversible de la retina. Por tanto, se observa isquemia retiniana en la clínica en situaciones agudas tales como oclusiones arteriales o venosas de la retina, tras la radiación y también en patologías crónicas tales como retinopatía diabética, retinopatía del recién nacido prematuro y enfermedades inflamatorias y hemopatías que conducen a daño retiniano que incluso da como resultado varios casos de una degeneración total de la retina. Por ejemplo, la retinopatía diabética (DR) es la principal causa de ceguera entre individuos en edad de trabajar en países occidentales, representando una preocupación principal de salud pública [1]. La pérdida de visión con DR progresiva surge mediante dos mecanismos principales, edema macular e isquemia retiniana con posteriores complicaciones neovasculares y hemorrágicas. La hiperglucemia crónica induce neurodegeneración, inflamación, activación de la glía que da en última instancia como resultado la rotura de la barrera hematorretiniana (BRB). La barrera hematorretiniana interna en capilares de la retina está compuesta por una capa de endotelio de unión estrecha, y la barrera retiniana externa está formada por el epitelio de pigmento retiniano (RPE) de unión estrecha. Estas dos barreras retinianas controlan estrechamente todos los intercambios entre la retina y la circulación sistémica al tiempo que mantienen, junto con células de Müller de la retina, la homeostasis hidroiónica. Se ha considerado que DR es principalmente una microangiopatía, usada de manera clínica para examinar y clasificar el estadio de la enfermedad [2]. Sin embargo, métodos de exploración novedosos han demostrado que la rotura de la barrera retiniana externa y la neurodegeneración preceden a cambios vasculares de la retina observables [3-5]. Hasta ahora, las opciones terapéuticas para DR han incluido la fotocoagulación por láser de la retina periférica isquémica para evitar la neovascularización y la inyección intraocular de fármacos antiedematosos (agentes anti-VEGF y corticoides) para reducir el edema macular [6]. Actualmente no hay ningún tratamiento disponible cuando la isquemia afecta a la macula y altera de manera irreversible la visión central. El tratamiento clínico de la retinopatía diabética ha logrado reducir significativamente el número de complicaciones graves, pero la isquemia retiniana sigue siendo una de las principales causas de pérdida de visión. Se han identificado dos Rho cinasas estrechamente relacionadas, ROCK1 y ROCK2, como efectores posteriores clave de Rho GTPasasas, que a su vez contribuyen a múltiples funciones del citoesqueleto [7]. Ambas cinasas tienen funciones celulares solapantes, sin embargo, en células polarizadas, se notifica que ROCK-1 es predominante [8-10]. Hasta ahora, se ha mostrado la activación de ROCK-1 anómala en diversas enfermedades tales como hipertensión [11, 12], vasoespasmos coronarios y cerebrales [13, 14], aterosclerosis [15], accidente cerebrovascular [16], hipertensión pulmonar [17, 18] y enfermedades cardiovasculares [19, 20]. En la retinopatía diabética, se piensa que la ruta de Rho/ROCK-1 está implicada en el desarrollo de microangiopatía retiniana, neovascularización y desprendimiento de retina traccional [21]. Fasudilo es un inhibidor de Rho-cinasa que ha demostrado propiedades notables como vasodilatador agudo, neuroprotector y antiinflamatorio no solo en modelos experimentales, sino también en ensayos clínicos [21-25]. Recientemente se notificaron resultados positivos en un estudio piloto en el que se combinó fasudilo con bevacizumab intravítreo (agente anti-VEGF) para pacientes con edema macular resistente a agente anti-VEGF solo [26].

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de falta de perfusión capilar retiniana. En particular, la presente invención se define por las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Los inventores plantearon la hipótesis de que la ruta de Rho/Rock1 contribuye a la remodelación del citoesqueleto en células endoteliales y células epiteliales del pigmento retiniano, alterando posteriormente la función de barreras y la perfusión capilar. Usaron retina diabética de ser humano y rata con diabetes tipo 2 Goto-Kakizaki (GK) de 12 meses de edad. Se analizó la activación de la ruta de Rho/Rhock1 en células endoteliales de la retina y en células epiteliales de pigmento (RPE) mediante su ubicación subcelular en ratas y seres humanos y la fosforilación de sus sustratos. Se sometió a prueba su inhibición por fasudilo in vivo en ratas con respecto a la permeabilidad de barreras y perfusión capilar. En ratas diabéticas, Rock1 está activado en células endoteliales de la retina y células de RPE, tal como se muestra mediante su internalización citoplasmática y activación de MYTP1. Se encontró una ubicación similar en retina diabética de ser humano. La activación de Rock1 indujo una intensa remodelación del citoesqueleto, polidispersidad de tamaño celular, constricción apical y vesículas de membrana que conducen a la apertura de la unión en células de RPE y al cierre capilar en capilares de la retina. Fasudilo restauró parcialmente la función de barrera y la perfusión retiniana y redujo la expresión de VEGF retiniano. Por tanto, la ruta de Rho/Rock1 es un factor principal en alteraciones de perfusión y de barrera inducidas por diabetes en la retina. Su inhibición ocular local puede tener efectos beneficiosos en el tratamiento de isquemia retiniana.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de ROCK para su uso para tratar la falta de perfusión capilar retiniana en un sujeto que lo necesita.

En algunas realizaciones, el sujeto padece isquemia retiniana. El término “isquemia retiniana” tiene su significado general en la técnica y se refiere a los estados en los que el riego sanguíneo a las células de la retina se ve alterado, dando como resultado una deficiencia de oxigenación en el tejido de la retina. El término incluye isquemia macular.

En algunas realizaciones, el sujeto padece isquemia retiniana consecuencia de una enfermedad ocular seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Behcet; uveítis diabética; edema, tal como edema macular, edema macular cistoide y edema macular diabético; coroiditis multifocal; oclusión de venas retinianas, retinopatía diabética, enfermedad oclusiva arterial retiniana y retinopatía por radiación.

En algunas realizaciones, el sujeto padece isquemia macular que está asociada con edema macular. La isquemia macular es una causa principal de pérdida de agudeza visual irreversible y reducción de la sensibilidad al contraste en pacientes con retinopatía diabética.

Tal como se usa en el presente documento, el término “tratamiento” o “tratar” se refiere tanto a tratamiento profiláctico o preventivo, así como a tratamiento curativo o de modificación de la enfermedad, incluyendo tratamiento de paciente en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que ha contraído la enfermedad, así como pacientes que están enfermos o a los que se les ha diagnosticado que padecen una enfermedad o estado médico, e incluye la supresión de recidiva clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que tiene un trastorno médico o que en última instancia puede adquirir el trastorno, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición de, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o trastorno que se repite, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Por “régimen terapéutico” quiere decirse el patrón de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, el patrón de dosificación usado durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La expresión “régimen de inducción” o “periodo de inducción” se refiere a un régimen terapéutico (o a la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un paciente durante el periodo inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un “régimen de carga”, que puede incluir administrar una dosis del fármaco mayor de la que emplearía un médico durante un régimen de mantenimiento, administrar un fármaco con mayor frecuencia que con la que administraría un médico el fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambos. La expresión “régimen de mantenimiento” o “periodo de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o a la porción de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un paciente durante el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, para mantener al paciente en remisión durante periodos de tiempo prolongado (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear una terapia continua (por ejemplo, administrar un fármaco a intervalos regulares, por ejemplo, cada semana, cada mes, cada año, etc.) o terapia intermitente (por ejemplo, tratamiento interrumpido, tratamiento intermitente, tratamiento en recidiva, o tratamiento tras alcanzar unos criterios predeterminados particulares [por ejemplo, dolor, manifestación de enfermedad, etc.]).

Tal como se usa en el presente documento el término “RhoA cinasa” o “ROCK” tiene su significado general en la técnica. ROCK es un miembro de la familia de serina-treonina proteína cinasas. ROCK existe en dos isoformas, ROCK1 y ROCK2 (T. Ishizaki et al, EMBO J., 1996, 15, 1885-1893). Se ha identificado ROCK como una molécula efectora de RhoA, una proteína de unión a GTP pequeña (proteína G) que desempeña un papel clave en múltiples rutas de señalización celulares.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de ROCK” se refiere a un compuesto natural o sintético que inhibe la actividad de ROCK1 y/o ROCK2. En una realización particular, el inhibidor es selectivo. Los compuestos de inhibición de ROCK selectivos no están limitados a ninguna manera particular de inhibición de ROCK selectiva. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más de los compuestos de inhibición de ROCK selectivos inhiben selectivamente la actividad de ROCK1 con respecto a la actividad de ROCK2. Por ejemplo, en algunas realizaciones, uno o más de los compuestos de inhibición de ROCK selectivos inhiben selectivamente la actividad de ROCK2 con respecto a la actividad de ROCK1. Además, en algunas realizaciones, uno o más de los compuestos de inhibición de ROCK selectivos inhiben selectivamente tanto la actividad de ROCK1 como la actividad de ROCK2 con capacidad similar.

En la técnica se conocen bien los inhibidores de ROCK. Por ejemplo, los derivados de isoquinolina, especialmente fasudilo, son inhibidores de ROCK típicos. Fasudilo (hexahidro-1-(5-isoquinolilsulfonil)-1 H-1,4-diazepina), también denominado HA-1077, es un derivado de isoquinolina-sulfonamida y el único inhibidor de ROCK clínicamente disponible desarrollado conjuntamente por Asahi Kasei de Japón y el Departamento de farmacología de la Universidad de Nagoya. Hidroxifasudilo es un metabolito activo de fasudilo in vivo, que tiene una mayor afinidad por ROCK que fasudilo. Otro derivado de isoquinolina, H-1152P, está optimizado basándose en fasudilo. Mediante unión competitiva a la cavidad de unión a ATP, Y-27632, otro tipo de inhibidor de ROCK, inhibe tanto ROCK1 como ROCK2. La optimización de estos compuestos conduce a un inhibidor de ROCK más potente, Y-39983, que es beneficioso para el tratamiento del glaucoma (Kubo T, Yamaguchi A, Iwata N, The therapeutic effects of Rho-ROCK inhibitors on CNS disorders. Ther Clin Risk Manag 2008; 4(3): 605-15). Recientemente se ha desarrollado SLx-2119, un inhibidor específico de ROCK2 (Boerma M, Fu Q, Wang J, Comparative gene expression profiling in three primary human cell lines after treatment with a novel inhibitor of Rho kinase or atorvastatin. Blood Coagul Fibrinolysis 2008; 19(7): 709-18). Se sintetizó una serie de análogos de fasudilo y se evaluó su selectividad y actividad inhibidora frente a ROCK (Satoh N, Toyohira Y, Itoh H, Stimulation of norepinephrine transporter function by fasudil, a Rho kinase inhibitor, in cultured bovine adrenal medullary cells. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 2012; 385(9): 921-31; Nakabayashi S, Nagaoka T, Tani T, Retinal arteriolar responses to acute severe elevation in systemic blood pressure in cats: role of endotheliumderived factors. Exp Eye Res 2012; 103: 63-70; Sun X, Minohara M, Kikuchi H, The selective Rho-kinase inhibitor Fasudil is protective and therapeutic in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol 2006; 180(1-2): 126-34; Yu JZ, Ding J, Ma CG, Therapeutic potential of experimental autoimmune encephalomyelitis by Fasudil, a Rho kinase inhibitor. J Neurosci Res 2010; 88(8): 1664-72; Hou SW, Liu CY, Li YH, Fasudil ameliorates disease progression in experimental autoimmune encephalomyelitis, acting possibly through antiinflammatory effect. CNS Neurosci Ther 2012; 18(11): 909-17; LoGrasso PV, Feng Y. Rho kinase (ROCK) inhibitors and their application to inflammatory disorders. Curr Top Med Chem 2009; 9(8): 704-23; Engel J Jr. A proposed diagnostic scheme for people with epileptic seizures and with epilepsy: report of the ILAE Task Force on Classification and Terminology. Epilepsia 2001; 42(6): 796-803; Fisher Rs , van Emde Boas W, Blume W, Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia 2005; 46(4): 470-2. Inan S, Buyukafsar K. Antiepileptic effects of two Rho-kinase inhibitors, Y-27632 and fasudil, in mice. Br J Pharmacol 2008; 155(1): 44-51; Meihui Chen, Anmin Liu, Ying Ouyang, Yingjuan Huang, Xiaojuan Chao, Rongbiao Pi Fasudil and its analogs: a new powerful weapon in the long war against central nervous system disorders? Expert Opinion on Investigational Drugs, abril de 2013, vol. 22, n.° 4, páginas 537-550). Otros ejemplos de inhibidores de ROCK incluyen los descritos en las publicaciones de patente internacional WO98/06433, WO00/09162, WO00/78351, WO01/17562, WO02/076976, EP1256574, WO02/100833, WO03/082808, WO2004/009555, WO2004/024717, WO2004/108724, WO2005/003101, WO20Q5/035501, WO2005/035503, WO2005/035506, WO2005/058891, WO2005/074642, WO2005/074643, WO2005/Q80934, WO2005/082367, WO2005/082890, WO2005/097790, WO2005/100342, WO2005/103050, WO2005/105780, WO2005/108397, WO2006/044753, WO2006/051311, WO2006/057270, WO2006/058120 , WO2006/072792, WO2011107608A1 y WO2007026920A2.

Por “cantidad terapéuticamente eficaz” quiere decirse una cantidad suficiente del inhibidor de ROCK para el tratamiento de falta de perfusión capilar retiniana con una razón de beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento médico. Se entenderá que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente invención lo decidirá el médico encargado dentro del alcance del criterio médico razonable. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz específico para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno que está tratándose y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto específico empleado; la composición específica empleada, la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del sujeto; el tiempo de administración, vía de administración y tasa de excreción del compuesto específico empleado; la duración del tratamiento; fármacos usados en combinación o de manera coincidente con el polipéptido específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, se encuentra dentro de las habilidades de la técnica iniciar dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta que se logra el efecto deseado. Sin embargo, la dosificación diaria de los productos puede hacerse variar a lo largo de un amplio intervalo desde 0,01 hasta 1.000 mg por adulto al día. Preferiblemente, las composiciones contienen 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 250 y 500 mg del inhibidor de ROCK para el ajuste sintomático de la dosificación al sujeto que va a tratarse. Un medicamento contiene normalmente desde aproximadamente 0,01 mg hasta aproximadamente 500 mg del inhibidor de ROCK, preferiblemente desde 1 mg hasta aproximadamente 100 mg del inhibidor de ROCK. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra habitualmente a un nivel de dosificación de desde 0,0002 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal al día, especialmente desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta 7 mg/kg de peso corporal al día.

El inhibidor de ROCK se combina normalmente con excipientes farmacéuticamente aceptables y opcionalmente matrices de liberación sostenida, tales como polímeros biodegradables, para formar composiciones farmacéuticas. El término “farmacéuticamente” o “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción desfavorable cuando se administran a un mamífero, especialmente un ser humano, según sea apropiado. Un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable se refiere a una carga sólida, semisólida o líquida no tóxica, diluyente, material de encapsulación o adyuvante de formulación de cualquier tipo.

En algunas realizaciones, el inhibidor de ROCK se administra al sujeto por la vía intravítrea.

En algunas realizaciones, el inhibidor de ROCK de la presente invención se administra al sujeto a través de un implante ocular biodegradable. Los implantes pueden formarse de una manera que el inhibidor de ROCK se distribuye o dispersa de manera homogénea a través de toda la matriz de polímero biodegradable. Adicionalmente, los implantes pueden formarse para liberar el inhibidor de ROCK en una región ocular del ojo a lo largo de diversos periodos de tiempo. Por tanto, el inhibidor de ROCK puede liberarse a partir de implantes realizados según la presente invención durante un periodo de tiempo de, por ejemplo, 30-200 días. El inhibidor de ROCK puede comprender desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 90% en peso del implante. En algunas realizaciones, el agente es desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 80% en peso del implante. En algunas realizaciones, el inhibidor de ROCK puede dispersarse de manera homogénea en el polímero biodegradable del implante. El implante puede realizarse, por ejemplo, mediante un método de extrusión secuencial o doble. La selección del polímero biodegradable usado puede variar con la cinética de liberación deseada, tolerancia del paciente, la naturaleza de la enfermedad que va a tratarse y similares. Las características de polímero que se consideran incluyen, pero no se limitan a, la biocompatibilidad y biodegradabilidad en el sitio de implantación, compatibilidad con el inhibidor de ROCK de interés y temperaturas de procesamiento. La matriz de polímero biodegradable comprende habitualmente al menos aproximadamente el 10, al menos aproximadamente el 20, al menos aproximadamente el 30, al menos aproximadamente el 40, al menos aproximadamente el 50, al menos aproximadamente el 60, al menos aproximadamente el 70, al menos aproximadamente el 80 o al menos aproximadamente el 90 por ciento en peso del implante. Los polímeros biodegradables que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, polímeros realizados de monómeros tales como éteres o ésteres orgánicos, que, cuando se degradan, dan como resultado productos de degradación fisiológicamente aceptables. También pueden usarse anhídridos, amidas, ortoésteres o similares, por sí mismos o en combinación con otros monómeros. Los polímeros son generalmente polímeros de condensación. Los polímeros pueden estar reticulados o no reticulados. Si están reticulados, habitualmente solo están ligeramente reticulados, y están reticulados en menos del 5%, habitualmente reticulados en menos del 1%. Son de interés particular los polímeros de ácidos carboxílicos hidroxialifáticos, o bien homo o bien copolímeros, y los polisacáridos. Entre los poliésteres de interés se incluyen homo o copolímeros de ácido D-láctico, ácido L-láctico, ácido láctico racémico, ácido glicólico, caprolactona y combinaciones de los mismos. Los copolímeros de ácido glicólico y láctico son de particular interés, en los que la tasa de biodegradación se controla mediante la razón de ácido glicólico con respecto a láctico. El porcentaje de cada monómero en un copolímero de poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA) puede ser del 0-100%, aproximadamente el 15-85%, aproximadamente el 25-75% o aproximadamente el 35-65%. En algunas realizaciones, se usan copolímeros de 25/75 PLGA y/o 50/50 PLGA. Los implantes oculares biodegradables también pueden incluir compuestos hidrófilos o hidrófobos adicionales que aceleran o retardan la liberación del inhibidor de ROCK. Adicionalmente, pueden incluirse en los implantes moduladores de la liberación tales como los descritos en la patente estadounidense n.° 5.869.079. La cantidad de modulador de la liberación empleada dependerá del perfil de liberación deseado, la actividad del modulador y del perfil de liberación del inhibidor de ROCK en ausencia de modulador. Cuando el agente de tamponamiento o potenciador o modulador de la liberación es hidrófilo, también puede actuar como acelerador de la liberación. Los aditivos hidrófilos actúan para aumentar las tasas de liberación mediante una disolución más rápida del material que rodea a las partículas de fármaco, lo cual aumenta el área de superficie del fármaco expuesto, aumentando de ese modo la tasa de difusión de fármaco. De manera similar, un agente de tamponamiento o potenciador o modulador hidrófobo puede disolverse más lentamente, ralentizando la exposición de partículas de fármaco, y ralentizando de ese modo la tasa de difusión de fármaco. La cinética de liberación de los implantes de la presente invención puede depender en parte del área de superficie de los implantes. Un área de superficie más grande expone más polímero e inhibidor de ROCK a líquido ocular, provocando una erosión más rápida de la matriz de polímero y disolución de las partículas de inhibidor de ROCK en el líquido. Por tanto, el tamaño y la forma del implante también puede usarse para controlar la tasa de liberación, periodo de tratamiento y concentración de inhibidor de ROCK en el sitio de implantación. A cargas de inhibidor de ROCK iguales, los implantes más grandes suministrarán una dosis proporcionalmente mayor, pero, dependiendo de la razón de superficie con respecto a masa, pueden presentar una tasa de liberación más lenta. Para la implantación en una región ocular, el peso total del implante oscila preferiblemente, por ejemplo, desde aproximadamente 200­ 15000 [mu]g, habitualmente desde aproximadamente 1000-5000 [mu]g. En algunas realizaciones, el peso total del implante es de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1.800 [mu]g. En algunas realizaciones, el peso total del implante es de aproximadamente 2400 a aproximadamente 3.600 [mu]g. Los implantes de la invención son normalmente sólidos, y pueden formarse como partículas, láminas, parches, placas, películas, discos, fibras, barras y similares, o pueden ser de cualquier tamaño o forma compatible con el sitio de implantación seleccionado, siempre que los implantes tengan la cinética de liberación deseada y suministren una cantidad de inhibidor de ROCK que sea terapéutica para el estado médico previsto del ojo. El límite superior para el tamaño de implante estará determinado por factores tales como la cinética de liberación deseada, toleración para el implante en el sitio de implantación, limitaciones de tamaño en la inserción y facilidad de manipulación. Por ejemplo, la cámara vítrea puede albergar implantes en forma de barra relativamente grandes, que tienen generalmente diámetros de aproximadamente 0,05 mm a 3 mm y una longitud de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 10 mm. En una variación aún adicional, también pueden usarse otros implantes que tienen geometrías variables, pero volúmenes aproximadamente similares. Los implantes biodegradables pueden insertarse en el ojo mediante una variedad de métodos, incluyendo colocación mediante pinzas, mediante trocar o mediante otros tipos de aplicadores, después de realizar una incisión en la esclerótica. En algunas realizaciones, puede usarse un trocar o aplicador sin crear una incisión. En algunas realizaciones, se usa un aplicador portátil para insertar uno o más implantes biodegradables en el ojo. El aplicador portátil comprende normalmente una aguja de acero inoxidable de 18-30 GA, una palanca, un accionador y un émbolo. Los dispositivos adecuados para insertar un implante o implantes en una región o sitio ocular posterior incluyen los dados a conocer en la solicitud de patente estadounidense con n.° de serie 10/666.872.

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, no debe interpretarse que estos ejemplos y figuras limiten de ninguna manera el alcance de la presente invención.

Figuras

Figura 1. Efecto de la diabetes sobre preparaciones planas de RPE diabético de rata y de ser humano. (a) Se estudió el citoesqueleto de células de RPE de rata mediante tinción con faloidina, se evaluó la integridad de la unión estrecha mediante tinción con ocludina. Se evaluó la inmunolocalización de ROCK-1 mediante una tinción conjunta con Rock-1 y faloidina. (b) Se evaluó la inmunolocalización de ROCK-1 en seres humanos mediante una tinción conjunta con Rock-1 y faloidina. Barra de escala = 10 |jm, n=7 para cada experimento.

Figura 2. Efecto de tratamiento intravítreo con fasudilo sobre la barrera hematorretiniana externa diabética. Se realizaron análisis de inmunotransferencia de tipo Western para evaluar la actividad de ROCK mediante un kit de inmunotransferencia que cuantifica el nivel de fosforilación de una forma recombinante de MYPT1, un sustrato de ROCK (a); nivel de proteína de ROCK1 (b); nivel de proteína de p-MLC (c). Inmunolocalización de ROCK1 y P-MLC en preparaciones planas de células de RPE. n = 6-12; ***= valor de p <0,001

Figura 3. Análisis cuantitativo de morfología de capa de células de RPE. Para mostrar el efecto de fasudilo sobre el tamaño celular, se muestra un diagrama de cajas que resume la distribución de células pequeñas en ojos tratados con fasudilo y con vehículo en el modelo de rata GK de tipo diabético. La retina tratada con fasudilo tenía significativamente menos células pequeñas que la retina tratada con vehículo, n=7 para cada experimento; ***= valor de p<0,001

Figura 4. Análisis de la permeabilidad de la barrera retiniana externa diabética y el edema retiniano externo. Se obtuvieron criosecciones de retina completa a partir de ratas diabéticas y de control sacrificadas dos horas después de una inyección intravenosa de moléculas marcadas con FITC de 150 KDa. Se estudiaron de manera cualitativa las fugas dentro de la retina en puntos de rotura de RPE (a), así como la infiltración retiniana en todas las demás capas de la retina (b). Se realizaron secciones de semitina de retina completa para evaluar el edema extracelular (c). Se estudiaron cualitativamente criosecciones de retina completa a partir de ratas a las que se les inyectó fasudilo intravítreo para evaluar la presencia de puntos de rotura de RPE (d). Se cuantificó la fluorescencia total corregida por retina neural mediante el software ImageJ (e). n = 5-6; ** = valor de p<0,01. Figura 5. Efecto de la activación de ROCK en vasos sanguíneos de la retina durante diabetes. (a) Inmunotinción con faloidina en arteriolas retinianas de rata diabética de retinas preparadas de manera plana (figura 5a, fila superior), y criosecciones (figura 5a, fila central) y sección ultradelgada de TEM (figura 5a, fila inferior). (b) Preparaciones planas de retina neural de rata diabética que muestran inmunotinción con ROCK y faloidina en arteriolas retinianas. (c) Se estudiaron criosecciones transversales de arteriolas de red hematorretiniana interna humana mediante marcaje con faloidina y ROCK1.

Figura 6. Efecto de fasudilo sobre capilares de la retina durante retinopatía diabética. (a) Detección automatizada de superficie de red capilar retiniana realizada con preparaciones planas de retina teñidas mediante una lectina inmunofluorescente (primera fila) para destacar las paredes de vasos en ratas tratadas con vehículo y con fasudilo. La evaluación cualitativa se ve ayudada por una codificación por color (segunda fila) en la que vasos pequeños se representan mediante colores fríos (azul) y arteriolas más grandes mediante colores cálidos (rojo). (b) Diagrama de dispersión que muestra la cuantificación de la superficie total de la red apilar retiniana en ratas tratadas con vehículo y con fasudilo. n=4-5; *=valor de p<0,05

Figura 7. Efecto de fasudilo sobre VEGF retiniano. (a) Inmunotinción de VEGF en preparaciones planas de retina en ratas tratadas con vehículo y. (b) Diagrama de dispersión de resultados de inmunotransferencia de tipo Western de VEGF en muestras de retina neural de ratas tratadas con vehículo y. n=8; ***= valor de p <0,001 Figura 8. Efecto de fasudilo intravítreo sobre dilatación de vasos de la retina de rata GK.

A. El diámetro vascular antes y después del tratamiento con fasudilo determinó una razón de vasodilatación que muestra un efecto significativo de fasudilo sobre el diámetro de vasos de la retina (p<0,05).

B. La cobertura de superficie de la retina por vasos pequeños aumentó significativamente en ratas GK tratadas con fasudilo en comparación con ratas GK tratadas con vehículo (n=4-5 por grupo, p<0,05), compatible con una vasodilatación de capilares de la retina.

C. La inmunotransferencia de tipo Western mostró una disminución significativa en el nivel de VEGF-164 en la retina neural de ratas GK tratadas con fasudilo en comparación con ratas GK tratadas con vehículo, lo que sugiere una hipoxia retiniana reducida en la retina tratada con fasudilo (n=8 por grupo). *=valor de p<0,05; **=valor de p<0,01; ***= valor de p <0,001.

Ejemplo

Métodos

Cuestiones éticas

Los experimentos con animales siguieron las directrices de la Comunidad Europea y se aprobaron por los Comités éticos locales y se registraron (Ce5/2012/085, Ce5/2012/080 y Ce5-2009-034). Según las reglas de las “3R”, se diseñaron los experimentos para reducir el número de animales. Al estar el modelo GK bien caracterizado en el presente laboratorio, pudo determinarse el número mínimo de animales requeridos para cada experimento (10 animales por grupo como máximo) y los puntos de tiempo más relevantes para el sacrificio de los animales.

Tejidos ocular humanos

Se usaron dos globos oculares de pacientes enucleados por melanoma periférico recurrente más de 5 años tras la protonterapia. Un paciente, con diabetes tipo 2 durante 23 años (mujer, 67 años de edad), que había padecido edema macular diabético y tenía graves complicaciones diabéticas sistémicas (nefropatía diabética con insuficiencia renal terminal y diálisis y neuropatía periférica). El segundo ojo era de un paciente no diabético (mujer, 56 años de edad) que presentaba un desprendimiento subfoveal mínimo (<30 |jm) y segmento alargado. Se cortaron en secciones los ojos enucelados y se usó la parte anterior (incluyendo la retina hasta el ecuador) para una exploración patológica clásica. Se usó la parte posterior de la retina de ambos ojos para determinación de inmunohistoquímica en criosecciones. Debido al procedimiento de enucleación, estaban disponibles tejidos recientes para el análisis.

Modelo animal

Se estudiaron ratas Goto-Kakizaki (GK) (Taconic Europe, Dinamarca), una raza Wistar de diabetes tipo 2 no obesa, a los 12 meses de edad. Se midió la glucemia no en ayunas usando equipos Accutrend GC y Accu-check compact (Roche) y se midió HbA1c con el sistema de pruebas múltiples A1C NOW+ (Bayer, Alemania). Un nivel de glucosa en plasma > 250 mg/dl (14 mmol/l) definió el estado diabético. En contraposición a las ratas Wistar de control, las ratas GK desarrollan hiperglucemia aproximadamente a las 14 semanas de edad (tabla 1). Las ratas Wistar (WS) de edad correspondiente al control eran normoglucémicas.

Inyección intravítrea del inhibidor de ROCK, fasudilo

Para las inyecciones intravítreas, se anestesió a ratas diabéticas con una inyección intraperitoneal de pentobarbital (Nembutal 40 mg/kg, Abbot, Saint-Remy sur Avre, Francia) y se dilataron las pupilas con una gota aplicada por vía tópica de tropicamida al 5% (Ciba Vision, Toulouse, Francia), y se sometieron a anestesia local con una gota de tetracaína al 1% (Ciba Vision). Se realizaron tres inyecciones consecutivas, de fasudilo a una concentración de 20 M o de vehículo, a un intervalo de 48 horas con un microscopio quirúrgico, usando una aguja de calibre 30 (Microfine: Becton Dickinson, Meilan, Francia, tal como se describió anteriormente [29-31]). Se sacrificó a los animales 48 horas tras la administración de 3 inyecciones intravítreas de 20 jM de fasudilo, cada inyección se realizó con 2 días de separación.

Inmunohistoquímica en criosecciones de retina y en preparaciones planas retinianas de retina neural o RPE/coroides

Para las secciones, se enuclearon ojos de rata, se fijaron en paraformaldehído al 4%, se crioprotegieron con sacarosa (al 20% en PBS) y se incrustaron en compuesto con temperatura de corte óptima (Tissue-Tek; Miles Inc., Bayer Diagnostics, Puteaux, Francia), se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80°C. Se realizaron secciones congeladas criostato (grosor de 10 jm ) (Leica CM 3050S, Wetzlar, Alemania) y se montaron en portaobjetos recubiertos con gelatina para análisis inmunohistoquímico.

Para preparaciones planas, tras la enucleación, se fijaron globos oculares en paraformaldehído (PFA) al 4% durante 15 min a temperatura ambiente y se cortaron en secciones en el limbo; se descartaron los segmentos anteriores. Se fijaron retinas neurales y RPE/coroides por separado durante 15 min adicionales en acetona a -20°C. Después se incubaron las muestras durante la noche a 4°C con anticuerpos primarios diluidos en PBS complementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10% y Triton X-100 al 0,1%. La lista de anticuerpos usados en este estudio se proporciona en la tabla 2. Se repitió la inmunohistoquímica al menos 7 veces con 7 animales diferentes para cada grupo. Se obtuvieron controles negativos mediante procedimientos de tinción que omitieron el anticuerpo primario (datos no mostrados).

Inmunotransferencia de tipo Western

Se homogeneizaron RPE/coroides y retina neural en un tampón de lisis (Mops 50 mM, base Tris 50 mM, SDS al 0,1%, EDTA 1 mM, pH 7,7) que contenía un cóctel de inhibidores de proteasa (Roche, Francia). Se determinó la concentración de proteína usando un kit de ensayo de proteínas de BCA Pierce (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.) Se sometieron (20-40 |jg) a SDS-PAGE en electroforesis en gel de Bis-Tris al 4-12% Nupage, y se sometieron a electrotransferencia sobre membranas de nitrocelulosa (Optitran BA-S 83 GE Healthcare Life Science Whatman). Se incubaron las membranas con anticuerpos primarios. Después, se incubaron las membranas con los anticuerpos secundarios de fragmento F(ab)2 conjugado con peroxidasa correspondiente (Santa cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA, EE.UU.) (dilución de 1:5000). Se detectaron bandas inmunorreactivas con el kit de reactivos de detección de inmunotransferencia de tipo Western ECL (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.). Se cuantificó la abundancia relativa de proteínas individuales identificadas mediante densitometría de barrido. La lista de anticuerpos usados para las inmunotransferencias de tipo Western se proporciona en la tabla 2.

Determinación de la actividad de ROCK

Se usó un kit de inmunotransferencia de actividad de ROCK (Cell Biolabs, San Diego, CA, EE.UU.) que usa MYPT1 recombinante como sustrato de ROCK. ROCK inactiva la miosina fosfatasa mediante una fosforilación específica de la subunidad diana de miosina fosfatasa 1 (MYPT1) en Thr696, lo cual da como resultado un aumento en el contenido fosforilado de la cadena ligera de miosina de 20 kDa (MLC20). Tras incubar el sustrato (MYPT1 recombinante) con muestras de RPE/coroides, se detectó la MYPT1 fosforilada mediante análisis por inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-fosfo-MYPT1 (Thr696). En resumen, se diluyeron muestras de proteína de RPE/coroides en tampón cinasa 1X. Se añadieron 25 j l (75 jg de proteínas) en tubos de microcentrífuga y se realizó el inicio de la reacción de cinasa añadiendo 50 j l de disolución 1X de cinasa/ATP/sustrato. Después se incubaron los tubos de microcentrífuga a 30°C durante 30-60 minutos con agitación suave. Después se detuvo la reacción de cinasa añadiendo 25 j l de tampón de muestra de SDS-PAGE reductor 4X. Se sometieron las muestras a ebullición durante 5 minutos y se centrifugaron durante 10 segundos a 12.000 X g. Se evaluó la inhibición de la actividad de ROCK mediante inmunotransferencia de tipo Western y se cuantificó.

Análisis cuantitativo de la morfología de la capa de células de RPE

Para analizar preparaciones planas de RPE y con el fin de evaluar la morfología celular, se creó una macroherramienta de ImageJ [32] en Fiji [33]. En resumen, tras un primer procesamiento de imágenes mediante filtrado de paso de banda de F^fT, se convirtieron las imágenes a formato binario y se enmascararon y después se procesaron para obtener una imagen de esqueleto (se eliminaron los bucles y segmentos aislados). Se invirtió esta imagen y se cortaron las células en segmentos y se etiquetaron con la herramienta de “análisis de partículas” en ImageJ, se delimitaron las regiones de interés (ROI) usando la herramienta de gestor de ROI. Se midió el número de vértices para cada célula tras la detección de puntos triples (los puntos en los que se unían entre sí tres ramificaciones) con la transformación de “acierto o error” binaria apropiada. Para esta transformación, se usó el programa adicional “morfología” de ImageJ. Eliminando estos puntos de la imagen de esqueleto, se contó el número de bordes individuales, así como su longitud. Después se verificó el número de vértices y se corrigió manualmente para tener en cuenta errores. Se eliminaron del análisis las imágenes con más del 5% de errores de alineación automática. Después de esto, entonces se midieron varios parámetros morfológicos para cada célula, por ejemplo área, perímetro, circularidad, número de vecinos/vértices/bordes de una célula, etc. Se usó ANOVA para examinar si había una diferencia estadísticamente significativa en la distribución del tamaño de célula entre los dos modelos diferentes, mientras que se tenía en cuenta las múltiples imágenes tomadas de diferentes animales (el modelo lineal era: modelo de área de célula número de imágenes número de animales).

Cuantificación de la rotura de la barrera hematorretiniana usando inyección intravenosa de FITC-dextrano Para evaluar la rotura de la barrera hematorretiniana, se inyectaron 200 j l de FITC-dextrano 150 KDa a 50 mg/ml en PBS (Sigma) por vía intravenosa en la cola de ratas tratadas con fasudilo o vehículo (n=5), 2 horas antes del sacrificio. Se evaluaron las fugas de FITC-dextrano midiendo la fluorescencia dentro de la retina usando el software imageJ, tal como se describió anteriormente por otros [34]. Se obtuvieron imágenes aleatorias de criosecciones (10 jm ) de retinas de rata en las que se inyectaron fasudilo y vehículo (10 imágenes a un aumento de 40x por animal) y se analizaron.

Evaluación cuantitativa de la microangiopatía retiniana

Para cuantificar el área de vasos sanguíneos grandes y pequeños en retina preparada de manera plana, se creó una macro de ImageJ en Fiji [32, 33]. En resumen, se usó la función de grosor local disponible con el programa adicional de Fiji para el software ImageJ para crear un mapa de los vasos sanguíneos, a partir del cual pudo evaluarse el diámetro de las estructuras locales. Se aplicaron umbrales a este mapa para definir dos máscaras binarias correspondientes a los vasos de gran diámetro (grosor local > umbral) y los vasos de pequeño diámetro (grosor local < umbral). Después se midió el área de esas máscaras y se expresó en cuanto al área de superficie ocupada por los vasos pequeños.

Análisis de secciones de semitina y ultradelgadas

Se fijaron ojos de ratas GK (12 meses de edad, n = 4 ratas por punto de tiempo) 1 hora en glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato (0,1 mol/l, pH 7,4) y después se disecaron, se fijaron posteriormente en tetraóxido de osmio al 1% en tampón de cacodilato y se deshidrataron en una serie graduada de alcohol antes de incluirse en resina epoxídica y orientarse. Se tiñeron secciones de semitina (1 |jm, ultramicrótomo Reichert Ultracut E (Leica)) con azul de toluidina. Se contratiñeron secciones ultradelgadas (80 nm) mediante acetato de uranilo y citrato de plomo y se observaron con un microscopio electrónico de transmisión (TEM, JEOL 100 CX II (JEOL) con 80 kV) y se fotografiaron.

Estadística

Para variables continuas, se proporciona la media ± DE. Se realizaron comparaciones usando la prueba no paramétrica de Mann-Whitney (software Prism versión 4.0c; software GraphPad, San Diego, CA), se consideró que los valores de p <0,05 eran significativos.

Resultados

Activación de ROCK-1 en rotura de la barrera hematorretiniana externa inducida por diabetes y remodelación del citoesqueleto de RPE

En el polo apical de células de RPE, la red de filamentos de F-actina está intrínsecamente vinculada con, y regula, la función de la unión estrecha (TJ). La visualización de la red de F-actina usando rodamina-faloidina mostró una marcada modificación de la forma de células de RPE en forma de células irregulares y o bien constreñidas o bien agrandadas (figura 1a, primera fila, flechas blancas, panel central) con fibras con tensión focal (figura 1a, primera fila, panel superior derecho, flecha blanca) responsables de la apertura de la unión focal, tal como se confirma mediante tinción con ocludina (figura 1a, segunda fila, flecha blanca). ROCK-1, dispersado en el citoplasma de RPE de control no diabético, se deslocalizó a partir del citoplasma a la membrana celular en el RPE de ratas diabéticas (figura 1a, tercera fila) y en el RPE de seres humanos diabéticos (figura 1b) indicando la activación de la ruta de ROCK-1/miosina 2, que está implicada en la constricción de red de actomiosina [19, 21].

La inyección intravítrea de fasudilo inhibe la sobreactivación de ROCK en células de RPE

Se evaluó la actividad de Rho-cinasa sobre el estado de fosforilación de dos sustratos conocidos: MYPT1 y MLC (descritos en los métodos). El ROCK-1 total no se redujo significativamente en el RPE de ojos tratados con fasudilo (n=6) en comparación con ojos en los que se inyectó vehículo (n=6) (figura 2a). Se observó actividad de ROCK-1 reducida en ojos tratados con fasudilo, ya que se observó una reducción significativa de MYTP1 fosforilado y MLC en el RPE de ojos tratados con fasudilo frente a ojos que recibieron vehículo (figuras 2b y c). El sustrato de ROCK, p-MLC, es responsable de la interacción de actina-miosina, la formación de tensión de fibras y constricción celular. En ojos tratados con fasudilo se observó una reubicación de ROCK1/P-MLC desde la membrana al interior del citoplasma, confirmando que se inhibió la activación de ambas proteínas (figura 2d). Fasudilo restaura la morfología de la monocapa de células de RPE y la rotura de barrera retiniana externa Usando la metodología de procesamiento de imágenes descrita anteriormente se examinó la composición de células en cuanto a tamaño y formación. En preparaciones planas de RPE de GK las irregularidades celulares fueron más comunes con muchas más células muy grandes (>400 jm 2) y pequeñas (<200 jm 2) que en retina de WS, en conjunto hubo una distribución diferente de manera estadísticamente significativa de tamaño de células en la retina de GK en comparación con la retina de WS (ANOVA, p<0,001), no hubo ninguna diferencia en la distribución de área celular entre la retina tratada con fasudilo de WS y con vehículo de WS (ANOVA, p=0,17). En la retina de GK tratada con fasudilo hubo una reducción en la frecuencia de células pequeñas y un en comparación con la retina de GK tratada con vehículo y un aumento en la frecuencia de células de tamaño normal (figura 3, p<0,001).

En ratas GK tratadas con fasudilo, FITC-dextrano 150 KDa no atravesó la barrera de RPE y permaneció en la circulación coroidea (figura 3a). En ratas GK tratadas con vehículo, moléculas marcadas con FITC pasaron a través de puntos de rotura de RPE entre segmentos fotorreceptores y núcleos (figura 4a, flechas blancas), (figura 4a, panel derecho) (figura 4b). En secciones de semitina, espacios extracelulares agrandados y grosor aumentado de las capas externas de la retina correspondieron a edema intrarretiniano y la rotura de la barrera retiniana externa (figura 4 c). En ojos de GK tratados con fasudilo, se observó una reducción significativa en la fuga de vasos en comparación con ojos tratados con vehículo (figura 4e). Al examinar las secciones histológicas, los ojos tratados con fasudilo demostraron una barrera de RPE intacta (figura 4d).

ROCK se activa en vasos de retina diabéticos en ratas y seres humanos

En retina preparada de manera plana, actina teñida con faloidina rodeó los diámetros regulares de vasos sanguíneos de la retina en ratas no diabéticas de control, pero mostró constricciones irregulares y focales de vasos de la retina en ratas diabéticas (figura 5a, fila superior, flechas blancas). Se observó una gran protuberancia desde las paredes del vaso al interior de la luz del vaso (figura 5a, fila central, flechas blancas). En secciones ultradelgadas de TEM, se visualizó la remodelación del citoesqueleto con vesículas/protuberancias de membranas no apoptóticas, correspondiendo posiblemente a protuberancias luminales (figura 5a, fila inferior, flecha negra).

En retina preparada de manera plana de ratas no diabéticas de control se detectó una tinción mínima de ROCK en vasos de la retina, mientras que en ratas GK la tinción de ROCK se ubicó conjuntamente con constricciones de actina y rellenó las vesículas/protuberancias de vasos internos (figura 5b, fila superior e inferior respectivamente). Esto indica que la activación de ROCK contribuye a la reducción del diámetro de la luz del vaso. De manera similar, en las imágenes de microscopía confocal en secciones de vasos de retina humanos diabéticos, se observó tinción positiva tanto para ROCK1 como para faloidina alrededor de la constricción de la pared del vaso y en las vesículas/protuberancias del vaso (figura 5c).

Fasudilo restaura la vasoconstricción capilar retiniana inducida por diabetes mediante inhibición de Rho-cinasa y reducción de VEGF

Se cuantificó la superficie de capilares marcados con lectina en retina preparada de manera plana de ratas GK (n=4 con fasudilo y n=5 con vehículo) (figura 6a). La densidad capilar (expresada como % de cobertura de superficie) aumentó significativamente en ojos de GK tratados con fasudilo en comparación con ojos tratados con vehículo (figura 6b). Se observó una disminución significativa en los niveles de VEGF en retina tratada con fasudilo (inmunotransferencia de tipo Western; n=8/grupo) y en preparaciones planas de retina con inmunotinción de VEGF (figura 7a), lo que indica una posible reducción en la isquemia retiniana.

Fasudilo reduce la vasoconstricción y mejora la perfusión retiniana de la retina diabética

La obtención de imágenes in vivo de vasos de la retina usando angiografía confocal mostró que el tratamiento con fasudilo indujo una vasodilatación significativa de vasos de la retina (datos no mostrados, figura 8A). Además; la superficie de cobertura capilar, evaluada en preparaciones planas de retina teñidas con lectina aumentó significativamente en ojos de GK tratados con fasudilo en comparación con ojos tratados con vehículo (datos no mostrados, figura 8B). Por consiguiente, la dilatación del lecho capilar se asoció con una disminución significativa en los niveles de VEGF (figura 8C), lo que sugiere una perfusión retiniana mejorada y posiblemente una isquemia retiniana reducida.

Discusión

Usando el modelo de rata GK de retina diabética, se mostró que la activación de ROCK-1 en los vasos del epitelio de pigmento retiniano/retina estaba asociada con remodelación del citoesqueleto, dando como resultado una rotura de la barrera retiniana externa y cierre de capilares de la retina. El papel clave que desempeña la activación de ROCK-1 en estos dos procesos se demostró claramente con la reducción significativa de fugas de vasos a través del epitelio retiniano y la marcada reducción en el cierre de vasos tras la administración intravítrea del inhibidor de ROCK1, fasudilo.

Además del papel bien estudiado de la BRB interna en la formación de edema macular diabético (DMO), cada vez más evidencias indican que la BRB externa desempeña un papel en el desarrollo de edema macular, con frecuencia antes de una retinopatía diabética patente, tal como se diagnostica según directrices internacionales [2]. Cada vez hay más evidencias que sugieren un papel para la BRB externa, además del papel bien estudiado de la BRB interna en la formación de edema macular diabético (DME), especialmente en las fases tempranas de la enfermedad e incluso antes de cualquier retinopatía diabética patente, tal como se diagnostica según directrices internacionales [35]. Estudios clínicos con seres humanos han demostrado un aumento en el grosor de la retina correlacionado con niveles de HbA1C antes de la aparición de DR o DME [24] y también se han descrito desprendimientos de retina serosos, ambos de los cuales sugieren disfunción de RPE en DR o DME en estado preclínico [3, 36]. Estudios con animales de Xu et al. en ratas Brown Norway a las que se les inyectó estreptozotocina (correspondiente a modelo de diabetes tipo 1), han mostrado alteraciones en la unión estrecha de RPE y fuga de moléculas de FITC-dextrano de menos de 40 kDa empezando a los 9 meses de duración de diabetes [37]. Estos hallazgos son compatibles con los presentes resultados en un modelo de rata espontáneo a los 12 meses de edad, lo cual corresponderá a una duración de diabetes de 9 meses (la aparición de diabetes en ratas GK es aproximadamente a las 12 semana,). Las fugas observadas de una molécula de FITC-dextrano más grande (150 KDa) pueden sugerir un mayor daño de RPE en comparación con el modelo de T1D de Xu et al. Esto concuerda con un aumento de la incidencia de DME en pacientes con T2D en comparación con pacientes con T1D en la clínica.

Alteraciones marcadas del citoesqueleto de actina de RPE coincidieron con modificaciones en la forma celular, conduciendo células constreñidas a roturas de la unión célula-célula y alteración de la BRB externa. Se entiende que la hiperglucemia crónica y el estrés oxidativo asociado causan el desarrollo de vesículas de membrana de RPE, este proceso se ha descrito anteriormente por Cousins et al. en células de RPE in vitro en respuesta a estrés oxidativo químico [38], pero no se habían examinado anteriormente las consecuencias in vivo de tal vesiculación. El papel del citoesqueleto de actina en la formación y regulación de uniones de células se ha estudiado bien, siendo el papel de GTPasas de la familia de Rho cinasa, que son esenciales para esto, esencial para esta organización compleja [39].

De manera interesante, no solo se regula la permeabilidad intercelular, sino también la transcripción génica, mediante los complejos de unión de células. En los presentes experimentos, el tratamiento con fasudilo se asoció con una expresión de VEGF reducida en la retina. En otros modelos, fasudilo ejerció efectos antiangiogénicos o redujo VEG^f a través de mecanismos no completamente esclarecidos [40, 41]. En células endoteliales, se mostró que fasudilo inhibe la expresión de HIF-1a inducida por hipoxia y perturba el bucle autocrino de EGF/VEGFR-2 [42]. La novedad de la presente observación es que fasudilo, aunque reduce VEGF, que es un potente vasodilatador, potenció la densidad capilar. Esto se logró mediante una reducción de la constricción de vasos y de la vesiculación intraluminal de células endoteliales, lo que sugiere que la inhibición de ROCK puede reducir el cierre capilar. Fasudilo puede presentar un alto interés clínico cuando la isquemia macular está asociada con edema macular, en contraposición a un bloqueo directo de VEGF que se sospechaba que aumentaba la isquemia en tales pacientes [43].

La patogénesis de la falta de perfusión capilar en retinopatía diabética sigue sin estar clara. Una adhesión aumentada de leucocitos-células endoteliales y atrapamiento en capilares de la retina [44], disfunción endotelial y estrés oxidativo [45] e inflamación vascular son factores contribuyentes reconocidos [46]. Los resultados de este artículo destacan otros posibles mecanismos en esta patogénesis, concretamente la activación de Rho-cinasa 1, que estaba relacionada con la reducción de la luz de vasos debido a la formación de vesículas de células endoteliales de membrana [47]. El papel de la activación de la ruta de RhoA/ROCK1/P-MLC se ha descrito en la formación de vesículas de membrana de células de cáncer de colon humanas, como respuesta a inhibidor del activador de plasminógeno 1 (PAI-1) [48]. Recientemente se asoció el polimorfismo de PAI-1 con un riesgo aumentado de retinopatía diabética y puede ser un activador de la ruta de ROCK en la retina diabética [49]. Se asociaron vesículas inducidas por TNF-a y combretastatina con muerte de células endoteliales in vitro [50, 51]. Debe examinarse si la formación de vesículas de membrana endotelial conduce en última instancia a la muerte de células endoteliales en microcirculación diabética. Los resultados de este estudio sugieren que la inhibición de ROCK tiene la capacidad de modular el desarrollo de enfermedad diabética y facilita la reparación de la morfología de células endoteliales antes de un daño retiniano irreversible. En este caso, la inhibición de ROCK con fasudilo restauró la morfología celular y la barrera funcional de RPE en ojos de GK demostrando que la remodelación del citoesqueleto instiga la unión estrecha de RPE en la retina diabética.

Fasudilo (Asahi Kasei, Corp Tokyo, autorizado a Shering) es el único inhibidor de ROCK aprobado en seres humanos en Japón para vasoespasmos cerebrales tras hemorragia subaracnoidea [52]. Se ha sugerido el posible beneficio de inhibidores de ROCK en diversos modelos preclínicos y en estudios clínicos para el tratamiento de arteriosclerosis, hipertensión, hipertensión pulmonar, accidente cerebrovascular, lesión por isquemia-reperfusión e insuficiencia cardíaca. Pero los efectos secundarios significativos (tales como convulsiones, hipotensión y perturbación del conocimiento) debido a la falta de especificidad de los inhibidores disponibles han restringido el desarrollo clínico [53-55].

También se ha propuesto la inhibición de ROCK en nefropatía diabética experimental y están desarrollándose inhibidores de ROCK más específicos para aumentar la posible ventana terapéutica [23]. En el caso de administración intraocular, no se espera ningún efecto secundario sistémico dado que el ojo es un órgano confinado con difusión sistémica limitada de compuestos inyectados intraoculares.

En resumen, se demostró que, en la retina con diabetes tipo 2, la activación de Rho cinasa 1 dio como resultado la remodelación del citoesqueleto y la formación de vesículas en la membrana celular. A su vez, esto contribuyó a la alteración de barreras retinianas implicadas en la formación de edema macular y al cierre microvascular y posterior isquemia retiniana. Estos resultados indican que la inhibición de ROCK intraocular es una posible diana molecular para la prevención de complicaciones asociadas con retinopatía diabética.

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Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Inhibidor de ROCK para su uso en un método para restaurar la perfusión capilar retiniana en un sujeto que padece isquemia retiniana consecuencia de retinopatía diabética, en el que el inhibidor de ROCK reduce la constricción de vasos y vesiculación intraluminal de células endoteliales.

2. Inhibidor de ROCK para su uso según la reivindicación 1, que se administra al sujeto por la vía intravítrea.

3. Inhibidor de ROCK para su uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor de ROCK es fasudilo.

4. Inhibidor de ROCK para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el inhibidor de ROCK se administra al sujeto por la vía intravítrea a través de un implante ocular biodegradable.