ES2925001T3 - Método para preparar una muestra de tejido - Google Patents

Abstract

El método implica proporcionar una muestra de tejido (13') y, opcionalmente, cortar la muestra de tejido proporcionada. La muestra de tejido se aplica en un portaobjetos de microscopio (18). Se fija una cubierta (22) sobre la muestra de tejido y se conecta al portaobjetos del microscopio utilizando una masa plástica deformable, curable y transparente (20). La cubierta se presiona con una fuerza predeterminada, que es inferior a 5N, preferiblemente entre 0,1 y 0,6N. La masa plástica deformable se endurece y se mantiene el paso de prensado del revestimiento. También se incluyen reivindicaciones independientes para lo siguiente: (1) un método para investigar una muestra de tejido (2) un kit para preparar una muestra de tejido para microscopía de escaneo láser confocal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar una muestra de tejido

La presente invención se refiere a un método para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal.

La invención se refiere asimismo a un método para el examen de muestras de tejido, así como a un kit para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal.

La microscopía de barrido láser confocal es una técnica con la que pueden obtenerse imágenes ópticas de alta resolución de una muestra. Es posible registrar una gran cantidad de imágenes con diferentes niveles de nitidez, obteniéndose de este modo informaciones de imagen tridimensionales, además de las informaciones de imagen bidimensionales. En los microscopios de barrido láser utilizados a tal fin, se emplea luz láser para excitar sustancias fluorescentes en una muestra y de este modo obtener asimismo informaciones histológicas específicas.

Estudios recientes han mostrado que la microscopía de barrido láser confocal también puede emplearse de manera efectiva en el diagnóstico o en la monitorización de la terapia de diferentes alteraciones de los tejidos (tanto benignas como malignas). Un ejemplo de ello es el diagnóstico y la monitorización de la terapia de un carcinoma de células basales. En el caso del carcinoma basocelular se trata de una enfermedad tumoral del epitelio de la piel, que aparece particularmente en aquellas zonas de la piel que están expuestas al sol, como p. ej. en la cara, especialmente en la zona de la nariz, de la frente y también de las orejas. La modalidad de tratamiento más frecuente y actualmente también la más efectiva para este tumor es un tratamiento quirúrgico, en que se extirpa el tumor propiamente dicho junto con el tejido adyacente, examinándose a continuación el borde del tejido excisionado en busca de eventuales células cancerígenas.

En este ámbito en particular se han consolidado dos métodos de tratamiento. En la cirugía micrográfica de Mohs se excisiona, tal y como se ha descrito anteriormente, el tumor, así como una pequeña cantidad de tejido limítrofe y las muestras de tejido excisionadas son aplastadas para que queden planas sobre el micrótomo de un criostato, evaluándose a continuación las secciones congeladas. Si al hacerlo se sigue constatando la presencia de tejido tumoral en los bordes hundidos de las secciones, se repetirá el método, volviendo a efectuarse otra secuencia de marcado y excisionado. Cada ciclo de excisionado y examen requiere entre 20 y 45 minutos.

La segunda técnica consolidada existente utiliza un método de obtención de imágenes histológicas tridimensionales, en que el tumor y el tejido adyacente son seccionados según los métodos establecidos, tintados con hematoxilinaeosina y embebidos en parafina. En función de cómo se realice el seccionado de la muestra de tejido, pueden obtenerse imágenes 3D completas de los bordes de corte exteriores de la muestra de tejido. No obstante, para la obtención de las secciones de parafina aquí utilizadas transcurren por regla general unas 20 horas.

Los dos métodos anteriormente descritos presentan, no obstante, ciertos inconvenientes. En particular, en el caso de la cirugía de Mohs cabe señalar que debido al uso de un criostato y de un micrótomo, la muestra de tejido es destruida durante el examen, lo que impide que puedan realizarse otros exámenes histológicos.

La formación de imágenes tridimensionales utilizando secciones SD tiene el inconveniente de que hasta la obtención de las secciones 3D transcurren 20 horas, lo que comporta que esta técnica no pueda emplearse como control directo durante una operación. De JP 6258209 A se conoce un método para el examen de una muestra de tejido, en donde la muestra es colocada sobre una placa de vidrio, a continuación se procede al vertido de gotas de resina sobre dicha muestra y finalmente dicha muestra es iluminada con luz UV.

La publicación SABAH ZIEFLE ET AL: "Confocal Laser Scanning Microscopy vs 3-Dimensional Histologic Imaging in Basal Cell Carcinoma", INTERNET CITATION, 1 de agosto de 2010, páginas 643-647, XP008152139, es una publicación científica que compara la microscopía de barrido láser confocal y el análisis de imágenes histológicas tridimensionales de carcinomas de células basales en cuanto al valor diagnóstico médico.

La publicación US 2011/292197 A1 revela un método en el marco del examen patológico de tejidos, en donde una muestra de tejido es colocada sobre un portaobjetos y cubierta con un vidrio cobertor con el objetivo de evitar perturbaciones en las imágenes, debidas a la presencia de burbujas de aire retenidas.

Para solucionar los problemas arriba mencionados, se ha intentado, utilizando la microscopía de barrido láser confocal, desarrollar una técnica, que permita analizar de manera rápida los bordes de corte externos de una muestra de tejido, obtenida por ejemplo durante la extirpación de un carcinoma de células basales, en busca de la eventual presencia de células anormales, en particular células cancerígenas, sin destruir la muestra.

Lo que ha resultado ser un problema importante es el procesamiento de la muestra de tejido de tal manera que los bordes de corte exteriores queden uniformes y planos sobre el portaobjetos utilizado para microscopía. Pegar la muestra directamente al portaobjetos ha resultado poco adecuado, ya que debido a las propiedades ópticas del adhesivo endurecido se generan artefactos que hacen imposible un diagnóstico fiable. La fijación de la muestra de tejido entre un portaobjetos y una funda mediante clips tampoco ha resultado adecuada, ya que por un lado el clip puede interferir en el campo de visión del microscopio y por otro porque el clip puede deslizarse, lo que a su vez genera perturbaciones al grabar la imagen. El pegado directo del portaobjetos a la tapa, con la muestra dispuesta entre la tapa y el portaobjetos, ha resultado ser generalmente inviable, al comportar muy a menudo una presión excesiva sobre la muestra de tejido, cosa que puede dañar la muestra y a su vez imposibilita un diagnóstico fiable.

Por consiguiente, es un objeto de la invención describir un método para el procesamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal, por medio del cual se garantice un ajuste limpio de los bordes de corte periféricos de la muestra de tejido en el portaobjetos, sin que la muestra resulte dañada o se deslice durante su medición. Además, la muestra de tejido también deberá estar disponible para exámenes posteriores una vez que se haya completado el examen.

También es un objeto de la invención, describir un método para el análisis de muestras de tejido mediante la microscopía de barrido láser confocal.

También es un objeto de la invención, describir un kit para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal, por medio del cual puedan procesarse las muestras de tejido de manera que esté garantizado un contacto limpio de los bordes de corte periféricos en el portaobjetos, sin que la muestra de tejido resulte dañada en el proceso, debiendo restar la muestra de tejido todavía disponible para exámenes posteriores después de haberse completado el examen.

De conformidad con la invención, la tarea se resuelve por el hecho que un método para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal incluye los siguientes pasos:

1.) Proporcionar una muestra de tejido 2.) eventualmente seccionar la muestra de tejido

3. ) Colocar la muestra de tejido en un portaobjetos

4. ) Colocar una tapa sobre la muestra de tejido, estando dicha tapa unida al portaobjetos por medio de una masa endurecible, plásticamente deformable,

5. ) Presionar la tapa sobre la muestra de tejido con una fuerza especificada y

6. ) Endurecer la masa plásticamente deformable mientras se mantiene el prensado del paso 5 y habiéndose seleccionado la masa endurecible, plásticamente deformable, entre las siliconas endurecibles y los poliéteres endurecibles, en particular entre las siliconas A y las siliconas K

La tarea mencionada en segundo lugar también se logra con un método para examinar muestras de tejido, que incorpora los pasos del acondicionamiento de una muestra de tejido, tal y como se ha descrito anteriormente, y el examen de la muestra de tejido acondicionada mediante microscopía de barrido láser confocal.

La tarea mencionada en tercer lugar se soluciona con un kit para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal, que incorpora lo siguiente,

una masa endurecible, plásticamente deformable, ), seleccionada entre las siliconas endurecibles y los poliéteres endurecibles, en particular entre las siliconas A y las siliconas K y

una guía para realizar los métodos descritos anteriormente y con, por lo menos, un portaobjetos y una tapa.

La solicitante ha descubierto ahora, que utilizando una masa endurecible y plásticamente deformable, puede fijarse una muestra de tejido entre un portaobjetos y una tapa, permitiendo la deformabilidad de la masa colocar la tapa de manera tal que pueda garantizarse un reposo plano de las superficies cortadas en el portaobjetos. Además, la masa asegura una distancia entre la tapa y el portaobjetos, de modo que la presión ejercida por la tapa y el portaobjetos sobre la muestra de tejido puede ajustarse de manera que la muestra no resulte dañada. En conclusión, se ha demostrado que con este método es posible separar la tapa y el portaobjetos una vez finalizada la microscopía, quedando la muestra disponible sin daños para posteriores exámenes.

De acuerdo con la invención, la expresión "una masa endurecible, plásticamente deformable" abarca aquí todas las masas sólidas, pero con capacidad de fluir, que ya sea químicamente, p. ej. por una reacción reticulante, ya sea por medios físicos, p. ej. por evaporación del disolvente, pueden solidificarse y desarrollar un efecto adhesivo a través de la solidificación.

De acuerdo con la invención, los términos "portaobjetos" y "tapa" incluyen cualquier objeto transparente sustancialmente plano que no interfiera con el examen microscópico. El portaobjetos y la tapa pueden ser diferentes o sustancialmente idénticos. En este último caso, los términos portaobjetos y tapa se utilizan únicamente para distinguir los objetos para su uso en el método.

En una realización de la invención, la masa endurecible, plásticamente deformable es seleccionada entre las siliconas endurecibles y los poliéteres endurecibles, en particular entre las siliconas A y las siliconas K.

Los materiales anteriormente mencionados se han revelado como especialmente convenientes en el método, en particular por sus propiedades de flujo, así como también por el hecho de que habitualmente secan rápidamente. Además, también es positivo que en lo relativo a la fluidez inicial, la resistencia posterior y el tiempo de curado, este tipo de masas ya estén disponibles comercialmente para las diferentes finalidades y realizaciones. Sorprendentemente, se ha demostrado que pueden utilizarse de manera favorable materiales que, por ejemplo, actualmente se comercializan como materiales de impresión dental.

En otra realización de la invención, la masa endurecible, plásticamente deformable es transparente.

El uso de una masa transparente es conveniente, porque incluso en caso de haber contacto entre la masa y la muestra de tejido en los bordes de esta última, con algo de masa penetrando entre el portaobjetos y la muestra de tejido, todavía es posible monitorear la posición exacta de la muestra y realizar una medición útil.

En otra realización de la invención, la fuerza aplicada en el paso 5 y el paso 6 es inferior a 5 N, preferiblemente inferior a 2 N y aún mejor, inferior a 1 N, situándose en particular entre 0,1 y 0,6 N.

Se ha demostrado que al ejercer fuerza en las zonas antes mencionadas, puede garantizarse que la muestra de tejido quede plana sobre el portaobjetos, evitándose al mismo tiempo que la muestra de tejido resulte dañada por ejercer una presión excesiva.

La forma más fácil de ejercer la fuerza deseada es colocar pequeños pesos sobre la tapa durante el prensado y el endurecimiento de la masa plásticamente deformable en los pasos 5 y 6, sabiendo que un peso de 100 g ejerce una fuerza de 1 N.

En otra realización de la invención, la masa endurecible, plásticamente deformable, muestra en estado no endurecido una consistencia del tipo 0, 1 ó 2 según la norma ISO 4823:2000.

La ISO 4823 mencionada anteriormente es una norma que se ocupa de los materiales de impresión dental. Los presentes inventores han descubierto que tales materiales de impresión dental pueden usarse de manera particularmente ventajosa en el método de la presente invención, por lo que aquí se hace referencia a dicha norma. Una consistencia en las zonas anteriormente mencionadas demostró ser beneficiosa al no haber una delicuescencia excesiva durante la aplicación, que podría comportar una contaminación de la muestra de tejido por la masa endurecible, plásticamente deformable. Asimismo, dicha consistencia comporta la ventaja adicional de que la masa continua siendo moldeable sin que tengan que aplicarse unas fuerzas que posiblemente podrían dañar la muestra de tejido.

En otra realización de la invención, la masa endurecible, plásticamente deformable muestra en estado no endurecido una dureza final de 40 a 95 Shore A, preferiblemente de 50 a 90 Shore A y en particular de 60 a 75 Shore A.

Se ha demostrado que las masas que fraguan en la dureza final mencionada anteriormente, forman unas uniones estables y fiables entre la tapa y el portaobjetos, pero no se vuelven tan duras y quebradizas como para que la muestra de tejido pueda resultar dañada durante el fraguado.

En otra realización de la invención, la muestra de tejido consiste en tejido cutáneo.

Como ya se ha indicado anteriormente, la presente técnica es particularmente útil para el examen y el tratamiento o la monitorización del tratamiento de alteraciones en la piel, en particular carcinomas de células basales, es decir, una forma de cáncer de piel, por lo que es particularmente ventajoso el uso de muestras de tejido cutáneo.

En otra realización de la invención, tras el paso 3.) el método incluye otro paso 3.a.) de la humectación de la muestra con un líquido, preferiblemente agua o un aceite.

Esta realización puede ser ventajosa en muestras secas, al poder garantizarse gracias a ella que la luz láser utilizada para la medición de la muestra llega uniformemente a la muestra. Para un experto en la materia es evidente que el líquido utilizado para humedecer la muestra debe ser transparente para la luz láser utilizada para la medición y para cualquier fluorescencia eventualmente emitida por la muestra. En este sentido, el agua y los aceites transparentes y aceites de microscopía de refracción particularmente alta han demostrado ser apropiados.

En otra realización de la invención, el kit cuenta con por lo menos un portaobjetos, teniendo preferiblemente el portaobjetos por lo menos una superficie básicamente lisa, que incluirá una zona rugosa que rodeará una zona con una superficie básicamente lisa.

La facilitación de portaobjetos en general y en particular de portaobjetos con la zona rugosa descrita facilita el manejo del kit, en particular gracias al hecho que al aplicar la masa endurecible y plásticamente deformable la existencia de la zona rugosa evita el flujo de la masa de la zona rugosa a la superficie lisa, que en general es menos humectable por la masa que el área rugosa. Gracias a la existencia de la zona rugosa, con la zona de superficie lisa que incluye, es posible mantener una zona exenta de la masa en donde poder colocar la muestra de tejido.

La facilitación de una zona rugosa presenta la ventaja adicional, de que con ello puede mejorarse la adherencia de la masa plásticamente deformable al portaobjetos.

En otra realización de la invención, el kit cuenta con por lo menos una tapa, teniendo preferiblemente ésta por lo menos una superficie básicamente lisa, que incluirá una zona rugosa que rodeará otra zona con una superficie básicamente lisa.

La facilitación de una tapa y en particular de una tapa con la zona rugosa anteriormente descrita proporciona las mismas ventajas que la facilitación del portaobjetos anteriormente descrito.

Para mejorar la adherencia, es particularmente ventajoso que el área rugosa del portaobjetos y de la tapa sean sustancialmente idénticas en forma y tamaño, de modo que cuando se coloque la tapa, el área rugosa de ésta entre en contacto con la masa aplicada al área rugosa del portaobjetos, lo que resulta en una unión particularmente fuerte entre el portaobjetos y la tapa.

En otra realización de la invención, de la medida citada anteriormente, el portaobjetos y la tapa son sustancialmente idénticos en forma y tamaño.

Dicha medida tiene la ventaja de que su fabricación es particularmente sencilla, ya que en lugar de dos objetos diferentes, concretamente una tapa y un portaobjetos, sólo hay que fabricar un objeto, que puede utilizarse tanto como portaobjetos y como tapa. Teniendo esto en cuenta, cabe señalar en particular que en el presente caso, tanto el portaobjetos como la tapa pueden ser iguales o diferentes, utilizándose los dos términos diferentes simplemente para diferenciar los dos componentes que, durante el proceso encierran la muestra de tejido, con el objetivo de facilitar la descripción.

Ni que decir tiene, que las características mencionadas anteriormente y las que aún quedan por explicar, pueden ser utilizadas no sólo en la combinación especificada en cada caso, sino también en otras combinaciones o solas, sin abandonar el marco de la presente invención.

La invención se describe y explica con más detalle a continuación, utilizando ejemplos de realización seleccionados en combinación con los dibujos. Muestran:

Fig. 1 de manera muy esquemática un rostro humano, afectado por un carcinoma de células basales,

Fig. 2 de manera muy esquemática una muestra de tejido con presencia de un carcinoma de células basales,

Fig. 3 de manera muy esquemática un paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía láser confocal,

Fig. 4 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 5 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 6 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 7 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 8 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 9 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 10 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 11 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

Fig. 12 de manera muy esquemática otro paso en el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal,

En la Fig. 1 aparece representado de forma muy esquemática un rostro humano afectado por un carcinoma de células basales con el número de referencia 10.

Dicho carcinoma basocelular 10 está rodeado por el tejido 12, igualmente a excisionar, que en el presente caso será marcado y a continuación excisionado para asegurar que se retira la mayor cantidad posible de células tumorales para evitar una reaparición del tumor.

La muestra de tejido 13, facilitada tras la excisión del tumor, aparece representada en la Fig. 12.

Para examinar los bordes de corte externos, que corresponden al tejido extraído más profundo, se debe proceder a excisionar a continuación en el presente caso la muestra de tejido 13, con el objetivo de posibilitar el apoyo de los bordes de corte en el portaobjetos. En el presente caso se describe un método de excisionado de la muestra de tejido 13, denominado método Muffin.No obstante, el presente método no se limita a dicho método Muffin, sino que puede utilizarse cualquier método conocido por los expertos para cortar la muestra de tejido, siendo el método más sencillo el corte en capas de la muestra de tejido 13. En el método Muffin empleado en el presente caso se realiza, con ayuda de un escalpelo 14, un corte alrededor del carcinoma basocelular 10 para separar el tejido circundante 12 del carcinoma basocelular 10. No obstante, hay que indicar que dicho corte no atraviesa completamente la muestra de tejido 13, sino que, como por ejemplo en el presente caso, sólo se introduce en la respectiva muestra unos dos tercios del grosor. Además, se realizan incisiones en el tejido circundante 12 en dos lados opuestos de la muestra de tejido 13, que atraviesan todo el tejido circundante 12 y llegan hasta el carcinoma basocelular 10.

Tras realizar los cortes mostrados en la Fig. 3, puede procederse a continuación, tal y como se muestra en la Fig. 4, a retirar el tejido circundante 12 del carcinoma basocelular 10, como por ejemplo se retira el molde de papel de una magdalena (Muffin), de donde también procede el nombre de esta técnica.

A continuación, en un siguiente paso se procede, como se muestra en la Fig. 5, a separar, p. ej. con unas tijeras quirúrgicas 16, el carcinoma basocelular 10 también por debajo del tejido circundante 12, a fin de obtener dos muestras de tejido, como se muestra p. ej. en la Fig. 6, en donde una muestra de tejido 13' está básicamente formada por tejido circundante 12 y la otra muestra de tejido 13" consta básicamente de carcinoma basocelular 10. Para poder examinar el carcinoma basocelular 10 en todo su grosor, para lo que debe asegurarse que dicho carcinoma reposa límpiamente en un portaobjetos, el carcinoma basocelular 10 fue cortado una vez más en el centro, tal y como se muestra en la Fig. 6.

La muestra de tejido 13' así obtenida, puede colocarse a continuación, tal y como se muestra a modo de ejemplo en la Fig. 7 para el tejido circundante 12, en un portaobjetos 18, mostrándose en la Fig. 7 una vista en planta. En la Fig. 7 y en las siguientes figuras, solo se muestra y describe a modo de ejemplo y en aras de la simplicidad el procesamiento posterior de la muestra de tejido 13 ^' procedente del tejido circundante 12. Las muestras de tejido 13'' resultantes del carcinoma de células basales 10 pueden procesarse de manera análoga, produciéndose una preparación separada para cada muestra. En este caso, la muestra es observada desde el reverso, es decir a través del portaobjetos 18. En un siguiente paso, se aplica un anillo alrededor de la muestra de tejido 13', realizado con una masa endurecible y plásticamente deformable 20, siendo en el presente caso una masa de impresión dental de la compañía Dreve, disponible comercialmente bajo la marca Regofix transparent. En aquellos casos en que la muestra de tejido sea una muestra particularmente seca, la muestra puede lavarse con un líquido, p. ej. agua o un aceite para asegurar posteriormente, al medir la muestra, una buena transmisión de la luz láser.

En un siguiente paso se coloca una tapa 22 sobre el portaobjetos 18, la masa endurecible, plásticamente deformable 20 y la muestra de tejido 13' procedente del tejido circundante 12. En el presente caso, la tapa 22 se muestra algo más pequeña que el portaobjetos 18. Sin embargo, esto sirve principalmente en el presente caso para ofrecer una mejor visualización de la tapa. La relación de tamaño entre el portaobjetos 18 y la tapa 22 es completamente irrelevante para este método y en aras de la simplicidad se utilizará en la mayoría de los casos una tapa 22 del mismo tamaño que el portaobjetos 18.

En un siguiente paso y tal y como se muestra en la Fig. 10 desde el lateral, se ejerce una presión sobre la tapa 22, p. ej. por medio de un peso 24, mediante la cual resultan ligeramente deformadas tanto la muestra de tejido 13', no visible en la figura 10, como también la masa endurecible y plásticamente deformable 20 entre la tapa 22 y el portaobjetos 18, asegurándose de este modo un contacto plano de la superficie de la muestra de tejido 13' en el portaobjetos 18. Dado que en el presente caso se utiliza para presionar un peso de 60 g, se aplicará aquí una fuerza de aprox. 0,6 N. Tras el curado de la masa 20, lo que se logra al cabo de unos dos minutos, puede retirarse el peso 24, estando la muestra ya lista para la medición con un microscopio de barrido láser confocal, como el que se muestra en la figura con el número de referencia 26. El microscopio de barrido láser confocal 26 es lo que se conoce como microscopio invertido, en el que la muestra a utilizar se dispone sobre una mesa 28 y es medida desde abajo a través del portaobjetos 18. Esta disposición tiene la ventaja de que a su vez favorece el contacto plano de la muestra de tejido 13' en el portaobjetos 18. Un microscopio de barrido láser confocal inverso 26 de este tipo es comercializado, por ejemplo, por la empresa Mavig.

Tras la conclusión del examen, tal y como se muestra en la Fig. 11, la tapa 22 puede volver a ser retirada del portaobjetos 18, estando aún disponible la muestra de tejido 13' para otros exámenes histológicos.

En la Fig. 12 se muestra de manera muy esquemática un kit para ser utilizado en el procedimeinto anteriormente descrito, identificado en su conjunto con el número de referencia 30.

El kit muestra una masa plásticamente deformable, aquí en forma de una masa bicomponente incluida en un aplicador 32. El uso de masas bicomponentes es a menudo ventajoso en el presente caso debido al hecho que por regla general endurecen en unos tiempos menores.

El kit presenta asimismo un portaobjetos 34. Dicho portaobjetos 34 es transparente y está fabricado en vidrio y presenta, en la cara aquí definida como cara superior, una superficie lisa 36.

En dicha superficie lisa 36 se ha realizado una zona rugosa 38, en el presente caso por chorreado de arena. En el presente caso, dicha zona rugosa 38 es más o menos cuadrada y rodea otra zona 40 con una superficie lisa.

La zona rugosa 38 está concebida para que durante el proceso anteriormente descrito se aplique sobre ella la masa endurecible, plásticamente deformable, comportando la rugosidad una mejor unión entre la masa curada y el portaobjetos y evitando también un derrame de la masa en las zonas con superficie lisa, en donde la masa endurecible, plásticamente deformable, presenta una menor humectabilidad.

El kit presenta asimismo una tapa 42, que en el presente caso es sustancialmente idéntica al portaobjetos 34. La tapa 42 muestra a su vez una superficie sustancialmente lisa 44, que sólo por el uso previsto es denominada aquí como cara inferior. En esta zona con una superficie lisa 44 se ha incorporado a su vez una superficie rugosa 46, que rodea otra zona con superficie lisa 48.

Comunmente, la muestra de tejido es colocada en la zona con una superficie lisa 40 del portaobjetos 34. A continuación, la masa endurecible, plásticamente deformable del aplicador 32 es aplicada sobre la zona rugosa 38, pudiendo efectuarse los pasos mencionados en último lugar también en orden inverso. A continuación, la tapa 42 es colocada sobre el portaobjetos 34 de manera que la zona rugosa 46 entre en contacto con la masa aplicada sobre la zona rugosa 38 y a continuación, tal y como se describe anteriormente, la presione. Gracias a la existencia de ambas zonas rugosas se logra una unión particularmente segura entre el portaobjetos y de la tapa.

Finalmente, el kit también incluye una guía 50 para la ejecución del método anteriormente descrito.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Método para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal, que muestra los s igu ientes pasos:

1. ) Proporcionar una muestra de tejido (13, 13', 13")

2. ) Eventualmente cortar la muestra de tejido (13, 13', 13")

3. ) Colocar la muestra de tejido en un portaobjetos (18; 34)

4. ) Colocar una tapa (22; 42) sobre la muestra de tejido (13, 13', 13"), estando la tapa (22; 42) unida al portaobjetos (18; 34) mediante una masa endurecible, plásticamente deformable (20),

5. ) Presionar la tapa (22; 42) sobre la muestra de tejido (13, 13', 13") con una fuerza especificada, y 6. ) Endurecer la masa plásticamente deformable (20), manteniéndose el presionado del paso 5, habiéndose seleccionado la masa endurecible, plásticamente deformable (20) entre las siliconas y los poliéteres endurecibles, seleccionándose en particular entre las siliconas A y las siliconas K.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que la masa endurecible, plásticamente deformable (20) es transparente.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que la fuerza aplicada en el paso 5 y en el paso 6 es inferior a 5 N, preferiblemente inferior a 2 N y aún mejor, inferior a 1 N, en particular entre 0.1 y 0.6 N.

4. Método según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por el hecho de que la masa endurecible, plásticamente deformable (20) muestra en estado no endurecido una consistencia del tipo 0, 1 ó 2 según la norma ISO 4823:2000.

5. Método según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por el hecho de que la masa endurecible, plásticamente deformable (20) muestra en estado no endurecido una dureza final de 40 a 95 Shore A, preferiblemente de 50 a 90 Shore A y en particular de 60 a 75 Shore A.

6. Método según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que la muestra de tejido (13, 13', 13") presenta tejido cutáneo.

7. Método según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que tras el paso 3.) incluye otro paso 3.a.) de la humectación de la muestra con un líquido, preferiblemente agua o un aceite.

8. Método para el examen de muestras de tejido que abarca los pasos del acondicionamiento de una muestra de tejido (13, 13', 13") de acuerdo con el método según una de las reivindicaciones 1 a 7 y examen de la muestra de tejido acondicionada (13, 13', 13") mediante microscopía de barrido láser confocal.

9. Kit para el acondicionamiento de una muestra de tejido para la microscopía de barrido láser confocal, que muestra lo siguiente, concretamente:

- una masa endurecible, plásticamente deformable (20), seleccionada entre las siliconas endurecibles y los poliéteres endurecibles, en particular entre las siliconas A y las siliconas K y

- una guía (50) para la realización del método según una de las reivindicaciones 1 a 8,

- por lo menos un portaobjetos (18; 34), y

- por lo menos una tapa (22; 42).

10. Kit según la reivindicación 9, caracterizado por el hecho de que la masa endurecible, plásticamente deformable (20) es transparente.

11. Kit según las reivindicaciones 9 ó 10, caracterizado por el hecho de que la masa endurecible, plásticamente deformable (20) muestra en estado no endurecido una consistencia del tipo 0, 1 ó 2 según la norma ISO 4823:2000.

12. Kit según una de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado por el hecho de que la masa endurecible, plásticamente deformable (20) muestra en estado no endurecido una dureza final de 40 a 95 Shore A, preferiblemente de 50 a 90 Shore A y en particular de 60 a 75 Shore A.

13. Kit según una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado por el hecho de que el portaobjetos (18; 34) presenta por lo menos una superficie sustancialmente lisa (36), habiendo en esta, por lo menos, una superficie básicamente lisa (36) una zona rugosa (38), que rodea otra zona con una superficie básicamente lisa (40).

14. Kit según una de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado por el hecho de que la tapa (22; 42) presenta por lo menos una superficie sustancialmente lisa (44), habiendo en esta, por lo menos, una superficie básicamente lisa (44) una zona rugosa (46), que rodea otra zona con una superficie básicamente lisa (48).

15. Kit según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado por el hecho de que la zona rugosa (38; 46) del portaobjetos (18; 34) y de la tapa (22; 42) son sustancialmente idénticos en forma y tamaño.

16. Kit según una de las reivindicaciones 9 a 15, caracterizado por el hecho de que el portaobjetos (18; 34) y la tapa (22; 42) son sustancialmente idénticos en forma y tamaño.