ES2924921T3 - Método proveedor de producción de enzimas celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 utilizando componentes de medios de cultivo de bajo coste - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de producción de enzimas celulasas por Penicillium funiculosumMRJ-16 utilizando componentes de medios mínimos y/o componentes de medios de bajo costo como celulosa o biomasa lignocelulósica pretratada como fuente de carbono y harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desgrasada como nitrógeno. fuente. La presente invención también proporciona un método para la producción de enzimas de alto título de celulasas y hemicelulasas usando Penicillium funiculosumMRJ-16 usando medios mínimos y/o componentes de medios de bajo costo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Método proveedor de producción de enzimas celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 utilizando componentes de medios de cultivo de bajo coste
Campo de la invención
La presente invención proporciona un método de producción de enzimas celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) utilizando los mínimos componentes de medios de cultivo. La presente invención también proporciona un método para la producción de enzimas celulasas y hemicelulasas a títulos altos a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) utilizando los mínimos componentes de medios de cultivo.
Antecedentes de la invención
El agotamiento de los combustibles fósiles y su utilización han causado inevitablemente un impacto desfavorable en nuestro medio ambiente y, posteriormente, ha despertado un interés en el desarrollo de tecnología sostenible para producir biocombustibles. Para producir biocombustibles, se prefiere la biomasa lignocelulósica que es más barata, renovable y fácilmente disponible en cantidad excedente. La estructura de la biomasa lignocelulósica consiste en tres polímeros principales: celulosa, hemicelulosa y lignina junto con una pequeña cantidad de sustituyentes fenólicos, minerales y grupos acetilo, etc. El polímero de celulosa y hemicelulosa en la biomasa lignocelulósica se degrada para producir azúcares pentosas y hexosas, que pueden utilizarse para la producción de etanol después de la fermentación alcohólica. La degradación requiere la separación de la celulosa y las hemicelulosas de la biomasa lignocelulósica mediante un pretratamiento químico y físico seguido de hidrólisis enzimática. La hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica requiere una variedad de proteínas celulolíticas, hemicelulolíticas, degradantes de la lignina, auxiliares y no catalíticas que actúan sinérgicamente.
Se requiere un avance en el procedimiento de producción de enzimas para transformar la biomasa celulósica en etanol de manera económica, ya que representa el 30 % del coste total del procedimiento. La principal dificultad en el proceso de producción de enzimas es la producción de enzimas a títulos altos, con una alta especificidad y una mezcla de enzimas bien equilibrada utilizando sustratos más baratos. En la industria, diferentes especies del género trichoderma, Penicillium, Aspergillus y Humicola fungi han despertado interés como productores de enzimas celulasas y hemicelulasas. Se han realizado diferentes modificaciones genéticas mediante técnicas convencionales y recombinantes en estas cepas fúngicas para producir el título deseado de enzimas. El mutante creado después de la manipulación genética mediante la tecnología de ADN recombinante necesitó unos factores de crecimiento o componentes de medios de cultivo específicos para producir las enzimas.
El método de cultivo de microorganismos y la producción de enzimas celulasas requiere un mecanismo de regulación complejo en un reactor. La eficacia de un hongo en términos de producción de celulasa depende del medio, los parámetros de cultivo y las condiciones de funcionamiento tales como temperatura, pH, velocidad de agitación y oxígeno disuelto, etc. Por lo tanto, la formulación de estrategias de fermentación adecuadas juega un papel importante en la decisión del destino del hongo. Las estrategias mencionadas anteriormente incluyen una fuente de carbono barata para la formación de hongos y un inductor para desencadenar la producción de enzimas específicas que deben añadirse a una velocidad específica puesto que una velocidad de suministro demasiado alta conlleva un cambio del procedimiento hacia la acumulación de biomasa fúngica, mientras que una velocidad de suministro demasiado baja provoca el deterioro de la biomasa fúngica. Se requiere el oxígeno disuelto adecuado para mantener el crecimiento celular y el metabolismo durante el proceso de fermentación. De manera similar, estudios previos han demostrado que el pH óptimo para las celulasas fúngicas varía de una especie a otra. De acuerdo con Bansal et al. (2012) el pH óptimo que permitió la máxima producción de celulasas a partir de A. niger NS-2 fue de 7. Sin embargo, Fawzi (2003) informó que un pH de 5,0 es óptimo para la producción de p-glucosidasa a partir de una cepa de Fusarium proliferatum NRRL26517. Por lo tanto, es importante comprender el pH óptimo para la máxima producción de celulasa a partir de la cepa fúngica utilizada.
Por lo tanto, la presente invención se refiere al desarrollo de un procedimiento de producción de una mezcla de enzimas celulasas a títulos altos a partir de una cepa fúngica mutante de una forma económica mediante el uso de componentes de medios de cultivo más baratos y la utilización del mismo.
El documento US 8956846 B2 describe la producción de enzimas celulasas a partir de la cepa Trichoderma reesei CL847 en proceso de fermentación continua. En este método, se usó glucosa con una concentración de 15 g/l para la formación del hongo, seguido de un suministro continuo de lactosa (250 g/l) como inductor a una velocidad de 4 ml/hora para permitir el proceso de producción de enzimas. El suministro de inductor se controló mediante la regulación de la presión parcial de oxígeno disuelto en el medio. El inductor se suministró cuando la presión parcial del oxígeno fue superior al 50 % de la presión de saturación de oxígeno y se detuvo cuando la presión parcial de oxígeno fue inferior al 40 %. La proteína final fue de 43,6 g/L, la actividad específica de la unidad de papel de filtro (FPU) y la pglucosidasa fue de 0,78 y 1,60 unidades internacionales (UI)/mg respectivamente. La FPU y pías enzimas glucosidasa estaban presentes en proporciones de 1:2 respectivamente, lo que es insuficiente para la hidrólisis del sustrato lignocelulósico. Por tanto, se necesita más p-glucosidasa. Sin embargo, el uso de glucosa y lactosa como fuentes de carbono no solo aumentará el coste de producción, sino que también planteará un problema para el suministro a largo plazo de estas materias primas, junto con el aumento de los precios de las materias primas.
El documento US 2014/0363846 divulga el cultivo de hongos que pertenecen al género Myceliophthora por fermentación sumergida para producir enzimas celulasas. Las fuentes de carbono utilizadas fueron fuentes de carbono solubles no inductoras de celulasa como glicerol, xilosa, glucosa, glucosa: xilosa (90:10), sacarosa, glucosa y sustrato inductor como soforosa, melaza, gentibiosa, celobiosa, fructosa y glucosa: fructosa (50:50). Cuando se usó glucosa sola y con cualquiera de los sustratos inductores mencionados anteriormente como fuentes de carbono se observaron resultados similares, pero se detectó una actividad máxima de 0,55 FPU/mg de proteínas cuando solo se usó xilosa como fuente de carbono. Esta solicitud de patente menciona la presencia de una variedad de celulasas, hemicelulasas, enzimas degradantes de lignina, estrasas, swollenina y expansinas secretadas por la cepa de Myceliophthora thermophila (ATCC n.° 42464) utilizada pero no presentó la actividad esperada del papel de filtro mencionada anteriormente.
El documento CN103045484B (2014) divulga una cepa mutante de Penicillium decumbens (CCTCC M2011195) creada mediante radiación UV y una sustancia mutágena NTG (N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina). Esta cepa mutante se utilizó para la producción de celulasas utilizando medios de fermentación compuestos por xilosa, sulfato de amonio, salvado de trigo, fosfato de potasio monobásico, celulosa microcristalina y sal de magnesio. Se observó una actividad del papel de filtro de 10 Ul/ml, actividad de la endoglucanasa de 30 Ul/ml, actividad de la exoglucanasa de 1,5 Ul/ml y p-glucosidasa de 8 Ul/ml. La actividad de la p-glucosidasa obtenida fue baja y la elección de una fuente de carbono como la xilosa y una fuente de nitrógeno como el salvado de trigo puede comportar que el proceso de producción de enzimas sea poco rentable e insostenible.
Ahmed A. y Bibi A (2018) Fungal Cellulase; Production and Applications: Minireview, LIFE: International Journal of Health and Life-Sciences ISSN 2454-5872 se refiere a una pequeña revisión sobre la producción y aplicación de las celulasas fúngicas. La revisión analiza brevemente la producción de celulasas fúngicas centrándose en los parámetros que influyen en su producción basándose en publicaciones relevantes. La revisión destaca la producción eficaz y rentable de celulasas a partir de Penicillium sp. indicando las funciones determinantes de los medios de fermentación, el pH, el tiempo de incubación, la temperatura y las aireaciones en el nivel de producción de celulosa. Ahmed et al. (2018) divulga además que los medios de fermentación adecuados para la producción de celulasa comprenden paja de arroz como fuente de carbono y harina de soja como fuente de nitrógeno. Además, Ahmed et al. divulga que la producción óptima de celulosa se logra con un pH de 5,0 y una temperatura de 30 °C.
Brijwani Khushal, Oberoi, H.S y Vadlani P. V (2010) Production of a cellulolytic enzyme system in mixed-culture solidstate fermentation of soybean hulls supplemented with wheat bran, Process Biochemistry 45, pp. 120-128 se refiere a un método de producción rentable de un sistema de enzimas celulolíticas con fermentación en estado sólido a partir de un cultivo mixto de cáscaras de soja complementado con salvado de trigo. Brijwani et al. (2010) divulga que es necesario optimizar los parámetros como el pH y la temperatura para conseguir una mejor actividad enzimática. Así, se mantuvo una temperatura óptima de 30 °C y un pH de 5 durante el proceso de fermentación. Brijwani et al. (2010) se refiere al uso de la cepa fúngica de Penicillium para la producción de la enzima celulasa, pero no se centra en una cepa en particular. Además, Brijwani et al. (2010) describe el uso de la cáscara de soja y el salvado de trigo como sustrato para la fermentación e indica que se lograron niveles apreciables de enzimas hasta un tiempo de incubación de 96 horas.
El documento RU 2261910 C2 se refiere a una cepa de Penicillium Funiculosum que se emplea para la producción eficaz de complejos enzimáticos que incluyen celulasas. El documento RU 2261910 C2 describe que el microorganismo utilizado para la preparación de enzimas de la presente invención se cultiva en condiciones aeróbicas en un medio que contiene celulosa, licor de maceración de maíz, carbonato de calcio y sulfato de amonio. Además, el documento RU 2261910 C2 también indica que los niveles óptimos de producción de enzimas se logran con un pH que oscila entre 3,0 y 6,0 y a una temperatura entre 27 °C y 36 °C.
El documento US 6534101 B1 divulga la cepa de Penicillium Funiculosum IMI 378536 y un método de cultivo para recuperar las enzimas producidas por el microorganismo. El documento describe la recuperación de la mezcla de enzimas que comprende xilanasas, p-glucanasas, celulasas y feruloil esterasas que mejoran la digestibilidad de los alimentos. Sin embargo, el procedimiento descrito para la producción de enzimas utiliza licor de maíz fermentado que contribuye significativamente al coste de producción.
A. M. de Castro, M. L. de Albuquerque de Carvalho, S. G. F. Leite and N. Pereira Jr. (2010) Cellulases from Penicillium funiculosum: production, properties and application to cellulose hydrolysis, J Ind Microbial Biotechnol 37:151-158 investiga la utilización de dos abundantes residuos agrícolas para la producción y aplicación de enzimas celulolíticas. De Castro et al. (2010) indica que se consideraron diferentes materiales obtenidos después del pretratamiento del bagazo de la caña de azúcar, así como sustratos sintéticos puros, para la producción de celulasa a partir de Penicillium funiculosum. Además, el documento indica que los mejores resultados para la producción de FPasa (354 UL(-1)) y beta-glucosidasa (1,835 UL(-1)) se observaron cuando se utilizó celulignina parcialmente deslignificada (PDC) del bagazo de la caña de azúcar. Sin embargo, el documento no dice nada sobre el uso de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno para reducir el coste de producción de la enzima.
Compendio de la invención
Un objetivo de la presente invención es producir enzimas celulasas y hemicelulasas a títulos altos a partir de los mínimos componentes de medios de cultivo y/o componentes de medios de cultivo de bajo coste tales como celulosa o biomasa lignocelulósica previamente tratada como fuente de carbono, y harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno junto con Penicillium funiculosum MRJ-16 (hipercelulolítica) (n.° de acceso 25142 en el MTCC).
La presente invención proporciona un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas a partir de Penicillium funiculosum m RJ-16, con n.° de acceso 25142 en el MTCC y fecha de deposición el 12 de junio de 2017, depositada en el IMTECH.
La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de enzimas de celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC), el procedimiento que comprende llevar a cabo la fermentación en un medio de fermentación que comprende:
(a) un 1-5 % en p/v de celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas; y
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada.
La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de enzimas de celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante, el procedimiento que comprende llevar a cabo la fermentación en un medio de fermentación que comprende:
(a) un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas;
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno.
En un rasgo característico preferido, el procedimiento para la producción de enzimas celulasas de acuerdo con la presente invención comprende:
(a) proporcionar un medio de fermentación que contenga una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno; (b) mantener la temperatura del medio de fermentación en el intervalo de 25 a 34 °C;
(c) ajustar el pH del medio de fermentación de 5 a 5,5;
(d) proporcionar una aireación del 50 %;
(e) inocular el medio de fermentación con un 10 % de semillas de Penicillium Funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) con actividad en forma líquida, y fermentar;
(f) dejar el proceso de fermentación durante 96 horas; y
(g) recoger el caldo enzimático y centrifugar para obtener las enzimas, en el que
el medio de fermentación comprende aproximadamente un 1-5 % en p/v de la fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas; y un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno.
En un rasgo característico preferido, la fuente de carbono en el medio de fermentación es celulosa y biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido con unas proporciones seleccionadas entre 1:1 o 1:2.
En otro rasgo característico preferido, en el procedimiento de producción de enzimas celulasas de la presente invención, no se controla el pH durante el proceso de fermentación. En otro rasgo característico preferido, la aireación durante el proceso de fermentación se mantiene por encima del 30 %. En otro rasgo característico preferido, antes de la fermentación, el medio de fermentación se esteriliza en autoclave a 120 °C durante aproximadamente 20 minutos.
En un rasgo característico preferido adicional, la biomasa lignocelulósica para la fermentación se selecciona entre paja de arroz, paja de trigo, rastrojo de maíz, tallo de algodón o bagazo de caña de azúcar. En un rasgo característico preferido, el pretratamiento ácido de la biomasa lignocelulósica se realiza con ácido sulfúrico concentrado. En otro rasgo característico preferido, la harina de soja para el medio de fermentación se selecciona entre harina de soja desgrasada o harina de soja normal.
En otro rasgo característico preferido más, la presente invención proporciona un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, el procedimiento que comprende las etapas de:
(a) preparar los componentes del medio de cultivo de fermentación utilizando un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa o biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido y un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno; (b) inocular los componentes del medio de la etapa (a) con un 10 % de semillas de Penicillium Funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) con actividad en forma líquida;
(c) someter el cultivo de Penicillium Funiculosum MRJ-16 de la etapa (b) a fermentación en un fermentador aireado; y
(d) recoger el caldo enzimático después del proceso de fermentación de la etapa (c) y someter el caldo a centrifugación para obtener las enzimas.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, en el que la fermentación de la etapa (c) se lleva a cabo a una temperatura de 25 a 34 °C.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, en el que la fermentación de la etapa (c) se lleva a cabo a una temperatura de 30 °C.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, en el que la fermentación de la etapa (c) se lleva a cabo durante 96 horas.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, en el que la aireación en el fermentador aireado se mantiene por encima del 30 %.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, en el que la fermentación de la etapa (c) se lleva a cabo con un pH de 5 a 5,5.
La presente invención proporciona además un procedimiento para producir enzimas celulasas y hemicelulasas, en el que la fermentación de la etapa (c) se lleva a cabo con un pH de 5.
Descripción detallada de la invención
Si bien la invención es susceptible de diversas modificaciones y/o procesos y/o sistema de disolvente alternativos, se ha mostrado la realización específica a modo de ejemplo y se describirá en detalle a continuación. Debe entenderse, sin embargo, que no pretende limitar la invención a los procedimientos particulares y/o temperatura, pH, proporciones, cantidad y cepas divulgadas, sino que, por el contrario, la invención pretende cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que se encuentren dentro del espíritu y el alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
La siguiente descripción es solo de realizaciones ejemplares y no pretende limitar el alcance, la aplicabilidad o la configuración de la invención de ninguna manera. Más bien, la siguiente descripción proporciona una ilustración práctica para implementar realizaciones ejemplares de la invención. Se pueden realizar diversas modificaciones a las realizaciones descritas en la función y disposición de los elementos descritos sin apartarse del alcance de la invención.
Todos los particulares y todos los detalles expuestos en el presente documento se utilizan en el contexto de algunas realizaciones y, por lo tanto, no deben tomarse necesariamente como factores limitantes de las reivindicaciones adjuntas. Las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes legales pueden realizarse en el contexto de realizaciones distintas a las utilizadas como ejemplos ilustrativos en la descripción a continuación.
Por conveniencia, antes de una descripción adicional de la presente divulgación, a continuación, se recopilan determinados términos empleados en la memoria descriptiva y en los ejemplos. Estas definiciones deben ser leídas a la luz del resto de la divulgación y entendidas por un experto en la técnica. Los términos utilizados en el presente documento tienen los significados admitidos y conocidos por los expertos en la técnica, sin embargo, por conveniencia y compleción, los términos particulares y sus significados se establecen a continuación.
Los artículos “un”, “uno/a”, “el”, “la” se utilizan para referirse a uno o más de uno (es decir, a al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
Los términos "comprende" y "que comprende" se usan en un sentido abierto e inclusivo, lo que significa que se pueden incluir elementos adicionales. No se pretende que se interprete como "consiste únicamente en".
A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que el contexto indique lo contrario, la palabra "comprender" y variaciones tales como "comprendiendo" y "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un elemento o etapa indicados, o un grupo de elementos o etapas indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o etapa o grupo de elementos o etapas.
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente una persona con experiencia ordinaria en la técnica a la que pertenece la presente divulgación. Aunque cualquier procedimiento y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden utilizar en la práctica o ensayo de la divulgación, a continuación, se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se incorporan en el mismo por referencia.
En comparación con la técnica anterior, la presente invención tiene como objetivo proporcionar un método para producir enzimas celulasas en un proceso por lotes que utiliza componentes de medios de cultivo de bajo coste en cantidades específicas junto con la cepa mutante de Penicillium Funiculosum, lo que a su vez aumenta la viabilidad comercial del procedimiento.
La presente invención proporciona un método de producción de enzimas celulasas a partir de Penicillium funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC y fecha de depósito de 12 de junio de 20l7) utilizando componentes de medios de cultivo de bajo coste. La presente invención también proporciona un método para la producción de enzimas celulasas y hemicelulasas a títulos altos a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 utilizando componentes de medios de cultivo de bajo coste o los mínimos componentes de medios de cultivo.
La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de enzimas de celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC), el procedimiento que comprende llevar a cabo la fermentación en un medio de fermentación que comprende:
(a) un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas;
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno.
La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de enzimas de celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC), el procedimiento que comprende llevar a cabo la fermentación en un medio de fermentación que consiste fundamentalmente en:
(a) un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas;
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno; y
(c) agua.
La presente invención proporciona un procedimiento para la producción de enzimas de celulasas a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC), el procedimiento que comprende llevar a cabo la fermentación en un medio de fermentación que consiste en:
(a) un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas;
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno;
(c) un agente de ajuste de pH; y
(d) agua.
En un rasgo característico preferido, el agente de ajuste de pH se selecciona entre CaCÜ3 , NH4OH, NaOH, para ajustar el pH del medio de fermentación de 5 a 5,5.
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para la producción de enzimas a títulos altos de celulasas y/o hemicelulasas. El método comprende llevar a cabo la fermentación a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) en un agua que comprende:
(a) un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas;
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno; y
(c) 2.5-5 % CaCO3.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de enzimas celulasas que comprende:
(a) proporcionar un medio de fermentación que contenga una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno; (b) mantener la temperatura del medio de fermentación en el intervalo de 25 a 34 °C;
(c) ajustar el pH del medio de fermentación de 5 a 5,5;
(d) proporcionar una aireación del 50 %;
(e) inocular el medio de fermentación con un 10 % de semillas de Penicillium Funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) con actividad en forma líquida, y fermentar;
(f) dejar el proceso de fermentación durante 96 horas; y
(g) recoger el caldo enzimático y centrifugar para obtener enzimas, en el que el medio de fermentación comprende un 1-5 % en p/v de la fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas; y un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de enzimas celulasas y/o hemicelulasas a títulos altos, el procedimiento comprende llevar a cabo la fermentación a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) en un medio de fermentación que comprende, el procedimiento que comprende
(a) preparación del medio de fermentación utilizando celulosa o biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido (un 1-5 % en p/v) y harina de soja o harina de soja desaceitada o torta de soja desaceitada (un 1-5 % en p/v), seguido de la inoculación con un 10 % de semillas de Penicillium Funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) con actividad en forma líquida;
(b) someter el cultivo de Penicillium Funiculosum MRJ-16 a fermentación en un fermentador aireado a 30 °C, pH ajustado a 5,5, aireación superior al 20 % durante 96 horas; y
(c) recoger el caldo enzimático después de 96 horas de fermentación y centrifugar para obtener un caldo enzimático bien definido.
De acuerdo con la presente invención, la harina de soja puede ser harina de soja desgrasada o harina de soja normal. De acuerdo con la presente invención, las enzimas producidas a partir de Penicillium funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) como se proporciona en la presente invención se usa con micelio para la sacarificación de la biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido. La aireación durante la fermentación se mantiene en todo momento por encima del 30 %.
En una realización de la presente invención, la biomasa previamente tratada que se utiliza de acuerdo con la presente invención incluye, pero no se limita a, paja de arroz, paja de trigo, rastrojo de maíz, tallo de algodón, etc. En otra realización, la celulosa y la biomasa lignocelulósica previamente tratada se pueden usar juntas en una mezcla.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se exponen a continuación para ilustrar los métodos y resultados de acuerdo con la materia objeto divulgada. Estos ejemplos no pretenden incluir todos los aspectos de la materia objeto divulgada en el presente documento, sino más bien ilustrar métodos, composiciones y resultados representativos. Estos ejemplos no pretenden excluir los equivalentes y variaciones de la presente invención, que son evidentes para los expertos en la técnica.
Ejemplo 1 - Producción de enzimas a partir de un medio de preparación
El proceso de fermentación se llevó a cabo en un biorreactor aireado de agitación continua con un recipiente de vidrio de doble pared de 7 L y un volumen de trabajo de 5 L. Los componentes del medio de fermentación utilizados fueron 5 g/L de sulfato de amonio, 6 g/L de KH2PO4 , 1 g/L de MgSÜ4.7H2O, 5 g/L de CaCÜ3 , 2,5 g/L de glicerol, 30 g/L de sólidos de maceración de maíz, 30 g/L de celulosa y 2 ml/L de polisorbato 80. El fermentador que contenía 4,5 L de medio de fermentación se esterilizó a 120 °C durante 20 minutos. Después de enfriar, la temperatura se mantuvo a 30 °C, el pH se ajustó a 5,5, la aireación por encima del 50 % seguido de la inoculación con un 10 % de semillas de Penicillium funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) con actividad en forma líquida. El pH no se reguló durante todo el proceso de fermentación y no se añadieron nutrientes; solo la aireación se mantuvo por encima del 30 %. Después de 96 horas de fermentación, se recogió el caldo enzimático, se centrifugó y se realizó el análisis del caldo enzimático bien definido. Las actividades enzimáticas se analizaron con el método de T.K Ghose y las proteínas se analizaron con el método de BCA. Los resultados del análisis enzimático obtenidos fueron 15 g/L de proteína, 65 Ul/ml de p-glucosidasa y 5,8 unidades de papel de filtro (FPU)/ml de actividad del papel de filtro.
El análisis del caldo enzimático en la presente invención se puede realizar de acuerdo con los métodos conocidos, tales como las metodologías proporcionadas en Ghose, T.K., 1987; Measurement of cellulase activities; Pure Appl. Chem. 59, 257-268; o Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, M. D., Fujimoto, E. K., Goeke, N. M., Olson, B. J., y Klenk, D. C. (1985) Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85.
Ejemplo 2 - Producción de enzimas a partir de líquido de maceración de maíz como fuente de nitrógeno
El cultivo de P. funiculosum MRJ-16 muíante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) se llevó a cabo en condiciones y composición del medio idénticas a las del ejemplo n.° 1 excepto que se usó licor de maceración de maíz como fuente de nitrógeno en lugar de los sólidos de maceración de maíz. Esto se hizo con el fin de economizar el proceso y comprobar si el cambio en la calidad de maceración del maíz afectaría a la capacidad de producción de enzimas de la cepa mutante. Como se ha mencionado anteriormente, el caldo enzimático recogido después de 96 horas del ensayo de fermentación dio 15,4 g/L de proteína, 66 Ul/ml de p-glucosidasa y 6,2 FPU/ml de actividad del papel de filtro.
Ejemplo 3 - Producción de enzimas a partir de urea o nitrato de sodio como fuente de nitrógeno
El P. funiculosum mutante MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) se cultivó en condiciones similares al ejemplo n.° 2 excepto que se usó la fuente de nitrógeno inorgánico, es decir, urea (0,1 %) o nitrato de sodio (0,5 %) en lugar del líquido de maceración de maíz. La urea es una fuente de nitrógeno barata y fácilmente disponible. El caldo enzimático, que se recogió después de 96 horas de fermentación y se analizó, dio 17 g/L de proteína, 60 Ul/ml de pglucosidasa y 6,7 FPU/ml de actividad del papel de filtro en el caso de la urea; 16,5 g/L de proteína, 56 Ul/ml de pglucosidasa y 6,4 FPU/ml de actividad del papel de filtro en el caso del nitrato de sodio.
Ejemplo 4 - Producción de enzimas a partir de biomasa previamente tratada como fuente de carbono
La producción de enzimas a partir de cepa mutante P. funiculosum MRJ-16 (n.° de acceso 25142 en el MTCC) se llevó a cabo en las condiciones y la composición del medio que se describen en el ejemplo n.° 2. Se utilizó biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido como fuente de carbono, por ejemplo, bagazo de caña de azúcar/paja de arroz/paja de trigo, en una cantidad similar a la de la celulosa. El pretratamiento se realizó a una concentración del 0,5-1,5 % de p/p de ácido sulfúrico, temperatura de 110-160 °C durante 10-30 minutos. Después de 96 horas de cultivo se obtuvieron unos resultados de 17,6 g/L de proteína, 72 Ul/ml de p-glucosidasa y 6,5 FPU/ml de actividad del papel de filtro.
Ejemplo 5 - Producción de enzimas a partir de biomasa previamente tratada y celulosa como fuente de carbono
El cultivo de la cepa P. funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) se llevó a cabo en condiciones y composición del medio idénticas a las del ejemplo n.° 4. Se utilizó biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido como fuente de carbono, por ejemplo, bagazo de caña de azúcar/paja de arroz/paja de trigo, junto con celulosa en proporciones de 1:1 o 1:2. La determinación analítica del caldo enzimático dio unos resultados de 18 g/L de proteína, 78 Ul/ml de p-glucosidasa y 7,2 FPU/ml de actividad del papel de filtro.
Ejemplo 6 - Producción de enzimas a partir de celulosa y harina de soja
El cultivo de la cepa P. funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC) se llevó a cabo en condiciones idénticas a las del ejemplo n.° 1. Sin embargo, no se usaron los componentes del medio mencionados anteriormente en el ejemplo n.° 1 y al agua solo se añadió celulosa, harina de soja desgrasada o harina de soja normal, ambas a una concentración del 1-5 % de p/v, el pH se ajustó a 5-5.5 y se esterilizó en autoclave a 120 °C durante 20 minutos. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C durante 96 horas. La determinación analítica del caldo enzimático recogido dio como resultado 18 g/L de proteína, 73 Ul/ml de p-glucosidasa y 7,6 FPU/ml de actividad del papel de filtro. Por lo tanto, el medio solo contenía celulosa y la harina de soja se utilizó para la producción de enzimas.
Ejemplo 7 - Producción de enzimas a partir de biomasa previamente tratada y harina de soja
La producción de enzimas a partir de P. funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso de MTCC 25142) se llevó a cabo en condiciones idénticas al ejemplo n.° 6 excepto que la celulosa se reemplazó por biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido. Al agua se añadió biomasa, harina de soja desgrasada o harina de soja normal, ambas a una concentración del 1-5 % de p/v, se ajustó el pH a 5-5,5 y se esterilizó en autoclave a 120 °C durante 20 minutos. La fermentación se llevó a cabo a 30 °C durante 96 horas y la enzima se recogió y se analizó. Los resultados fueron 16,8 g/L de proteína, 71 Ul/ml de p-glucosidasa y 7,0 FPU/ml de actividad del papel de filtro.
Ejemplo 8 - Hidrólisis de biomasa lignocelulósica previamente tratada
La eficacia del cóctel de enzimas producido en el ejemplo n.° 6 se determinó por su capacidad para hidrolizar la biomasa lignocelulósica, tal como la paja de arroz previamente tratada con ácido, y producir azúcares como la glucosa. La hidrólisis se realizó con una alta carga de sustrato de biomasa, es decir, un 20 % con un pH 4-5, 50 mM de tampón de citrato, temperatura de 50 °C con diferentes cargas de enzimas desde 1-10 FPU/g de biomasa seca. Los azúcares liberados se determinaron a intervalos regulares de tiempo por HPLC. El cóctel de enzimas funcionó eficazmente y dio lugar a una conversión de glucano del 59 % en 48 horas a partir de una concentración de enzimas de 5 FPU/g de sustrato.
Figure imgf000009_0001
Ejemplo 9 - Hidrólisis de biomasa lignocelulósica previamente tratada
La eficacia del cóctel de enzimas producido en el ejemplo n.° 7 se determinó por su capacidad para hidrolizar la biomasa lignocelulósica, tal como la paja de arroz previamente tratada con ácido, y producir azúcares. La hidrólisis se realizó con una alta carga de sustrato de biomasa, es decir, un 20 % con un pH 4-5, 50 mM de tampón de citrato, temperatura de 50 °C con diferentes cargas de enzimas desde 1-10 FPU/g de biomasa seca. Los azúcares liberados se determinaron a intervalos regulares de tiempo por HPLC. El cóctel de enzimas funcionó eficazmente y dio lugar a una conversión de glucano del 60 % en 48 horas a partir de una concentración de enzimas de 5 FPU/g de sustrato.
Figure imgf000009_0002

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para la producción de celulasa a partir de Penicillium Funiculosum MRJ-16 mutante (n.° de acceso 25142 en el MTCC), el procedimiento que comprende llevar a cabo la fermentación en un medio de fermentación que comprende:
(a) un 1-5 % en p/v de celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismas; y
(b) un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada.
2. Un procedimiento para la producción de celulasa que comprende:
(a) proporcionar un medio de fermentación que contenga una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno;
(b) mantener la temperatura del medio de fermentación en el intervalo de 25 a 34 °C;
(c) ajustar el pH del medio de fermentación de 5 a 5,5;
(d) proporcionar una aireación del 50 %;
(e) inocular el medio de fermentación con un 10 % de semillas de Penicillum funiculosum MRJ-16, n.° de acceso 25142 en el MTCC, con actividad en forma líquida y fermentar;
(f) dejar el proceso de fermentación durante 96 horas; y
(g) recoger el caldo enzimático y centrifugar para obtener las enzimas,
en el que el medio de fermentación comprende un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa, biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido o una combinación de las mismos, y un 1-5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desaceitada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno.
3. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la fuente de carbono en el medio de fermentación es celulosa y biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido en proporciones seleccionadas entre 1:1 o 1:2.
4. Un procedimiento para producir enzimas celulasa y hemicelulasa, el procedimiento que comprende las etapas de:
(a) preparar los componentes del medio de cultivo de fermentación utilizando un 1-5 % en p/v de fuente de carbono seleccionada entre celulosa o biomasa lignocelulósica previamente tratada con ácido y un 1­ 5 % en p/v de harina de soja o harina de soja desgrasada o torta de soja desaceitada como fuente de nitrógeno;
(b) inocular los componentes del medio de la etapa (a) con un 10 % de semillas de Penicillium funiculosum MRJ-16, n.° de acceso 25142 en el MTCC, con actividad en forma líquida
(c) someter el cultivo de Penicillium Funiculosum MRJ-16 de la etapa (b) a fermentación en un fermentador aireado; y
(d) recoger el caldo enzimático después del proceso de fermentación de la etapa (c) y someter el caldo a centrifugación para obtener las enzimas.
5. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el pH no se ha controlado durante el proceso de fermentación y la aireación durante el proceso de fermentación se mantiene por encima del 30 %.
6. El procedimiento como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la biomasa lignocelulósica se selecciona entre paja de arroz, paja de trigo, rastrojo de maíz, tallo de algodón o bagazo de caña de azúcar y la harina de soja se selecciona entre harina de soja desgrasada o harina de soja normal.
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