ES2919964T3

ES2919964T3 - Material compuesto que se forma in situ para la restauración de tejido

Info

Publication number: ES2919964T3
Application number: ES16837731T
Authority: ES
Inventors: Russell Martin; Hai-Quan Mao
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2016-08-17
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2036-08-17
Also published as: WO2017031171A1; EP3337464B1; EP4091639A1; US20190060516A1; EP3337464A4; EP3337464A1

Abstract

La composición y los métodos actualmente revelados se proporcionan para un compuesto de nanofibra de nanofibra de formación in situ, que se forma utilizando esquemas de unión no covalentes entre la superficie de la fibra y los polímeros formadores de hidrogel. Un método para curar un defecto de tejido blando puede incluir la aplicación de dicho material compuesto a un defecto de tejido blando. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Material compuesto que se forma in situ para la restauración de tejido

ANTECEDENTES

1. Campo

La presente divulgación se refiere a materiales compuestos y a métodos que restauran volumen de tejido blando perdido, a la vez que se promueve la regeneración de tejido blando.

2. Descripción de la técnica relacionada

Los defectos de tejido blando resultantes de traumatismo, resección oncológica o malformación congénita son difíciles de tratar mediante los medios convencionales. Las terapias actuales, que incluyen reordenaciones de tejido o transferencia de tejido, causan defectos en el sitio del donante. Otras terapias, tales como los implantes protésicos, conducen a fibrosis y encapsulación. Las estrategias existentes para promover el crecimiento infiltrante de tejido también son poco adecuadas para el tratamiento de defectos de tejido blando. Las actuales matrices acelulares producen láminas fibróticas planas de tejido en vez del tejido tridimensional blando requerido para las reconstrucciones ideales. Finalmente, aunque el injerto de grasa puede restaurar defectos de tejido blando, su uso más amplio está impedido por la supervivencia variable del injerto y los volúmenes limitados de restauración. Un enfoque ideal para la reconstrucción de tejido blando sería fomentar la regeneración de tejidos blandos, tales como tejido adiposo in vivo, seguido de la implantación de los tejidos para promover la regeneración. Sin embargo, el recrecimiento de tejido adiposo requiere una matriz adecuada para que las células se unan, migren, proliferen, se diferencien y organicen en un nuevo tejido. Gran parte de la matriz extracelular (MEC) nativa está ausente en el sitio de reparación. Por lo tanto, el volver a crear una matriz sintética que no solo restaure inmediatamente el volumen de tejido perdido, sino que también reacondicione el microentorno, soporte la infiltración de células hospedadoras y promueva la regeneración de tejido blando, se convierte en una tarea esencial cuando se reparan defectos de tejido blando usando reconstrucción basada en tejido adiposo.

Los hidrogeles ofrecen varias ventajas como material de relleno para la reconstrucción de tejido blando. Sin embargo, para lograr una propiedad mecánica suficiente, se requieren normalmente mayores densidades de reticulación. En estas condiciones, sin embargo, las células de tejido hospedador (por ejemplo, progenitores de adipocitos y progenitores endoteliales) no son capaces de penetrar y crecer en los armazones. En el caso de los hidrogeles degradables, es típica la formación de tejido cicatricial y fibroso debido a que el crecimiento infiltrante de tejido hospedador ocurre muy lentamente, o al menos a un ritmo inferior a la absorción del material de fibra.

Recientemente se han desarrollado nanofibras funcionalizadas para servir de mimético de MEC para soportar diversas actividades celulares. Se pueden usar poli-a-ésteres biodegradables sintéticos conforme a la FDA, tales como la policaprolactona (PCL) o la poli(lactida-co-glicolida) (PLGA), para generar nanofibras mediante un proceso conocido como electrohilado. Las suturas e implantes biodegradables preparados a partir de estos polímeros se han usado ampliamente en la clínica debido a su excelente trayectoria de biocompatibilidad. Se han desarrollado diversas nanofibras de diámetros y topografías variables para aplicaciones en la ingeniería de células madre. Estas nanofibras, sin embargo, no ofrecen estructuras macroscópicas, que hace que sean difíciles de usar como armazones 3D.

Se han descubierto péptidos que se unen a HA por presentación en fagos (Mummert, Mark E., et al. "Development of a peptide inhibitor of hyaluronan-mediated leukocyte trafficking". The Journal of experimental medicine 192.6 (2000): 769-780) y usado como una molécula pequeña para modular el seguimiento de células en situaciones como el tratamiento de infecciones de heridas (Zaleski, Kathleen J., et al. "Hyaluronic acid binding peptides prevent experimental staphylococcal wound infection". Antimicrobial agents and chemotherapy 50.11 (2006): 3856-3860). El grupo de Elisseeff ha favorecido el uso de péptidos que se unen a HA para la unión de ácido hialurónico endógeno para mejorar la lubricación en articulaciones (Singh, Anirudha, et al. "Biomaterials comprising hyaluronic acid binding peptides and extracellular matrix binding peptides for hyaluronic acid retention and tissue engineering applications". Solicitud de patente de EE. UU. N.° 14/906.111) y la retención de agua en lentes de contacto (Beachley, Vincent, et al. "Contact Lens Surface Modification with Hyaluronic Acid (HA) Binding Peptide for HA Accumulation and Retention". Solicitud de patente de EE. UU. N.° 14/439.270). Sin embargo, se cree que nadie ha usado previamente péptidos que se unen a HA para potenciar las propiedades del hidrogel, modular la unión interfacial con nanofibras, o mejorar los materiales de relleno de tejido blando.

Dados los diversos problemas asociados a dichos métodos y sistemas convencionales, todavía existe la necesidad en la técnica de soluciones mejoradas para la curación de defectos de tejido blando. La presente divulgación proporciona una solución para esta necesidad que vence los diversos problemas observados en la técnica.

SUMARIO

La invención se basa, al menos en parte, en la identificación de complejos de armazón que tienen componentes de fibra polimérica que poseen propiedades mejoradas (por ejemplo, calidades mejoradas para la reconstrucción de tejido blando, como se detalla más adelante).

En un aspecto, la invención proporciona un complejo de armazón como se define en la reivindicación 1, que comprende una fibra polimérica no tejida que tiene un diámetro medio de desde aproximadamente 100 nm hasta aproximadamente 8000 nm unida covalentemente a un resto de unión a hidrogel, en donde el resto de unión a hidrogel está asociado con un material de hidrogel, en donde el material de hidrogel se selecciona del grupo que comprende ácido hialurónico, colágeno o una combinación de los mismos, o una matriz extracelular de tejido procesada; y en donde el complejo de armazón comprende además un resto de reticulación presente en una cantidad eficaz para inducir la reticulación entre la fibra de policaprolactona y el ácido hialurónico.

El resto de unión a hidrogel incluye una secuencia seleccionada del grupo que consiste en péptidos que se unen a ácido hialurónico seleccionados de GAHWQFNALTVR, LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN y STMMSRSHKTRSHH y péptido que se une a colágeno GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM; y opcionalmente el resto de unión a hidrogel incluye una segunda secuencia seleccionada del grupo que consiste en péptidos que se unen a ácido hialurónico seleccionados de CRRDDGAHWQFNALTVR, LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN y STMMSRSHKTRSHHV y péptido que se une a colágeno GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM.

En una realización, el material de hidrogel está presente en el complejo en una red funcional.

En una realización adicional, la relación entre fibra y material de hidrogel anhidro es desde aproximadamente 1:10 hasta aproximadamente 10:1.

La fibra polimérica comprende policaprolactona electrohilada.

En una realización, el complejo se formula para ser sustancialmente biocompatible. Opcionalmente, la fibra polimérica incluye un material polimérico biológico que incluye una seda, un colágeno, un quitosano y/o una combinación de los mismos.

En una realización, el material de hidrogel incluye ácido hialurónico. Opcionalmente, el material de hidrogel incluye un material de hidrogel que incluye un poli(etilenglicol), un colágeno, un dextrano, una elastina, un alginato, una fibrina, un alginato, un ácido hialurónico, un poli(alcohol vinílico), un derivado de los mismos, o una combinación de los mismos.

En ciertas realizaciones, el material de hidrogel incluye una matriz extracelular de tejido procesada.

En una realización, la matriz extracelular de tejido procesada es derivable de un tejido adiposo.

En una realización, el material de hidrogel incluye un ácido hialurónico que cubre al menos una porción de una superficie externa de la fibra de policaprolactona.

El complejo de armazón incluye una pluralidad de poros presentes sobre o dentro de una superficie del complejo de armazón, donde los poros están presentes en una concentración de al menos aproximadamente 50 poros por cm2 de la superficie, y donde al menos el 80 % de los poros tiene un diámetro de poro promedio sobre la superficie es de al menos 5 micrómetros.

Opcionalmente, el complejo de armazón promueve el crecimiento de tejido y la infiltración de células cuando se implanta en un tejido diana presente en un sujeto humano.

En ciertas realizaciones, el complejo de armazón es biodegradable cuando se implanta en un tejido humano.

En una realización, el complejo de armazón es sustancialmente no biodegradable cuando se implanta en un tejido humano.

En otra realización, el complejo de armazón adicional incluye un agente terapéutico seleccionado de una célula, una molécula pequeña, un ácido nucleico y un polipéptido.

Otro aspecto de la invención proporciona un biomaterial implantable que incluye un complejo de armazón de la invención.

En ciertas realizaciones, el material implantable es acelular.

En una realización, el material implantable se formula para administración por inyección.

En otra realización, el material implantable se formula para administración subdérmica.

En el presente documento se describe un kit que contiene material implantable de la invención.

Un aspecto adicional de la invención proporciona un dispositivo médico de retención de forma de tejido en un sujeto que se somete a un procedimiento quirúrgico, que incluye el complejo de armazón y/o el material implantable de la invención en una cantidad eficaz para proporcionar la retención de una forma de tejido cuando se administra al sujeto.

En el presente documento se describe un método de preparación de un implante para la reparación de tejido o cartílago, implicando el método las etapas de: proporcionar un armazón tridimensional acelular que incluye fibras poliméricas orientadas para producir una pluralidad de poros, donde al menos una porción de las fibras poliméricas están reticuladas con otras fibras de policaprolactona; disponer una composición que incluye un material de hidrogel sobre las fibras poliméricas para formar un complejo; y hacer reaccionar o estabilizar el complejo para formar un implante estabilizado, por lo que se prepara el implante.

Opcionalmente, el tejido incluye un tejido blando.

En el presente documento se describe un método de preparación de un implante para la reparación de tejido o cartílago, implicando el método las etapas de: proporcionar un armazón tridimensional acelular que incluye fibras poliméricas orientadas para producir una pluralidad de poros; disponer una composición que incluye un material de hidrogel sobre las fibras poliméricas para formar un complejo; y hacer reaccionar o estabilizar el complejo para formar un implante estabilizado donde al menos una porción de las fibras poliméricas está reticulada con el material de hidrogel.

En el presente documento se describe un método de resolución de un defecto de tejido resultante de un traumatismo o intervención quirúrgica, implicando el método distender el tejido, donde la distención del tejido incluye el implante de una cantidad eficaz del complejo de armazón de la invención en el tejido para así distenderlo.

En el presente documento se describe un método de reducción o inversión de defecto de tejido resultante de una enfermedad, trastorno o afección asociado al envejecimiento, implicando el método distender el tejido que incluye el tejido, donde la distensión del tejido incluye implantar una cantidad eficaz de un complejo de armazón de la invención en el tejido para así distenderlo.

Opcionalmente, el defecto de tejido incluye tejido pleural, tejido muscular, piel, o una combinación de los mismos.

En el presente documento se describe un material compuesto que incluye un gel y al menos una nanoestructura dispuesta dentro del gel. El gel puede ser un hidrogel o cualquier otro gel adecuado. La nanoestructura puede ser una nanofibra o cualquier otra nanoestructura adecuada. La nanoestructura se puede unir covalentemente con el gel. La nanoestructura se puede fabricar de policaprolactona (PCL) o cualquier otro material adecuado.

En el presente documento se describe un método de curación de un defecto de tejido blando que comprende aplicar un material compuesto a un defecto de tejido blando, en donde el material compuesto incluye un gel y una nanoestructura dispuesta dentro del gel.

En el presente documento se describe un método de fabricación de un material compuesto para su uso en la curación de defectos de tejido blando que incluye proporcionar un gel y disponer las nanofibras dentro del gel.

Si procede o no se excluye específicamente, se contempla que una cualquiera de las realizaciones de la invención descritas en el presente documento sea capaz de ser combinada con una cualquiera o más realizaciones de la invención, aun cuando las realizaciones se describan en diferentes aspectos de la invención.

Estas y otras realizaciones se desvelan por la siguiente Descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La siguiente descripción detallada, dada a modo de ejemplo, pero no prevista para limitar la invención únicamente a las realizaciones específicas descritas, se puede entender mejor junto con los dibujos adjuntos.

La Fig. 1A ilustra la estructura de una realización de un material compuesto según la presente divulgación, que muestra nanoestructuras dispuestas en un gel, y en particular, la unión covalente de la nanoestructura a grupos funcionales en el gel.

La Fig. 1B muestra una imagen de microscopio óptico de un material compuesto completamente hinchado como se ilustra en la Fig. 1;

la Fig. 1C es una imagen del aspecto macroscópico de un material compuesto hidratado como se ilustra en la Fig. 1;

la Fig. 1D muestra una imagen de micrografía electrónica de barrido (SEM) de un material compuesto deshidratado como se ilustra en la Fig. 1, que revela la similitud ultra-estructural con MEC;

la Fig. 2A representa curvas de esfuerzo-deformación de una realización del material compuesto de la Fig. 1 representado frente al hidrogel de HA solo, que revela el módulo elástico mejorado en comparación con el hidrogel a la misma densidad de reticulación;

la Fig. 2B representa una prueba de fatiga que muestra que la realización de un material compuesto de la Fig. 2A retiene un grado similar de solidez de la integridad mecánica en comparación con el hidrogel regular;

las Fig. 3A y 3B muestran fluorescencia y superposición (Fig. 3A) con imágenes de contraste de fase (Fig. 3B) de CMA cultivadas en material compuesto de nanofibra-hidrogel de HA durante 4 días;

las Fig. 3C y 3D muestran fluorescencia y superposición (Fig. 3C) con imágenes de contraste de fase (Fig. 3D) de CMA cultivadas en hidrogel de HA común durante 4 días;

las Fig. 4A y 4B muestran una imagen de fluorescencia y superposición (Fig. 4A) con imagen de contraste de fase (Fig. 4B) que contrasta CMA que migran desde esferoides a lo largo de nanofibras alineadas de 650 nm.

La Fig. 5A es una fotografía que muestra el aspecto del material compuesto de nanofibra-hidrogel in situ en el cuerpo adiposo inguinal de la rata;

la Fig. 5B muestra imágenes de tinción con H&E de secciones de tejidos alrededor del material compuesto recogidas 2 semanas después de la implantación; y

la Fig. 5C muestra imágenes de tinción con H&E de secciones de tejido recogidas de la interfase de material compuesto-tejido a las 4 semanas, que muestra la infiltración de células.

La Fig. 6A representa un esquema de síntesis para el material compuesto de fibra de policaprolactona (PCL)-hidrogel de HA.

La Fig. 6B representa una ilustración esquemática de la estructura del material compuesto con unión interfacial entre fibras de PCL y la red de cadenas de HA.

La Fig. 6C representa imágenes ópticas que muestran el aspecto general de un material compuesto recién preparado de fibra cilíndrica-hidrogel de HA (izquierda) y un hidrogel de HA (derecha) con las mismas dimensiones (barra de escala = 5 mm).

La Fig. 6D representa imágenes ópticas del mismo conjunto de muestras después de la liofilización y rehidratación.

La Fig. 6E representa imágenes de SEM de sección transversal de un hidrogel de HA (barra de escala = 40 pm).

La Fig. 6F representa imágenes de SEM de sección transversal de material compuesto de fibra de PCL-hidrogel de HA (barra de escala = 100 pm).

La Fig. 6G representa imágenes de SEM de sección transversal de tejido adiposo nativo descelularizado (barra de escala = 10 pm).

La Fig. 7A representa el efecto del diámetro de la fibra y la unión interfacial sobre el módulo de compresión de refuerzo del hidrogel de HA. Se prepararon el hidrogel de HA y los materiales compuestos basados en 4,5 mg/ml de HA. Los valores de esfuerzo se midieron al 50 % de deformación. *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 7B representa el efecto del diámetro de la fibra y la unión interfacial sobre el módulo de compresión de refuerzo del hidrogel de PEG. Se prepararon el hidrogel de PEG y los materiales compuestos basados en 30 mg/ml de PEGSH y 20 mg/ml de PEGDA, y se usaron fibras de PCL de 1,0 pm para sintetizar los materiales compuestos de fibra-hidrogel de PEG. Los valores de esfuerzo se midieron al 50 % de deformación. *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 8A representa el efecto de la densidad de unión interfacial y el diámetro de la fibra sobre el módulo de almacenamiento por cizallamiento de refuerzo del hidrogel de HA. *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 8B representa el efecto de la densidad de unión interfacial y el diámetro de la fibra sobre el módulo de almacenamiento por cizallamiento de refuerzo del hidrogel de PEG. Los valores del módulo de almacenamiento por cizallamiento se midieron a una frecuencia de 1 Hz. *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 8C representa el efecto de la densidad de unión interfacial y el diámetro de la fibra sobre el módulo de almacenamiento por cizallamiento de refuerzo del hidrogel de HA. Los valores del módulo de almacenamiento por cizallamiento se midieron a una frecuencia de 1 Hz. *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 8D representa el efecto de la densidad de unión interfacial y el diámetro de la fibra sobre el módulo de almacenamiento por cizallamiento de refuerzo del hidrogel de HA. Los valores del módulo de almacenamiento por cizallamiento se midieron a una frecuencia de 1 Hz. *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 9A representa el efecto de la cantidad de carga de fibra sobre el módulo de almacenamiento por cizallamiento del hidrogel de HA. Se sintetizaron el hidrogel de HA y los materiales compuestos usando 10 mg/ml de HA. Los módulos de almacenamiento por cizallamiento se miden a una frecuencia de 1 Hz. Las flechas azules indican condiciones para ambos materiales compuestos con 1 con respecto a 2 de relación molar de grupos SH con respecto a grupos (DA+MAL). *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 9B representa el efecto de la cantidad de carga de fibra sobre el módulo de almacenamiento por cizallamiento del hidrogel de HA. Se sintetizaron el hidrogel de HA y los materiales compuestos usando 4,5 mg/ml de HA. Los módulos de almacenamiento por cizallamiento se miden a una frecuencia de 1 Hz. Las flechas azules indican condiciones para ambos materiales compuestos con 1 con respecto a 2 de relación molar de grupos SH con respecto a grupos (DA+MAL). *p < 0,05 (prueba de la t de Student).

La Fig. 10A representa la resistencia mecánica del material compuesto de fibra-hidrogel de HA a diferentes frecuencias. Se mide el módulo de almacenamiento por cizallamiento del hidrogel de HA y los materiales compuestos frente a diferentes frecuencias de carga de cizallamiento.

La Fig. 10B representa la resistencia mecánica del material compuesto de fibra-hidrogel de HA a diferente rehidratación. Comparación del esfuerzo de compresión de los materiales compuestos antes y después de la rehidratación (deformación = 40 %).

La Fig. 10C representa la resistencia mecánica del material compuesto de fibra-hidrogel de HA a diferente carga cíclica. Se miden los esfuerzos de compresión de un hidrogel de HA y el material compuesto correspondiente frente a la carga cíclica (deformación = 25 %).

La Fig. 11A representa la capacidad de migración de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) en hidrogel de HA en el día 27. El control de hidrogel de HA y los dos materiales compuestos se seleccionaron para presentar módulos de compresión similares de aproximadamente 1,9 kPa. Se tiñeron F-actina y núcleos de CMAh con la faloidina Alexa Fluor® 568 (rojo) y DAPI (azul), respectivamente. Se marcaron las nanofibras con Alexa Fluor® 647 (blanco). Barras de escala = 100 gm.

La Fig. 11B representa la capacidad de migración de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) en material compuesto de nanofibras-hidrogel de HA en el día 27. El control de hidrogel de HA y los dos materiales compuestos se seleccionaron para presentar módulos de compresión similares de aproximadamente 1.9 kPa. Se tiñeron F-actina y núcleos de CMAh con la faloidina Alexa Fluor® 568 (rojo) y DAPI (azul), respectivamente. Se marcaron las nanofibras con Alexa Fluor® 647 (blanco). Barras de escala = 100 gm.

La Fig. 11C representa la capacidad de migración de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) en material compuesto de RGD-nanofibras-hidrogel de HA en el día 27. Se seleccionaron el control de hidrogel de HA y los dos materiales compuestos para presentar módulos de compresión similares de aproximadamente 1.9 kPa. Se tiñeron F-actina y núcleos de CMAh con la faloidina Alexa Fluor® 568 (rojo) y DAPI (azul), respectivamente. Se marcaron las nanofibras con Alexa Fluor® 647 (blanco). Barras de escala = 100 gm.

La Fig. 11D representa la capacidad de migración de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) en material compuesto de RGD-nanofibras-hidrogel de HA en el día 27. Se seleccionaron el control de hidrogel de HA y los dos materiales compuestos para presentar módulos de compresión similares de aproximadamente 1.9 kPa. Las flechas amarillas en (d) y (e) indican células que se adhieren a fibras o grupos de fibras. Se tiñeron F-actina y núcleos de CMAh con la faloidina Alexa Fluor® 568 (rojo) y DAPI (azul), respectivamente. Se marcaron las nanofibras con Alexa Fluor® 647 (blanco). Barras de escala = 20 gm.

La Fig. 11E representa la capacidad de migración de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) en material compuesto de nanofibras-hidrogel de HA en el día 27. Se seleccionaron el control de hidrogel de HA y los dos materiales compuestos para presentar módulos de compresión similares de aproximadamente 1,9 kPa. Las flechas amarillas en (d) y (e) indican células que se adhieren a fibras o grupos de fibras. Se tiñeron F-actina y núcleos de CMAh con la faloidina Alexa Fluor® 568 (rojo) y DAPI (azul), respectivamente. Se marcaron las nanofibras con Alexa Fluor® 647 (blanco). Barras de escala = 20 gm.

La Fig. 11F representa la capacidad de migración de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh). Se muestra una ilustración esquemática de esferoides de CMAh en la estructura de material compuesto con unión interfacial entre fibras de PCL y la red de cadenas de HA.

La Fig. 12A representa la regeneración de tejido mediada por el material compuesto implantado de fibra-hidrogel de HA e hidrogel de HA en 30 días. Se muestran imágenes macroscópicas del material compuesto antes (recuadros) y después de la implantación bajo el cuerpo adiposo inguinal (barra de escala = 2 mm). Las estrellas blancas indican las matrices implantadas.

La Fig. 12B representa la regeneración de tejido mediada por el material compuesto implantado de fibra-hidrogel de HA e hidrogel de HA en 30 días. Se muestran imágenes macroscópicas del hidrogel de HA antes (recuadros) y después de la implantación bajo el cuerpo adiposo inguinal (barra de escala = 2 mm). Las estrellas blancas indican las matrices implantadas.

La Fig. 12C representa la regeneración de tejido mediada por el material compuesto implantado de fibra-hidrogel de HA e hidrogel de HA en 30 días. Se muestran imágenes teñidas con H&E y tricromo de Masson de (i) tejido adiposo nativo, (ii) tejido curado después de la cirugía de referencia, (iii, v) tejido implantado con fibra-hidrogel de HA, y (iv, vi) el tejido implantado con hidrogel de HA en el día 14 y día 30. En las imágenes, H = hidrogel de HA, C = material compuesto de fibra-hidrogel de HA, B = tejido adiposo pardo, flecha amarilla = vaso sanguíneo. Barra de escala = 200 pm.

La Fig. 12D representa la regeneración de tejido mediada por el material compuesto implantado de fibra-hidrogel de HA e hidrogel de HA en 30 días. Se muestran imágenes teñidas con H&E y tricromo de Masson de (i) tejido adiposo nativo, (ii) tejido curado después de la cirugía de referencia, (iii, v) tejido implantado con fibra-hidrogel de HA, y (iv, vi) el tejido implantado con hidrogel de HA en el día 14 y día 30. La tinción azul de la tinción tricromática de Masson indica el colágeno total en tejido examinado. En las imágenes, H = hidrogel de HA, C = material compuesto de fibra-hidrogel de HA, B = tejido adiposo pardo, flecha amarilla = vaso sanguíneo. Barra de escala = 200 pm.

La Fig. 13A representa un diagrama esquemático de la preparación de fibras modificadas en la superficie con MAL por el método de injerto de PAA.

La Fig. 13B representa densidades promedio de grupos carboxilo en fibras después del injerto de PAA con 3 y 10 % (v/v) de ácido acrílico (*p < 0,05, n = 6).

La Fig. 14 representa módulos de almacenamiento por cizallamiento del hidrogel de HA con diversas relaciones molares de SH con respecto a DA preparado con 4,5 mg/ml de HA-SH.

La Fig. 15A representa módulos de almacenamiento por cizallamiento de materiales compuestos de fibra-hidrogel de HA preparados a partir de diversas cantidades de fibras. El diámetro promedio de las fibras es 686 nm, la densidad superficial de MAL en las fibras era 100 nmol/mg y los materiales compuestos se prepararon con 4,5 mg/ml de HA-SH y 5 mg/ml de PEGDA. Las flechas azules indican 1 con respecto a 2 de relación molar de grupos SH con respecto a grupos (DA+MAL). *p < 0,05 (n = 3).

La Fig. 15B representa módulos de almacenamiento por cizallamiento de materiales compuestos de fibra-hidrogel de PEG con diversas cantidades de fibras cargadas. *p < 0,05 (n = 3).

La Fig. 16 representa el tamaño de poro promedio del hidrogel de HA y se estimó el material compuesto de nanofibra-hidrogel de HA basándose en las imágenes de SEM de su sección transversal (*p < 0,05).

La Fig. 17A representa la infiltración de células y el crecimiento infiltrante de tejido a través del material compuesto de fibra-hidrogel de HA en el día 14. Los tejidos seccionados se tiñeron por H&E para colágeno total (azul). Etiquetas: C = material compuesto de fibra-hidrogel de HA, flecha amarilla = vaso sanguíneo. Barra de escala = 50 pm.

La Fig. 17B representa la infiltración de células y el crecimiento infiltrante de tejido a través del material compuesto de fibra-hidrogel de HA en el día 14. Los tejidos seccionados se tiñeron por tricromo de Masson para el colágeno total (azul). Etiquetas: C = material compuesto de fibra-hidrogel de HA, flecha amarilla = vaso sanguíneo. Barra de escala = 50 pm.

La Fig. 17C representa la infiltración de células y el crecimiento infiltrante de tejido a través del material compuesto de fibra-hidrogel de HA en el día 30. Los tejidos seccionados se tiñeron por H&E para colágeno total (azul). Etiquetas: C = material compuesto de fibra-hidrogel de HA, flecha amarilla = vaso sanguíneo. Barra de escala = 50 pm.

La Fig. 17D representa la infiltración de células y el crecimiento infiltrante de tejido a través del material compuesto de fibra-hidrogel de HA en el día 30. Los tejidos seccionados se tiñeron por tricromo de Masson para colágeno total (azul). Etiquetas: C = material compuesto de fibra-hidrogel de HA, flecha amarilla = vaso sanguíneo. Barra de escala = 50 pm.

La Fig. 18 representa imágenes de SEM de la sección transversal de tejido adiposo descelularizado (panel superior) y el material compuesto de fibra-hidrogel de HA (panel inferior).

La Fig. 19A representa la capacidad de migración de CMAh en hidrogeles de HA (G' = 24,85 p 2,92 Pa) en el día 4. El hidrogel de HA se fabricó con 2,5 mg/ml de HA-SH y 5,0 mg/ml de PEGDA. Barra de escala = 100 pm. La Fig. 19B representa la capacidad de migración de CMAh en material compuesto de fibra-hidrogel de HA de 1.0 pm (G' = 32,29 p 2,16 Pa) en el día 4. Los materiales compuestos se fabricaron con 2,5 mg/ml de HA, 5.0 mg/ml de PEGDA y 10 mg/ml de fibras. Barra de escala = 100 pm.

La Fig. 19C representa la capacidad de migración de CMAh en material compuesto de fibra-hidrogel de HA de 286 nm (G' 39,56 p 1,26 Pa) en el día 4. Los materiales compuestos se fabricaron con 2,5 mg/ml de HA, 5,0 mg/ml de PEGDA y 10 mg/ml de fibras. Barra de escala = 100 pm.

La Fig. 20A representa la formulación inyectable. El material compuesto de fibra-hidrogel se puede formular para aplicaciones inyectables.

La Fig. 20B representa que el material compuesto inyectable es estable inmediatamente después de la inyección. La Fig. 20C representa que el material compuesto inyectable sigue siendo no dispersivo en agua con retención de forma y volumen.

La Fig. 20D representa la infiltración de células y el crecimiento infiltrante de tejido a través del material compuesto de fibra-hidrogel de HA inyectable en el día 30, que muestra la amplia remodelación celular y la formación de adipocitos. Los tejidos seccionados se tiñeron por H&E. Etiquetas: c = material compuesto de fibrahidrogel de HA.

La Fig. 21 representa las características estructurales de un ejemplo de dicho material compuesto donde el hidrogel es ácido hialurónico (HA)-red reticulada de PEG y las nanofibras están funcionalizadas en la superficie con restos de unión a HA (péptidos). La unión interfacial se refiere a enlace no covalente entre péptidos que se unen a HA y la cadena de HA en la red de hidrogel.

La Fig. 22 representa muestras de material compuesto preparadas con enlace no covalente. Desde la izquierda: péptido 1 que se une a HA, GAHWQFNALTVR, péptido 2 que se une a HA, STMMSRSHKTRSHH; y secuencia combinada de péptido 1, GHTAWLQAVRFN.

La Fig. 23 representa trazados representativos de barridos de amplitud, que muestran la rigidez mecánica en forma de módulo de almacenamiento de los materiales compuestos. El péptido 1 que se une a HA es GAHWQFNALTVR, el péptido 2 que se une a HA es STMMSRSHKTRSHH y el péptido combinado es GHTAWLQAVRFN, una secuencia aleatoria del péptido 1.

La Fig. 24 representa la comparación del módulo de almacenamiento promedio de diferentes materiales compuestos de hidrogel-fibra al 1 % de deformación (+/- 0,3 %) para los materiales compuestos de nanofibra funcionalizados con péptido. El péptido 1 Hab es GAHWQFNALTVR, el péptido 2 Hab es STMMSRSHKTRSHH y el péptido combinado GHTAWLQAVRFN, una secuencia aleatoria del péptido 1.

La Fig. 25 representa Juvederm Voluma con y sin 10 mg/ml de fragmentos de nanofibras funcionalizadas. Juvederm Voluma (jeringa superior) es un líquido claro (arriba), pero la mezcla de Juvederm Voluma y fragmentos de nanofibra dispersados da una suspensión blanca lechosa (fondo).

Las Fig. 26A y 26B representan trazados representativos de barridos de frecuencia (Fig. 26A) y amplitud (Fig. 26B) de Juvederm Voluma con y sin 10 mg/ml de nanofibras funcionalizadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a un complejo de armazón según la reivindicación 1. La invención también se refiere a un biomaterial implantable y a un dispositivo médico como se define en las reivindicaciones.

Lo siguiente es una descripción detallada de la invención proporcionada para ayudar a los expertos en la técnica en la puesta en práctica de la presente invención. La terminología usada en la descripción de la invención en el presente documento solo es para describir realizaciones particulares y no pretende ser limitante de la invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Las siguientes referencias proporcionan a un experto una definición general de muchos de los términos (a menos que se defina de otro modo en el presente documento) usados en la presente invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991). En general, los procedimientos de los métodos de biología molecular descritos o inherentes en el presente documento y similares son métodos comunes usados en la técnica. Dichas técnicas convencionales se pueden encontrar en manuales de referencia, tales como, por ejemplo, Sambrook et al., (2000, Molecular Cloning--A Laboratory Manual, tercera edición, Cold Spring Harbor Laboratories); y Ausubel et al., (1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New-York).

Los siguientes términos pueden tener significados que se les atribuyan a continuación, a menos que se especifique lo contrario. Sin embargo, se debe entender que también son posibles otros significados que son conocidos o entendidos por los expertos habituales en la técnica. En caso de conflicto, controlará la presente memoria descriptiva, que incluye definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solo y no pretenden ser limitantes.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, un "complejo de armazón" incluye cualquier asociación covalente de dos componentes: una fibra polimérica y un material de hidrogel. El complejo de armazón contiene la fibra polimérica y el material de hidrogel en una "red funcional", que significa que las interacciones entre los componentes producen un beneficio químico, bioquímico, biofísico, físico o fisiológico. Además, una red funcional puede incluir componentes adicionales, que incluyen células, materiales biológicos (por ejemplo, polipéptidos, ácidos nucleicos, lípidos, hidratos de carbono), compuestos terapéuticos, moléculas sintéticas y similares. En ciertas realizaciones, el complejo de armazón promueve el crecimiento de tejido y la infiltración de células cuando se implanta en un tejido diana presente en un sujeto humano.

Como se usa en el presente documento, el término "hidrogel" es un tipo de "gel", y se refiere a una matriz polimérica que se hincha en agua, que consiste en una red tridimensional de macromoléculas (por ejemplo, polímeros hidrófilos, polímeros hidrófobos, mezclas de los mismos) mantenida junta por reticulaciones covalentes o no covalentes que pueden absorben una cantidad sustancial de agua (por ejemplo, 50 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o más del 99 % por unidad de molécula distinta de agua) para formar un gel elástico. La matriz polimérica se puede formar a partir de cualquier polímero sintético o material natural adecuado. Como se usa en el presente documento, el término "gel" se refiere a una red tridimensional sólida que abarca el volumen de un medio líquido y lo atrapa mediante efectos de tensión superficial. Esta estructura de red interna puede resultar de enlaces físicos (geles físicos) o enlaces químicos (geles químicos), así como unidades cristalinas u otras zonas de unión que siguen intactas dentro del líquido de extensión. Se puede usar prácticamente cualquier líquido como sustancia de relleno, que incluye agua (hidrogeles), aceite y aire (aerogel). Tanto en peso como en volumen, los geles son de composición principalmente líquida y así presentan densidades similares a las de sus líquidos constituyentes. Un hidrogel es un tipo de gel que usa agua como medio líquido.

Las definiciones de polímeros "hidrófobos" e "hidrófilos" se basan en la cantidad de vapor de agua absorbida por los polímeros al 100 % de humedad relativa. Según esta clasificación, los polímeros hidrófobos absorben solo hasta del 1 % agua al 100 % de humedad relativa ("hr"), mientras que los polímeros moderadamente hidrófilos absorben 1 -10 % de agua, los polímeros hidrófilos son capaces de absorber más del 10 % de agua y los polímeros higroscópicos absorben más del 20 % de agua. Un polímero "hinchable en agua" es uno que absorbe una cantidad de agua superior a al menos el 50 % de su propio peso, tras la inmersión en un medio acuoso.

El término "reticulado" en el presente documento se refiere a una composición que contiene reticulaciones intramoleculares y/o intermoleculares, tanto si surgen mediante enlace covalente como no covalente, y pueden ser directas o incluir un reticulante. Enlace "no covalente" incluye tanto el enlace de hidrógeno como el enlace electrostático (iónico).

El término "polímero" incluye estructuras de polímero lineal y ramificado, y también engloba polímeros reticulados así como copolímeros (que pueden o pueden no estar reticulados), por lo que incluyen copolímeros de bloque, copolímeros alternantes, copolímeros al azar y similares. Los compuestos denominados en el presente documento como "oligómeros" son polímeros que tienen un peso molecular inferior a aproximadamente 1000 Da, preferentemente inferior a aproximadamente 800 Da. Los polímeros y oligómeros pueden ser naturales u obtenerse de fuentes sintéticas.

Reconstrucción de tejido blando

Pérdidas devastadoras de tejido blando de la extirpación de tumores, traumatismo, envejecimiento o malformación congénita afectan a millones de personas cada año. La pérdida de tejidos que incluyen piel, grasa y músculo conducen a alteraciones funcionales y estéticas importantes que son difíciles de tratar mediante medios convencionales. Como un ejemplo, cada año se realizan en los Estados Unidos más de 300.000 mastectomías parciales, que conducen a cicatrices desfigurante de la mama debido a la pérdida de tejido blando de la mama. Las opciones existentes para la restauración de tejido blando tienen inconvenientes significativos. Los colgajos de tejido autólogo requieren el movimiento de tejidos blandos de otra parte del cuerpo en procedimientos quirúrgicos largos que dejan déficits del sitio donante {LoTempio 2010. Plastic and Reconstructive Surgery, 126(2), 393-401; Patel 2012. Annals of Plastic Surgery, 69(2), 139-144}. Los implantes protésicos tienen tendencia a una repuesta a cuerpos extraños que conduce a fibrosis y encapsulación {Calobrace 2014 Plastic and Reconstructive Surgery, 134(1 Suppl), 6S-11; Tsoi 2014. Plastic and Reconstructive Surgery, 133(2), 234-249}. El injerto de grasa que implica la colocación de adipocitos recogidos durante la liposucción está limitado a pequeños volúmenes y está impedido por la mala supervivencia del injerto {Kakagia 2014 Surgical Innovation, 21(3), 327-336; Largo 2014 British Journal of Plastic Surgery, 67(4), 437-448}.

Finalmente, se pueden usar cargas de tejido blando de hidrogel inyectables, pero estas solo son adecuadas para defectos más pequeños y la restauración de volumen que proporcionan es transitorio {Young 2011. Acta Biomaterialia, 7(3), 1040-1049; Varma 2014 Acta Biomaterialia, 10(12), 4996-5004}. Se ha propuesto una nueva generación de soluciones de ingeniería de tejidos que se centra en el uso de armazones de hidrogel para regenerar tejidos blandos, tales como tejido adiposo en el sitio de reconstrucción.

Actuales enfoques de ingeniería de tejidos para la reconstrucción de tejido blando

Se han identificado células madre derivadas de tejido adiposo (CMA) en lechos de la herida que rodean a los defectos de tejido blando {Salibian 2013 Archives of plastic surgery 40,6: 666-675}. Se pueden diferenciar en tejidos blandos, tales como grasa, cuando están soportados con un microentorno de matriz adecuado. Por lo tanto, las estrategias para rellenar el sitio de reparación con materiales funcionales tienen el potencial de permitir la regeneración de nuevo tejido usando las CMA endógenas. Los hidrogeles han sido ampliamente estudiados como una matriz de armazón para la regeneración de defectos de tejido debido a su naturaleza tridimensional (3D) y propiedades elásticas, que son similares a las de los tejidos blandos. Se han usado diversos métodos para generar armazones de hidrogel con módulos similares a los de los tejidos adiposos nativos (~2 kPa) {Alkhouli 2013 American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism, 305(12), E1427-35; Sommer 2013 Acta biomaterialia 9.11 (2013): 9036-9048} a la vez que se mantiene su volumen y forma frente al esfuerzo físico del tejido circundante. Esto requiere mayor densidad de reticulación y tamaño de poro promedio más pequeño {Ryu 2011 Biomacromolecules 12.7 (2011): 2653-2659; Khetan 2013 Nature Materials, 12(5), 458-465; Li 2014 Journal of Neurotrauma, 31 (16), 1431-1438}, que conducen a una baja infiltración celular y a escasa regeneración. La capacidad de los armazones de hidrogel para promover la infiltración celular es la clave para la satisfactoria restauración de tejido blando. La falta de infiltración vascular es la responsable del fracaso de los injertos de grasa de gran volumen y otros intentos de ingeniería de tejido. Ningún material actualmente disponible puede rellenar el volumen perdido en los defectos de tejido blando mientras se promueve la vascularización temprana y la diferenciación de CMA para regenerar tejido blando.

Matriz de hidrogel

Durante los últimos años, Li y Wen han desarrollado un hidrogel de ácido hialurónico (HA) conjugado con péptido de bucle derivado de laminina (CCRRIKVAVWLC, 10 pM) con tamaño de poro y módulo optimizados (10 - 100 Pa) para el trasplante de células madre. Han mostrado que este hidrogel soporta la robusta migración de células madre neurales (CMN) y el brote de axones de las células diferenciadas {Li 2014 Journal of Neurotrauma, 31(16), 1431-1438}. En un modelo de lesión cortical controlada (LCC) de ratas para lesión cerebral traumática, este hidrogel, cuando se inyecta en el día 3 después de la lesión LCC, promueve una significativa formación de redes de vasculatura que llena el sitio de lesión (> 10 mm) de 4 semanas a 6 meses después de la implantación. Esta mejoría de la angiogénesis se atribuyó a la capacidad de este hidrogel para retener y presentar factores de crecimiento secretados del tejido, particularmente el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Los informes de bibliografía también revelaron que pequeños fragmentos de degradación de HA de 3-10 unidades de disacáridos fueron potentes reguladores de la proliferación celular endotelial, migración, formación de túbulos y angiogénesis {Slevin 2002 Journal of Biological Chemistry, 277(43), 41046-41059}. En un estudio reciente, se probó la eficacia de este hidrogel de HA para administrar esferoides de CMN derivadas de tejido fetal humano en un sitio de lesión del cerebro después de la LCC. Este hidrogel de HA proporcionó una sólida formación vascular en el interior de la matriz de armazón tras el trasplante. Los vasos sanguíneos regenerados crecieron en la lesión y penetraron a través de la matriz implantada, y soportaron la supervivencia y el crecimiento de los progenitores neuronales. Aun cuando estos estudios no son para la regeneración de tejido adiposo, estos resultados confirmaron la capacidad única de esta composición de HA optimizada para promover el crecimiento vascular del hospedador. Lo que es más importante, la matriz de hidrogel es suficientemente porosa para permitir la sólida migración celular en el interior de la matriz de hidrogel. Sin embargo, el uso de este hidrogel de HA directamente para la reconstrucción de tejido blando no es factible, ya que su propiedad mecánica no es lo suficientemente alta como para mantener la integridad del sitio de implantación — el tejido adiposo circundante tiene un módulo superior a 10 veces más alto. El aumento de la densidad de reticulación para mejorar su módulo hará que sea poco permeable para la infiltración y la migración celular. Se necesita una nueva estrategia para aumentar la propiedad mecánica sin disminuir significativamente el tamaño de poro promedio del hidrogel a granel. Se proporcionan materiales de hidrogel que contienen y/o se aíslan de una matriz extracelular de tejido procesada, tal como matriz extracelular derivada y/o derivable de un tejido adiposo.

Complejos de armazón.

En el presente documento se proporcionan complejos de armazón adecuados para su uso en dispositivos médicos que se incorporan en el tejido de un sujeto humano al que se administran los complejos, por ejemplo, por inyección o implantación. Los complejos de armazón contienen una fibra polimérica que tiene, en general, un diámetro medio de desde 100 nm hasta 8000 nm, o aproximadamente 150 nm a aproximadamente 5.000 nm, o aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500, 2.000, 2.500, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000, 5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500 u 8.000. Como se proporciona en el presente documento, la relación entre la fibra polimérica y el material de hidrogel se puede determinar por cualquier medio conocido en la técnica. Por ejemplo, la relación entre la fibra polimérica y el material de hidrogel es desde aproximadamente 1:100 hasta aproximadamente 100:1 basada en la masa de componente, tal como aproximadamente 1:50 a aproximadamente 50:1, o 1:10 a aproximadamente 10:1, tal como 1:5 a aproximadamente 5:1, tal como aproximadamente 1:3 a aproximadamente 3:1.

La relación entre la fibra polimérica y el material de hidrogel también se proporciona como una base de concentración, por ejemplo, un peso de fibra polimérica dada por volumen de material de hidrogel. Por ejemplo, la concentración es desde aproximadamente 1 hasta 50 mg/ml. El material de hidrogel está unido a la superficie externa (o una superficie externa, dependiendo de la composición y la forma) de la fibra de polímero. El complejo de armazón no es, en general, un material sólido uniforme. En su lugar, los complejos de armazón contienen una pluralidad de poros presentes sobre o dentro de una superficie del complejo de armazón. La presencia, el tamaño, la distribución, la frecuencia y otros parámetros de los poros se pueden modular durante la creación del complejo de armazón. El tamaño de poro puede ser desde inferior a aproximadamente 1 micrómetro hasta 100 micrómetros, incluyendo 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 6070, 80, 90 o 100 micrómetros, y el tamaño del mismo se confecciona de forma que al menos el 80 %, 90 %, 95 % o más del 95 % de los poros tengan un diámetro de poro promedio sobre la superficie que es al menos 5 micrómetros.

Los complejos de armazón de la invención son adecuados para su incorporación en un tejido de un sujeto humano, y por lo tanto, en general, son "biocompatibles", que significa capaces de interactuar con un sistema biológico (tal como se encuentra en un sujeto humano) sin inducir una respuesta patofisiológica en él y/o con él. En algunas realizaciones, el complejo de armazón se proporciona para ser retenido de forma duradera en el tejido. Alternativamente, los complejos de armazón son retenidos transitoriamente en el sujeto humano, y se proporcionan como sustancialmente biodegradables. La fibra polimérica contiene policaprolactona electrohilada no tejida.

Como se proporciona en el presente documento, el complejo incluye un resto de reticulación presente en una cantidad eficaz para inducir la reticulación entre la fibra de policaprolactona y el ácido hialurónico.

Diseño de armazones para la restauración de tejido blando

Se ha usado ampliamente el concepto de material compuesto como mecanismo de refuerzo de material. Por ejemplo, la adición de partículas de hidroxiapatita al hidrogel puede aumentar su rigidez {Wu 2008 Materials Chemistry and Physics 107.2 (2008): 364-39}, y el módulo de tracción del material compuesto aumenta incluso más para partículas alargadas {Yusong 2007 Journal of Materials Science, 42(13), 5129-5134}. Se han usado ampliamente mallas de nanofibras electrohiladas como sustrato para la ingeniería de tejidos debido a su similitud topográfica con la MEC nativa. De particular interés, la MEC descelularizada de tejido adiposo es de naturaleza altamente fibrosa y porosa (Fig. 6G) {Young 2011. Acta Biomaterialia, 7(3), 1040-1049}. Varios estudios recientes han intentado resumir los componentes fibrosos introduciendo fibras de poli(lactida) (PLA) fragmentada o quitosano en un hidrogel de polietilenglicol (PEG), poliacrilamida o alginato {Coburn 2011 Smart Structures and Systems, 7(3), 213; #37; Zhou 2011 Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 84(1), 155-162; Shin 2015 Journal of Materials Chemistry}. Las fibras fragmentadas se mezclan con disoluciones de precursor de hidrogel y se incorporan en el hidrogel durante el proceso de gelificación para crear una arquitectura 3D. Estos hidrogeles incorporados en fibra han mostrado propiedades mecánicas mejoradas con respecto a los hidrogeles correspondientes. Sin embargo, no ha habido informes sobre las pruebas de infiltración de células hospedadoras in vivo. Además, estos hidrogeles son no degradables y requieren ligandos adhesivos para la adherencia y diferenciación de adipocitos.

Diseño de materiales compuestos de nanofibra-hidrogel

Para lograr el efecto de refuerzo con fibras mientras se mantiene una alta porosidad en la fase de hidrogel, se proporciona un material compuesto de fibra electrohilada-hidrogel que ofrece propiedades superiores en comparación con otros armazones. Más allá de la mezcla de nanofibras y una matriz de hidrogel, que se ha informado previamente {Coburn 2011 Smart Structures and Systems, 7(3), 213}, aquí se introduce la unión interfacial entre las superficies de fibra y la red de reticulación de hidrogel (Fig. 6). Dicho diseño de material compuesto no solo permite el refuerzo mecánico más fuerte del componente de fibra sólido, sino que también permite el ajuste independiente de las propiedades mecánicas aparentes y el tamaño de poro/porosidad promedio de la fase de hidrogel, que permite tanto las propiedades de infiltración de células como la integridad estructural óptimas. Se contempla además que las fibras se pueden emplear como sustratos de adherencia celular preferidos para CMA y progenitores endoteliales, actuando, por lo tanto, como una guía para soportar la migración celular y la diferenciación de CMA.

Innovación

Recientemente se ha proporcionado diseños de material compuesto de nanofibra-hidrogel con unión interfacial entre las superficies de nanofibra y la red de hidrogel (Fig. 6A). Este material compuesto manipulado tiene el potencial de mejorar espectacularmente la propiedad mecánica del hidrogel sin disminuir significativamente el tamaño de poro promedio en la fase de hidrogel. La introducción de unión interfacial puede ofrecer un efecto de resistencia mecánica superior en comparación con solo la flexión física de los dos componentes. Este estudio cartografiará el intervalo de propiedades mecánicas (módulos de compresión y cizallamiento) que pueden obtenerse con los materiales compuestos de fibra de policaprolactona (PCL) electrohilada-hidrogel de HA a diferencia de las mezclas. La segunda innovación es la demostración de que dicho material compuesto de nanofibra-hidrogel restaura los defectos de tejido blando. La caracterización preliminar demostró que el material compuesto compartió características estructurales con el tejido adiposo (Fig. 6) {Christman, 2012 US 20120264190 A1; Young 2011. Acta Biomaterialia, 7(3), 1040-1049}. Se planteó la hipótesis de que este material compuesto ofreciera integridad estructural y propiedades mecánicas importantes para la regeneración de tejido blando. Este estudio también ha demostrado la versatilidad y la eficiencia de materiales compuestos, en comparación con los hidrogeles.

Una innovación clave de las composiciones proporcionadas en el presente es la composición de fibras funcionalizadas con péptidos para la incorporación de péptidos que se unen a hidrogel, tales como los péptidos que se unen a HA que tienen el potencial de mejorar enormemente los productos para el mercado de rellenos dérmicos. El mercado ha tendido hacia productos que duren más y/o sean más rígidos para su uso en indicaciones como la mitad de la mejilla. Estas indicaciones están en una capa más profunda dentro de la piel o por debajo y necesitan que la formulación sea más rígida para mantener su integridad y elevar las capas de piel que la recubren para lograr el efecto voluminizante deseado. Las empresas comerciales han logrado estos objetivos aumentando el nivel de carga de componentes de hidrogel y aumentando el grado de reticulación entre los constituyentes. Sin embargo, estas soluciones también disminuyen inherentemente la porosidad del hidrogel resultante, dando como resultado una respuesta a cuerpos extraños que causa inflamación, fibrosis, y la eventual degradación del material implantado sin sustitución de tejido endógeno. La introducción de nanofibras en los hidrogeles refuerza los geles por un mecanismo diferente de formación de una estructura de material compuesto bifásico. Esta estrategia deja al componente de hidrogel con porosidad suficiente para permitir el crecimiento infiltrante celular, evitar una respuesta a cuerpos extraños y garantizar la buena biocompatibilidad y la remodelación celular endógena. Es necesaria la unión interfacial entre las fases del material compuesto (fibras e hidrogel) para lograr este refuerzo. Esta composición logra esta unión interfacial mediante la funcionalización de la superficie de fibras con péptidos que tienen afinidad específica por los componentes de hidrogel. El uso de estos péptidos tiene varias ventajas clave. Las nanofibras se pueden usar con prácticamente cualquier fuente de ácido hialurónico, puesto que los péptidos tienen afinidad por el esqueleto de ácido hialurónico en general. Esto significa que las fibras funcionalizadas con péptido no son dependientes de ninguna formulación de HA particular o resto de reticulación para lograr su efecto. También se pueden usar directamente fibras funcionalizadas con péptido para potenciar las cargas dérmicas comerciales existentes sin modificaciones de producción. Por lo tanto, las fibras también se pueden usar en formulaciones que son completamente sintéticas, sin el uso de matriz extracelular u otros materiales derivados de tejido para lograr sus efectos. La composición resultante tiene otras propiedades beneficiosas. La unión interfacial es reversible, que produce una formulación que es auto-curable, fluidiza por cizallamiento y es inyectable. El material compuesto reforzado resultante también se puede formular para que tenga propiedades mecánicas isotrópicas para imitar mejor el tacto del tejido blando nativo. Finalmente, también se pueden usar fibras de péptido para potenciar otros hidrogeles y cargas dérmicas por funcionalización de las fibras con otras secuencias de péptidos, tales como las que tienen unión específica a colágeno. Esta composición de fibra funcionalizada con péptido es una plataforma flexible con el potencial de potenciar enormemente los productos para la reparación y la potenciación de tejido blando.

La finalización satisfactoria de este proyecto suministrará una solución disponible para la venta para la restauración de volumen faltante de tejido blando, particularmente para defectos más grandes donde el establecimiento de la red vascular, el mantenimiento de la integridad del sitio de reparación de tejido, la promoción de la migración y la organización celular, y el reclutamiento de células hospedadoras, son todos esenciales para una restauración sostenible de tejido. El amplio historial clínico de los componentes de materiales usados en este diseño de material compuesto con estos datos preliminares sobre la compatibilidad de tejidos indicó una compatibilidad de tejidos superior y una vía de aprobación reglamentaria directa para la traducción clínica.

Características:

La invención proporciona la unión interfacial entre nanofibras y red de polímero rojo en el componente de hidrogel. Esto es importante para la formación de un material compuesto "verdadero". Se demostró que la flexión de dichas fibras y el hidrogel no proporcionó el mismo grado de potenciamiento mecánico. También hay informes previos sobre el uso de mezclas de nanofibra-hidrogel. En otras palabras, la unión interfacial diferencia de manera importante este nuevo trabajo de la técnica. Además, la unión interfacial incluye enlaces covalentes como se muestra en este manuscrito, y la unión secundaria, tal como enlaces de hidrógeno e interacción de cargas electrostáticas.

Esto también es el primer trabajo en el campo que demuestra el refuerzo isotrópico - el material compuesto es más fuerte en todas las orientaciones, según se necesite para sustituir defectos volumétricos de geometría arbitraria. Los diseños con esteras de nanofibra o un pequeño número de filamentos alineados son inherentemente anisotrópicos. Este diseño es capaz de formar tanto materiales isotrópicos como anisotrópicos.

El trabajo presentado en el presente documento, para al menos ciertos aspectos, define que los componentes usados para la formación de material compuesto sea una red de hidrogel con tamaño de poro y porosidad suficientes para la migración celular y el crecimiento infiltrante de tejido hospedador, y nanofibras que incluyen de forma suelta fibras de polímero con diámetros que varían desde100 nm hasta 8000 nm.

Componente de gel/hidrogel

El material compuesto de hidrogel de la invención incluye un componente de hidrogel seleccionado del grupo que comprende ácido hialurónico, colágeno o una combinación de los mismos, o una matriz extracelular de tejido procesada.

El componente de polímero de los geles y/o hidrogeles puede comprender un éster de celulosa, por ejemplo, acetato de celulosa, acetato-propionato de celulosa (CAP), acetato-butirato de celulosa (CAB), propionato de celulosa (CP), butirato de celulosa (CB), propionato-butirato de celulosa (CPB), diacetato de celulosa (CDA), triacetato de celulosa (CTA), o similares. Estos ésteres de celulosa se describen en las patentes de EE. UU. N.° 1.698.049, 1.683.347, 1.880.808, 1.880.560, 1.984.147, 2.129.052 y 3.617.201, y se pueden preparar usando técnicas conocidas en la técnica u obtenidas comercialmente. Los ésteres de celulosa comercialmente disponibles adecuados en el presente documento incluyen CA 320, CA 398, CAB 381, CAB 551, CAB 553, CAP 482, CAP 504, todos disponibles de Eastman Chemical Company, Kingsport, Tenn. Dichos ésteres de celulosa tienen normalmente un peso molecular medio numérico de entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 75.000.

Los ésteres de celulosa y comprenden una mezcla de unidades monoméricas de celulosa y éster de celulosa; por ejemplo, el acetato-butirato de celulosa comercialmente disponible contiene unidades monoméricas de acetato de celulosa, así como unidades monoméricas de butirato de celulosa y unidades de celulosa sin esterificar.

Los geles/hidrogeles empleados en la invención también pueden comprender otros polímeros hinchables en agua, tales como polímeros de acrilato, que, en general, se forman a partir de ácido acrílico, ácido metacrílico, acrilato de metilo, acrilato de etilo, metacrilato de metilo, metacrilato de etilo y/u otros monómeros vinílicos. Los polímeros de acrilato adecuados son los copolímeros disponibles con el nombre comercial "Eudragit" de Rohm Pharma (Alemania), como se indica arriba. Los copolímeros Eudragit de la serie E, L, S, RL, RS y NE están disponibles como solubilizados en un disolvente orgánico, en una dispersión acuosa, o como un polvo seco. Los polímeros de acrilato preferidos son copolímeros de ácido metacrílico y metacrilato de metilo, tales como los polímeros de la serie Eudragit L y Eudragit S. Dichos copolímeros particularmente preferidos son Eudragit L-30D-55 y Eudragit L-100-55 (el último copolímero es una forma secada por pulverización de Eudragit L-30D-55 que se puede reconstituir con agua). El peso molecular del copolímero Eudragit L-30D-55 y Eudragit L-100-55 es aproximadamente 135.000 Da, con una relación entre grupos carboxilo libre y grupos éster de aproximadamente 1:1. El copolímero es, en general, insoluble en líquidos acuosos que tienen un pH inferior a 5,5. Otro copolímero de ácido metacrílico-metacrilato de metilo particularmente adecuado es Eudragit S-100, que se diferencia de Eudragit L-30D-55 en que la relación entre los grupos carboxilo libres y los grupos éster es aproximadamente 1:2. Eudragit S-100 es insoluble a pH inferior a 5,5, pero a diferencia de Eudragit L-30D-55, es poco soluble en líquidos acuosos que tienen un pH en el intervalo de 5,5 a 7,0. Este copolímero es soluble a pH 7,0 y por encima. También se puede usar Eudragit L-100, que tiene un perfil de solubilidad dependiente del pH entre el de Eudragit L-30D-55 y Eudragit S-100, en tanto que sea insoluble a un pH inferior 6,0. Se apreciará por los expertos en la técnica que Eudragit L-30D-55, L-100-55, L-100 y S-100 se pueden sustituir con otros polímeros aceptables que tienen características de solubilidad dependientes del pH similares.

Cualquiera de las composiciones de gel/hidrogel descritas en el presente documento se puede modificar para contener un agente activo y, por lo tanto, actuar de sistema de administración de agente activo cuando se aplica a una superficie del cuerpo (por ejemplo, un sitio de reparación de tejido) en relación transmisora de agente activo con el mismo. La liberación de agentes activos "cargados" en las presentes composiciones de hidrogel usadas en la invención implica normalmente tanto la absorción de agua como la desorción del agente mediante un mecanismo de difusión controlado por el hinchamiento. Las composiciones de hidrogel que contienen agente activo se pueden emplear, a modo de ejemplo, en sistemas de administración de fármacos transdérmicos, en apósitos para heridas, en formulaciones farmacéuticas tópicas, en sistemas de administración de fármacos implantados, en formas farmacéuticas orales, y similares.

Los agentes activos adecuados que se pueden incorporar en las presentes composiciones de hidrogel y suministrar por vía sistémica (por ejemplo, con una forma farmacéutica transdérmica, oral, u otra forma farmacéutica adecuada para la administración sistémica de un fármaco) incluyen, pero no se limitan a: analépticos; analgésicos; anestésicos; antiartríticos; fármacos respiratorios, que incluyen antiasmáticos; antineoplásicos, que incluyen fármacos antineoplásicos; anticolinérgicos; anticonvulsivos; antidepresivos; antidiabéticos; antidiarreicos; antihelmínticos; antihistamínicos; antihiperlipidémicos; antihipertensores; antiinfecciosos tales como antibióticos y antivíricos; antiinflamatorios; preparaciones antijaquecosas; antieméticos; fármacos antiparkinsonianos; antipruríticos; antipsicóticos; antipiréticos; antispasmódicos; antituberculosos; antiulcerosos; antivíricos; ansiolíticos; supresores del apetito; fármacos para el trastorno por déficit de atención (TDA) y el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH); preparaciones cardiovasculares que incluyen bloqueantes de los canales de calcio, antianginosos, agentes para el sistema nervioso central (SNC), beta-bloqueantes y antiarrítmicos; estimulantes del sistema nervioso central; preparaciones para la tos y el resfriado, que incluyen descongestionantes; diuréticos; materiales genéticos; remedios herbales; hormonolíticos; hipnóticos; hipoglucemiantes; inmunosupresores; inhibidores del leucotrieno; inhibidores mitóticos; relajantes musculares; antagonistas narcóticos; nicotina; agentes nutritivos, tales como vitaminas, aminoácidos esenciales y ácidos grasos; fármacos oftálmicos, tales como agentes antiglaucoma; parasimpatolíticos; fármacos peptídicos; psicoestimulantes; sedantes; corticoides, que incluyen progestógenos, estrógenos, corticosteroides, andrógenos y anabolizantes; agentes para dejar de fumar; simpatomiméticos; tranquilizantes; y vasodilatadores que incluyen coronarios, periféricos y cerebrales generales. Los agentes activos específicos con los que son útiles las presentes composiciones adhesivas incluyen, sin limitación, anabasina, capsaicina, dinitrato de isosorbida, aminostigmina, nitroglicerina, verapamilo, propranolol, silabolina, foridona, clonidina, citisina, fenazepam, nifedipino, fluacizina y salbutamol.

Para la administración de fármacos tópicos y/o amortiguadores medicinales (por ejemplo, almohadillas medicinales), los agentes activos adecuados incluyen, a modo de ejemplo, los siguientes:

bacteriostáticos y bactericidas: bacteriostáticos y bactericidas adecuados incluyen, a modo de ejemplo: compuestos de halógeno, tales como yodo, complejos de yodopovidona (es decir, complejos de PVP y yodo, también denominados "povidina" y disponibles con el nombre comercial Betadine de Purdue Frederick), sales de yoduro, cloramina, clorhexidina e hipoclorito de sodio; plata y compuestos que contienen plata, tales como sulfadiazina, proteína de plataacetiltannato, nitrato de plata, acetato de plata, lactato de plata, sulfato de plata y cloruro de plata; compuestos de organoestaño, tales como benzoato de tri-n-butilestaño; cinc y sales de cinc; oxidantes, tales como peróxido de hidrógeno y permanganato de potasio; compuestos de arilmercurio, tales como borato de fenilmercurio o merbromina; compuestos de alquilmercurio, tales como tiomersal; fenoles, tales como timol, o-fenilfenol, 2-bencil-4-clorofenol, hexaclorofeno y hexilresorcinol; y compuestos de nitrógeno orgánico, tales como 8-hidroxiquinolina, clorquinaldol, clioquinol, etacridina, hexetidina, clorhexedina y ambazona.

Antibiótico: los antibióticos adecuados incluyen, pero no se limitan a, antibióticos de la familia de las lincomicinas (con referencia a una clase de antibióticos originalmente recuperados de Streptomyces lincolnensis), antibióticos de la familia de las tetraciclinas (con referencia a una clase de antibióticos originalmente recuperados de Streptomyces aureofaciens) y antibióticos basados en azufre, es decir, sulfonamidas. Los antibióticos a modo de ejemplo de la familia de las lincomicinas incluyen lincomicina, clindamicina, compuestos relacionados como se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N.° 3.475.407, 3.509.127, 3.544.551 y 3.513.155, y sales y ésteres farmacológicamente aceptables de los mismos. Los antibióticos a modo de ejemplo de la familia de las tetraciclinas incluyen la propia tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, demeclociclina, rolitetraciclina, metaciclina y doxiciclina y sus sales y ésteres farmacéuticamente aceptables, particularmente las sales de adición de ácido, tales como la sal de clorhidrato. Los antibióticos basados en azufre a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, las sulfonamidas sulfacetamida, sulfabenzamida, sulfadiazina, sulfadoxina, sulfamerazina, sulfametazina, sulfametizol, sulfametoxazol, y las sales y ésteres farmacológicamente aceptables de los mismos, por ejemplo, sulfacetamida sódica.

Analgésicos: analgésicos adecuados son anestésicos locales, que incluyen, pero no se limitan a, acetamidoeugenol, acetato de alfadolona, alfaxalona, amucaína, amolanona, amilocaína, benoxinato, betoxicaína, bifenamina, bupivacaína, buretamina, butacaína, butaben, butanilicaína, butalital, butoxicaína, carticaína, 2-cloroprocaína, cincocaína, cocaetileno, cocaína, ciclometicaína, dibucaína, dimetisoquina, dimetocaína, diperadon, diclonina, ecgonidina, ecgonina, aminobenzoato de etilo, cloruro de etilo, etidocaína, etoxadrol, .beta.-eucaína, euprocin, fenalcomina, fomocaína, hexobarbital, hexilcaína, hidroxidiona, hidroxiprocaína, hidroxitetracaína, p-aminobenzoato de isobutilo, kentamina, mesilato de leucinocaína, levoxadrol, lidocaína, mepivacaína, meprilcaína, metabutoxicaína, metohexital, cloruro de metilo, midazolam, mirtecaína, naepaína, octacaína, ortocaína, oxetazaína, paretoxicaína, fenacaína, fenciclidina, fenol, piperocaína, piridocaína, polidocanol, pramoxina, prilocaína, procaína, propanidid, propanocaína, proparacaína, propipocaína, propofol, propoxicaína, pseudococaína, pirrocaína, risocaína, alcohol salicílico, tetracaína, tialbarbital, timilal, tiobutabarbital, tiopental, tolicaína, trimecaína, zolamina, y combinaciones de los mismos. La tetracaína, la lidocaína y la prilocaína son analgésicos a los que se hace referencia en el presente documento.

Otros agentes tópicos que se pueden administrar usando las presentes composiciones de hidrogel como sistemas de administración de fármacos incluyen los siguientes: antifúngicos, tales como ácido undecilénico, tolnaftato, miconazol, griseofulvina, ketoconazol, ciclopirox, clotrimazol y cloroxilenol; queratolíticos, tales como ácido salicílico, ácido láctico y urea; vesicantes, tales como cantaridina; agentes contra el acné, tales como peróxidos orgánicos (por ejemplo, peróxido de benzoílo), retinoides (por ejemplo, ácido retinoico, adapaleno y tazaroteno), sulfonamidas (por ejemplo, sulfacetamida sódica), resorcinol, corticosteroides (por ejemplo, triamcinolona), alfa-hidroxiácidos (por ejemplo, ácido láctico y ácido glicólico), alfa-cetoácidos (por ejemplo, ácido glioxílico) y agentes antibacterianos específicamente indicados para el tratamiento del acné, que incluyen ácido azelaico, clindamicina, eritromicina, meclociclina, minociclina, nadifloxacina, cefalexina, doxiciclina y ofloxacina; despigmentantes y blanqueantes de la piel, tales como hidroquinona, ácido kójico, ácido glicólico y otros alfa-hidroxiácidos, artocarpina, y ciertos peróxidos orgánicos; agentes para tratar verrugas, que incluyen ácido salicílico, imiquimod, dinitroclorobenceno, ácido dibutilescuárico, podofilina, podofilotoxina, cantaridina, ácido tricloroacético, bleomicina, cidofovir, adefovir y sus análogos; y antiinflamatorios, tales como corticosteroides y fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), donde los AINES incluyen ketoprofeno, flurbiprofeno, ibuprofeno, naproxeno, fenoprofeno, benoxaprofeno, indoprofeno, pirprofeno, carprofeno, oxaprozina, pranoprofeno, suprofeno, alminoprofeno, butibufeno, fenbufeno y ácido tiaprofénico.

Para apósitos para heridas, agentes activos adecuados son los útiles para el tratamiento de heridas, e incluyen, pero no se limitan a, compuestos bacteriostáticos y bactericidas, antibióticos, analgésicos, vasodilatadores, potenciadores de la cicatrización de tejidos, aminoácidos, proteínas, enzimas proteolíticas, citocinas y factores de crecimiento de polipéptido.

Para administración tópica y transdérmica de algunos agentes activos, y en apósitos para heridas, puede ser necesario o deseable incorporar un potenciador de la permeación en la composición de hidrogel para potenciar la tasa de penetración del agente en o a través de la piel. Los potenciadores adecuados incluyen, por ejemplo, los siguientes: sulfóxidos, tales como sulfóxido de dimetilo (DMSO) y sulfóxido de decilmetilo; éteres, tales como monoetil éter de dietilenglicol (disponible comercialmente como Transcutol) y monometil éter de dietilenglicol; tensioactivos, tales como laurato de sodio, laurilsulfato de sodio, bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de benzalconio, Poloxamer (231, 182, 184), Tween (20, 40, 60, 80) y lecitina (patente de EE. UU. N.° 4.783.450); las azacicloheptan-2-onas sustituidas en 1, particularmente 1-n-dodecilciclaza-cicloheptan-2-ona (disponible con la marca registrada Azone de Nelson Research & Development Co., Irvine, Calif.; véanse las patentes de EE. UU. N.° 3.989.816, 4.316.893, 4.405.616 y 4.557.934); alcoholes, tales como etanol, propanol, octanol, decanol, alcohol bencílico y similares; ácidos grasos, tales como ácido láurico, ácido oleico y ácido valérico; ésteres de ácidos grasos, tales como miristato de isopropilo, palmitato de isopropilo, propionato de metilo y oleato de etilo; polioles y ésteres de los mismos, tales como propilenglicol, etilenglicol, glicerol, butanodiol, polietilenglicol y monolaurato de polietilenglicol (PEGML; véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 4.568.343); amidas y otros compuestos nitrogenosos, tales como urea, dimetilacetamida (DMA), dimetilformamida (DMF), 2-pirrolidona, 1-metil-2-pirrolidona, etanolamina, dietanolamina y trietanolamina; terpenos; alcanonas; y ácidos orgánicos, particularmente ácido salicílico y salicilatos, ácido cítrico y ácido succínico. También se pueden usar mezclas de dos o más potenciadores.

En ciertas otras realizaciones, las composiciones de material compuesto de la invención que comprenden un gel (por ejemplo, un componente de hidrogel) y una nanoestructura, como se define en las reivindicaciones, también pueden comprender componentes aditivos opcionales adicionales. Dichos componentes se conocen en la técnica y pueden incluir, por ejemplo, cargas, conservantes, reguladores del pH, suavizantes, espesantes, pigmentos, colorantes, partículas refractivas, estabilizadores, agentes de tenacidad, antiadherentes, fármacos (por ejemplo, antibióticos, promotores de la angiogénesis, antifúngicos, inmunosupresores, anticuerpos y similares) y potenciadores de la permeación. Estos aditivos, y cantidades de los mismos, se seleccionan de tal forma que no interfieran significativamente con las propiedades químicas y físicas deseadas de la composición de hidrogel.

Se pueden incorporar ventajosamente cargas absorbentes para controlar el grado de hidratación cuando el adhesivo está sobre la piel u otra superficie del cuerpo. Dichas cargas pueden incluir celulosa microcristalina, talco, lactosa, caolín, manitol, sílice coloidal, alúmina, óxido de cinc, óxido de titanio, silicato de magnesio, silicato de magnesio y aluminio, almidón hidrófobo, sulfato de calcio, estearato de calcio, fosfato de calcio, fosfato de calcio dihidratado, papel tejido y no tejido y materiales de algodón. Otras cargas adecuadas son inertes, es decir, sustancialmente no adsorbentes, e incluyen, por ejemplo, polietilenos, polipropilenos, copolímeros de poliuretano-poliéter-amida, poliésteres y copolímeros de poliéster, nailon y rayón.

Las composiciones también pueden incluir uno o más conservantes. Los conservantes incluyen, a modo de ejemplo, p-cloro-m-cresol, alcohol feniletílico, alcohol fenoxietílico, clorobutanol, éster metílico de ácido 4-hidroxibenzoico, éster propílico de ácido 4-hidroxibenzoico, cloruro de benzalconio, cloruro de cetilpiridinio, diacetato o gluconato de clorohexidina, etanol y propilenglicol.

Las composiciones también pueden incluir compuestos reguladores del pH. Los compuestos útiles como reguladores del pH incluyen, pero no se limitan a, tampones glicerol, tampones citrato, tampones borato, tampones fosfato, o también se pueden incluir tampones ácido cítrico-fosfato para garantizar que el pH de la composición de hidrogel sea compatible con el de la superficie del cuerpo de un individuo.

Las composiciones también pueden incluir suavizantes adecuados. Los suavizantes adecuados incluyen ésteres de ácido cítrico, tales como trietilcitrato o acetiltrietilcitrato, ésteres de ácido tartárico, tales como dibutiltartrato, ésteres de glicerol, tales como diacetato de glicerol y triacetato de glicerol; ésteres de ácido ftálico, tales como ftalato de dibutilo y ftalato de dietilo; y/o tensioactivos hidrófilos, preferentemente tensioactivos no iónicos hidrófilos, tales como, por ejemplo, ésteres parciales de ácidos grasos de azúcares, ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol, éteres de alcoholes grasos de polietilenglicol y ésteres de ácidos grasos de polietilenglicol-sorbitano.

Las composiciones también pueden incluir espesantes. Los espesantes preferidos en el presente documento son compuestos naturales o derivados de los mismos, e incluyen, a modo de ejemplo: colágeno; galactomananos; almidones; derivados de almidón e hidrolizados; derivados de celulosa, tales como metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa; ácidos silícicos coloidales; y azúcares, tales como lactosa, sacarosa, fructosa y glucosa. También se pueden usar espesantes sintéticos, tales como poli(alcohol vinílico), copolímeros de vinilpirrolidona-acetato de vinilo, polietilenglicoles y polipropilenglicoles.

En ciertas realizaciones, el material compuesto de hidrogel de la invención que comprende un hidrogel y una nanoestructura como se define en las reivindicaciones puede comprender además un componente que promueve la angiogénesis. Un reto para lograr una regeneración de tejidos blandos clínicamente relevante antes de la presente invención es que el tejido regenerado debe ser revascularizado preferentemente. Por lo tanto, cualquier material que promueva la regeneración de tejido blando también debe fomentar preferentemente la angiogénesis. Una forma de lograr esto es mediante el uso de componentes de hidrogel que contienen heparina, que pueden servir de sitios de unión del factor de crecimiento para enriquecer y retener factores de crecimiento que promueven la angiogénesis y la formación de tejido.

Los materiales compuestos de la invención se basan en ácido hialurónico (HA) como material de hidrogel. El HA es un polisacárido lineal no sulfatado con unidades repetidas de disacáridos que forman el componente de hidrogel. El HA también es un componente nativo no inmunogénico de la matriz extracelular en tejidos humanos, y se usa ampliamente como relleno dérmico en procedimientos estéticos y reconstructivos.

La degradación del HA se facilita por hialuronidasas nativas cuya expresión aumenta en áreas de daño e inflamación de tejido. Y, lo que es más importante, los estudios han mostrado que pequeños fragmentos de degradación de HA de 3-10 unidades de disacárido son potentes reguladores de la proliferación celular endotelial, migración, formación de túbulos y la angiogénesis. Se cree que estas funciones biológicas del HA están mediadas por CD44 en una vía que implica a Ras y PKC. El bloqueo de las interacciones CD44/HA usando anticuerpos anti-CD44 redujo la proliferación y la migración de células endoteliales microvasculares humanas in vitro. Se han investigado hidrogeles de HA como posibles matrices para la administración de células en una variedad de modelos de lesión de células y tejidos. Estos hidrogeles pueden servir de armazón protector y de soporte para células y también pueden reducir la cicatrización. Por lo tanto, se cree que el HA tiene una función crítica en mejorar la regeneración de tejido promoviendo la infiltración de células y promoviendo la angiogénesis.

En primer lugar, el material tiene integridad tridimensional y una consistencia similar a la del tejido adiposo nativo. Esto hace que sea adecuado para la restauración disponible para venta de volumen faltante de tejido blando. En segundo lugar, el material se puede depositar preferentemente con una pluralidad de nanofibras flexibles que pueden servir de sustratos para la migración de adipocitos y progenitores endoteliales. En tercer lugar, el material tiene porosidad suficiente para permitir que estas células precursoras se infiltren e integren rápidamente en el armazón en vez de formar una cápsula fibrosa alrededor de él. En cuarto lugar, el componente de hidrogel de HA proporciona compresibilidad y expansión volumétrica mientras que también proporciona importantes señales angiogénicas. En quinto lugar, los componentes de nanofibra e hidrogel son biodegradables, lo que les permite ser sustituidos por tejido blando regenerado. En sexto lugar, todos los materiales componentes tienen un fuerte historial de seguridad en numerosos dispositivos aprobados por la FDA, lo que reduce posiblemente los obstáculos reglamentarios para la traducción clínica.

Los materiales compuestos de gel/hidrogel/nanoestructura de la invención también pueden incluir agentes reparadores de tejido, tales como varios factores de crecimiento, que incluyen factor de crecimiento epidérmico (EDF), PDGF y factores de crecimiento nervioso (NGF). Por ejemplo, las composiciones pueden incluir EGF. El factor de crecimiento epidérmico (EGF) fue descubierto después de la observación de que heridas cutáneas en ratones de laboratorio parecían curarse más rápidamente cuando se dejó que los ratones se las chuparan. Esto no fue simplemente debido a algún antiséptico en la saliva (tal como la lisozima). Se mostró que era responsable un factor de crecimiento específico, ahora conocido como EGF. El EGF es idéntico a la urogastrona, y tiene propiedades angiogénicas. El factor de crecimiento transformante-alfa (TGF-alfa.) es muy similar, uniéndose al mismo receptor, y es incluso más eficaz en estimular la regeneración de células epiteliales (epitelización).

Por lo tanto, los hidrogeles usados en la presente invención que comprenden EGF/TGF se pueden usar ventajosamente en la aceleración de la cicatrización y quemaduras, reducción en la formación de cicatrices queloides (especialmente para quemaduras), apósitos para injertos de piel y tratamiento de úlceras crónicas de las piernas.

Los agentes de reparación de tejido útiles en la presente invención incluyen varios factores de crecimiento, que incluyen factor de crecimiento epidérmico (EDF), PDGF y factor de crecimiento nervioso (NGF). En general, las hormonas promotoras del crecimiento afectarán a entre uno y cuatro tejidos. Muchos de los productos desarrollados para dichas proteínas se dirigen a reparaciones de heridas de un tipo u otro, aunque existen otras indicaciones. Algunos de los factores de crecimiento de tejido más importantes se describen más adelante.

Las composiciones de gel/nanoestructura de la invención también pueden incluir uno o más factores de crecimiento que pueden ser útiles en los métodos de reparación de tejido y otras aplicaciones de la invención.

Por ejemplo, la invención contempla incluye PDGF en las composiciones de la invención. El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) es un mitógeno para casi todas las células derivadas de forma mesenquimatosa, es decir, células de sangre, músculo, hueso, cartílago y tejido conjuntivo. Es una glucoproteína dimérica que existe como homodímeros AA o BB, o como el heterodímero AB. Al igual que con muchos factores de crecimiento, se considera ahora que el PDGF es un miembro de una familia más grande de factores. Además del PDGF, esta familia incluye los factores homodiméricos el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placentario (PIGF), heterodímeros VEGF/PIGF y el factor de crecimiento de tejido conjuntivo (CTGF), un factor de tipo PDGF secretado por células endoteliales vasculares humanas y fibroblastos. Junto con NGF, TGF-.beta. y hormonas de glucoproteína, tales como la hormona gonadotrópica coriónica humana (hCG), el PDGF se clasifica ahora como un miembro de la superfamilia de los factores de crecimiento de nudo de cisteína. Todos estos factores se pueden usar junto con los hidrogeles usados en la presente invención.

El PDGF se produce por plaquetas y se libera en el transcurso de la coagulación de la sangre. Es solo uno de los factores de crecimiento que derivan de estas células. El PDGF atrae a fibroblastos y glóbulos blancos al sitio de la lesión, así como estimula el crecimiento de tejido conjuntivo de sustitución (principalmente fibroblastos y células de músculo liso). Estimula la división celular en diversas células, que incluyen las que producen colágeno, por lo que se incentiva la angiogénesis. También estimula la mitogénesis, la vasoconstricción, la quimiotaxia, la actividad enzimática y la movilización del calcio.

Los factores de crecimiento derivados de plaquetas de la sangre se pueden usar para restaurar el recrecimiento de tejido óseo y blando durante ciertos tratamientos usando las composiciones de la invención y para acelerar el proceso de curación de heridas crónicas y agudas. Por consiguiente, las composiciones de hidrogel/nanoestructura de la presente invención pueden comprender ventajosamente una mezcla de factores de crecimiento derivados de plaquetas.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura de la presente invención se pueden usar en genoterapia, por ejemplo, para la administración local del gen PDGF. El ADN de plásmido que codifica el PDGF se incorpora en los fibroblastos de la matriz de hidrogel y de tejido de granulación, que se originan en el tejido viable que rodea la herida, proliferan y migran dentro de la matriz, actuando de dianas para la transferencia y la expresión génica de plásmidos.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura de la invención también pueden incluir VEGF para promover la angiogénesis. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF - también conocido como factor de permeabilidad vascular) es otro factor de crecimiento vascular, y es una citocina angiogénica multifuncional. Contribuye a la angiogénesis (crecimiento de vasos sanguíneos) tanto indirectamente como directamente, estimulando la proliferación de células endoteliales al nivel de microvasos, haciendo que migren y alteren su expresión genérica. El VEGF también hace que estas células endoteliales sean hiperpermeables, haciendo que liberen proteínas plasmáticas fuera del espacio vascular, que provoca cambios en el área, que contribuye a la angiogénesis.

Las composiciones de la invención también pueden incluir FGF. El factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) es en realidad una familia de péptidos de al menos 19 14 18 kD que pertenecen a la familia de los factores de crecimiento de unión a heparina, y son mitógenos para fibroblastos cultivados y las células endoteliales vasculares. También son angiogénicos in vivo y esta angiogenicidad se potencia por el TNF. El FGF se puede usar de una manera similar al EGF. bFGF, también conocido como FGF-2, participa en el control de la megacariocitopoyesis humana y se ha mostrado que los FGF son eficaces en estimular la formación de células endoteliales, y en ayudar en la reparación de tejido conjuntivo.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura también pueden comprender factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), también conocido como FGF-7, para su uso en la cicatrización y otros trastornos que implican la destrucción de células epiteliales.

Los factores de crecimiento transformante (TGF) tienen la capacidad de transformar diversas estirpes celulares, y pueden conferir, por ejemplo, la capacidad de crecer en cultivo durante un número limitado de generaciones, crecimiento en múltiples capas en vez de monocapas, y la adquisición de un cariotipo anormal. Existen al menos cinco miembros de la familia de TGF, siendo los dos más ampliamente estudiados TGF-alfa y TGF-beta. El primero es mitogénico para fibroblastos y células endoteliales, angiogénico, y promueve la resorción ósea. Las composiciones también pueden incluir TGF. TGF-beta es un mediador general de la regulación celular, un poderoso inhibidor del crecimiento celular, e inhibe la proliferación de muchos tipos de células. TGF-beta puede antagonizar los efectos mitogénicos de otros factores de crecimiento de péptidos, y también puede inhibir el crecimiento de muchas estirpes celulares de tumor. TGF-beta también tiene efectos angiogénicos, y promueve la formación de colágeno en fibroblastos. Las indicaciones para hidrogeles usados en la presente invención incluyen úlceras crónicas de la piel, tales como úlceras neurotróficas del pie en pacientes diabéticos. Otras áreas incluyen cicatrización, reparación de hueso y enfermedades inmunosupresoras.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura de la presente invención se pueden usar, por ejemplo, para llevar células adecuadas. Éstas se pueden incorporar en el gel justo antes de la aplicación a una herida, u otra área adecuada, para maximizar la eficacia. Las células adecuadas incluyen fibroblastos y queratinocitos autólogos, que son principalmente responsables de la formación de dermis y epidermis. Geles separados que comprenden cada uno un tipo de célula se pueden aplicar consecutivamente o juntos, o un gel puede comprender ambos tipos de células, pero esto es, en general, menos preferido.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura de la presente invención pueden comprender útilmente, por ejemplo, colágeno. Aunque el colágeno, en esta forma, es poco probable que sirva a una función estructural útil, sirve principalmente de proteína de sacrificio, donde la actividad proteolítica es no deseablemente alta, por lo que ayuda, por ejemplo, a la prevención de la maceración de tejido sano.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura también pueden incluir ciertas enzimas. Las enzimas se usan en el desbridamiento de tanto heridas agudas como crónicas. El desbridamiento es la retirada de tejido no viable y materia extraña de una herida y es un acontecimiento natural en el proceso de reparación de heridas. Durante la fase inflamatoria, los neutrófilos y los macrófagos digieren y retiran las plaquetas "usadas", los restos celulares y el tejido lesionado avascular del área de la herida. Sin embargo, con la acumulación de cantidades significativas de tejido dañado, este proceso natural se ve desbordado e insuficiente. La acumulación de tejido necrótico supone entonces una demanda fagocítica considerable a la herida y retarda la cicatrización. Por consiguiente, el desbridamiento de tejido necrótico es un objetivo particular de la terapia tópica y un componente importante del abordaje óptimo de heridas.

Se pueden incorporar enzimas, por ejemplo, en hidrogeles usados en la presente invención para administración tópica para proporcionar un método selectivo de desbridamiento. Las enzimas adecuadas pueden derivar de diversas fuentes, tales como camarón antártico, cangrejo, papaya, extracto bovino y bacterias. Las enzimas adecuadas comercialmente disponibles incluyen colagenasa, papaína/urea y una combinación de fibrinolisina y desoxirribonucleasa.

Las enzimas para su uso en la presente invención funcionan, en general, en una de dos formas: digiriendo directamente los componentes de la muda (por ejemplo, fibrina, bacteria, leucocitos, residuo celular, exudado seroso, ADN); o disolviendo los "anclajes" de colágeno que aseguran el tejido avascular al lecho de la herida subyacente.

Los hidrogeles usados en la presente invención pueden comprender disolución de Dakin, si se desea, en general, para ejercer efectos antimicrobianos y el control del olor. Como un agente de desbridamiento, la disolución de Dakin es no selectiva debido a sus propiedades citotóxicas. La disolución de Dakin desnaturaliza la proteína, haciendo que sea más fácilmente eliminada de la herida. El aflojamiento de la muda también facilita el desbridamiento por otros métodos. Los hidrogeles que comprenden la disolución de Dakin se pueden cambiar dos veces al día si el objetivo es el desbridamiento. En general, la protección de la piel peri-herida se debe proveer, por ejemplo, de pomadas, apósitos líquidos de película barrera de la piel, u obleas sólidas de barrera de la piel.

El gel usado en la presente invención se puede administrar por cualquier método adecuado, tal como por una jeringa o envase de fuelle (sistemas de administración de dosis única) o un sistema multidosis, tal como un sistema de administración presurizada o administración por un sistema de tipo 'bolsa en lata' (tal como el publicado en el documento de patente WO98/32675). Un ejemplo de un envase de fuelle se muestra en el número de diseño de GB publicado 2082665.

Por definición, la presente descripción también se extiende a un sistema de administración de dosis única que comprende un gel usado en la presente invención, para el tratamiento de heridas. La descripción también se extiende a un sistema de administración presurizada que comprende un gel usado en la presente invención, y un hidrogel presurizado usado en la presente invención en un recipiente de aerosol capaz de formar un espray tras la liberación de presión del mismo. El uso de dichos medios de administración permite al gel administrarlo a áreas en un paciente que son de otro modo difíciles de ser alcanzadas por aplicación directa, tal como sobre la espalda de un paciente cuando el paciente está tumbado.

En cierta realización, puede ser ventajoso convertir las composiciones de hidrogel usadas en la invención en eléctricamente conductoras para su uso en electrodos biomédicos y otros contextos de electroterapia, es decir, para fijar un electrodo u otro miembro eléctricamente conductor a la superficie del cuerpo. Por ejemplo, la composición de hidrogel se puede usar para fijar un electrodo de estimulación nerviosa transcutánea, un electrodo de retorno electroquirúrgico, o un electrodo de EKG a la piel o tejido mucoso del paciente. Estas aplicaciones implican la modificación de la composición del hidrogel para contener una especie conductora. Las especies conductoras adecuadas son electrolitos iónicamente conductores, particularmente los que normalmente se usan en la fabricación de adhesivos conductores usados para la aplicación a la piel u otra superficie del cuerpo, e incluyen sales inorgánicas ionizables, compuestos orgánicos, o combinaciones de ambos. Los ejemplos de electrolitos iónicamente conductores incluyen, pero no se limitan a, sulfato de amonio, acetato de amonio, acetato de monoetanolamina, acetato de dietanolamina, lactato de sodio, citrato de sodio, acetato de magnesio, sulfato de magnesio, acetato sódico, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, sulfato de calcio, cloruro de litio, perclorato de litio, citrato de sodio y cloruro de potasio, y pares rédox, tales como una mezcla de sales férricas y ferrosas, tales como sulfatos y gluconatos. Las sales preferidas son cloruro de potasio, cloruro sódico, sulfato de magnesio y acetato de magnesio, y el cloruro de potasio es el más preferido para las aplicaciones de EKG. Aunque prácticamente cualquier cantidad de electrolito puede estar presente en las composiciones adhesivas de la invención, es preferible que cualquier electrolito presente esté en una concentración en el intervalo de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 15 % en peso de la composición de hidrogel. El procedimiento descrito en la patente de EE. UU. N.° 5.846.558 a Nielsen et al. para la fabricación de electrodos biomédicos se puede adaptar para su uso con las composiciones de hidrogel usadas en la invención. También se pueden usar otros procedimientos de fabricación adecuados, como será apreciado por los expertos en la técnica.

Reticulación

El complejo de armazón de la invención comprende un resto de reticulación presente en una cantidad eficaz para inducir la reticulación entre la fibra de policaprolactona y el ácido hialurónico. Para ciertas aplicaciones, particularmente cuando se desea una elevada fuerza cohesiva, los polímeros de gel/hidrogeles de la invención pueden ser reticulados covalentemente. La divulgación contempla que la reticulación se pueda desear como entre los polímeros de los componentes de gel/hidrogel de los materiales compuestos de la invención. La invención contempla cualquier medio adecuado de reticulación de polímeros entre sí. Los polímeros de gel/hidrogel pueden ser reticulados covalentemente con otros polímeros, ya sea intramolecularmente o intermolecularmente, o mediante enlaces covalentes. En el primer caso, no hay enlaces covalentes uniendo los polímeros entre sí, mientras que en el último caso hay reticulaciones covalentes que unen los polímeros entre sí. Las reticulaciones se pueden formar usando cualquier medio adecuado, que incluye el uso de calor, radiación o un agente de curado químico (reticulación). El grado de reticulación debe ser suficiente para eliminar o al menos minimizar el flujo en frío bajo compresión. La reticulación también incluye el uso de una tercera molécula, un "reticulante", utilizado en el proceso de reticulación.

Para la reticulación térmica, se usa un iniciador de la polimerización de radicales libres, y puede ser cualquiera de los iniciadores generadores de radicales libres conocidos convencionalmente usados en la polimerización de vinilo. Los iniciadores preferidos son peróxidos orgánicos y compuestos azoicos. En general, se usan en una cantidad desde aproximadamente el 0,01 % en peso hasta el 15 % en peso, preferentemente del 0,05 % en peso al 10 % en peso, más preferentemente desde aproximadamente el 0,1 % en peso hasta aproximadamente el 5 % y lo más preferentemente desde aproximadamente el 0,5 % en peso hasta aproximadamente el 4 % en peso del material polimerizable. Los peróxidos orgánicos adecuados incluyen peróxidos de dialquilo, tales como peróxido de t-butilo y 2,2-bis(t-butilperoxi)propano, peróxidos de diacilo, tales como peróxido de benzoílo y peróxido de acetilo, perésteres, tales como perbenzoato de t-butilo y per-2-etilhexanoato de t-butilo, perdicarbonatos, tales como dicetilperoxidicarbonato y diciclohexilperoxidicarbonato, peróxidos de cetona, tales como peróxido de ciclohexanona y peróxido de metiletilcetona, e hidroperóxidos, tales como hidroperóxido de cumeno e hidroperóxido de terc-butilo. Los compuestos azoicos adecuados incluyen azo-bis(isobutironitrilo) y azo-bis(2,4-dimetilvaleronitrilo). La temperatura para la reticulación térmica dependerá de los componentes reales y puede ser fácilmente deducida por un experto habitual en la técnica, pero normalmente varía desde aproximadamente 80 °C hasta aproximadamente 200 °C.

La reticulación también se puede llevar a cabo con radiación, normalmente en presencia de un fotoiniciador. La radiación puede ser ultravioleta, alfa, beta, gamma, haz de electrones y radiación de rayos X, aunque se prefiere la radiación ultravioleta. Los fotosensibilizadores útiles son sensibilizadores de triplete del tipo "abstracción de hidrógeno", e incluyen benzofenona y benzofenona sustituida y acetofenonas, tales como bencildimetilcetal, 4-acriloxibenzofenona (ABP), 1-hidroxi-ciclohexilfenilcetona, 2,2-dietoxiacetofenona y 2,2-dimetoxi-2-fenilaceto-fenona, alfa-cetoles sustituidos, tales como 2-metil-2-hidroxipropiofenona, éteres de benzoína, tales como metil éter de benzoína e isopropil éter de benzoína, éteres de benzoína sustituida, tales como metil éter de anisoína, cloruros de sulfonilo aromáticos, tales como cloruro de 2-naftalenosulfonilo, oximas fotoactivas, tales como 1 -fenil-1,2-propanodiona-2-(O-etoxicarbonil)-oxima, tioxantonas que incluyen tioxantonas sustituidas con alquilo y halógeno, tales como 2-isopropiltioxantona, 2-clorotioxantona, 2,4-dimetiltioxanona, 2,4-diclorotioxanona y 2,4-dietiltioxanona, y óxidos de acilfosfina. La radiación que tiene una longitud de onda de 200 a 800 nm, preferentemente, 200 a 500 nm, se prefiere para su uso en el presente documento, y la luz ultravioleta de baja intensidad es suficiente para inducir la reticulación en la mayoría de los casos. Sin embargo, con fotosensibilizadores del tipo abstracción de hidrógeno, puede ser necesario una intensidad a UV de mayor intensidad para lograr una reticulación suficiente. Dicha exposición se puede proporcionar por un procesador de lámpara de mercurio, tal como los disponibles de PPG, Fusión, Xenon y otros. La reticulación también se puede inducir irradiando con radiación gamma o un haz de electrones. Los parámetros de irradiación apropiados, es decir, el tipo y la dosis de radiación usada para efectuar la reticulación, serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los agentes de curado químicos adecuados, también denominados "promotores" de la reticulación química, incluyen, sin limitación, polimercaptanos, tales como 2,2-dimercapto dietil éter, hexa(3-mercaptopropionato) de dipentaeritritol, bis(3-mercaptoacetato) de etileno, tetra(3-mercaptopropionato) de pentaeritritol, tetratioglicolato de pentaeritritol, dimercaptoacetato de polietilenglicol, di(3-mercaptopropionato) de polietilenglicol, tri(3-mercaptopropionato) de trimetiloletano, tritioglicolato de trimetiloletano, tri(3-mercaptopropionato) de trimetilolpropano, tritioglicolato de trimetilolpropano, ditioetano, di- o tritiopropano y 1,6-hexanoditiol. El promotor de la reticulación se añade al polímero hidrófilo sin reticular para promover la reticulación covalente del mismo, o a una mezcla del polímero hidrófilo sin reticular y el oligómero complementario, para proporcionar la reticulación entre los dos componentes.

Los polímeros y/o nanoestructuras también pueden ser reticulados antes de la mezcla con el oligómero complementario. En dicho caso, se puede preferir sintetizar el polímero en forma reticulada, mezclando un precursor monomérico con respecto al polímero con comonómero multifuncional y copolimerizando. Los ejemplos de precursores monoméricos y productos poliméricos correspondientes son del siguiente modo: precursores de N-vinilamida para un producto de poli(N-vinilamida); N-alquilacrilamidas para un producto de poli(N-alquilacrilamida); ácido acrílico para un producto de ácido poliacrílico; ácido metacrílico para un producto de poli(ácido metacrílico); acrilonitrilo para un producto de poli(acrilonitrilo); y N-vinilpirrolidona (NVP) para un producto de poli(vinilpirrolidona) (PVP). La polimerización se puede llevar a cabo en masa, en suspensión, en disolución, o en una emulsión. Se prefiere la polimerización en disolución, y son particularmente preferidos los disolventes orgánicos polares, tales como acetato de etilo y alcanoles inferiores (por ejemplo, etanol, alcohol isopropílico, etc.). Para la preparación de polímeros de vinilo hidrófilos, la síntesis tendrá lugar normalmente por un proceso de polimerización de radicales libres en presencia de un iniciador de radicales libres, como se ha descrito anteriormente.

El comonómero multifuncional incluye, por ejemplo, bisacrilamida, ésteres acrílicos o metacrílicos de dioles, tales como butanodiol y hexanodiol (se prefiere diacrilato de 1,6-hexanodiol), otros acrilatos, tales como tetraacrilato de pentaeritritol, y diacrilato de 1,2-etilenglicol, y diacrilato de 1,12-dodecanodiol. Otros monómeros de reticulación multifuncional útiles incluyen (met)acrilatos multifuncionales oligoméricos y poliméricos, por ejemplo, diacrilato de poli(óxido de etileno) o dimetacrilato de poli(óxido de etileno); agentes de reticulación polivinílicos, tales como divinilbenceno sustituido y sin sustituir; y acrilatos de uretano difuncionales, tales como EBECRYL 270 y EBECRYL 230 (uretanos acrilatados de peso molecular medio ponderal 1500 y peso molecular medio ponderal 5000, respectivamente--ambos disponibles de UCB de Smyrna, Ga.), y combinaciones de los mismos. Si se emplea un agente de reticulación química, la cantidad usada será preferentemente tal que la relación ponderal entre el agente de reticulación y el polímero hidrófilo esté en el intervalo de aproximadamente 1:100 a 1:5. Para lograr una mayor densidad de reticulación, si se desea, se combina reticulación química con curado con radiación.

Nanoestructuras

Los componentes de nanoestructura de la invención comprenden una fibra polimérica no tejida que tiene un diámetro medio de desde 100 nm hasta 8000 nm unido covalentemente a un resto de unión a hidrogel, en donde la fibra polimérica comprende policaprolactona electrohilada. Las nanoestructuras pueden ser de cualquier forma adecuada, que incluye fibras, filamentos, secciones de malla, filamentos o redes ramificados, hojas, o partículas moldeadas. Las nanoestructuras también pueden comprender cualquier grupo funcional químico adecuado para facilitar la reticulación covalente o no covalente entre las nanoestructuras y los polímeros de los hidrogeles de la invención. Se conocen bien en la técnica métodos, técnicas y materiales para la preparación y la funcionalización de nanoestructuras.

Se pueden usar métodos de microfabricación para preparar las nanoestructuras. Los dispositivos desvelados se pueden ensamblar y/o fabricar usando una técnica de microfabricación adecuada. Dichos métodos y técnicas son ampliamente conocidos en la técnica.

Los procesos de microfabricación que se pueden usar en la preparación de las nanoestructuras desveladas en el presente documento incluyen litografía; técnicas de grabado, tales como láseres, grabado con plasma, fotolitografía o grabado químico, tal como químico en húmedo, en seco y eliminación de resina fotosensible; o por técnicas de forma libre sólida, que incluyen impresión tridimensional (3DP), estereolitografía (SLA), sinterizado selectivo por láser (SLS), fabricación de partículas balísticas (BPM) y modelado por deposición fundida (FDM); por micromecanizado; oxidación térmica de silicio; galvanoplastia y galvanización no electrolítica; procesos de difusión, tales como difusión de boro, fósforo, arsénico y antimonio; implantación de iones; deposición de películas, tales como evaporación (filamento, haz de electrones, destello y ensombrecimiento y cobertura escalonada), pulverización iónica, deposición química de vapor (CVD), epitaxia (fase vapor, fase líquida y haz molecular), galvanización no electrolítica, serigrafía, laminación o por combinaciones de los mismos. Véase Jaeger, Introduction to Microelectronic Fabrication (Addison-Wesley Publishing Co., Reading Mass. 1988); Runyan, et al., Semiconductor Integrated Circuit Processing Technology (Addison-Wesley Publishing Co., Reading Mass. 1990); Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987 1998; Rai-Choudhury, ed., Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication (SPIE Optical Engineering Press, Bellingham, Wash. 1997). La selección del material que se usa como molde determina cómo se configura la superficie para formar la estructura de ramificación.

Por ejemplo, se pueden usar procesos del estado de la técnica para la fabricación de sistemas microelectromecánicos (MEMS) que utilizan procesos y métodos fotolitográficos derivados de la industria de los semiconductores. Los métodos más recientemente desarrollados incluyen "litografía suave" (Whitesides et al., Angew Chem. Int ed, 37; 550 575, (1998)) y tectónica microfluídica (patente de EE. UU. N.° 6.488.872, Beebe et al., Nature; 404:588-59 (2000)). Las revisiones y otras discusiones de la fabricación de microdispositivos poliméricos incluyen Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization; 2a ed.; CRC Press: Boca Raton, 1997; Becker, H. y Locascio, L. E. "Polymer microfluidic devices." Talanta, 56(2):267-287, 2002; Quake, S. R. y Scherer, A. "From microto nanofabrication with soft materials." Science, 290(5496): 1536-1540, 2000; y Whitesides, G. M. y Stroock, A. D. "Flexible methods for microfluidics." Physics Today, 54(6):42-48, 2001

Las nanoestructuras también se fabrican por hilado electrostático (también denominado electrohilado). Se conoce bien la técnica del electrohilado de líquidos y/o disoluciones capaces de formar fibras y se ha descrito en varias patentes, tales como, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 4.043.331 y 5.522.879. El proceso de electrohilado implica, en general, la introducción de un líquido en un campo eléctrico, de manera que se haga que el líquido produzca fibras. Estas fibras son atraídas, en general, hacia un conductor en un potencial eléctrico de atracción para la recogida. Durante la conversión del líquido en fibras, las fibras se endurecen y/o secan. Este endurecimiento y/o secado se puede causar por el enfriamiento del líquido, es decir, donde el líquido normalmente es un sólido a temperatura ambiente; por evaporación de un disolvente, por ejemplo, por deshidratación (endurecimiento físicamente inducido); o por un mecanismo de curado (endurecimiento químicamente inducido).

El proceso de hilado electrostático se ha dirigido normalmente hacia el uso de las fibras para crear una estera u otro material no tejido, como se desvela, por ejemplo, en la patente de EE. UU. N.° 4.043.331. Las nanofibras que varían desde 50 nm hasta 5 micrómetros de diámetro pueden ser electrohiladas en una malla de nanofibra no tejida o alineada. Debido al pequeño diámetro de las fibras, los textiles electrohilados poseen inherentemente un área superficial muy alta y un tamaño de poro pequeño. Estas propiedades hacen que las telas electrohiladas sean posibles candidatos para varias aplicaciones, que incluyen: membranas, armazones de tejido y otras aplicaciones biomédicas.

Se pueden producir fibras electrostáticamente hiladas que tienen diámetros muy delgados. Los parámetros que influyen en el diámetro, la consistencia y la uniformidad de las fibras electrohiladas incluyen la carga de material polimérico y reticulante (carga) en la combinación formadora de fibras, la tensión aplicada y la distancia aguja-colector. Según una realización, la nanofibra tiene un diámetro que varía desde aproximadamente 1 nm hasta aproximadamente 100 pm. En otras realizaciones, la nanofibra tiene un diámetro en un intervalo de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm. Además, la nanofibra puede tener una relación de aspecto en un intervalo de al menos aproximadamente 10 a aproximadamente al menos 100. Se apreciará que, debido al diámetro muy pequeño de las fibras, las fibras tienen una elevada área superficial por unidad de masa. Esta elevada relación entre el área superficial y la masa permite transformar disoluciones o líquidos formadores de fibra a partir de materiales líquidos o formadores de fibras solvatadas en nanofibras sólidas en fracciones de un segundo.

El material polimérico usado para formar las nanofibras/nanoestructuras se puede seleccionar de cualquier material formador de fibra que sea compatible con los agentes de reticulación. Dependiendo de la aplicación prevista, el material polimérico formador de fibra puede ser hidrófilo, hidrófobo o anfifílico. Además, el material polimérico formador de fibra puede ser un material polimérico térmicamente sensible.

Los polímeros sintéticos o naturales, biodegradables o no biodegradables, pueden formar las nanofibras/nanoestructuras como componentes de la invención. Un "polímero sintético" se refiere a un polímero que se prepara sintéticamente y que incluye unidades monoméricas que no existen de forma natural. Por ejemplo, un polímero sintético puede incluir unidades monoméricas no naturales, tales como unidades de acrilato o acrilamida. Los polímeros sintéticos se forman normalmente por reacciones de polimerización tradicionales, tales como adición, condensación o polimerizaciones por radicales libres. Los polímeros sintéticos también pueden incluir los que tienen unidades monoméricas naturales, tales como unidades monoméricas de péptidos, nucleótidos y sacáridos que existen de forma natural en combinación con unidades monoméricas no naturales (por ejemplo, derivados de péptido sintético, nucleótido y sacárido). Estos tipos de polímeros sintéticos se pueden producir por técnicas de síntesis habituales, tales como por síntesis en fase sólida, o recombinantemente, cuando se permita.

Un "polímero natural" se refiere a un polímero que se prepara o naturalmente, recombinantemente, o sintéticamente, y que consiste en unidades monoméricas que existen de forma natural en el esqueleto polimérico. En algunos casos, el polímero natural se puede modificar, procesar, derivatizar o tratar de otro modo, para cambiar las propiedades químicas y/o físicas del polímero natural. En estos casos, el término "polímero natural" se modificará para reflejar el cambio al polímero natural (por ejemplo, un "polímero natural derivatizado", o un "polímero natural desglucosilado").

Los materiales de nanofibra, por ejemplo, pueden incluir tanto materiales de polímero de adición como de polímero de condensación, tales como poliolefina, poliacetal, poliamida, poliéster, éter y éster de celulosa, poli(sulfuro de alquileno), poli(óxido de arileno), polisulfona, polímeros de polisulfona modificados y mezclas de los mismos. Los materiales a modo de ejemplo dentro de estas clases genéricas incluyen polietileno, poli(e-caprolactona), poli(lactato), poli(glicolato), polipropileno, poli(cloruro de vinilo), poli(metacrilato de metilo) (y otras resinas acrílicas), poliestireno y copolímeros de los mismos (que incluyen copolímeros de bloque de tipo ABA), poli(fluoruro de vinilideno), poli(cloruro de vinilideno), poli(alcohol vinílico) en diversos grados de hidrólisis (87 % al 99,5 %) en formas reticuladas y no reticuladas. Los polímeros de adición a modo de ejemplo tienden a ser vítreos (una Tg superior a temperatura ambiente). Este es el caso de composiciones de polímero de poli(cloruro de vinilo) y poli(metacrilato de metilo), de poliestireno, o aleaciones, o baja cristalinidad para materiales de poli(fluoruro de vinilideno) y poli(alcohol vinílico).

En algunos casos, no es parte de la invención, los materiales de nanofibra/nanoestructura son polímeros de condensación de poliamida. En realizaciones más específicas, el polímero de condensación de poliamida es un polímero de nailon. El término "nailon" es un nombre genérico para todas las poliamidas sintéticas de cadena larga. Se puede preparar otro nailon por la policondensación de épsilon-caprolactama en presencia de una pequeña cantidad de agua. Esta reacción forma un nailon-6 (fabricado de una lactama cíclica - también conocida como ácido épsilonaminocaproico) que es una poliamida lineal. Además, también se contemplan copolímeros de nailon. Los copolímeros se pueden preparar combinando diversos compuestos de diamina, diversos compuestos de diácido y diversas estructuras de lactama cíclica en una mezcla de reacción y luego formando el nailon con materiales monoméricos situados aleatoriamente en una estructura de poliamida. Por ejemplo, un material de nailon 6,6-6,10 es un nailon fabricado a partir de hexametilendiamina y una mezcla de diácidos C6 y C10. Un nailon 6-6,6-6,10 es un nailon fabricado por copolimerización de ácido épsilon-aminocaproico, hexametilendiamina y una mezcla de un material de diácidos C6 y C10.

Los copolímeros de bloque también se pueden usar como materiales de nanofibra. En la preparación de una composición para la preparación de nanofibras, se puede elegir un sistema de disolventes de forma que ambos bloques sean solubles en el disolvente. Un ejemplo es un polímero de ABA (estireno-EP-estireno) o AB (estireno-EP) en disolvente de cloruro de metileno. Los ejemplos de dichos copolímeros de bloque son un tipo Kraton de polímeros de bloque AB y ABA que incluyen estireno/butadieno y estireno/butadieno (etileno propileno) hidrogenado, un tipo Pebax de épsilon-caprolactama/óxido de etileno y un tipo Sympatex de poliéster/óxido de etileno y poliuretanos de óxido de etileno e isocianatos.

Los polímeros de adición, tales como poli(fluoruro de vinilideno), poliestireno sindiotáctico, copolímeros de fluoruro de vinilideno y hexafluoropropileno, poli(alcohol vinílico), poli(acetato de vinilo), polímeros de adición amorfos, tales como poli(acrilonitrilo) y sus copolímeros con ácido acrílico y metacrilatos, poliestireno, poli(cloruro de vinilo) y sus diversos copolímeros, poli(metacrilato de metilo) y sus diversos copolímeros, pueden ser hilados en disolución con relativa facilidad debido a que son solubles a bajas presiones y temperaturas. El polímero altamente cristalino, como el polietileno y el polipropileno, requieren, en general, temperatura más alta y disolventes a alta presión si se van a hilar en disolución.

Las nanofibras también se pueden formar a partir de composiciones poliméricas que comprenden dos o más materiales poliméricos en mezcla polimérica, formato de aleación, o en una estructura químicamente unida reticulada. Se pueden mezclar dos materiales de polímero relacionados para proporcionar la nanofibra con propiedades beneficiosas. Por ejemplo, se puede mezclar un poli(cloruro de vinilo) de alto peso molecular con un poli(cloruro de vinilo) de bajo peso molecular. Similarmente, se puede mezclar un material de nailon de alto peso molecular con un material de nailon de bajo peso molecular. Además, se pueden mezclar especies diferentes de un género polimérico general. Por ejemplo, se puede mezclar un material de estireno de alto peso molecular con un poliestireno de alto impacto de bajo peso molecular. Un material de nailon-6 se puede mezclar con un copolímero de nailon, tal como un copolímero de nailon-6; 6,6; 6,10. Además, un poli(alcohol vinílico) que tiene un bajo grado de hidrólisis, tal como un poli(alcohol vinílico) hidrolizado al 87 %, se puede mezclar con un poli(alcohol vinílico) completamente hidrolizado o superhidrolizado que tiene un grado de hidrólisis entre el 98 y el 99,9 % y superior. Todos estos materiales en mezcla pueden ser reticulados usando mecanismos de reticulación apropiados. Los nailon pueden ser reticulados usando agentes de reticulación que son reactivos con el átomo de nitrógeno en el enlace amida. Los materiales de poli(alcohol vinílico) pueden ser reticulados usando materiales reactivos de hidroxilo, tales como monoaldehídos, tales como formaldehído, ureas, resina de melamina-formaldehído y sus análogos, ácidos bóricos, y otros compuestos inorgánicos, dialdehídos, diácidos, uretanos, epoxis y otros agentes de reticulación conocidos. El reactivo de reticulación reacciona y forma enlaces covalentes entre cadenas de polímero para mejorar sustancialmente el peso molecular, la resistencia a productos químicos, la resistencia global y la resistencia a la degradación mecánica.

También se pueden usar polímeros biodegradables en la preparación de las nanoestructuras.

Los ejemplos de clases de polímeros sintéticos que se han estudiado como materiales biodegradables incluyen poliésteres, poliamidas, poliuretanos, poliortoésteres, policaprolactona (PCL), poliiminocarbonatos, carbonatos alifáticos, polifosfacenos, polianhídridos y copolímeros de los mismos. Los ejemplos específicos de materiales biodegradables que se pueden usar a propósito de, por ejemplo, los dispositivos médicos implantables incluyen polilactida, poliglicolida, polidioxanona, poli(lactida-co-glicolida), poli(glicolida-co-polidioxanona), polianhídridos, poli(glicolida-co-carbonato de trimetileno) y poli(glicolida-co-caprolactona). También se pueden usar mezclas de estos polímeros con otros polímeros biodegradables.

En algunas realizaciones, las nanofibras son polímeros no biodegradables. No biodegradable se refiere a polímeros que, en general, no son capaces de ser degradados no enzimáticamente, hidrolíticamente o enzimáticamente. Por ejemplo, el polímero no biodegradable es resistente a la degradación que puede ser causada por proteasas. Los polímeros no biodegradables pueden incluir o polímeros naturales o sintéticos.

La inclusión de agentes de reticulación dentro de la composición que forma la nanofibra permite a la nanofibra ser compatible con un amplio intervalo de superficies de soporte. Los agentes de reticulación se pueden usar solos o en combinación con otros materiales para proporcionar una característica superficial deseada.

Los agentes de reticulación adecuados incluyen o materiales monoméricos (materiales de molécula pequeña) o poliméricos que tienen al menos dos grupos activables reactivos latentes que son capaces de formar enlaces covalentes con otros materiales cuando se someten a una fuente de energía, tal como radiación, energía eléctrica o térmica. En general, los grupos activables reactivos latentes son entidades químicas que responden a energía externa aplicada específica o a estímulos para generar especies activas con enlaces covalentes resultantes con una estructura química adyacente. Los grupos reactivos latentes son aquellos grupos que retienen sus enlaces covalentes en condiciones de almacenamiento, pero que forman enlaces covalentes con otras moléculas tras la activación por una fuente de energía externa. En algunas realizaciones, los grupos reactivos latentes forman especies activas, tales como radicales libres. Estos radicales libres pueden incluir nitrenos, carbino o estados excitados de cetonas tras la absorción de energía eléctrica, electroquímica o térmica externamente aplicada. Se informa de diversos ejemplos de grupos reactivos latentes conocidos o comercialmente disponibles en las patentes de EE. UU. N.° 4.973.493; 5.258.041; 5.563.056; 5.637.460; o 6.278.018.

Por ejemplo, se pueden usar fotorreticulantes multifuncionales comercialmente disponibles basados en triclorometiltriazina disponibles de o Aldrich Chemicals, Produits Chimiques Auxiliaires et de Syntheses, (Longjumeau, Francia), Shin-Nakamara Chemical, Midori Chemicals Co., Ltd. o Panchim S. A. (Francia). Los ocho compuestos incluyen 2,4,6-tris(triclorometil)-1,3,5-triazina, 2-(metil)-4,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina, 2-(4-metoxinaftil)-4,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina, 2-(4-etoxinaftil)-4,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina, 4-(4-carboxilfenil)-2,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina, 2-(4-metoxifenil)-4,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina, 2-(1 -eten-2,2'-furil)-4,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina y 2-(4-metoxiestiril)-4,6-bis(triclorometil)-1,3,5-triazina.

Métodos de uso y realizaciones a modo de ejemplo

Las composiciones de la invención se pueden usar ventajosamente en numerosas situaciones de reparación de tejido, así como en otras aplicaciones, tales como proporcionar recubrimientos sobre catéteres y otros dispositivos quirúrgicos e implantes. Las composiciones de la invención también se pueden usar para administrar los agentes activos descritos en el presente documento, tales como antibióticos, factores de crecimiento y agentes inmunosupresores.

La divulgación proporciona un método de curación de un defecto de tejido blando que comprende aplicar un material compuesto a un defecto de tejido blando, en donde el material compuesto incluye un gel y una nanoestructura dispuesta dentro del gel.

Se apreciará que las propiedades ventajosas de las composiciones de hidrogel/nanoestructura descritas en el presente documento incluyen la capacidad de: 1) proporcionar una fácil caracterización y control de calidad; 2) integrar con matrices de tejido existentes; 3) ser incorporadas directamente en matrices recién formadas; 4) incluir directamente células y factores bioactivos; 5) mantener la biocompatibilidad; 6) controlar la biorresorción; 7) colarse fácilmente en formas anatómicas complicadas debido a la mayor rigidez estructural debido a las nanoestructuras; y 8) presentar las propiedades mecánicas de tejidos nativos, tales como cartílago articular.

En una aplicación, las composiciones de material compuesto de hidrogel/nanoestructura de la invención se pueden usar para reparar tejido de cartílago. Los actuales procedimientos quirúrgicos basados en biológicos para la reparación de cartílago incluyen implantación de condrocitos autólogos, perforación, condroplastia de abrasión, microfractura y artroplastia en mosaico. Todos estos procedimientos tratan solo las lesiones de cartílago articular focal y no las superficies de articulaciones denudadas de cartílago, tal como se observa en osteoartritis intensa y artritis reumatoide. Por lo tanto, usan tantos tapones de tejido de cartílago como condrocitos expandidos recogidos del paciente para rellenar los defectos de cartílago. Se espera que estos tejidos o condrocitos rellenen el defecto sintetizando material completamente de nuevo, tal como cartílago hialino recién sintetizado, que se ha integrado con matrices de cartílago existentes y tiene las propiedades biomecánicas del cartílago normal. Sin embargo, dichos procedimientos promueven todos la formación de un tejido reparativo (fibrocartílago) en vez de cartílago hialino verdadero con daño mecánico adicional al fibrocartílago que se cree que predispone la articulación a la osteoartritis.

Además, la disponibilidad de cartílago endógeno como material de reparación está bastante limitada con su adquisición presentando sus propios riesgos y morbilidad al paciente. Como es evidente de la discusión anterior, las composiciones de hidrogel/nanoestructura resultantes desveladas en el presente documento presentan materiales prácticos para nuevas terapias prometedoras en pacientes que padecen enfermedades degenerativas del cartílago.

Como se describe en el presente documento, las presentes composiciones de hidrogel/nanoestructura se pueden preparar teniendo propiedades ampliamente variables que son adecuadas para cualquier número de implantación o potenciación de tejido sintético, así como otras aplicaciones clínicas. Como ya se ha descrito, los presentes materiales se pueden usar para reparar defectos de cartílago producidos como resultado de o lesión o enfermedad. Los defectos debidos a lesión que puede ser así reparados pueden estar relacionados con los deportes o accidentes, y pueden implicar solo la capa de cartílago superficial, o pueden incluir el hueso subcondral subyacente. Los defectos debidos a enfermedad que pueden ser reparados usando las composiciones descritas en el presente documento incluyen los resultantes de osteoartritis y artritis reumatoide. Si son de lesión o enfermedad, dichos defectos pueden estar o en cartílago maduro o de placas de crecimiento. Las formulaciones para hidrogeles para el cartílago de placas de crecimiento sintético pueden requerir la inclusión de material de armazón sin sustituir para permitir la biorresorción controlada del biomaterial durante el crecimiento.

Otro campo donde pueden ser útiles las composiciones de hidrogel/nanoestructura descritas en el presente documento es la reparación, la reconstrucción o la potenciación de tejidos cartilaginosos, así como blandos, de la cabeza y el cuello. La disponibilidad de biomateriales para la potenciación de tejido blando y la reconstrucción de cabeza y cuello ha seguido siendo un reto fundamental en el campo de la cirugía plástica y reconstructiva. Se ha realizado una significativa investigación e inversión para el desarrollo de un material con compatibilidad biológica y vida útil apropiadas. Los resultados de esta investigación no han sido prometedores. Cuando se ponen en animales inmunocompetentes, se ha mostrado que falla la integridad estructural de los materiales actualmente propuestos a medida que se absorbe la región estructural. Además, aunque los materiales sintéticos convencionales ofrecen una excelente vida útil, presentan ciertas dificultades inevitables. Por ejemplo, las siliconas han estado cargadas de preocupaciones referidas a la seguridad y efectos inmunorrelacionados de larga duración. Los polímeros sintéticos PTFE (gortex) y silásticos ofrecen menos reactividad del tejido, pero no ofrecen integración del tejido y pueden representar riesgos a largo plazo de infecciones por cuerpos extraños y extrusión. Los materiales descritos en la presente solicitud serán útiles para preparar un material de armazón de tejido blando sintético para la potenciación o reparación de defectos de tejido blando de la cabeza y el cuello. En particular, las composiciones de hidrogel/nanoestructura, que son no inflamatorias, no inmunogénicas, y que se pueden preparar teniendo el grado de viscoelasticidad apropiado (véase la descripción en el presente documento), se podrían usar como un material de armazón implantable eficaz.

Además, las presentes composiciones de hidrogel/nanoestructura se pueden usar, por ejemplo, como materiales novedosos, biocompatibles y biodistensibles para preparar implantes de cartílago que se usan frecuentemente en procedimientos reconstructivos de la cabeza y el cuello para reparar defectos cartilaginosos u óseos secundarios a traumatismo o anomalías congénitas. Las aplicaciones específicas a la oreja incluyen otoplastia y reconstrucción auricular, que se realizan frecuentemente para reparar defectos cartilaginosos debidos a traumatismo, neoplasia (es decir, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales y melanoma) y defectos congénitos, tales como microtia. Las aplicaciones específicas a la nariz incluyen procedimientos cosméticos y reconstructivos de la nariz y el tabique nasal. La potenciación de la giba dorsal, los injertos de la punta, en escudo y expansores se usan frecuentemente en la rinoplastia cosmética. La reconstrucción nasal tras traumatismo, neoplasia, enfermedades autoinmunitarias, tales como granulomatosis de Wegener, o defectos congénitos, requieren cartílago para su reparación. Las perforaciones del tabique son difíciles de gestionar y fracasan frecuentemente en el tratamiento. Los injertos de cartílago serían ideales para estas aplicaciones, ya que frecuentemente no está disponible cartílago autólogo o de donante. Las aplicaciones específicas para la garganta incluyen reconstrucción laringotraqueal, que en los niños requiere normalmente la recogida de cartílago costal, que no es sin morbilidad. El cartílago auricular y septal no es frecuentemente adecuado para la presente aplicación. Los materiales cartilaginosos sintéticos preparados a partir de los hidrogeles desvelados en el presente documento se pueden sintetizar para adecuarse a cada una de las aplicaciones anteriores, basándose en el ajuste de los parámetros de la síntesis de hidrogeles, tales como la concentración de reactivo, las tasas de sustitución y la reticulación. La reconstrucción laringotraqueal se realiza normalmente para el estrechamiento de las vías respiratorias debido a estenosis subglótica o traqueal. La etiología puede ser traumática (es decir, traumatismo por intubación, o traqueotomía) o idiopática. Otras posibilidades incluyen la potenciación de la barbilla y las mejillas, y el uso de reparación del ectropión del párpado inferior, además de numerosas aplicaciones craneofaciales. Se debe observar que estas aplicaciones pueden no necesitar cartílago con las exigentes propiedades mecánicas del cartílago articular. También puede ser conveniente la inclusión de una población de células o agentes bioactivos.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura descritas en el presente documento también se pueden usar para la reparación y el estrechamiento de la fosa nasal, normalmente tras una resección quirúrgica excesivamente agresiva, para prevenir la acumulación crónica de líquido en las fosas nasales, que conduce a infección e incrustación. Otra aplicación prometedora es en la reconstrucción laringotraqueal en tanto niños como adultos, como resultado de lesión laringotraqueal debida, por ejemplo, a intubación durante un procedimiento quirúrgico, tal como cirugía cardiovascular. Las composiciones de hidrogel/nanoestructura que se describen en el presente documento también se pueden usar para proporcionar sustituciones del anillo cricoides para proteger la arteria carótida tras la resección del cuello para cáncer - la composición de la invención se puede colocar entre la arteria carótida y la piel como una barrera protectora para la arteria carótida contra la pérdida de la barrera de la piel. Como recubrimiento protector durante la repoblación neuronal de un nervio reseccionado - el tejido fibroso se forma frecuentemente más rápido que la repoblación neuronal, previniendo su eventual formación. La colocación de las terminaciones nerviosas dentro de una composición de hidrogel/nanoestructura del tubo previamente colado de la invención podría excluir la formación de tejido fibroso del sitio de repoblación.

Las composiciones de hidrogel/nanoestructura de la invención también se pueden usar para la reparación de defectos de tejido blando de cualquier órgano interno o externo. Por ejemplo, los materiales de la invención se pueden usar para tanto la potenciación de la barbilla y las mejillas, como para su uso en la reparación del ectropión del párpado inferior, además de numerosas aplicaciones craneofaciales. Para fines cosméticos y reconstructivos en sitios distintos de la cabeza y el cuello, por ejemplo el uso como implantes mamarios para el aumento de mama, como sellante para heridas, por ejemplo para rellenar el hueco dejado después de extirpar los ganglios linfáticos (es decir, debido a cáncer) en la mama o el cuello, para sellar los ganglios linfáticos y reducir el drenaje de líquido incontrolado en el sitio de resección que podría conducir a infección y otras complicaciones.

Además de los usos anteriores, las composiciones de hidrogel/nanoestructura descritas en el presente documento se pueden usar en otras aplicaciones de ingeniería de tejido para producir tejidos ortopédicos sintéticos, que incluyen, pero no se limitan a, hueso, tendón, ligamento, menisco y disco intervertebral, usando estrategias y metodologías similares como se ha descrito anteriormente para la síntesis de formas artificiales de cartílago. Las composiciones de hidrogel/nanoestructura también se pueden usar para producir tejidos no ortopédicos sintéticos que incluyen, pero no se limitan a, las cuerdas vocales, el cuerpo vítreo, las válvulas del corazón, el hígado, el páncreas y el riñón, usando estrategias y metodologías similares a como se ha descrito anteriormente para la síntesis de formas artificiales de cartílago.

Otro campo donde las composiciones de hidrogel/nanoestructura desveladas en el presente documento se pueden usar es en aplicaciones gastrointestinales donde es necesario tratar o prevenir la formación de tejido cicatricial o constricciones en órganos abdominales o gastrointestinales. Ya existen varios productos en diversas fases de aprobación clínica y por la FDA que, en general, se llaman "hidrogeles", que se diseñan o tienen previsto ser útiles en el tratamiento y la prevención de la cicatrización y/o de la formación de constricciones. Los materiales de la presente invención son superiores a otros hidrogeles conocidos en los que los aquí desvelados pueden incluir una nanoestructura que puede proporcionar soporte, forma y resistencia a los materiales de hidrogel. Las composiciones de hidrogel/nanoestructura desveladas en el presente documento se pueden usar en aplicaciones similares a las que usan o pretender usar los hidrogeles ya conocidos, que incluyen las siguientes: para el tratamiento de constricciones o cicatrización del tubo gastrointestinal. El tratamiento implica la inyección del material de hidrogel en el sitio de una constricción esperada para prevenir la cicatrización, o en un sitio de constricción existente después de la terapia para agrandar en tubo GI estrechado para prevenir que ocurra la constricción.

Los materiales de la invención también se pueden usar para el tratamiento de constricciones esofágicas. Las constricciones esofágicas son una complicación común de la enfermedad por reflujo gastroesofágico (ERGE). La ERGE es causada por ácido, bilis y otros contenidos gástricos nocivos que refluyen dentro del esófago y que dañan las células que revisten el esófago. Aproximadamente el 7-23 % de los pacientes con ERGE desarrollan una constricción esofágica, o cicatrización fibrosa del esófago. La cicatrización del esófago también se puede causar por terapias ablativas usadas para tratar esófago de Barrett. La principal complicación de dichas terapias ablativas es que la lesión ablativa se extiende demasiado profunda en la pared del esófago y produce una cicatrización o constricción esofágica. Las constricciones esofágicas previenen el tragado normal y son una causa importante de morbilidad de los pacientes. Los materiales descritos en el presente documento se pueden usar para tratar o prevenir constricciones esofágicas resultantes de ERGE, esófago de Barrett y terapias ablativas esofágicas.

Los materiales compuestos de la invención también se pueden usar para el tratamiento de enfermedad de Crohn. La enfermedad de Crohn provoca constricciones o cicatrices que bloquean o estrechan la luz del intestino, previniendo la función intestinal normal. Los presentes materiales pueden ser útiles para tratar o prevenir dichas constricciones.

Los materiales compuestos también se pueden usar en métodos de tratamiento de colangitis esclerosante primaria (CEP). La CEP es una enfermedad rara de los conductos biliares del hígado. Los conductos biliares forman una red de ramificaciones dentro del hígado y salen del hígado por dos ramas principales que se combinan en el conducto biliar común que drena el hígado y la vesícula biliar de la bilis en el duodeno. Los conductos biliares son de diámetro muy estrecho, que mide solo hasta 2 mm normalmente en sus porciones más distales más grandes, y sin embargo deben normalmente drenar litros de bilis cada día del hígado en el duodeno. Cualquier bloqueo de estos conductos puede producir una grave afección conocida como ictericia, que permite que muchas toxinas y especialmente productos de degradación de la hemoglobina se acumulen en el cuerpo. La CEP es una enfermedad cicatrizante o estructurante de los conductos biliares dentro del hígado y en los conductos biliares extrahepáticos descritos anteriormente que conectan el hígado con el intestino delgado. Las constricciones de los conductos biliares de la CEP se pueden tratar o prevenir con las presentes composiciones de hidrogel/nanoestructura.

Los materiales compuestos de la invención también se pueden usar para tratar pancreatitis crónica. La pancreatitis crónica es una enfermedad inflamatoria del páncreas crónica que puede ser complicada por cicatrices o constricciones de los conductos pancreáticos. Estas constricciones bloquean el drenaje de los jugos pancreáticos, que normalmente deben salir del páncreas a través de un sistema de conductos o conductos de drenaje en el intestino delgado. El jugo pancreático contiene muchas enzimas digestivas y otros elementos importantes para la digestión normal y la absorción de nutrientes. El bloqueo o el estrechamiento de los conductos pancreáticos por la pancreatitis crónica puede producir graves complicaciones en las que el páncreas autodigiere y forma infecciones y o abscesos abdominales posiblemente mortales. Las constricciones pancreáticas de la pancreatitis crónica se pueden tratar o prevenir con los presentes hidrogeles.

Las composiciones presentemente descritas también se pueden usar para el tratamiento de constricciones de los conductos biliares y los conductos pancreáticos inducidos por cálculos. Los cálculos biliares son un trastorno muy común, una complicación principal de los cuales es la formación de constricciones de los conductos biliares y los conductos pancreáticos, que se pueden tratar o prevenir con los hidrogeles, para el tratamiento de enfermedad intestinal isquémica. Los intestinos tienen tendencia a la formación de cicatrices o constricciones cuando se compromete su riego sanguíneo. La circulación sanguínea comprometida se denomina isquemia, y se puede causar por muchas patologías, que incluyen enfermedad cardiovascular, aterosclerosis, hipotensión, hipovolemia, hipoalbuminemia inducida por enfermedad renal o hepática, vasculitis, enfermedad inducida por fármacos y muchas otras. El resultado terminal de todas estas etiologías puede producir constricciones intestinales que bloquean el intestino y previenen su función normal. Los presentes materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura se pueden usar para tratar o prevenir constricciones intestinales isquémicas.

Las composiciones de la invención también se pueden usar para el tratamiento de constricciones intestinales inducidas por radiación. La radioterapia para el cáncer está asociada con numerosas morbilidades, entre las cuales son importantes la formación de constricciones intestinales. Los presentes materiales compuestos de hidrogel se pueden usar para tratar o prevenir las constricciones intestinales inducidas por radiación.

Además de fabricar tejidos sintéticos o reparar tejidos nativos, los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura desvelados aquí también se pueden usar para proporcionar un recubrimiento para estructuras o dispositivos no biológicos que se van a usar en la cirugía o de otro modo para la implantación in vivo, tal como instrumentos quirúrgicos, o próstesis cerámicas o metálicas. Dicho recubrimiento proporcionaría una barrera entre el material no biológico del dispositivo y el tejido vivo. La función de los hidrogeles como barrera para los dispositivos no biológicos incluye, pero no se limita a: 1) prevención de la absorción de macromoléculas y/o células sobre las superficies de dispositivos no biológicos, que puede conducir a la incrustación de proteínas o trombosis en la superficie del dispositivo; 2) presentación de una superficie no tóxica, no inflamatoria, no inmunogénica, biológicamente compatible, para dispositivos fabricados de materiales de otro modo no biológicamente compatibles; 3) compatibilidad con la función del dispositivo, tal como la difusión de glucosa para un sensor de glucosa, transmisión de fuerza mecánica para un sensor de presión, o endotelización de un injerto vascular o prótesis endovascular; 4) mejora de la función del dispositivo, tal como proporcionar una barrera de carga a una barrera de tamaño existente en una nefrona artificial basada en MEMS; 5) incorporación en dispositivos no biológicos de una población viable de células atrapadas dentro de un entorno acuoso fisiológicamente compatible; y 6) inclusión de fármacos o factores bioactivos, tales como factores de crecimiento, agentes antivíricos, antibióticos o moléculas de adhesión diseñadas para fomentar la vascularización, la epitelización o la endotelización del dispositivo.

Basándose en lo anterior, los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura de la presente invención se pueden usar para proporcionar un recubrimiento no alergénico para una variedad de dispositivos implantables que incluyen un sensor de glucosa implantable para el tratamiento de la diabetes. Además, los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura se pueden usar para proporcionar: una barrera de carga para el desarrollo de nefronas artificiales basadas en MEMS; un entorno acuoso fisiológicamente compatible en el que las células renales incorporadas, tales como los podocitos, se pueden incorporar en un diseño de nefrona artificial basado en MEMS; y un recubrimiento para dispositivos de MEMS implantables diseñado para una variedad de fines que incluyen, pero no se limitan a, administración de fármacos, detección mecánica y como un sistema de biodetección.

Los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura desvelados, y particularmente un hidrogel basado en hialuronano, también se pueden unir covalentemente a dispositivos basados en silicio, por ejemplo mediante una primera unión covalente de la amina primaria de tiramina con la superficie del silicio para proporcionar una química superficial recubierta de hidroxifenilo. Esto puede usar la misma química usada para unir el ADN que ha sido modificado con una amina libre a las superficies de silicio. El hidrogel basado en HA se acopla entonces covalentemente con la superficie recubierta de hidroxifenilo por la misma química impulsada por peroxidasa usada en su modo de reticulación preferido descrito anteriormente.

Los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura también se pueden usar para el recubrimiento de dispositivos cardiovasculares no biológicos, tales como catéteres, prótesis endovasculares e injertos vasculares. Estos incluirían dispositivos fabricados de materiales convencionalmente no usados debido a su incompatibilidad biológica, pero que tienen características de diseño superiores a los dispositivos actualmente en uso. Se podrían incorporar factores bioactivos en los hidrogeles para promover la endotelización o epitelización del hidrogel, y así del dispositivo implantado.

Aunque los ejemplos y los usos particulares de los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura de la invención se han descrito en el presente documento, dichos usos específicos no pretenden ser limitantes. Los materiales compuestos de hidrogel/nanoestructura de la invención se pueden usar para cualquier aplicación usada, en general, para hidrogeles conocidos, y en particular, son útiles para la reparación y/o la regeneración de tejido blando en cualquier parte en el cuerpo.

Ahora se hará referencia a los dibujos en donde números de referencia similares identifican características o aspectos estructurales similares de la divulgación objeto. Para los fines de explicación e ilustración, y no limitación, una vista ilustrativa de una realización de un material compuesto biodegradable según la divulgación se muestra en la Fig. 1A y se designa, en general, como el símbolo de referencia 100. Los sistemas y métodos descritos en el presente documento se pueden usar para potenciar la curación de defectos de tejido blando.

Refiriéndose, en general, a las Fig. 1A-1D, el material compuesto biodegradable 100 puede incluir un gel 103 reforzado con nanofibras 101 que combina las ventajas de tanto el gel 103 como las nanofibras 101. El gel 103 puede incluir cualquier material adecuado, tal como, pero no se limita a, el hidrogel. Las nanofibras 101 se pueden preparar de cualquier nanomaterial adecuado, por ejemplo, policaprolactona (PCL) o cualquier otro material adecuado, y pueden adoptar cualquier forma y/o tamaño adecuado. El material compuesto 100 incluye elevada porosidad (por ejemplo, para mediar en la adhesión y migración celular) mientras se mantienen propiedades mecánicas suficientes (por ejemplo, para mantener la integridad y el soporte de tejido).

Las nanofibras 101 se conjugan covalentemente con el hidrogel 103 formando una o más cadenas de polímero. La unión covalente de los hidrogeles 103 con las nanofibras 101 puede producir un material con un conjunto combinado de propiedades ideales superiores a las de los materiales constituyentes usados solos o como una mezcla simple.

La Fig. 2A representa curvas de esfuerzo-deformación de una realización del material compuesto de la Fig. 1 representadas frente al hidrogel de HA solo, que revelan el módulo elástico mejorado en comparación con el hidrogel a la misma densidad de reticulación. Como se muestra, el módulo elástico del material compuesto 100 probado (4,5 mg/ml de HA, 10 mg/ml de PEG-DA, 6,75 mg/ml de fibras de PCL) fue 750 Pa, y el hidrogel solo a la misma densidad fue 320 Pa. La Fig. 2B representa una prueba de fatiga que muestra que el material compuesto como se ilustra en la Fig. 1 retiene un grado similar de solidez de la integridad mecánica en comparación con el hidrogel regular.

Con referencia a las Fig. 3A-3B, se mostró que el material compuesto 100 soportaba la migración de células madre derivadas de tejido adiposo (CMA). Las c Ma marcadas con GFP de aspirados de liposucción se cultivaron en esferoides y luego se sembraron en material compuesto o hidrogel.

Las Fig. 3A y 3B muestran la fluorescencia y la superposición (Fig. 3A) con imágenes de contraste de fase (Fig. 3B) de CMA cultivadas en material compuesto de nanofibra-hidrogel de HA durante 4 días. Las células migraron hacia afuera con procesos y trayectorias largos y extendidos. A diferencia, las CMA cultivadas en hidrogel de HA solo mostradas en las Fig. 3C y 3D no mostraron una migración celular significativa.

Las Fig. 4A y 4B muestran una imagen de fluorescencia y la superposición (Fig. 4A) con imagen de contraste de fase (Fig. 4B) que contrasta con las CMA que migran de esferoides a lo largo de las nanofibras de 650 nm alineadas 101, que muestran su fuerte respuesta migratoria a la presencia de nanofibras 101.

Ejemplo 1: Preparación de nanofibras con péptidos modificados en la superficie (materiales compuestos de nanofibra-hidrogel).

(A) Electrohilado de fibras de policaprolactona (PCL). Se produjeron láminas de nanofibras aleatorias por electrohilado de PCL. La disolución de hilado se preparó como una PCL al 16 % p/p (85 % de PCL de Mn 45.000, 15 % de PCL de Mn 80.000, ambas de Sigma) en una mezcla de disolventes de diclorometano y dimetilformamida (9:1, p/p). Las fibras se hilaron a una tasa de 5,25 ml/h a través de una aguja roma de calibre 27 separada 10 cm de la cara de la rueca a tierra, que hilaba a 1.000 rpm. La tensión aplicada fue 15 kV y la bomba de electrohilado barrió de un lado a otro la distancia de desplazamiento de 85 mm durante 140 pases a 2 mm/s (aproximadamente 4 h). Entonces se cortó la lámina de fibras en láminas individuales de 14 cm de diámetro para la funcionalización. En ciertos casos desvelados previamente, los parámetros de hilado habían incluido el uso de una disolución al 10 % en peso de PCL en 90 %/1 % p/p de D^cM-DMF, a un caudal de 0,6 ml/h a través de una aguja roma de 27 de calibre 15 cm desde la placa metálica objetivo. La tensión de la aguja en dichas realizaciones fue 10 kV, con la placa objetivo negativamente inclinada con una tensión de -3 kV. Se hiló un ml de disolución para cada lámina de nanofibra.

(B) Preparación de fibras funcionalizadas en la superficie con grupos ácido carboxílico. Las fibras se funcionalizaron entonces con un proceso de múltiples etapas. Para funcionalizar superficialmente sobre fibras con péptidos, la superficie de las fibras se introdujo con grupos carboxilo injertando poli(ácido acrílico) (PAA) según la bibliografía con una modificación menor [Interface Focus 2011, 1, 725-733]. Brevemente, se trataron con plasma láminas de fibra bajo una atmósfera de 280 mmHg con oxígeno a temperatura ambiente durante 7 minutos por lado para inducir radicales libres sobre una superficie de las fibras. Entonces se expusieron 300 mg de fibras en 50 ml de disolución al 3 % v/v de ácido acrílico en NaIO30,5 mM a UV (60 mW/cm2, DYMAX Light Curing Systems 5000 Flood, Torrington, CT) durante 90 segundos por lado para la fotopolimerización de PAA sobre la superficie de fibras (fibras de PAA). Después de incubar las fibras de PAA a temperatura ambiente durante 20 min, las fibras de PAA se lavaron 5 veces con agua desionizada para retirar el ácido acrílico sin reaccionar.

(C) Conjugación de péptidos. Para conjugar péptidos con cada grupo de fibra, se añadieron 35 mg de lámina de fibra a un vial de centelleo de vidrio de 7 ml junto con 90 mg de EDC (clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida, número de pieza de Proteochem c 1100) y 70 mg de NHS (N-hidroxisuccinimida, número de pieza de Proteochem c1 101). Se añadieron ocho mg del péptido a cada vial. El primer péptido que se unió a HA tuvo la secuencia GAHWQFNALTVR. El segundo péptido que se unió a HA tuvo la secuencia STMMSRSHKTRSHH. El control de péptido tuvo la secuencia Gh Ta WLQAVRFN, que es una versión mezclada del primer péptido que se une a HA. Se añadieron 6 ml de tampón MES (pH6) a cada vial, que reaccionó durante la noche a temperatura ambiente. Las fibras se lavaron 5x con alcohol isopropílico y agua desionizada, respectivamente, para retirar los reactivos y péptidos sin reaccionar (en ciertos otros casos desvelados, los grupos acrilato podrían reaccionar opcionalmente con EDC y diazimina para formar aminas primarias. Estas aminas se podrían hacer reaccionar con SMCC para unirse a grupos maleimida, que podrían reaccionar fácilmente con los grupos tiol en el hidrogel.)

(D) Criomolienda de nanofibras. En ciertos casos ejemplificados, se molieron las fibras modificadas en la superficie para preparar fragmentos de fibra usando un molino criogénico (Freezer/Mill 6870, SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ) con los siguientes parámetros: 7 ciclos de 1 min para la molienda y 3 min para el enfriamiento en nitrógeno líquido a la tasa de 10 Hz. Se recogieron los fragmentos de fibra y se dispersaron en alcohol isopropílico desenmarañando las fibras bajo flujo de cizallamiento a través de una aguja de calibre 20. Se centrifugó la suspensión de fibras y el sedimento de fibras se resuspendió en agua desionizada. Entonces se ultracongelaron las fibras y se liofilizaron. Entonces se resuspendieron los fragmentos de fibra secados a 25 mg/ml en PBS, listos para ser usados en la formación de materiales compuestos.

En ciertos casos previos, se molieron las fibras modificadas en la superficie para preparar fragmentos de fibras usando un mortero cerámico. Para la criomolienda usando un mortero, se cortó la malla de fibra funcionalizada en secciones de 60 mg o menos. Se empapó una muestra de 60 mg en etanol, y entonces se añadió al mortero cerámico que se había llenado parcialmente con nitrógeno líquido. La muestra de fibra se volverá muy rígida. Manteniendo la muestra lo suficientemente fría para mantener la rigidez, la lámina de fibras se corta con tijeras en secciones de ~5 mm x 5 mm. Cuando se ha cortado toda la hoja, las fibras se muelen con el mortero y la mano durante ~20 min, manteniendo el mortero parcialmente lleno de nitrógeno líquido. Entonces se vierte la suspensión de fibras en etanol. Se añade aproximadamente 1 mg de tensioactivo a la suspensión para ayudar a prevenir el enmarañamiento de fibras. La suspensión se centrifuga durante 30 min a 300 g, y el sobrenadante se desecha. Las fibras se dejan secar durante la noche. Entonces se pesan las fibras en un tubo de centrifugadora secundario, de manera que se pueda suspender una concentración precisa de fibras. Entonces se empapan las fibras en etanol para esterilizarlas, se centrifugan, se desecha el sobrenadante y se dejan secar durante la noche en una vitrina de seguridad biológica. Entonces se resuspenden las fibras hasta la concentración deseada en agua desionizada, normalmente 15 mg/ml.

(E) Preparación y reología de materiales compuestos. En ciertos aspectos, cada material compuesto tuvo la misma formulación de 4 mg/ml de ácido hialurónico tiolado (HA-SH, número de pieza de ESI-Bio GS220) y 5 mg/ml de PEG-DA (número de pieza de ESI-Bio GS700). Se fijó la concentración de fibra a 10 mg/ml para todos aquellos grupos. Cada formulación se dispensó inmediatamente en 4 moldes cada una, con 130 microlitros por molde. Los moldes tuvieron orificios cilíndricos de 8 mm de diámetro en PDMS hechos con un punzón de biopsia. Entonces se dejó que gelificaran las formulaciones de gel durante la noche en la estufa de incubación a 37 °C. Entonces se sacaron los geles de los moldes y se probaron en un reómetro oscilante (ARES-02 Rheometer, TA Instruments, New Castle, DE). Los geles se probaron con una placa paralela lisa de 8 mm de diámetro a una altura de 1,5 mm. Las muestras se probaron cada una primero por un barrido de frecuencias desde 0,1 Hz hasta 1 Hz al 1 % de deformación. Entonces se probaron inmediatamente las muestras para un barrido de amplitudes desde el 0,1 hasta el 10 % de deformación (Figura 23). El módulo elástico se determinó promediando los valores obtenidos del barrido de amplitudes desde el 0,7 % hasta el 1,3 %.

En ciertos otros casos, para formar el material compuesto de hidrogel, se usó 1 ml de la suspensión de fibras para rehidratar 1 vial de HA-SH, dando como resultado una disolución de 15 mg/ml de fibras y 10 mg/ml de HA-SH. A 900 pl de esta disolución, se añadió 100 pl de 10 % de disolución madre de PEG-DA, dando una concentración final de 13,6 mg/ml de fibra, 9 mg/ml de ácido hialurónico y 10 mg/ml de PEG-DA. Esta es la formulación para los ejemplos iniciales in vivo, pero se han preparado otras formulaciones variando las concentraciones de constituyentes.

Los materiales compuestos resultantes de dichos casos fueron de color blanco lechoso (Fig. 1C), a diferencia de los hidrogeles transparentes sin las fibras. Los geles de material compuesto mantuvieron su forma y tuvieron buena manejabilidad, mientras que el grupo de hidrogel solo fue más propenso al rasgado. Las fibras en el hidrogel fueron dispersas y oscilaron en longitud de decenas a centenas de micrómetros (Fig. 1B). Una imagen de SEM de sección transversal de un material compuesto de muestra fracturada liofilizada muestra la estrecha asociación entre las fibras y el componente de hidrogel, así como la elevada densidad de fibras dispersadas (Fig. 1D).

MATERIALES Y MÉTODOS

Se compró ácido hialurónico (HA) tiolado de ESI BIO (Alameda, CA). Se compraron diacrilatos de poli(etilenglicol) de Laysan Bio, Inc (Arab, AL). Se obtuvieron los siguientes de Sigma; poli(e-caprolatona), etilamino-maleimida, ácido acrílico, azul de toluidina o, N-hidroxisuccinimida (NHS), cisteína, albúmina de suero bovino (BSA), ácido acético y Triton™ X-100. Se compraron medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS), penicilina/estreptomicina, la faloidina Alexa Fluor® 568 y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de Invitrogen Life Technologies. Se obtuvo etil(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) de AnaSpec, Inc. (Fremont, CA). Todos los otros productos químicos y reactivos fueron de calidades analíticas.

Electrohilado de nanofibras de PCL para experimentos de reología:

Para fabricar dos diámetros diferentes de fibras de PCL, se prepararon disolución al 11,0 y 8,5 % (p/v) de PCL en una mezcla de diclorometano y dimetilformamida (9:1, v/v) y una mezcla de cloroformo y metanol (3:1, v/v), respectivamente. Cada disolución homogénea de PCL se cargó en una jeringa con una aguja metálica de 27 G. Entonces se realizó el electrohilado con los siguientes parámetros; 1,0 ml/h de tasa de alimentación, 15 kV de una tensión positiva aplicada para una aguja metálica y 12 cm de una distancia entre el extremo de una aguja a tierra. Se observó la morfología de las fibras usando un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FESEM, JEOL 6700F) y se midió un diámetro de fibras con imágenes FESEM usando el software ImageJ (US National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Electrohilado para materiales compuestos in vivo:

Condiciones de hilado: 16 % p/v de PCL (95 % de PCL de Mn de 45.000, 5 % de PCL de Mn de 80.000, ambos de Sigma) en una mezcla de disolventes de diclorometano y dimetilformamida (9:1, p/p). Las fibras se hilaron a una tasa de 5,25 ml/h a través de una aguja roma de 27 de calibre separada 10 cm de la cara de la rueca a tierra, hilado a 1000 rpm. La tensión aplicada fue 15 kV y la bomba de electrohilado barrió de un lado a otro la distancia de desplazamiento de 85 mm durante 140 pases a 2 mm/s (aproximadamente 4 h). Entonces se cortó la lámina de fibras en hojas individuales de 14 cm de diámetro para la funcionalización.

Preparación de fibras funcionalizadas en la superficie con MAL:

Para funcionalizar en la superficie sobre fibras con MAL, se indujo una superficie de fibras con grupos carboxilo injertando poli(ácido acrílico) (PAA) según la bibliografía con una modificación menor [Interface Focus 2011, 1, 725 733]. Brevemente, las fibras se trataron con plasma a 280 mmHg con una atmósfera de oxígeno a temperatura ambiente durante 10 min para inducir radicales libres sobre una superficie de fibras. Entonces se expusieron 70 mg de fibras en 10 ml de disolución al 3 o 10 % (v/v) de ácido acrílico en NaIO30,5 mM a UV (36 mW/cm2, DYMAX Light Curing Systems 5000 Flood, Torrington, CT) durante 90 s para la fotopolimerización de PAA sobre la superficie de fibras (fibras de PAA). Después de incubar las fibras de PAA a temperatura ambiente durante 20 min, las fibras de PAA se lavaron con 20 ml de agua desionizada tres veces para retirar el ácido acrílico sin reaccionar. Después de secar completamente al aire las fibras de PAA, se determinó una densidad de grupos carboxilo sobre las fibras de PAA por el ensayo de azul de toluidina O (TBO) con la suposición de que TBO interactúa con un grupo carboxilo sobre fibras en 1:1 de relación molar [J Biomed Mater Res 2003, 67, 1093-1104]. Brevemente, se sumergieron completamente fibras de PAA (1 x 1 cm2) en 1 ml de disolución 0,5 mM de TBO en 0,1 mM de NaOH (pH 10) después de empapar en 20 pl de etanol al 50 % (v/v) y hacer reaccionar con agitación suave a temperatura ambiente durante 5 h. Después de lavarlas con NaOH 0,1 mM (pH 10), se desorbió el TBO adsorbido sobre una superficie de fibras de PAA usando 1 ml de ácido acético al 50 % (v/v) con agitación vigorosa a temperatura ambiente durante 1 h. Entonces se midió una densidad óptica del sobrenadante a 633 nm usando un lector de microplacas (BioTeck Synergy2, Winooski, VT). Se usó TBO en ácido acético al 50 % (v/v) como patrón.

Se molieron las fibras de PAA para preparar fragmentos de fibra usando un molino criogénico (Freezer/Mill 6770, SPEX SamplePrep, Metuchen, NJ) con los siguientes parámetros; 10 ciclos de 1 min para la molienda y 3 min para el enfriamiento en nitrógeno líquido. Después de recoger los fragmentos de fibra de PAA en un tubo cónico de 50 ml, los fragmentos de fibras de PAA se dispersaron completamente en 10 ml de una mezcla de alcohol isopropílico y agua destilada (1:1, v/v) para modificar con aminoetil-MAL sobre una superficie de fibras. Brevemente, se añadieron fibras de PAA a NHS y EDC para activar los grupos carboxilo de PAA sobre las fibras. Una relación molar entre grupo carboxilo y NHS y EDC fue 1 a 4 y 4, respectivamente. La activación se realizó agitando suavemente a temperatura ambiente. Después de 1 h, se añadió aminoetil-MAL a las fibras activadas con grupos carboxilo con 1 a 2 de relación molar entre grupos carboxilo y aminoetil-MAL. Entonces, la reacción se realizó agitando suavemente a temperatura ambiente durante 12 h. Se liofilizaron las fibras funcionalizadas en la superficie con MAL después de lavar con agua destilada tres veces. Aquí, una densidad de MAL sobre las fibras fue con la suposición de que todos los grupos carboxilo sobre una superficie de fibras estuvieron completamente sustituidos con MAL.

Preparación de materiales compuestos de fibra-hidrogel de HA:

Para preparar un material compuesto de fibra-hidrogel de HA, se disolvieron completamente HA-SH y PEG-DA en PBS (pH 7,4) hasta la concentración deseada de 12,5 mg/ml y 100 mg/ml, respectivamente. Las fibras de MAL con la concentración deseada de 25 mg/ml se dispersaron completamente en PBS (pH 7,4). La suspensión de nanofibras, HA-SH, PEG-DA y PBS se añadieron entonces sucesivamente para alcanzar la concentración final deseada de la formulación. Después de mezclar homogéneamente la disolución de precursor de material compuesto, para estudios reológicos, se vertió 100 pl de la disolución de precursor de material compuesto en un molde (O = 8 mm) y se incubó a 37 °C durante 2 h para la gelificación. Para los estudios de compresión, se añadieron 200 pl de disolución de precursor a un molde cilindrico de teflón (O = 6,35 mm, h = 6,35 mm) y se incubó como antes. Para observar la morfología de la sección transversal de un material compuesto de fibra-hidrogel de HA e hidrogel de HA usando FESEM, se deshidrataron un material compuesto e hidrogel de HA por lavado sucesivo con etanol (10 min de cada uno al 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % y 100 % de etanol) antes de o el secado en el punto crítico (Samdri-795, Tousimis, Rockvillle, MD) o el secado químico (HDMS). Las muestras se fracturaron por congelación en nitrógeno líquido para revelar la estructura de poros internos. La estructura se recubrió por pulverización con una capa de platino de 10 nm (Hummer 6.2 Sputter System, Anatech UDA, Hayward, CA), luego se obtuvieron imágenes con un SEM de campo de emisión (JEOL 6700F, Tokio, Japón).

Para la preparación de los materiales compuestos para los estudios in vivo en animales, se reconstituyó el HA-SH hasta 12,5 mg/ml en PBS. Se disolvió PEG-DA hasta 100 mg/ml en PBS. Las fibras de MAL se resuspendieron hasta 25 mg/ml en PBS estéril. Las fibras se combinaron en primer lugar con la disolución de HA-SH y se dejó que reaccionaran durante 10 min antes de combinarse con PEG-DA para obtener las concentraciones finales deseadas. La suspensión se pipeteó entonces inmediatamente en los moldes cilíndricos de teflón (McMaster-Carr, Robbinsville, NJ) con 300 pl en moldes cilíndricos de 11,125 mm de diámetro y 3 mm de altura para las muestras in vivo. Entonces se colocaron los geles en la estufa de incubación a 37 °C para gelificar durante la noche.

Para confirmar el efecto de la unión interfacial entre grupos tiol de HA y MAL sobre las fibras, se inactivó MAL sobre las fibras usando cisteína para preparar un material compuesto de fibra-hidrogel de HA inactivado. Brevemente, se dispersó 1 mg de fibras en 1 ml de disolución de cisteína en PBS (pH 8,0), entonces la relación molar entre MAL y cisteína fue 1 a 2. Después de inactivar la MAL con agitación suave a temperatura ambiente durante 12 h, las fibras inactivadas con MAL se lavaron cinco veces con 1 ml de agua destilada para retirar la cisteína sin reaccionar y se liofilizaron.

Propiedades mecánicas de materiales compuestos de fibras-hidrogel de HA:

Prueba de compresión. Se pipeteó la suspensión de precursor de hidrogel en los moldes cilíndricos de teflón (McMaster-Carr, Robbinsville, NJ), con 200 pl en moldes cilíndricos de 6,35 mm de diámetro y 6,35 mm de altura para la prueba de compresión. Entonces se colocaron los geles en la estufa de incubación a 37 °C para gelificar durante la noche. Los geles se sacaron de sus moldes y se probaron inmediatamente por compresión uniaxial no confinada entre dos placas paralelas con el medidor mecánico de Endura TEC ELF 3200 Series, BOSE ElectroForce, Eden Prairie, MN). Las muestras se comprimieron hasta el 50 % de deformación, determinándose el módulo elástico a partir de la pendiente de la porción lineal de la curva de esfuerzo-deformación desde el 10 % hasta el 20 % de deformación. Las muestras se probaron tres veces cada una, y se probaron tres muestras por grupo para determinar el módulo de compresión promedio. Para medir el módulo de compresión de materiales compuestos de fibra-hidrogel de HA rehidratados, los materiales compuestos se liofilizaron y se rehidrataron con 1 ml de PBS (pH 7,4) a 37 °C durante 24 h. Para la prueba de fatiga, las muestras de compresión se sometieron repetidamente a ciclos desde el 0 % hasta el 25 % de deformación a 0,1 Hz.

Prueba reológica. Se midió el módulo de almacenamiento por cizallamiento (G') de diversos materiales compuestos de fibra-HA usando un reómetro oscilatorio (reómetro ARES-G2, TA Instruments, New Castle, DE) con una placa paralela (O = 8 mm). Se empleó un barrido de frecuencia oscilatoria para monitorizar la variación de G' desde 1 Hz hasta 10 Hz con deformación constante del 10 %.

Migración de CMAh en materiales compuestos de fibra-hidrogel de HA:

Se cultivaron células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) en DMEM alto en glucosa que contenía 10 % de FBS, 1 % de penicilina/estreptomicina y 1 ng/ml de bFGF. El medio de cultivo se intercambió tres veces por semana para el crecimiento óptimo. Para preparar esferoides de CMAh, se vertió 50 gl de disolución de CMAh (5,6 x 105 células/ml) en un gel de agarosa micromoldeado colado (esferoides de micromolde MicroTissues® 3D Petri Dish®, 96 orificios) para preparar esferoides de CMAh y se incubó agitando suavemente a 37 °C durante 24 h.

Se disolvieron completamente HA-SH y PEG-DA en PBS (pH 7,4) con concentración final de 4,5 y 2,5 mg/ml para HA y 5,0 mg/ml para PEG-DA. Las fibras previamente humedecidas con 20 gl de 50 % (v/v) de etanol se dispersaron completamente en PEG-DA con concentración final de 10,0 mg/ml, luego se añadió HA-SH a una mezcla de fibras y PEG-DA. Se vertieron treinta gl de disolución de precursor de material compuesto en cada pocillo de una placa de cultivo de tejido de 96 pocillos y se incubaron para reticular a 37 °C durante 1 h para evitar conseguir esferoides de CMAh sobre una superficie de placa de cultivo de tejido. Entonces se vertieron 50 gl de disolución de precursor de material compuesto con 3 ~ 5 de esferoides de CMAh en cada pocillo. Después de reticular a 37 °C durante 1 h, se añadieron 200 gl de medio nuevo a cada pocillo y el medio se intercambió cada par de días. Para observar células migradas de esferoides de CMAh en el interior de los materiales compuestos, se tiñeron F-actina y núcleos de CMAh con la faloidina Alexa Fluor® 568 y DAPI, respectivamente. Brevemente, después de 4 días de cultivo, los materiales compuestos con esferoides de CMAh se fijaron con 100 gl de paraformamida al 4 % (v/v) a temperatura ambiente durante la noche. Entonces, después de lavar tres veces con PBS (pH 7,4), los materiales compuestos se incubaron con 100 gl de BSA al 1 % (p/v) en PBS para inhibir la tinción no específica a 4 °C durante la noche y se lavó tres veces con PBS. Posteriormente, los materiales compuestos se incubaron con 100 gl de Triton-X 100 al 0,1 % (v/v) en PBS a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar tres veces con PBS, se añadieron 100 gl de la faloidina Alexa Fluor® 568 160 nM a cada material compuesto y se incubó a temperatura ambiente durante 4 h. Entonces, después de retirar el sobrenadante, los materiales compuestos se incubaron con 100 gl de 0,5 gg/ml de DAPI a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar tres veces con PBS, las CMAh migradas se observaron usando microscopio confocal láser de barrido (CLSM, Carl Zeiss LSM780, Alemania) a ex. 561 nm y em. 570-600 nm para la faloidina Alexa Fluor® 568, y ex. 405 nm y em. 385-420 nm para DAPI.

Rendimiento de un material compuesto de fibra-hidrogel in vivo:

Se reconstituyó HA-SH a 12,5 mg/ml en PBS. PEG-DA se disolvió hasta 100 mg/ml en PBS. Las fibras de MAL se resuspendieron hasta 25 mg/ml en PBS estéril. Las fibras se combinaron en primer lugar con la disolución de HA y se dejó que reaccionaran durante 10 min antes combinarse con PEG-DA para obtener las concentraciones finales deseadas. La suspensión se pipeteó entonces inmediatamente en los moldes cilíndricos de teflón (McMaster-Carr, Robbinsville, NJ), con 300 gl en moldes cilíndricos de 11,125 mm de diámetro y 3 mm de altura. Entonces se dispusieron los geles en la estufa de incubación a 37 °C para gelificar durante la noche. Las dos formulaciones se seleccionaron de manera que correspondieran con la rigidez de 2 kPa del tejido adiposo. La formulación de solo HA fue 10 mg/ml de PEG-DA y 9 mg/ml de HA-SH, y la formulación de material compuesto de HA-fibra fue 5 mg/ml de PEG-DA, 5 mg/ml de HA-SH y 12,5 mg/ml de nanofibras dispersadas.

Para estudiar la biocompatibilidad de los armazones de nanomateriales de material compuesto, se implantaron bajo los cuerpos adiposos inguinales de ratas Sprague-Dawley y se observaron durante duraciones de tiempo variables. Con anestesia volátil, se hizo una incisión de 1 cm justo proximal al pliegue inguinal bilateralmente. Tras la disección roma de tejidos subcutáneos, se expuso el cuerpo adiposo inguinal. Se elevó con hemostasis meticulosa usando electrocauterio y con conservación cuidadosa de los vasos nutricios. Los armazones se implantaron bajo el cuerpo adiposo en el lado derecho del animal. El lado izquierdo no recibió implante y sirvió de control de cirugía simulada. Ambos lados se cerraron en un modo en capas habitual. Los animales se observaron durante 7, 14, 30 y 90 días. En los momentos de tiempo de recogida, los animales se sacrificaron y se expuso el cuerpo adiposo inguinal con y sin armazones y se fijó en 4 % de PFA. Los especímenes se incorporaron y seccionaron para tinción habitual con hematoxilina y eosina.

Análisis estadístico

Todos los resultados se expresan en valores medios y la desviación estándar. La significación estadística entre un par de grupos se determinó realizando un ANOVA unilateral con el software SigmaPlot 12.0 (SPSS); un valor de p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

En el presente documento se contempla cualquier otro método adecuado para la realización de realizaciones del material compuesto 100 como se desvela en el presente documento.

Ejemplo 2: Prueba de compresión del material compuesto de nanofibra-hidrogel

Para la prueba de compresión, las muestras de fibra-hidrogel se conformaron en cilindros de 8,5 mm de diámetro y ~4 mm de altura, se dejó que fraguaran durante la noche en moldes a 37 °C. Se determinaron los módulos elásticos por prueba de compresión con un Bose EnduraTEC ELF 3200 (Eden Prairie, MN). La muestra se sometió a compresión uniaxial entre dos placas paralelas, se comprimió a hasta el 50 % de deformación. Los módulos elásticos se determinaron midiendo la pendiente de la región lineal inicial. Se probaron dos muestras, con las mismas formulaciones de hidrogel, con y sin fibras. La muestra de solo hidrogel se formó con 4,5 mg/ml de HA-SH y 10 mg/ml de PEG-DA (diacrilato de polietilglicol, peso molecular 3350). El grupo de material compuesto de fibra-hidrogel tuvo las mismas concentraciones de hidrogel, pero además tuvo 6,75 mg/ml de nanofibras de PCL que tenían una superficie funcionalizada con grupos maleimida que pueden reaccionar fácilmente con el ácido hialurónico tiolado.

Se pueden observar trazados de esfuerzo-deformación representativos en la Fig. 2A. El grupo de solo hidrogel tuvo un módulo elástico de 320 Pa, mientras que el material compuesto de fibra-hidrogel tuvo un mayor módulo de 750 Pa. La elevada rigidez del material compuesto de fibra-hidrogel se puede observar en los mayores valores de esfuerzo en cada valor de deformación. La presencia de nanofibras funcionalizadas aumentó enormemente la resistencia y la rigidez del material. Por lo tanto, la estructura global del material compuesto puede tener una rigidez que se corresponde con la del tejido diana, mientras que el componente de hidrogel puede tener una menor densidad de reticulación que la densidad que se necesitaría para lograr la misma rigidez sin el beneficio de las nanofibras. Esto daría una mejor respuesta celular para una rigidez dada del implante.

Entonces se probaron los grupos de muestra por compresión repetida hasta el 25 % de deformación (20 ciclos) a 0,1 Hz. Las trazas representativas se pueden observar en la Fig. 2B. Esto muestra que los hidrogeles y los materiales compuestos pueden tolerar compresión repetida, y que el material compuesto es persistentemente más rígido que el grupo sin fibra.

Ejemplo 3: Interacción de células-materiales.

Para probar la respuesta celular al hidrogel del material compuesto, se probó el potencial migratorio de células madre derivadas de tejido adiposo (CMA) en formulaciones variables de hidrogeles, con y sin fibras.

Las CMA se transfectaron para expresar GFP, luego se conformaron en agrupaciones de esferoides por siembra de las células durante la noche en moldes de alginato fabricados por moldes de microtejidos. Las células se sembraron como esferoides para evaluar mejor la motilidad celular, ya que los esferoides son una fuente de puntos distinta de la que se pueden medir fácilmente las células migratorias. Los esferoides se mezclaron con el hidrogel antes ser pipeteados en una placa de 96 pocillos y dejar que fraguaran. Entonces se obtuvieron imágenes de las células durante los siguientes días para observar su migración. Las células fueron capaces de migrar cada vez más a medida que se redujeron las concentraciones de ácido hialurónico y PEG-DA, debido a los tamaños de poro respectivamente crecientes. A las mismas densidades de hidrogel (4,5 mg/ml de ácido hialurónico y 2,5 mg/ml de PEG-DA), las células fueron más capaces de migrar en muestras con nanofibras dispersas (12 mg/ml, Fig. 3A y 3B) que sin (como se muestra en las Fig. 3C y 3D). Esto indica que la presencia de nanofibras funcionalizadas no solo mejoró las propiedades mecánicas de las nanofibras, sino que también puede ayudar a mejorar la migración celular.

Para mostrar claramente que las CMA estuvieron fuertemente influidas por la presencia de nanofibras, se cultivaron esferoides de CMA sobre láminas de nanofibras alineadas, sin hidrogel. Después de 96 horas, las células (verdes en las Fig.3C y 3D) migraron claramente de los esferoides a lo largo del mismo eje de las nanofibras alineadas (mostradas en la Fig. 3D).

Ejemplo 4: Compatibilidad de tejidos del material compuesto de nanofibra-hidrogel.

Para estudiar la biocompatibilidad de los armazones de nanomaterial de material compuesto, se implantaron bajo los cuerpos adiposos inguinales ratas Sprague-Dawley y se observaron durante longitudes de tiempo variables. Con anestesia volátil, se hizo una incisión de 1 cm justamente proximal al pliegue inguinal bilateralmente.

La Fig. 5A es una fotografía que muestra el aspecto del material compuesto de nanofibra-hidrogel in situ bajo el cuerpo adiposo inguinal de la rata. La Fig. 5B muestra imágenes de tinción con H&E de secciones de tejidos alrededor del material compuesto recogidas 2 semanas después de la implantación. Se muestran extensiones de células mesenquimatosas eosinófilas teñidas de rosa oscuro que migran en el nanomaterial (teñido de rosa claro).

La Fig. 5C muestra imágenes de tinción con H&E de secciones de tejido recogidas de la interfase de tejido del material compuesto a las 4 semanas, que muestra la infiltración de células. El tejido mesenquimatoso que rodea el sitio de implantación se tiñe de rosa oscuro con eosina. El nanomaterial parece rosa claro. Se pueden observar células mesenquimatosas rosas infiltrantes en la interfase, así como supuestos adipocitos con vacuolas redondas claras.

Tras la disección roma de tejidos subcutáneos, se expuso el cuerpo adiposo inguinal. Se elevó con hemostasia meticulosa usando electrocauterio y con conversación cuidadosa de los vasos nutricios. Los armazones se implantaron bajo el cuerpo adiposo en el lado derecho del animal. El lado izquierdo no recibió implante y sirvió de control de cirugía simulada. Ambos lados se cerraron en un modo en capas habitual. Los animales se observaron durante 2, 4 y 6 semanas. En los momentos de tiempo de recogida, los animales se sacrificaron y se expuso el cuerpo adiposo inguinal con y sin armazones y se fijó en 4 % de PFA. Se incorporaron los especímenes y se seccionaron para tinción con hematoxilina y eosina habitual. En los momentos iniciales (2 semanas), se encontró que células mesenquimatosas del lecho de la herida infiltraban el material, lo que indica que el material tiene porosidad superficial para permitir el crecimiento infiltrante celular nativo (tinción rosa oscura en la Fig. 5B).

Y, lo que es más importante, el crecimiento infiltrante celular se logró incluso en ausencia de factores de crecimiento exógenos. La presencia de células que infiltran el material en vez de simplemente rodearlo distingue este nanomaterial de material compuesto de otros materiales aloplásticos en el uso actual. Los últimos materiales son aislados por cápsula fibrosa y son, por lo tanto, menos deseables para la reconstrucción de tejido blando. En momentos posteriores (4 semanas), el crecimiento infiltrante celular es incluso más evidente con la aparición de áreas vacuolares que pueden representar diferenciación de adipocitos nacientes (tinción rosa oscura y círculos claros en la Fig. 5C).

Ejemplo 5: Diseño de un material compuesto de fibra-hidrogel de HA

Las fibras podrían formar la arquitectura fibrosa que se puede observar frecuentemente en la matriz extracelular nativa, que ayuda en la migración celular y que refuerza las propiedades mecánicas inicialmente bajas del hidrogel. Introduciendo la unión interfacial entre el hidrogel y las fibras (Fig. 6A, Fig. 6B), el material compuesto se refuerza sin disminuir el tamaño de poro promedio ni la porosidad (Fig. 6), que impediría significativamente la migración celular. También se esperaba que las propiedades mecánicas pudieran ser ajustadas controlando la densidad de la unión interfacial entre el hidrogel y la superficie de las fibras. Aquí, las fibras funcionalizadas en la superficie se prepararon con maleimida (MAL) para introducir la unión interfacial con ácido hialurónico tiolado (HA-SH) (Fig. 6). La superficie de fibras electrohiladas de poli(s-caprolactona) (PCL) se trató con plasma de O²para inducir radicales libres sobre su superficie antes del injerto de poli(ácido acrílico) (PAA). Los grupos carboxilo se activaron acoplando reactivos, NHS y EDC, luego se hizo reaccionar N-(2-aminoetil)maleimida con los grupos carboxilo activados (Figura 13). Posteriormente, las fibras funcionalizadas con MAL se introdujeron en la disolución precursora de hidrogel compuesta de HA-SH y PEGDA fabricando un material compuesto de fibra-hidrogel. Los grupos tiol de HA-SH se emplearon para formar un gel por reacción con tanto los grupos de MAL sobre las fibras como los grupos de DA del conector de PEG. Es interesante señalar que una sección transversal de un material compuesto de fibra-hidrogel mostró una estructura 3D fibrosa con una alta porosidad (Fig. 6), en comparación con una sección transversal de hidrogel de HA con una densidad de reticulación similar. Los materiales compuestos resultantes mostraron una distribución homogénea de nanofibras a través de tanto la anchura como la altura del material compuesto, que permite el refuerzo isotrópico. Por tanto, un material compuesto rehidratado de fibra-hidrogel de HA mostró 99,34 % de recuperación de volumen después de la liofilización, mientras que el hidrogel de HA mostró el 70,17 % de recuperación de volumen (Fig. 6D).

Ejemplo 6: Módulo de compresión de un material compuesto de fibra-hidrogel de HA

En primer lugar, se verificó que el material compuesto poseía su máxima rigidez (bajo cizallamiento) cuando los grupos reactivos fueron iguales en una base molar. Los grupos tiol en HA-SH pueden reaccionar con cualquiera de los grupos de MAL sobre las nanofibras o los grupos acrilato sobre PEG-DA, por lo que cuando la relación molar entre SH y (DA+MAL) era aproximadamente 1 a 1, los geles mostraron un módulo de almacenamiento óptimo con cizallamiento. Por lo tanto, esta relación se mantuvo para todos los estudios posteriores. Los geles se sometieron a una prueba de compresión no confinada para evaluar el módulo elástico del hidrogel de HA y los materiales compuestos de fibrahidrogel de HA (Fig. 7). El efecto de refuerzo de las nanofibras funcionalizadas se puede observar en el esfuerzo de compresión cuando se deformaron hasta el 50 % (Fig. 7A). El esfuerzo de compresión fue 3,1 veces superior en el grupo de fibras de 1,0 gm que en el grupo de solo hidrogel, que muestra el efecto del refuerzo mecánico. El grupo de fibra de 286 nm mostró un efecto de refuerzo incluso más pronunciado con un esfuerzo de compresión de 4,2 veces superior al 50 % de deformación. Es interesante señalar que el efecto de rigidización de las fibras de 286 nm se redujo enormemente hasta solo 1,3 veces con respecto al hidrogel cuando los grupos maleimida se inactivaron antes de la gelificación, lo que confirma que la unión interfacial de la fibra al hidrogel es crucial para el efecto de refuerzo de las fibras funcionalizadas. Además, cuando las fibras de 286 nm no se funcionalizaron antes de formar el material compuesto, desapareció el efecto de refuerzo, dando como resultado materiales compuestos apenas más rígidos que el hidrogel solo. El mismo efecto de refuerzo se puede observar cuando se formulan geles más rígidos por la formulación de materiales compuestos con mayores concentraciones de HA y PEG-DA (Figura 7). La unión interfacial también muestra una respuesta a la dosis en su rigidización del gel de material compuesto, ya que añadir progresivamente más grupos maleimida a la superficie de nanofibra da como resultado materiales progresivamente más rígidos que dan más pruebas de la importancia de la unión interfacial. Los materiales compuestos también se probaron para cambios en las propiedades mecánicas antes y después de la deshidratación y la rehidratación. Los geles, con y sin nanofibras funcionalizadas de dos densidades de maleimida diferentes, se probaron mecánicamente con compresión. Entonces se liofilizaron los geles, luego se dejó que se rehidrataran completamente y se probaron para la compresión otra vez. Todas las muestras mantuvieron sus rigideces después de la rehidratación, que indica que los materiales compuestos pueden ser adecuados para su uso clínicamente como un producto liofilizado. Mientras que el gel de HA solo mantuvo aparentemente su rigidez, el propio gel se había compactado significativamente durante el proceso de deshidratación-rehidratación, a diferencia de los grupos que contenían fibra. Los geles de material compuesto también se sometieron a carga cíclica para probar los esfuerzos de la fatiga, con trazas representativas mostradas en la Figura 10. Con carga repetida hasta el 25 % de deformación, los geles del material compuesto mantuvieron sus rigideces con el tiempo y fueron coherentemente más rígidos que el hidrogel solo.

Ejemplo 7: Módulo de almacenamiento por cizallamiento de un material compuesto de fibra-hidrogel de HA

Además del mayor módulo de compresión, los materiales compuestos de fibra-hidrogel de HA mostraron un módulo de almacenamiento por cizallamiento significativamente mayor que el hidrogel de HA solo (Fig. 8A). El módulo de almacenamiento por cizallamiento de un material compuesto con fibras de 286 nm fue superior al de un material compuesto con fibras de 686 nm (Fig. 8C). También se confirmó que el módulo de almacenamiento por cizallamiento de los materiales compuestos aumentó al aumentar la densidad superficial de la maleimida en las fibras de 286 nm, similar al módulo en la prueba de compresión (Fig. 8D). Introduciendo las fibras con 62 nmol/mg de MAL sobre su superficie, el material compuesto mostró un aumento de 1,3 veces en su módulo de almacenamiento por cizallamiento en comparación con el del hidrogel de HA solo. Además, el módulo de almacenamiento por cizallamiento de un material compuesto con 147 nmol/mg de MAL sobre sus fibras aumentó 1,8 veces con respecto al módulo de 62 nmol/mg de grupo MAL, que muestra una clara respuesta a la dosis al aumento de 2,4 veces correspondiente en la densidad superficial de MAL sobre las fibras. Cuando los grupos MAL sobre las fibras se inactivaron antes de la gelificación, el módulo de almacenamiento por cizallamiento disminuyó correspondientemente en comparación con el de las fibras sin inactivar, similarmente a lo que se observó en la prueba de compresión. Además, el módulo de almacenamiento por cizallamiento de los materiales compuestos se mantuvo cuando la frecuencia aumentó hasta 10 Hz, mientras que tanto el hidrogel de HA solo como el material compuesto con fibras inactivadas mostraron módulos de almacenamiento por cizallamiento que disminuían a 10 Hz que a 1 Hz. El módulo de almacenamiento por cizallamiento de los materiales compuestos aumentó al aumentar la densidad superficial de MAL sobre las fibras independientemente del área superficial (diámetro) de las fibras, que indica que el efecto previamente observado de la fibra sobre la rigidez pudo haber sido una función de la densidad de maleimida (Fig. 8D). Se obtuvo una regresión lineal de la correlación entre la densidad superficial de MAL y el módulo de almacenamiento por cizallamiento con R2 = 0,93. Además, los materiales compuestos mostraron una respuesta a la dosis con respecto a la carga de fibra, ya que el módulo de almacenamiento por cizallamiento de los materiales compuestos aumentó con una relación ponderal creciente entre fibras funcionalizadas y componentes de hidrogel (Fig. 9).

Ejemplo 8: Migración celular en un material compuesto de fibra-hidrogel de HA ^{in v itro}

Se planteó la hipótesis de que el material compuesto de fibra-hidrogel de HA potenciara la migración celular en comparación con el hidrogel de HA debido a (i) una mayor porosidad del material compuesto con un mayor tamaño de poro, proporcionando una espaciabilidad para la migración celular cuando tienen las mismas propiedades mecánicas y (ii) una arquitectura fibrosa que imita a la MEC en el material compuesto, lo que permite guiar intrínsicamente la migración celular. Por lo tanto, para demostrar las hipótesis actuales, se sembraron esferoides de células madre derivadas de tejido adiposo humano (CMAh) como una célula modelo y un trozo de tejido imitador en el interior del hidrogel de HA y materiales compuestos, entonces los esferoides de CMAh se cultivaron durante 27 días (Fig. 11). Se eligieron las c Ma debido a su presencia en tejidos adiposos y la importancia en tanto la angiogénesis como la formación de adipocitos. Aunque los materiales compuestos tienen un módulo de Young similar, 1,9 kPa, al hidrogel de HA, el tamaño de poro de los materiales compuestos es 2,08 veces superior al del hidrogel de HA (Fig. 16). Por lo tanto, se observó claramente que las CMAh migraron tridimensionalmente en el interior de los materiales compuestos (Fig. 11B-11E) debido a que los poros más grandes se podrían acomodar para migrar las células, mientras que las CMAh mantuvieron su forma esferoide sin migración celular en el hidrogel de HA (Fig. 11A). En particular, la migración celular mejoró impresionantemente cuando las fibras se modificaron con el péptido de adhesión celular, RGD, para el material compuesto (Fig. 11C). Sin embargo, en el ámbito in vivo, la difusión de factores dentro del material compuesto desde el medio local debe proporcionar señales adhesivas adicionales, que reducen esta diferencia. En algunos casos, las fibras parciales formaron ligeramente un grupo durante la gelificación debido a la interacción hidrófoba entre las fibras de PCL, y se observó que los cuerpos de células agarraban preferentemente los grupos de fibras en el interior de los materiales compuestos (Fig. 11D y 11E). Además, a las mismas concentraciones de HA y PEG-DA (Fig. 19), los materiales compuestos mostraron una migración celular potenciada en comparación con el grupo sin fibras, que muestra que las nanofibras en sí podrían ayudar intrínsecamente a guiar la migración celular independientemente de la porosidad.

Ejemplo 9: Respuesta al tejido e infiltración de tejido hospedador

Para determinar el potencial terapéutico de estos implantes de material compuesto, se probaron in vivo los implantes de material compuesto en un modelo de cuerpo adiposo de rata. Las formulaciones de los grupos de implante se formularon para lograr la misma rigidez inicial de 2 kPa que el gel del material compuesto y el tejido adiposo diana. Por lo tanto, la formulación del implante de gel de HA solo tuvo una mayor concentración de tanto HA tiolado como PEG-DA para corresponderse con la rigidez del grupo de material compuesto de fibra. A pesar de las mayores concentraciones, los implantes de solo HA no fueron capaces de mantener su forma y volumen durante el transcurso del estudio. Con observación macroscópica después de 4 semanas, los implantes de solo HA se estiraron y fueron de volumen significativamente más pequeño. Considerando su aspecto macroscópico y la ausencia histológica de infiltración, el sistema de solo HA no se puede optimizar para ser capaz de fomentar la infiltración de células y mantener una forma predeterminada. Los implantes de material compuesto de fibra-gel, sin embargo, mantuvieron bien su forma original con enorme observación después de 90 días in vivo. Sorprendentemente, sin embargo, con observación histológica, los materiales compuestos habían sido infiltrados tan minuciosamente que la frontera entre el implante y el tejido nativo se había vuelvo difícil de determinar.

Se ha desarrollado un modelo de defecto de tejido blando en ratas Lewis, donde el cuerpo adiposo inguinal se expone y eleva usando técnicas microquirúrgicas y los materiales compuestos preformados se colocan debajo. En un estudio piloto, los materiales compuestos de nanofibra de PCL-hidrogel de HA e hidrogeles de HA se implantaron con módulos similares bajo el cuerpo adiposo inguinal de ratas Lewis macho de 8-12 semanas (n = 3 por momento de tiempo). Tanto los grupos de hidrogel de HA como de material compuesto mostraron buena compatibilidad con el tejido en los días 14 y 30 después del trasplante (Fig. 12, POD 14, observaciones similares en POD 30. POD = fecha posoperatoria). La histología en POD 30 no mostró mayor nivel de respuesta inflamatoria que el grupo de cirugía simulado. La tinción H&E y tricrómica de Masson mostró septación e infiltración celular por grasa nativa a través del material compuesto, formación de capilares alrededor del perímetro y regeneración de porciones glandulares, así como de adipocitos, de grasa nativa (Fig. 12). Por otra parte, el control de hidrogel de HA careció de infiltración celular y formó una lámina delgada de tejido fibrótico y respuesta a cuerpos extraños. Este hidrogel de HA se preparó con 2 kPa para garantizar una propiedad mecánica suficiente. Este resultado subraya la importancia de la porosidad del armazón para la infiltración de células.

En un momento de tiempo temprano (2 semanas), células mesenquimatosas del lecho de la herida se encontraron infiltrando el material, que indica que el material tiene porosidad suficiente para permitir el crecimiento infiltrante celular nativo (tinción rosa oscura en la Fig. 12). Y, lo que es más importante, el crecimiento infiltrante celular se logró incluso en ausencia de factores de crecimiento exógenos. La presencia de células que infiltran el material en vez de simplemente rodearlo distingue este nanomaterial de material compuesto de otros materiales aloplásticos en el uso actual. Los últimos materiales son aislados por la cápsula fibrosa y son, por lo tanto, menos deseables para la reconstrucción de tejido blando. En momentos de tiempo posteriores (4 semanas), el crecimiento infiltrante celular es incluso más evidente con la aparición de áreas vacuolares que pueden representar la diferenciación de adipocitos nacientes.

Ejemplo 10: Formulación heparinizada

También se preparó una formulación de material compuesto con heparina conjugada con el ácido hialurónico. Esta formulación se probó in vivo idénticamente al armazón previamente formado anteriormente. El tejido se recogió (n = 3) en los días 7, 14, 30 y 90. Muchos factores de crecimiento relevantes tienen dominios de unión a heparina, tales como bFGF, PDGF y VEGF. La heparina conjugada puede servir a dos fines; en primer lugar, puede unirse a muchos de los factores de crecimiento endógenos que estarán presentes en el lugar de inyección y sirven de depósito local y señal atractiva para el tejido a regenerar. En segundo lugar, el material compuesto heparinizado se puede usar para precargar el armazón con factores de crecimiento para potenciar mejor la regeneración. Los armazones heparinizados mostraron angiogénesis potenciada en los días 7 y 14 en comparación con los armazones de material compuesto no heparinizados, pero resultados similares en los días 30 y 90.

Ejemplo 11: Formulación inyectable

El material compuesto de hidrogel-nanofibra también se ha formulado en una variante inyectable. Se mezcló 200 gl de la misma composición que se usa para el material compuesto previamente formado usado in vivo (5 mg/ml de HA tiolado, 5 mg/ml de PEG-DA, 12,5 mg/ml de fibras) y se dejó que fraguara parcialmente en la jeringa durante 8-10 min. En este momento, el material compuesto es un líquido fluido viscoso que se puede inyectar a través de una aguja quirúrgica (Fig. 20). Una vez inyectado, el material compuesto mantiene su forma cuando se invierte y es no dispersivo, mantiene la forma y no se hincha / se hincha poco cuando se sumerge en agua. Para probar la biocompatibilidad del material compuesto inyectable, la suspensión se inyecta entonces en el cuerpo adiposo inguinal de la rata a través de una aguja de 21 de calibre. Entonces se recogió el tejido (n = 3) en los días 7, 14, 30 y 90, y se analizó idénticamente a los ejemplos previos. El material compuesto demostró una amplia remodelación celular a los 30 días mientras se mantenía el volumen y sin causar encapsulación fibrótica. Se pueden observar claramente adipocitos en la etapa temprana que se desarrollan dentro del material compuesto.

Ejemplo 12: Discusión de los Ejemplos 5-11

Se han estudiado ampliamente los hidrogeles como material de relleno para la regeneración de defectos de tejido debido a su entorno hidratado 3D y alta porosidad, que facilita la migración de células. Sin embargo, los hidrogeles han demostrado ser malos sustitutos de los defectos volumétricos, debido a que las propiedades mecánicas relativamente débiles del hidrogel son insuficientes para mantener su volumen durante todo el periodo de regeneración del tejido, ya que el hidrogel puede ser fácilmente degradado y se derrumba por líquidos corporales y esfuerzos internos y externos. Para mejorar las propiedades mecánicas del hidrogel, las principales estrategias en el campo han sido (i) aumentar la concentración de precursores de hidrogel, (ii) aumentar la densidad de la red de reticulación en el interior del hidrogel, y (iii) introducir materiales de refuerzo, tales como por incorporación de partículas de hidroxiapatita o laminando con láminas de fibra [Mater Chem Physics, 2008, 107, 364-369, Biomaterials 2006, 27, 505-518, Acta Biomaterialia 2010, 6, 1992-2002]. Desafortunadamente, estas estrategias muy reforzadoras redujeron inherentemente el tamaño de poro promedio y la porosidad del hidrogel resultante, previniendo que las células fueran capaces de migrar en estos hidrogeles. Por lo tanto, se buscó reforzar los hidrogeles por un nuevo mecanismo que todavía retendría la alta porosidad que permitiría la rápida infiltración celular. Se diseñó un material compuesto introduciendo nanofibras funcionalizadas que podían reforzar el material compuesto de hidrogel general mientras que dejaban la fase de hidrogel prácticamente intacta, incluyendo la porosidad. El material compuesto de fibra-hidrogel resultante mejora con respecto a los materiales compuestos de tejido blando previos debido a dos componentes clave. En primer lugar, las nanofibras son necesarias para ser uniformemente dispersadas con un alto nivel de carga dentro del hidrogel para lograr el refuerzo isotrópico. El campo de la ingeniería de tejidos ha utilizado, en general, nanofibras electrohiladas como hojas o esteras planas de fibras. Estas se transforman entonces normalmente en materiales compuestos por impregnación de las esteras con una disolución precursora de hidrogel.

Esto limita enormemente la dispersión de las nanofibras a través del hidrogel y limita la geometría de los materiales compuestos a hojas o tubos 2D. Aunque estas geometrías son útiles para ciertas aplicaciones, tales como la reparación de nervios o apósitos para heridas, son malas elecciones para la reparación de defectos volumétricos. Por criomolienda de las láminas de fibras fue posible reducir la longitud promedio de las fibras a una longitud suficientemente corta que les permite seguir en suspensión en disoluciones acuosas. Por lo tanto, las muestras se pipetearon entonces fácilmente en disoluciones precursoras de hidrogel, creando una dispersión uniforme de fragmentos de nanofibra en todo el volumen del hidrogel antes de la gelificación. La disolución se puede usar entonces directamente como una formulación inyectable, o añadir a moldes para formar geles de armazón de cualquier geometría arbitraria, a diferencia de la geometría plana limitada de la mayoría de las mallas de nanofibras electrohiladas. La estructura de material compuesto de fibras dispersadas dentro de un hidrogel también resume la arquitectura fibrosa de la matriz extracelular (Fig. 6G), proporcionando sitios de adhesión que pueden ayudar en la migración celular dentro del material compuesto.

En segundo lugar, simplemente la dispersión de las nanofibras dentro del hidrogel es insuficiente para formar un material compuesto fuerte. Estos datos indicaron que simplemente la inclusión de las propias nanofibras proporcionó muy poca mejora en el módulo elástico del material compuesto, con mejoras que ocurrieron solo cuando se introdujo la unión interfacial. La unión interfacial es necesaria debido a que sin la formación de un fuerte enlace entre los componentes de hidrogel y fibra, los componentes de agua e hidrogel podrían pasar por encima de los componentes de fibra sin transferir las cargas al material más rígido. Además, la interfase entre dichos materiales dispares podría conducir a la deslaminación y al fallo en el material compuesto. Además, la hidrofobia inicial de la PCL dificulta la dispersión en disoluciones acuosas, ya que las fibras se aglutinan juntas preferentemente y forman coágulos que caen de la suspensión. El tratamiento con plasma y la posterior funcionalización con grupos ácido carboxílico y grupos amina aumenta enormemente la hidrofilia de las fibras y permite la dispersión. El espectacular aumento en las propiedades mecánicas solo ocurrió cuando la unión interfacial ocurrió entre los grupos maleimida sobre las superficies de fibra y los grupos tiol sobre las moléculas de ácido hialurónico. Esta unión de fuerza covalente transfiere las cargas más eficientemente a las fibras durante la compresión o tensión, que conduce a un material más rígido y más fuerte. Además, los materiales compuestos muestran una fuerte tendencia a aumentar los módulos elásticos con densidad de maleimida creciente, enfatizando su prioridad en el mecanismo de refuerzo, así como la naturaleza ajustable del refuerzo.

En este estudio se identificó que era posible ajustar las propiedades mecánicas del material compuesto de fibrahidrogel por diversos factores, que incluyen el área superficial total de las fibras, la densidad de los grupos maleimida funcionales sobre la superficie de la fibra y la cantidad de fibras cargadas en el hidrogel. En primer lugar, los materiales compuestos con diámetro de fibras más pequeño mostraron un mayor módulo de compresión y de almacenamiento por cizallamiento que los de materiales compuestos con mayor diámetro de fibras (Fig. 7A y Fig. 8C). Similarmente, en la bibliografía, una única fibra de polietileno de peso molecular ultra-alto (UHMWPE) (~25 gm), que se activó por plasma usando glutaraldehído, mostró un aumento de aproximadamente 2,36 veces de resistencia al cizallamiento interfacial en un hidrogel de poli(alcohol vinílico) en comparación con el de un haz de fibras de UHMWPE de 60 [Acta Biomaterialia 2014, 10, 3581-3589]. Por lo tanto, es posible disminuir el diámetro de la fibra y, por lo tanto, el aumentar el área superficial específica de la fibra puede ser eficaz en mejorar las propiedades mecánicas del material compuesto. Sin embargo, cada grupo de fibra tuvo una densidad superficial de MAL ligeramente diferente sobre las fibras (aproximadamente 10-15 nmol/mg), por lo que el efecto de área superficial de fibras solo no se puede determinar definitivamente. Por tanto, en segundo lugar, los materiales compuestos se fabricaron con fibras del mismo diámetro, pero con diversas densidades superficiales de MAL sobre las fibras (Fig. 8). Los módulos de compresión y de almacenamiento por cizallamiento de materiales compuestos aumentaron al aumentar la densidad superficial de MAL sobre las fibras. Se confirmó que un material compuesto sin la unión interfacial solo mostró una ligera mejoría de su módulo de compresión (Fig. 7) usando fibras modificadas mediante la etapa de PAA (grupos carboxilo sobre las fibras), pero no las etapas de conjugación de MAL adicionales. La importancia de la unión interfacial se confirmó además por la inactivación de los grupos MAL sobre las fibras con cisteína antes de la gelificación. La cisteína se conjuga con el grupo maleimida y previene la unión interfacial entre las fibras y el hidrogel, que permite aislar solo el efecto de unión interfacial, puesto que las fibras fueron de otro modo procesadas idénticamente con los grupos de unión interfacial. Es interesante señalar que las propiedades mecánicas de los materiales compuestos con las fibras inactivadas con MAL se redujeron espectacularmente (Fig. 7A y Fig. 8B), mostrando el grupo de fibras inactivadas con MAL un menor módulo de compresión que el de hidrogel de HA solo cuando la concentración de HA fue de 10 mg/ml (Fig. 7). Es posible que las fibras inactivadas con MAL debilitaran el material compuesto global por deslaminación fácil en la interfase de las fibras y el hidrogel, como se observa en estudios previos [Acta Biomaterialia 2014, 10, 3581-3589]. Por tanto, puede ser que las fibras sin grupos funcionales actúen como una sustancia extraña que inhibe la gelificación en comparación con un hidrogel compuesto de un componente o sin sustancia extraña durante la gelificación [JMC B 2015, DOI: 10.1039/C3TB21830A, Journal of Biomedical Materials Research Parte A 2010, 95 (2), 564-573]. Además, se verificó una correlación significativa entre el módulo de almacenamiento por cizallamiento y la densidad de la unión interfacial por materiales compuestos con diversas densidades superficiales de MAL (Fig. 8C). Estos estudios proporcionan una fuerte evidencia de que las propiedades mecánicas del hidrogel podrían ser reforzadas y ajustadas por la unión interfacial. En tercer lugar, el módulo de almacenamiento por cizallamiento de los materiales compuestos se potenció con una relación ponderal creciente entre fibras e hidrogel (Fig. 9). Por lo tanto, se confirmó que la relación ponderal era otra variable que se podía usar para ajustar las propiedades mecánicas de un material compuesto de fibra-hidrogel. Sin embargo, aquí, se confirmó que al aumentar la carga de fibra, los aumentos en el módulo de almacenamiento por cizallamiento empezaron a estabilizarse e incluso disminuyeron ligeramente por encima de 0,6 de la relación ponderal. Una posibilidad de este efecto de saturación puede ser que la densidad de unión interfacial de un material compuesto se redujera por cómo el exceso fibras con MAL reaccionó con una gran fracción de grupos tiol del HA, que previene que reaccionen con PEG-DA para la gelificación. Considerando que el módulo de almacenamiento por cizallamiento más alto del hidrogel de HA se obtuvo con una cantidad equimolar de cada grupo funcional de HA-SH y PEG-DA, así como la disminución del módulo de almacenamiento por cizallamiento con cantidades en exceso de o HA-SH o PEG-DA (Fig. 14A), el exceso de MAL sobre las fibras con la cantidad creciente de fibras podría alterar la unión de SH a DA en el interior de un material compuesto.

En general, los biomateriales implantados tienen que resistir a numerosos esfuerzos internos y externos durante la regeneración del defecto de tejido. Aunque el esfuerzo no es intenso ni continuo, las pruebas de resistencia al esfuerzo se realizaron en una condición repetida y una alta frecuencia (10 Hz) para imitar dichos esfuerzos (Fig. 10 y Fig. 8). Tanto el hidrogel de HA como el material compuesto de fibra-hidrogel de HA resistió sin ningún daño ni reducción de su resistencia mecánica durante la deformación de compresión repetida. Claramente, los materiales compuestos con la unión interfacial retuvieron su módulo de almacenamiento por cizallamiento a 10 Hz de frecuencia, mientras que el módulo de almacenamiento por cizallamiento del hidrogel de HA y el material compuesto sin la unión interfacial se redujeron a 10 Hz. Esta tendencia indica que la unión interfacial con las fibras dispersas es esencial para el refuerzo de las propiedades mecánicas del material compuesto. Además, los materiales compuestos de fibra-HA mantuvieron sus dimensiones y sus módulos de Young después de ser sometidos a liofilización y posterior rehidratación, mientras que el gel de solo HA se encogió sustancialmente en el mismo proceso (Fig. 6C y Fig. 10). Este mantenimiento de forma, volumen y rigidez después de la deshidratación y rehidratación es una característica importante de la traducción clínica de esta tecnología, ya que tener una forma liofilizada del material compuesto facilitaría esterilizar y almacenar el producto comercial.

Para la reconstrucción de tejido blando, el armazón implantado ideal rellenaría inmediatamente el vacío del defecto, pero también serviría de un sustrato para que las propias células del cuerpo crecieran en el armazón, proliferaran y se diferenciaran en el fenotipo de tejido apropiado, sustituyendo con el tiempo el armazón artificial con tejido normal y sano. Por lo tanto, es especialmente importante que las células relevantes sean capaces de migrar dentro del hidrogel o armazón de material compuesto. Para determinar las posibilidades de que tipos relevantes de células migren dentro de los armazones, se sembraron esferoides de CMAh en el interior de hidrogeles de HA y materiales compuestos de fibra-HA y se evaluó su migración celular. Las CMAh no migrarían en el interior del hidrogel de solo HA debido a que el hidrogel de HA era demasiado blando para servir a las fuerzas de tracción para la migración celular (Fig. 11A) [Biomaterials 2015, 42, 134-143]. Es interesante señalar que aunque el módulo de almacenamiento por cizallamiento de los materiales compuestos fue similar al del hidrogel de HA, las CMAh fueron capaces de migrar significativamente lejos de un esferoide dentro de los materiales compuestos (Fig. 11). Una hipótesis es que las fibras en el interior de un material compuesto pueden proporcionar sitios de adhesión para guiar la migración celular similarmente a los componentes de fibrilla de la MEC nativa de tejido adiposo. Se demostró previamente que las fibras alineadas y aleatorias podrían ser un factor crítico para la adhesión, proliferación, diferenciación y migración celular en diversos tipos de células [Biomaterials 2005, 26, 2537-2547/2006, 27, 6043-6051/2009, 30, 556-564/2010, 31,9031-9039, Acta Biomaterialia 2013, 9, 7727-7736]. Especialmente se observó que las células reconocieron las fibras como una matriz guía, ya que sus citoesqueletos se alinearon con y siguieron a lo largo de las fibras subyacentes [Biomaterials 2006, 30, 6043-6051/2009,30, 556-564]. Sin embargo, el diámetro de las fibras en el interior de los materiales compuestos no afectó la migración de las células, ya que migraron firmemente en materiales compuestos con nanofibras de 1000 nm o 286 nm (Figura 19).

Los efectos de la porosidad y la migración celular observados en las pruebas de sobremesa y el cultivo celular in vitro se tradujeron en profundas diferencias durante la prueba in vivo de los materiales compuestos. Los hidrogeles formulados para imitar la rigidez de la grasa de 2 kPa sin fibras tuvieron una porosidad demasiado baja para la infiltración celular. La respuesta celular era para aislar el hidrogel con una gruesa capa de colágeno, con la ausencia de infiltración o remodelación típica de una respuesta a cuerpos extraños. Sin embargo, el material compuesto de nanofibra-hidrogel tuvo porosidad suficiente para facilitar el crecimiento infiltrante celular, la vascularización y la remodelación celular sin la respuesta a cuerpos extraños. Esto ofrece la perspectiva de rellenar permanentemente el defecto volumétrico en el cuerpo con lo que por último lugar será el propio tejido del cuerpo. Los resultados fueron incluso más pronunciados en la formulación inyectable, que puede formar una interfase más compacta con el tejido hospedador y mostró signos de robusta adipogénesis.

Conclusión:

La dispersión de nanofibras funcionalizadas dentro de un hidrogel forma una estructura de material compuesto con las resistencias combinadas de los dos componentes. La unión interfacial entre las nanofibras y los componentes de hidrogel es esencial para preparar un fuerte material compuesto, mientras se mantiene la alta porosidad y tamaño de poro para facilitar el crecimiento infiltrante de tejido y células. Las propiedades del material compuesto resultante pueden ser fácilmente ajustadas variando el diámetro de la fibra, el nivel de carga de fibras, el nivel de densidad de maleimida y los niveles de carga de componentes de hidrogel. Esto permite reducir la reticulación y la porosidad más alta con una rigidez general elegida, que aumenta la infiltración celular y la posterior remodelación de tejido. Las fibras por sí mismas también pueden mejorar directamente la migración celular, proporcionando sitios de adhesión similares a los observados en la MEC nativa. El implante de material compuesto resultante puede ser ajustado para corresponderse con la rigidez de tejido adiposo nativo, pero siguen existiendo la permeabilidad para la infiltración celular y la remodelación. Este novedoso material compuesto es lo suficientemente fuerte como para llenar inmediatamente un defecto volumétrico de cualquier forma arbitraria. El implante de material compuesto sirve entonces de armazón permisivo para que las propias células del cuerpo se infiltren en el material compuesto, formen vasos sanguíneos y se diferencien en células como adipocitos. El armazón será lentamente degradado durante la remodelación del tejido, hasta que el vacío del defecto inicial se haya sustituido completamente por tejido normal y sano. La estructura de material compuesto tiene grandes posibilidades de potencial de cirugía reconstructiva y estética.

Ejemplo 13. Mediciones de propiedades mecánicas de material(es) compuesto(s) formado(s) con nanofibras funcionalizadas con el péptido 1 que se une a HA.

El material compuesto formado con nanofibras funcionalizadas con el péptido 1 que se une a HA produjo un material compuesto significativamente más rígido que el formado con nanofibras no tratadas, con un 32 % de aumento en el módulo de almacenamiento (226 Pa frente a 171 Pa para el grupo de fibras no tratadas, p < 0,05). Además, el módulo de almacenamiento del grupo de péptido 1 que se une a HA fue superior al del grupo de péptidos mezclados (p < 0,05), lo que muestra que la potenciación es debida a la secuencia específica (Fig. 24).

Ejemplo 14. Compatibilidad con y potenciamiento de materiales de relleno dérmicos existentes

Para demostrar la compatibilidad con y el potenciamiento de los materiales de relleno dérmicos existentes, se funcionalizaron en la superficie las nanofibras con péptido de unión a HA GAHWQFNALTVR y se añadieron a un material de relleno basado en ácido hialurónico comercial, Juvederm Voluma (Fig. 25). Se mezcló cinco mg de fragmentos de nanofibra con 0,5 ml de Juvederm Voluma dando una concentración de 10 mg/ml de nanofibras y 20 mg/ml de ácido hialurónico. Se probó una alícuota de 200 microlitros de esta formulación en el reómetro TA g 2 Ares con una placa lisa de 25 mm de diámetro a una altura de 0,35 mm. Las muestras se probaron cada una en primer lugar por un barrido de frecuencia desde 0,1 Hz hasta 10 Hz al 1 % de deformación. Las muestras se probaron entonces inmediatamente para un barrido de amplitud desde el 0,1 hasta el 10 % de deformación. El módulo elástico se determinó promediando los valores obtenidos del barrido de amplitud desde el 0,7 % hasta el 1,3 %. El material compuesto formado con las nanofibras funcionalizadas con el péptido que se une a HA produjo un material compuesto más rígido que Voluma solo, con un aumento del 17 % en el módulo de almacenamiento (317 Pa frente a 271 Pa para Voluma solo; Fig. 26).

Ejemplo 15. Producción y uso de complejos de armazón

Se pueden crear complejos de armazón a partir de la combinación de una fibra polimérica y un "resto de unión a hidrogel'', que significa un componente capaz de unión al hidrogel. Se sintetiza una composición de fibras poliméricas, o se modifica después de la síntesis, para aceptar un resto de unión a hidrogel. Los restos de unión a hidrogel a modo de ejemplo incluyen péptidos, anticuerpos y similares. Alternativamente, el resto de unión a hidrogel comprende un anticuerpo, polipéptido de tipo anticuerpo, o aptámero. Por ejemplo, un resto de unión a hidrogel comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en péptidos que se unen a ácido hialurónico seleccionados de CRRDDGAHWQFNALTVR (opcionalmente GAHWQFNALTVR), LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN y STMMSRSHKTRSHHV (opcionalmente STMMSRSHKTRSHH) o el péptido que se une a colágeno GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM, o variantes o fragmentos de los mismos. El resto de unión a hidrogel se asocia covalentemente o no covalentemente con la fibra polimérica.

Los complejos de armazón se incorporan entonces en un dispositivo médico útil en construir o reconstruir tejido, como se describe en el presente documento. Dichos dispositivos médicos son de un tamaño y forma tal que pueden ser fácilmente inyectados (por ejemplo, como un gel) o implantados (es decir, insertados) en un sujeto humano en o proximales al sitio de un defecto de tejido (por ejemplo, en el sitio de tratamiento quirúrgico).

Opcionalmente, estas formulaciones inyectables se preparan de forma que no necesiten gelificarse in situ. Como se proporcionó anteriormente, tras una etapa de conjugación de maleimida (MAL), el grupo MAL se hace reaccionar para la unión con uno o más péptidos que se unen a HA.

Se proporcionan secuencias de péptidos cortas que se pueden unir específicamente, pero no covalentemente, con ácido hialurónico, colágeno, hidroxiapatita y más. Estos péptidos se usan como terapéuticos, tal como para inhibir la infección durante la cicatrización (véase Zaleski, Kathleen J., et al. "Hyaluronic acid binding peptides prevent experimental staphylococcal wound infection". Antimicrobial Agents and Chemotherapy 50.11 (2006): 3856-3860). Proteínas tales como RHAMM, cdc37, SPACR y otras se unen a HA por un motivo de 9 a 11 aminoácidos de la forma B-X⁷-B, siendo B el aminoácido básico lisina o arginina y representando X aminoácidos no ácidos. HABP35 es la secuencia del dominio I de unión a HA de RHAMM de ratón, seguida por la secuencia del dominio II de unión a HA de RHAMM de ratón. HABP35 se sintetiza para incluir tanto los dominios I como II separados por un conector, y contiene cuatro motivos B-X⁷-B. Se ha mostrado que Pep-1 (es decir, HABP52) se une al ácido hialurónico (HA) con alta afinidad e inhibe la adhesión de leucocitos con H^a. Este péptido carece de similitud con los motivos de unión de HA tratados anteriormente, en tal caso 2 de los 16 aminoácidos son básicos. A diferencia, HABP35 posee 11 de los 27 restos básicos, que pueden ayudar a contribuir a la unión iónica de este péptido con HA negativamente cargado.

En una realización, el péptido de unión a HA se une con la superficie de un dispositivo para mejorar la molestia del que lo lleva, proporcionando una capa superficial de HA sobre el cristalino (documentos de patente WO 2014071132 A1; WO2013110056 A1; Singh (2014). Enhanced lubrication on tissue and biomaterial surfaces through peptidemediated binding of hyaluronic acid. Nature Materials, 13(10), 988-995. doi:10.1038/nmat4048. Además, se desvelan péptidos que se unen a colágeno, tales como el motivo de unión a colágeno (CBM, GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM) (véase Lee, J.-Y., et al. "Assembly of collagen-binding peptide with collagen as a bioactive scaffold for osteogenesis in vitro and in vivo." Biomaterials 28.29 (2007): 4257-4267.)

En ciertas realizaciones, las longitudes de nanofibra individuales se modifican para tener longitudes progresivamente más cortas a tiempo de criomolienda creciente. Los materiales compuestos de fibras más grandes son más difíciles de inyectar a través de una aguja de calibre dado cuando se forman ovillos de nanofibras que son en total demasiado grandes como para pasar a través de la cánula. Este enmarañamiento es una función de múltiples factores, que incluyen la longitud de la fibra (fibras más largas), hidrofobia de la fibra (las fibras hidrófobas se aglomeran juntas preferentemente para minimizar las interacciones termodinámicamente desfavorables entre la superficie hidrófoba y el agua) y concentración de fibras. La suspensión de fibras se puede preparar para permitir el uso de agujas de diámetro más pequeño por reducción de la longitud de la fibra con elevado tiempo de criomolienda, que modifica la química superficial para aumentar la hidrofilia, y reduciendo la concentración de fibra. Con estas optimizaciones, se proporcionan formulaciones de material compuesto que son capaces de ser inyectadas a través de agujas de orificio pequeño para aplicaciones estéticas. Las instrucciones para el uso de Juvederm Voluma XC especifican el uso de agujas de calibre 25 o 27 para el relleno de mejillas (subcutáneo o supraperióstico), mientras que Juvederm Ultra especifica una aguja de calibre 30 para los defectos más superficiales de la dermis media a profunda.

En el presente documento se proporcionan suspensiones de nanofibras poliméricas que son suficientemente cortas e hidrófilas como para permitir la inyección a través de una aguja de calibre 32. Los péptidos que se unen a HA o colágeno se conjugan (o "injertan") con la superficie de la fibra, luego dispersan las nanofibras en hidrogeles basados en HA tiolados, o geles comercialmente disponibles (por ejemplo, Juvederm).

Ventajosamente, los complejos de armazón en forma de un gel se refuerzan mecánicamente a través de la presencia de las nanofibras, que se unen específicamente, pero no covalentemente, a través del dominio de unión. Este refuerzo es principalmente isotrópico, a menos que se diseñe específicamente para introducir propiedades anisotrópicas, tales como por una distribución de fibras o gradiente irregular. La inclusión de estas fibras aumenta el módulo elástico del material en comparación con sin fibras o fibras combinadas bajo compresión, tensión o cizallamiento. También aumenta la resistencia y la tenacidad definitivas del material. Preferentemente, el grado de refuerzo (aumentos en el módulo elástico) se diseña para ser de grado intermedio, que es un mayor refuerzo que una pluralidad de fibras sin dominios de unión específica, pero inferior a un complejo de armazón que tiene enlaces covalentes entre fibras de polímero e hidrogel. En particular, el componente de hidrogel con los armazones es auto-curable; los enlaces no covalentes son capaces de volver a formarse entre las fibras y el hidrogel si se desgarra. Además, se cree que el complejo de armazón que lleva los restos de unión a HA, tales como péptidos de unión a HA, actuarán de fluido no newtoniano, posiblemente dilatante, pero más probablemente pseudoelástico, ya que el aumento de la fuerza de cizallamiento alterará los enlaces de péptidos de unión, lo que le permite fluir más fácilmente en condiciones de alto cizallamiento. Por lo tanto, es capaz de fluir a través de una jeringa y aguja cuando se aplica presión suficiente, pero parecerá ser un sólido viscoelástico cuando se alivie esa presión, tal como subdérmicamente después de la inyección.

En algunos casos que no son parte de la invención, las fibras conjugadas con péptidos que se unen a hidrogel se combinan con hidrogeles comerciales existentes (tales como los no covalentemente unidos a fibras de polímero), e hidrogeles que son fraguados con química de reticulación (tales como HA tiolado y PEG-DA). Las fibras refuerzan la estructura, pero no es sustancialmente capaz de fluir tras el fraguado. Una ventaja de los restos de unión a hidrogel incluye el aumento de la deposición de MEC nativa en el dispositivo médico que contiene el complejo de armazón, proporcionándose así un relleno de volumen duradero. También se proporcionan formulaciones que contienen menores concentraciones de hidrogel y/o hidrogel de menor peso molecular y/o mejoran la respuesta celular a los dispositivos (incluyendo formación capsular rígida reducida), con respecto a las composiciones que carecen de restos de unión a hidrogel, mientras se mantiene el mismo aspecto estético y sensación durante una duración similar. Además, se requiere menos procesamiento de la reticulación en presencia de péptidos que se unen a hidrogel u otros restos. Se observa que la inclusión de péptidos que se unen a hidrogel en el complejo de armazón permite una reducción en la concentración (por ejemplo, desde 20-24 mg/ml de HA o mayor hasta 15 mg/ml o inferior), por lo que se espera que el hidrogel inyectado sea permisivo a las células, dando como resultado la restauración permanente en el sitio inyectado.

EQUIVALENTES

Se entiende que los ejemplos y las realizaciones detallados descritos en el presente documento se dan a modo de ejemplo para fines ilustrativos solo. Diversas modificaciones o cambios en vista de los mismos se sugerirán a los expertos en la técnica y están incluidos dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, las cantidades relativas de los componentes pueden variar para optimizar los efectos deseados, se pueden añadir componentes adicionales y/o se pueden sustituir componentes similares por uno o más de los componentes descritos, en tanto que la materia resultante entre dentro del alcance de las reivindicaciones. Características y funcionalidades ventajosas adicionales asociadas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un complejo de armazón, que comprende una pluralidad de poros presentes sobre o dentro de una superficie del complejo de armazón, en donde los poros están presentes en una concentración de al menos 50 poros por cm2 de la superficie, y en donde al menos el 80 % de los poros tiene un diámetro de poro promedio sobre la superficie que tiene al menos 5 micrómetros, y que comprende una fibra polimérica no tejida que tiene un diámetro medio de desde 100 nm hasta 8000 nm unida covalentemente a un resto de unión a hidrogel, en donde la fibra polimérica comprende policaprolactona electrohilada, y en donde el resto de unión a hidrogel está unido a la superficie externa del polímero fibra, en donde:

el resto de unión a hidrogel comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en péptidos que se unen a ácido hialurónico seleccionados de GAHWQFNALTVR, LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN y STMMSRSHKTRSHH y péptido que se une a colágeno GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM, en donde

el resto de unión a hidrogel comprende opcionalmente una segunda secuencia seleccionada del grupo que consiste en péptidos que se unen a ácido hialurónico seleccionados de CRRDDGAHWQFNALTVR, LKQKIKHVVKLKVVVKLRSQLVKRKQN y STMMSRSHKTRSHHV y péptido que se une a colágeno GLRSKSKKFRRPDIQYPDATDEDITSHM; y

en donde el resto de unión a hidrogel está asociado con un material de hidrogel, en donde el material de hidrogel se selecciona del grupo que comprende ácido hialurónico, colágeno o una combinación de los mismos, o una matriz extracelular de tejido procesada;

y que comprende además un resto de reticulación presente en una cantidad eficaz para inducir la reticulación entre fibra de policaprolactona y ácido hialurónico.

2. El complejo de armazón de la reivindicación 1, en donde el resto de unión a hidrogel está asociado con o es capaz de asociarse con un ácido hialurónico que cubre al menos una porción de una superficie externa de la fibra de policaprolactona.

3. El complejo de armazón de la reivindicación 1 o 2, en donde el complejo de armazón es biodegradable cuando se implanta en un tejido humano.

4. El complejo de armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además un agente terapéutico seleccionado de una célula, una molécula pequeña, un ácido nucleico y un polipéptido.

5. Un biomaterial implantable que comprende el complejo de armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El material implantable de la reivindicación 5, que es acelular.

7. El material implantable de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, formulado para administración subdérmica.

8. Un dispositivo médico para retener la forma de tejido en un sujeto que se somete a un procedimiento quirúrgico, que comprende el complejo de armazón de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una cantidad eficaz para proporcionar la retención de una forma de tejido cuando se administra al sujeto.