ES2915907T3

ES2915907T3 - Procedimientos para el tratamiento de la disfunción endotelial vascular utilizando mononucleótido de nicotinamida

Info

Publication number: ES2915907T3
Application number: ES15768836T
Authority: ES
Inventors: Douglas R Seals; Lindsey Gano; Picciotto Natalie De; Amy Sindler; Jamie Justice
Original assignee: University of Colorado
Current assignee: University of Colorado
Priority date: 2014-03-24
Filing date: 2015-03-24
Publication date: 2022-06-27
Anticipated expiration: 2035-03-24
Also published as: US20190282595A1; US10307437B2; EP3242665A1; US11433088B2; EP3242665A4; EP3242665B1; US20170087171A1; WO2015148522A1; PL3242665T3

Abstract

Una composición que comprende un mononucleótido de nicotinamida y un excipiente farmacéutico, para su uso en el tratamiento de la disfunción endotelial vascular en un sujeto, donde la composición es para administrar de 0,1 mg a 50 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para el tratamiento de la disfunción endotelial vascular utilizando mononucleótido de nicotinamida

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente descripción se refiere, en general, a composiciones para uso en el tratamiento de la disfunción endotelial vascular, donde las composiciones comprenden un mononucleótido de nicotinamida.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) siguen siendo la principal causa de muerte en la sociedad moderna de los países desarrollados. Se espera que la cantidad de adultos mayores en el mundo desarrollado se duplique al menos para 2050, y esto está asociado con proyecciones de aumentos marcados en la carga de ECV.

El envejecimiento aumenta el riesgo de ECV en gran parte debido a la disfunción de las arterias, a saber, la disfunción endotelial y la rigidez de las grandes arterias elásticas. La disfunción del endotelio vascular se evalúa principalmente a través de la dilatación dependiente del endotelio (DDE) y se deteriora en gran medida debido al aumento de la producción de superóxido (O²-). El aumento de O²- reduce la biodisponibilidad de la potente molécula vasodilatadora y vasoprotectora de óxido nítrico (NO). El aumento de la rigidez aórtica, en particular, reduce la capacidad de amortiguar los aumentos de presión producidos por la eyección sistólica de sangre hacia las grandes arterias elásticas con cada contracción cardíaca. Esto aumenta la presión arterial sistólica y la presión del pulso arterial (la diferencia entre la presión arterial sistólica y diastólica), así como la "pulsatilidad" del flujo sanguíneo, que se transmite a la microvasculatura de los órganos vulnerables de alto flujo, como el cerebro y los riñones. causando daños en los órganos diana y otros efectos fisiopatológicos. De manera similar, el aumento de la rigidez arterial se ha relacionado con la disfunción endotelial y ahora se reconoce como el principal factor de riesgo independiente para las enfermedades cardiovasculares asociadas con la edad. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar tratamientos que reduzcan el riesgo de ECV con el envejecimiento.

Sin estar ligado a la teoría, los mecanismos por los cuales las arterias se endurecen con la edad no se comprenden completamente, pero se cree que incluyen cambios en la composición de las proteínas estructurales dentro de la pared arterial. El colágeno (tipo I) es la principal proteína de carga en la pared arterial y su abundancia aumenta con la edad. En cambio, la elastina, la principal proteína estructural que confiere elasticidad, se encuentra reducida en las arterias viejas. Se ha demostrado previamente en ratones (Fleenor BS y col. 2012a, Aging Cell. 11, 269-276) y fibroblastos aórticos cultivados (Fleenor BS y col. 2010, J Physiol. 588, 3971-3982) que el estrés oxidativo contribuye a algunos o todos los cambios estructurales asociados con la edad que se observan en las arterias.

Se cree que dos antecedentes clave y predictores independientes de una ECV clínica en adultos mayores incluyen la disfunción del endotelio vascular, evaluada por la dilatación dependiente del endotelio (DDE), y la rigidez de la arteria elástica grande, medida por la velocidad de la onda del pulso aórtico (aPWV). Se cree que un mecanismo común que contribuye tanto a la disfunción del endotelio vascular como a la rigidez de las grandes arterias elásticas con el envejecimiento implica un estrés oxidativo vascular asociado al superóxido excesivo (Seals D.R. y col. 2011, Clin Sci 120, 357-375; Fleenor B.S. y col. 2012a, Aging Cell. 11,269-276; Bachschmid M.M. y col. 2013, Ann Med. 45, 17-36). El aumento de la producción vascular de superóxido ocurre con el envejecimiento y reduce la biodisponibilidad de la molécula vasodilatadora y vasoprotectora de óxido nítrico (NO), mientras que también causa alteraciones en las principales proteínas estructurales (colágeno y elastina) en las grandes arterias elásticas (es decir, la aorta y las arterias carótidas). Estos cambios contribuyen directamente a la disfunción endotelial relacionada con la edad y al aumento de la rigidez arterial. Como tales, los tratamientos que reducen la producción excesiva de superóxido en las arterias envejecidas tienen el potencial de mejorar la disfunción vascular asociada con la edad.

Se reconoce que existe una asociación entre la disfunción endotelial y una disminución de la función cognitiva y motora (física) tanto durante el envejecimiento normal como en los estados patológicos asociados con la edad. Se reconoce además que la función endotelial desempeña un papel en la regulación sistémica del metabolismo, la fluidez de la sangre, la perfusión tisular, la función inmunitaria y la mejora de la longevidad.

Se ha demostrado previamente que la restricción calórica (RC) de por vida, así como la RC a corto plazo en animales viejos, previene o revierte la disfunción endotelial y la rigidización de las grandes arterias elásticas al reducir la producción de superóxido, aumentar la biodisponibilidad del NO y modificar las proteínas estructurales (Rippe C. y col. 2010 Aging Cell. 9, 304-312; Donato A.J. y col. 2013, Aging Cell. 12, 772-783). Sin embargo, debido a que la adherencia a la RC no es práctica para la mayoría de los humanos, existe un interés creciente en las terapias farmacológicas que pueden inducir los beneficios de la RC. El documento de los EE. UU. 2009/0030071 sugiere el uso de nebivolol para tratar la rigidez arterial y la disfunción endotelial.

Las sirtuinas son una clase de proteínas enzimáticas que poseen actividad de desacilasa, incluidas la actividad de desacetilasa, desuccinilasa, demalonilasa, demiristoilasa y depalmitoilasa; algunas de las sirtuinas (por ejemplo, SIRT6) también poseen actividad de monorribosiltransferasa. La expresión y actividad de las enzimas sirtuinas se reduce con el avance de la edad. Hay 7 sirtuinas de mamíferos (SIRT 1-7) que corresponden a la levadura Sir2 (regulación de información de tipo de apareamiento silencioso). Las sirtuinas también poseen una actividad de desacetilasa dependiente de un dinucleótido de nicotinamida adenina (NAD+). La SIRT1 de los mamíferos, uno de los siete miembros de la familia sirtuina de desacetilasas/desacilasas de proteína, es una desacetilasa dependiente de un dinucleótido de adenina nicotinamida (NAD+) que actúa como un sensor de energía metabólica implicado en varios de los efectos beneficiosos de la RC, incluida la reducción del estrés oxidativo (Boily G. y col. 2008, PLoS One. 3, e1759; Merksamer P.I. y col. 2013, Aging (Albany NY). 5, 144-150). Al mejorar la biosíntesis de NAD+ con precursores de NAD+, tal como NMN y ribósido de nicotinamida (RN), aumenta la actividad de la desacetilasa dependiente de NAD+ SIRT1 (Imai S. 2010, Pharmacol Res. 62, 42-47; Satoh A. y col. 2011, Handb Exp Pharmacol. 206, 125-162; Canto C. y col. 2012, Cell Metab. 15, 838-847). La nicotinamida fosforribosiltransferasa puede otorgar a las células endoteliales humanas una vida útil replicativa prolongada y una capacidad angiogénica mejorada en un entorno con alto contenido de glucosa (Borradaile N. M. y col., 2009, Aging Cell, 8(2), 100-112). Los polifenoles de la dieta también pueden desempeñar un papel en la regulación de SIRT1 (Chung S. y col., 2010, Archives of Biochemistry and Biophysics, 501(1), 79-90).

Con el avance de la edad, hay una reducción de la expresión y actividad de las sirtuinas en mamíferos y humanos. Debido a esto, se cree que las sirtuinas influyen en muchos procedimientos de envejecimiento. La expresión de SIRT 1 en células endoteliales se asocia positivamente con la DDE en adultos jóvenes y mayores (Donato A.J. Y col., 2011 J. Physiol. 589, 4545-4554), lo que implica que la SIRT1 puede influir en la función vascular en humanos. Estudios previos muestran que la reducción de la expresión y la actividad de SIRT1 es un mecanismo clave que media en el deterioro de la DDE en las arterias que envejecen (Rippe C. y col. 2010, Aging Cell. 9, 304-312; Donato A.J. y col.

2011, J Physiol. 589, 4545-4554; Gano L.B. y col. 2014, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1754-1763), y hallazgos recientes indican que la activación farmacológica de SIRT1 con el compuesto SRT1720 mejora la DDE en ratones viejos en parte al reducir el estrés oxidativo (Gano L.B. y col. 2014, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1754-1763). Se ha demostrado que el estrés oxidativo cumple un rol importante en el desarrollo de la disfunción del endotelio vascular y la rigidez de las grandes arterias elásticas asociadas con el aumento de la edad (Lakatta EG & Levy, 2003 Heart Fail Rev. 7, 29-49; Sellos y col. 2011, Clin Sci 120, 357-375). El estrés oxidativo en la vasculatura conduce a una disminución de la biodisponibilidad de NO, lo que provoca disfunción endotelial y la rigidización de las grandes arterias elásticas. El superóxido reacciona con el NO formando peroxinitrito (ONOO‘), que reduce la biodisponibilidad del NO; esto da como resultado una menor biodisponibilidad de NO para contribuir a la vasodilatación. Además, el ONOO’ oxida los residuos de tirosina en proteínas que producen nitrotirosina después de la traducción, un marcador clave del estrés oxidativo.

Se ha establecido que el estrés oxidativo y la inflamación están íntimamente conectados (Csiszar A. y col. 2008, J Appl Physiol. 105, 1333-1341; Ungvari Z. y col.2010, J Gerontol A Biol Sci Med Sci.65, 1028-1041) y se ha descubierto que la SIRT 1 modula la actividad del factor nuclear kappa B (NE^kB) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) (Yoshino J y col., 2011, Cell Metab. 14,528-536), los cuales son reguladores maestros del procedimiento inflamatorio. El subconjunto p65 de NE^kB es una diana principal de SIRT1 y se desacetila en respuesta a la activación de SIRT1.

La biodisponibilidad de NAD+ también disminuye con la edad en varios tejidos de mamíferos y se ha demostrado que la restauración de los niveles de NAD+ mejora la diabetes tipo 2 inducida por la edad y la dieta alta en grasas en ratones, al tiempo que restaura la expresión génica relacionada con el estrés oxidativo y la inflamación a la de un ratón sano no diabético, en parte a través de la activación de SIRT1.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En esta invención, se describen composiciones y procedimientos para evaluar y tratar la disfunción endotelial vascular. En varios aspectos, se proporciona una composición que comprende un mononucleótido de nicotinamida y un excipiente farmacéutico, para su uso en el tratamiento de la disfunción endotelial vascular en un sujeto, donde la composición es para administrar de 0,1 mg a 50 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día. En diversas realizaciones, antes del tratamiento se determina un indicador de disfunción endotelial vascular en un sujeto. En realizaciones adicionales, la dosis de mononucleótido de nicotinamida es de 1 mg a 25 mg por kg de peso corporal por día. En realizaciones adicionales, la dosis se administra de forma crónica a los sujetos. En realizaciones adicionales, la dosis se administra a sujetos en respuesta al indicador.

En realizaciones adicionales, después del tratamiento se determina un efecto sobre la disfunción del endotelio vascular en el sujeto. En realizaciones adicionales, determinar el indicador de disfunción endotelial vascular comprende determinar el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en un sujeto. En realizaciones adicionales, el grado de dilatación dependiente del endotelio está asociado con una mayor producción de superóxido. En realizaciones adicionales, el grado de dilatación dependiente del endotelio está asociado con una expresión disminuida de SIRT1. En realizaciones adicionales, el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial disminuye en respuesta a la administración de la composición que comprende el mononucleótido de nicotinamida. En realizaciones adicionales, la disminución en el grado de dilatación dependiente del endotelio comprende además una disminución en la producción de superóxido y un aumento en la biodisponibilidad del óxido nítrico. En realizaciones adicionales, la disminución en la extensión de la dilatación dependiente del endotelio comprende además un aumento en la expresión y actividad de la proteína SIRT1. En realizaciones adicionales, la composición se administra durante un período de tiempo de 30 días, 3 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 2 años, 5 años, 7 años, 10 años, 15 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años o terapia continua durante la vida del sujeto.

En varios aspectos de la invención, el tratamiento con NMN reduce selectivamente la rigidez en animales viejos. En aspectos adicionales, se proporciona una composición que comprende un mononucleótido de nicotinamida y un excipiente farmacéutico, para su uso en la reducción del grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en un sujeto, donde la composición es para administrar de 0,1 mg a 50 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día. En varias realizaciones, antes de disminuir la extensión de la dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en un sujeto, se determina el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en el sujeto. En realizaciones adicionales, la composición es para administrar de 1 mg a 25 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día. En realizaciones adicionales, la dosis se administra de manera crónica a dicho sujeto. En realizaciones adicionales, una disminución en la dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial se asocia con un aumento en la biodisponibilidad del dinucleótido de nicotinamida (NAD+). En realizaciones adicionales, una disminución en la dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial comprende además una disminución en la producción de superóxido, un aumento en la biodisponibilidad del óxido nítrico y/o un aumento en la expresión y actividad de la proteína SIRT1.

En aspectos de la invención, el tratamiento con NMN activa la SIRT1 y reduce la inflamación y el estrés oxidativo, lo que da como resultado una función vascular mejorada.

En aspectos de la invención, el tratamiento con NMN revierte la disfunción vascular asociada con la edad al mejorar la función endotelial y reducir la rigidez de las grandes arterias elásticas en ratones C57B1/6 de edad avanzada, al tiempo que restaura la disminución relacionada con la edad en la expresión de la proteína SIRT1 y reduce el estrés oxidativo. En aspectos de la invención, el tratamiento con NMN restaura selectivamente la actividad de SIRT1 en las arterias de ratones viejos a la de controles jóvenes. En aspectos adicionales, la proporción de subconjunto p65 acetilado al total del factor de transcripción NEkB disminuye con el tratamiento con NMN.

En aspectos de la invención, el NMN invierte la rigidización de las grandes arterias elásticas asociada con el envejecimiento. En otro aspecto, el tratamiento con NMN normaliza el colágeno. En otro aspecto, el tratamiento con NMN conserva parcialmente la elastina en la pared arterial.

Los aspectos y las realizaciones adicionales se harán evidentes a partir de la descripción detallada que se proporciona en este documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

El asunto a tratar, que se considera como la invención, se señala particularmente y se reivindica claramente en las reivindicaciones al término de la memoria descriptiva. Sin embargo, se obtiene mejor una comprensión más completa de la presente invención haciendo referencia a la descripción detallada y las reivindicaciones cuando se consideran en relación con las figuras de los dibujos, donde los números iguales indican elementos similares y donde:

La FIG. 1 ilustra las respuestas a las dosis para la acetilcolina del dilatador dependiente del endotelio (ACh) en controles jóvenes y viejos (YC y OC) (FIG. 1A); las respuestas a las dosis para la dilatación dependiente de NO en ratones jóvenes y viejos tratados con NMN (YNMN y ONMN) (FIG. 1B); y el nitroprusiato de sodio (SNP, por sus siglas en inglés) del dilatador independiente del endotelio (FIG. 1C).

La FIG. 2 ilustra la respuesta a la dosis máxima de la acetilcolina (ACh) del dilatador dependiente del endotelio en ratones de control jóvenes y viejos (YC y OC) y ratones tratados con NMN jóvenes y viejos (YNMN y ONMN) en presencia o ausencia de TEMPOL (FIG. 2A); la producción de superóxido siendo evaluada por resonancia paramagnética de electrones (EPR) (FIG. 2B); y la abundancia de nitrotirosina (NT) en la aorta (FIG. 2C).

La FIG. 3 ilustra la velocidad de la onda del pulso aórtico (aPWV) en ratones de control jóvenes y viejos (YC y OC) y ratones tratados con NMN jóvenes y viejos (YNMN y ONMN) (FIG. 3A); el módulo elástico (FIG. 3B); la expresión de colágeno-I arterial total (Coll) en la aorta (FIG. 3C); y la expresión de elastina total en la aorta (FIG. 3D). La FIG. 4 ilustra la expresión de SIRT1 en la aorta de ratones de control jóvenes y viejos (YC y OC) y ratones jóvenes y viejos tratados con NMN (YNMN y ONMN) (FIG. 4A) y la proporción de NE^kB acetilado a total en la aorta (FIG. 4B).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Como se usa en esta invención, la frase “excipiente farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de los siguientes: agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Los ejemplos adicionales de excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen agentes o menores cantidades de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, conservantes o tampones, que mejoran la vida útil o la efectividad de la composición. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención y los procedimientos para su preparación serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Dichas composiciones y procedimientos para su preparación se pueden encontrar, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a edición (Mack Publishing Company, 1995). Las composiciones farmacéuticas se elaboran preferiblemente en condiciones de GMP. Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, empaquetarse o venderse a granel, como una dosis unitaria individual o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. Tal como se usa en esta invención, una "dosis unitaria" es la cantidad discreta de composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. En algunas realizaciones, uno o más ingredientes activos pueden estar presentes en la composición además del mononucleótido de nicotinamida (NMN, por sus siglas en inglés). La cantidad del ingrediente activo es, por lo general, equivalente a la dosificación del ingrediente activo que se administraría a un sujeto o una fracción conveniente de tal dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de tal dosificación.

Como se usa en esta invención, una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" de una composición se refiere a una cantidad efectiva en la impedimento o tratamiento de un trastorno para el tratamiento del cual la composición es efectiva. Un "trastorno" se refiere a cualquier afección que podría beneficiarse del tratamiento con la composición. En algunas realizaciones, una composición de la invención es efectiva en el tratamiento de la enfermedad cardiovascular. En algunas realizaciones, una composición de la invención es efectiva en el tratamiento de la disfunción endotelial vascular.

Como se usa en esta invención, "tratado", "tratando" o "tratamiento" son términos que se refieren a la disminución o alivio de al menos un síntoma asociado o causado por el estado, trastorno o enfermedad que se está tratando. Por ejemplo, el tratamiento puede conseguir la reducción de uno o más síntomas de un trastorno o la erradicación completa de un trastorno.

Como se usa en esta invención, "afecciones", "enfermedades" y "trastornos" son términos que se refieren e incluyen el envejecimiento, la enfermedad cardiovascular (ECV), la aterosclerosis y la disfunción endotelial. En las realizaciones, el trastorno puede ser un trastorno asociado con el envejecimiento, una enfermedad cardiovascular, aterosclerosis o disfunción endotelial, por ejemplo, deficiencias cognitivas, la enfermedad de Alzheimer, una disfunción motora, la resistencia a la insulina y la sarcopenia.

En varios aspectos, sin estar ligado a ninguna teoría, los niveles de NAD+ se incrementan en los ratones C57B1/6 viejos al administrar el precursor intracelular directo, el mononucleótido de nicotinamida (NMN), para aumentar la actividad de la sirtuina, disminuir el estrés oxidativo y restaurar la biodisponibilidad del NO.

En varios aspectos de la invención, el mononucleótido de nicotinamida (NMN) puede administrarse como ingrediente activo en composiciones terapéuticas, para tratar la disfunción del endotelio vascular, entre otros. Generalmente, el NMN es adecuado para su administración en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. En esta invención, el término "excipiente" se usa para describir cualquier ingrediente que no sea el ingrediente activo. La elección de los excipientes dependerá en gran medida de factores tales como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos (por ejemplo, NMN) en las composiciones y formulaciones farmacéuticas pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que es efectivo para alcanzar la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin ser tóxico para el paciente.

Sin estar ligados a ninguna teoría, se cree que la biodisponibilidad disminuida de NAD+ contribuye a la disfunción vascular asociada con la edad. En varios aspectos, el NMN se puede administrar a un sujeto en una cantidad terapéuticamente efectiva. En otros aspectos, la función endotelial puede evaluarse a través de la dilatación dependiente del endotelio (DDE) y la rigidez aórtica. La función endotelial se puede evaluar antes y después del tratamiento con NMN.

El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de la composición que se encuentra en la formulación, la vía de administración, el horario de administración, la velocidad de excreción de la composición particular que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con la composición particular empleada, la edad, el sexo, el peso, el estado general de salud y la historia clínica del paciente que se esté tratando, así como también factores similares conocidos en la técnica médica.

Un médico con experiencia en la técnica puede determinar y recetar fácilmente la cantidad efectiva requerida de la composición farmacéutica de la presente invención. Por ejemplo, el médico puede iniciar las dosis de la composición de la invención empleadas en la formulación farmacéutica en niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosificación hasta alcanzar el efecto deseado.

En varias realizaciones, la concentración del ingrediente activo está entre 10 mg y 6000 mg de mononucleótido de nictotinamida por ml de formulación líquida. En las realizaciones, la concentración de NMN es de 100 mg, 125 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg, 1200 mg, 1500 mg, 2000 mg, 2500 mg, 3000 mg, 3500 mg, 4000 mg, 4500 mg, 5000 mg, 5500 mg o 6000 mg por ml de formulación líquida. En las realizaciones, la concentración de NMN puede calcularse en base al peso corporal de un sujeto. En las realizaciones, la concentración de NMN está entre 0,1 mg y 50 mg por kg de peso corporal. En las realizaciones, la concentración de NMN va desde 0. 1 mg y 25 mg por kg de peso corporal. En las realizaciones, la concentración de NMN es de 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, 12,5 mg, 15 mg, 18 mg, 20 mg, 22,5 mg o 25 mg por kg de peso corporal. En las realizaciones, la concentración de NMN va desde 1 mg y 25 mg por kg de peso corporal. En realizaciones, la concentración de NMN administrada a un sujeto es de 1.200 mg/día para un sujeto que pesa 150 lbs.

En varias realizaciones, una composición de la invención se puede administrar como una dosis diaria durante un período de tiempo a un sujeto. En las realizaciones, una composición de la invención se puede administrar de forma crónica o a largo plazo. En las realizaciones, la composición se puede administrar durante un período de días, semanas, meses, años o terapia continua durante la vida de un sujeto. En las realizaciones, la composición se puede administrar durante un período de tiempo de 30 días, 3 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 2 años, 5 años, 7 años, 10 años, 15 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años o 40 años. En realizaciones, se puede determinar un régimen de tratamiento para un sujeto individual dependiendo de varios factores. En algunas realizaciones, un factor puede incluir, entre otros, una determinación del cambio en la extensión de la dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en respuesta a la administración de la composición de la invención. En realizaciones adicionales, la rigidización de las grandes arterias elásticas con el avance de la edad puede conducir a un aumento en las presiones arteriales sistólica y de pulso, hipertrofia ventricular izquierda y daño tisular en órganos vitales de alto flujo, como el cerebro y los riñones. En las realizaciones, un sujeto que exhibe una respuesta inmediata a la composición, por ejemplo, una reducción inmediata en la dilatación dependiente del endotelio y/o una rigidez arterial, puede requerir dosis menos frecuentes que un sujeto que muestra una respuesta a la composición en un momento posterior o después de varias dosis.

Cualquier procedimiento para administrar compuestos similares a los farmacéuticos o nutracéuticos en la técnica puede emplearse adecuadamente según la invención.

EJEMPLO

Se probó la suplementación de mononucleótido de nicotinamida (NMN), un producto intermedio de NAD+ clave, dado que tiene el potencial de activar la SIRT1 desacetilasa dependiente de NAD+ de mamífero y revierte el estrés oxidativo y la disfunción vascular asociados con la edad. Los ratones de control viejos (OC) tenían una dilatación dependiente del endotelio (DDE) de la arteria carótida alterada (60 ± 5 contra 84 ± 2 %), una medida de la función endotelial y DDE mediada por óxido nítrico (NO) (37 ± 4 contra 66 ± 6 %), en comparación con ratones jóvenes (YC). Este deterioro asociado con la edad en DDE fue restaurado en los OC mediante el eliminador de superóxido (O²-) TEMPOL (4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxilo; 82 ± 7 %). Los OC también tenían un aumento en la velocidad de la onda del pulso aórtico (aPWV, 464 ± 31 contra 337 ± 3 cm/s) y el módulo elástico (EM, 6407 ± 876 contra 3119 ± 471 kPa), medidas de rigidez de la arteria elástica grande, en comparación con los YC. Los OC tuvieron una mayor producción de O²aórtico (2,0 ± 0,1 contra 1,0 ± 0,1 AU), abundancia de nitrotirosina (un marcador de estrés oxidativo) y colágeno-1, y una actividad reducida de elastina y SIRT1 vascular, medida a través del estado de acetilación del subconjunto p65 de NEkB, en comparación con los Yc . El tratamiento con NMN en ratones viejos restauró la DDE (86 ± 2 %) y la DDE mediada por NO (61 ± 5 %), redujo los valores de aPWV (359 ± 14 cm/s) y EM (3694 ± 315 kPa), normalizó la producción de O²(0,9 ± 0,1 AU), disminuyó la nitrotirosina, revirtió el colágeno-I, aumentó parcialmente la elastina y restauró la actividad vascular de SIRT 1. El tratamiento con NMN restaura la actividad de SIRT 1 y revierte la disfunción arterial relacionada con la edad, mientras que, a la vez, reduce el estrés oxidativo.

Materiales y procedimientos

Animales. Se compraron ratones machos jóvenes C57B1/6 (4-8 meses) de Charles River, mientras que los ratones machos viejos C57B1/6 (26-28 meses), se obtuvieron de la colonia de roedores del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Los ratones fueron alimentados ad libitum con comida normal para roedores mientras duró el estudio. Después de un período de aclimatación de 2 semanas, los ratones jóvenes y viejos se dividieron en dos subgrupos: los animales de control (YC, OC) continuaron con agua potable normal y los otros animales (YNMN, ONMN) recibieron la suplementación con el mononucleótido de nicotinamida (NMN; Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, EE. UU.) en el agua bebible (240 mg/kg/día) durante 8 semanas. Todos los ratones se alojaron en un centro de cuidado de animales en la Universidad de Colorado Boulder en un ciclo de 12:12 de luz-oscuridad de una hora. Todos los procedimientos con animales siguieron la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (publicación de NIH No. 85-23, revisada en 1996) y contaron con la aprobación del Comité de uso y cuidados de los animales de UCB.

Respuestas vasodilatadoras de la arteria carótida ex vivo. La DDE y la dilatación independiente del endotelio se determinaron ex vivo en arterias carótidas aisladas como se describió previamente (Rippe C. y col. 2010, Aging Cell.

9, 304-312; Sindler AL y col. 2011, Aging Cell. 10, 429-437). Los ratones se anestesiaron con isoflurano y se sacrificaron mediante exanguinación a través de una punción cardíaca. Las arterias carótidas se extirparon cuidadosamente, se canularon en puntas de micropipetas de vidrio y se aseguraron con suturas de nailon (11-0) en cámaras de miografía individuales (DMT Inc., Ann Arbor, MI, EE. ^uU.) que contenían soluciones salinas fisiológicas tamponadas. Las arterias se presurizaron a 50 mmHg a 37 °C y se dejaron equilibrar durante 45 minutos antes de la experimentación. Después de la preconstricción submáxima con fenilefrina (2 ^jM), se determinó el diámetro luminal en respuesta a la acetilcolina (ACh: 1*10'9 - 1*10'4 M; Sigma-Aldrich Corp.) con y sin coadministración del inhibidor de NO sintasa, L-NAME, 0,1 mM, incubación de 30 minutos; (Sigma-Aldrich Corp.) o el mimético de superóxido dismutasa 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxilo (TEMPOL, 0,1 mM, 1 hora de incubación; Sigma-Aldrich Corp.). La dilatación independiente del endotelio se determinó mediante la vasodilatación en respuesta al nitroprusiato de sodio del donante de NO (SNP: 1*10'11 - 1*10'4 M; Sigma-Aldrich Corp.).

Todos los datos de dosis-respuesta se presentan como porcentaje de dilatación, es decir, las FIGS. 1A, 1C y 2A. La preconstricción se calculó como un porcentaje del diámetro intraluminal máximo según la siguiente fórmula:

Debido a las diferencias en el diámetro máximo de la arteria carótida entre animales jóvenes y viejos, las respuestas vasodilatadoras se registraron como diámetros reales expresados como porcentaje de la respuesta máxima según la siguiente fórmula:

Dilatación (%) = (Ds-Db)/(Dm-Db) x 100

Donde Dm es el diámetro intraluminal máximo a 50 mmHg, Db es el diámetro intraluminal en estado estacionario después de la preconstricción antes de la primera adición de un fármaco, y Ds es el diámetro intraluminal en estado estacionario registrado después de la adición de un fármaco.

La dilatación dependiente de NO se determinó a partir de la DDE máxima (es decir, la dilatación con la dosis más alta [1*10-4 M] ACh) en ausencia o presencia de L-NAME según la siguiente fórmula:

Dilatación dependiente de NO (%)= Dilatación máxima - Dilatación máxima C^h+L.NAME

Velocidad de la onda de pulsos aórticos in vivo. La velocidad de la onda del pulso aórtico (aPWV) se midió como se describió anteriormente (Sindler A.L. y col. 2011, Aging Cell. 10, 429-437; Fleenor B.S. y col. 2012b, Exp Gerontol.

47, 588-594). Brevemente, se anestesió a los ratones con un 2 % de isoflurano y se los colocó en decúbito supino sobre una placa calefactora con electrodos de electrocardiograma (ECG) fijados a sus piernas. La velocidad del flujo sanguíneo aórtico se midió con dos sondas Doppler colocadas en el arco aórtico transverso y la aorta abdominal, respectivamente. Para cada sitio se determinó el tiempo de preeyección, el tiempo entre la onda R del ECG y el pie de la señal Doppler. El valor de aPWV se calculó dividiendo la distancia entre las sondas transversa y abdominal por la diferencia en los tiempos de preeyección torácica y abdominal.

Módulo elástico in vitro. Se determinaron las propiedades mecánicas intrínsecas in vitro de la aorta torácica y se usaron para calcular el módulo elástico como se describió anteriormente. Segmentos aórticos (~1,5 mm de longitud) de ratones se limpiaron de grasa perivascular y otros tejidos circundantes. A continuación, se cargaron en una cámara de miografía de alambre calibrada y precalentada (37 °C) (DMT Inc.) que contenía solución salina tamponada con fosfato sin calcio. Las muestras aórticas se estiraron previamente durante 3 minutos hasta un desplazamiento del diámetro luminal de 1 mm que se devolvió a la línea base sin estirar, y esto se repitió dos veces. Para comenzar el experimento después del estiramiento previo, los segmentos se estiraron hasta una fuerza de referencia de 1 mN. El desplazamiento luminal se incrementó gradualmente (~ 10 % de aumento) cada 3 minutos, y la fuerza se registró después de cada período de tiempo de 3 minutos. Se aumentó el desplazamiento hasta que se produjo el fallo mecánico del tejido, definido por una disminución transitoria observada en la fuerza. La tensión y la deformación se calcularon donde la tensión se definió como: t = AL/2HD. t = tensión unidimensional, A = tensión, L = carga unidimensional aplicada, H = espesor de pared, D = eslora del buque. La deformación se definió como: A = Ad/d(i). A = deformación, d = cambio de diámetro, d(i) = diámetro inicial. La pendiente de la curva tensión-deformación se usó para determinar el módulo elástico como se describió anteriormente (Fleenor BS y col. 2012b, Exp Gerontol. 47, 588 594). Producción de superóxido aórtico. La medición de la producción de superóxido en la aorta torácica se realizó mediante espectroscopia de resonancia paramagnética de electrones (EPR), como se describió anteriormente (LaRocca T.J. y col. 2013, Mech Ageing Dev. 134, 314-320). Se extirpó la aorta y se disecó libre de grasa perivascular y otros tejidos circundantes. Se incubaron segmentos aórticos de 1 mm durante 1 hora a 37 °C en un tampón Krebs-Hepes con la sonda de espín específica para el superóxido, 1-hidroxi-3metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina ^{(CMH; 0,5 mM; Enzo Life Sciences, Inc., Farmington,}N^y, ^{EE. UU.), para la detección de la producción de superóxido}de células enteras. La amplitud de la señal se analizó utilizando un espectrómetro EPR de banda X MS300 (Magnettech GmbH, Berlín, Alemania) con los siguientes ajustes: campo central, 3350 G; barrer, 80 G; modulación de microondas, 3000 mG, y atenuación de microondas, 7 dB. Los datos se presentan en relación con la media del grupo de YC.

Manchado Western. Las aortas se usaron como una arteria elástica grande sustituta para proporcionar suficiente tejido para el análisis de la expresión de proteínas mediante el manchado Western, como se describió anteriormente (Donato AJ y col. 2013, J Physiol. 589, 4545-4554; Gano LB y col. 2014, Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1754-1763). Se extirparon las aortas, se limpiaron de grasa perivascular y otros tejidos circundantes y se congelaron en nitrógeno líquido antes del almacenamiento a -80 °C. El tejido se homogeneizó en un tampón de lisis de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) enfriado con hielo que contenía inhibidores de proteasa y fosfatasa [Protease Inhibitor Cocktail Tablet (Roche, Indianápolis, IN, EE. UU.) y un cóctel de inhibidor de fosfatasa al 0,01 % (Sigma Aldrich Corp.)] y se pulverizó usando una licuadora de vaso. La proteína se cargó en geles de poliacrilamida al 4-12 % (12 |jg por pozo), se separó por electroforesis y se transfirió a membranas de nitrocelulosa (Criterion System; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EE. UU.) para el análisis de manchado Western. Las membranas se incubaron con los siguientes anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C: anti-nitrotirosina (NT 1:500; Abcam, Cambridge, MA, EE. UU.), antisirtuinl (SIRT1 1:1000; Abcam), anti-p65 (subconjunto del factor nuclear kappa B (NP^kB; 1:500 Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, EE. UU.)) y p65 antiacetilado (subconjunto del factor nuclear kappa B [ac-NF^kB; 1:500 Cell Signaling Technology Inc.]). Las proteínas se visualizaron en un sistema de adquisición digital (ChemiDoc-It; UVP, Inc., Upland, CA, EE. UU.) usando quimioluminiscencia con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Westgrove, PA, EE. UU.), sustrato de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, EE. UU.). La intensidad relativa se cuantificó utilizando el software Image-J, Versión 1.0. Todos los datos se normalizaron a la expresión de alfa actina del músculo liso (a actina 1:5000; Abcam). La proporción de p65 acetilado al total se determinó ejecutando dos manchados de Western idénticos. Se sondeó una membrana para el p65 acetilado, mientras que, en la otra, se sondeó el p65 total. Cada valor se normalizó a actina a en el gel correspondiente. Se determinó la proporción de p65 acetilado al total de p65 para cada animal y, a continuación, se normalizó a la media del grupo de YC.

Inmunohistoquímica. Se usó inmunohistoquímica para determinar la expresión aórtica de colágeno tipo I y elastina como se describió previamente (Fleenor BS y col. 2010 J Physiol. 588, 3971-3982). Se extirparon segmentos de aorta torácica y se limpiaron de grasa perivascular y otros tejidos circundantes. Los segmentos se congelaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT; Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.) en isopentano enfriado con nitrógeno líquido. Los segmentos aórticos (7 jm cada uno) se fijaron en acetona durante 10 minutos y se lavaron en tampón Tris. Todos los portaobjetos se tiñeron con Dako EnVision™+ el kit de HRP-DAB de sistema (Dako, Carpinteria, CA) según el protocolo del fabricante utilizando los siguientes anticuerpos primarios: colágeno tipo I (Coll; 1:100, Millipore Corp., Temecula, CA, EE. UU.) y alfa elastina (a elastina; 1:50, Abcam). Los anticuerpos primarios se incubaron durante 1 hora a 4 °C. El polímero marcado se aplicó durante 30 minutos y se visualizó la tinción después de una exposición de 4 minutos a diaminobencidina (DAB). A continuación, los portaobjetos se deshidrataron y se cubrieron con un cubreobjetos. Las microfotografías digitales se obtuvieron utilizando un fotomicroscopio Nikon Eclipse TS100 y la cuantificación se realizó con el software Image-J, versión 1.0. Las capas adventicia y media de cada muestra se cuantificaron juntas para la expresión de todo el vaso. Los portaobjetos de múltiples lotes se normalizaron al mismo animal YC representativo y se normalizaron a la media de YC de cada día de tinción.

Análisis estadísticos. Los datos se presentan como media ± EEM en texto, figuras y tablas. Todos los análisis se realizaron con SPSS. Se utilizó un ANOVA (Análisis de varianza) unidireccional para analizar las características morfológicas, la DDE máxima, la DDE mediada por NO, la espectroscopia EPR, el valor de aPWV, el módulo elástico, los manchados Western y la inmunohistoquímica. Las diferencias dentro de los grupos en la respuesta a la dosis máxima de DDE a la acetilcolina en ausencia, contra la presencia de TEMPOL, se determinaron utilizando un ANOVA de las medidas repetidas de dos factores (grupo * tratamiento). Cuando se observó un efecto principal significativo, se usaron pruebas post-hoc de T ukey para determinar diferencias específicas por pares. La significancia se estableció en p < 0,05.

Resultados

Características de los animales y consumo de NMN

En la Tabla 1, se muestran las características morfológicas seleccionadas.

Tabla 1.

No hubo diferencias significativas en la masa corporal entre los cuatro grupos. Se observó un aumento de la masa cardíaca relacionado con la edad y una disminución de la masa grasa y muscular, que no se modificaron con el tratamiento con NMN. Todos los animales consumieron la misma cantidad de comida a lo largo de la duración del estudio, y la ingesta de NMN fue similar en los grupos tratados tanto de jóvenes como de adultos.

El tratamiento con NMN restaura la DDE máxima y la DDE mediada por NO en ratones viejos

Los diámetros de referencia de la arteria carótida (|jm) evaluados ex vivo fueron mayores en ratones viejos (controles: 480 ± 17; tratados: 478 ± 9) contra ratones jóvenes (controles: 424 ± 4; tratados: 432 ± 5). El tratamiento con NMN no tuvo un efecto significativo sobre los diámetros de referencia de la arteria carótida. La DDE máxima para la acetilcolina evaluada ex vivo fue menor en el control viejo en comparación con los ratones de control jóvenes y estuvo mediada en parte por una influencia dilatadora del óxido nítrico (NO) disminuida, como lo indica una reducción menor en la DDE en presencia contra la ausencia de la N-G-nitro-L-arginina inhibidora de la sintasa de NO (L-NAME) (FIG. 1A, 1B, n = 13-22/grupo). El tratamiento con NMN rescató la DDE en ratones viejos restaurando la dilatación mediada por NO, pero no tuvo ningún efecto en los animales jóvenes tratados (FIG. 1A, 1B). No hubo diferencias significativas en la DDE máxima o la DDE mediada por NO en los animales jóvenes y viejos tratados, en comparación con los controles jóvenes. La dilatación independiente del endotelio al nitroprusiato de sodio de donante de NO, un control para evaluar la sensibilidad del músculo liso vascular al NO, no fue significativamente diferente entre los grupos (FlG. 1C, n = 7-22/grupo). Los valores son media ± EEM. *p < 0,05 contra todos

El NMN reduce el estrés oxidativo vascular

La incubación ex vivo con el mimético de la superóxido dismutasa, 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (TEMPOL), restableció la EDD en las arterias carótidas de los animales de control viejos, mientras que no tuvo un efecto significativo en los otros grupos ( figura 2A, n=5-9/group. * pag < 0,05 frente a TEMPOL), lo que indica una disfunción endotelial excesiva mediada por superóxido con el envejecimiento. Para evaluar más a fondo la influencia del envejecimiento y el tratamiento con NMN sobre el estrés oxidativo en las arterias, se utilizaron aortas debido a la mayor cantidad de tejido proporcionado para el ensayo bioquímico. En comparación con ratones jóvenes, las aortas de animales viejos exhibieron una mayor producción de superóxido, evaluada directamente por espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (FlG. 2B; los valores están normalizados al valor medio de YC, señal EPR representativa a continuación, n = 4-9/grupo), y una mayor abundancia de nitrotirosina (FlG. 2C), un marcador de la modificación de proteínas oxidativas y la huella celular del estrés oxidativo. El tratamiento con NMN mejoró el aumento relacionado con la edad en la producción de superóxido (FlG. 2B) y redujo notablemente la abundancia de nitrotirosina aórtica en ratones viejos (FlG. 2C, n = 4-6/grupo), mientras que no tiene un efecto significativo en ratones jóvenes. Los datos se expresan en relación con la actina de músculo liso a y se normalizan al valor medio de los YC. Los valores son media ± EEM, * p < 0,05 contra todos; No. De p < 0,05 contra los YC. Juntos, estos datos indican que el NMN revierte el estrés oxidativo asociado con la edad en las arterias, lo que, a su vez, media mejoras en la función endotelial.

El tratamiento con NMN normaliza la rigidez aórtica en ratones viejos

La rigidez de la arteria elástica grande, evaluada in vivo mediante el valor de aPWV, fue mayor en los ratones de control viejos en comparación con los ratones de control jóvenes (FlG. 3A, n = 5-9/grupo). El tratamiento con NMN revirtió el aumento de aPWV asociado con la edad en ratones viejos, mientras que no tuvo un efecto significativo en ratones jóvenes (FlG. 3A). De manera similar, el módulo elástico, un índice in vitro de la rigidez arterial intrínseca, fue más alto en los controles viejos en comparación con los jóvenes y se normalizó con el tratamiento con NMN (FlG. 3B, n = 5-6/grupo). Las aortas torácicas de animales de control viejos exhibieron una expresión marcadamente aumentada de colágeno tipo l (FlG. 3C, n=4-9/grupo) y elastina disminuida (FlG. 3D) en comparación con controles jóvenes. En ratones viejos, el NMN redujo el colágeno arterial tipo l a niveles de ratones jóvenes (FlG. 3C) y aumentó la elastina a niveles no significativamente diferentes de los de ratones jóvenes (FlG. 3D, n = 4-11/grupo). Valores normalizados al valor medio de YC. Los valores son media ± EEM. Barras = 100 jm . * p < 0,05 contra todos; No. de p < 0,05 contra YC.

El tratamiento con NMN activa la SIRT1

Los niveles medios de expresión de SIRT1 aórtica fueron ~50 % menores en los animales viejos, en comparación con los ratones jóvenes, aunque la diferencia no alcanzó un significado estadístico (FIG. 4A, n = 5-7/grupo). El tratamiento con NMN aumentó la expresión de la proteína SIRT 1 en animales jóvenes y tendió a aumentar la SIRT 1 en animales viejos (FIG. 4A). La activación de la SIRT1 se determinó evaluando la relación de NEkB acetilado al total (subconjunto p65) (FIG. 4B). Esta proporción fue notablemente mayor en la aorta de los animales de control viejos en comparación con los controles jóvenes (p < 0,05), lo que indica que la actividad de SIRT1 aórtica se redujo con el envejecimiento. Los datos se expresan en relación con la actina de músculo liso a y se normalizan al valor medio de los YC. Los valores son media ± EEM, No. de p < 0,05 contra los YC; f p < 0,05 contra los OC. El tratamiento con NMN restauró la actividad de SIRT1 aórtica en animales viejos (p < 0,05; FIG. 4B, n = 5-11/grupo).

Los datos demuestran que 8 semanas de tratamiento con NMN restauraron la actividad arterial de SIRT1 y mejoraron la disfunción endotelial asociada con la edad y la rigidización de las grandes arterias elásticas en ratones C57B1/6 machos. Estas mejoras se asociaron con la biodisponibilidad de NO restaurada, el estrés oxidativo reducido y la normalización total o parcial de las proteínas estructurales en la pared arterial.

El NMN mejora la DDE mediada por NO y reduce el estrés oxidativo arterial

La disfunción endotelial es el principal antecedente de la aterosclerosis, un predictor del riesgo clínico de ECV y está relacionada con muchos trastornos comunes del envejecimiento, incluidos los deterioros cognitivos, la enfermedad de Alzheimer, la disfunción motora, la resistencia a la insulina y la sarcopenia (Heitzer T. y col. 2001, Circulation. 104, 2673-2678; Gokce N. y col. 2002, Circulation. 105, 1567-1572; Widlansky M.E. y col. 2003, J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160; Seals D.R. y col. 2011, Clin Sci 120, 357-375; Seals D.R. y col. 2014, Physiology (Bethesda). 29, 250 264). Las funciones motoras y cognitivas están asociadas con el mantenimiento de la independencia y la calidad de vida en adultos mayores y representan criterios de valoración clínicos. Se demostró una reversión de la disfunción endotelial asociada con la edad mediante el tratamiento oral con NMN. El envejecimiento en los animales de control se asoció con un deterioro en la DDE de la arteria carótida ex vivo en respuesta a la acetilcolina debido a la reducción de la dilatación mediada por NO (FIG. 1A-1B). Este último se determinó como la diferencia en DDE en ausencia frente a presencia de producción de NO lograda mediante la administración conjunta del inhibidor de sintasa de NO, el éster metílico de NG-nitro-L-arginina (L-NAME) (Max DilationACh - Max DilationACh+ L-NAME, n = 5-12/grupo). El tratamiento con NMN restauró sustancialmente o completamente la DDE al restaurar la dilatación mediada por NO. No se cree que la mejora en la DDE con el tratamiento con NMN en ratones viejos se deba a un aumento en la sensibilidad del músculo liso vascular al NO porque NMN no influyó en la dilatación en respuesta a la administración de un donante de NO (nitroprusiato de sodio), es decir, una dilatación que no es inducida por la producción endotelial de NO.

Los resultados demuestran que los efectos del envejecimiento y el tratamiento con NMN sobre la función endotelial estuvieron mediados por diferencias en el estrés oxidativo. Los experimentos farmacofuncionales revelaron que las arterias de ratones viejos no tratados mostraron restauración de la DDE máxima en presencia del mimético de la superóxido dismutasa, TEMPOL, lo que indica que el estrés oxidativo excesivo relacionado con el superóxido puede ser la causa del deterioro de la DDE asociado con la edad (FIG. 2A). A diferencia de los ratones viejos no tratados, TEMPOL no provocó una mejora significativa en la DDE en ratones viejos que recibieron tratamiento con NMN. El tratamiento con NMN puede restaurar la DDE en los animales viejos al eliminar la supresión de la función endotelial mediada por superóxido con el envejecimiento.

Estas observaciones basadas en la función están respaldadas por evaluaciones directas de la producción de superóxido arterial mediante espectroscopia de resonancia paramagnética de electrones, así como también por los resultados de nitrotirosina, un marcador celular de estrés oxidativo. El envejecimiento en los animales de control se asoció con marcados aumentos tanto en la producción de superóxido aórtico como en la abundancia de nitrotirosina (FIG. 2B-2C). En respuesta al tratamiento con NMN, se observó una normalización de la producción de superóxido aórtico y una marcada reducción en la abundancia de nitrotirosina en ratones viejos.

En conjunto, estos hallazgos respaldan los diversos aspectos y realizaciones de la invención que comprenden la prevención del deterioro relacionado con la edad, la prevención del estrés con el tratamiento de NMN, que el estrés oxidativo es un factor clave que contribuye a la disfunción endotelial asociada con la edad y que la supresión del estrés oxidativo puede ser un mecanismo importante por el cual el NMN ejerce sus efectos beneficiosos sobre la función endotelial en animales viejos.

El NMN reduce la rigidez de las grandes arterias elásticas

El tratamiento con NMN revierte el aumento asociado con la edad en dos índices funcionales de rigidez aórtica: aPWV, la medida clínica estándar de oro de la rigidez de las grandes arterias elásticas, y el módulo elástico, una medida in vitro de las propiedades mecánicas intrínsecas de las arterias (FIG. 3A- 3B).

El tratamiento con NMN invierte la acumulación de colágeno de tipo I en todo el vaso y mejora la elastina arterial en ratones viejos (FIGS. 3C-3D). El NMN reduce la rigidez arterial, al menos en parte, mejorando los cambios estructurales que se producen en las arterias con el avance de la edad.

Se han observado reducciones en el colágeno aórtico en ratones viejos sometidos a otras intervenciones conductuales o farmacológicas a corto plazo en la vejez. El NMN también indujo una restauración parcial de elastina aórtica a niveles no significativamente diferentes de los animales de control jóvenes. No se ha observado un aumento en la elastina aórtica con cualquier otro estilo de vida o intervención farmacológica en ratones, aunque la CR de por vida protege contra la pérdida de propiedades elásticas dentro de las arterias, incluida la degradación de la elastina (Fornieri C. y col. 1999, Connect Tissue Res. 40, 131-143). Estos resultados demuestran que el NMN restaura parcialmente la elastina arterial.

Activación de SIRT1 por NMN

Las mediciones de NAD+ en las muestras aórticas no se pudieron adquirir con confianza, probablemente debido a la cantidad limitada de tejido y al tiempo necesario para extraer la aorta en comparación con tejidos más grandes y más fáciles de obtener, como el músculo esquelético o el tejido adiposo blanco. El tratamiento con NMN restauró selectivamente la actividad de SIRT1 en las arterias de ratones viejos a la de controles jóvenes, como indica una disminución en la proporción de subconjunto p65 acetilado al total del factor de transcripción NE^kB (FIG. 4B).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un mononucleótido de nicotinamida y un excipiente farmacéutico, para su uso en el tratamiento de la disfunción endotelial vascular en un sujeto, donde la composición es para administrar de 0,1 mg a 50 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día.

2. La composición según la reivindicación 1 para su uso según la reivindicación 1, donde, antes del tratamiento, se determina un efecto sobre la disfunción del endotelio vascular en el sujeto.

3. La composición según la reivindicación 1 o 2 para su uso según la reivindicación 1 o 2, donde después del tratamiento se determina un efecto sobre la disfunción del endotelio vascular en el sujeto.

4. La composición según la reivindicación 2 para su uso según la reivindicación 2, donde determinar el indicador de disfunción endotelial vascular comprende determinar el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en el sujeto.

5. La composición según la reivindicación 4 para su uso según la reivindicación 4, donde el grado de dilatación dependiente del endotelio está asociado con una mayor producción de superóxido.

6. La composición según la reivindicación 4 para su uso según la reivindicación 4, donde el grado de dilatación dependiente del endotelio está asociado con una disminución de la expresión de SIRT1.

7. La composición según la reivindicación 4 para su uso según la reivindicación 4, donde el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial disminuye en respuesta a la administración de la composición que comprende mononucleótido de nicotinamida.

8. La composición según la reivindicación 7 para su uso según la reivindicación 7, donde la disminución en el grado de dilatación dependiente del endotelio comprende además una disminución en la producción de superóxido y un aumento de la disponibilidad de óxido nítrico.

9. La composición según la reivindicación 7 para su uso según la reivindicación 7, donde la disminución en el grado de dilatación dependiente del endotelio comprende además un aumento en la expresión y actividad de la proteína SIRT1.

10. Una composición que comprende un mononucleótido de nicotinamida y un excipiente farmacéutico, para su uso en la reducción del grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en un sujeto, donde la composición es para administrar de 0,1 mg a 50 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día.

11. La composición según la reivindicación 10 para su uso según la reivindicación 10, donde, antes de disminuir la extensión de la dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en un sujeto, se determina el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial en el sujeto.

12. La composición según la reivindicación 10 u 11 para su uso según la reivindicación 10 u 11, donde una disminución en el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial se asocia con un aumento en la biodisponibilidad del dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD+).

13. La composición según la reivindicación 12 para su uso según la reivindicación 12, donde la disminución en el grado de dilatación dependiente del endotelio y/o la rigidez arterial comprende además una disminución en la producción de superóxido, un aumento en la biodisponibilidad del óxido nítrico y/o un aumento en la expresión y actividad de la proteína SIRT1.

14. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la composición es para administrar de 0,1 mg a 25 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día, o de 1 mg a 25 mg de mononucleótido de nicotinamida por kg de peso corporal por día.

15. La composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición es para su administración durante un período de tiempo de 30 días, 3 meses, 6 meses, 12 meses, 18 meses, 2 años, 5 años, 7 años, 10 años, 15 años, 20 años, 25 años, 30 años, 35 años, 40 años, o terapia continua durante toda la vida del sujeto.