ES2912603B2

ES2912603B2 - RECOMBINANT SACCHAROMYCES CEREVISIAE FOR THE PRODUCTION OF HYDROXYTYROSOL

Info

Publication number: ES2912603B2
Application number: ES202031186A
Authority: ES
Inventors: Navarro José Manuel Guillamón; Calvo Sara Muñiz; Alcaraz Ricardo Bisquert
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2023-03-27
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: ES2912603A1; WO2022112627A1

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Saccharomyces cerevisiae recombinante para la producción de hidroxitirosolRecombinant Saccharomyces cerevisiae for the production of hydroxytyrosol

La presente invención se refiere a una cepa de Saccharomyces cerevisiae modificada genéticamente mediante integración múltiple del complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli y la enzima modificada ARO4 K229L, con capacidad de producir hidroxitirosol (HT) a partir de glucosa. Por lo tanto, la presente invención se engloba dentro del campo de la biotecnología, en particular, en el uso de microorganismos recombinantes en procesos industriales.The present invention refers to a strain of Saccharomyces cerevisiae genetically modified by multiple integration of the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex and the modified enzyme ARO4 K229L, with the capacity to produce hydroxytyrosol (HT) from glucose. Therefore, the present invention falls within the field of biotechnology, in particular, in the use of recombinant microorganisms in industrial processes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION

El hidroxitirosol (HT) es considerado como uno de los más potentes antioxidantes en la naturaleza. Se encuentra mayoritariamente en las aceitunas y en el aceite de oliva. En la última década, numerosos estudios muestran los beneficios saludables de los antioxidantes en general, pero del HT en particular. Las propiedades beneficiosas atribuidas al aceite de oliva se derivan principalmente de la presencia de este compuesto. El HT puede ser utilizado como nutracéutico debido a sus propiedades anticancerígenas, cardioprotectoras, antiinflamatorias y neuroprotectoras.Hydroxytyrosol (HT) is considered one of the most powerful antioxidants in nature. It is found mainly in olives and olive oil. In the last decade, numerous studies have shown the healthy benefits of antioxidants in general, but HT in particular. The beneficial properties attributed to olive oil derive mainly from the presence of this compound. HT can be used as a nutraceutical due to its anticancer, cardioprotective, anti-inflammatory and neuroprotective properties.

La mayoría del HT disponible actualmente en el mercado procede de extractos de hoja del olivo o de residuos de la industria olivarera (alpechín). Sin embargo, el HT extraído forma parte de una fracción poco purificada. Por el contrario, el HT puro alcanza precios muy altos de mercado (alrededor de 12.000 €/g; Sigma Aldrich). El alto precio se atribuye a la baja concentración en sus fuentes naturales (aceituna y otros vegetales), a los bajos rendimientos de extracción y a la dificultad de sintetizar HT químicamente. Además, la mayoría de los efectos beneficiosos en la salud se han obtenido en condiciones que utilizaban el compuesto muy puro. Por todo ello, se ha incrementado el interés en producir este compuesto mediante aproximaciones biotecnológicas mediante el uso de microorganismos modificados genéticamente para obtener rendimientos que puedan ser viables para su producción industrial.Most of the HT currently available on the market comes from olive leaf extracts or waste from the olive industry (alpechín). However, the extracted HT is part of a poorly purified fraction. On the contrary, pure HT reaches very high market prices (around €12,000/g; Sigma Aldrich). The high price is attributed to the low concentration in its natural sources (olives and other vegetables), the low extraction yields, and the difficulty of chemically synthesizing HT. Furthermore, most of the beneficial health effects have been obtained under conditions using the very pure compound. For all these reasons, interest has increased in producing this compound through biotechnological approaches through the use of genetically modified microorganisms to obtain yields that may be viable for industrial production.

En el estado de la técnica, la mayoría de las estrategias realizadas para la sobreproducción de HT han utilizado a Escherichia coli como factoría celular. En el documento US2010/0047887A1 se describe cepas de E. coli modificadas genéticamente capaces de dirigir la producción de hidroxitirosol a partir de tirosol mediante la sobrexpresión de los genes hpaB y hpaC de E. coli. In the state of the art, most of the strategies carried out for the overproduction of HT have used Escherichia coli as a cellular factory. The document US2010/0047887A1 describes modified E. coli strains genetically capable of directing the production of hydroxytyrosol from tyrosol by overexpression of the E. coli hpaB and hpaC genes .

En el documento Wei Chen, et al., 2019, Nature Communications, Vol. 10, Art. 960 se describen estrategias de ingeniería metabólica para el incremento de la producción de hidroxitirosol a partir de tirosol en E. coli, en particular se describe la comparación de la producción de hidroxitirosol entre cepas recombinantes con mutaciones en el complejo enzimático HpaBC y cepas recombinantes con el complejo enzimático silvestre.The document Wei Chen, et al., 2019, Nature Communications, Vol. 10, Art. 960 describes metabolic engineering strategies for increasing the production of hydroxytyrosol from tyrosol in E. coli, in particular the comparison of hydroxytyrosol production between recombinant strains with mutations in the HpaBC enzyme complex and recombinant strains with the wild-type enzyme complex.

En este momento, las estrategias biotecnológicas desarrolladas para incrementar la producción de hidroxitirosol se llevan a cabo mediante el uso de tirosol o tirosina como fuentes de carbono, conllevando un incremento de los gastos de la producción industrial. Por ello, se hace necesario desarrollar nuevas estrategias biotecnológicas en la industria alimentaria para incrementar la producción de hidroxitirosol preferiblemente a partir de fuentes de carbono simples, como por ejemplo a partir de glucosa. Además, la mayoría de las estrategias realizadas para la producción de HT utilizan Escherichia coli como factoría celular y sería recomendable desarrollar estrategias con otros microorganismos, preferiblemente usados en industria alimentaria.At this moment, the biotechnological strategies developed to increase the production of hydroxytyrosol are carried out through the use of tyrosol or tyrosine as carbon sources, leading to an increase in the expenses of industrial production. Therefore, it is necessary to develop new biotechnological strategies in the food industry to increase the production of hydroxytyrosol preferably from simple carbon sources, such as glucose. In addition, most of the strategies carried out for the production of HT use Escherichia coli as a cell factory and it would be advisable to develop strategies with other microorganisms, preferably used in the food industry.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a una levadura vínica, particularmente Saccharomyces cerevisiae, modificada genéticamente mediante integración múltiple en el genoma del complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli y la enzima ARO4 de Saccharomyces cerevisiae con una mutación puntual, particularmente la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 en la secuencia de aminoácidos de ARO4 (ARO4 K229L), con capacidad de producir hidroxitirosol (HT) a partir de glucosa, disminuyendo los gastos de la producción industrial de HT.The present invention relates to a wine yeast, particularly Saccharomyces cerevisiae, genetically modified by multiple integration into the genome of the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex and the Saccharomyces cerevisiae ARO4 enzyme with a point mutation, particularly the K (lysine) substitution. by L (leucine) at position 229 in the amino acid sequence of ARO4 (ARO4 K229L), with the capacity to produce hydroxytyrosol (HT) from glucose, reducing the costs of industrial production of HT.

Además, Saccharomyces cerevisiae se clasifica como un microorganismo GRAS, Generally Recognized As Safe por la FDA, y presenta propiedades antimicrobianas frente a bacterias y antioxidante, permitiendo su uso como factoría celular en la industria alimentaria y actuar como sustituto o reductor del elevado contenido de sulfuroso en vinos (relacionado cada vez más con alergias o sensibilidad por parte del consumidor).In addition, Saccharomyces cerevisiae is classified as a GRAS microorganism, Generally Recognized As Safe by the FDA, and has antimicrobial and antioxidant properties against bacteria, allowing its use as a cell factory in the food industry and acting as a substitute or reducer for high sulfur content. in wines (increasingly related to allergies or sensitivity on the part of the consumer).

Inicialmente, los inventores desarrollaron cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes mediante integración múltiple en el genoma del complejo hidroxilasa HpaBC de Escheríchia coli, consistente en dos genes HpaB y HpaC responsables de la actividad 4-hidroxifenilacetato monooxigenasa que transforman el tirosol en HT (cepa Saccharomyces cerevisiae HpaBC). Además, introdujeron modificaciones en las enzimas involucradas en la ruta de la síntesis de aminoácidos aromáticos (triptófano, fenilalanina y tirosina). Dichas modificaciones fueron, tanto en la sobreexpresión de los genes de Saccharomyces cerevisiae silvestre; ARO3, ARO4, ARO7 y ARO10, así como la desregulación de la represión catabólica en el metabolismo de los aminoácidos aromáticos mediante mutaciones puntuales de genes de dicho metabolismo, particularmente la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 222 de ARO3 [HpaBC ARO3 K222L], la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 de ARO4 [HpaBC ARO4 K229L] y la sustitución de G (glicina) por S (serina) en la posición 141 de ARO7 [HpaBC ARO7 G141S].Initially, the inventors developed strains of Saccharomyces cerevisiae recombinants by multiple integration into the genome of the Escheríchia coli HpaBC hydroxylase complex, consisting of two genes HpaB and HpaC responsible for the 4-hydroxyphenylacetate monooxygenase activity that transforms tyrosol into HT ( Saccharomyces cerevisiae HpaBC strain). In addition, they introduced modifications in the enzymes involved in the aromatic amino acid synthesis pathway (tryptophan, phenylalanine and tyrosine). Said modifications were, both in the overexpression of wild Saccharomyces cerevisiae genes; ARO3, ARO4, ARO7 and ARO10, as well as the deregulation of catabolic repression in the metabolism of aromatic amino acids through point mutations of genes of said metabolism, particularly the substitution of K (lysine) for L (leucine) at position 222 of ARO3 [HpaBC ARO3 K222L], the substitution of K (lysine) for L (leucine) at position 229 of ARO4 [HpaBC ARO4 K229L] and the substitution of G (glycine) for S (serine) at position 141 of ARO7 [ HpaBC ARO7 G141S].

Todas las cepas de Saccharomyces cerevisiae recombinantes mostraron un aumento de la producción de hidroxitirosol en comparación con la cepa control, sin embargo, la cepa de Saccharomyces cerevisiae HpaBC ARO4 K229L mostró un incremento significativo en la producción de hidroxitirosol, llegando hasta una concentración de HT de aproximadamente 6 mg-L-1 (Figura 1 y Tabla 3).All recombinant Saccharomyces cerevisiae strains showed an increase in hydroxytyrosol production compared to the control strain, however, the Saccharomyces cerevisiae strain HpaBC ARO4 K229L showed a significant increase in hydroxytyrosol production, reaching up to a HT concentration of approximately 6 mg-L-1 (Figure 1 and Table 3).

Posteriormente, los inventores determinaron la producción de hidroxitirosol a partir de glucosa de la cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante HpaBC + ARO4K229L en otras condiciones de cultivo (y en comparación con la cepa de Saccharomyces cerevisiae HpaBC), obteniendo un aumento de más de 26 veces la producción de hidroxitirosol con respecto a la producción de la cepa control, Saccharomyces cerevisiae HpaBC, superando los 8,5 mg-L-1 (Figura 4 y Tabla 7).Subsequently, the inventors determined the production of hydroxytyrosol from glucose of the recombinant Saccharomyces cerevisiae strain HpaBC + ARO4K229L under other culture conditions (and in comparison with the Saccharomyces cerevisiae strain HpaBC), obtaining an increase of more than 26 times the production of hydroxytyrosol with respect to the production of the control strain, Saccharomyces cerevisiae HpaBC, exceeding 8.5 mg-L-1 (Figure 4 and Table 7).

Finalmente, los inventores optimizaron tanto las condiciones de glucosa como el tiempo de producción para la obtención de hidroxitirosol. La cepa de Saccharomyces cerevisiae con el plásmido que comprende HpaBC + ARO4K229L llegó a superar los 350 mg-L-1 (Figura 5). Además, la cepa Saccharomyces cerevisiae recombinante con el complejo HpaBC + ARO4K229L integrado, en condiciones óptimas de cultivo, llegó a superar los 18 mg- L-1 (Figura 6).Finally, the inventors optimized both the glucose conditions and the production time to obtain hydroxytyrosol. The Saccharomyces cerevisiae strain with the plasmid comprising HpaBC + ARO4K229L exceeded 350 mg-L-1 (Figure 5). In addition, the recombinant Saccharomyces cerevisiae strain with the integrated HpaBC + ARO4K229L complex, under optimal culture conditions, exceeded 18 mg-L-1 (Figure 6).

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a una cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante, de aquí en adelante la "cepa de la invención”, que comprende las siguientes secuencias de nucleótidos:Therefore, in a first aspect, the present invention relates to a strain of Recombinant Saccharomyces cerevisiae , hereinafter the "strain of the invention", comprising the following nucleotide sequences:

(i) las secuencias de nucleótidos que codifican el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli o un fragmento de las mismas, y(i) the nucleotide sequences encoding the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex or a fragment thereof, and

(ii) la secuencia de nucleótidos que codifica para la enzima ARO4 de Saccharomyces cerevisiae que comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 (ARO4 K229L) o un fragmento de la misma;(ii) the nucleotide sequence encoding the Saccharomyces cerevisiae ARO4 enzyme comprising the substitution of K (lysine) for L (leucine) at position 229 (ARO4 K229L) or a fragment thereof;

en donde la secuencia de nucleótidos (ii) está sobreexpresada con respecto a una cepa de Saccharomyces cerevisiae no recombinante o wild type. wherein the nucleotide sequence (ii) is overexpressed with respect to a non-recombinant or wild type Saccharomyces cerevisiae strain .

En la presente invención el término "cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante” se refiere a aquella cepa de una levadura vínica, particularmente de la especie Saccharomyces cerevisiae, que ha sido modificada genéticamente, distinguiéndose así de la cepa "madre”, "parental” o wild type. En el contexto de la presente invención, los términos "Saccharomyces cerevisiae recombinante” y "Saccharomyces cerevisiae transgénica” son términos equivalentes y significan lo mismo.In the present invention the term "recombinant Saccharomyces cerevisiae strain" refers to that strain of a wine yeast, particularly of the species Saccharomyces cerevisiae, which has been genetically modified, thus distinguishing itself from the "mother", "parent" or wild strain. In the context of the present invention, the terms "recombinant Saccharomyces cerevisiae " and "transgenic Saccharomyces cerevisiae " are equivalent terms and mean the same thing.

La cepa de la invención es sobreproductora de hidroxitirosol a partir de glucosa gracias a que presenta insertado en su genoma varias secuencias de nucleótidos, de aquí en adelante "secuencias de la invención”, que codifican para las siguientes enzimas o proteínas:The strain of the invention is an overproducer of hydroxytyrosol from glucose thanks to the fact that it has several nucleotide sequences inserted into its genome, hereinafter "sequences of the invention", which code for the following enzymes or proteins:

(i) el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC, consistente en dos genes HpaB (secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1 que codifica una proteína con secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2) y HpaC (secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3 que codifica una proteína con secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4) responsables de la actividad 4-hidroxifenilacetato monooxigenasa que transforman el tirosol en HT. En una realización particular, el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC es el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli. (i) the HpaBC hydroxylase enzyme complex, consisting of two genes HpaB (nucleotide sequence SEQ ID NO: 1 encoding a protein with amino acid sequence SEQ ID NO: 2) and HpaC (nucleotide sequence SEQ ID NO: 3 encoding a protein with amino acid sequence SEQ ID NO: 4) responsible for the 4-hydroxyphenylacetate monooxygenase activity that transforms tyrosol into HT. In a particular embodiment, the HpaBC hydroxylase enzyme complex is the HpaBC hydroxylase enzyme complex from Escherichia coli.

En otra realización particular el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli comprende las secuencias de nucleótidos correspondientes a los genes HpaB y HpaC, de aquí en adelante el "complejo enzimático hidroxilasa HpaBC” que presentan, al menos, un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, respectivamente. En otra realización particular, el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli comprende, o consiste en, las secuencias de nucleótidos que presentan un 100% de identidad de secuencia con las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3.In another particular embodiment, the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex comprises the nucleotide sequences corresponding to the HpaB and HpaC genes, hereinafter the "HpaBC hydroxylase enzyme complex" that present at least 70, 75, 80, 85 , 90, 95, 96, 97, 98, 99% sequence identity with SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.In another particular embodiment, the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex comprises, or consists of, the nucleotide sequences that have 100% sequence identity to the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.

En otra realización particular, la secuencia de aminoácidos que codifica el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli comprende las secuencias de aminoácidos que presentan, al menos, un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO:4. En otra realización particular, la secuencia de aminoácidos que codifica el complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli comprende, o consiste en, las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4.In another particular embodiment, the amino acid sequence encoding the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex comprises the amino acid sequences that present at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 % sequence identity with SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4. In another particular embodiment, the amino acid sequence encoding the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex comprises, or consists of, the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.

En la presente invención, todas las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que presentan una identidad de secuencia de, al menos, un 70% con las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 o con las secuencias SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, respectivamente, se consideran variantes funcionalmente equivalentes del complejo enzimático hidroxilasa HpaBC de Escherichia coli, es decir, aunque comprendan distinta secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, son capaces de catalizar la actividad 4-hidroxifenilacetato monooxigenasa que transforma el tirosol en HT. Es práctica de rutina para un experto en la materia los ensayos para determinar si diferentes secuencias se consideran funcionalmente equivalentes.In the present invention, all nucleotide or amino acid sequences that have a sequence identity of at least 70% with the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 or with the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively, are considered functionally equivalent variants of the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex, that is, even though they comprise different nucleotide or amino acid sequences, they are capable of catalyzing the 4-hydroxyphenylacetate monooxygenase activity that transforms tyrosol. in HT. It is routine practice for one skilled in the art to assay to determine whether different sequences are considered functionally equivalent.

(ii) la enzima sintasa 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) codificada por el gen ARO4 que cataliza el primer paso en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y que además comprende la sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 en su secuencia proteica, de aquí en adelante "ARO4 K229L”. En una realización particular, el gen ARO4 K229L es el gen ARO4 K229L de Saccharomyces cerevisiae. (ii) the enzyme 3-deoxy-D-arabino-heptulosonato-7-phosphate (DAHP) synthase encoded by the ARO4 gene that catalyzes the first step in the biosynthesis of aromatic amino acids and also includes the substitution of K (lysine) for L (leucine) at position 229 in its protein sequence, hereinafter "ARO4 K229L". In a particular embodiment, the ARO4 K229L gene is the ARO4 K229L gene of Saccharomyces cerevisiae.

En otra realización particular, la secuencia del gen ARO4 K229L comprende una secuencia de nucleótidos que presenta, al menos, un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 6. En otra realización particular, el gen ARO4 K229L comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos que presenta un 100% de identidad de secuencia con la secuencia SEQ ID NO: 6.In another particular embodiment, the ARO4 K229L gene sequence comprises a nucleotide sequence that presents at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% sequence identity with SEQ ID NO: 6. In another particular embodiment, the ARO4 K229L gene comprises, or consists of, a nucleotide sequence that presents 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6.

En otra realización particular, la secuencia de aminoácidos codificada por el gen ARO4 K229L de Saccharomyces cerevisiae comprende una secuencia de aminoácidos que presenta, al menos, un 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 7. En otra realización particular, la secuencia de aminoácidos que codifica el gen ARO4 K229L de Saccharomyces cerevisiae comprende, o consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7.In another particular embodiment, the amino acid sequence encoded by the ARO4 gene K229L from Saccharomyces cerevisiae comprises an amino acid sequence that has at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% sequence identity with SEQ ID NO: 7. In another particular embodiment, the amino acid sequence encoding the ARO4 K229L gene of Saccharomyces cerevisiae comprises, or consists of, the amino acid sequence SEQ ID NO: 7.

En la presente invención, todas las secuencias de nucleótidos o de aminoácidos que presentan una identidad de secuencia de, al menos, un 70% con la secuencia SEQ ID NO: 6 o con la secuencia SEQ ID NO: 7, respectivamente, se consideran variantes funcionalmente equivalentes del gen ARO4 K229L de Saccharomyces cerevisiae, es decir, aunque comprendan distinta secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, tienen actividad sintasa 3-desoxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato (DAHP) para catalizar el primer paso en la biosíntesis de aminoácidos aromáticos. Es práctica de rutina para un experto en la materia los ensayos para determinar si diferentes secuencias se consideran funcionalmente equivalentes.In the present invention, all nucleotide or amino acid sequences that have a sequence identity of at least 70% with the sequence SEQ ID NO: 6 or with the sequence SEQ ID NO: 7, respectively, are considered variants. functionally equivalent to the Saccharomyces cerevisiae ARO4 K229L gene, that is, although they comprise a different nucleotide or amino acid sequence, they have 3-deoxy-D-arabino-heptulosonato-7-phosphate (DAHP) synthase activity to catalyze the first step in biosynthesis of aromatic amino acids. It is routine practice for one skilled in the art to assay to determine whether different sequences are considered functionally equivalent.

En la presente invención, el término "variante" significa un polipéptido o proteína (o en su caso un polinucleótido) que tiene la misma actividad que un polipéptido o proteína (o polinucleótido) de referencia, pero que comprende una alteración en su secuencia, es decir, una sustitución, inserción y/o deleción, en una o más (p.ej., varias) posiciones. A modo de ejemplo, una sustitución significa el reemplazo del aminoácido (o de un nucleótido) que ocupa una posición con un aminoácido (o de un nucleótido) diferente; una deleción significa la deleción del aminoácido (o de un nucleótido) que ocupa una posición; y una inserción significa agregar un aminoácido (o de un nucleótido) adyacente e inmediatamente después del aminoácido (o de un nucleótido) que ocupa una posición. Los cambios en los polinucleótidos incluyen, sin limitar a, sustituciones, inserciones y/o deleción entre uno o más nucleótidos, representados por sus bases nitrogenadas tales como adenina (A), guanina (G), citosina (C), timina (T) y uracilo (U). Los cambios en los aminoácidos pueden ser de una naturaleza menor, es decir, sustituciones o inserciones de aminoácidos conservadoras que no afectan significativamente al plegamiento y/o la actividad del polipéptido/de la proteína; pequeñas deleciones, típicamente de 1-30 aminoácidos; pequeñas extensiones amino o carboxilo-terminales, tales como un residuo de metionina amino-terminal; un péptido enlazador pequeño de hasta 20-25 residuos; o una pequeña extensión que facilita la purificación cambiando la carga neta u otra función, como una cola de polihistidina, un epítopo antigénico o un dominio de unión. Los ejemplos de sustituciones conservadoras están dentro de los grupos de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrófobos (leucina, isoleucina y valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina), y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina, treonina y metionina). Las sustituciones de aminoácidos que generalmente no alteran la actividad específica son conocidas en la técnica. Las sustituciones comunes son Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gly.In the present invention, the term "variant" means a polypeptide or protein (or, where appropriate, a polynucleotide) that has the same activity as a reference polypeptide or protein (or polynucleotide), but that includes an alteration in its sequence, that is ie, a substitution, insertion and/or deletion, at one or more (eg, several) positions. By way of example, a substitution means the replacement of the amino acid (or a nucleotide) occupying a position with a different amino acid (or a nucleotide); a deletion means the deletion of the amino acid (or of a nucleotide) occupying a position; and an insertion means adding an amino acid (or a nucleotide) adjacent to and immediately after the amino acid (or a nucleotide) that occupies a position. Changes in polynucleotides include, but are not limited to, substitutions, insertions, and/or deletion between one or more nucleotides, represented by their nitrogenous bases such as adenine (A), guanine (G), cytosine (C), thymine (T) and uracil (U). The amino acid changes may be of a minor nature, ie, conservative amino acid substitutions or insertions that do not significantly affect the folding and/or activity of the polypeptide/protein; small deletions, typically 1-30 amino acids; small amino- or carboxyl-terminal extensions, such as an amino-terminal methionine residue; a small linker peptide of up to 20-25 residues; or a small extension that facilitates purification by changing the net charge or other function, such as a polyhistidine tag, an antigenic epitope, or a domain of Union. Examples of conservative substitutions are within the groups of basic amino acids (arginine, lysine and histidine), amino acids (glutamic acid and aspartic acid), polar amino acids (glutamine and asparagine), hydrophobic amino acids (leucine, isoleucine and valine), aromatic amino acids (phenylalanine, tryptophan, and tyrosine), and small amino acids (glycine, alanine, serine, threonine, and methionine). Amino acid substitutions that generally do not alter specific activity are known in the art. Common substitutions are Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/ Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu and Asp/Gly.

En el contexto de la presente invención también se contemplan fragmentos de las secuencias de nucleótidos o fragmentos de las proteínas codificadas por dichas secuencias de nucleótidos, siempre y cuando dichos fragmentos puedan desempeñar la función de la proteína completa. Así, el término "fragmento" se refiere a una proteína o polipéptido (o polinucleótido) con uno o más aminoácidos (o nucleótidos) ausentes de los extremos de su secuencia, como por ejemplo el terminal amino y/o carboxilo de la proteína o el polipéptido o en los extremos 3'o 5'de la secuencia de nucleótidos; donde el fragmento tiene la actividad de la proteína completa. Ensayos para averiguar si un fragmento de una proteína/polinucleótido tiene la misma actividad/función que la proteína/polinucleótido completa han sido descritos en párrafos anteriores para el caso de las variantes de las proteínas/polinucleótidos.In the context of the present invention, fragments of the nucleotide sequences or fragments of the proteins encoded by said nucleotide sequences are also contemplated, as long as said fragments can perform the function of the complete protein. Thus, the term "fragment" refers to a protein or polypeptide (or polynucleotide) with one or more amino acids (or nucleotides) missing from the ends of its sequence, such as the amino and/or carboxyl terminus of the protein or the polypeptide or at the 3' or 5' ends of the nucleotide sequence; where the fragment has the activity of the complete protein. Assays to find out if a fragment of a protein/polynucleotide has the same activity/function as the complete protein/polynucleotide have been described in previous paragraphs for the case of protein/polynucleotide variants.

En la presente invención, se entiende por “identidad” o “identidad de secuencia” al grado de similitud entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos obtenido mediante el alineamiento óptimo de las dos secuencias. Dependiendo del número de residuos comunes entre las secuencias alineadas, se obtendrá un grado de identidad expresado en tanto por ciento. El grado de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse por métodos convencionales, por ejemplo, mediante algoritmos estándar de alineamiento de secuencias conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo BLAST. Los programas BLAST, por ejemplo, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, son de dominio público en la página web de The National Center for Biotechonology Information (NCBI). In the present invention, "identity" or "sequence identity" is understood to be the degree of similarity between two nucleotide or amino acid sequences obtained by optimal alignment of the two sequences. Depending on the number of common residues between the aligned sequences, a degree of identity expressed as a percentage will be obtained. The degree of identity between two amino acid sequences can be determined by conventional methods, for example, by standard algorithms for sequence alignment known in the state of the art, such as BLAST. The BLAST programs, eg, BLASTN, BLASTX, and TBLASTX, BLASTP and TBLASTN, are in the public domain on the website of The National Center for Biotechnology Information (NCBI).

Una característica de la cepa de la invención es que la secuencia de nucleótidos (ii) está sobreexpresada con respecto a una cepa de Saccharomyces cerevisiae no recombinante o wild type. A characteristic of the strain of the invention is that the nucleotide sequence (ii) is overexpressed with respect to a non-recombinant or wild type Saccharomyces cerevisiae strain.

Como entiende un experto en la materia los codones de las secuencias de nucleótidos de la invención pueden estar optimizados para su expresión en Saccharomyces cerevisiae, es decir, la secuencia de nucleótidos ha sido alterada con respecto a la secuencia de nucleótidos original de forma que uno o más codones de la secuencia de nucleótidos han sido cambiados a un codón diferente que codifica el mismo aminoácido, pero que es utilizado con más frecuencia por la célula huésped (en la presente invención, una Saccharomyces cerevisiae) que el codón original. La degeneración del código genético hace que todos los aminoácidos excepto metionina y triptófano estén codificados por más de un condón. Por ejemplo, arginina, leucina y serina están codificados por 6 codones diferentes, pero muchos organismos usan ciertos codones con más frecuencia que otros. Particularmente como la secuencia (i) de la invención es heteróloga a la célula huésped (pertenece a E. coli), cabe la posibilidad de optimizar la secuencia de nucleótidos para su expresión en Saccharomyces cerevisiae. As understood by a person skilled in the art, the codons of the nucleotide sequences of the invention may be optimized for their expression in Saccharomyces cerevisiae, that is, the nucleotide sequence has been altered with respect to the original nucleotide sequence in such a way that one or more codons in the nucleotide sequence have been changed to a different codon that codes for the same amino acid, but is used more frequently by the host cell (in the present invention, a Saccharomyces cerevisiae) than the original codon. The degeneracy of the genetic code causes all amino acids except methionine and tryptophan to be coded for by more than one condom. For example, arginine, leucine, and serine are coded for by 6 different codons, but many organisms use certain codons more frequently than others. Particularly as the sequence (i) of the invention is heterologous to the host cell (belongs to E. coli), it is possible to optimize the nucleotide sequence for its expression in Saccharomyces cerevisiae.

Las secuencias de nucleótidos (i) y (ii) de la cepa de la invención pueden formar de parte de una o más construcciones genéticas que serán introducidas en Saccharomyces cerevisiae para obtener la cepa de la invención. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con una construcción génica que comprende, al menos, una secuencia entre las secuencias de nucleótidos (i) y (ii) de la cepa de la invención. La construcción génica puede comprender, además, los elementos necesarios para la expresión de las secuencias de nucleótidos (i) y (ii) de la cepa de la invención. Dichos elementos incluyen, sin limitar a, promotores, terminadores de la transcripción, marcadores de selección, orígenes de replicación, potenciadores de la expresión (enhancers) y sitios de unión a ribosomas (RBS).The nucleotide sequences (i) and (ii) of the strain of the invention may form part of one or more genetic constructions that will be introduced into Saccharomyces cerevisiae to obtain the strain of the invention. Therefore, the present invention also relates to a gene construct comprising at least one sequence between the nucleotide sequences (i) and (ii) of the strain of the invention. The gene construction can also comprise the elements necessary for the expression of the nucleotide sequences (i) and (ii) of the strain of the invention. Such elements include, without limitation, promoters, transcription terminators, selection markers, origins of replication, expression enhancers, and ribosome binding sites (RBS).

Además, como entiende un experto en la materia, las secuencias de nucleótidos (i) y (ii) de la cepa de la invención pueden estar unidas operativamente con un promotor que puede actuar en la Saccharomyces cerevisiae hospedadora. La selección del promotor puede permitir la expresión de un producto génico deseado en una diversidad de condiciones. Los promotores pueden seleccionarse para una función óptima, de manera que se inserte la construcción del vector. Los promotores pueden seleccionarse también basándose en sus características reguladoras. Los ejemplos de dichas características incluyen mejora de la actividad de transcripción e inducibilidad.Furthermore, as is understood by one skilled in the art, the nucleotide sequences (i) and (ii) of the strain of the invention may be operably linked to a promoter capable of acting in the Saccharomyces cerevisiae host. Promoter selection can allow expression of a desired gene product under a variety of conditions. Promoters can be selected for optimal function such that the vector construct is inserted. Promoters can also be selected based on its regulatory characteristics. Examples of such features include enhancement of transcription activity and inducibility.

El promotor puede ser un promotor inducible. Por ejemplo, el promotor puede inducirse de acuerdo con la temperatura, el pH, una hormona, un metabolito (por ejemplo, lactosa, manitol, un aminoácido), la luz (por ejemplo, longitud de onda específica), un metal pesado o un antibiótico.The promoter may be an inducible promoter. For example, the promoter can be induced according to temperature, pH, a hormone, a metabolite (eg, lactose, mannitol, an amino acid), light (eg, specific wavelength), a heavy metal, or a antibiotic.

Los marcadores de selección son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Estos marcadores de selección, o genes de selección, pueden ser genes de resistencia a antibióticos, genes reporteros, como el gen que codifica la beta-galactosidasa del operón lactosa, etc. Entre los genes que confieren resistencia a antibióticos se incluyen, sin limitar a, ampicilina, tetraciclina, kanamicina, higromicina, gentamicina, etc. Los marcadores permiten la selección de las células transformadas satisfactoriamente que crecen en un medio que contiene el antibiótico correspondiente porque llevan el gen de resistencia apropiado.Selection markers are widely known in the state of the art. These selection markers, or selection genes, can be antibiotic resistance genes, reporter genes, such as the gene encoding the lactose operon beta-galactosidase, etc. Genes that confer antibiotic resistance include, but are not limited to, ampicillin, tetracycline, kanamycin, hygromycin, gentamicin, etc. The markers allow the selection of successfully transformed cells that grow in medium containing the corresponding antibiotic because they carry the appropriate resistance gene.

La introducción de las secuencias de nucleótidos (i) y (ii) de la cepa de la invención o de la construcción/es génica/s que comprenden dichas secuencias de nucleótidos puede realizarse mediante el empleo de un vector, por ejemplo, un vector de expresión.The introduction of the nucleotide sequences (i) and (ii) of the strain of the invention or of the gene construct(s) comprising said nucleotide sequences can be carried out by using a vector, for example a vector of expression.

En la presente descripción, el término “vector” se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede usarse para transportar o trasferir una secuencia de nucleótidos al interior de una célula. Un vector puede contener diferentes elementos funcionales que incluyen, pero no se limitan a, elementos de control de la transcripción, como promotores u operadores, regiones o potenciadores de la unión a factores de transcripción, y elementos de control para iniciar y terminar la transcripción. Los vectores incluyen, pero no se limitan a: plásmidos, cósmidos, virus, fagos, casetes de expresión recombinantes y transposones. Algunos vectores son capaces de replicarse o dividirse autónomamente tras ser introducidos en la célula huésped, como los vectores bacterianos con un origen de replicación bacteriano. Otros vectores pueden integrarse en el genoma de la célula huésped y replicarse así junto con el genoma celular.In the present description, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule that can be used to transport or transfer a nucleotide sequence into a cell. A vector may contain different functional elements including, but not limited to, transcriptional control elements, such as promoters or operators, transcription factor binding regions or enhancers, and control elements to initiate and terminate transcription. Vectors include, but are not limited to: plasmids, cosmids, viruses, phages, recombinant expression cassettes, and transposons. Some vectors are capable of autonomous replication or division upon introduction into the host cell, such as bacterial vectors with a bacterial origin of replication. Other vectors can integrate into the host cell genome and thus replicate along with the cell genome.

La obtención de dicho vector puede realizarse por métodos convencionales conocidos por los técnicos en la materia, al igual que para la transformación de Saccharomyces cerevisiae se pueden utilizar diferentes métodos ampliamente conocidos -transformación química, liposomas, transfección, electroporación, bombardeo de partículas, balas génicas (“gene gurí’), microinyección, etc. - descritos en diversos manuales ampliamente conocidos por el experto en la materia.Obtaining said vector can be carried out by conventional methods known to those skilled in the art, as well as for the transformation of Saccharomyces cerevisiae, different widely known methods can be used - chemical transformation, liposomes, transfection, electroporation, particle bombardment, gene bullets ( 'gene gourd'), microinjection, etc. - described in various manuals widely known to the person skilled in the art.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición, de aquí en adelante “composición de la invención”, que comprende la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención, incluyendo solas o en combinación todas las realizaciones particulares descritas en párrafos anteriores. Adicionalmente, la composición de la invención puede comprender otras especies del género Saccharomyces, además de la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención, tales como: S. uvarum, S. bayanus, S. pastorianus, S. eubayanus, S. paradoxus, S. mikatae, S. jurei, S. kudriavzevii y S. arboricola. Además, la composición de la invención puede comprender otras especies de levaduras no convencionales utilizadas como factorías celulares, tales como Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbrueckii, Lachanceae thermotolerans, Ogataea polymorpha, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Candida boidinii, Pichia methanolica, Xanthophyllomyces dendrorhous y Kluyveromyces lactis. Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición que comprende un consorcio sintético microbiano, también denominada “composición de la invención”, comprendido por la cepa de la invención tal como se ha definido a lo largo de la presente descripción, y al menos un microorganismo que no es Saccharomyces cerevisiae. In another aspect, the present invention relates to a composition, hereinafter "composition of the invention", comprising the Saccharomyces cerevisiae strain of the invention, including alone or in combination all the particular embodiments described in previous paragraphs. Additionally, the composition of the invention may comprise other species of the genus Saccharomyces , in addition to the Saccharomyces cerevisiae strain of the invention, such as: S. uvarum, S. bayanus, S. pastorianus, S. eubayanus, S. paradoxus, S. mikatae, S. jurei, S. kudriavzevii and S. arboricola. In addition, the composition of the invention may comprise other unconventional yeast species used as cell factories, such as Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbrueckii, Lachanceae thermotolerans, Ogataea polymorpha, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Arxula adeninivorans, Candida boidinii , Pichia methanolica , Xanthophyllomyces dendrorhous , and Kluyveromyces lactis. Therefore, in another aspect, the present invention relates to a composition comprising a synthetic microbial consortium, also called "composition of the invention", comprised of the strain of the invention as defined throughout the present description, and at least one microorganism that is not Saccharomyces cerevisiae.

Tal como se demuestra en los ejemplos de la presente invención, mediante el cultivo de la cepa de la invención es posible producir hidroxitirosol (HT) a partir de glucosa.As demonstrated in the examples of the present invention, by culturing the strain of the invention it is possible to produce hydroxytyrosol (HT) from glucose.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención es un método para producir hidroxitirosol, de aquí en adelante el “método de la invención” que comprende:Therefore, another aspect of the present invention is a method for producing hydroxytyrosol, hereinafter the "method of the invention" comprising:

(a) cultivar al menos la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención o una población que comprende la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno, y(a) culturing at least the Saccharomyces cerevisiae strain of the invention or a population comprising the Saccharomyces cerevisiae strain of the invention in a culture medium comprising at least one carbon source and one nitrogen source, and

(b) purificar el hidroxitirosol obtenido durante la etapa (a).(b) purifying the hydroxytyrosol obtained during step (a).

La cepa de la invención ha sido definida en párrafos anteriores del presente documento, y se aplica de igual forma a este aspecto de la invención, así como todas sus realizaciones particulares (solas o en combinación).The strain of the invention has been defined in previous paragraphs of this document, and applies equally to this aspect of the invention, as well as all its particular embodiments (alone or in combination).

El término “hidroxitirosol” usado en la presente invención, se refiere a una molécula química con formula 3,4-dihidroxifeniletanol que es un polifenol fitoquímico con propiedades antioxidantes.The term "hydroxytyrosol" used in the present invention refers to a chemical molecule with the formula 3,4-dihydroxyphenylethanol, which is a phytochemical polyphenol with antioxidant properties.

Como entiende el experto en la materia, el crecimiento o cultivo de la cepa o de la población que comprende la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende los componentes necesarios para que dicho microorganismo prolifere. Así, en el presente documento, el término “medio de cultivo” se refiere a una sustancia, un compuesto, una mezcla, una disolución que comprende la fuente de carbono y nitrógeno necesarias para el crecimiento y metabolismo del microorganismo, en donde dicho medio de cultivo puede ser sólido, semisólido, semilíquido o líquido.As understood by a person skilled in the art, the growth or culture of the strain or of the population comprising the Saccharomyces cerevisiae strain of the invention is carried out in a culture medium comprising the necessary components for said microorganism to proliferate. Thus, in the present document, the term "culture medium" refers to a substance, a compound, a mixture, a solution that comprises the source of carbon and nitrogen necessary for the growth and metabolism of the microorganism, wherein said culture medium culture can be solid, semi-solid, semi-liquid or liquid.

En el presente documento, el término “fuente de nitrógeno” se refiere a moléculas, compuestos químicos, materia orgánica, que comprenden átomos de nitrógeno (N) y que son metabolizadas por los microorganismos para llevar a cabo su crecimiento y desarrollo, en donde dicha fuente de nitrógeno puede tener origen inorgánico u orgánico.In this document, the term "nitrogen source" refers to molecules, chemical compounds, organic matter, which comprise nitrogen (N) atoms and which are metabolized by microorganisms to carry out their growth and development, where said Nitrogen source can be of inorganic or organic origin.

En una realización particular del método de la invención la fuente de nitrógeno se selecciona de la lista que consiste en: amonio, urea, los diferentes veintidós aminoácidos proteinogénicos y cualquier combinación entre ellos. En otra realización particular del método de la invención, la fuente de nitrógeno es amonio.In a particular embodiment of the method of the invention, the nitrogen source is selected from the list consisting of: ammonium, urea, the different twenty-two proteinogenic amino acids and any combination between them. In another particular embodiment of the method of the invention, the nitrogen source is ammonium.

En el presente documento, el término “fuente de carbono” se refiere a moléculas, compuestos químicos, materia orgánica, que comprenden átomos de carbono (C) y que son metabolizadas por los microorganismos para llevar a cabo su crecimiento y desarrollo, en donde dicha fuente de carbono puede tener origen inorgánico u orgánico.In this document, the term "carbon source" refers to molecules, chemical compounds, organic matter, which comprise carbon atoms (C) and which are metabolized by microorganisms to carry out their growth and development, where said Carbon source can be of inorganic or organic origin.

En una realización particular del método de la invención la fuente de carbono se selecciona de la lista que consiste en: glucosa, fructosa, manosa, galactosa, sacarosa, maltosa y rafinosa. En otra realización particular del método de la invención, la fuente de carbono es glucosa. In a particular embodiment of the method of the invention, the carbon source is selected from the list consisting of: glucose, fructose, mannose, galactose, sucrose, maltose and raffinose. In another particular embodiment of the method of the invention, the carbon source is glucose.

En una realización particular del método de la invención, el medio de cultivo comprende glucosa en una concentración entre 1 y 400 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo.In a particular embodiment of the method of the invention, the culture medium comprises glucose in a concentration between 1 and 400 grams of glucose per liter of culture medium.

En otra realización más particular del método de la invención, el medio de cultivo comprende glucosa en una concentración entre 50 y 350 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo (g/L), y más preferiblemente entre 100 y 300 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo, y aún más preferiblemente entre 100 y 250 gramos de glucosa por litro de medio de cultivo.In another more particular embodiment of the method of the invention, the culture medium comprises glucose in a concentration between 50 and 350 grams of glucose per liter of culture medium (g/L), and more preferably between 100 and 300 grams of glucose per liter. liter of culture medium, and even more preferably between 100 and 250 grams of glucose per liter of culture medium.

En otra realización aún más particular, el medio de cultivo comprende glucosa en una concentración de 110 g/g, 120 g/g, 130 g/g, 140 g/g, 150 g/g, 160 g/g, 170 g/g, 180 g/g, 190 g/g, 200 g/g, 210 g/g, 220 g/g, 230 g/g o 240 g/g (gramos de glucosa por litro de medio de cultivo), más preferiblemente una concentración de glucosa de 150 g/g o 160 g/g.In another even more particular embodiment, the culture medium comprises glucose in a concentration of 110 g/g, 120 g/g, 130 g/g, 140 g/g, 150 g/g, 160 g/g, 170 g/ g, 180 g/g, 190 g/g, 200 g/g, 210 g/g, 220 g/g, 230 g/g or 240 g/g (grams of glucose per liter of culture medium), more preferably one glucose concentration of 150 g/g or 160 g/g.

Además, el medio de cultivo del método de la invención puede comprender oligoelementos (sales) y vitaminas.Furthermore, the culture medium of the method of the invention may comprise trace elements (salts) and vitamins.

Así mismo, el medio de cultivo utilizado puede ser un medio de cultivo completo utilizado en la industria para el crecimiento de levaduras, como por ejemplo las melazas de caña de azúcar y remolacha, subproducto de la industria azucarera, o el licor de maíz de la industria del almidón.Likewise, the culture medium used can be a complete culture medium used in the industry for yeast growth, such as sugar cane and beet molasses, a by-product of the sugar industry, or corn liquor from the starch industry.

Como entiende un experto en la materia, el cultivo de la cepa o de una población que comprende la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención tiene que llevarse a cabo en unas condiciones adecuadas para que la levadura pueda crecer y sintetizar HT. Las condiciones adecuadas de pH, temperatura, humedad, etc., necesarias para cultivar una cepa de Saccharomyces cerevisiae son ampliamente conocidas en el estado de la técnica.As understood by a person skilled in the art, the cultivation of the strain or of a population comprising the strain of Saccharomyces cerevisiae of the invention must be carried out under suitable conditions so that the yeast can grow and synthesize HT. The adequate conditions of pH, temperature, humidity, etc., necessary to cultivate a strain of Saccharomyces cerevisiae are widely known in the state of the art.

En general, el crecimiento de levaduras Saccharomyces cerevisiae requiere de una temperatura por encima de aproximadamente 10°C y por debajo de aproximadamente 40°C. Así, en una realización particular del método de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 15°C y 40°C, preferiblemente de entre 25°C y 35°C, más preferiblemente de entre 24°C y 32°C. En otra realización todavía más particular, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo a una temperatura de 28°C.In general, the growth of Saccharomyces cerevisiae yeasts requires a temperature above about 10°C and below about 40°C. Thus, in a particular embodiment of the method of the invention, step (a) is carried out carried out at a temperature between 15°C and 40°C, preferably between 25°C and 35°C, more preferably between 24°C and 32°C. In another even more particular embodiment, stage (a) of the method of the invention is carried out at a temperature of 28°C.

Además, el crecimiento o cultivo de la cepa o de la población que comprende la cepa de Saccharomyces cerevisiae en la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo en un tiempo o duración entre 70 y 370 horas. En otra realización particular, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo en un tiempo de entre 120 y 320 horas, más preferiblemente entre 150 y 290 horas. En otra realización más particular, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo en un tiempo de 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 o 280 horas.In addition, the growth or cultivation of the strain or of the population comprising the Saccharomyces cerevisiae strain in step (a) of the method of the invention is carried out in a time or duration between 70 and 370 hours. In another particular embodiment, stage (a) of the method of the invention is carried out in a time between 120 and 320 hours, more preferably between 150 and 290 hours. In another more particular embodiment, stage (a) of the method of the invention is carried out in a time of 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270 or 280 hours. .

En otra realización más particular del método de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo durante 220 horas.In another more particular embodiment of the method of the invention, stage (a) is carried out for 220 hours.

Dicho crecimiento se lleva a cabo en condiciones de agitación, preferiblemente agitación orbital constante (100-150rpm), con aireación.Said growth is carried out under shaking conditions, preferably constant orbital shaking (100-150rpm), with aeration.

Finalmente, el método de la invención comprende una etapa b) que comprende la purificación del hidroxitirosol. Es práctica de rutina para un experto en la materia determinar los métodos de purificación de hidroxitirosol. Ejemplos de métodos de purificación de hidroxitirosol incluyen, sin limitarse a, decantación, lavados con agua bidestilada, hidrolisis celular mediante tratamientos alcalinos, filtración, precipitación, centrifugación, sedimentación, tratamiento con hipoclorito sódico, tratamiento con agentes surfactantes, tratamiento con hidróxido de potasio, tratamiento con hidróxido de sodio, extracción con solventes orgánicos (p.e. metanol) y calentamiento.Finally, the method of the invention comprises a step b) comprising the purification of hydroxytyrosol. It is routine practice for one skilled in the art to determine methods of purification of hydroxytyrosol. Examples of hydroxytyrosol purification methods include, but are not limited to, decantation, bidistilled water washes, cell hydrolysis by alkaline treatments, filtration, precipitation, centrifugation, sedimentation, sodium hypochlorite treatment, surfactant treatment, potassium hydroxide treatment, treatment with sodium hydroxide, extraction with organic solvents (e.g. methanol) and heating.

En otra realización particular del método de la invención la purificación del hidroxitirosol de la etapa (b) se lleva a cabo mediante extracción con un solvente orgánico, preferiblemente con metanol, más preferiblemente en una disolución al 50% de metanol.In another particular embodiment of the method of the invention, the purification of the hydroxytyrosol in step (b) is carried out by extraction with an organic solvent, preferably with methanol, more preferably in a 50% methanol solution.

Además, en otra realización más particular del método de la invención, la purificación del hidroxitirosol de la etapa (b) se lleva a cabo mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). In addition, in another more particular embodiment of the method of the invention, the purification of the hydroxytyrosol of step (b) is carried out by means of high performance liquid chromatography (HPLC).

Tal como se demuestra en los ejemplos de la presente invención, la cepa de la invención es capaz de producir hidroxitirosol (HT) a partir de glucosa, disminuyendo los gastos de la producción industrial de HT, permitiendo su uso como factoría celular en la industria alimentaria, particularmente en enología. Dentro de la presente invención, también se contempla la producción de hidroxitirosol a partir de glucosa mediante la composición de la invención.As demonstrated in the examples of the present invention, the strain of the invention is capable of producing hydroxytyrosol (HT) from glucose, reducing the costs of the industrial production of HT, allowing its use as a cellular factory in the food industry. , particularly in oenology. Within the present invention, the production of hydroxytyrosol from glucose by means of the composition of the invention is also contemplated.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente invención, se refiere al uso de la cepa de Saccharomyces cerevisiae de la invención o de la composición de la invención para la producción de hidroxitirosol, de aquí en adelante el "uso de la invención”.Therefore, another aspect of the present invention refers to the use of the Saccharomyces cerevisiae strain of the invention or the composition of the invention for the production of hydroxytyrosol, hereinafter the "use of the invention".

La cepa de la invención y la composición de la invención han sido definidos en párrafos anteriores del presente documento, y se aplican de igual forma a este aspecto de la invención, así como todas sus realizaciones particulares (solas o en combinación).The strain of the invention and the composition of the invention have been defined in previous paragraphs of the present document, and apply equally to this aspect of the invention, as well as all its particular embodiments (alone or in combination).

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.Throughout the description and claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages, and features of the invention will emerge in part from the description and in part from the practice of the invention. The following examples and figures are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASBRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES

Figura 1. Comparación de la concentración de hidroxitirosol en m gL-1 entre las cepas BY4743 HpaBC con los distintos genes candidatos expresados en vector episomal p423GPD. Como cepa control se usó la BY4743 HpaBC con el vector p423GPD vacío. La mayor producción se obtuvo en el sobreexpresante de ARO4 K229L. Figure 1 . Comparison of the hydroxytyrosol concentration in m gL-1 between the BY4743 HpaBC strains with the different candidate genes expressed in the p423GPD episomal vector. The BY4743 HpaBC with the empty p423GPD vector was used as a control strain. The highest production was obtained in the overexpressant of ARO4 K229L.

Figura 2. Esquema de la mutagénesis dirigida por PCR empleada para generar una mutación puntual en la secuencia del gen ARO4 desde el ADN genómico de S. cerevisiae. Figure 2 . Schematic of PCR-directed mutagenesis used to generate a point mutation in the ARO4 gene sequence from S. cerevisiae genomic DNA.

Figura 3. Esquema de la obtención de los casetes génicos construidos para la sobreproducción de hidroxitirosol mediante su integración en levaduras. Figure 3 . Diagram of obtaining the gene cassettes constructed for the overproduction of hydroxytyrosol by means of its integration in yeast.

Figura 4. Producción de hidroxitirosol y tirosol a partir de glucosa de las cepas de S. cerevisiae HpaBC y la cepa S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L, en un medio mínimo con 160 g L -1 de glucosa durante 120 horas a 28°C. Para la determinación del hidroxitirosol y el tirosol, las muestras fueron diluidas en un 50% con metanol y filtradas con un filtro de 0,22 ^m y HPLC-PDA. Figure 4 . Production of hydroxytyrosol and tyrosol from glucose of the S. cerevisiae HpaBC strains and the S. cerevisiae HpaBC strain ARO4 K229L, in a minimal medium with 160 g L -1 of glucose for 120 hours at 28°C. For the determination of hydroxytyrosol and tyrosol, the samples were diluted 50% with methanol and filtered with a 0.22 ^m filter and HPLC-PDA.

Figura 5. Evaluación de la producción de hidroxitirosol en la cepa BY4743 HpaBC con el plásmido episomal p423GPD ARO4 K229L a distintos tiempos en un medio mínimo con 160 g L -1 de glucosa durante 295 horas a 28°C. Figure 5 . Evaluation of the production of hydroxytyrosol in the BY4743 HpaBC strain with the episomal plasmid p423GPD ARO4 K229L at different times in a minimal medium with 160 g L -1 of glucose for 295 hours at 28°C.

Figura 6. Producción de hidroxitirosol en la cepa S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L, con crecimiento a 28 °C en un medio mínimo con 20, 80, 160, 200, 250 y 300 g L -1 de glucosa, medido a distintos tiempos. Figure 6 . Hydroxytyrosol production in the strain S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L, growing at 28 °C in a minimal medium with 20, 80, 160, 200, 250 and 300 g L -1 of glucose, measured at different times.

EJEMPLOSEXAMPLES

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.Next, the invention will be illustrated by means of tests carried out by the inventors, which show the effectiveness of the product of the invention.

EJEMPLO 1: SELECCIÓN DE GENES CANDIDATOS PARA LA PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL EN LEVADURAEXAMPLE 1: SELECTION OF CANDIDATE GENES FOR THE PRODUCTION OF HYDROXYTYROSOL IN YEAST

Los inventores realizaron una selección de genes candidatos sobre una cepa S. cerevisiae de laboratorio (BY4743) con los genes hpaB (código ENA: CAA86048.1) (SEQ ID NO: 1) y hpaC (código ENA: CAA86049.2) (SEQ ID NO: 3) de E. coli integrados en los elementos repetitivos Ty1 del genoma. Para comparar la producción de hidroxitirosol al coexpresar los diferentes genes candidatos con el complejo HpaBC, se clonó cada gen candidato por separado (ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6), ARO4 (SEQ ID NO: 9), ARO3 (SEQ ID NO: 10), ARO3 K222L (SEQ ID NO: 11), ARO7 (SEQ ID NO: 12), ARO7 G141S (SEQ ID NO: 13) y ARO10 (SEQ ID NO: 14)) en plásmido p423GPD, se transformó la levadura con crecimiento en medio selectivo (SC - His) y determinación de la concentración de hidroxitirosol a las 72 h. La selección de genes candidatos resultó en la elección de ARO4 con la mutación puntual K229L como mejor propuesta para coexpresar junto con el complejo HpaBC (Figura 1). The inventors screened candidate genes on a laboratory S. cerevisiae strain (BY4743) with the genes hpaB (ENA code: CAA86048.1) (SEQ ID NO: 1) and hpaC (ENA code: CAA86049.2) (SEQ ID NO: 3) of E. coli integrated into the Ty1 repetitive elements of the genome. To compare the production of hydroxytyrosol when co-expressing the different candidate genes with the HpaBC complex, each candidate gene was cloned separately ( ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6), ARO4 (SEQ ID NO: 9), ARO3 (SEQ ID NO: 10), ARO3 K222L (SEQ ID NO: 11), ARO7 (SEQ ID NO: 12), ARO7 G141S (SEQ ID NO: 13) and ARO10 (SEQ ID NO: 14)) into plasmid p423GPD, the yeast was transformed with growth in selective medium (SC-His) and determination of the hydroxytyrosol concentration at 72 h. The selection of candidate genes resulted in the choice of ARO4 with the point mutation K229L as the best proposal to coexpress together with the HpaBC complex (Figure 1).

Materiales y MétodosMaterials and methods

1.1. Clonaje de los distintos genes en plásmidos episomales.1.1. Cloning of the different genes in episomal plasmids.

Para la modificación de un cambio de aminoácido en ARO3, ARO4 y ARO7 se procedió mediante mutagénesis dirigida por PCR usando la combinación de cebadores ARO3 F BamHI (SEQ ID NO: 21) / ARO3 K222L R (SEQ ID NO: 22) / ARO3 K222L F (SEQ ID NO: 23) / ARO3 R XhoI (SEQ ID NO: 24), ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) / ARO4 K229L R (SEQ ID NO: 26) / ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) / ARO4 K229L F (SEQ ID NO: 28) y ARO7 F BamHI (SEQ ID NO: 29) / ARO7 G141S R (SEQ ID NO: 30) / ARO7 G141S F (SEQ ID NO: 31) / ARO7 R XhoI (SEQ ID NO: 32), respectivamente, generando los siguientes cambios: sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 222 de ARO3 (ARO3 K222L o aro3*) (SEQ ID NO: 19), sustitución de K (lisina) por L (leucina) en la posición 229 de ARO4 (ARO4 K229L o aro4*) (SEQ ID NO: 7) y sustitución de G (glicina) por S (serina) en la posición 141 de ARO7 (ARO7 G141S o aro7*) (SEQ ID NO: 20).For the modification of an amino acid change in ARO3, ARO4 and ARO7, PCR-directed mutagenesis was carried out using the combination of primers ARO3 F BamHI (SEQ ID NO: 21) / ARO3 K222L R (SEQ ID NO: 22) / ARO3 K222L F (SEQ ID NO: 23) / ARO3 R XhoI (SEQ ID NO: 24), ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) / ARO4 K229L R (SEQ ID NO: 26) / ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) / ARO4 K229L F (SEQ ID NO: 28) and ARO7 F BamHI (SEQ ID NO: 29) / ARO7 G141S R (SEQ ID NO: 30) / ARO7 G141S F (SEQ ID NO: 31) / ARO7 R XhoI (SEQ ID NO: 32), respectively, generating the following changes: substitution of K (lysine) by L (leucine) at position 222 of ARO3 ( ARO3 K222L or aro3*) (SEQ ID NO: 19), substitution of K (lysine) by L (leucine) at position 229 of ARO4 ( ARO4 K229L or aro4*) (SEQ ID NO: 7) and substitution of G (glycine) by S (serine) at position 141 of ARO7 ( ARO7 G141S or ring7*) (SEQ ID NO: 20).

Cada gen se amplificó mediante PCR a partir del DNA genómico de la cepa de S. cerevisiae Sc288C, utilizando los cebadores de la tabla 1. Se utilizaron las parejas de cebadores ARO3 F BamHI (SEQ ID NO: 21) / ARO3 R XhoI (SEQ ID NO: 24), ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) / ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) y ARO7 F BamHI (SEQ ID NO: 29) / ARO7 R XhoI (SEQ ID NO: 32) para amplificar los genes ARO3, ARO4 y ARO7 tanto en su versión silvestre como en la versión modificada. Estos cebadores incluyen colas que contienen la secuencia de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI y XhoI, las cuales se utilizaron para el clonaje de cada gen por separado en el plásmido p423GPD (Mumberg et al., 1995), originando los plásmidos p423GPD-aro3, p423GPD-aro3*, p423GPD-aro4, p423GPD-aro4*, p423GPD-aro7, p423GPD-aro7* y p423GPD-aro10. El gen ARO10 únicamente se testó su sobreexpresión, por ponerlo bajo el control de un promotor fuerte (GPD), sin utilizar ninguna versión modificada del mismo. La correcta construcción de dichos plásmidos, se confirmó mediante secuenciación Sanger utilizando los cebadores GPDPro-F (SEQ ID NO: 33) y CYC1-R (SEQ ID NO: 34) (Tabla 1).Each gene was amplified by PCR from the genomic DNA of the S. cerevisiae strain Sc288C, using the primers in Table 1. The pairs of primers ARO3 F BamHI (SEQ ID NO: 21) / ARO3 R XhoI (SEQ ID NO: 24), ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) / ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) and ARO7 F BamHI (SEQ ID NO: 29) / ARO7 R XhoI (SEQ ID NO: 32) for amplify the ARO3, ARO4 and ARO7 genes both in their wild type version and in the modified version. These primers include tails that contain the recognition sequence of the restriction enzymes BamHI and XhoI, which were used for the cloning of each gene separately in the plasmid p423GPD ( Mumberg et al., 1995), originating the plasmids p423GPD-aro3. , p423GPD-aro3*, p423GPD-aro4, p423GPD-aro4*, p423GPD-aro7, p423GPD-aro7* and p423GPD-aro10. The ARO10 gene was only tested for its overexpression, by placing it under the control of a strong promoter (GPD), without using any modified version of it. The correct construction of said plasmids was confirmed by Sanger sequencing using the primers GPDPro-F (SEQ ID NO: 33) and CYC1-R (SEQ ID NO: 34) (Table 1).

También se transformó el plásmido p423GPD sin ningún inserto y se usó como control negativo. Estos plásmidos expresan el gen clonado bajo el control de un promotor constitutivo fuerte, en este caso la secuencia promotora de la gliceraldehído-3-P deshidrogenasa (GPD), lo que asegura una sobreexpresión. Además, estos plásmidos se mantienen en un alto número de copias dentro de la célula mientras se mantenga la presión selectiva en el medio de crecimiento, en este caso la ausencia de histidina en el medio es la presión de selección necesaria para el mantenimiento del plásmido (BY4743 es mutante para este aminoácido).Plasmid p423GPD without any insert was also transformed and used as a control. negative. These plasmids express the cloned gene under the control of a strong constitutive promoter, in this case the glyceraldehyde-3-P dehydrogenase (GPD) promoter sequence, ensuring overexpression. Furthermore, these plasmids are maintained at a high number of copies within the cell as long as the selective pressure in the growth medium is maintained, in this case the absence of histidine in the medium is the necessary selection pressure for the maintenance of the plasmid ( BY4743 is a mutant for this amino acid).

Para la transformación de S. cerevisiae se utilizó el protocolo de transformación de acetato de litio descrito por Gietz et al., 2004, en el que las células son incubadas en presencia de acetato de litio, polietilenglicol, DNA “carrier” y los plásmidos p423GPD-aro3, p423GPD-aro3*, p423GPD-aro4, p423GPD-aro4*, p423GPD-aro7, p423GPD-aro7* y p423GPD-aro10 y sometidas a un choque térmico de 42°C durante 20 minutos. Posteriormente, las células se siembran en los diferentes medios de selección y se incuban a 30°C durante 2 o 3 días.For the transformation of S. cerevisiae , the lithium acetate transformation protocol described by Gietz et al., 2004 was used, in which the cells are incubated in the presence of lithium acetate, polyethylene glycol, "carrier" DNA and the p423GPD plasmids. -aro3, p423GPD-aro3*, p423GPD-aro4, p423GPD-aro4*, p423GPD-aro7, p423GPD-aro7* and p423GPD-aro10 and subjected to a heat shock of 42°C for 20 minutes. Subsequently, the cells are seeded in the different selection media and incubated at 30°C for 2 or 3 days.

Tabla 1. Cebadores utilizados para la obtención de cepas de levadura que sobreexpresa cada uno de los diferentes genes candidatos. Table 1. Primers used to obtain yeast strains that overexpress each of the different candidate genes.

1.2. Condiciones de crecimiento y preparación de las muestras1.2. Growth conditions and sample preparation

Para determinar la producción de hidroxitirosol, las cepas de laboratorio con HpaBC integrado en su genoma (S. cerevisiae HpaBC) y transformadas con los distintos plásmidos (p423GPD-aro3, p423GPD-aro3*, p423GPD-aro4, p423GPD-aro4*, p423GPD-aro7, p423GPD-aro7* y p423GPD-aro10) fueron inoculadas en 5 mL de medio sintético completo sin histidina (SC-His) toda la noche a 28° C en agitación. La composición de este medio se específica en la Tabla 2.To determine the production of hydroxytyrosol, laboratory strains with HpaBC integrated into their genome ( S. cerevisiae HpaBC) and transformed with the different plasmids (p423GPD-aro3, p423GPD-aro3*, p423GPD-aro4, p423GPD-aro4*, p423GPD- aro7, p423GPD-aro7* and p423GPD-aro10) were inoculated into 5 mL of complete synthetic medium without histidine (SC-His) overnight at 28°C under shaking. The composition of this medium is specified in Table 2.

A la mañana siguiente, se inocularon 25 ^L del cultivo crecido en 1,5 mL de medio SC-His fresco en placas de 24 pocillos de 2 mL de capacidad. Este cultivo se incubó en agitación constante a 28 °C, y tras 72 h de crecimiento se tomó muestra para analizar por HPLC-PDA. Las muestras se diluyeron al 50% con metanol absoluto de calidad de HPLC y fueron filtradas con filtros de nylon de 0,22 ^m previamente a la inyección en el cromatógrafo.The following morning, 25 ^L of the grown culture was inoculated into 1.5 mL of fresh SC-His medium in 2 mL capacity 24-well plates. This culture was incubated under constant agitation at 28 °C, and after 72 h of growth, a sample was taken to be analyzed by HPLC-PDA. Samples were diluted 50% with HPLC grade absolute methanol and filtered through 0.22 µm nylon filters prior to injection into the chromatograph.

SCSC

Glu

20 g L -1 glu

20g L -1

Base nitrogenada de levadura sin aminoácidos ni sulfato deNitrogenous yeast base without amino acids or sulfate

amonio (Difco™) ^{1,7 g L -1} ammonium (Difco™) ^{1.7 g L -1}

Sulfato de amonio 5 g L -1Ammonium sulfate 5 g L -1

Mezcla SC - His (FORMEDIUM™) 1,93 g L -1 Tabla 2. Composición del medio sintético completo sin histidina (SC - His) utilizado para la producción de hidroxitirosolSC-His mix (FORMEDIUM™) 1.93 g L -1 Table 2. Composition of the complete synthetic medium without histidine (SC-His) used for the production of hydroxytyrosol.

1.3. Detección y cuantificación de hidroxitimsol mediante cromatografía líquida1.3. Detection and quantification of hydroxythymsol by liquid chromatography

El hidroxitirosol producido se detectó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en un cromatógrafo Waters ACQ Arc Sys Core usando una columna Accucore™ C18 (Thermo Scientific) de fase reversa, de dimensiones 4,6 * 150 mm y 2,6 ^m de tamaño de partícula. Las fases móviles empleadas fueron A (acetonitrilo) y B (0,01% ácido trifluoroacético en agua) con un flujo constante de 1 mLmin-1, el volumen de inyección fue de 10 ^L y el programa de gradientes se ajustó como sigue: flujo inicial de 0:100 % (A:B), 18 min 10:90 % (A:B), 19-27 min 25:75 % (A:B), 28-31 min 100:0 % (A:B) y 39 min 0:100 % (A:B). La detección de analitos tuvo lugar en un detector de matriz de diodos 2998 PDA donde se extrajo el cromatograma correspondiente a la absorbancia a A=210 nm. El tiempo de retención para el hidroxitirosol fue 9,366 min y de 13,112 min para el tirosol.The hydroxytyrosol produced was detected by high performance liquid chromatography (HPLC) on a Waters ACQ Arc Sys Core chromatograph using an Accucore™ C18 ( Thermo Scientific) reverse phase column, dimensions 4.6 * 150 mm and 2.6 ^m. of particle size. The mobile phases used were A (acetonitrile) and B (0.01% trifluoroacetic acid in water) with a constant flow of 1 mLmin-1, the injection volume was 10 ^L and the gradient program was adjusted as follows: initial flow of 0:100% (A:B), 18 min 10:90% (A:B), 19-27 min 25:75% (A:B), 28-31 min 100:0% (A: B) and 39 min 0:100% (A:B). The detection of analytes took place in a 2998 PDA diode array detector where the chromatogram corresponding to the absorbance at A=210 nm was extracted. The retention time for hydroxytyrosol was 9,366 min and 13,112 min for tyrosol.

ResultadosResults

La cepa control, con el complejo de E. coli HpaBC p423GPD produjo 0,025 m gL-1 de hidroxitirosol a partir de un medio completo, con glucosa y nutrientes precursores como la tirosina, tras 72 h de crecimiento en dicho medio. La misma cepa con la sobreexpresión de los distintos genes (ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6), ARO4 (SEQ ID NO: 9), ARO3 (SEQ ID NO: 10), ARO3 K222L (SEQ ID NO: 11), ARO7 (SEQ ID NO: 12), ARO7 G141S (SEQ ID NO: 13) y ARO10 (SEQ ID NO: 14)) aumentó la producción de hidroxitirosol en todos los casos (Figura 1).The control strain, with the E. coli HpaBC p423GPD complex, produced 0.025 m gL-1 of hydroxytyrosol from a complete medium, with glucose and precursor nutrients such as tyrosine, after 72 h of growth in said medium. The same strain with the overexpression of the different genes ( ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6), ARO4 (SEQ ID NO: 9), ARO3 (SEQ ID NO: 10), ARO3 K222L (SEQ ID NO: 11), ARO7 (SEQ ID NO: 12), ARO7 G141S (SEQ ID NO: 13) and ARO10 (SEQ ID NO: 14)) increased hydroxytyrosol production in all cases (Figure 1).

No obstante, la cepa con ARO4 modificado con la sustitución K229L (S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L) produjo una cantidad de hidroxitirosol muy superior a su versión silvestre, y también mayor a cualquiera de los otros genes probados, llegando a cantidades de hasta 6 m gL-1 (Figura 1 y Tabla 3).However, the strain with ARO4 modified with the K229L substitution (S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L) produced a much higher amount of hydroxytyrosol than its wild version, and also higher than any of the other genes tested, reaching amounts of up to 6 m gL-1 (Figure 1 and Table 3).

La producción de hidroxitirosol por la cepa S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L es 240 veces superior a la de la cepa control, indicando la sinergia ejercida entre ARO4 K229L y HpaBC. En cuanto a las modificaciones puntuales en los genes ARO3 y ARO7 no se observó un cambio significativo en la cantidad de hidroxitirosol producida bajo las condiciones de este ensayo.The production of hydroxytyrosol by the strain S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L is 240 times higher than that of the control strain, indicating the synergy exerted between ARO4 K229L and HpaBC. Regarding the specific modifications in the ARO3 and ARO7 genes, no significant change was observed in the amount of hydroxytyrosol produced under the conditions of this trial.

Tabla 3. Concentraciones en m gL-1 de hidroxitirosol producido por las cepas modificadas tras 72 h en medio SC - His. Se indica la desviación estándar de la medida de tres réplicas independientes. Table 3. Concentrations in m gL-1 of hydroxytyrosol produced by the modified strains after 72 h in SC-His medium. The standard deviation of the measurement of three independent replicates is indicated.

EJEMPLO 2: PRODUCCIÓN DE HIDROXITIROSOL CON ARO4 K229LEXAMPLE 2: PRODUCTION OF HYDROXYTYROSOL WITH ARO4 K229L

Los inventores han optimizado la producción de hidroxitirosol a partir de glucosa con la cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante, la cepa S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L, mediante la combinación de la integración múltiple en el genoma del complejo hidroxilasa HpaBC de E. coli (SEQ ID NO: 5), capaz de transformar el tirosol en hidroxitirosol, y la sobreexpresión de ARO4 de S. cerevisiae con la mutación puntual K229L (ARO4 K229L), igualmente mediante la integración en el genoma (SEQ ID NO: 8). Además, sobre esta misma cepa, se evaluó la producción de hidroxitirosol en un medio mínimo con 160 g L -1 de glucosa durante 295 h para determinar el tiempo óptimo para la producción de hidroxitirosol (Figura 5). The inventors have optimized the production of hydroxytyrosol from glucose with the recombinant Saccharomyces cerevisiae strain, the S. cerevisiae strain HpaBC ARO4 K229L, by combining multiple genome integration of the E. coli HpaBC hydroxylase complex (SEQ ID NO: 5), capable of transforming tyrosol into hydroxytyrosol, and the overexpression of ARO4 from S. cerevisiae with the point mutation K229L (ARO4 K229L), also through integration into the genome (SEQ ID NO: 8). Furthermore, on this same strain, the production of hydroxytyrosol was evaluated in a minimal medium with 160 g L -1 of glucose for 295 h to determine the optimal time for the production of hydroxytyrosol (Figure 5).

2.1. Construcción de plásmidos y cepas productoras de hidroxitimsol (HT) 2.1. Construction of plasmids and strains producing hydroxythymsol ( HT)

Las secuencias de los genes hpaB (código ENA: CAA86048.1) (SEQ ID NO: 1) y hpaC (código ENA: CAA86049.2) (SEQ ID NO: 3) de E. coli fueron amplificadas con los cebadores hpaB BamHI F (SEQ ID NO: 39), hpaB XhoI R (SEQ ID NO: 40), hpaC BamHI (SEQ ID NO: 41) F y hpaC XhoI R (SEQ ID NO: 42) (Tabla 4) a partir de los plásmidos p426GPD-hpaB y p425GPD-hpaC (Tabla 5), construidos por Muñiz-Calvo, et al., 2020. The sequences of the E. coli hpaB (ENA code: CAA86048.1) (SEQ ID NO: 1) and hpaC (ENA code: CAA86049.2) (SEQ ID NO: 3) genes were amplified with the hpaB BamHI F primers . (SEQ ID NO: 39), hpaB XhoI R (SEQ ID NO: 40), hpaC BamHI (SEQ ID NO: 41) F and hpaC XhoI R (SEQ ID NO: 42) (Table 4) from plasmids p426GPD -hpaB and p425GPD-hpaC (Table 5), constructed by Muñiz-Calvo, et al., 2020.

Para la modificación de un cambio de aminoácido en el gen ARO4, se procedió a la amplificación del gen ARO4 (SEQ ID NO: 9) mediante PCR a partir del DNA genómico de la cepa de S. cerevisiae Sc288C, utilizando los cebadores ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) y ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) (Tabla 4). Estos cebadores incluyen colas que contienen la secuencia de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI y XhoI, las cuales se utilizaron para el clonaje de ARO4 en el plásmido p426GPD (Mumberg et al., 1995), originando el plásmido p426GPD-aro4 (Tabla 5). A partir del plásmido p426GPD-aro4 se realizó mutagénesis dirigida por PCR (Figura 2), para generar una mutación puntual en la secuencia de ARO4 utilizando los cebadores ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) / ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) / ARO4 K229L F (SEQ ID NO: 28) / ARO4 K229L R (SEQ ID NO: 26) (Tabla 4). En concreto, se produjo la sustitución de la secuencia AAG (codificante para el aminoácido lisina, K) por TTG (codificante para el aminoácido leucina, L) en la posición de nucleótido 685 de la secuencia de ARO4 (SEQ ID NO: 9) obteniendo la secuencia ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6).For the modification of an amino acid change in the ARO4 gene, the ARO4 gene (SEQ ID NO: 9) was amplified by PCR from the genomic DNA of the S. cerevisiae Sc288C strain, using the ARO4 F BamHI primers. (SEQ ID NO: 25) and ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) (Table 4). These primers include tails that contain the recognition sequence of the restriction enzymes BamHI and XhoI, which were used for the cloning of ARO4 in the plasmid p426GPD ( Mumberg et al., 1995), originating the plasmid p426GPD-aro4 (Table 5). ). From the p426GPD-aro4 plasmid, PCR-directed mutagenesis was performed (Figure 2), to generate a point mutation in the ARO4 sequence using the primers ARO4 F BamHI (SEQ ID NO: 25) / ARO4 R XhoI (SEQ ID NO: 27) / ARO4 K229L F (SEQ ID NO: 28) / ARO4 K229L R (SEQ ID NO: 26) (Table 4). Specifically, the sequence AAG (coding for the lysine amino acid, K) was replaced by TTG (coding for the leucine amino acid, L) at nucleotide position 685 of the ARO4 sequence (SEQ ID NO: 9), obtaining the sequence ARO4 K229L (SEQ ID NO: 6).

Tabla 4. Cebadores utilizados para la obtención de cepas de levadura modificadas genéticamente para la producción de hidroxitirosol. Table 4. Primers used to obtain genetically modified yeast strains for the production of hydroxytyrosol.

Tabla 5. Plásmidos utilizados para la obtención de cepas de levadura modificadas genéticamente para la producción de hidroxitirosol. Table 5. Plasmids used to obtain genetically modified yeast strains for the production of hydroxytyrosol.

Para la construcción de los plásmidos de integración pCfB2988 HpaBC y pCfB257 ARO4* se procedió al ensamblaje de los mismos mediante la técnica de clonaje conocida como USER (reacción de escisión específica de uracilo). Para ello, se amplificaron mediante PCR los siguientes “biobricks”: hpaB (SEQ ID NO:1), hpaC (SEQ ID NO:3), promotor dual TEF1-PGK1 (SEQ ID NO: 17) y GPDp-ARO4* (SEQ ID NO: 18). Para la amplificación de dichos “biobricks”, se utilizaron cebadores que contenían uracilos y la ADN polimerasa Phusion U Hot Start (Thermo Scientific). Los cebadores empleados para la amplificación de los “biobricks” fueron: GP2F (HpaB) (SEQ ID NO: 47), GV2R (HpaB) (SEQ ID NO: 48), GV1R (HpaC) (SEQ ID NO: 43), GP1F (HpaC) (SEQ ID NO: 44), PG1R (TEF1p) (SEQ ID NO: 45), PG2R (PGK1p) (SEQ ID NO: 46), PV2F (GPDp) (SEQ ID NO: 49) y GV2R (ARO4) (SEQ ID NO: 50) (Tabla 4).For the construction of the integration plasmids pCfB2988 HpaBC and pCfB257 ARO4*, they were assembled using the cloning technique known as USER (uracil-specific cleavage reaction). For this, it The following "biobricks" were amplified by PCR: hpaB (SEQ ID NO:1), hpaC (SEQ ID NO:3), TEF1-PGK1 dual promoter (SEQ ID NO: 17) and GPDp-ARO4* (SEQ ID NO: 18 ). For the amplification of said "biobricks", primers containing uracils and Phusion U Hot Start DNA polymerase (Thermo Scientific) were used. The primers used for the amplification of the "biobricks" were: GP2F (HpaB) (SEQ ID NO: 47), GV2R (HpaB) (SEQ ID NO: 48), GV1R (HpaC) (SEQ ID NO: 43), GP1F (HpaC) (SEQ ID NO: 44), PG1R (TEF1p) (SEQ ID NO: 45), PG2R (PGK1p) (SEQ ID NO: 46), PV2F (GPDp) (SEQ ID NO: 49) and GV2R (ARO4 ) (SEQ ID NO: 50) (Table 4).

Para ensamblar el complejo HpaBC en el plásmido pCfB2988 se amplificaron tres secuencias o “biobricks”, una conteniendo HpaC (SEQ ID NO: 6), otra conteniendo HpaB (SEQ ID NO: 5) y una tercera (SEQ ID NO: 17) conteniendo dos promotores constitutivos fuertes PGK1p (SEQ ID NO: 15) y TEF1p (SEQ ID NO: 16) amplificados a partir de los plásmidos construidos previamente p425GPD-hpaC, p426GPD-hpaC y pCfB2628, respectivamente (Muñiz-Calvo, et al., 2020; Germann et al., 2016) (Tabla 5). Para ello se usaron los cebadores GV1R (HpaC) (SEQ ID NO: 43) /GP1F (HpaC) (SEQ ID NO: 44) / PG1R(TEF1p) (SEQ ID NO: 45) / PG2R (PGK1p) (SEQ ID NO: 46) / GP2F (HpaB) (SEQ ID NO: 47) / GV2R(HpaB) (SEQ ID NO: 48) (Tabla 4).To assemble the HpaBC complex in plasmid pCfB2988, three sequences or "biobricks" were amplified, one containing HpaC (SEQ ID NO: 6), another containing HpaB (SEQ ID NO: 5) and a third (SEQ ID NO: 17) containing two strong constitutive promoters PGK1p (SEQ ID NO: 15) and TEF1p (SEQ ID NO: 16) amplified from the previously constructed plasmids p425GPD-hpaC, p426GPD-hpaC, and pCfB2628, respectively ( Muñiz-Calvo, et al., 2020 ; Germann et al., 2016) (Table 5). For this, the primers GV1R (HpaC) (SEQ ID NO: 43) / GP1F (HpaC) (SEQ ID NO: 44) / PG1R(TEF1p) (SEQ ID NO: 45) / PG2R (PGK1p) (SEQ ID NO : 46) / GP2F(HpaB) (SEQ ID NO: 47) / GV2R(HpaB) (SEQ ID NO: 48) (Table 4).

Para ensamblar el ARO4 modificado en el pCfB257, tras la mutagénesis dirigida se construyó el plásmido p426GPD-ARO4* (Tabla 5) (Figura 2), a partir del cual se amplificó tanto el promotor como la secuencia de ARO4 mutado con los cebadores PV2F (GPDp) (SEQ ID NO: 49) / GV2R (ARO4) (SEQ ID NO: 50) (Tabla 4), obteniéndose así el “biobrick” GPDp-ARO4* (SEQ ID NO: 18).To assemble the modified ARO4 in pCfB257, after site-directed mutagenesis, the plasmid p426GPD-ARO4* was constructed (Table 5) (Figure 2), from which both the promoter and the mutated ARO4 sequence were amplified with the PV2F primers ( GPDp) (SEQ ID NO: 49) / GV2R (ARO4) (SEQ ID NO: 50) (Table 4), thus obtaining the "biobrick" GPDp-ARO4* (SEQ ID NO: 18).

En paralelo, los vectores pCfB2988 y pCfB257 empleados (Jensen et al., 2014 y Maury et al., 2016) se prepararon mediante tratamiento secuencial con las enzimas AsiSI (SfaAI) (Thermo Fisher Scientific) y BsmI (New England Biolabs). Después de la purificación, los vectores preparados y las secuencias amplificadas se mezclaron y trataron con la enzima USER™ (New England Biolabs) y tras la reacción, la mezcla se utilizó directamente para la transformación bacteriana obteniéndose pCfB2988 HpaBC y pCfB257ARO4* (Tabla 5) (Figura 3). La correcta construcción de los plásmidos pCfB2988 HpaBC y pCfB257ARO4* se confirmó mediante secuenciación Sanger utilizando los cebadores ADH1_test_fw (SEQ ID NO: 51) y CYC1_test_rv (SEQ ID NO: 52) (Tabla 4). In parallel, the vectors pCfB2988 and pCfB257 used ( Jensen et al., 2014 and Maury et al., 2016) were prepared by sequential treatment with the enzymes AsiSI (SfaAI) (Thermo Fisher Scientific) and BsmI (New England Biolabs). After purification, the prepared vectors and the amplified sequences were mixed and treated with the USER™ enzyme (New England Biolabs) and after the reaction, the mixture was used directly for bacterial transformation, obtaining pCfB2988 HpaBC and pCfB257ARO4* (Table 5). (Figure 3). The correct construction of the plasmids pCfB2988 HpaBC and pCfB257ARO4* was confirmed by Sanger sequencing using the primers ADH1_test_fw (SEQ ID NO: 51) and CYC1_test_rv (SEQ ID NO: 52) (Table 4).

El plásmido pCfB2988 HpaBC, es un vector que permite integraciones múltiples del complejo HpaBC en sitios que comparten homología con los elementos Ty1, los cuales están distribuidos ampliamente por todo el genoma de la levadura. Por otra parte, el plásmido pCfB257ARO4* se integra de forma sencilla en la localización X-3 del cromosoma 10, la cual ha sido previamente seleccionada por presentar un buen nivel de expresión génica, tener un riesgo mínimo de reordenamientos espontáneos y no afectar el crecimiento de la cepa modificada mediante inserción en dicho lugar (Maury et al., 2016). The pCfB2988 HpaBC plasmid is a vector that allows multiple integrations of the HpaBC complex at sites that share homology with Ty1 elements, which are widely distributed throughout the yeast genome. On the other hand, the pCfB257ARO4* plasmid is easily integrated into the X-3 location of chromosome 10, which has been previously selected for presenting a good level of gene expression, having a minimal risk of spontaneous rearrangements and not affecting growth. of the modified strain by insertion at said site ( Maury et al., 2016).

Para poder integrar el casete génico HpaBC (SEQ ID NO: 5), así como el casete génico con el gen ARO4 mutado (SEQ ID NO: 8) (Figura 3), se generó una cepa vínica auxótrofa para los genes URA3 y URA3+LEU2 utilizando los plásmidos CRISPR/Cas9 pWS173 y pWS174 (tabla 5) para interrumpir la traducción de dichos genes introduciendo un codón de parada prematuro, mediante los cebadores URA3 STOP F (SEQ ID NO: 35), URA3 STOP R (SEQ ID NO: 36), LEU2 STOP F (SEQ ID NO: 37) y LEU2 STOP R (SEQ ID NO: 38) (Tabla 4).In order to integrate the HpaBC gene cassette (SEQ ID NO: 5), as well as the gene cassette with the mutated ARO4 gene (SEQ ID NO: 8) (Figure 3), an auxotrophic vinous strain for the URA3 and URA3+ genes was generated. LEU2 using the CRISPR/Cas9 plasmids pWS173 and pWS174 (table 5) to interrupt the translation of said genes by introducing a premature stop codon, using the primers URA3 STOP F (SEQ ID NO: 35), URA3 STOP R (SEQ ID NO: 36), LEU2 STOP F (SEQ ID NO: 37) and LEU2 STOP R (SEQ ID NO: 38) (Table 4).

Para la integración de las modificaciones anteriormente comentadas en la cepa, tras la comprobación de la correcta construcción de los vectores pCfB2988 HpaBC y pCfB257 ARO4* mediante secuenciación Sanger, se amplificaron ambos vectores para la extracción de los casetes génicos, mediante la digestión de ambos plásmidos con la enzima de restricción NotI y purificación por columna, previo a la transformación de la levadura (Figura 3). En la tabla 5 se muestra la información de ambos plásmidos.For the integration of the previously mentioned modifications in the strain, after verifying the correct construction of the vectors pCfB2988 HpaBC and pCfB257 ARO4* by means of Sanger sequencing, both vectors were amplified for the extraction of the gene cassettes, by means of the digestion of both plasmids. with the restriction enzyme NotI and purification by column, prior to the transformation of the yeast (Figure 3). Table 5 shows the information of both plasmids.

Para la transformación de S. cerevisiae se utilizó el protocolo de transformación de acetato de litio descrito por Gietz et al., 2004, en el que las células son incubadas en presencia de acetato de litio, polietilenglicol, DNA “carrier’ y el plásmido de interés y sometidas a un choque térmico de 42°C durante 20 minutos. Posteriormente, las células se siembran en los diferentes medios de selección y se incuban a 30°C durante 2 o 3 días.For the transformation of S. cerevisiae , the lithium acetate transformation protocol described by Gietz et al., 2004 was used, in which the cells are incubated in the presence of lithium acetate, polyethylene glycol, "carrier" DNA and the plasmid of interest and subjected to a thermal shock of 42°C for 20 minutes. Subsequently, the cells are seeded in the different selection media and incubated at 30°C for 2 or 3 days.

La correcta integración de las secuencias fue confirmada mediante PCR de colonia utilizando los cebadores (hpaC BamHI F (SEQ ID NO: 41) / hpaC XhoI R (SEQ ID NO: 42)) para HpaBC y las parejas (X-3903 Up (SEQ ID NO: 53) / 2221 (SEQ ID NO: 54)) o (2220 (SEQ ID NO: 55) / X-3904 Down (SEQ ID NO: 56)) para ARO4*(Tabla 4).The correct integration of the sequences was confirmed by colony PCR using the primers (hpaC BamHI F (SEQ ID NO: 41) / hpaC XhoI R (SEQ ID NO: 42)) for HpaBC and the pairs (X-3903 Up (SEQ ID NO: 53) / 2221 (SEQ ID NO: 54)) or (2220 (SEQ ID NO: 55) / X-3904 Down (SEQ ID NO: 56)) for ARO4* (Table 4).

La cepa originada tras la integración del casete génico obtenido de la digestión con Notl del pCfB2988 HpaBC se identifica como "cepa HpaBC”. La cepa originada tras la integración en la cepa HpaBC del casete génico obtenido de la digestión con Notl del pCfB257ARO4* se identifica como "cepa HpaBC ARO4K229L” (Figura 3).The strain originated after the integration of the gene cassette obtained from the Notl digestion of pCfB2988 HpaBC is identified as "HpaBC strain". The strain originated after the integration into the HpaBC strain of the gene cassette obtained from the Notl digestion of pCfB257ARO4* is identified as "HpaBC strain ARO4K229L” (Figure 3).

2.2. Condiciones de crecimiento y preparación de las muestras2.2. Growth conditions and sample preparation

Para determinar la producción de hidroxitirosol, las cepas vínicas modificadas HpaBC y HpaBC ARO4K229L fueron inoculadas en 5 mL de medio mínimo toda la noche a 28° C en agitación. La composición de este medio se específica en la tabla 6.To determine the production of hydroxytyrosol, the modified vinous strains HpaBC and HpaBC ARO4K229L were inoculated in 5 mL of minimal medium overnight at 28°C under agitation. The composition of this medium is specified in Table 6.

A la mañana siguiente, se inoculó el cultivo en medio fresco en una proporción 1/100 y se creció en medio mínimo en matraces tipo Erlenmeyer con una proporción de volumen de medio / volumen total de 1/5. Este cultivo se incubó en agitación constante a 28° C, y tras 120 h de crecimiento se tomó muestra para analizar por HPLC-PDA. Las muestras se diluyeron al 50% con metanol absoluto de calidad de HPLC y fueron filtradas con filtros de nylon de 0,22 ^m previamente a la inyección en el cromatógrafo.The following morning, the culture was inoculated in fresh medium at a ratio of 1/100 and grown in minimal medium in Erlenmeyer-type flasks with a volume ratio of medium/total volume of 1/5. This culture was incubated with constant shaking at 28°C, and after 120 h of growth, a sample was taken to be analyzed by HPLC-PDA. Samples were diluted 50% with HPLC grade absolute methanol and filtered through 0.22 µm nylon filters prior to injection into the chromatograph.

Para determinar la producción de hidroxitirosol con la cepa vínica modificada HpaBC ARO4K229L bajo condiciones óptimas de cultivo se modificó la concentración de glucosa del medio mínimo testando un rango amplio desde 20 hasta 300 g L-1. El tiempo de cultivo también se modificó a la luz de los resultados obtenidos en el ejemplo 1, tomando muestra a tiempos 220, 240 y 315 h.To determine the production of hydroxytyrosol with the modified wine strain HpaBC ARO4K229L under optimal culture conditions, the glucose concentration of the minimum medium was modified, testing a wide range from 20 to 300 g L-1. The culture time was also modified in light of the results obtained in example 1, taking samples at times 220, 240 and 315 h.

Para evaluar el efecto del tiempo en la producción de hidroxitirosol la cepa de laboratorio con HpaBC integrado en su genoma (S. cerevisiae HpaBC) y transformada con el plásmido p423GPD-aro4* fue inoculada en 5 mL de medio mínimo suplementado con leucina (380 mg L-1) toda la noche a 28° C en agitación. La composición de este medio se específica en la Tabla 6. A la mañana siguiente se inocularon 500 ^L de cultivo crecido en 50 mL de medio mínimo fresco con 160 g L -1 de glucosa y suplementado con leucina en matraces de 250 mL de capacidad. Este cultivo se incubó en agitación constante a 28° C y tras 120, 144, 168, 197, 223, 247 y 295 h de crecimiento se tomaron muestras para analizar mediante HPLC-PDA (Figura 5). Las muestras se diluyeron al 50% con metanol absoluto de calidad de HPLC y fueron filtradas con filtros de nylon de 0,22 ^m previamente a la inyección en el cromatógrafo.To evaluate the effect of time on the production of hydroxytyrosol, the laboratory strain with HpaBC integrated into its genome ( S. cerevisiae HpaBC) and transformed with the plasmid p423GPD-aro4* was inoculated in 5 mL of minimal medium supplemented with leucine (380 mg L-1) overnight at 28°C under agitation. The composition of this medium is specified in Table 6. The following morning, 500 ^L of culture grown in 50 mL of fresh minimal medium with 160 g L -1 of glucose and supplemented with leucine were inoculated in 250 mL capacity flasks. . This culture was incubated with constant shaking at 28°C and after 120, 144, 168, 197, 223, 247 and 295 h of growth, samples were taken to be analyzed by HPLC-PDA (Figure 5). The samples were diluted to 50% with HPLC grade absolute methanol and were filtered with 0.22 µm nylon filters prior to injection into the chromatograph.

Tabla 6. Composición del medio mínimo utilizado para la producción de hidroxitirosol. *Las concentraciones de glucosa empleadas fueron 20, 80, 160, 200, 250 y 300 g L -1, como se menciona anteriormente. Table 6. Composition of the minimum medium used for the production of hydroxytyrosol. *The glucose concentrations used were 20, 80, 160, 200, 250 and 300 g L -1, as mentioned above.

2.3. Detección y cuantificación de hidroxitirosol mediante cromatografía líquida23. Detection and quantification of hydroxytyrosol by liquid chromatography

El hidroxitirosol producido se detectó mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) en un cromatógrafo Waters ACQ Arc Sys Core usando una columna Accucore™ C18 (Thermo Scientific) de fase reversa, de dimensiones 4,6 * 150 mm y 2,6 ^m de tamaño de partícula. Las fases móviles empleadas fueron A (acetonitrilo) y B (0.01% ácido trifluoroacético en agua) con un flujo constante de 1 mLmin-1, el volumen de inyección fue de 10 ^L y el programa de gradientes se ajustó como sigue: flujo inicial de 0:100 % (A:B), 18 min 10:90 % (A:B), 19-27 min 25:75 % (A:B), 28-31 min 100:0 % (A:B) y 39 min 0:100 % (A:B). La detección de analitos tuvo lugar en un detector de matriz de diodos 2998 PDA donde se extrajo el cromatograma correspondiente a la absorbancia a A = 210 nm. El tiempo de retención para el hidroxitirosol fue 9,366 min y de 13,112 min para el tirosol.The hydroxytyrosol produced was detected by high performance liquid chromatography (HPLC) on a Waters ACQ Arc Sys Core chromatograph using an Accucore™ C18 (Thermo Scientific) reverse phase column, dimensions 4.6 * 150 mm and 2.6 ^m. of particle size. The mobile phases used were A (acetonitrile) and B (0.01% trifluoroacetic acid in water) with a constant flow of 1 mLmin-1, the injection volume was 10 ^L and the gradient program was adjusted as follows: initial flow 0:100% (A:B), 18 min 10:90% (A:B), 19-27 min 25:75% (A:B), 28-31 min 100:0% (A:B) and 39 min 0:100% (A:B). The detection of analytes took place in a 2998 PDA diode array detector where the chromatogram corresponding to the absorbance at A = 210 nm was extracted. The retention time for hydroxytyrosol was 9,366 min and 13,112 min for tyrosol.

ResultadosResults

La cepa de S. cerevisiae con el complejo de E. coli HpaBC produjo aproximadamente 0,3 m gL-1 de hidroxitirosol desde glucosa en un medio simple tras 120 h de crecimiento en dicho medio. Al modificar dicha cepa con la sobreexpresión del gen ARO4 modificado con la sustitución K229L produjo un aumento de más de 26 veces la producción de hidroxitirosol respecto a la cepa con solo HpaBC, superando los 8,5 m gL-1 (Figura 4 y Tabla 7). Del mismo modo que ocurre con el hidroxitirosol, la sobreexpresión de la variante ARO4 K229L, produjo un aumento de alrededor de 30 veces de la síntesis de tirosol, llegando a superarse los 200 m gL-1 (Figura 4 y Tabla 7).The S. cerevisiae strain with the E. coli HpaBC complex produced approximately 0.3 μgL-1 of hydroxytyrosol from glucose in plain medium after 120 h of growth in plain medium. When modifying this strain with the overexpression of the ARO4 gene modified with the K229L substitution, it produced an increase of more than 26 times in the production of hydroxytyrosol compared to the strain with only HpaBC, exceeding 8.5 m gL-1 (Figure 4 and Table 7 ). As with hydroxytyrosol, overexpression of the variant ARO4 K229L, produced an increase of about 30 times in tyrosol synthesis, exceeding 200 m gL-1 (Figure 4 and Table 7).

Tabla 7. Concentraciones en m gL-1 de tirosol e hidroxitirosol producido por las cepas modificadas tras 120 h en medio mínimo con 160 g L -1 de glucosa. Table 7. Concentrations in m gL-1 of tyrosol and hydroxytyrosol produced by the modified strains after 120 h in minimal medium with 160 g L -1 of glucose.

Por otra parte, la producción de hidroxitirosol por la cepa S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L en medio mínimo con 160 g L -1 de glucosa y suplementado con leucina (380 mg L-1) superó los 350 m gL-1 a partir de las 223 h de crecimiento, sin mostrar un gran aumento a tiempos posteriores (Figura 5). Teniendo en cuenta estos resultados se estableció un tiempo óptimo de producción en torno a las 220h de crecimiento. En estas condiciones de concentración de glucosa y tiempo de cultivo, la producción de hidroxitirosol por la cepa S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L es 42 veces superior a la de la cepa control, poniendo de manifiesto el impacto de la concentración de glucosa y el tiempo de incubación en la producción de HT.On the other hand, the production of hydroxytyrosol by the strain S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L in a minimal medium with 160 g L -1 of glucose and supplemented with leucine (380 mg L-1) exceeded 350 m gL-1 from the 223 h of growth, without showing a great increase at later times (Figure 5). Taking these results into account, an optimum production time of around 220 hours of growth was established. Under these conditions of glucose concentration and culture time, the production of hydroxytyrosol by the strain S. cerevisiae HpaBC ARO4 K229L is 42 times higher than that of the control strain, revealing the impact of glucose concentration and culture time. incubation in the production of HT.

Cuando se testó la concentración de glucosa óptima y el tiempo de cultivo, con esta misma cepa de S. cerevisiae, produjo más de 17 mg L-1 de hidroxitirosol tras 220 h de crecimiento en medio mínimo con 300 g L -1 de glucosa (Figura 6 y Tabla 8).When the optimal glucose concentration and culture time were tested with this same strain of S. cerevisiae, it produced more than 17 mg L-1 of hydroxytyrosol after 220 h of growth in minimal medium with 300 g L -1 of glucose ( Figure 6 and Table 8).

Tabla 8. Concentraciones en m gL-1 de hidroxitirosol producido por la cepa modificada tras 220, 240 y 315 h en medio mínimo con 300 g L -1 de glucosa. Table 8. Concentrations in m gL-1 of hydroxytyrosol produced by the modified strain after 220, 240 and 315 h in minimal medium with 300 g L -1 of glucose.

Claims

1. A recombinant Saccharomyces cerevisiae strain comprising the following nucleotide sequences:

(i) the nucleotide sequences encoding the Escherichia coli HpaBC hydroxylase enzyme complex or a fragment thereof, and

(ii) the nucleotide sequence encoding the Saccharomyces cerevisiae ARO4 enzyme comprising the substitution of K (lysine) for L (leucine) at position 229 (ARO4 K229L) or a fragment thereof;

wherein the fragments of sequences (i) and (ii) code for fragments of the proteins that perform the function of the complete protein and wherein the nucleotide sequence (ii) is overexpressed with respect to a non-recombinant Saccharomyces cerevisiae strain .

2. The strain according to claim 1 wherein the nucleotide sequences that code for the HpaBC hydroxylase enzyme complex comprise the nucleotide sequences that have an identity of at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% with the nucleotide sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 and are functionally equivalent variants of the nucleotide sequences that comprise the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.

3. The strain according to claim 1 or 2 wherein the HpaBC hydroxylase enzyme complex comprises the amino acid sequences that have a sequence identity of at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 , 99% with the amino acid sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, wherein said sequences are functionally equivalent variants of the amino acid sequences that comprise the sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4.

4. The strain according to any one of claims 1 to 3, wherein the nucleotide sequences that code for the HpaBC hydroxylase enzyme complex comprise the nucleotide sequences that present 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3.

5. The strain according to any one of claims 1 to 4, wherein the nucleotide sequence encoding the ARO4 K229L enzyme of Saccharomyces cerevisiae comprises a nucleotide sequence that has a sequence identity of at least 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99% with the nucleotide sequence SEQ ID NO: 6 and is a functionally equivalent variant of the nucleotide sequence comprising the sequence SEQ ID NO: 6.

6. The strain according to any one of claims 1 to 5, wherein the enzyme ARO4 K229L from Saccharomyces cerevisiae comprises an amino acid sequence that has a sequence identity of at least 70, 75, 80, 85, 90, 95 , 96, 97, 98, 99% with the amino acid sequence SEQ ID NO: 7, wherein said sequence is a functionally equivalent variant of the amino acid sequence comprising the sequence SEQ ID NO: 7.

7. The strain according to any one of claims 1 to 6, wherein the nucleotide sequence that codes for the Saccharomyces cerevisiae ARO4 K229L enzyme comprises a nucleotide sequence that has 100% sequence identity with the sequence SEQ ID NO: 6.

A composition comprising a strain of Saccharomyces cerevisiae according to any one of claims 1 to 7.

9. A method of producing hydroxytyrosol comprising:

(a) cultivating at least one strain of Saccharomyces cerevisiae according to any one of claims 1 to 7, or a population comprising a strain of Saccharomyces cerevisiae according to any one of claims 1 to 7, in a culture medium comprising at least a carbon source and a nitrogen source, and

(b) purifying the hydroxytyrosol obtained during step (a).

The method according to claim 9 wherein the carbon source is glucose and/or the nitrogen source is ammonium.

11. The method according to claim 10 wherein the culture medium comprises glucose in a concentration between 1 and 400 grams of glucose per liter of culture medium.

The method according to claim 11 wherein the culture medium comprises glucose in a concentration between 100 and 300 grams of glucose per liter of culture medium, more preferably 150 or 160 grams of glucose per liter of culture medium.

The method according to any one of claims 9 to 12, wherein step (a) is carried out at a temperature between 25 and 35°C for between 100 and 150 hours under stirring conditions.

The method according to claim 13 wherein the temperature is 28°C.

The method according to claim 13 or 14 wherein step (a) is carried out for 120 hours.

The method according to any one of claims 9 to 15, wherein the purification of the hydroxytyrosol of step (b) is carried out with a methanol solution.

17. The method according to claim 16 wherein furthermore the purification of the hydroxytyrosol of step (b) is carried out by means of high performance liquid chromatography (HPLC).

18. Use of the Saccharomyces cerevisiae strain according to any one of claims 1 to 7 or of the composition according to claim 8 for the production of hydroxytyrosol.