ES2911600T3 - Métodos para identificar si pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presentan un estado hipercoagulable - Google Patents

Abstract

Método para identificar si un paciente con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presenta un estado hipercoagulable, que comprende i) determinar la capacidad de generación de trombina a partir de una muestra de sangre que se ha obtenido del paciente, ii) determinar el nivel de al menos un biomarcador soluble de disfunción endotelial, iii) comparar la capacidad determinada en la etapa i) y el nivel determinado en la etapa ii) con sus valores de referencia predeterminados respectivos y iv) concluir que el paciente presenta un estado hipercoagulable cuando tanto la capacidad de generación de trombina como el nivel del marcador soluble de disfunción endotelial son superiores a sus valores de referencia predeterminados respectivos, en el que: - la capacidad de generación de trombina se determina mediante un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT), y - el al menos un biomarcador soluble de disfunción endotelial se selecciona del grupo que consiste en factor de Von Willebrand, factor VIII, receptor endotelial de la proteína C, inhibidor de la ruta del factor tisular, vesículas extracelulares derivadas del endotelio y complejos ADN-histona circulantes.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para identificar si pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presentan un estado hipercoagulable

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para identificar si pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presentan un estado hipercoagulable.

Antecedentes de la invención

A pesar de los beneficios observados con las terapias recientes, incluyendo los moduladores neurohormonales, el pronóstico de los pacientes hospitalizados por insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) sigue siendo malo, con tasas de reingreso que se aproximan al 50% a los 6 meses1 y una mortalidad a un año de hasta el 30%.2 En este pronóstico tan negativo influyen en parte los episodios tromboembólicos que se producen en hasta el 30% de los pacientes y que a menudo son la causa de muerte.3 Estos hallazgos epidemiológicos están respaldados por múltiples mecanismos que pueden contribuir a un estado hipercoagulable en los pacientes con insuficiencia cardiaca (IC), tales como el aumento de los factores procoagulantes solubles, la disfunción endotelial o la inflamación.45 Por tanto, los mecanismos trombóticos pueden surgir como posibles dianas terapéuticas de interés en la IC.56 La reducción selectiva de la generación de trombina con un nuevo anticoagulante oral, en lugar del agotamiento no selectivo de múltiples factores de coagulación dependientes de la vitamina K con warfarina, puede ser prometedora. Este ensayo aleatorizado, COMMANDER-HF, que incluye aproximadamente 5.000 pacientes, está en marcha e inicia la terapia anticoagulante con el agente anti-Xa rivaroxabán poco después del alta de la ICAD.6 Para respaldar estos estudios, se requieren una evaluación biológica de la generación excesiva de trombina en los pacientes con ICAD y una mejor comprensión de los mecanismos que conducen a la formación de trombina en estudios longitudinales que incluyen a pacientes seleccionados y que usan pruebas sofisticadas.

Cada vez hay más pruebas de que el daño endotelial contribuye a la patogenia de la ICAD. El endotelio ejerce su función de mantenimiento de la homeostasis vascular a través del equilibrio entre su función anticoagulante natural respaldada por la ruta de la proteína C activada (APC) y las actividades procoagulantes inducidas. En la superficie endotelial, la unión de la trombina a la trombomodulina (TM) da como resultado la activación de la proteína C, y esta reacción se facilita cuando la proteína C se une al receptor endotelial de la proteína C (EPCR). Se ha notificado que la interrupción de esta ruta de APC dependiente del endotelio fomenta la trombosis endocárdica en la ICAD en ratones.7 Los niveles elevados de vesículas extracelulares derivadas del endotelio (VEe) que reflejan una función endotelial avanzada son factores predisponentes independientes de acontecimientos cardiovasculares en los pacientes con IC.8 Esto también favorece las propiedades procoagulantes del endotelio en la IC. Por último, las trampas extracelulares de neutrófilos, que se liberan en diversas enfermedades, inducen daños en las células endoteliales y degradan proteolíticamente el sistema anticoagulante dependiente del endotelio, tal como TFPI, proteína C y TM.9

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a métodos para identificar si pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presentan un estado hipercoagulable. La presente invención se define por las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

Los sujetos con insuficiencia cardiaca (IC) tienen un mayor riesgo de desarrollar trombosis. Por ello, los inventores determinaron la capacidad de generación de trombina en los pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD). En su estudio prospectivo incluyeron a 34 pacientes con ICAD y 30 pacientes hospitalizados de control sin IC. Se monitorizó la generación de trombina in vitro y su regulación por disminución por la proteína C activada (APC) mediante un trombograma automatizado calibrado en el momento del ingreso hospitalario, el día del alta y después de al menos seis semanas de estabilidad clínica. Se cuantificaron las vesículas extracelulares derivadas del endotelio (VEe) circulantes mediante citometría de flujo. Se cuantificaron los niveles circulantes de complejos ADN-histona mediante ELISA. En comparación con los controles, el potencial de trombina endógena (ETP) fue mayor en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso usando plasma rico en plaquetas y permaneció aumentado durante el periodo de hospitalización. Después de seis semanas de estabilidad clínica, los valores de ETP disminuyeron hasta los valores de los controles. La concentración de APC que inhibe la generación de trombina en un 50% fue mayor en el momento del ingreso en comparación con el periodo posterior al alta. Los marcadores solubles de disfunción endotelial, incluyendo el factor de Von Willebrand, el factor VIII y el receptor endotelial de la proteína C, fueron más elevados en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso. Los niveles plasmáticos de los complejos ADN-histona estaban significativamente elevados en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso en comparación con los controles y disminuyeron significativamente en el momento posterior al alta. También se hallaron mayores concentraciones (aumento de 5 veces) de VEe positivas para anexina V/factor tisular (TF) en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso en comparación con los controles y disminuyeron significativamente en el momento posterior al alta. La concentración de VEe positivas para TF se correlacionó positivamente con el ETP. La disfunción endotelial avanzada que da como resultado niveles elevados de FVIII y VEe procoagulantes aumenta la generación de trombina y amortigua la regulación por disminución de la ruta de APC en la fase aguda de la IC descompensada. Los hallazgos demuestran que los métodos para determinar la capacidad de generación de trombina en los pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD), que combinan las mediciones del potencial de trombina endógena y la disfunción endotelial, son particularmente valiosos para estratificar a los pacientes y, por tanto, para orientar los tratamientos y el seguimiento de los mismos.

Por consiguiente, el primer objeto de la presente invención se refiere a un método para identificar si un paciente con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presenta un estado hipercoagulable, que comprende i) determinar la capacidad de generación de trombina a partir de una muestra de sangre obtenida del paciente, ii) determinar el nivel de al menos un biomarcador soluble de disfunción endotelial, iii) comparar la capacidad determinada en la etapa i) y el nivel determinado en la etapa ii) con sus valores de referencia predeterminados respectivos y iv) concluir que el paciente presenta un estado hipercoagulable cuando tanto la capacidad de generación de trombina como el nivel del marcador soluble de disfunción endotelial son superiores a sus valores de referencia predeterminados respectivos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “insuficiencia cardiaca” designa la incapacidad del corazón de suministrar un flujo sanguíneo suficiente para satisfacer las necesidades del organismo, y esta patología está bien descrita en la práctica médica. Tal como se usa en el presente documento, el término “insuficiencia cardiaca aguda” designa una insuficiencia cardiaca de aparición repentina, que se refiere a episodios en los que un paciente con insuficiencia cardiaca crónica conocida o que carece de insuficiencia cardiaca crónica desarrolla bruscamente un empeoramiento de los síntomas y requiere hospitalización. Los síntomas comunes de las complicaciones debidas a la insuficiencia cardiaca aguda incluyen, pero no se limitan a, disnea por congestión pulmonar o choque cardiogénico por bajo gasto cardiaco, fatiga fácil (intolerancia al ejercicio), edema periférico, anasarca (edema generalizado pronunciado), nicturia (micción nocturna frecuente), bradicardia, bloqueo auriculoventricular, hipotensión, mareo, síncope, diabetes, oliguria o anuria, hipopotasemia, broncoespasmo, sudor frío y asma. Tal como se usa en el presente documento, el término “insuficiencia cardiaca aguda descompensada” o “ICAD” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un estado en el que un paciente que padece insuficiencia cardiaca experimenta un aumento de los signos y síntomas de la enfermedad después de un periodo de estabilidad relativa (Allen y O'Connor, CMAJ 176(6):797-805, 2007).

Tal como se usa en el presente documento, el término “estado hipercoagulable” tiene su significado general en la técnica y se refiere al término médico para una afección en la que hay una tendencia anómalamente aumentada hacia la coagulación (espesamiento) de la sangre en comparación con los sujetos de control de la misma edad. En particular, el estado hipercoagulable indica que el paciente tiene un alto riesgo de trombosis. Tal como se usa en el presente documento, el término “trombosis” se refiere a la formación de un coágulo sanguíneo en el interior de un vaso sanguíneo, que obstruye el flujo de sangre a través del sistema circulatorio. Por tanto, el término “trombosis” incluye, entre otras, trombosis atrófica, trombosis arterial, trombosis cardiaca, trombosis coronaria, trombosis creciente, trombosis mesentérica, trombosis placentaria, trombosis extensa, trombosis traumática y trombosis venosa.

El término “muestra de sangre” significa una muestra de sangre completa obtenida del paciente. Por ejemplo, la sangre puede extraerse del paciente siguiendo un procedimiento de venopunción convencional en tubos al vacío que contienen citrato de sodio 0,106 M. En algunas realizaciones, la muestra de sangre es una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP) o una muestra de plasma desplaquetado. Por ejemplo, el plasma rico en plaquetas (PRP) puede obtenerse mediante centrifugación a 190 g durante 10 min (a temperatura ambiente), seguida de pipeteo de la capa de PRP.

Según la presente invención, la capacidad de generación de trombina se determina mediante cualquier método bien conocido en la técnica. Por ejemplo, usando un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT) desarrollado, por ejemplo, por Hemker y colaboradores, se mide con precisión la generación de trombina en plasma (Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, Regnault V, de Smedt E, Wagenvoord R, Lecompte T, Béguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysio1Haemost Thromb.

2003;33(1):4-15). El trombograma automatizado calibrado muestra la concentración de trombina en plasma de coagulación con o sin plaquetas (plasma rico en plaquetas/plasma desplaquetado, PRP/PPP) mediante la monitorización del desdoblamiento de un sustrato fluorogénico y su comparación con una actividad de trombina conocida constante en una muestra paralela de no coagulación. Normalmente, la actividad de la trombina frente al tiempo se presenta, por tanto, como una curva de Thrombogram™ (TG) que se caracteriza por una fase de iniciación que proporciona cantidades mínimas de trombina, seguida de una ráfaga de actividad. La sangre forma un coágulo al principio de la ráfaga, y casi toda la trombina se forma después de que se haya formado el coágulo. Por tanto, Thrombogram™ muestra diversas fases, incluyendo el periodo de latencia, la fase de propagación, el tiempo hasta el pico y la altura del pico, y el ETP. Se pretende que el término “periodo de latencia”, tal como se usa en el presente documento, indique el tiempo (min) que transcurre antes de que se inicie la ráfaga de trombina. El término “tiempo hasta el pico” (min), tal como se usa en el presente documento, significa el tiempo que transcurre entre el inicio de la reacción y el momento en que se alcanza el pico. Tal como se usa en el presente documento, el término “altura del pico” (nM) significa la actividad máxima de trombina alcanzada durante el ensayo en una muestra sometida a prueba. El término “ETP” o “potencial de trombina endógena”, tal como se usa en el presente documento, significa la integral de tiempo de la curva hasta que se alcanza el momento de actividad de trombina (casi) cero, correspondiente al área bajo la curva (nM.min) (véanse, por ejemplo, los documentos EP 0 420 332-B1, EP 0 802 986-B1 y Hemker et al. (1993) Thromb. Haemostasis 70: 617-624). Por tanto, el ETP representa el equilibrio entre las fuerzas procoagulantes y anticoagulantes que funcionan en el plasma y se calcula preferiblemente para determinar la capacidad de generación de trombina del paciente. Los métodos de evaluación previamente conocidos para determinar el potencial de trombina endógena incluyen los dados a conocer en Hemker et al. (1993) Thromb. Haemost 70: 617-624; y en el documento WO 2004/016807-A1, y normalmente incluyen el descrito en el ejemplo. Por consiguiente, en algunas realizaciones, el método de la presente invención comprende determinar el ETP en la muestra de sangre obtenida del paciente y comparar dicho valor con un valor de referencia predeterminado. En algunas realizaciones, se añade proteína C activada (APC) a la muestra de sangre y de ese modo se determina la concentración de APC que inhibe la generación de trombina en un 50% y se compara con un valor de referencia predeterminado tal como se describe en el ejemplo.

El método de la presente invención comprende determinar el nivel de al menos un marcador soluble de disfunción endotelial seleccionado del grupo que consiste en factor de Von Willebrand, factor VIII, receptor endotelial de la proteína C, inhibidor de la ruta del factor tisular, vesículas extracelulares derivadas del endotelio y complejos ADN-histona circulantes en la muestra de sangre del paciente.

Tal como se usa en el presente documento, el término “factor de Von Willebrand” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier polipéptido soluble presente en la muestra de sangre que se deriva del factor de Von Willebrand humano, que se caracteriza por la secuencia de referencia del NCBI NP_000543.

Tal como se usa, el término “factor VIII” o “FVIII” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier polipéptido soluble presente en la muestra de sangre que se deriva del factor VIII humano, que se caracteriza por la secuencia de referencia del NCBI AAA52484.1.

Tal como se usa en el presente documento, el término “proteína C activada” o “APC” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier polipéptido soluble presente en la muestra de sangre que se deriva de la APC humana, que se caracteriza por la secuencia de referencia del NCBI NP_000303.

Tal como se usa en el presente documento, el término “receptor endotelial de la proteína C” o “EPCR” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier polipéptido soluble presente en la muestra de sangre que se deriva del EPCR humano, que se caracteriza por la secuencia de referencia del NCBI NP_006395.

Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor de la ruta del factor tisular” o “TFPI” tiene su significado general en la técnica y se refiere a cualquier polipéptido soluble presente en la muestra de sangre que se deriva del TFPI humano, que se caracteriza por la secuencia de referencia del NCBI NP_001027452.

Los métodos convencionales para determinar el nivel de un marcador soluble implican normalmente poner en contacto la muestra de sangre obtenida del paciente con una pareja de unión específica para dicho marcador. En algunas realizaciones, la pareja de unión puede ser un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferiblemente monoclonal, dirigido contra el marcador soluble específico. Los anticuerpos policlonales de la invención, o un fragmento de los mismos, pueden producirse según métodos conocidos administrando el antígeno o epítopo apropiado a un animal huésped seleccionado de, por ejemplo, cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas y ratones, entre otros. Pueden usarse diversos adyuvantes conocidos en la técnica para mejorar la producción de anticuerpos. Aunque los anticuerpos útiles para la práctica de la invención pueden ser policlonales, se prefieren los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales de la invención, o un fragmento de los mismos, pueden prepararse y aislarse usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción y el aislamiento incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma; la técnica del hibridoma de células B humanas; y la técnica del hibridoma del VEB. En algunas realizaciones, la pareja de unión puede ser un aptámero. Los aptámeros son una clase de molécula que representan una alternativa a los anticuerpos en cuanto a reconocimiento molecular. Los aptámeros son secuencias de oligonucleótidos u oligopéptidos con capacidad para reconocer prácticamente cualquier clase de moléculas diana con alta afinidad y especificidad. Tales ligandos pueden aislarse a través de evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial (SELEX) de una biblioteca de secuencias aleatorias. En algunas realizaciones, la pareja de unión de la invención se marca con una molécula o sustancia detectable, tal como un sustrato cromogénico, una molécula fluorescente, una molécula radiactiva o cualquier otro marcador conocido en la técnica. En la técnica se conocen marcadores que generalmente proporcionan (directa o indirectamente) una señal. Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término “marcado”, con respecto al anticuerpo o aptámero, abarque el mareaje directo del anticuerpo o aptámero mediante el acoplamiento (es decir, unión física) de una sustancia detectable, tal como un agente radiactivo, una enzima (por ejemplo, peroxidasa del rábano o fosfatasa alcalina) o un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) o indocianina (Cy5) o aloficocianina), al anticuerpo o aptámero, así como el marcaje indirecto de la sonda o el anticuerpo por reactividad con una sustancia detectable. Un anticuerpo o aptámero de la invención puede marcarse con una molécula radiactiva mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, las moléculas radiactivas incluyen, pero no se limitan a, átomos radiactivos para estudios gammagráficos tales como I123, I124, In111, Re186, Re188. Preferiblemente, los anticuerpos contra los marcadores de superficie ya están conjugados con un fluoróforo (por ejemplo, conjugados con FITC y/o conjugados con PE o aloficocianina).

Los ensayos anteriormente mencionados pueden implicar la unión de las parejas de unión (es decir, anticuerpos o aptámeros) a un soporte sólido. Los soportes sólidos que pueden usarse en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o de pocillo de microtitulación); poli(cloruro de vinilo) (por ejemplo, láminas o pocillos de microtitulación); látex de poliestireno (por ejemplo, perlas o placas de microtitulación); poli(fluoruro de vinilideno); papel diazotizado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas con respuesta magnética, y similares. Las superficies sólidas son preferiblemente perlas. Dado que las vesículas extracelulares tienen un diámetro de aproximadamente 0,1 a 1 |im, las perlas para su uso en la presente invención deben tener un diámetro superior a 1 |im. Las perlas pueden prepararse a partir de diferentes materiales, incluyendo, pero sin limitarse a, vidrio, plástico, poliestireno y material acrílico. Además, las perlas están preferiblemente marcadas de manera fluorescente. En algunas realizaciones, se usa un método ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), en el que los pocillos de una placa de microtitulación se recubren con un conjunto de anticuerpos que reconocen dicho marcador soluble de interés. Luego se añade la muestra de sangre a los pocillos recubiertos. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno, puede(n) lavarse la(s) placa(s) para retirar las moléculas no unidas y se añade una molécula de unión secundaria marcada de manera detectable. Se permite que la molécula de unión secundaria reaccione con cualquier proteína marcadora de muestra capturada, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria usando métodos bien conocidos en la técnica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “vesícula extracelular” o “VE” tiene su significado general en la técnica y designa una vesícula de la membrana plasmática desprendida de una célula apoptótica o activada. El tamaño de las vesículas extracelulares oscila entre 0,1 |im y 1 |im de diámetro. Los marcadores de superficie de las vesículas extracelulares son los mismos que los de las células a partir de las cuales se originan. Tal como se usa en el presente documento, el término “vesícula extracelular derivada del endotelio” se refiere a una vesícula extracelular que se deriva de una célula endotelial. En particular, las vesículas extracelulares derivadas del endotelio se caracterizan por la expresión de factor tisular (TF) y anexina V. Por tanto, en algunas realizaciones, el método de la presente invención comprende determinar el nivel de vesículas extracelulares endoteliales TF+ y/o AnnV+. Los métodos convencionales para determinar el nivel de vesículas extracelulares en una muestra de sangre se conocen bien en la técnica. Por ejemplo, los métodos pueden consistir en recoger una población de vesículas extracelulares de un paciente y usar parejas de unión diferencial dirigidas contra los marcadores de superficie específicos de dichas vesículas extracelulares, en los que las vesículas extracelulares están unidas por dichas parejas de unión a dichos marcadores de superficie. Según la invención, los métodos de citometría de flujo son métodos preferidos para determinar el nivel de vesículas extracelulares en la muestra de sangre obtenida del paciente. Por tanto, por ejemplo, puede usarse clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para separar, en la muestra de sangre, las vesículas extracelulares deseadas. En otra realización, pueden usarse perlas magnéticas para aislar las vesículas extracelulares (MACS). Por ejemplo, pueden usarse perlas marcadas con anticuerpos monoclonales específicos para la selección positiva de vesículas extracelulares. Otros métodos pueden incluir el aislamiento de vesículas extracelulares mediante el agotamiento de los componentes no extracelulares de las vesículas (selección negativa). Por ejemplo, las vesículas extracelulares pueden excitarse con luz de longitud de onda de 488 nm y pueden medirse las fluorescencias verde y roja logarítmicas de FITC, PE y aloficocianina a través de filtros de paso de banda de 530/30 nm, 585/42 nm y 660/20 nm, respectivamente. El número absoluto de vesículas extracelulares puede calcularse entonces a través de un software específico útil en la práctica de los métodos de la presente invención. Por consiguiente, en una realización específica, el método de la invención comprende las etapas de obtener una muestra de sangre tal como se describió anteriormente; colocar dicha muestra preparada en un recipiente; añadir tanto anticuerpos marcados contra marcadores de superficie que son específicos de las vesículas extracelulares de interés como una concentración conocida de superficies sólidas fluorescentes; realizar un análisis por FACS en la muestra preparada con el fin de calcular el número absoluto de vesículas extracelulares en la misma.

Tal como se usa en el presente documento, el término “complejos ADN-histona” tiene su significado general en la técnica y se refiere a las redes fibrilares de ADN, proteínas nucleares, incluyendo histonas, y proteínas granulares que se liberan de los neutrófilos durante una compleja ruta de señalización de muerte celular denominada NETosis. Por tanto, en algunas realizaciones, el método de la presente invención comprende determinar el nivel circulante de complejos ADN-histona. Métodos convencionales para determinar el nivel de estos complejos son métodos ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), en los que los pocillos de una placa de microtitulación se recubren con un conjunto de anticuerpos que reconocen las histonas. Luego se añade la muestra de sangre a los pocillos recubiertos. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno, puede(n) lavarse la(s) placa(s) para retirar los restos no unidos y se añade un anticuerpo anti-ADN marcado de manera detectable. Se permite que el anticuerpo anti-ADN reaccione con cualquier proteína marcadora de muestra capturada, se lava la placa y se detecta la presencia de anticuerpo anti-ADN usando métodos bien conocidos en la técnica.

Normalmente, el valor de referencia predeterminado es un valor umbral o un valor de corte. Normalmente, un “valor umbral” o “valor de corte” puede determinarse de manera experimental, empírica o teórica. Un valor umbral también puede seleccionarse arbitrariamente basándose en las condiciones experimentales y/o clínicas existentes, tal como reconocería un experto habitual en la técnica. Por ejemplo, puede usarse la medición retrospectiva de las capacidades de generación de trombina o de los niveles de marcadores solubles en muestras históricas de pacientes debidamente conservadas para establecer el valor de referencia predeterminado. El valor umbral debe determinarse con el fin de obtener la sensibilidad y la especificidad óptimas según la función de la prueba y la relación beneficio/riesgo (consecuencias clínicas de falsos positivos y falsos negativos). Normalmente, la sensibilidad y la especificidad óptimas (y, por tanto, el valor umbral) pueden determinarse usando una curva característica operativa del receptor (ROC) basada en datos experimentales. Por ejemplo, después de cuantificar el nivel de expresión en un grupo de referencia, puede usarse un análisis algorítmico para el tratamiento estadístico de los niveles determinados en las muestras que van a someterse a prueba y obtener de ese modo un patrón de clasificación que tiene significación para la clasificación de muestras. El nombre completo de una curva ROC es curva característica operativa del receptor, que también se conoce como curva de rendimiento diagnóstico. Se usa principalmente para pruebas diagnósticas bioquímicas clínicas. Una curva ROC es un indicador completo que refleja las variables continuas de la tasa de verdaderos positivos (sensibilidad) y la tasa de falsos positivos (1-especificidad). Revela la relación entre la sensibilidad y la especificidad con el método de composición de imagen. Se establecen una serie de diferentes valores de corte (umbrales o valores críticos, valores límite entre los resultados normales y anómalos de la prueba diagnóstica) como variables continuas para calcular una serie de valores de sensibilidad y especificidad. Luego se usa la sensibilidad como coordenada vertical y la especificidad como coordenada horizontal para trazar una curva. Cuanto mayor sea el área bajo la curva (AUC), mayor será la precisión del diagnóstico. En la curva ROC, el punto más cercano al extremo superior izquierdo del diagrama de coordenadas es un punto crítico que tiene altos valores tanto de sensibilidad como de especificidad. El valor AUC de la curva ROC se sitúa entre 1,0 y 0,5. Cuando el AUC>0,5, el resultado del diagnóstico es cada vez mejor a medida que el AUC se acerca a 1. Cuando el AUC está entre 0,5 y 0,7, la precisión es baja. Cuando el AUC está entre 0,7 y 0,9, la precisión es moderada. Cuando el AUC es superior a 0,9, la precisión es bastante alta. Este método algorítmico se realiza preferiblemente con un ordenador. Para el trazado de la curva ROC pueden usarse softwares o sistemas existentes en la técnica, tales como, por ejemplo, el software estadístico médico MedCalc 9.2.0.1, SPSS 9.0, ROCPOWER.SAS, DESIGNROC.FOR, MULTIREADER POWER.SAS, CREATE-ROC.SAS, GB STAT VI0.0 (Dynamic Microsystems, Inc. Silver Spring, Md., EE.UU.), etc. En algunas realizaciones, se obtienen altos valores de significación estadística (por ejemplo, bajos valores de p) para un intervalo de valores de cuantificación arbitrarios sucesivos, y no sólo para un único valor de cuantificación arbitrario. Por tanto, en algunas realizaciones, en lugar de usar un valor de referencia predeterminado definido, se proporciona un intervalo de valores. Por tanto, se establece arbitrariamente un valor mínimo de significación estadística (umbral mínimo de significación, por ejemplo, valor de p umbral máximo) y se conserva un intervalo de una pluralidad de valores de cuantificación arbitrarios para los que el valor de significación estadística calculado en la etapa g) es más alto (más significativo, por ejemplo, valor de p más bajo), de modo que se proporciona un intervalo de valores de cuantificación. Este intervalo de valores de cuantificación incluye un “valor de corte” tal como se describió anteriormente. Por ejemplo, según esta realización específica de un valor “de corte”, el estado del paciente puede determinarse comparando la capacidad o el nivel con el intervalo de valores que se identifican. Por tanto, en algunas realizaciones, un valor de corte consiste en un intervalo de valores de cuantificación, por ejemplo, centrado en el valor de cuantificación para el que se encuentra el valor de significación estadística más alto (por ejemplo, generalmente el valor de p mínimo que se encuentra). Por ejemplo, en una escala hipotética de 1 a 10, si el valor de corte ideal (el valor con la significación estadística más alta) es 5, un intervalo adecuado (a modo de ejemplo) puede ser de 4-6. Por ejemplo, puede evaluarse a un paciente comparando los valores obtenidos mediante la determinación de capacidades o niveles, donde valores superiores a 5 revelan que el paciente presenta un estado hipercoagulable y valores inferiores a 5 revelan que el paciente no presenta características de un estado hipercoagulable. En algunas realizaciones, puede evaluarse a un paciente comparando los valores obtenidos mediante la determinación de capacidades o niveles y comparando los valores en una escala, donde valores superiores al intervalo de 4-6 indican que el paciente presenta un estado hipercoagulable y valores inferiores al intervalo de 4-6 indican que el paciente no presenta un estado hipercoagulable, y valores que se encuentran dentro del intervalo de 4-6 indican que se necesita más investigación para concluir que el paciente presenta un estado hipercoagulable.

El método de la presente invención es particularmente adecuado para determinar si el paciente está en riesgo de ser rehospitalizado. Tal como se usa en el presente documento, el término “rehospitalizado” designa un paciente que ha sido hospitalizado por insuficiencia cardiaca y que vuelve a ser hospitalizado. En este contexto, el paciente vuelve a ser hospitalizado por la misma enfermedad. Dicho de otro modo, el término “rehospitalizado” designa una nueva hospitalización por insuficiencia cardiaca.

El método de la presente invención también es particularmente adecuado para determinar si un paciente es idóneo para un tratamiento con un anticoagulante. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticoagulante” tiene su significado general en la técnica y se refiere a un compuesto que puede prevenir o inhibir la coagulación de la sangre. Se han descrito diversos compuestos como anticoagulantes que afectan a una o más enzimas o sustancias auxiliares de la cascada de coagulación. Las cumarinas, por ejemplo, son antagonistas de la vitamina K de origen vegetal que agotan al organismo de la forma activa de la vitamina K que se requiere como sustancia auxiliar para las actividades de la trombina y los factores VII, IX y X. Las cumarinas típicas incluyen la warfarina, el acenocumarol, el fenprocumón, la atromentina, el brodifacum o la fenindiona. Las heparinas son glicosaminoglicanos altamente sulfatados y se asemejan a otra clase de anticoagulantes que se producen de manera natural. Activan la antitrombina, que bloquea la actividad de la trombina y otras enzimas de la cascada de coagulación, incluyendo el factor Xa, y, por tanto, inhiben la formación de coágulos de fibrina. Normalmente, se usa la heparina de bajo peso molecular (HBPM) o la heparina no fraccionada (HNF) como heparina en la terapia anticoagulante. También se usan heparanoides en la terapia anticoagulante, tales como danaparoid (también denominado Orgaran). En algunas realizaciones, el anticoagulante es un inhibidor del factor Xa. Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibidor del factor Xa” se refiere a la capacidad de un compuesto para alterar la función del factor Xa. Un inhibidor del factor Xa puede bloquear o reducir la actividad del factor Xa mediante la formación de un enlace covalente reversible o irreversible entre el inhibidor y el factor Xa o a través de la formación de un complejo unido de manera no covalente. En algunas realizaciones, la inhibición del factor Xa puede evaluarse usando el método descrito en Wong et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2008, 6(5), 820-829; Weitz et al., Thromb. Haemost. 2006, 96(3), 274-284; Turpie, A., Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007, 27, 1238-1247; Turpie, A., European Heart Journal 2007, 29, 155-165; y Jiang, et al., Thrombosis and Haemostasis 2009, 101(4), 780-782. Los ejemplos de inhibidores del factor Xa incluyen, pero no se limitan a, tamixabán, rivaroxabán, fondaparinux e idraparinux.

Los resultados obtenidos por los inventores también revelan que el paciente que presenta un estado hipercoagulable puede ser idóneo para una terapia anticoagulante que consiste en administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una ADNasa. En la presente invención puede usarse cualquier ADNasa adecuada. La ADNasa será lo más preferiblemente una ADNasa I (EC 3.1.21.1). Sin embargo, en algunas realizaciones, puede ser una ADNasa II (EC 3.1.21.1). Las ADNasas se producen en varias especies y puede usarse en la invención cualquier ADNasa que pueda escindir el ADN. La ADNasa puede ser de origen animal, tal como, por ejemplo, de origen bovino o porcino. Puede ser de origen vegetal, fúngico o microbiano. Sin embargo, normalmente y lo más preferiblemente, la ADNasa es de origen humano y es preferiblemente una ADNasa humana recombinante. Pueden usarse preparaciones de ADNasa disponibles comercialmente, tales como Dornase™ y Pulmozyme™, en las realizaciones de la invención. En algunas realizaciones, la ADNasa tiene actividad hidrolítica de ADN, por ejemplo, en el caso de la ADNasa I puede hidrolizar el ADN para dar nucleótidos 5'-fosfato y en el caso de la ADNasa Iⁱ puede hidrolizar el ADN para dar nucleótidos 3'-fosfato. Puede usarse un ensayo basado en fluorescencia usando, por ejemplo, tinción de Hoechst, tal como la que se detectó en Labarce y Paiden, 1980, Anal. Biochem., 102:344-352 para someter a ensayo la hidrólisis del a Dn . La actividad hidrolítica puede evaluarse de diversas formas conocidas en la técnica, incluyendo electroforesis analítica en gel de poliacrilamida y agarosa, ensayo de hipercromicidad (Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:349-362 (1950); Kunitz, J. Gen. Physiol. 33:363-377 (1950)) o ensayo de verde de metilo (Kurnick, Arch. Biochem. 29:41-53 (1950); Sinicropi, et al., Anal. Biochem. 222:351-358 (1994)). La descomposición de las moléculas de ADN desde las formas de alto peso molecular a las de bajo peso molecular puede monitorizarse preferiblemente mediante técnicas tales como la electroforesis en gel de agarosa. Pueden realizarse experimentos de control en ausencia de la enzima y/o en presencia de una proteína que se sabe que posee actividad ADNasa. Se sabe que las ADNasas son propensas a la desamidación. Los residuos de asparagina y, en particular, la asparagina en las posiciones de aminoácido 7 y 74 de la ADNasa I humana madura, son propensos a la desamidación. Este proceso convierte los residuos de asparagina en cuestión en residuos de ácido aspártico o iso-aspartato. La desamidación reduce la actividad de la enzima, y este es particularmente el caso de la desamidación en la asparagina en la posición de aminoácido 74 de la ADNasa I humana madura. Existen técnicas para eliminar las formas desamidadas de las enzimas para dejar las formas amidadas, y estas pueden emplearse para preparar ADNasas para su uso en la invención. Estas técnicas pueden incluir intercambio catiónico tentacular (TcX) o purificación por afinidad usando ADN para purificar las formas amidadas de la enzima que todavía son capaces de unirse al ADN. Una preparación de ADNasa para su uso en la invención puede comprender normalmente del 85 al 100% (preferiblemente del 90 al 100%, más preferiblemente del 95 al 100% e incluso más preferiblemente del 99 al 100%) de enzima amidada, o parcialmente amidada, en peso. En particular, estos porcentajes se refieren a la cantidad de enzima totalmente amidada, es decir, amidándose todos los residuos que están naturalmente amidados. Normalmente tendrán más del 95%, preferiblemente más del 99% e incluso más preferiblemente más del 99,9% de la ADNasa en forma amidada. En particular, estos valores se refieren a los valores en el momento de la producción o a sus valores desde un mes hasta un año, preferiblemente desde dos hasta seis meses y más preferiblemente desde tres hasta cuatro meses después de la producción. Pueden referirse al valor durante cualquier momento de la vida útil del producto. En la invención pueden usarse variantes de ADNasas que se producen de manera natural o conocidas. Por tanto, el término ADNasa abarca tales variantes. El término “variantes” se refiere a polipéptidos que tienen el mismo carácter esencial o la misma funcionalidad biológica básica que la ADNasa. El carácter esencial de una ADNasa es la actividad fosfodiesterasa y la capacidad de hidrolizar el ADN. En el presente documento se describen ensayos para medir la escisión del ADN, y estos pueden usarse para determinar si una variante tiene actividad hidrolítica. La secuencia de la ADNasa puede modificarse para que tenga una semivida más larga. Por ejemplo, la secuencia de la enzima puede cambiarse para eliminar las secuencias de reconocimiento de determinadas proteasas y, en particular, las derivadas de células inflamatorias. La ADNasa empleada en la invención también puede modificarse químicamente para alterar sus propiedades tales como, por ejemplo, su semivida biológica. Para ello, pueden introducirse modificaciones covalentes haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos de la ADNasa nativa o variante con un agente de derivatización orgánico que puede reaccionar con residuos N-terminales o C-terminales o cadenas laterales de aminoácidos seleccionados. Los métodos y agentes de derivatización adecuados se conocen bien en la técnica. Los residuos que, en particular, pueden derivatizarse incluyen residuos de cisteinilo (lo más habitualmente por reacción con ahaloacetatos), residuos de histidilo (por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0), residuos de lisinilo y amino-terminales (por reacción con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácidos carboxílicos), residuos de arginilo (por reacción con reactivos tales como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina). Los grupos laterales carboxílicos (aspartilo o glutamilo) pueden modificarse selectivamente por reacción con carbodiimidas o pueden convertirse en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio. La unión covalente de agentes tales como polietilenglicol (PEG) o albúmina sérica humana a las ADNasas puede reducir su inmunogenicidad y/o la toxicidad de la variante y/o prolongar su semivida y, por tanto, puede usarse en la invención. En algunas realizaciones de la invención, la ADNasa puede conjugarse directamente con el glicosaminoglicano o unirse a través de una molécula intermedia.

Los resultados obtenidos por los inventores también revelan que el paciente que presenta un estado hipercoagulable puede ser idóneo para una terapia anticoagulante que consiste en administrar un antagonista de la selectina P. De hecho, dicho antagonista puede ser adecuado para prevenir los efectos perjudiciales mediados por las vesículas extracelulares derivadas del endotelio presentes en el torrente sanguíneo del paciente. Tal como se usa en el presente documento, el término “selectina P” tiene su significado general en la técnica y se refiere a una proteína de 140 kDa expresada por las plaquetas y las células endoteliales humanas, tal como describen Hsu-Lin et al., J Biol Chem 259: 9121 (1984) y Mc Ever et al., J Clin Invest 84:92 (1989). El término también se conoce como CD62P, GMP-140, PADGEM y LECAM-3. Tal como se usa en el presente documento, el término “antagonista de la selectina P” incluye cualquier agente que puede antagonizar la selectina P, por ejemplo, inhibiendo la interacción entre la selectina P y un ligando 1 de glicoproteína de selectina P, por ejemplo, inhibiendo las interacciones de las plaquetas activadas y las células endoteliales que expresan selectina P con leucocitos que expresan PSGL-1. En algunas realizaciones, el antagonista de la selectina P es un anticuerpo contra la selectina P. Los anticuerpos contra la selectina P se conocen a partir de, por ejemplo, la patente estadounidense 4.783.399, el documento WO 93/06863, Geng et al. (J. Biol. Chem., 266 (1991) 22313-22318), el documento WO 93/21956, el documento WO 2005/100402 y el documento WO2008069999. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-selectina P de la presente invención es SEG101, también denominado crizanlizumab.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratamiento” o “tratar” se refieren tanto al tratamiento profiláctico o preventivo como al tratamiento curativo o modificador de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de sujetos con riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que la han contraído, así como de sujetos que están enfermos o a los que se les ha diagnosticado una enfermedad o afección médica, e incluye la supresión de la recaída clínica. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que padece un trastorno médico o que, en última instancia, puede adquirirlo, con el fin de prevenir, curar, retrasar la aparición, reducir la gravedad de o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o un trastorno recurrente, o con el fin de prolongar la supervivencia de un sujeto más allá de lo esperado en ausencia de tal tratamiento. Por “régimen terapéutico” se entiende la pauta de tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, la pauta posológica usada durante la terapia. Un régimen terapéutico puede incluir un régimen de inducción y un régimen de mantenimiento. La expresión “régimen de inducción” o “periodo de inducción” se refiere a un régimen terapéutico (o la parte de un régimen terapéutico) que se usa para el tratamiento inicial de una enfermedad. El objetivo general de un régimen de inducción es proporcionar un alto nivel de fármaco a un sujeto durante el periodo inicial de un régimen de tratamiento. Un régimen de inducción puede emplear (en parte o en su totalidad) un “régimen de carga”, que puede incluir la administración de una dosis mayor del fármaco que la que un médico emplearía durante un régimen de mantenimiento, la administración de un fármaco con mayor frecuencia con la que un médico administraría un fármaco durante un régimen de mantenimiento, o ambas cosas. La expresión “régimen de mantenimiento” o “periodo de mantenimiento” se refiere a un régimen terapéutico (o la parte de un régimen terapéutico) que se usa para el mantenimiento de un sujeto durante el tratamiento de una enfermedad, por ejemplo, para mantener al sujeto en remisión durante largos periodos de tiempo (meses o años). Un régimen de mantenimiento puede emplear una terapia continua (por ejemplo, la administración de un fármaco a intervalos regulares, por ejemplo, semanales, mensuales, anuales, etc.) o una terapia intermitente (por ejemplo, un tratamiento interrumpido, un tratamiento intermitente, un tratamiento en caso de recaída o un tratamiento al alcanzar un criterio particular predeterminado [por ejemplo, la manifestación de la enfermedad, etc.]).

La invención se ilustrará adicionalmente con las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse en modo alguno como una limitación del alcance de la presente invención.

Figuras

Figura 1. La insuficiencia cardiaca aguda descompensada aumenta la generación de trombina en plasma. Curva representativa de generación de trombina en plasma rico en plaquetas. La generación de trombina se desencadenó por factor tisular 0,5 pM y se monitorizó con el ensayo de trombograma automatizado calibrado. Figura 2. La insuficiencia cardiaca aguda descompensada afecta a la sensibilidad de la proteína C activada. Inhibición del potencial de trombina endógena (ETP) por la proteína C activada (APC) en plasma rico en plaquetas.

Figura 3. Los niveles de marcadores circulantes de activación endotelial, tales como el factor de Von Willebrand (VWF), están elevados en los pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada.

Figura 4. La concentración de vesículas extracelulares derivadas del endotelio procoagulantes está elevada en los pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada. Las actividades procoagulantes relacionadas con las vesículas extracelulares se basan en el potencial dependiente de fosfolípidos detectado por la unión de anexina V.

Figura 5. Los niveles plasmáticos de complejos ADN-histona están elevados en los pacientes con insuficiencia cardiaca aguda descompensada.

Ejemplos

EJEMPLO 1:

Material y métodos

Recogida de muestras de sangre

Se recogieron muestras de sangre venosa en jeringas Monovette® (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) que contenían 1/10 de volumen de citrato de sodio 0,106 M. Se realizaron todos los análisis en las dos horas siguientes a la recogida de sangre. Se preparó plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación de la sangre a 190 g durante 10 minutos a 20°C. Se recuperó el PRP y se ajustó a 150 g/l mediante la adición de plasma desplaquetado obtenido mediante centrifugación de la sangre restante a 1750 g durante 10 min a 20°C. Se obtuvo plasma libre de plaquetas (PFP) a partir del plasma desplaquetado centrifugado a 13000 g durante 30 min a 4°C. Se congeló inmediatamente el PFP a -80°C y se descongeló 15 min a 37°C cuando fue necesario. Para la enumeración y caracterización de las vesículas extracelulares, se sometieron las muestras de sangre a dos centrifugaciones sucesivas a 2500 g durante 15 min, y se preparó el plasma desplaquetado (PDP) y se almacenó a -80°C hasta su uso.

Ensayos de generación de trombina

Se realizó el trombograma automatizado calibrado (CAT) a 37°C en un fluorómetro de placa de microtitulación (Fluoroskan Ascent, ThermoLabsystems, Helsinki, Finlandia) usando un programa informático específico (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos).10 Se desencadenó la coagulación con factor tisular (TF) humano recombinante 0,5 pM (Innovin®, Dade Behring). Para las mediciones en PFP, se añadió una mezcla de fosfatidilcolina (PC)/serina (PS)/etanolamina (PE) (PC/PS/PE, 60/20/20, % en moles) a una concentración final de 4 |iM. Se registraron por triplicado curvas de generación de trombina usando PRP en ausencia o en presencia de proteína C activada (APC) propia a varias concentraciones finales (6,7, 13,9, 25 y 65 nM) y PFP en ausencia o en presencia de APC propia a varias concentraciones finales (0,85, 1,7, 6,7 y 13,9 nM). La cantidad total de actividad de trombina (es decir, el potencial de trombina endógena, ETP) se evaluó como el área bajo la curva. La concentración de APC que produjo una inhibición del 50% de ETP se definió como CI⁵⁰-APC.¹¹ Variables hemostáticas y marcadores endoteliales

Todas las mediciones se realizaron en plasma desplaquetado. Se midieron TM soluble, EPCR soluble, inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) libre, factor de Von Willebrand (VWF) y factor VIII (FVIII) mediante kits de ELISA (Asserachrom, Diagnostica Stago™, Asniéres, Francia).

Vesículas extracelulares de origen celular

Se adquirieron los anticuerpos fluorescentes, CD41-ficoeritrina (CD41-PE), CD144-PE, CD14-PE y aloficocianina-EPCR de BD Pharmingen™. El otro anticuerpo contra TF, el clon TF9-10H10, la aloficocianina-TF era de Biotechne™, y la anexina-V (AnnV)-FITC de Fisher Scientific™. Se enumeraron las MP mediante citometría de flujo de alta sensibilidad usando un procedimiento normalizado:12 se incubó el plasma (20 |il) con la concentración óptima de anticuerpo específico más 10 |il de AnnV-FITC. Se analizaron las muestras teñidas en un instrumento GALLIOS (Beckman-Coulter™, Miami, FL, EE.UU.).

Resultados

En comparación con los controles, el potencial de trombina endógena (ETP) fue mayor en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario, usando plasmas ricos en plaquetas y desplaquetados, y permaneció aumentado durante el periodo de hospitalización (figura 1).

La concentración de proteína C activada (APC) que inhibe la generación de trombina en el plasma rico en plaquetas en un 50% también fue mayor en el momento del ingreso hospitalario (figura 2).

Los marcadores solubles de disfunción endotelial, incluyendo factor de Von Willebrand (figura 3), factor VIII, inhibidor de la ruta del factor tisular libre y las formas solubles del receptor endotelial de la proteína C y trombomodulina, eran más elevados en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario.

Se encontraron mayores concentraciones de vesículas extracelulares derivadas del endotelio positivas para anexina-V/factor tisular (TF) en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario en comparación con los controles (figura 4).

Los niveles plasmáticos de complejos ADN-histona como medida indirecta de la ruta de señalización de la muerte de neutrófilos altamente compleja (NETosis) están elevados en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario (figura 5).

EJEMPLO 2:

Métodos

Pacientes y controles

El estudio fue un estudio prospectivo monocéntrico de 34 pacientes consecutivos ingresados en un servicio de cardiología por ICAD (todos en clase funcional III o IV de la New York Heart Association, NYHA) definida según las directrices de la Sociedad Europea de Cardiología como la rápida aparición/progresión de síntomas y signos de IC secundarios a una función cardiaca anómala que requiere ingreso hospitalario. Se recogió sangre en el momento del ingreso hospitalario, el día del alta y después del alta hospitalaria tras al menos seis semanas de estabilidad clínica. Las mediciones hemodinámicas formaban parte de la evaluación clínica de los pacientes y la terapia de la IC durante la estancia en el hospital y en el momento del alta quedaba a discreción del médico tratante. También se incluyó un grupo de 30 pacientes con IC crónica (ICC) estable reclutados en clínicas ambulatorias para identificar las diferencias con la fase aguda de la IC descompensada. En el estudio se incluyeron 30 pacientes de control (CT) con función ventricular conservada remitidos al departamento de cardiología para una evaluación médica programada y que no presentaban IC pero tenían patrones similares de comorbilidades, factores de riesgo (por ejemplo, hipertensión, diabetes y tabaquismo) y medicación previa para aclarar la posible contribución de confusión de la estancia hospitalaria. Los criterios de exclusión para todos los grupos del estudio fueron los factores que podían afectar a la coagulación: trastornos infecciosos e inflamatorios, neoplasia, creatinina sérica >200 |imol/l, uso de fármacos esteroideos, síndrome coronario agudo, fibrilación auricular y todas las comorbilidades que requerían anticoagulación terapéutica. Los criterios de exclusión durante la estancia hospitalaria fueron el empeoramiento de la IC que requería un dispositivo de asistencia o un trasplante de corazón. Todos los pacientes con ICAD recibieron una profilaxis contra la tromboembolia venosa (TEV) (enoxaparina 4000 UI una vez al día). La recogida de sangre se realizó antes de la profilaxis contra la TEV en el momento del ingreso y 36 horas después de la última inyección de enoxaparina el día del alta. No se administró profilaxis contra la TEV en los pacientes CT y con ICC. El protocolo del estudio fue aprobado por el comité ético local (acuerdo del Comité para la Protección de Personas 15/10/2014). Todos los pacientes del estudio dieron su consentimiento informado por escrito.

Recogida de muestras de sangre

Se recogieron muestras de sangre venosa en jeringas Monovette® (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania) que contenían 1/10 de volumen de citrato de sodio 0,106 M. Todos los análisis se realizaron en las dos horas siguientes a la recogida de sangre. Se preparó plasma rico en plaquetas (PRP) mediante centrifugación de la sangre a 190 g durante 10 minutos a 20°C. Se recuperó el PRP y se ajustó a 150 g/l para CAT mediante la adición de plasma desplaquetado obtenido mediante centrifugación de la sangre restante a 1750 g durante 10 min a 20°C. Se obtuvo plasma libre de plaquetas (PFP) a partir del plasma desplaquetado centrifugado a 13000 g durante 30 min a 4°C. Se congeló inmediatamente el PFP a -80°C y se descongeló 15 min a 37°C cuando fue necesario. Para la enumeración y caracterización de las VE, se sometió la sangre a dos centrifugaciones sucesivas a 2500 g durante 15 min, y se preparó el plasma desplaquetado (PDP) y se almacenó a -80°C hasta su uso.

Ensayos de generación de trombina

Se realizó CAT a 37°C usando un programa informático específico (Thrombinoscope BV, Maastricht, Países Bajos), tal como se notificó previamente. Se desencadenó la coagulación con factor tisular (TF) humano recombinante 0,5 pM (Innovin®, Dade Behring). Para las mediciones en PFP, se añadió una mezcla casera de fosfatidilcolina/serina/etanolamina (60/20/20, % en moles) a una concentración final de 4 |iM. Se registraron por triplicado las curvas de generación de trombina en ausencia o en presencia de APC propia a varias concentraciones finales (6,7, 13,9, 25 y 65 nM para el PRP y 0,85, 1,7, 6,7 y 13,9 nM para el PFP). La cantidad total de actividad de trombina (es decir, el potencial de trombina endógena, ETP) se evaluó como el área bajo la curva. La concentración de APC que produjo una inhibición del 50% del ETP se definió como CI⁵⁰-APC.

Cuantificación de variables hemostáticas y marcadores endoteliales

Todas las mediciones se realizaron en PDP. Se midieron trombomodulina (TM) soluble, receptor endotelial de la proteína C (EPCR) soluble, inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI) libre, factor de Von Willebrand (VWF) y factor VIII (FVIII) mediante kits de ELISA (Asserachrom, Diagnostica Stago™, Asniéres, Francia).

Medición de vesículas extracelulares derivadas del endotelio

Se adquirieron los anticuerpos fluorescentes, CD144-ficoeritrina (CD144-PE) y aloficocianina-EPCR de BD Pharmingen. El otro anticuerpo contra TF, el clon TF9-10H10, la aloficocianina-TF era de Biotechne™, y la anexina-V (AnnV)-FITC de Fisher Scientific™. Se enumeraron las VE mediante citometría de flujo de alta sensibilidad usando un procedimiento normalizado: se incubó plasma (20 |il) con la concentración óptima del anticuerpo específico más 10 |il de AnnV-FITC. Se analizaron las muestras teñidas en un instrumento GALLIOS (Beckman-Coulter™, Miami, FL, EE.UU.).

Determinación de los niveles plasmáticos de nucleosomas

Se midieron los niveles circulantes de nucleosomas en PDP mediante un ELISA específico usando un par de anticuerpos dirigidos contra los componentes de histona y ADN de los nucleosomas (detección de muerte celular-ELISA plus, Roche Diagnostics, Sigma-Aldrich). Como el fabricante no proporcionó una curva de calibración, se usó un material de referencia que contenía altas cantidades de nucleosomas endógenos, y los valores de nucleosomas se notificaron en unidades arbitrarias.

Análisis estadístico

Los datos categóricos se presentan como números (%); los datos continuos se presentan como media±error estándar (DE). Las diferencias en los valores categóricos se realizaron mediante la prueba 2 de Pearson o la prueba exacta no paramétrica de Fisher, según el caso. Las variables continuas se compararon usando pruebas de Wilcoxon. La variación de las variables estudiadas en los pacientes con ICAD a lo largo del periodo de seguimiento se evaluó mediante la prueba de Friedman. Las correlaciones se evaluaron mediante el cálculo del coeficiente de correlación de Spearman. El riesgo alfa se fijó al 5% para todos los análisis. Los análisis se realizaron con SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC, EE.UU.).

Resultados

Características clínicas de nivel inicial

El grupo con ICAD antes de iniciar el estudio era similar al grupo de pacientes de cardiología sin IC (CT) en cuanto a la razón de sexos, comorbilidades y factores de riesgo (tabla 1). La ICAD presentaba una disminución de la fracción de expulsión del ventrículo izquierdo y un aumento del volumen diastólico final del ventrículo izquierdo y de las presiones arteriales pulmonares. Los niveles séricos de péptido natriurético tipo B (BNP) y de proteína C reactiva (CRP) fueron mayores en los pacientes con ICAD que en los controles. No se encontraron diferencias significativas en el uso de medicación cardiovascular activa, excepto en el caso de los diuréticos, que se usaron con más frecuencia en los pacientes con ICAD. Cinco pacientes con ICAD murieron en los tres meses siguientes al alta hospitalaria sin que hubiera un seguimiento biológico disponible. Los pacientes con ICC de control diferían sustancialmente de los pacientes con ICAD en cuanto a la hipertensión y la diabetes, que eran más frecuentes en los pacientes con ICA^d . Tal como se esperaba, los niveles de BNP y CRP fueron mayores en los pacientes con ICAD que en los pacientes con ICC. Los pacientes con ICC y con ICAD presentaban una función renal reducida similar, tal como se mide mediante GFR (<60 ml/min), en comparación con los controles. Los recuentos de leucocitos y plaquetas, así como los niveles de fibrinógeno, no fueron diferentes en todos los grupos.

La generación de trombina in vitro se acelera y aumenta en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario

En el momento del ingreso hospitalario, el ETP en presencia de plaquetas (PRP ajustado al mismo recuento de plaquetas) fue mayor, mientras que el periodo de latencia y el tiempo hasta el pico fueron notablemente más cortos, aunque no significativamente, en los pacientes con ICAD en comparación con los controles (tabla 2 y datos no mostrados). En ausencia de plaquetas (PFP), el pico de trombina, el ETP y la velocidad aumentaron, y el periodo de latencia y el tiempo hasta el pico se acortaron en los pacientes con ICAD en comparación con los controles (tabla 2 y datos no mostrados). En comparación con los controles, el ETP aumentó en los pacientes con ICC sólo en presencia de plaquetas. No hubo diferencias significativas en el ETP entre los pacientes con ICC y con ICAD en el momento del ingreso en presencia de plaquetas, mientras que el ETP fue mayor en ausencia de plaquetas en los pacientes con ICAD. El aumento de los valores del ETP y/o del pico de trombina se mantuvo el día del alta, pero se perdió en el momento posterior al alta (tabla 2 y datos no mostrados).

La sensibilidad de APC se altera en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario

El ETP en presencia de APC fue sistemáticamente mayor en el momento del ingreso hospitalario en comparación con los controles (datos no mostrados). La concentración de APC (CI⁵⁰-APC) que dio la inhibición semimáxima de ETP sin APC aumentó significativamente en presencia de plaquetas en el momento del ingreso hospitalario en comparación con los controles (tabla 2). La CI⁵⁰-APC en ausencia de plaquetas tendió a aumentar en los pacientes con ICAD en comparación con los controles, pero no alcanzó significación estadística. No se encontraron diferencias entre los pacientes con ICC y los controles o los pacientes con ICAD en el momento del ingreso en presencia de plaquetas, mientras que la CI⁵⁰-APC en ausencia de plaquetas aumentó en los pacientes con ICAD en comparación con los pacientes con ICC. Cuando se combinan el ETP (sin APC) y la CI⁵⁰-APC usando su producto aritmético, se confirmó un fenotipo procoagulante por un valor cercano al triple en el momento del ingreso hospitalario en comparación con los controles (tabla 2). Este parámetro tendió a aumentar en el PRP de los pacientes con ICC en comparación con los controles, pero no alcanzó significación estadística. En comparación con los pacientes con ICC, los valores de ETP*CI50-APC aumentaron en ausencia de plaquetas en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso. Los valores de ETP en presencia de APC se desplazaron hacia abajo en el momento posterior al alta en comparación con el ingreso (datos no mostrados). En el momento del alta hospitalaria, e incluso más en el momento posterior al alta, el producto aritmético ETP*CI50-APC estaba disminuido.

Los marcadores solubles de activación endotelial están elevados en las fases agudas descompensadas de la IC

Los pacientes con ICAD tenían mayores niveles plasmáticos de sEPCR, sTM, VWF, TFPI libre y FVIII en el momento del ingreso hospitalario frente a los controles (tabla 2 y datos no mostrados). El aumento de FVIII fue paralelo al aumento de VWF, tal como revelaron valores similares de la razón FVIII/VWF. Los niveles de estos factores fueron significativamente mayores en el momento del ingreso de pacientes con ICAD en comparación con los niveles plasmáticos del grupo con ICC. Sólo el FVIII y, por tanto, la razón FVIII/FVR, estaba elevado en los pacientes con ICC en comparación con los controles. La elevación de estos factores se mantuvo el día del alta, pero se perdió en el momento posterior al alta, excepto en el caso del TFPI libre. En comparación con los controles, las concentraciones de vEe AnnV+, VEe TF+ y VEe AnnV+/TF+ fueron significativamente mayores en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso (tabla 2 y datos no mostrados). La concentración de VEe TF+ en los pacientes con ICC aumentó significativamente en comparación con los controles. No se observaron diferencias en las concentraciones de VEe EPCR+ y VEe AnnV+/EPCR+ entre los pacientes con ICAD y los controles o los pacientes con ICC (tabla 2). La concentración de VEe AnnV+ y VEe TF+ en los pacientes con ICAD disminuyó significativamente a lo largo del curso hospitalario y se redujo en el momento posterior al alta en comparación con el ingreso.

Los nucleosomas circulantes están elevados en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso hospitalario

Se midieron los niveles plasmáticos de nucleosomas en un subgrupo de pacientes con ICAD que incluía a todos los que tuvieron seguimiento después del alta. Los nucleosomas circulantes estaban aumentados en los pacientes con ICAD en el momento del ingreso en comparación con los controles y los pacientes con ICC (datos no mostrados). En el día del alta, los niveles de nucleosomas seguían siendo elevados, mientras que se evidenciaba un descenso significativo en el momento posterior al alta. Los niveles de nucleosomas en el momento del ingreso hospitalario se correlacionaron de manera significativa con la CI⁵⁰-APC y el ETP*CI50-APC en presencia de plaquetas (r=0,59; p=0,013 y r=0,63; p=0,006, respectivamente) y con VEe AnnV+ (r=0,76; p=0,0004).

Tabla 1. Características del paciente en el nivel inicial

c r ICC valor de p ICAD valor de p valor de p (N=30) (N=30) C T frente (N=34) C T frente ICC frente a ICC a IC C a ICAD

D em ografía

Género masculino 22(73%) 23 (77%) 0.77 22 (65%) 0.46 0.30 Edad(años) 65*1$ 69*12 0.33 73*17 0.03 0.17

Factores de riesgo

Hipertensión 18(60%) 16 (53%) 060 27(79%) 009 0.03 Diabetes 8(27%) 5(17%) 0.34 15(44%) 0.1S 0.02 Tabaquismo 8(27%) 12(40%) 0.27 7(21%) 0.S7 0.09

A ntecedentes previos

Cardiopatía valvular 4(13%) 4(13%) 1.00 8(24%) 0.35 0.3S Cardiopatía isquémica 14(47%) 18(60%) 0.30 13(38%) OSO 0.08 Desfibrilador cardiaco ¡mplantable 0(0%) 14 (47%) < 0.0001 3(9%) 0.10 0.0006 Terapia de resincronización cardiaca #(&%) 3 (10 % ) 0.24 4 (12% ) 0J2 1.0

Nefropatía crónica 3 (10% ) 3 (10% ) LOO 9 (27% ) 011 0.12

M edicam entos concom itantes

Bloqueantes (3 17(57% ) 25 (83%) 0.009 27(79%) 0.07 0.29

Inhibidores de ACE 17(57% ) 26 (87% ) 0.003 29 (85% ) 0.02 0M

Diuréticos 3(10% ) 17 (57% ) <00001 32 (94% ) < 0.0001 &00I

Estatinas 17(57% ) 23 (77% ) 0052 _{2 2} (65% ) 0.62 0.13

Aspirina 22(73% ) 24 (83% ) OJS 24 (71% ) 0.64 0.16

Clopidogrel 7(23%) ^{5 ( 17 % )} 056 130BN) 0.23 0.08

Ecocardiografía

VDFVI (mi) 91*9 146*3 oo tm 132451 0.02 0.07

VSFVI (mi) m w 102436 0002 82±39 0.07 0.10

PAP (mmHg) 3 » 44 * 7 <0.0061 45410 <00001 0.76

Biología en e l m om ento de l ingreso

BNP (ng/l) Mifctíl 345*1015 <00001 14324146$ <0.0001 < 0.0001 Creatinina (mg/l)

10.9±0 5 0.21 11261.0 050 019 GFR (ml/min/1.73m2) ^{® ± ! 4} 57*12 0.0002 55*19 0.002 050 Glucemia (g/l) 1.0tCL2 1.140 3 034 1 M 4 003 029 CRP (mg/l) 3.462$ 7 ,2 * 65 028 14.9*10.6 <ooou <0.0001 ASAT (Ul/I) 19*3 22620 00004 36434 0.24 0.0Q2 ALAT (Ul/I) 17*3 _{1 9 * 1 3} 043 38*63 0 .» 0M

Fibrinógeno (g/l) 27 ± 0.7 2.5*0,8 0.42 2.9±1.1 0.38 0.15 Recuento de leucocitos (103/mm3) €.4*1.9 6,4*1.6 0.52 6J& 22 OM 0.44 Recuento de plaquetas (103/mm3) 213*107 1926107 0.57 201681 É J 2 0.86 Los resultados son la media±DE o frecuencia (porcentaje). ACE indica enzima convertidora de angiotensina; VDFVI: volumen diastólico final del ventrículo izquierdo; VSFVI: volumen sistólico final del ventrículo izquierdo; FEVI: fracción de expulsión del ventrículo izquierdo; PAP: presiones arteriales pulmonares; BNP: péptido natriurético tipo B; GFR: tasa de filtración glomerular; CRP: proteína C reactiva; ASAT: aspartato aminotransferasa; ALAT: alanina aminotransferasa.

Tabla 2. Parámetros de generación de trombina y marcadores circulantes de activación endotelial

CT ICC valor de p Ingreso valor de p valor de p Alta por ICAD tras valor de p por ICAD ICAD alta

CT frente CT frente a ICC frente a ICAD a ICC ingreso ingreso ingreso-altapor ICAD por ICAD tras alta*

M 30 30 32 27 13 ^{EIPCiAloan) 9iifclfi2} 1147*760 ^{0.007 1293*463 o .m 025 1375*451 11004398 0053} _{Periodo de latericia (m in) 17.1*7.3} 12.7*41 002 13.6*6.4 0.054 030 13.7*3.6 15.4*42 033 ^{Pico de trom bina (nM )} 81*44 lQCttói 0,44 _100*58 ^BJS 072 11.2*53 ₆₈₄₃₈ o m ^{Tiempo hasta el pico (min) 27 7*12 9} 21.7*82 ^{007 21.4*8,4 0 m 097} 21.3*6.0 ^{26 7 *8.0 003} _{V elo cidad (n M /m in )} 162-*lS ^Z 1?.'MS 1 ^{o m 16.9*14.4} _{0.42 061} ^18.6*12.0 7,946.6 ⁰⁰² C I50-APC (nM ) 6 S-J-.3.2 8.5*30 _{O H} 14.3*13.7 ^{0,008 0.23} 9.8*525 ^{8.044.0 o n E TP x C I50-APC} 6956*3862 1017.1*6231 _0.058 ^{18460*19555 0,0862 006 13891*9917 8051*4848 0 03} P lasm a lib re de p laq u e ta s (PFP)

M 29 30 21 29 13 ETF(nM.min) 8061331 932*385 028 1150*412 o .m 008 11794427 900*510 003

^{Periodo de latericia (m in) 10 .M 4} 8.4*36 0.16 3 .9 * 0 6.0061 « a « a 4.7±1.2 5.042.0 & m

_{TFP I lib re (n g /m l)} 10,9*2,5 ¹¹ 9*2 ⁸ ₀₁₆ 13.9*4.1 _{0.002 §.ms} ^12.8*3.3 12.3*2.4 ₀₆₂ ^{R azón FV III/V W F 0.46 *626} 065*021 ^{0.001 046 *025} m i ^{0.002 0.32*0.14 0.42*0.16} 048 V esículas ex tracelu lares derivadas d e l endo te lio

N 30 22 31 33 13

^{A n n W r T (V E /p l)} _{57*44 85*76 03 6 258*321 0.003 0.045} 1115*116 _{61*49 OI2} ^{w a t " (v e / u I) 87*54} _104*92 ^{099 128*153 072 om} 122*122 ^{98 *76 048 EPCRVTF* (V E /p l) 69 *54 55*44} ₀₃₄ 116*151 _{024 007} 107*114 ^64*33 ₀₂₇ Los valores son las medias±DE. ETP indica el potencial de trombina endógena en ausencia de proteína C activada (APC); CI⁵⁰-APC, la concentración de a Pc necesaria para reducir el ETP en un 50%; EPCR, receptor endotelial de la proteína C; TM, trombomodulina; VWF, factor de Von Willebrand; FVIII, factor VIII de coagulación; TFPI, inhibidor de la ruta del factor tisular; VE, vesículas extracelulares, AnnV, anexina V; TF, factor tisular. * Prueba de Friedman para las variables cuantitativas a lo largo del periodo de seguimiento.

Bibliografía

A lo largo de esta solicitud, diversas referencias describen el estado de la técnica al que pertenece esta invención.

1. Kociol RD, Hammill BG, Fonarow GC, Klaskala W, Mills RM, Hernandez AF, Curtís LH. Generalizability and longitudinal outcomes of a national heart failure clinical registry: Comparison of Acute Decompensated Heart Failure National Registry (ADHERE) and non-ADHERE Medicare beneficiaries. Am Heart J. 2010; 160: 885-92. S0002-8703(10)00661-7 [pii] 10.1016/j.ahj.2010.07.020.

2. Giamouzis G, Kalogeropoulos A, Georgiopoulou V, Laskar S, Smith AL, Dunbar S, Triposkiadis F, Butler J. Hospitalization epidemic in patients with heart failure: risk factors, risk prediction, knowledge gaps, and future directions. J Card Fail. 2011; 17: 54-75. S1071-9164(10)01089-4 [pii] 10.1016/j.cardfail.2010.08.010.

3. Gurbel PA, Tantry US. Antiplatelet and anticoagulant agents in heart failure: current status and future perspectives. JACC Heart Fail. 2014; 2: 1-14. S2213-1779(13)00410-1 [pii] 10.1016/j.jchf.2013.07.007.

4. Gheorghiade M, Vaduganathan M, Fonarow GC, Greene SJ, Greenberg BH, Liu PP, Massie BM, Mehra MR, Metra M, Zannad F, Cleland JG, van Veldhuisen DJ, Shah AN, Butler J. Anticoagulation in heart failure: current status and future direction. Heart Fail Rev. 2013; 18: 797-813. 10.1007/s10741-012-9343-x.

5. Zannad F, Stough WG, Regnault V, Gheorghiade M, Deliargyris E, Gibson CM, Agewall S, Berkowitz SD, Burton P, Calvo G, Goldstein S, Verheugt FW, Koglin J, O'Connor CM. Is thrombosis a contributor to heart failure pathophysiology? Possible mechanisms, therapeutic opportunities, and clinical investigation challenges. Int J Cardiol. 2013; 167: 1772-82. S0167-5273(12)01647-6 [pii] 10.1016/j.ijcard.2012.12.018.

6. Zannad F, Greenberg B, Cleland JG, Gheorghiade M, van Veldhuisen DJ, Mehra MR, Anker SD, Byra WM, Fu M, Mills RM. Rationale and design of a randomized, double-blind, event-driven, multicentre study comparing the efficacy and safety of oral rivaroxaban with placebo for reducing the risk of death, myocardial infarction or stroke in subjects with heart failure and significant coronary artery disease following an exacerbation of heart failure: the COMMANDER HF trial. Eur J Heart Fail. 2015; 17: 735-42. 10.1002/ejhf.266.

7. Schoner A, Tyrrell C, Wu M, Gelow JM, Hayes AA, Lindner JR, Thornburg KL, Hasan W. Endocardial Endothelial Dysfunction Progressively Disrupts Initially Anti then Pro-Thrombotic Pathways in Heart Failure Mice. PLoS One. 2015; 10: e0142940. 10.1371/journal.pone.0142940PONE-D-15-35329 [pii].

8. Nozaki T, Sugiyama S, Sugamura K, Ohba K, Matsuzawa Y, Konishi M, Matsubara J, Akiyama E, Sumida H, Matsui K, Jinnouchi H, Ogawa H. Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure. Eur J Heart Fail. 2010; 12: 1223-8. hfq145 [pii] 10.1093/eurjhf/hfq145.

9. Martinod K, Wagner DD. Thrombosis: tangled up in NETs. Blood, 2014; 123: 2768-76.

10. Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, Regnault V, de Smedt E, Wagenvoord R, Lecompte T, Beguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma. Pathophysio1Haemost Thromb.

2003; 33: 4-15.

11. Regnault V, Beguin S, Wahl D, de Maistre E, Coenraad Hemker H, Lecompte T. Thrombinography shows acquired resistance to activated protein C in patients with lupus anticoagulants. Thromb Haemost. 2003; 89: 208­ 12.

12. Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Kasthuri RS, Key NS, Dignat-George F. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 2010; 8: 2571-4.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Método para identificar si un paciente con insuficiencia cardiaca aguda descompensada (ICAD) presenta un estado hipercoagulable, que comprende i) determinar la capacidad de generación de trombina a partir de una muestra de sangre que se ha obtenido del paciente, ii) determinar el nivel de al menos un biomarcador soluble de disfunción endotelial, iii) comparar la capacidad determinada en la etapa i) y el nivel determinado en la etapa ii) con sus valores de referencia predeterminados respectivos y iv) concluir que el paciente presenta un estado hipercoagulable cuando tanto la capacidad de generación de trombina como el nivel del marcador soluble de disfunción endotelial son superiores a sus valores de referencia predeterminados respectivos, en el que:

- la capacidad de generación de trombina se determina mediante un ensayo de trombograma automatizado calibrado (CAT), y

- el al menos un biomarcador soluble de disfunción endotelial se selecciona del grupo que consiste en factor de Von Willebrand, factor VIII, receptor endotelial de la proteína C, inhibidor de la ruta del factor tisular, vesículas extracelulares derivadas del endotelio y complejos ADN-histona circulantes.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre es una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP) o una muestra de plasma desplaquetado.

3. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar el potencial de trombina endógena (ETP) en la muestra de sangre obtenida del paciente y comparar dicho valor con un valor de referencia predeterminado.

4. Método según la reivindicación 1, en el que se añade proteína C activada (APC) a la muestra de sangre y de ese modo se determina la concentración de APC que inhibe la generación de trombina en un 50% y se compara con un valor de referencia predeterminado.

5. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar el nivel de un marcador soluble poniendo en contacto la muestra de sangre obtenida del paciente con una pareja de unión específica para dicho marcador.

6. Método según la reivindicación 1, que comprende determinar el nivel de vesículas extracelulares endoteliales TF+ y/o AnnV+.