ES2906879T3 - Molécula nueva con actividad anticancerígena - Google Patents

Abstract

Un compuesto que tiene la fórmula (I): **(Ver fórmula)** como una mezcla racémica, o diastereoisómero de la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Molécula nueva con actividad anticancerígena

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una nueva molécula extraída de algas marinas, y esta molécula para uso en la inhibición del crecimiento de células cancerosas.

Antecedentes de la invención

El cáncer es una enfermedad que pone en grave peligro la salud de los seres humanos. Alrededor del mundo, alrededor de 6 millones de personas mueren de cáncer cada año, con otros 10 millones gravemente afectados por la enfermedad. De acuerdo con la estimación de la Organización Mundial de la Salud, en el siglo XXI, el cáncer se convertirá en el "asesino número uno" de la humanidad.

En las últimas décadas, estaban disponibles muchas formas de tratar el cáncer, incluyendo principalmente cirugía, radioterapia, quimioterapia, hormonoterapia, terapia génica e inmunoterapia, entre las cuales la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia se han convertido en los principales medios. La quimioterapia se refiere al tratamiento del cáncer con medicamentos químicos. Es el campo de más rápida expansión en el tratamiento del cáncer. Un gran número de nuevos medicamentos dirigidos a diferentes dianas están listos para su aplicación clínica, y los avances en la investigación del mecanismo de acción de los fármacos y la farmacocinética han hecho que las vías de administración clínica y los medios sean más adecuados para matar las células tumorales y proteger los tejidos normales.

La búsqueda de moléculas derivadas de la naturaleza para inhibir las células cancerosas ha conducido al descubrimiento de moléculas como Taxol o Vinblastina. A pesar de la utilidad de los alcaloides taxus y vinca en la clínica, existen serias limitaciones para estas terapias.

Un gran inconveniente a la hora de tratar el cáncer es conseguir selectividad frente a este tipo de células cancerosas. Sigue existiendo la necesidad de descubrir y aislar nuevos compuestos potentes que tengan actividad selectiva contra ciertos tipos de células cancerosas, proporcionando así moléculas anticancerígenas altamente selectivas.

En este contexto, son muy deseables nuevas moléculas para añadir a la armada ya existente de fármacos quimioterapéuticos. Kim SK; Thomas NV; Li X, Advances in Food and Nutrition Research, vol. 64, 2011, páginas 213­ 224 describe compuestos anticancerígenos de macroalgas marinas.

Sumario de la invención

Un aspecto principal que pretende abordar la presente invención es proporcionar una nueva molécula extraída del alga Chaetomorpha Cannabina (CC). El alcance de la protección es como se define en las reivindicaciones.

La presente memoria descriptiva divulga un extracto enriquecido en un compuesto definido por la fórmula (I):

De acuerdo con un primer aspecto, se proporciona un compuesto definido por la fórmula (I) en forma purificada. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona el compuesto tal como se define en el presente documento para su uso en la inhibición del crecimiento de células cancerosas, in vivo, por ejemplo en un mamífero. La presente memoria descriptiva también describe el uso del compuesto como se define en el presente documento para inhibir el crecimiento de células cancerosas in vitro.

La presente memoria descriptiva describe el uso del extracto o compuesto como se define en el presente documento para la fabricación de una composición para tratar el cáncer en un mamífero.

La presente memoria descriptiva proporciona una composición que comprende el extracto o el compuesto como se define en el presente documento, mezclado con un excipiente fisiológicamente aceptable.

La presente memoria descriptiva proporciona el uso de la composición como se define en el presente documento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

La presente memoria descriptiva proporciona un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas que comprende poner en contacto dicha célula con una concentración inhibidora del crecimiento del extracto, el compuesto o la composición, como se define en el presente documento.

La presente memoria descriptiva proporciona un método para tratar el cáncer en un mamífero que comprende administrar al mamífero una concentración inhibidora del crecimiento de la composición como se define en el presente documento.

La presente memoria descriptiva proporciona un método para aislar un compuesto como se define en este documento que comprende las etapas de:

a) mezclar biomasa del alga Chaetomorpha Cannabina (CC) con un primer disolvente para obtener una mezcla biomasa:disolvente;

b) eluir dicha mezcla en columna de SPE con varias concentraciones de un segundo disolvente y recuperar una fracción de disolvente;

c) el fraccionamiento de dicha fracción de metanol de la etapa b) en una columna CombiFlash con varias concentraciones de un tercer disolvente, y recuperación de una fracción que contiene el compuesto de fórmula (I), y opcionalmente, enriquecimiento o purificación de dicho compuesto a partir de dicha fracción.

Descripción detallada de la invención

Descripción de las Figuras

Figura 1. Fotografía de una muestra de alga Chaetomorpha Cannabina (CC) utilizada para la extracción.

Figura 2. Actividad in vitro de diferentes concentraciones de extractos crudos #1 (NC77) sobre la viabilidad de siete líneas celulares.

Figura 3. Estrategia de fraccionamiento y subfraccionamiento del extracto crudo #1 de Chaetomorpha Cannabina (NC77).

Figura 4. Actividad in vitro de las fracciones (F1-F5) del extracto crudo #1 (NC77) sobre la viabilidad de cinco líneas celulares de cáncer.

Figura 5. Cromatograma de GC de FAME preparado a partir de NC77 y la fracción Fr-4 de NC77.

Figura 6. Perfil de RMN 1H para el extracto de NC77.

Figura 7. Perfiles de RMN 1H para la fracción Fr-4 de NC77.

Figura 8. Comparación por HPLC entre dos muestras de NC77-Fr4 de dos fechas de recolección diferentes.

Figura 9. Diagrama de flujo de fraccionamiento, subfraccionamiento y purificación de componentes principales de NC77.

Figura 10. Perfil de UPLC-DAD/ELSD/HRMS del compuesto de Fórmula (I).

Figura 11. Espectros HRMS del compuesto de Fórmula (I).

Figuras 12. Espectro de RMN 1H del compuesto de Fórmula (I).

Figura 13. Espectro de COSY del compuesto de Fórmula (I).

Figura 14. Espectro de TOCSY del compuesto de Fórmula (I).

Figura 15. Espectro de HSQC del compuesto de Fórmula (I).

Figura 16. Espectro de HMBC del compuesto de Fórmula (I).

Figura 17. Fragmentos de iones observados en HRMS para el compuesto de Fórmula (I).

Abreviaturas y Definiciones

Abreviaturas

bis-AAF-R110: bis-alanil-alanil-fenilalanil-rodamina 110; CIMA: indicativo colorimétrico de actividad metabólica; GF-AFC: Gly-Phe-7-amino-4-trifluorometilcumarina; HILIC: cromatografía líquida de interacción hidrofílica. SPE C-18: extracción en fase sólida sobre columna C-18.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de tales células y la referencia a "el cultivo" incluye la referencia a uno o más cultivos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. Todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entienden los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención, a menos que se indique claramente lo contrario.

Los términos "aproximadamente" o "alrededor de" como se usan en este documento se refieren a un margen de o -10% del número indicado. En aras de la precisión, el término aproximadamente cuando se usa junto con, por ejemplo: 90% significa 90% /- 9%, es decir, del 81% al 99%. Más precisamente, el término aproximadamente se refiere a o - 5% del número indicado, en el que por ejemplo: 90% significa 90% /- 4,5%, es decir, de 86,5% a 94,5%. Cuando se usa en el contexto de un pH, el término "aproximadamente" significa /- 0,5 unidades de pH.

Como se usa en esta memoria descriptiva y en la reivindicación reivindicaciones, las palabras "que comprende" (y cualquier forma de que comprende, tal como "comprende"), "que tiene" (y cualquier forma de que tiene, tal como " tiene"), "que incluye" (y cualquier forma de que incluye, tal como "que incluye") o "que contiene" (y cualquier forma de que contiene, tal como "contiene") son inclusivas o abiertas y no excluyen elementos o etapas de métodos adicionales no mencionados.

Como se usa en este documento, los términos "enfermedad" y "trastorno" pueden usarse indistintamente o pueden ser diferentes en el sentido de que la enfermedad o condición en particular puede no tener un agente causante conocido (por lo que la etiología aún no se ha resuelto) y por lo tanto, todavía no se reconoce como una enfermedad, sino sólo como una afección o síndrome indeseable, en el que los médicos han identificado un conjunto más o menos específico de síntomas.

El término "sujeto" o "paciente" como se usa en el presente documento se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero, y lo más preferiblemente un ser humano que es el objeto de tratamiento, observación o experimento.

"Mamífero" incluye seres humanos y animales domésticos, tales como animales de laboratorio y mascotas domésticas (por ejemplo, gatos, perros, cerdos, vacas, ovejas, cabras, caballos, conejos), y animales no domésticos, tales como animales silvestres y similares.

El término "extracto" tal como se usa en el presente documento significa una composición preparada poniendo en contacto el disolvente con biomasa de algas marinas, producida siguiendo los procedimientos de la invención, que demuestra actividad inhibidora contra una o más líneas de células cancerosas in vitro. En un aspecto de la invención, un extracto demuestra actividad inhibidora contra el crecimiento de células cancerosas in vivo. Como se usa en el presente documento, el término "extracto" significa un extracto que es: crudo, fraccionado, subfraccionado, separado, aislado, enriquecido o purificado, sin limitarse a los mismos.

El término "aislado" se usa en el presente documento para indicar que el compuesto existe en un medio físico distinto de aquel en el que se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, la molécula aislada puede estar sustancialmente aislada (por ejemplo, enriquecida o purificada) con respecto al medio celular complejo en el que se encuentra de forma natural, tal como en un extracto crudo. Cuando la molécula aislada se enriquece o purifica, el nivel absoluto de pureza no es crítico y los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los niveles apropiados de pureza de acuerdo con el uso que se le va a dar a la biomasa. En algunas circunstancias, la molécula aislada forma parte de una composición (por ejemplo, un extracto más o menos crudo que contiene muchas otras sustancias) o sistema tampón, que puede contener, por ejemplo, otros componentes. En otras circunstancias, la molécula aislada se puede purificar hasta la homogeneidad esencial, por ejemplo, determinada espectrofotométricamente, por RMN o por cromatografía (por ejemplo, LC-MS).

El término "crudo" significa compuestos o moléculas que no se han separado por completo de los componentes de la composición original en la que estaba presente. Por lo tanto, los términos "separar", "purificar" o "aislar" se refieren a métodos mediante los cuales uno o más componentes contaminantes (es decir, no relevantes) de la muestra biológica se eliminan de uno o más componentes deseados de la muestra.

La molécula o moléculas descritas en el presente documento pueden formularse como composiciones farmacéuticas mediante formulación con aditivos tales como excipientes, portadores farmacéuticamente aceptables y vehículos farmacéuticamente aceptables, o como formulaciones nutracéuticas o nutricionales con aditivos tales como excipientes nutracéutica o nutricionalmente aceptables, portadores nutracéutica o nutricionalmente aceptables y vehículos nutracéutica o nutricionalmente aceptables.

Como se usa en el presente documento, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que son fisiológicamente tolerables y normalmente no producen una reacción alérgica o similar no deseada, tal como molestias gástricas, mareos y similares, cuando se administran a seres humanos. Preferiblemente, como se usa en este documento, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por la agencia reguladora del gobierno federal o estatal o enumerado en la Farmacopea de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para uso en animales, y más particularmente en humanos.

El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se pueden administrar los compuestos de la presente invención. Se pueden emplear como vehículo agua estéril o soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin.

La molécula o moléculas y la composición o composiciones de la presente invención se pueden preparar como formulaciones nutricionales tales como alimentos, incluidos alimentos médicos o funcionales y suplementos dietéticos. Un "alimento médico o funcional" se define como el que se consume como parte de una dieta habitual pero que se ha demostrado que tiene beneficios fisiológicos y/o reduce el riesgo de una enfermedad o afección, tal como una enfermedad crónica, más allá de las funciones nutricionales básicas. Un "suplemento dietético" se define como un producto destinado a complementar la dieta humana y normalmente se proporciona en forma de píldora, cápsula, comprimido o formulación similar. A modo de ejemplo, pero no de limitación, un suplemento dietético puede incluir uno o más de los siguientes ingredientes: vitaminas, minerales, hierbas, productos botánicos, aminoácidos, sustancias dietéticas destinadas a complementar la dieta aumentando la ingesta dietética total y concentrados, metabolitos, constituyentes, extractos o combinaciones de cualquiera de los anteriores. Los suplementos dietéticos también pueden incorporarse a los productos alimenticios, tales como los alimentos funcionales diseñados para promover la salud o para prevenir enfermedades o trastornos. Si se administra como una preparación medicinal, la composición se puede administrar, ya sea como profilaxis o como tratamiento, a un paciente en cualquiera de varios métodos. Las composiciones en cuestión se pueden administrar solas o en combinación con otros agentes farmacéuticos y se pueden combinar con un portador fisiológicamente aceptable de las mismas. La cantidad eficaz y el método de administración y el objetivo de la formulación particular pueden variar en función del sujeto individual, el estadio de la enfermedad o afección y otros factores evidentes para un experto en la técnica. En el caso de una formulación farmacéutica así como una formulación nutracéutica, durante el curso del tratamiento, la concentración de las composiciones en cuestión se puede monitorear (por ejemplo, se pueden monitorear los niveles en plasma sanguíneo) para asegurar que se mantenga el nivel deseado.

El término "nutracéutico" se ha utilizado para referirse a cualquier sustancia que sea un alimento o una parte de un alimento y proporcione beneficios médicos o para la salud, incluida la prevención y el tratamiento de enfermedades o afecciones. Por lo tanto, un nutracéutico es un producto aislado o purificado de los alimentos que generalmente se vende en formas medicinales que no suelen asociarse con los alimentos. Se ha demostrado que un nutracéutico tiene un beneficio fisiológico o brinda protección contra enfermedades crónicas. Por lo tanto, las composiciones que caen bajo la etiqueta "nutracéuticos" pueden variar desde nutrientes aislados, suplementos dietéticos y dietas específicas hasta alimentos diseñados genéticamente, productos herbales y alimentos procesados tales como cereales, sopas y bebidas. En un sentido más técnico, el término se ha utilizado para referirse a un producto aislado o purificado de los alimentos, y generalmente vendido en formas medicinales que normalmente no se asocian con los alimentos y que ha demostrado tener un beneficio fisiológico o brindar protección contra enfermedades crónicas. Los excipientes nutracéuticamente aceptables adecuados pueden incluir soluciones líquidas tales como una solución que comprende un aceite derivado de un vegetal y/o animal y/o pescado.

Los términos "molécula" y "compuesto" se usan en este documento de manera intercambiable.

Descripción detallada de aspectos particulares de la invención

Con el objetivo de proporcionar una fuente alternativa de moléculas anticancerígenas, se proporciona un compuesto anticancerígeno extraído y aislado de un extracto disolvente de Chaetomorpha Cannabina (CC).

Extracto

De acuerdo con una realización particular de la presente invención, la molécula bioactiva de las algas enumeradas anteriormente se encuentra en una fracción de MeOH al 100% y se define por la fórmula:

Molécula activa del extracto

De acuerdo con una realización particular, la invención proporciona un compuesto como el definido por la fórmula (I):

como una mezcla racémica o enantiómero de la misma.

Composición

En la divulgación, se proporciona una composición que comprende el compuesto como se define en el presente documento, mezclado con un excipiente fisiológicamente aceptable.

Usos y métodos de uso.

De acuerdo con una realización alternativa, la presente invención proporciona el compuesto como se define en el presente documento para su uso en la inhibición del crecimiento de células cancerosas. Particularmente, se proporciona el uso del compuesto como se define en el presente documento para la fabricación de una composición para usar en el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero.

En la divulgación, se proporciona el uso de la composición como se define en el presente documento para el tratamiento del cáncer en un mamífero.

Más particularmente, el mamífero es un animal de compañía o un ser humano.

Método de extracción y aislamiento

En la divulgación, se proporciona un método para extraer el compuesto como se define en el presente documento, que comprende las etapas de:

a) mezclar biomasa procedente del alga Chaetomorpha Cannabina (CC) con un primer disolvente para obtener una mezcla biomasa:primer disolvente;

b) eluir dicha mezcla en una columna de SPE con varias concentraciones de un segundo disolvente y recuperar una segunda fracción de disolvente;

c) fraccionar dicha fracción de metanol de la etapa b) en una columna CombiFlash con varias concentraciones de una tercera mezcla de disolventes, y recuperación de una fracción que contiene los componentes principales.

De acuerdo con una realización alternativa, el método comprende además una etapa de desengrasado con hexano antes de la etapa a).

De acuerdo con una realización particular, el método comprende además la etapa de: d) subfraccionar dicha fracción en una columna de HPLC semipreparativa con una cuarta mezcla de disolventes para obtener una subfracción enriquecida en el compuesto (I).

De acuerdo con una realización opcional, el método comprende además la etapa de: d1) enriquecer o purificar un compuesto de Fórmula (I) a partir de dicha subfracción:

De acuerdo con una realización alternativa, el método comprende además la etapa de: e) secar dicha subfracción mediante la eliminación del disolvente para obtener un extracto seco enriquecido en un compuesto de Fórmula (I):

Disolvente para extracción

En particular, la molécula se extrae con un primer disolvente. Más particularmente, el primer disolvente del extracto es agua o alcohol; y aún más particularmente: etanol acuoso.

En particular, el extracto crudo es un extracto etanólico acuoso de CC. Más particularmente, el extracto crudo es un: extracto etanólico acuoso al 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%. Incluso más particularmente, el extracto crudo es un extracto de etanol acuoso al 80%. Más particularmente, el extracto crudo es un extracto previamente desengrasado con hexano.

En particular, el segundo disolvente es metanol, metanol acuoso o una mezcla de metanol y acetonitrilo. Más particularmente, el extracto es una fracción del segundo disolvente C-18 del extracto crudo: particularmente un 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de un segundo disolvente, siendo particularmente: MeOH acuoso, o MeOH al 100%, o CH²Ch:MeOH (1:1). Más particularmente, la fracción es una fracción de MeOH acuoso al 30% a MeOH al 100%.

En particular, el tercer disolvente es metanol o metanol acuoso. Más particularmente, el extracto es una subfracción de columna ultrarrápida de la fracción C-18. Particularmente, la subfracción es una subfracción de MeOH de aproximadamente 40%.

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo fabricar y utilizar la presente invención, y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención ni pretenden representar que los experimentos a continuación son todos o los únicos experimentos realizados. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana a ella.

Ejemplos - Actividad anticancerígena del compuesto (I) purificado a partir de algas marinas recolectadas en Terranova y Labrador

Ejemplo 1 - Recolección e identificación de algas marinas

Se estableció un programa de recolección de algas marinas para diferentes regiones geográficas de Terranova, Labrador y Quebec durante varios períodos de tiempo.

El procedimiento general de recolección fue el siguiente: las algas marinas se recogieron de la zona intermareal a mano con cuchillos, mientras que los buzos recogieron las algas marinas de las zonas submareales. Las muestras se colocaron en bolsas plásticas de muestreo y se transportaron al laboratorio en hieleras de agua de mar. A su llegada al laboratorio, cada especie fue lavada individualmente para eliminar epífitas y materias extrañas (arena, mejillones, isópodos, etc.). Luego, las muestras se revisaron visualmente para asegurarse de que estuvieran limpias. Si no, la materia restante se eliminó a mano con un lavado adicional. Las algas se secaron con papel secante, se pesaron con precisión de g (peso húmedo de la planta) y se trituraron. La biomasa triturada se transfirió a matraces Erlenmeyer y se congeló a -60 °C hasta que se prepararon los extractos.

También se fotografió una muestra representativa de diferentes muestras de Chaetomorpha cannabina (véase la Figura 1) y se congeló a -20°C para confirmar la especie por parte del Dr. Robert Hooper, un ficólogo del Memorial University de Terranova.

Ejemplo 2. Preparación del extracto

2.1 Secado por congelación

Para preparar las muestras para la extracción, primero se seco por congelación el alga marina. Se colocaron matraces Erlenmeyer que contenían algas trituradas, que se habían congelado a -60 °C, en un secador por congelación y se liofilizaron durante 72-96 h a 69 x 10'3 mbar. Luego se registró el peso (g) de biomasa seca como peso seco de la planta (g). Esta etapa explica las diferencias en el contenido de agua entre las algas marinas que, de lo contrario, podrían afectar la solubilidad de los componentes bioactivos. Los metabolitos secundarios de las plantas también son más estables cuando se almacenan en forma seca. Además, la extracción a gran escala de biomasa vegetal seca puede causar menos problemas que la extracción de biomasa fresca. Para preservar los compuestos termolábiles, se utilizan condiciones de baja temperatura durante todo el proceso de extracción.

2.2 Desgrasado de muestras

Se sabe que la fracción lipídica de las algas marinas varía del 1 al 5% de la materia seca de las algas, que puede estar dominada por ácidos grasos poliinsaturados. Las algas marrones y rojas son particularmente ricas en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga tales como el ácido eicosapentaenoico (n3, C20:5), mientras que las algas verdes pueden poseer un nivel de ácido alfa linoleico (n3, C18:3). Dado que estos ácidos grasos poliinsaturados son extremadamente susceptibles a la oxidación, pueden generar productos de oxidación de lípidos durante el análisis. Para eliminar los procesos oxidativos anteriores que pueden tener un efecto en los resultados, las muestras se desengrasaron antes de la extracción de los compuestos.

Las muestras de algas liofilizadas se trituraron hasta obtener un polvo y se desengrasaron mezclando el polvo con hexano (1:5, p/v, 5 min) en un mezclador Waring a temperatura ambiente. Las muestras desgrasadas se secaron al aire, se empacaron al vacío en bolsas de polietileno y se mantuvieron a -20 °C hasta su extracción.

2.3 Extracción del producto crudo

Se pueden utilizar diferentes disolventes o sistemas de disolventes para la extracción de compuestos. En general, el etanol se usa comúnmente debido a su menor toxicidad en comparación con otros disolventes. Además, se ha demostrado en muchos estudios que los extractos de etanol tienen la mayor actividad antioxidante.

Los compuestos se extrajeron en etanol acuoso al 80% a 4 °C durante 24 h. Luego se eliminó el disolvente al vacío a 37 °C durante 45 a 60 min y las suspensiones concentradas resultantes se liofilizaron durante 72 a 96 h a -80 °C y 69 x 10'3 mbar utilizando un secador por congelación. Se pesaron los extractos secos (peso seco del extracto en g) y se almacenaron a -60 °C hasta la preparación para el cribado.

Los rendimientos de extracción se calcularon y expresaron como g de extracto seco por g de algas marinas secas de acuerdo con la Tabla 1.

Tabla 1: Rendimientos de extracción

Ejemplo 3. Cribado anticancerígeno de extractos crudos de algas marinas

3.1 Purificación mediante fraccionamiento guiado por bioensayo

Inicialmente, se evaluó la actividad anticancerígena de los extractos de algas marinas en modelos in vitro a través del ensayo CIMA. A partir de estos resultados, se seleccionaron los extractos que exhibían el mayor potencial anticancerígeno para su purificación mediante fraccionamiento guiado por bioensayo.

3.2 Preparación de compuestos

Se prepararon soluciones patrón de los extractos en dimetilsulfóxido (DMSO) a razón de 10 mg/ml y se almacenaron en alícuotas de 200 j l a -2o °C hasta el análisis. Esta preparación aseguró que el DMSO suministrado a las células en cultivo nunca excediera el 1%.

3.3 Ensayo CIMA

Los extractos preparados se evaluaron siguiendo condiciones de exposición crónica en las que las células se sembraron a razón de 2 x 103 células/pocillo (placa de 96 pocillos) y se incubaron con compuestos de ensayo durante 72 h. Cada compuesto se evaluó en un intervalo de concentraciones (0, 10, 25, 50 o 100 jg/ml). La proliferación celular se evaluó inicialmente utilizando un indicador colorimétrico estándar de ensayo de actividad metabólica (CIMA). En este ensayo, la reducción de tetrazol se evaluó como una medida de la función metabólica que evalúa la actividad mitocondrial para determinar el grado de proliferación celular dentro de un cultivo. Este ensayo se basa en la reducción de la sal amarilla de tetrazolio a formazán púrpura por la enzima reductasa mitocondrial en células viables, lo que da como resultado un cambio de color que confiere un cambio en la absorbancia. Se seleccionaron seis líneas celulares humanas para la evaluación primaria: U373 (glioblastoma-astrocitoma), A549 (carcinoma de pulmón), THP-1 (leucemia monocítica aguda), MCF7 (adenocarcinoma de glándula mamaria), SKOV3 (adenocarcinoma de ovario) y CCD1079SK (fibroblasto, no canceroso pero proliferante) (véase la Figura 2 y la Tabla 2). La Tabla 3 expresa la ¹C⁵⁰ para cada extracto.

De los resultados presentados en la Tabla 2, se seleccionó el extracto #1 (NC77) para fraccionamiento adicional y se evaluó de la misma manera.

Tabla 2. Cribado in vitro de las fracciones #1 NC77 #2 NC107.

Tabla 3. Cálculos de IC ara los extractos crudos de NC77 NC 107

3.4 Fraccionamiento

El extracto crudo #1 se fraccionó en cinco fracciones mediante separación en columna de SPE C-18 usando 15 ml de cada uno de metanol al 5% (fracción 1), metanol al 25% (fracción 2), metanol al 50% (fracción 3), metanol al 100% (fracción 4) y metanol:diclorometano (1:1) (fracción 5). Los extractos se fraccionaron y las fracciones resultantes se evaluaron utilizando el ensayo CIMA. El fraccionamiento guiado por bioensayo proporcionó información detallada sobre el compuesto o compuestos responsables de la bioactividad específica.

Las siguientes cantidades se obtuvieron a partir de la estrategia descrita en la Figura 3 y se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Cantidades obtenidas ara cada fracción de NC77

3.4.1 Resultados de fracciones

Las fracciones resultantes se evaluaron utilizando el ensayo CIMA. El fraccionamiento guiado por bioensayo proporcionó información detallada sobre el compuesto o compuestos responsables de la bioactividad específica (Tabla 5). La Tabla 6 indica la IC⁵⁰ de cada fracción.

También se muestra en la Figura 4, que la actividad estaba en las fracciones 3 y 4. Considerando los rendimientos obtenidos para cada fracción, los resultados del fraccionamiento indicaron claramente que la actividad anticancerígena estaba distribuida en F4 y se estableció la prioridad para la selección del extracto #1 (fracción 4). La fracción 4 (0,34 g) de NC77 se sometió así a un subfraccionamiento adicional como se presenta a continuación.

Tabla 5. Identificación de fracciones activas del extracto #1

Tabla 6. Cálculos de IC ara fracciones de NC77

Ejemplo 4. Subfraccionamiento de la Fracción 4 del extracto #1 (NC77)

La fracción 4 se seleccionó para un subfraccionamiento adicional basándose en los resultados del bioensayo (Tabla 5). Por lo tanto, en una segunda etapa, se disolvió NC77-F4 en diclorometano/metanol y se mezcló con Celite y se secó por evaporación rotatoria. La muestra se cargó en una columna de gel de sílice GOLD de alto rendimiento Teledyne ISCo de 24 g y se eluyó con diclorometano/metanol en CombiFlash® Rf, Teledyne ISCO. El subfraccionamiento se realizó como un gradiente del Disolvente A (CH²Ch) y Disolvente B (metanol: agua 1:1) de la siguiente manera: 0% B para 2 CV (volumen de columna) luego hasta 40% B para 17 CV, hasta 100% B para 4 CV para una elución total en 23 CV.

Las fracciones se monitorearon por TLC y algunas se combinaron y secaron usando Rotavap y Genevac para producir cinco (5) subfracciones como se presenta en la Tabla 7.

Tabla 7. Rendimientos del subfraccionamiento de NC77-F4

Estas subfracciones se sometieron de nuevo a la evaluación del bioensayo presentado anteriormente. Los resultados se expresan en la Tabla 8 como % de viabilidad (media ± desviación estándar de tres repeticiones), con valores de LD⁵⁰/IC⁵⁰ en la Tabla 9. Los resultados más activos están sombreados en gris con los análisis estadísticos indicados. La concentración máxima de DMSO fue del 1% a razón de 100 jg/m l con SDS del 5% utilizado como un inductor tóxico conocido.

Los resultados indicaron claramente que la actividad anticancerígena se distribuyó en las subfracciones F3 y F4 de la fracción 4 de NC77.

Tabla 8. Resultados del cribado in vitro, subfracciones de la fracción 4 de NC77

Tabla 9. Cálculos de LD⁵⁰ de las subfracciones de NC77-F4 /ml

Ejemplo 5. Caracterización de un componente principal de NC77 y NC77-F4

5.1. Preparación y análisis de muestras:

Preparación de FAME y análisis por GC-MS

El extracto #1 (NC77) y su fracción 4 (NC77-Fr. 4) se analizaron por GC-MS. A las muestras se les añadió 1 ml de solución de metóxido de sodio y 1 ml de hexano, con la tapa cerrada. Los viales de reacción se pusieron en un bloque de calentamiento (80 °C) durante 15 min agitando los viales con la mano a intervalos de 5 min. Se agregó 1 ml de solución saturada de NaCl después de enfriar a temperatura ambiente y se agitó a mano varias veces. A continuación, los viales de reacción se centrifugaron durante 20 min a 2.000 rpm. Las soluciones superiores se transfirieron a viales de GC. Para el análisis de GC-MS, se utilizó un Agilent 6890 con detector selectivo de masas 5973. La columna era Agilent DB-23 (59 m x 0,25 mm, 0,15 pm), volumen de inyección de 1 pl. Programa del horno: 50 °C durante 1 min, 25 °C/min a 170 °C, 2,75 °C/min a 215 °C (mantener 12 min), 40 °C/min a 230 °C (mantener 3,11 min). El tiempo de proceso total fue de 37,65 min. La temperatura del FID fue de 280 °C, el flujo de hidrógeno fue de 40 ml/min, el flujo de aire fue de 400 ml/min, el flujo de aporte de N² fue de 20 ml/min. La relación de división fue de 2:1. El gas portador fue helio y se mantuvo a presión constante (30 psi). El modo de ionización del MSD fue EI, temperatura de interfaz 250 °C, fuente de MS 230 °C, Cuadrupolo de MS 150 °C. El intervalo de masas fue de 50-600 m/z.

Análisis de HPLC-DAD para comparar diferentes lotes

La separación se realizó en una columna Agilent Zorbax SB-C18 (2,1 x 30 mm, 3,5 |jm) utilizando un HPLC Agilent 1100. El disolvente A era formiato de amonio 10 mM (pH 3,2) y el disolvente B era 90% de acetonitrilo con 10% de formiato de amonio 100 mM (pH 3,2). El gradiente fue de 30% B hasta 100% B en 12 min y se lavó con acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% durante 2 min. La temperatura de la columna fue de 55 °C. El caudal fue de 0,5 ml/min.

Análisis de carotenoides por HPLC-DAD/MS

El análisis se realizó en el sistema Agilent 1200 utilizando una columna de carotenoide YMC, 0,5 jm (250 x 2 mm) a 32 °C. Fase móvil: disolvente A AmAc/MeOH 50 mM, disolvente B MTBE, con gradiente de 5-65% de B en 40 min. El caudal fue de 0,2 ml/min y el detector de DAD se controló a 450 nm. La identificación de los picos en el cromatograma se realizó sobre la base de la comparación de TR con estándares conocidos: fucoxantina, astaxantina, luteína, zeaxantina, cantaxantina, a y p-caroteno. Todos los estándares se adquirieron a través de Chromadex.

UPLC-DAD/ELSD/HRMS y MS/MS

Se usaron los siguientes instrumentos para la adquisición de datos LC-UV-ELSD-HRMS: bomba Accela 1250 (Thermo Fisher Scientific); Espectrómetro de masas Orbitrap de mesa Exactive (Thermo Fisher) equipado con sonda calentada de ionización por electroaspersión; Ultimate 3000 DAD (Thermo Scientific Dionex) y ELSD 3300 (Alltech). La separación se llevó a cabo en una columna Hypersil C18 (50 x 2,1 mm, Thermo) utilizando una fase móvil compuesta por (A) ácido fórmico al 0,1% y (B) ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo, con un gradiente lineal de 5% B hasta 100% de B en 4,2 min, se mantuvo durante 3,2 min, el caudal fue de 400 jl/min.

El HRMS se adquirió en polaridad positiva o negativa a una resolución de 25.000, cada uno con un barrido de HCD con energía de colisión a 50 eV para todas las fragmentaciones iónicas con una resolución de 10.000. Se usaron las siguientes condiciones óptimas de fuente de iones: el flujo envolvente es 15, el caudal de gas auxiliar es 3; tensión de aspersión de 3 kV (-2,5 kV para la negativa); temperatura del capilar y del calentador de 350 °C y 250 °C, respectivamente.

RMN

Las muestras se reconstituyeron en 100 j l de CDCb y se transfirieron 60 j l de cada muestra a tubos de RMN de 1,7 mm. Todos los espectros se analizaron en un espectrómetro Bruker Avance III de 700 MHz equipado con una sonda de 1,7 mm enfriada criogénicamente que funciona a 16K.

5.2. Análisis de NC77 y NC77-Fr. 4

El trabajo preliminar de creación de perfiles realizado previamente indicó que los lípidos eran los componentes principales en NC77-Fr. 4. Como tal, se realizó un análisis de GC-MS para comprender la composición de ácidos grasos en este extracto y su fracción bioactiva.

La Figura 5 es el cromatograma de GC de FAME preparado a partir del extracto n.° 1 (NC77) y n.° 1-F4 (NC77-Fr. 4). El tiempo de retención y la identificación tentativa basada en la comparación de la base de datos del NIST se presentan en la Tabla 10. Se demostró que el ácido graso principal era el ácido palmítico.

Tabla 10. Identificación de ácidos grasos usando análisis por GC-MS del extracto #1 (NC77) y del extracto #1-F4 (NC77-Fr. 4)

TR (min)______________________________ Compuestos_________________________________________________ 11,32 Tetradecanoato de metilo

13,51 Ácido hexadecanoico, éster metílico

13,87 Ácido 9-hexadecenoico, éster metílico, (Z)-15,49 Desconocido

16,71 Ácido 8-octadecenoico, éster metílico

16,83 Ácido 8-octadecenoico, éster metílico

17,56 Ácido 9,12-octadecadienoico, (Z, Z)-, éster metílico

18,66 1,2-15,16-Diepoxihexadecano

23,47 Eicosa-5,8,11,14,17-pentaenoato de metilo (EPA)

También se compararon los perfiles de RMN y HPLC de dos lotes diferentes de NC77 y NC77-Fr. 4 preparados y probados anteriormente, con nuevas muestras.

Como se muestra en las Figuras 6 y 7, el extracto #1 y su fracción 4 (NC77 y NC77-Fr. 4) preparados en noviembre de 2015 tienen perfiles de RMN 1H similares a los observados en el lote anterior (junio/2015). Los lípidos (ácidos grasos) parecían ser los componentes principales.

La comparación de HPLC se muestra en la Figura 8. Los dos parecían tener perfiles similares de componentes principales.

Ejemplo 6. Fraccionamiento y purificación de componentes principales de NC77-F4-F13

En una segunda serie de experimentos, se fraccionó NC77 como antes y se subfraccionó la fracción 4 pero con un protocolo ligeramente diferente para obtener una mejor separación de compuestos. En resumen, se disolvieron 3,14 g del extracto n.° 1 (NC77) en metanol, mezclado sobre Celite y se secaron usando un evaporador rotatorio. A continuación, la muestra se cargó en una columna de SPE Thermo Scientific acondicionada previamente y equilibrada (HYPERSEP C18 20G). Se obtuvieron cuatro fracciones eluyendo la columna de SPE con metanol al 5% (Fr. 1), metanol al 25% (Fr. 2), metanol al 50% (Fr. 3) y metanol al 100% (Fr. 4).

Con base en el resultado del bioensayo anterior, la fracción 4 (0,34 g) se sometió a un fraccionamiento adicional. La fracción 4 se disolvió en diclorometano/metanol y se mezcló con Celite y se secó. La muestra se cargó en una columna de gel de sílice GOLD de alto rendimiento Teledyne ISCO de 24 g y se eluyó con diclorometano/metanol en CombiFlash® Rf, Teledyne ISCO. El gradiente de disolvente de elución (A y B) fue el siguiente: 0% de B para 2 CV (volumen de columna) luego a 40% de B para 15 CV y se mantuvo en 40% de B para 2 CV, hasta 100% de B para 2 Cv ^{y se mantuvo al 100% de B para 2} Cv. ^{El volumen de elución total fue de 23 CV. A es diclorometano y B es} metanol/diclorometano (1:1). Las fracciones se monitorearon por TLC y algunas se combinaron y secaron usando Rotavap y Genevac.

Con base en el análisis de TLC, la subfracción 13 de Fr. 4 (Fr. 4-13, 0,11 g) se eligió para la purificación posterior ya que mostró que contenía componentes principales. En esta etapa, se utilizó una columna de gel de sílice de 12 g de CombiFlash® Rf. El gradiente de disolvente (A y B) fue: 0% de B para 2 CV luego hasta 100% de B para 25 CV y se ^{mantuvo en 100% de B para 2 CV. La elución total fue de 29} Cv. ^{A es diclorometano y B es metanol al 5% en} diclorometano. De nuevo, las fracciones se combinaron selectivamente de acuerdo con la TLC.

Se purificaron adicionalmente tres subfracciones utilizando HPLC semipreparativa (Agilent). La columna utilizada fue ZORBAX SB-C18 (9,4 x 50 mm, 5 |jm) y la fase móvil fue agua/acetonitrilo. El gradiente de elución varió para diferentes muestras para optimizar la separación. La temperatura de la columna fue de 55 °C y el caudal de 5 ml/min.

Como se muestra en la Figura 9, el fraccionamiento y la purificación descritos anteriormente produjeron 19 muestras para un análisis estructural completo. Entre ellos, la muestra 31-34-5 (3,9 mg) era un compuesto puro.

Ejemplo 7. Estructura del compuesto puro 31-34-5

7.1. Compuesto 31-34-5 (fórmula (I))

Los datos de UPLC-DAD/ELSD/HRMS (Figura 10) revelaron el compuesto 31-34-5 como un compuesto puro. Picos de HRMS (Figura 11) de m/z 335,21950 (modo positivo, observado para C¹sH³²O⁴Na+, calculado 335,21983) y m/z 311,22283 (modo negativo, observado para C¹⁸H³¹O⁴-, calculado 311,22223) confirmaron la fórmula molecular de C¹⁸H³²O⁴.

Los espectros de RMN 1H, COSY, TOCSY y HSQC (Figuras 12-15) mostraron la presencia de 2 metinos olefínicos (55,79 ppm), 3 metinos oxigenados (55,34, 4,09, 3,67 ppm) , 11 metilenos (52,6-1,0 ppm) y 1 grupo metilo terminal (50,87 ppm).

HMBC (Figura 16) reveló las correlaciones clave de C-H que conducen a proponer 12,13-dihidroxi-10-octadecen-9-olide como la estructura para el compuesto 31-34-5 (flechas para correlaciones clave de HMBC):

Se determinó que el doble enlace en C-10,11 estaba en forma trans basándose en el valor J de acoplamiento de los protones olefínicos. Los iones del fragmento de HRMS (Figura 17) también confirmaron la estructura.

Con base en la búsqueda de la estructura en las bases de datos, el compuesto 31-34-5 es un compuesto nuevo. Es un derivado de ácido graso, probablemente formado a través de la esterificación de ácido octadecanoico insaturado y oxigenado o ácido esteárico (18:0). La asignación completa de datos espectrales se enumera en la Tabla 11.

Tabla 11. Datos de RMN del^ com uesto 31-34-5

Ejemplo 8. Actividad anticancerígena in vitro del compuesto de fórmula (I)

La actividad anticancerígena in vitro del compuesto (I) se presenta como la viabilidad celular promedio en la Tabla 12, mientras que la Tabla 13 presenta los mismos datos pero como las veces que cambia la viabilidad ± error estándar.

Tabla 12

Tabla 13

La presente invención ha sido descrita en términos de realizaciones particulares encontradas o propuestas por el presente inventor para comprender modos preferidos para la práctica de la invención. Los expertos en la técnica apreciarán que, a la luz de la presente divulgación, se pueden realizar numerosas modificaciones y cambios en las realizaciones particulares ejemplificadas sin apartarse del alcance previsto de la invención. Todas estas modificaciones están destinadas a ser incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula (I):

como una mezcla racémica, o diastereoisómero de la misma.

2. El compuesto de la reivindicación 1, para uso en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero.

3. El compuesto de la reivindicación 1, incorporado en una formulación para uso oral.

4. El compuesto de la reivindicación 3, en el que dicha formulación oral es una formulación nutracéutica o nutricional.

5. Un polvo, jarabe, cápsula de gel, píldora, cápsula u otro dispositivo para administración oral que comprende una cantidad eficaz anticancerígena del compuesto de la reivindicación 1.

6. Una solución inyectable que comprende el compuesto de la reivindicación 1 y un portador seleccionado del grupo que consiste en agua estéril, soluciones salinas acuosas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol.