ES2905320T3 - Perfil metabolómico de la lesión del sistema nervioso central - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto que comprende: (a) obtener un perfil de metabolitos a partir de una muestra de prueba biológica del sujeto; y (b) usar análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático para comparar el perfil del sujeto con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de mTBI y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin mTBI para determinar si el sujeto tiene mTBI, en el que el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos comprende metabolitos seleccionados de los metabolitos incluidos en las Tablas 2 y 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Perfil metabolómico de la lesión del sistema nervioso central

Campo de la invención

El campo de esta invención se relaciona con la metabolómica y los métodos para diagnosticar lesiones del sistema nervioso central (CNS), incluidas todas las lesiones de la médula espinal del cerebro. Más específicamente, la presente invención se refiere a la metabolómica y los métodos para diagnosticar lesiones cerebrales traumáticas leves, incluidas las lesiones por conmoción cerebral y explosión.

Antecedentes de la invención

La lesión cerebral adquirida (ABI) y la lesión adquirida de la médula espinal (ASI) son daño cerebral y espinal, respectivamente, causados por eventos que ocurren en el útero, perinatal y posnatal. Estas deficiencias son el resultado de una lesión cerebral traumática (por ejemplo, mecánica, ondas de presión, etc.) o una lesión no traumática derivada de una fuente interna o externa (por ejemplo, accidente cerebrovascular, tumores, infección, envenenamiento, hipoxia, isquemia, radiación, abuso de sustancias, etc.).

La lesión cerebral traumática (TBI), es una agresión al cerebro debido a una fuerza mecánica externa, que conduce a un deterioro permanente o temporal de las funciones cognitivas, físicas y psicosociales, con un estado de conciencia disminuido o alterado asociado (incluye conmoción cerebral y lesión por explosión). El Grupo Interdisciplinario de Interés Especial en Lesiones de la Cabeza del Congreso Estadounidense de Medicina de Rehabilitación define la TBI "leve" como "una interrupción fisiológica traumáticamente inducida de la función cerebral", que se manifiesta por uno de los siguientes: cualquier período de pérdida de conciencia (LOC), cualquier pérdida de memoria para eventos inmediatamente anteriores o posteriores al evento, cualquier alteración en el estado mental en el momento del evento y déficits neurológicos focales, que pueden o no ser transitorios. La escala de coma de Glasgow (GCS) ayuda a definir la gravedad de una TBI (3 a 8, grave; 9 a 12 moderada; 13 a 15 leve), según las respuestas oculares, verbales y motoras. La TBI es un importante problema de salud pública de proporciones epidémicas, con una incidencia anual de 1,6 a 3,2 millones en los Estados Unidos. La TBI leve o mTBI, de la cual la conmoción cerebral y la lesión por ondas explosivas son subconjuntos, es la forma más común y representa casi el 75% de todas las TBI [http://www.cdc.gov/TraumaticBrainInjury]. La TBI leve puede ser causada por fuerzas de impacto en las que la cabeza golpea o es golpeada por algo, o fuerzas impulsivas, en las que la cabeza se mueve sin sufrir un traumatismo (por ejemplo, cuando el pecho golpea algo y la cabeza sale disparada hacia adelante). Todos los grupos de edad sufren conmociones cerebrales, desde los más jóvenes hasta los ancianos. Ciertas actividades se asocian más frecuentemente con conmociones cerebrales, incluidos el atletismo y el servicio militar, pero también son el resultado de un trauma general causado por colisiones de vehículos motorizados, caídas desde altura y agresiones. Las conmociones cerebrales a menudo resultan en síntomas agudos significativos y, en algunos individuos, disfunción neurológica a largo plazo.

Una onda de presión (por ejemplo, la explosión de una bomba) puede causar el intervalo completo de gravedad de TBI, de leve a grave, y puede incluir lesiones penetrantes por proyectiles. La fisiopatología de la TBI relacionada con explosión es distintiva, y la magnitud de la lesión depende de varios factores, incluida la energía de la explosión y la distancia desde el epicentro de la explosión (Rosenfeld, et al., Lancet Neurol. Septiembre de 2013; 12(9): 882-93). Una lesión por explosión es un tipo complejo de trauma físico que resulta de la exposición directa o indirecta a una explosión (Rosenfeld, et al., Lancet Neurol. Septiembre de 2013. 12(9): 882-93). Las lesiones primarias son causadas por ondas de sobrepresión explosivas u ondas de choque. Esto es especialmente probable cuando una persona está cerca de una munición que explota, tal como una mina terrestre. Los modelos animales sugieren que el cerebro es vulnerable a la lesión primaria por explosión. Las ondas de tensión y de cizallamiento de la sobrepresurización podrían potencialmente causar TBI directamente (por ejemplo, conmoción cerebral, hemorragia, edema, lesión axonal difusa). El mecanismo primario de explosión también puede provocar un infarto cerebral debido a una lesión pulmonar por explosión y la consiguiente formación de émbolos gaseosos ["Blast Injuries: Traumatic Brain Injuries from Explosions", Brainline.org].

Aunque el diagnóstico de TBI de moderado a grave es sencillo, la TBI leve se subdiagnostica después de eventos explosivos y de conmoción cerebral ["Blast Injuries: Traumatic Brain Injuries from Explosions", Brainline.org]. Es decir, mientras que las TBI moderadas y graves se diagnostican fácilmente en función de los signos clínicos, las TBI leves pueden pasar desapercibidas debido a signos clínicos sutiles, transitorios o ausentes. Estos últimos requieren un diagnóstico objetivo, tal como un análisis de sangre que sea sensible, específico y reproducible.

El diagnóstico de mTBI clínicamente significativo puede ser difícil, como lo son las decisiones de detener el juego o las actividades. Tampoco está claro cuándo los pacientes con mTBI deben regresar a sus actividades diarias. Por lo tanto, existe un gran interés en el descubrimiento de biomarcadores para ayudar en la mTBI, incluidos los diagnósticos, pronósticos y rehabilitación de lesión cerebral primaria por explosión y conmoción cerebral. En la actualidad, ningún biomarcador tiene suficiente sensibilidad y especificidad.

Las lesiones cerebrales no traumáticas (sin TBI) también pueden dar como resultado síntomas neurológicos levemente anormales. Dada la naturaleza a menudo sutil de las lesiones sin TBI, podrían identificarse mejor con una prueba diagnóstica objetiva, tal como un análisis de sangre, que sea sensible, específico y reproducible.

Lesiones traumáticas de la médula espinal (TSI; por ejemplo, lesiones por hiperflexión, hiperextensión, tensión lateral, rotación, compresión, distracción y transección parcial de la médula espinal de la columna; a menudo por colisiones de vehículos de motor, caídas desde altura, deportes, etc.) y las lesiones de la médula espinal no traumáticas (sin TSI; por ejemplo, enfermedad del disco intervertebral, interrupción del suministro de sangre, infección, electrocución, cáncer, radiación, etc.) también pueden provocar síntomas periféricos leves (por ejemplo, una lesión "incompleta"). Dada la naturaleza a menudo sutil de las lesiones TSI y sin TSI, podrían identificarse mejor con una prueba diagnóstica objetiva, tal como un análisis de sangre, que sea sensible, específico y reproducible.

La metabolómica es un campo de estudio relativamente nuevo que mide el perfil de metabolitos pequeños de una persona (<1500 Dalton). Dos métodos comunes para la metabolómica son la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y la espectrometría de masas (MS). El primero mide un gran número de metabolitos, pero carece de sensibilidad (intervalo micromolar), mientras que el segundo es muy sensible para cuantificar aminoácidos, acilcarnitinas, glicerofosfolípidos, esfingolípidos y azúcares (intervalo picomolar). El atractivo de la metabolómica radica en el concepto de que los metabolitos caen más abajo de la variación genética, transcriptómica, proteómica y ambiental, proporcionando así la medida más integrada y dinámica del fenotipo y la condición médica.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al campo de la elaboración de perfiles metabolómicos o metabolitos individuales como biomarcadores para diagnosticar lesiones del sistema nervioso central (CNS), incluidas lesiones cerebrales adquiridas (ABI) y lesiones espinales adquiridas (ASI). Estas lesiones pueden ser traumáticas (mTBI y mTSI) y no traumáticas (sin t Bi y sin TSI), incluidas lesiones por conmoción cerebral o contusión, lesión por explosión, así como lesiones por accidente cerebrovascular, envenenamiento, angustia psicológica, químicas, infecciosas, inflamatorias, autoinmunes, degenerativas, hipóxicas, isquémicas, metabólicas y lesiones cerebrales/medulares inducidas por cáncer/radiación.

La presente invención se refiere al uso de perfiles metabolómicos o metabolitos individuales como biomarcadores para diagnosticar específicamente lesiones cerebrales y/o de la médula espinal. Únicamente para los fines de este documento, el término "ACNSI" (lesión adquirida del CNS) se utilizará para referirse a "ABI y/o ASI". Además, sin CNSI (sin lesión del CNS) se utilizará para referirse a sujetos normales o de control.

En una realización, la presente invención es un método para diagnosticar mTBI en un sujeto que incluye: (a) obtener un perfil de metabolitos del sujeto; y (b) usar análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático para comparar el perfil del sujeto con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de mTBI y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin CNSI para diagnosticar si el sujeto tiene mTBI.

En una realización del método de diagnóstico de mTBI, el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos con mTBI y sin mTBI se obtiene obteniendo un primer perfil de metabolitos de una población de sujetos que se sabe que tienen mTBI y un segundo perfil de metabolitos de una población de sujetos de control sin mTBI (denominados "normales").

En otra realización del método de diagnóstico de mTBI, el perfil de metabolitos del sujeto y el primer y segundo conjuntos predeterminados de perfiles con mTBI y sin mTBI se proporcionan como conjuntos de datos metabolómicos multidimensionales, y en el que la etapa (b) comprende aplicar a los conjuntos de datos de metabolómica multidimensional (i) una reducción de dimensionalidad, (ii) una selección de características, o (iii) tanto la reducción de dimensionalidad como la selección de características, para obtener un conjunto de datos de metabolómica reducido.

En otra realización del método de diagnóstico de mTBI, la etapa (b) comprende normalizar el perfil de metabolitos del sujeto y los conjuntos de perfiles de metabolitos predeterminados con mTBI y sin mTBI para obtener la matriz, y realizar análisis de componentes principales directamente en la matriz de metabolitos.

En otra realización, la presente invención es un método para diagnosticar mTBI en un sujeto que incluye: (a) obtener un perfil de metabolitos del sujeto; (b) crear una matriz de correlaciones por pares entre el perfil de metabolitos del sujeto y un conjunto predeterminado de perfiles de mTBI y un conjunto predeterminado de perfiles sin mTBI e identificar grupos con mTBI y sin mTBI en la matriz de correlación; y (c) determinar si el perfil del sujeto cae dentro del grupo con mTBI o el grupo sin mTBI.

En una realización del método anterior para diagnosticar mTBI en un sujeto, los conjuntos predeterminados de perfiles de metabolitos con mTBI y sin mTBI se obtienen respectivamente obteniendo un primer conjunto de perfiles de metabolitos de una población de sujetos que se sabe que tienen mTBI y un segundo conjunto de perfiles de metabolitos de una población de sujetos de control sin mTBI (normales).

En otra realización, la presente invención es un método para rastrear o seguir la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI, incluyendo el método: (a) obtener perfiles de metabolitos del paciente en diferentes momentos durante la intervención médica (terapia de rehabilitación); y (b) usar análisis estadísticos multivariados y aprendizaje automático para comparar los perfiles del paciente en cada uno de los diferentes momentos con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de mTBI y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin mTBI para seguir la eficacia de la intervención médica (terapia de rehabilitación) en el paciente.

En una realización del método de seguimiento de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos con mTBI y sin mTBI se obtienen obteniendo un primer perfil de metabolitos de una población de sujetos que se sabe que tienen mTBI y un segundo perfil de metabolitos de una población de sujetos de control sin mTBI (denominados "normales").

En otra realización del método de seguimiento de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, los perfiles de metabolitos del paciente y el primer y segundo conjuntos predeterminados de perfiles de metabolitos con mTBI y sin mTBI se proporcionan como conjuntos de datos metabolómicos multidimensionales, y en los que la etapa (b) comprende aplicar a los conjuntos de datos metabolómicos multidimensionales (i) una reducción de dimensionalidad, (ii) una selección de características, o (iii) ambas reducción de dimensionalidad y selección de características, para obtener un conjunto de datos de metabolómica reducido.

En otra realización del método de seguimiento o rastreo de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, la etapa (b) comprende la normalización de los perfiles de metabolitos del paciente y los conjuntos de perfiles de metabolitos predeterminados con mTBI y sin mTBI para obtener la matriz y realizar análisis de componentes principales directamente en la matriz de metabolitos.

En otra realización del método de seguimiento de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos con mTBI y sin mTBI se emparejan para uno o más de: edad, sexo, actividad, constitución corporal, nutrición, medicamentos y morbilidad.

En otra realización del método de seguimiento de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, el perfil de metabolitos del paciente y el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos se obtienen usando metabolómica.

En otra realización del método de seguimiento de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, la metabolómica se realiza con una o más de cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía en capa fina, análisis electroquímico, espectroscopia de masas (MS), espectroscopia de índice de refracción, espectroscopia ultravioleta, análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarrojo cercano, resonancia magnética nuclear (RMN), análisis de dispersión de luz, cromatografía de gases (GC) o GC acoplada con MS, inyección directa (DI) acoplada con LC-MS/MS.

En otra realización del método de seguimiento de la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con mTBI de la presente invención, las etapas de obtención, uso, creación y determinación se ejecutan utilizando un ordenador adecuadamente programado.

En una realización del método de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, el perfil predeterminado con mTBI y sin mTBI se emparejan para uno o más de: edad, sexo, actividad, nutrición, hábito corporal, medicamentos y co- morbosidad.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, el perfil de metabolitos del sujeto/paciente (incluyendo lípidos y ácidos grasos) y el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos se obtienen usando metabolómica.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, la metabolómica (incluidos los lípidos y los ácidos grasos) se realiza con una o más de cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía en capa fina, análisis electroquímico, espectroscopia de masas (MS), espectroscopia de índice de refracción, espectroscopia ultravioleta, análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarrojo cercano, resonancia magnética nuclear (RMN), análisis de dispersión de luz, cromatografía de gases (GC) o GC acoplada con MS, inyección directa (DI) acoplada con LC-MS/MS.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, las etapas de obtención, uso, creación y determinación se ejecutan utilizando un ordenador adecuadamente programado.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, los perfiles de metabolitos se obtienen de una muestra de prueba biológica seleccionada del grupo que consiste en: sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, saliva, líquido sinovial, orina, líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar y extractos. En un aspecto, el metabolito incluye fosfolípidos, glicerofosfolípidos, lípidos, plasmalógenos, ácidos grasos, azúcares, aminoácidos, nucleótidos, productos intermedios formados durante procesos celulares o combinaciones de los mismos. En otro aspecto, el metabolito incluye lípidos y ácidos grasos o combinaciones de los mismos.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, los perfiles de metabolitos incluyen los siguientes metabolitos: C5, PC aa C32:1, PC aa C32:2, PC aa C36:5, PC aa C36: 6, PC ae C34:0, PC ae C34:3, PC ae C36:0, PC ae C36:1, PC ae C36:2, PC ae C38:1, PC ae C38:2, PC ae C38:3, Putrescina, Formiato, Metanol y Succinato, y los que mTBI es conmoción cerebral.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, los perfiles de metabolitos incluyen los siguientes metabolitos: C5, PC aa C30:2, PC aa C32:0, PC aa C32:1, PC aa C32:2, PC aa C32:3, PC aa C34:4, PC aa C36:6, PC aa C42:6, PC ae C30:0, PC ae C30:1, PC ae C32:1, PC ae C34:0, PC ae C34:2, PC ae C34:3, PC ae C36:0, PC ae C36:2, PC ae C38:1, PC ae C38:3, SM C22:3, SM C24:0, SM C24:1, Ácido alfa-aminoadípico, trans-OH-prolina, Putrescina, betaína, Formiato, Glucosa, Glicerol, Metanol y Serina, y en los que la mTBI es conmoción cerebral.

En un aspecto de esta realización, la mTBI es una conmoción cerebral o una explosión primaria en una lesión cerebral traumática inducida por explosión.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, la mTBI es una conmoción cerebral.

En otra realización de los métodos de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones anteriores, la mTBI es una explosión primaria en una lesión cerebral traumática inducida por una explosión.

La presente invención enseña un producto de programa informático para usar junto con un sistema informático, el producto de programa informático que incluye un medio de almacenamiento legible por computadora y un mecanismo de programa informático integrado en el mismo, el mecanismo de programa informático que comprende instrucciones ejecutables para realizar un método de diagnóstico de ACNSI en un sujeto, comprendiendo dichas instrucciones ejecutables: (a) usar análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático para comparar el perfil metabólico de un sujeto con un conjunto predeterminado de perfiles metabólicos de ACNSI y un conjunto predeterminado de perfiles metabólicos normales; y (b) determinar si el sujeto tiene ACNSI con base en dicha comparación.

En el producto del programa informático, el mecanismo del programa puede comprender además instrucciones ejecutables para: (i) identificar metabolitos en un primer conjunto de muestras biológicas de una población de sujetos que se sabe que tienen ACNSI y en un segundo conjunto de muestras biológicas de una población de sujetos de control sin ACNSI (denominados "normales") obteniendo así el perfil de ACNSI predeterminado y el perfil normal predeterminado utilizando las matrices de ACNSI y de metabolitos normales.

En otra variante del producto de programa informático, se realiza una reducción de la dimensionalidad inicial en el perfil de metabolitos del sujeto y en los perfiles de ACNSI y normales predeterminados por t-SNE.

En otra variante del producto de programa informático, la ACNSI se selecciona de mTSI y sin TSI. En un aspecto de esta realización, la mTSI incluye contusión, estiramiento y/o transección parcial de la médula espinal, y sin TSI incluye lesiones causadas por enfermedad del disco intervertebral, electricidad, accidente cerebrovascular, envenenamiento, lesiones químicas, infecciosas, isquémicas, metabólicas, inflamatorias, de la médula espinal, autoinmunes, degenerativas, hipóxicas e inducidas por cáncer/radiación.

En otra variante del producto de programa informático, la ACNSI se selecciona de mTBI y sin TBI.

En otra variante del producto de programa informático, la ACNSI es mTBI. En un aspecto de esta realización, la mTBI es una conmoción cerebral o una explosión primaria en una lesión cerebral traumática inducida por explosión.

En otra variante del producto de programa informático, la ACNSI no es TBI. En un aspecto de esta realización, sin TBI se selecciona de lesión cerebral inducida por electricidad (electrocución), lesión cerebral inducida por convulsiones, lesión cerebral inducida por cirugía, lesión cerebral inducida por accidente cerebrovascular, lesión cerebral inducida por veneno, lesión cerebral psicológica , lesión cerebral química, lesión cerebral infecciosa, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral metabólica, lesión cerebral inflamatoria, lesión cerebral autoinmune, lesión cerebral degenerativa, lesión cerebral hipóxica y lesión cerebral inducida por cáncer/radiación.

La presente invención enseña un método para evaluar un modelo animal no humano de ACNSI humano, incluyendo el método: (a) obtener un perfil de metabolitos del modelo animal no humano de ACNSI; y (b) usar análisis estadísticos multivariados y aprendizaje automático para comparar el perfil del modelo animal no humano con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de ACNSI humano y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin ACNSI humano para determinar si el animal no humano clasifica como ACNSI.

En una variante del método de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, los conjuntos predeterminados de perfiles de metabolitos de ACNSI y sin ACNSI humano se obtienen obteniendo un primer perfil de metabolitos de una población de sujetos que se sabe que tienen ACNSI y un segundo perfil de metabolitos de una población de sujetos de control sin ACNSI (denominados "normales").

En otra variante del método de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, el perfil de metabolitos del modelo animal no humano de ACNSI y el primer y segundo conjuntos predeterminados de perfiles de ACNSI y sin ACNSI se proporcionan como conjuntos de datos de metabolómica multidimensional, y en el que la etapa (b) comprende aplicar a los conjuntos de datos de metabolómica multidimensional (i) una reducción de dimensionalidad, (ii) una selección de características, o (iii) reducción de dimensionalidad y selección de características, para obtener un conjunto de datos de metabolómica reducido.

En otra variante del método de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, la etapa (b) comprende normalizar el perfil de metabolitos del animal no humano y los conjuntos de perfiles de metabolitos predeterminados de ACNSI y sin ACNSI para obtener la matriz y realizar análisis de componentes principales directamente en la matriz de metabolitos.

En otra variante de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, la ACNSI se selecciona de mTSI y sin TSI. En un aspecto de esta realización, la mTSI incluye contusión, estiramiento y/o transección parcial de la médula espinal, y las lesiones no traumáticas de la médula espinal incluyen lesiones causadas por enfermedad del disco intervertebral, electricidad, accidente cerebrovascular, envenenamiento, lesiones químicas, infecciosas, isquémicas, metabólicas, inflamatorias, autoinmunes, degenerativas, hipóxicas y lesiones de la médula espinal inducidas por radiación/cáncer.

En otra variante del método de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, la ACNSI se selecciona de mTBI y sin TBI.

En otra variante del método de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, la ACNSI es mTBI. En un aspecto de esta realización, la mTBI es una conmoción cerebral o una explosión primaria en una lesión cerebral traumática inducida por explosión.

En otra variante del método de evaluación de un modelo animal no humano de ACNSI, la ACNSI no es TBI. En un aspecto de esta realización, la lesión cerebral no traumática se selecciona de lesión cerebral inducida por accidente cerebrovascular, lesión cerebral inducida por veneno, lesión cerebral psicológica, lesión cerebral química, lesión cerebral infecciosa, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral metabólica, lesión cerebral inflamatoria, lesión cerebral autoinmune, lesión cerebral degenerativa, lesión cerebral hipóxica y lesión cerebral inducida por cáncer/radiación.

Breve descripción de los dibujos

Las siguientes figuras ilustran varios aspectos y realizaciones preferidas y alternativas de la invención.

Figura 1: Gráfico de sujetos individuales trazados en el espacio bidimensional reducido para ilustrar el poder de la etapa de reducción de dimensionalidad t-SNE (12 sujetos con conmoción cerebral - círculos llenos, 17 sujetos de control - círculos sin relleno).

Figura 2: Gráfico que ilustra el agrupamiento jerárquico de enlace completo aglomerativo, que produce 3 grupos de nivel superior: Grupo verde ("G") - todos con conmoción cerebral, pero 2, grupo de color cian ("C") - todos con conmoción cerebral, grupo rojo ("R") - dos con conmoción cerebral, uno de control).

Figura 3: Gráfico que ilustra una curva operativa del receptor (ROC). Téngase en cuenta que las curvas para el pliegue 0 de ROC, el pliegue 1 de ROC y el pliegue 2 de ROC están superpuestas.

Figura 4: Gráfico de animales individuales trazados en un diagrama de dispersión tridimensional de los 3 componentes principales (15 animales de explosión - círculo lleno, 15 animales de control - 'X').

Figura 5: Gráfico de sujetos individuales trazados en el espacio bidimensional reducido para ilustrar el poder de la etapa de reducción de dimensionalidad de t-SNE (ratas de explosión - círculos sin relleno, ratas de control - círculos rellenos).

Figura 6: Coeficiente de correlación producto-momento de Pearson para comparar por pares perfiles de metabolitos entre sujetos.

Figura 7: Gráfico que ilustra el agrupamiento jerárquico de enlace completo aglomerativo, que produce 2 grupos de nivel superior: grupo de explosión ("B") (n=15) y grupo de control (C) (n=15).

Figura 8: Gráfico que ilustra el enfoque de análisis y modelado de datos utilizado en las realizaciones de la presente invención.

Descripción de la invención

abreviaturas

Tabla de metabolitos de MS

C0 (Carnitina) Acilcarnitinas

C10 (Decanoilcarnitina) Acilcarnitinas

C10:1 (Decenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C10:2 (Decadienilcarnitina) Acilcarnitinas

C12 (Dodecanoilcarnitina) Acilcarnitinas

C12-DC (Dodecanodioilcarnitina) Acilcarnitinas

C12:1 (Dodecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C14 (Tetradecanoilcarnitina) Acilcarnitinas

C14:1 (Tetradecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C14:1-OH (Hidroxitetradecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C14:2 (Tetradecadienilcarnitina) Acilcarnitinas

C14:2-OH (Hidroxitetradecadienilcarnitina) Acilcarnitinas

C16 (Hexadecanoilcarnitina) Acilcarnitinas

C16-OH (Hidroxihexadecanoilcarnitina) Acilcarnitinas

C16:1 (Hexadecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C16:1-OH (Hidroxihexadecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C16:2 (Hexadecadienilcarnitina) Acilcarnitinas

C16:2-OH (Hidroxihexadecadienilcarnitina) Acilcarnitinas

C18 (Octadecanoilcarnitina) Acilcarnitinas

C18:1 (Octadecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C18:1-OH (Hidroxioctadecenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C18:2 (Octadecadienilcarnitina) Acilcarnitinas

C2 (Acetilcarnitina) Acilcarnitinas

C3 (Propionilcarnitina) Acilcarnitinas

C3-OH (Hidroxipropionilcarnitina) Acilcarnitinas

C3:1 (Propenoilcarnitina) Acilcarnitinas

C4 (Butirilcarnitina) Acilcarnitinas

C4-OH (C3-DC) (Hidroxibutirilcarnitina) Acilcarnitinas

C4:1 (Butenilcarnitina) Acilcarnitinas

C5 (Valerilcarnitina) Acilcarnitinas

C5-DC (C6-OH)(Glutarilcarnitina) Acilcarnitinas

C5-M-DC (Metilglutarilcarnitina) Acilcarnitinas

C5-OH (C3-DC-M) (Hidroxivalerilcarnitina) Acilcarnitinas

C5:1 (Tiglilcarnitina) Acilcarnitinas

C5:1-DC (Glutaconilcarnitina) Acilcarnitinas

C6(C4:1-DC) (Hexanoilcarnitina) Acilcarnitinas

(continuación)

C6:1 (Hexenoilcamitina) Acilcarnitinas C7-DC (Pimelilcarnitina) Acilcarnitinas C8 (Octanoilcarnitina) Acilcarnitinas C9 (Nonailcarnitina) Acilcarnitinas Alanina Aminoácidos Arginina Aminoácidos Asparagina Aminoácidos Aspartato Aminoácidos Citrulina Aminoácidos Glutamato Aminoácidos Glutamina Aminoácidos Glicina Aminoácidos Histidina Aminoácidos Isoleucina Aminoácidos Leucina Aminoácidos Lisina Aminoácidos Metionina Aminoácidos Ornitina Aminoácidos Fenilalanina Aminoácidos Prolina Aminoácidos Serina Aminoácidos Treonina Aminoácidos Triptófano Aminoácidos Tirosina Aminoácidos Valina Aminoácidos Acetilornitina Aminas biogénicas Ácido aminoadípico Aminas biogénicas Dimetilarginina asimétrica Aminas biogénicas Carnosina Aminas biogénicas Creatinina Aminas biogénicas Dopa Aminas biogénicas Dopamina Aminas biogénicas Histamina Aminas biogénicas Hidroxiprolina Aminas biogénicas Quinurenina Aminas biogénicas Sulfóxido de metionina Aminas biogénicas Nitrotirosina Aminas biogénicas Feniletilamina Aminas biogénicas Putrescina Aminas biogénicas Sarcosina Aminas biogénicas Serotonina Aminas biogénicas (continuación)

Espermidina Aminas biogénicas Espermina Aminas biogénicas Dimetilarginina simétrica Aminas biogénicas Taurina Aminas biogénicas Dimetilarginina total Aminas biogénicas Hexosa Carbohidratos lysoPC a C14:0 Fosfolípidos lysoPC a C16:0 Fosfolípidos lysoPC a C16:1 Fosfolípidos lysoPC a C17:0 Fosfolípidos lysoPC a C18:0 Fosfolípidos lysoPC a C18:1 Fosfolípidos lysoPC a C18:2 Fosfolípidos lysoPC a C20:3 Fosfolípidos lysoPC a C20:4 Fosfolípidos lysoPC a C24:0 Fosfolípidos lysoPC a C26:0 Fosfolípidos lysoPC a C26:1 Fosfolípidos lysoPC a C28:0 Fosfolípidos lysoPC a C28:1 Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos Fosfolípidos

Fosfolípidos

Fosfolípidos aa Fosfolípidos (continuación)

PC aa C38:1 Fosfolípidos PC aa C38:3 Fosfolípidos PC aa C38:4 Fosfolípidos PC aa C38:5 Fosfolípidos PC aa C38:6 Fosfolípidos PC aa C40:1 Fosfolípidos PC aa C40:2 Fosfolípidos PC aa C40:3 Fosfolípidos PC aa C40:4 Fosfolípidos PC aa C40:5 Fosfolípidos PC aa C40:6 Fosfolípidos PC aa C42:0 Fosfolípidos PC aa C42:1 Fosfolípidos PC aa C42:2 Fosfolípidos PC aa C42:4 Fosfolípidos PC aa C42:5 Fosfolípidos PC aa C42:6 Fosfolípidos PC ae C30:0 Fosfolípidos PC ae C30:1 Fosfolípidos PC ae C32:1 Fosfolípidos PC ae C32:2 Fosfolípidos PC ae C34:0 Fosfolípidos PC ae C34:1 Fosfolípidos PC ae C34:2 Fosfolípidos PC ae C34:3 Fosfolípidos PC ae C36:0 Fosfolípidos PC ae C36:1 Fosfolípidos PC ae C36:2 Fosfolípidos PC ae C36:3 Fosfolípidos PC ae C36:4 Fosfolípidos PC ae C36:5 Fosfolípidos PC ae C38:0 Fosfolípidos PC ae C38:1 Fosfolípidos PC ae C38:2 Fosfolípidos PC ae C38:3 Fosfolípidos PC ae C38:4 Fosfolípidos PC ae C38:5 Fosfolípidos PC ae C38:6 Fosfolípidos PC ae C40:1 Fosfolípidos PC ae C40:2 Fosfolípidos PC ae C40:3 Fosfolípidos (continuación)

PC ae C40:4 Fosfolípidos

PC ae C40:5 Fosfolípidos

PC ae C40:6 Fosfolípidos

PC ae C42:0 Fosfolípidos

PC ae C42:1 Fosfolípidos

PC ae C42:2 Fosfolípidos

PC ae C42:3 Fosfolípidos

PC ae C42:4 Fosfolípidos

PC ae C42:5 Fosfolípidos

PC ae C44:3 Fosfolípidos

PC ae C44:4 Fosfolípidos

PC ae C44:5 Fosfolípidos

PC ae C44:6 Fosfolípidos

SM (OH) C14:1 Esfingolípidos

SM (OH) C16:1 Esfingolípidos

SM (OH) C22:1 Esfingolípidos

SM (OH) C22:2 Esfingolípidos

SM (OH) C24:1 Esfingolípidos

SM C16:0 Esfingolípidos

SM C16:1 Esfingolípidos

SM C18:0 Esfingolípidos

SM C18:1 Esfingolípidos

SM C20:2 Esfingolípidos

SM C22:3 Esfingolípidos

SM C24:0 Esfingolípidos

SM C24:1 Esfingolípidos

SM C26:0 Esfingolípidos

SM C26:1 Esfingolípidos

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Además, a menos que se indique lo contrario, excepto dentro de las reivindicaciones, el uso de "o" incluye "y" y viceversa. Los términos no limitativos no deben interpretarse como limitativos a menos que se indique expresamente o el contexto indique claramente lo contrario (por ejemplo, "que incluye", "que tiene" y "que comprende" normalmente indican "que incluye sin limitación"). Las formas singulares incluidas en las reivindicaciones tales como "un", "uno, una" y "el, la" incluyen la referencia en plural a menos que se indique expresamente lo contrario. Para ayudar en la comprensión y preparación de la presente invención, se proporcionan los siguientes ejemplos ilustrativos, no limitativos.

En este documento, la definición de "lesión cerebral traumática leve" "mTBI", que también puede denominarse en la bibliografía como lesión cerebral leve o conmoción cerebral, es la tomada del Congreso Americano de Medicina de Rehabilitación (ACRM; J Head Trauma Rehabil 1993;8(3):86-87), y se refiere a una persona que ha tenido una interrupción fisiológica de la función cerebral inducida traumáticamente, manifestada por al menos uno de los siguientes: 1. cualquier período de pérdida de conciencia; 2. cualquier pérdida de memoria de eventos inmediatamente anteriores o posteriores al evento; 3. cualquier alteración en el estado mental en el momento del evento (por ejemplo, sensación de aturdimiento, desorientación o confusión); y 4. déficit o déficits neurológicos focales que puede ser transitorio o no; pero cuando la gravedad de la lesión no supera lo siguiente: pérdida del conocimiento de aproximadamente 30 minutos o menos; después de 30 minutos, una escala de coma de Glasgow (GCS) inicial de 13­ 15; y amnesia postraumática (PTA) no mayor de 24 horas. Esta definición incluye: 1. la cabeza que es golpeada, 2. la cabeza golpeando un objeto, y 3. el cerebro experimentando un movimiento de aceleración/desaceleración (es decir, latigazo cervical) sin traumatismo externo directo en la cabeza. La tomografía computarizada, imágenes de resonancia magnética, electroencefalograma, espectroscopia de infrarrojo cercano, tomografía de emisión positiva o las evaluaciones neurológicas de rutina pueden ser normales. Debido a la falta de emergencia médica o/a las realidades de ciertos sistemas médicos, es posible que algunos pacientes no tengan los factores anteriores médicamente documentados en la etapa aguda. En estos casos conviene considerar la sintomatología que, ligada a un traumatismo craneoencefálico, puede sugerir la existencia de una mTBI.

Las "lesiones cerebrales no traumáticas" (sin TBI) incluyen lesiones cerebrales que pueden ser el resultado de accidentes cerebrovasculares, envenenamientos, trastornos psicológicos, productos químicos, infecciones, inflamación, enfermedades autoinmunes, procesos degenerativos, hipoxia, isquemia, trastornos metabólicos y cáncer/radiación.

En este documento, la definición de "lesión traumática leve de la médula espinal" "mTSI" es una lesión incompleta con uno o más síntomas espinales que pueden resolverse con el tiempo (por ejemplo, pérdida del control de los intestinos o la vejiga, mala regulación de la presión arterial y temperatura corporal, dolor, sensaciones débiles, sentido débil de la posición del cuerpo, disfunción sexual, etc.). Las causas de mTSI pueden incluir contusión, estiramiento y transección parcial de la médula espinal.

Las "lesiones no traumáticas de la médula espinal" (sin TSI) incluyen lesiones de la médula espinal que pueden ser el resultado de accidentes cerebrovasculares, envenenamientos, productos químicos, infecciones, inflamación, enfermedades autoinmunes, procesos degenerativos, hipoxia, isquemia, trastornos metabólicos y cáncer/radiación.

"Metaboloma" se refiere a la colección de todos los metabolitos en una célula, tejido, órgano u organismo biológico, que son los productos finales de los procesos celulares. "Metaboloma" incluye lipidoma, azúcares, nucleótidos y aminoácidos. El lipidoma es el perfil lipídico completo en una célula, tejido, órgano u organismo biológico.

"Perfil metabolómico" se refiere a la caracterización y/o medición de metabolitos de molécula pequeña en un espécimen o muestra biológica, incluidas células, tejidos, órganos, organismos o cualquier fracción derivada de los mismos y fluidos como sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, saliva, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, orina, lavado broncoalveolar, extractos de tejido, etc.

El perfil de metabolitos puede incluir información tal como la cantidad y/o el tipo de moléculas pequeñas presentes en la muestra. El experto en la materia sabría que la información que es necesaria y/o suficiente variará dependiendo del uso previsto del "perfil de metabolitos". Por ejemplo, el "perfil de metabolitos" se puede determinar usando una sola técnica para un uso previsto, pero puede requerir el uso de varias técnicas diferentes para otro uso previsto dependiendo de factores tales como el estado de la enfermedad involucrada, los tipos de moléculas pequeñas presentes en un compartimento celular diana particular, ensayándose el compartimento celular per se, y así sucesivamente.

La información relevante en un "perfil de metabolitos" también puede variar según el uso previsto de la información recopilada, por ejemplo, un espectro. Por ejemplo, para algunos usos previstos, las cantidades de un metabolito particular o una clase particular de metabolitos pueden ser relevantes, pero para otros usos, la distribución de tipos de metabolitos puede ser relevante.

Los perfiles de metabolitos pueden generarse mediante varios métodos, por ejemplo, HPLC, cromatografía en capa fina (TLC), análisis electroquímico, espectroscopia de masas (MS), espectroscopia de índice de refracción (RI), espectroscopia ultravioleta (UV), análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarrojo cercano (IR cercano), espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopia de fluorescencia, interferometría de polarización dual, métodos computacionales, análisis de dispersión de luz (LS), cromatografía de gases (GC) o GC acoplada con MS, inyección directa (DI) acoplada con LC-MS/MS y/u otros métodos o combinación de métodos conocidos en la técnica.

El término "metabolitos de molécula pequeña" incluye moléculas orgánicas e inorgánicas que están presentes en la célula, el compartimento celular o el orgánulo, normalmente con un peso molecular inferior a 2.000 o 1.500. El término no incluye macromoléculas grandes, tales como proteínas grandes (por ejemplo, proteínas con pesos moleculares superiores a 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 o 10.000), ácidos nucleicos grandes (por ejemplo, ácidos nucleicos con peso molecular pesos superiores a 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 7.000, 8.000, 9.000 o 10.000), o polisacáridos grandes (por ejemplo, polisacáridos con pesos moleculares superiores a 2.000, 3.000, 4.000, 5.000, 6.000, 6000, 9.000 o 10.000). Los metabolitos de moléculas pequeñas de la célula generalmente se encuentran libres en solución en el citoplasma o en otros orgánulos, tales como las mitocondrias, en las que forman un grupo de compuestos intermediarios que pueden metabolizarse más o usarse para generar moléculas grandes, llamadas macromoléculas. El término "metabolitos de moléculas pequeñas" incluye moléculas de señalización y compuestos intermedios en las reacciones químicas que transforman la energía derivada de los alimentos en formas utilizables.

Los ejemplos de metabolitos de moléculas pequeñas incluyen fosfolípidos, glicerofosfolípidos, lípidos, plasmalógenos, azúcares, ácidos grasos, aminoácidos, nucleótidos, compuestos intermedios formados durante los procesos celulares, isómeros y otras moléculas pequeñas que se encuentran dentro de la célula. En una realización, se aíslan las moléculas pequeñas de la invención. Los metabolitos preferidos incluyen lípidos y ácidos grasos.

El término "sujeto" como se usa en el presente documento se refiere a todos los miembros del reino animal, incluidos los mamíferos, preferiblemente los seres humanos.

El término "paciente", como se usa en el presente documento, se refiere a un sujeto del que se sospecha que tiene una lesión adquirida del sistema nervioso central (ACNSI). En este documento ACNSI incluye una lesión cerebral adquirida (ABI) y una lesión adquirida de la médula espinal (ASI). Estas lesiones pueden ser traumáticas (mTBI y mTSI) y no traumáticas (sin TBI y sin TSI). mTBI incluye conmoción cerebral y explosión, incluida la lesión por onda de sobrepresión por explosión. Sin TBI incluye lesión cerebral inducida por electricidad (electrocución), lesión cerebral inducida por convulsiones, lesión cerebral inducida por cirugía, lesión cerebral inducida por accidente cerebrovascular, lesión cerebral inducida por veneno, lesión cerebral psicológica, lesión cerebral química, lesión cerebral infecciosa, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral metabólica, lesión cerebral inflamatoria, lesión cerebral autoinmune, lesión cerebral degenerativa, lesión cerebral hipóxica y lesión cerebral inducida por cáncer/radiación. mTSI incluye contusión, estiramiento y/o transección parcial de la médula espinal, y sin TSI incluye enfermedad del disco intervertebral, lesiones de la medula espinal inducidas por electricidad, accidente cerebrovascular, envenenamiento, lesiones químicas, infecciosas, isquémicas, metabólicas, inflamatorias, autoinmunes, degenerativas, hipóxicas y por cáncer/radiación.

Descripción general

La presente invención se refiere al uso de perfiles metabolómicos en el diagnóstico de lesiones adquiridas del sistema nervioso central (ACNSI), incluyendo ABI y ASI. ABI incluye mTBI y sin TBI. ASI incluye mTSI y sin TSI. Las lesiones traumáticas en el cerebro y la médula espinal pueden incluir conmoción cerebral y explosión, incluida la lesión por sobrepresión por explosión, así como contusión, estiramiento y/o transección parcial de la médula espinal. Las lesiones no traumáticas (sin TBI y sin TSI) pueden incluir lesiones inducidas por electricidad (electrocución), inducidas por convulsiones, inducidas por cirugía, accidentes cerebrovasculares, envenenamientos, angustia psicológica, sustancias químicas, infecciones, inflamación, enfermedades autoinmunes, procesos degenerativos, hipoxia, isquemia, trastornos metabólicos y cáncer/radiación (también, enfermedad del disco intervertebral para sin t S i). La presente invención también se refiere a biomarcadores individuales en el diagnóstico de ABI tales como mTBI y sin TBI, y ASI, tales como mTSI y sin TSI en un sujeto.

Los solicitantes descubrieron que el perfil metabolómico identifica formas de ACNSI con un grado de certeza relativamente alto. A partir de la fecha de esta invención, la capacidad predictiva de los métodos de la presente invención puede ser la mejor prueba biológica hasta la fecha para el diagnóstico de mTBI. Los métodos y programas informáticos de la presente invención pueden utilizarse en pruebas de metabolómica en el punto de atención con instrumentos portátiles, de mesa/encimera o de mano que generan perfiles de metabolitos.

Perfiles metabolómicos

Dado que los metabolitos existen en una gama muy amplia de concentraciones y muestran diversidad química, no existe un instrumento que pueda medir de forma fiable todos los metabolitos en el metaboloma no humano o humano en un solo análisis. En su lugar, los profesionales de la elaboración de perfiles metabolómicos suelen utilizar un conjunto de instrumentos, que suelen incluir diferentes combinaciones de cromatografía líquida (LC) o cromatografía de gases (GC) acoplada con MS, para obtener una amplia cobertura metabólica [Circulation. 2012; 126: 1110-1120]. Aunque en esta invención se usaron perfiles metabólicos de RMN y LC-MS/MS de inyección directa (DI/LC-MS/MS), debe entenderse que también se pueden utilizar otros instrumentos como el análisis electroquímico, RI, UV, IR cercano, LS, GC, etc.

Los perfiles metabólicos de RMN y DI-LC-MS/MS obtenidos de individuos que se sabe que tienen una mTBI y de individuos sin mTBI ("controles" o "normales") se analizaron individualmente empleando técnicas de reducción de dimensionalidad no supervisadas; se construyó un clasificador de predicción de mTBI utilizando métodos de aprendizaje automático supervisado. Específicamente: los datos de DI-LC-MS/MS y/o RMN sin procesar obtenidos de muestras biológicas se normalizaron y se sometieron a uno o ambos análisis de componentes principales (PCA) e incrustación de vecino más cercano estocástico distribuido en t (t-SNE). En todos los casos de PCA, los 10 vectores propios principales explicaron más del 80 % de la varianza, por lo que se eliminaron los vectores propios posteriores. Se registraron las cargas de metabolitos en los 10 vectores propios principales y cada sujeto se proyectó en el espacio PCA para inspeccionar las cargas de componentes del sujeto. Los gráficos de dispersión bidimensionales y tridimensionales de los 2 componentes principales (resp. 3) revelaron una fuerte agrupación de mTBI frente a sujetos de control (Figuras 1 y 4). En función de la solidez de este resultado, se entrenó una máquina de vectores de soporte (SVM) de núcleo lineal para clasificar sujetos con mTBI a partir de un perfil metabólico de entrada. Se realizó una validación cruzada de 10 veces del clasificador que arrojó una precisión superior al 80% solo en datos sin procesar de DI-LC-MS/MS, y entre aproximadamente el 90-92% solo en datos de DI-LC-MS/MS solo con número reducido de metabolitos, más del 65% de precisión en los datos de RMN solos y alrededor del 92% de precisión en los datos de DI-LC-MS/MS y RMN combinados. Finalmente, se completó un coeficiente de correlación producto-momento de Pearson entre los perfiles metabólicos de cada par de pacientes para obtener una matriz de correlación. La estructura clara era visible en la matriz de correlación tan completa: se realizó un agolpamiento jerárquico de vinculación en la matriz que agrupaba efectivamente a los individuos en un grupo con 'mTBI', un grupo 'sin mTBI' y un pequeño grupo heterogéneo.

Basándose en el perfil metabolómico del plasma sanguíneo (DI-LC-MS/MS y RMN juntos, o DI-LC-M/MS solo), de pacientes humanos, se predijo una mTBI con aproximadamente un 92 % de certeza.

Podrían desarrollarse pruebas en el punto de atención (por ejemplo, MS de sobremesa) para identificar ABI, incluidos pacientes con mTBI y sin TBI, y para pronosticar sus lesiones cerebrales.

Como tal, en una realización, la presente invención proporciona un método para diagnosticar o pronosticar un ACNSI en un sujeto, que incluye lesiones cerebrales adquiridas (ABI) y lesiones de la médula espinal adquiridas (ASI). El método puede incluir las siguientes etapas: (a) obtener un perfil de metabolitos del sujeto; y (b) usar análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático para comparar el perfil del sujeto con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de lesiones ACNSI y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de lesiones sin ACNSI (denominado como "control" o "normal") para determinar o diagnosticar si el paciente tiene lesión ACNSI o pronosticar la ASNSI.

Se puede establecer una biblioteca de perfiles metabólicos para casos de ABI diagnosticados, incluidos mTBI y sin TBI. Por ejemplo, una biblioteca de perfiles metabólicos de conmoción cerebral, explosión primaria en lesión cerebral traumática inducida por explosión, lesión cerebral inducida por electricidad (electrocución), lesión cerebral inducida por convulsiones, lesión cerebral inducida por cirugía, lesión cerebral inducida por accidente cerebrovascular, lesión cerebral inducida por veneno, lesión cerebral psicológica, lesión cerebral química, lesión cerebral infecciosa, lesión cerebral isquémica, lesión cerebral metabólica, lesión cerebral inflamatoria, lesión cerebral autoinmune, lesión cerebral degenerativa, lesión cerebral hipóxica y lesión cerebral inducida por cáncer/radiación y cualquier otra posible forma de ABI. Esta biblioteca puede usarse como el conjunto predeterminado de perfiles metabólicos de ABI. De manera similar, se pueden establecer bibliotecas para casos de ASI diagnosticados para obtener un conjunto predeterminado de perfiles metabólicos de ASI. El conjunto predeterminado de perfiles metabólicos normales se puede obtener de sujetos que se sabe que no tienen una forma de ABI y/o ASI. Usando análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático, se puede hacer una comparación del perfil del sujeto con el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de ABI/ASI y el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin ABI/sin ASI (denominado como "control" o "normal") para determinar no solo si el paciente tiene ABI/ASI, sino también el tipo de ABI/ASI (es decir, conmoción cerebral, explosión primaria en lesión cerebral traumática inducida por explosión, lesión cerebral inducida por electricidad (electrocución), lesión cerebral inducida por convulsiones, lesión inducida por cirugía, lesión inducida por accidente cerebrovascular, lesión inducida por veneno, lesión psicológica, lesión química, lesión infecciosa, lesión isquémica, lesión metabólica, lesión inflamatoria, lesión autoinmune, lesión degenerativa, lesión hipóxica y lesión inducida por cáncer/radiación, etc.) y el pronóstico.

Las bibliotecas de perfiles predeterminados (ABI, ASI y controles) pueden proporcionarse en un producto informático (tarjetas de memoria, como una aplicación para dispositivos portátiles tales como tabletas y teléfonos móviles, etc.), o pueden cargarse en la memoria de un sistema informático, incluidos los ordenadores centrales, las superficies de escritorio, las superficies de laboratorio, los dispositivos portátiles, tales como tabletas y los teléfonos móviles. La sangre o cualquier otro fluido corporal, por ejemplo, sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, saliva, líquido sinovial, orina, líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar, lágrimas, sudor, extractos, etc., puede extraerse de un sujeto del que se sospecha que tiene una ABI y/o ASI. Se puede obtener un perfil de metabolitos del fluido del sujeto utilizando cualquier tecnología conocida (por ejemplo, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía en capa fina, análisis electroquímico, espectroscopia de masas (MS), espectroscopia de índice de refracción, espectroscopia ultravioleta, análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopía de infrarrojo cercano, resonancia magnética nuclear (RMN), análisis de dispersión de luz, cromatografía de gases (GC) o GC acoplada con MS, inyección directa (DI) acoplada con LC-MS/MS, etc.). A continuación, el perfil de metabolitos del sujeto puede cargarse en el sistema informático (ordenadores centrales, tabletas, tabletas de laboratorio, dispositivos portátiles, etc.). Luego, un operador puede comparar el perfil del sujeto con el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de ABI y/o ASI y el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin ABI/sin ASI (denominado como "control" o "normal") utilizando análisis estadísticos multivariados y aprendizaje automático para determinar no solo si el paciente tiene ABI y/o ASI, sino también el tipo de ABI y/o ASI, o si un tratamiento es eficaz. El operador puede seleccionar el tipo de análisis multivariado y aprendizaje automático.

Los retornos a un perfil metabolómico normal pueden servir como ayuda para seguir las intervenciones médicas (incluida la terapia de rehabilitación) de individuos afectados por una ABI, ASI, mTSI, sin TSI, mTBI y/o sin TBI, y guiar el regreso al juego, escuela, trabajo y/o actividades diarias antes de ABI/antes de ASI.

Como tal, en otra realización, la presente invención es un método para rastrear o seguir la eficacia de una intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) en un paciente con ACNSI, incluido el paciente con mTSI, el paciente sin TSI, el paciente con mTBI y el paciente sin TBI, incluyendo el método: (a) obtener perfiles de metabolitos del paciente en diferentes momentos durante la intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación); y (b) usar análisis estadísticos multivariados y aprendizaje automático para comparar los perfiles del paciente durante o en cada uno de los diferentes momentos con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de ACNSI y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin ACNSI (control normal) para seguir la eficacia de la intervención médica en el paciente. Un retorno a un perfil metabolómico normal del paciente puede servir para evaluar si la intervención médica (incluida la terapia de rehabilitación) del paciente ha tenido éxito.

En una realización, la presente invención es un método para evaluar un modelo animal no humano de ACNSI humano, que incluye mTBI y sin TBI, así como mTSI y sin TSI. El método puede usarse para determinar los modelos animales que mejor representen la condición humana, lo que puede ser útil para la intervención y el descubrimiento terapéuticos. El método, en una realización, puede incluir: (a) obtener un perfil de metabolitos del modelo animal no humano de ACNSI; y (b) usar análisis estadísticos multivariados y aprendizaje automático para comparar el perfil del modelo animal no humano con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de ACNSI humano y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin ACNSI humano para determinar si el animal no humano tiene ACNSI. El modelo animal no humano puede considerarse un modelo preciso, fiable y reproducible de ACNSI humano si se clasifica como ACNSI. El modelo animal no humano puede ser un modelo de ACNSI humano si se clasifica como ACNSI con un nivel predeterminado de precisión o certeza.

Para ayudar en la comprensión y preparación de la presente invención, se proporcionan los siguientes ejemplos ilustrativos, no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Materiales y métodos

El consejo de ética de investigación humana de la Western University aprobó este estudio. Se obtuvo el consentimiento informado de los tutores legales y el asentimiento de los sujetos adolescentes.

Reclutamiento de sujetos:

Se reclutaron atletas de hockey sobre hielo adolescentes masculinos (División Bantam; de 12 a 14 años de edad) del suroeste de Ontario, Canadá, para participar en este estudio. Para ayudar al reclutamiento, se exhibió un cartel de información del estudio en los estadios de Hockey sobre hielo de la ciudad, con el consentimiento de los oficiales de los estadios, y se hicieron presentaciones verbales a varias juntas regionales de hockey y entrenadores. Los atletas de hockey adolescentes que se presentaron a los médicos de atención primaria en la Clínica de Medicina Deportiva Fowler Kennedy en la Universidad Western con sospecha de conmoción cerebral fueron evaluados y abordados para obtener su consentimiento. Se realizó un diagnóstico de conmoción cerebral deportiva cuando se observó un mecanismo de lesión seguido de la aparición de los síntomas típicos de conmoción cerebral y la ausencia de lesión estructural. Los sujetos de control eran jugadores de hockey no lesionados que tenían la misma edad, sexo y actividad, y que no habían sufrido una conmoción cerebral en el pasado. Se excluyó a cualquier sujeto con una lesión o enfermedad neurológica conocida. Después del reclutamiento, a todos los sujetos del estudio se les asignó un número de estudio aleatorio para su identificación. No se utilizaron más identificadores de sujetos para proteger la identidad.

Los sujetos con conmociones cerebrales y de control, incluidos sus padres/tutores, completaron una herramienta de evaluación de conmociones cerebrales deportivas - 3a edición [SCAT3; 13-14 años de edad; (Guskiewicz et al., 2013)] o Child-SCAT3 [(una herramienta modificada recomendada para niños de 12 años o jóvenes que tiene en cuenta las diferencias de desarrollo en el rendimiento (Glaviano et al., 2015)]. Todos los atletas lesionados se sometieron a un historial completo, un examen físico y neurológico por un médico especialista en medicina deportiva con experiencia en el manejo de conmociones cerebrales. Los atletas lesionados recibieron atención estandarizada para conmociones cerebrales dirigida por un médico de medicina deportiva de atención primaria.

A todos los sujetos en la primera visita a la clínica se les extrajeron 20 ml de sangre por un flebotomista certificado, enfermera o médico en tubos Vacutainer de EDTA. La sangre se centrifugó y el plasma se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C.

DI-LC/MS/MS

Se aplicó un enfoque de metabolómica cuantitativa dirigida para analizar las muestras de plasma utilizando una combinación de espectrometría de masas de inyección directa (kit AbsoluteIDQMR) con un kit de LC/MS/MS de fase inversa (BIOCRATEs Life Sciences AG, Austria). Este kit, en combinación con un espectrómetro de masas ABI 4000 Q-Trap (Applied Biosystems/MDS Sciex), se puede utilizar para la identificación y cuantificación específicas de hasta 180 metabolitos endógenos diferentes, incluidos aminoácidos, acilcarnitinas, aminas biogénicas, glicerofosfolípidos, esfingolípidos y azúcares. El método combina la derivatización y extracción de analitos y la detección espectrométrica selectiva de masas utilizando múltiples pares de monitorización de reacciones. Los estándares internos marcados con isótopos y otros estándares internos están integrados en el filtro de placa del kit para la cuantificación de metabolitos. El kit AbsoluteIDQ contenía una placa de 96 pocillos profundos con una placa de filtro unida con cinta selladora y los reactivos y disolventes utilizados para preparar el ensayo de placa. Los primeros 14 pocillos del kit se utilizaron para un blanco; tres muestras cero, siete estándares y tres muestras de control de calidad proporcionadas con cada kit. Todas las muestras de plasma se analizaron con el protocolo del kit AbsoluteIDQ, de acuerdo con el manual del usuario. Brevemente, las muestras de plasma se descongelaron en hielo y luego se agitaron y centrifugaron a 13.000 x g. Cada muestra de plasma (10 j l) se cargó en el centro del filtro de la placa superior del kit de 96 pocillos y se secó en una corriente de nitrógeno. Posteriormente, se añadieron 20 j l de una solución al 5% de isotiocianato de fenilo para la derivatización. Después de la incubación, las manchas del filtro se secaron nuevamente usando un evaporador. A continuación, se consiguió la extracción de los metabolitos añadiendo 300 j l de Metanol que contenían acetato de amonio 5 mM. Los extractos se obtuvieron por centrifugación en la placa inferior de 96 pocillos profundos, seguido de una etapa de dilución con el disolvente de operación del kit de MS. El análisis espectrométrico de masas se realizó en un instrumento de espectrometría de masas en tándem API4000 Qtrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA) equipado con un sistema de suministro de disolvente. Las muestras se suministraron al espectrómetro de masas mediante LC seguido de DI. El software Biocrates MetlQ se utilizó para controlar todo el flujo de trabajo del ensayo, desde el registro de muestras hasta el cálculo automatizado de las concentraciones de metabolitos. Se utilizó un esquema de perfilado específico para detectar cuantitativamente los metabolitos de moléculas pequeñas conocidos mediante el monitoreo de múltiples reacciones, la pérdida neutra y los escaneos de iones precursores.

RMN

Las muestras de plasma se desproteinizaron mediante ultrafiltración como se describió previamente (Psychogios et al., 2011). Antes de la filtración, las unidades de filtro centrífugos de corte de 3 KDa (Amicon Microcon YM-3) se enjuagaron cinco veces cada una con 0,5 ml de H²O y se centrifugaron (10.000 rpm durante 10 minutos) para eliminar el glicerol residual unido a las membranas del filtro. A continuación, se transfirieron alícuotas de cada muestra de plasma a los dispositivos de filtro de centrífuga y se centrifugaron (10.000 rpm durante 20 minutos) para eliminar las macromoléculas (principalmente proteínas y lipoproteínas) de la muestra. Los filtrados se revisaron visualmente en busca de evidencia de que la membrana estuviera comprometida y para estas muestras se repitió el proceso de filtración con un filtro diferente y el filtrado se inspeccionó nuevamente. Se recogieron los filtrados posteriores y se registraron los volúmenes. Si el volumen total de la muestra era inferior a 600 jl, se añadía una cantidad adecuada de tampón de NaH² PO⁴50 mM (pH 7,0) hasta que el volumen total de la muestra fuera de 600 jl. Cualquier muestra a la que se le tuvo que agregar tampón para llevar el volumen de la solución a 600 jl, se anotó con el factor de dilución y las concentraciones de metabolitos se corrigieron en el análisis posterior. Posteriormente, se añadieron 70 j l de D²O y 30 j l de una solución tampón estándar (DSS 11,7 mM (2,2-dimetil-2-silcepentano-5-sulfonato disódico], imidazol 730 mM y NaN³ al 0,47% en H²O) a la muestra.

A continuación, la muestra de plasma (700 j l) se transfirió a un tubo de RMN estándar para el análisis espectral posterior. Todos los espectros de RMN 1H se recogieron en un espectrómetro Inova de 500 MHz (Varian Inc. Palo Alto, CA) equipado con una sonda de temperatura ambiente de gradiente de campo pulsado con gradiente Z de HCN de 5 mm. Los espectros de RMN 1H se adquirieron a 25 °C utilizando el primer transitorio de la secuencia de pulsos de saturación previa de NOESY, elegida por su alto grado de precisión cuantitativa (Saude et al., 2006). Todos los FID (descomposiciones por inducción libre) se llenaron con ceros en puntos de datos de 64 K y se sometieron a un ensanchamiento de línea de 0,5 Hz. El singlete producido por los grupos metilo del DSS se usó como estándar interno para referenciar el desplazamiento químico (establecido en 0 ppm) y para la cuantificación, todos los espectros de RMN 1H se procesaron y analizaron usando el paquete de software profesional de RMN Chenomx versión 7.1 (Chenomx Inc., Edmonton, AB). El paquete de software de RMN de Chenomx permite el análisis cualitativo y cuantitativo de un espectro de RMN ajustando manualmente las firmas espectrales de una base de datos interna al espectro. Específicamente, el ajuste espectral para el metabolito se realizó utilizando la biblioteca de metabolitos estándar de 500 MHz de Chenomx. Normalmente, el 90% de los picos visibles se asignaron a un compuesto y más del 90% del área espectral se podía ajustar de forma rutinaria con el software de análisis espectral Chenomx. La mayoría de los picos visibles están anotados con un nombre compuesto. Se ha demostrado previamente que este procedimiento de ajuste proporciona una precisión de concentración absoluta del 90% o superior. Cada espectro fue procesado y analizado por al menos dos espectroscopistas de RMN para minimizar la identificación y cuantificación erróneas de compuestos. Se utilizó la adición de muestras para confirmar las identidades de los compuestos asignados. La adición de muestras implica la adición de 20-200 jM del compuesto sospechoso y el examen de los espectros resultantes para determinar si la intensidad relativa de la señal de RMN cambió como se esperaba.

Análisis de datos

Los datos demográficos y de la herramienta de conmoción cerebral se informaron como la media ± desviación estándar (SD), con un valor P < 0,05 tomado como nuestro estándar de significancia estadística. Los datos sin procesar de RMN y MS para cada sujeto se recogieron y normalizaron dentro de cada marcador de metabolito, entre sujetos. Más específicamente, los datos de cada marcador metabólico se escalaron para tener una norma unitaria. El análisis exploratorio inicial implicó realizar un análisis de componentes principales (PCA) directamente en los sujetos mediante la matriz de metabolitos. Motivado por la observación de que la dimensionalidad inherente de los datos era significativamente menor que el número de marcadores de metabolitos, se realizó una reducción de la dimensionalidad no lineal en la matriz de datos completa utilizando el algoritmo de incrustación del vecino más cercano estocástico distribuido en t (t-SNE) (van der Maaten y Hinton, 2008). A diferencia de PCA, que impone una refactorización lineal, ortogonal y quebradiza de los datos, t-SNE supone que la representación "óptima" de los datos se encuentra en una variedad con geometría compleja, pero de baja dimensión, incrustada en el espacio dimensional completo de los datos sin procesar. Se utilizó t-SNE para reducir el conjunto completo de datos metabólicos a solo dos dimensiones. Luego se entrenaron máquinas de vectores de soporte (SVM) separadas, con núcleos lineales, en los conjuntos de datos completos y reducidos de dimensionalidad para clasificar a los sujetos como con o sin conmoción cerebral. Se realizó una validación cruzada de nuestro clasificador utilizando un enfoque de exclusión y se evaluó la significancia estadística frente a una distribución nula generada por un nuevo muestreo. Para investigar la robustez del clasificador entrenado, se generaron curvas de características operativas del receptor (ROC); se generó una curva para cada pliegue de un enfoque de validación cruzada de 4 pliegues donde el clasificador de cada pliegue se entrena en un subconjunto de los datos y luego se prueba en un subconjunto separado, retenido, que no se usó para el entrenamiento. La curva ROC grafica la tasa de verdaderos positivos contra la tasa de falsos positivos del clasificador; la esquina superior izquierda de la gráfica es "ideal" y la diagonal principal estaría ocupada por un clasificador que simplemente adivinó las etiquetas al azar.

Resultados

Metabolómica

Se ensayó plasma de jugadores de hockey sobre hielo adolescentes masculinos: 12 controles con conmoción cerebral (13,4 ± 2,3 años de edad) y 17 controles sin lesiones (12,9 ± 1,0 años de edad; P = 0,213). El tiempo estimado desde la ocurrencia de la conmoción cerebral hasta la extracción de sangre en la primera visita a la clínica fue de 2,3 ± 0,7 días.

La evaluación de síntomas autoinformados de acuerdo con SCAT3 (n=11) reveló una puntuación total de síntomas y una gravedad total de síntomas de 11,6 ± 4,8 y 29,3 ± 22,8, respectivamente (Tabla 1). Un paciente con conmoción cerebral fue evaluado con Child SCAT y tuvo una puntuación total de síntomas de 6 y una gravedad total de síntomas de 12. Todos los controles sin lesiones fueron evaluados con SCAT3 (n=17), que reveló una puntuación total de síntomas y una gravedad total de síntomas de 0,5 ± 1,5 y 0,6 ± 1,8, respectivamente.

Se analizó el plasma para los metabolitos 143 y 31 mediante DI/LC-MS/MS (Tabla 2) y RMN (Tabla 3), respectivamente.

PCA

Utilizando PCA, se demostró que los 10 componentes principales representan el 82% de la variación en los datos, con cada uno de los 10 componentes ponderados a través de muchos de los metabolitos subyacentes (Tabla 4). La observación más llamativa fue la alta variación en los glicerofosfolípidos en plasma entre sujetos con y sin conmoción cerebral.

t-SNE

El conjunto completo de datos metabólicos se redujo a dos dimensiones usando t-SNE, ya que la dimensionalidad inherente de los datos fue significativamente menor que el número de metabolitos (Figura 1). Después de esta etapa de reducción de la dimensionalidad, se entrenó una máquina de vectores de soporte (SVM), con un núcleo lineal, para clasificar a los sujetos como con o sin conmoción cerebral. La validación cruzada del clasificador utilizando un enfoque de dejar uno fuera demostró una tasa de precisión del 92% en el diagnóstico de una conmoción cerebral en jugadores adolescentes de hockey sobre hielo.

Tomando la precisión de la clasificación como nuestra estadística de prueba, se investigó la importancia de nuestra precisión observada a través de la prueba de permutación. Se generó una distribución nula mezclando aleatoriamente etiquetas de clase; entrenar y probar un nuevo clasificador para cada conjunto de etiquetas mezcladas y registrar la tasa de clasificación. Al comparar nuestra tasa de precisión observada del 92% con una distribución nula de 10.000 muestras en la que ninguno de los clasificadores nulos alcanzó una tasa de precisión del 92%, se calculó una p < 0,0001.

Luego, se minimiza el número de metabolitos requeridos para lograr una precisión de clasificación razonable. Usando una prueba de ji cuadrado para seleccionar metabolitos informativos de manera univariante, se continuó observando una precisión de clasificación del 92% con solo 17 metabolitos (Tabla 5, Columna 1). A continuación, se utilizó la eliminación recursiva de características para verificar la precisión, y se obtuvo una precisión de clasificación similar del 90% con 31 metabolitos (Tabla 5, Columna 2).

Como etapa final, se agruparon sujetos con y sin conmoción cerebral mediante comparación directa de sus perfiles metabolómicos. Se calculó el coeficiente de correlación producto-momento de Pearson para cada par de perfiles metabólicos del sujeto (normalizados) para producir una matriz de correlación. Las agrupaciones se identificaron de manera óptima en esta matriz de correlación con agolpamiento jerárquico de enlace completo aglomerativo (Figura 2).

Se generó una curva operativa del receptor sobre una validación cruzada de 4 veces con un SVM (Figura 3), demostrando el rendimiento de un clasificador binario a medida que se varía su umbral de discriminación, y produciendo una ROC media de 0,91.

^ *

Tabla 2. DI-LC/MS/MS 143 metabolitos

continuación

Tabla 3. RMN 31 metabolitos

continuación

Tabla 4: PCA identificó los 10 principales metabolitos ponderados para cada uno de los 10 componentes principales

"Com ." .

Tabla 5. Precisión de clasificación similar, usando dos técnicas analíticas independientes, lograda con menos metabolitos.

En este estudio, se realizaron perfiles metabolómicos en jugadores adolescentes de hockey sobre hielo con conmociones cerebrales y controles emparejados. Utilizando análisis estadísticos multivariados y aprendizaje automático, se predijeron los individuos con conmociones cerebrales con hasta un 92% de certeza. Uno de los patrones más llamativos observados fue la dependencia del modelo de los cambios en los glicerofosfolípidos plasmáticos, que representan aproximadamente el 50% de la varianza entre sujetos con y sin conmoción cerebral. La elaboración de perfiles metabolómicos con aprendizaje automático es un nuevo método de diagnóstico de conmociones cerebrales con alta sensibilidad.

Se investigó específicamente la conmoción cerebral en jugadores adolescentes de hockey sobre hielo. En nuestra región, los varones adolescentes corren el mayor riesgo de conmoción cerebral y sufren conmociones con mayor frecuencia en actividades relacionadas con el deporte en estadios de hockey sobre hielo (Stewart et al., 2014). Las conmociones cerebrales en estos pacientes adolescentes son motivo de especial preocupación ya que sus cerebros aún se están desarrollando (Halstead et al., 2010; Toledo et al., 2012). Los pacientes más jóvenes también son más susceptibles a las lesiones debido a cráneos más delgados, músculos del cuello más débiles, menos mielinización, mayor contenido de agua en el cerebro, requisitos metabólicos más altos y un espacio subaracnoideo más grande en el que el cerebro puede moverse más libremente (Karlin, 2011; Morrison et al., 2013). Posteriormente, las tasas de conmoción cerebral son más altas en los jóvenes y el tiempo de recuperación se prolonga en relación con los adultos (Lovell et al., 2004; Pellman et al., 2006). De hecho, la lesión cerebral puede tener consecuencias de por vida para los adolescentes debido a la interrupción del desarrollo intelectual y social (Toledo et al., 2012). El diagnóstico preciso de la conmoción cerebral es particularmente importante para los adolescentes, ya que el rápido despliegue de servicios de rehabilitación y tratamiento temprano apropiados podría cambiar la vida de esta población vulnerable.

En la actualidad, el diagnóstico de conmoción cerebral se basa únicamente en el juicio clínico. Los pacientes con conmoción cerebral en nuestro estudio fueron diagnosticados por un mecanismo de lesión con síntomas típicos de conmoción cerebral. Los pacientes fueron evaluados con SCAT3 o Child-SCAT3 para un sujeto de 12 años, ya que estas son las herramientas de evaluación de conmociones cerebrales recomendadas para estos grupos de edad (Guskiewicz et al., 2013; Glaviano et al., 2015). Con base en el número promedio de síntomas autoinformados y el puntaje de gravedad de los síntomas, nuestros datos sugieren una gravedad de los síntomas leve a moderada de nuestros atletas masculinos con conmociones cerebrales. Además, hasta donde sabemos, el nuestro es el primer estudio que informa valores SCAT3 normativos para atletas masculinos adolescentes no lesionados. El reporte propio de los síntomas se complica por la naturaleza subjetiva de la evaluación, y los atletas generalmente no informan los síntomas (Lovell y Solomon, 2013; Meier et al., 2015).

El diagnóstico de conmoción cerebral sigue siendo problemático, con el juicio clínico como estándar dorado (McCrory et al., 2013). Por lo tanto, ha habido una búsqueda activa de un biomarcador de diagnóstico en sangre (por ejemplo, GFAP, Tau, NFL). A pesar de una gran cantidad de investigaciones, no se ha identificado ningún biomarcador o panel de biomarcadores para diagnósticos generalizados, probablemente debido a una sensibilidad, especificidad o reproducibilidad inadecuadas (Jeter et al., 2013). Un solo biomarcador o una pequeña cantidad de biomarcadores pueden no reflejar con precisión la heterogeneidad del paciente y la lesión que ocurre en el trauma cerebral. Preocupaciones adicionales se relacionan con los biomarcadores individuales que se comparan con definiciones variables de conmoción cerebral, con el uso inconsistente de elementos de datos clínicos y relacionados con biomarcadores comunes, con el tiempo variable de las medidas de resultado y con la falta de comprensión de los perfiles temporales individuales (Papa et al., 2015). Nuestro perfil metabolómico, con 174 metabolitos examinados y tan solo 17 metabolitos requeridos para la precisión de la clasificación, puede ser útil para desarrollar futuras pruebas en el punto de atención y un sistema de apoyo a la toma de decisiones para futuros diagnósticos de conmoción cerebral (es decir, interfaz de Internet).

Las estadísticas convencionales están dirigidas por modelos porque se basan en la suposición de que hay un número relativamente pequeño de variables importantes y que la selección cuidadosa de variables es la clave para un buen desempeño del modelo. Este enfoque ha proporcionado información clínica importante sobre las poblaciones, pero es significativamente limitado para comprender la enfermedad en los individuos. Un complemento de las estadísticas convencionales es el aprendizaje automático, que permite que los datos creen el modelo mediante la detección de patrones subyacentes (Shouval et al., 2014). La metabolómica es ideal para las técnicas de aprendizaje automático, ya que el desempeño final del modelo depende de la cantidad de información que contiene cada conjunto de datos.

El perfilado metabolómico requiere análisis de todos los metabolitos detectados simultáneamente, siendo las técnicas de análisis PCA las más utilizadas (Bujak et al., 2014). A diferencia de PCA, que impone una refactorización lineal, ortogonal y frágil de los datos, t-SNE supone que la representación "óptima" de los datos se encuentra en una variedad con geometría compleja, pero de baja dimensión, incrustada en el espacio dimensional completo de los datos sin procesar (van der Maaten y Hinton, 2008). El poder de la etapa de reducción de la dimensionalidad de t-SNE se observó una vez que los sujetos individuales se graficaron en el espacio bidimensional reducido.

Utilizando los análisis antes mencionados, se determinó que la varianza en los metabolitos entre sujetos con y sin conmoción cerebral era más pronunciada para los glicerofosfolípidos. Los glicerofosfolípidos son moléculas dinámicas que se renuevan a diferentes velocidades según su estructura, composición y localización en las membranas celulares. Con respecto al cerebro, los glicerofosfolípidos representan aproximadamente el 25% del peso seco y están muy concentrados en la mielina (Farooqui et al., 2000). Los glicerofosfolípidos regulan la fluidez y permeabilidad de la membrana y son una reserva para una variedad de segundos mensajeros. La degradación de los glicerofosfolípidos se produce a través de las fosfolipasas.

Una vez que se redujo el número de metabolitos, pero aún se mantuvo una alta precisión de clasificación, los más informativos fueron los glicerofosfolípidos de colina con varios plasmalógenos de colina (por ejemplo, PCaeC34:0, PCaeC34:3, PCaeC36:0, PCaeC36:1, PCaeC36 :2, PCaeC38:1, PCaeC38:2 y PCaeC38:3). Los plasmalógenos están presentes en cantidades significativas en la mielina, y >70% de los glicerofosfolípidos de la mielina son plasmalógenos (Braverman y Moser, 2012). Se considera que los plasmalógenos tienen varias funciones, entre ellas contribuir a la estructura de la membrana, actuar como antioxidantes de la membrana y ser una fuente de moléculas de segundo mensajero.

La acilcarnitina C5 también tuvo un papel destacado en la precisión de la clasificación. El papel de C5 es complejo y está relacionado con el metabolismo energético, el transporte de ácidos grasos y la oxidación de ácidos grasos mitocondriales, la cetosis, el estrés oxidativo y el daño de la membrana mitocondrial. C5 se produce durante el catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada leucina e isoleucina. Una elevación de la acilcarnitina C5 puede ser un indicador de bloqueo en los niveles de isovaleril-CoA deshidrogenasa y acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta/ramificada. Otros metabolitos de importancia para una clasificación precisa incluyen Putrescina, Metanol, Formiato y Succinato. Cuando estos últimos metabolitos se toman juntos, los hallazgos sugieren cambios agudos en el metabolismo energético del cerebro después de una conmoción cerebral en estos atletas jóvenes (Sikoglu et al., 2015).

La mayoría de los metabolitos informativos, como los glicerofosfolípidos, se agrupan en grupos de metabolitos. No obstante, es difícil desarrollar una teoría unificadora. Los metabolitos identificados pueden reflejar consecuencias secundarias a la lesión por conmoción cerebral primaria o pueden tener impactos metabólicos secundarios comunes. La experimentación adicional con modelos animales de TBI puede ser informativa cuando tanto el cerebro como el plasma se pueden analizar en paralelo.

La normalización de los metabolitos podría reflejar la curación y recuperación del tejido, y ayudar a guiar la rehabilitación de la conmoción cerebral y el regreso seguro al juego y otras actividades diarias. Proporcionar una medida objetiva de la recuperación a través de la metabolómica tiene un gran potencial para mejorar el manejo de la conmoción cerebral al estandarizar aún más las prácticas de regreso al juego y regreso al aprendizaje más allá de lo que la legislación y las políticas pueden proporcionar actualmente. Esto puede proteger a los atletas de regresar a sus actividades demasiado pronto, lo que puede conducir a un mayor riesgo de conmociones cerebrales repetidas, otras lesiones y la prolongación de los síntomas (Harmon et al, 2013). Finalmente, el juicio clínico es el "estándar dorado" de facto para el diagnóstico de conmoción cerebral y, por lo tanto, la conmoción cerebral puede haber sido diagnosticada en exceso en el "grupo con conmoción cerebral". Además, es posible que se hayan pasado por alto conmociones cerebrales previas en el grupo de "control", mientras que las lesiones cerebrales subclínicas no se habrían representado con precisión.

En resumen, utilizando perfiles de metabolómica de plasma, junto con análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático, se identificaron individuos con conmoción cerebral con un 92% de certeza. De las dos técnicas analíticas utilizadas, RMN y DI-LC/MS/MS, los metabolitos medidos con MS en tándem parecen ofrecer una mayor capacidad predictiva. De hecho, gran parte de la varianza observada entre los grupos se debió a cambios en los glicerofosfolípidos y C5 en plasma. El perfil de metabolómica representa un método de diagnóstico novedoso para mTBI y puede ser susceptible de pruebas metabolómicas en el punto de atención.

Referencias para el Ejemplo 1

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Ejemplo 2 - Lesión cerebral traumática por explosión primaria

Materiales y métodos

Exposición a explosión

Al realizar esta investigación, los autores se adhirieron a la "Guía para el cuidado y uso de animales de experimentación" y "La ética de la experimentación con animales" publicadas por el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Se adquirieron ratas Sprague-Dawley macho adultas de Charles River Laboratories (St. Constant, Quebec, Canadá) y se aclimataron durante al menos una semana antes de la exposición. Hay 15 muestras de control y 15 de explosión. El día del uso, los animales (-280-330 g) se anestesiaron con isoflurano al 3% en oxígeno y se colocaron en una sujeción que consistía en una manga cilíndrica de plástico transparente, con el cuello ceñido cómodamente en un collar de plástico y la cabeza sobresaliendo a través de una abertura en el extremo, que es cóncava de manera que coincida con la curvatura del interior del tubo de explosión. Los cuartos traseros se sujetaron mediante una tapa de extremo provista de un pistón. A la izquierda de la cabeza y contralateral a la dirección de la onda de choque, se aseguró una red de malla entre dos pasadores colocados verticalmente en línea con el costado y por encima y por debajo de la cabeza. El movimiento de la cabeza se restringió usando dos métodos diferentes definidos como reposacabezas 1 y 2. Con el reposacabezas 1, la cabeza se colocó contra la red vertical y luego se mantuvo en su lugar usando una red adicional alrededor de la cabeza. El reposacabezas 2 también usó la malla vertical, pero con la cabeza del animal anestesiado sostenida usando una delgada tira de cinta adhesiva colocada horizontalmente entre los pasadores inferiores. Es importante destacar que este método no aseguró la cabeza en su lugar contra la malla vertical con una red adicional. Después de un total de ocho minutos de anestesia, la sujeción que contenía al animal se colocó en la pared del simulador avanzado de explosión (ABS) 4280 mm debajo del diafragma, de modo que solo la cabeza sobresalía en la sección de prueba. Los grupos de prueba consistieron en un control simulado, mientras que el grupo experimental consistió en exposiciones laterales, solo de la cabeza, de sobrepresiones estáticas de ondas de choque de un solo pulso de 30 psi con una duración positiva de ~6-7 mseg.

Simulador avanzado de explosión (ABS)

Se usó un ABS hecho a medida (~30,5 cm de diámetro y 5,79 m de longitud) para producir ondas explosivas simuladas. A diferencia de un tubo de choque convencional, el ABS fue diseñado desde un principio para replicar la dinámica de onda de un estallido explosivo por medio de su área divergente de forma especial. Es particularmente importante reproducir las formas de onda adaptadas correctas para la presión estática y dinámica en la onda de choque que, con mayor frecuencia, se tergiversan en los tubos de choque convencionales. El ABS consta de una sección "conductora" llena de gas a alta presión separada por un diafragma frágil de una sección de transición, que conduce a una sección de prueba de presión ambiental. La presurización controlada del impulsor provoca la ruptura del diafragma a presiones predeterminadas, liberando abruptamente el gas a alta presión e impulsando una onda de choque adaptada a lo largo de la sección de prueba. La inclusión de un eliminador de onda final (EWE) al final de la sección de prueba impide que las ondas reflejadas se propaguen de regreso al área de prueba; el EWE también mitiga el ruido y la salida de gases al espacio del laboratorio. Por medio de estas características de diseño únicas, el ABS genera ondas de choque de un solo pulso altamente reproducibles diseñadas para replicar las de un estallido explosivo. La presión diana y las formas de onda requeridas se lograron utilizando helio comprimido en el controlador y varias capas y espesores de láminas de acetato de celulosa reforzadas para el diafragma frangible.

Adquisición de datos de presión del ABS

Las presiones estáticas se midieron utilizando manómetros PCB 113A28 colocados a 2780, 3280, 3780, 4280 y 4780 mm del diafragma. Las presiones totales experimentadas por el animal de prueba se midieron usando una sonda de Pitot (transductor de presión Endevco 8530B) orientada de manera que midió las presiones totales en la ubicación de prueba a 4280 mm del diafragma. Las presiones dinámicas se obtuvieron calculando la diferencia entre la presión estática y la total registrada en este lugar. Todos los datos de presión se registraron mediante una interfaz Labview personalizada y se registraron en una placa digitalizadora GaGe Octopus 8389 CompuScope PCIe a una velocidad de muestreo de 500.000 muestras/seg.

Metabolómica

Las ratas se sacrificaron humanitariamente y el volumen de sangre circulante se eliminó mediante punción intracardíaca. La sangre se transfirió inmediatamente de la jeringa a tubos que contenían EDTA y se centrifugó. La capa de plasma superior se eliminó, se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta que se analizó.

DI-LC-MS/MS

Se aplicó un enfoque de metabolómica cuantitativa dirigida para analizar las muestras de plasma utilizando una combinación de espectrometría de masas de inyección directa (kit AbsoluteIDQMR) con un kit LC-MS/MS de fase inversa (BIOCRATEs Life Sciences AG, Austria). Este kit, en combinación con un espectrómetro de masas ABI 4000 Q-Trap (Applied Biosystems/MDS Sciex), se puede utilizar para la identificación y cuantificación específicas de hasta 180 metabolitos endógenos diferentes, incluidos aminoácidos, acilcarnitinas, aminas biogénicas, glicerofosfolípidos, esfingolípidos y azúcares. El método utilizado combina la derivatización y extracción de analitos, y la detección espectrométrica de masas selectiva utilizando pares de monitorización de reacciones múltiples (MRM). Los estándares internos marcados con isótopos y otros estándares internos están integrados en el filtro de placa del kit para la cuantificación de metabolitos. El kit AbsoluteIDQ contenía una placa de 96 pocillos profundos con una placa de filtro unida con cinta selladora y los reactivos y disolventes utilizados para preparar el ensayo de la placa. Los primeros 14 pocillos del kit se utilizaron para un blanco; tres muestras cero, siete estándares y tres muestras de control de calidad proporcionadas con cada kit. Todas las muestras de plasma se analizaron con el protocolo del kit AbsoluteIDQ, según el manual del usuario. Brevemente, las muestras de plasma se descongelaron en hielo y luego se agitaron y centrifugaron a 13.000 x g. Se cargaron 10 pl de cada muestra de plasma en el centro del filtro de la placa superior del kit de 96 pocillos y se secaron en una corriente de nitrógeno. Posteriormente, se añadieron 20 pl de una solución al 5% de isotiocianato de fenilo para la derivatización. Después de la incubación, las manchas del filtro se secaron nuevamente usando un evaporador. A continuación, se consiguió la extracción de los metabolitos añadiendo 300 pl de Metanol que contenían acetato de amonio 5 mM. Los extractos se obtuvieron por centrifugación en la placa inferior de 96 pocillos profundos, seguido de una etapa de dilución con el disolvente de operación del kit de m S. El análisis espectrométrico de masas se realizó en un instrumento de espectrometría de masas en tándem API4000 Qtrap® (Applied Biosystems/MDS Analytical Technologies, Foster City, CA) equipado con un sistema de suministro de disolvente. Las muestras se enviaron al espectrómetro de masas mediante LC seguido de DI. El software Biocrates MetIQ se utilizó para controlar todo el flujo de trabajo del ensayo, desde el registro de muestras hasta el cálculo automatizado de las concentraciones de metabolitos y la exportación de datos a otros programas de análisis de datos. Se utilizó un esquema de perfilado específico para detectar cuantitativamente los metabolitos de moléculas pequeñas conocidos mediante el monitoreo de múltiples reacciones, la pérdida neutra y los escaneos de iones precursores.

Análisis de datos

Los datos de DI-LC-MS/MS sin procesar para cada animal se ingirieron y normalizaron dentro de cada marcador de metabolito, entre sujetos (específicamente: los datos para cada marcador metabólico se escalaron para tener una norma de unidad). El análisis exploratorio inicial implicó realizar un análisis de componentes principales (PCA) directamente en la matriz de animales x metabolitos.

El conjunto completo de datos metabólicos sin procesar también se redujo a dos dimensiones utilizando t-SNE, ya que la dimensionalidad inherente de los datos fue significativamente menor que la cantidad de metabolitos. Después de esta etapa de reducción de la dimensionalidad, se entrenó una SVM, con un núcleo lineal, para clasificar a los sujetos como con o sin conmoción cerebral.

Resultados

Análisis PCA

La Figura 4 es un gráfico PCA de los primeros 3 componentes. Todos los controles se agrupan en un grupo relativamente apretado en el lado derecho, a excepción de unos pocos controles que se agruparon con los animales sometidos a explosión. El clasificador tiene una precisión del 83% entre la explosión y el control. La Tabla 6 muestra los 8 principales metabolitos ponderados para cada uno de los 10 componentes principales.

Reducción de dimensionalidad

El conjunto de datos metabólicos completo se redujo a dos dimensiones usando t-SNE, ya que la dimensionalidad inherente de los datos fue significativamente menor que el número de metabolitos (véase la Figura 5). Después de esta etapa de reducción de la dimensionalidad, se entrenó una SVM, con un núcleo lineal, para clasificar las ratas como de explosión o de control. La validación cruzada de nuestro clasificador utilizando un enfoque de exclusión demostró una tasa de precisión de hasta el 86% (intervalo 80-86%) en la identificación de una rata de explosión primaria de una de control (validación cruzada de 11 veces).

La Figura 6 es un coeficiente de correlación producto-momento de Pearson para comparar por pares perfiles de metabolitos entre sujetos.

La Figura 7 ilustra un agrupamiento jerárquico en la matriz de distancia de la Figura 6. El agrupamiento jerárquico de la Figura 6 muestra un grupo grande a la izquierda que son todos los controles (C). El grupo más grande a la derecha es principalmente explosión (B), pero también algunos controles. En las Figuras 6 y 7 etiquetas 0-15 son ratas Blast, 16-31 son ratas de control.

Tomando la precisión de la clasificación como nuestra estadística de prueba, se investigó la significancia de nuestra precisión observada a través de la prueba de permutación. Se generó una distribución nula mezclando aleatoriamente etiquetas de clase; entrenar y probar un nuevo clasificador para cada conjunto de etiquetas mezcladas; y registrar la tasa de clasificación. La generación de 1.000 distribuciones nulas con un enfoque de permutación produce una p < 0,0001 para la tasa de clasificación (conservadora) del 80%.

Tabla 6: PCA

continuación

Ejemplo 3 - Pronóstico

Metabolómica

Se analizó el plasma de tres grupos de participantes: (1) participantes que tenían un primer episodio de conmoción cerebral, (2) participantes con dos o más conmociones cerebrales notificadas y (3) participantes de control sin antecedentes de conmoción cerebral. Todos los controles con y sin conmoción cerebral se evaluaron clínicamente para determinar los síntomas y la gravedad de la conmoción cerebral. Los participantes también fueron evaluados de acuerdo con los criterios de diagnóstico estándar aceptados. Se analizó el plasma en busca de metabolitos mediante DI/LC-MS/MS y RMN.

PCA

Usando PCA, se demostró que los 10 componentes principales explican la mayoría de la varianza en los datos, con cada uno de los 10 componentes ponderados en muchos de los metabolitos subyacentes.

t-SNE

El conjunto completo de datos metabólicos se redujo a dos dimensiones usando t-SNE, ya que la dimensionalidad inherente de los datos fue significativamente menor que el número de metabolitos. Después de esta etapa de reducción de la dimensionalidad, se entrenó una máquina de vectores de soporte (SVM), con un núcleo lineal, para clasificar a los sujetos como con o sin conmoción cerebral. La validación cruzada del clasificador utilizando un enfoque de dejar uno fuera demostró un alto porcentaje de tasa de precisión en el diagnóstico de una primera conmoción cerebral frente a múltiples conmociones cerebrales.

Tomando la precisión de clasificación como nuestra estadística de prueba, la significancia de la precisión puede probarse mediante pruebas de permutación. Se puede generar una distribución nula mezclando aleatoriamente las etiquetas de clase; entrenar y probar un nuevo clasificador para cada conjunto de etiquetas mezcladas y registrar la tasa de clasificación.

El número de metabolitos necesarios para lograr una precisión de clasificación razonable puede minimizarse usando una prueba de Ji cuadrado para seleccionar metabolitos informativos de una manera univariante y observar el porcentaje de precisión de clasificación con un conjunto minimizado de metabolitos.

Como etapa final, los tres grupos diferentes pueden agruparse mediante comparación directa de sus perfiles metabolómicos, incluido el lipidoma. El coeficiente de correlación producto-momento de Pearson se puede calcular para cada par de perfiles metabólicos de sujetos (normalizados) para generar una matriz de correlación. Las agrupaciones se pueden identificar de manera óptima en esta matriz de correlación con agrupamiento jerárquico de enlace completo aglomerativo.

Se puede generar una curva operativa del receptor sobre una validación cruzada de 4 veces con un SVM, para demostrar el rendimiento de un clasificador binario a medida que se varía su umbral de discriminación.

Ejemplo 4 - Diferenciación de tipos de ACNSI

Metabolómica

Se ensayó el plasma de seis grupos de participantes: (1) participantes de mTBI que sufrieron una conmoción cerebral (grupo de conmoción cerebral), (2) participantes de mTBI que sufrieron una explosión primaria en una lesión cerebral traumática inducida por onda expansiva (grupo de explosión), (3) participantes sin TBI con lesión cerebral por angustia psicológica (por ejemplo, PTSD) (grupo psicológico), (4) participantes con mTSI que tienen contusión de la médula espinal (grupo de contusión), (5) participantes sin TSI (grupo sin TSI) y (6) participantes de control sin antecedentes de lesión cerebral/medular. Los participantes fueron evaluados de acuerdo con los criterios de diagnóstico estándar aceptados.

El plasma se ensayó en busca de metabolitos por DI/LC-MS/MS y RMN

PCA

Usando PCA, se demostró que los 10 componentes principales explican la mayoría de la varianza en los datos, con cada uno de los 10 componentes ponderados en muchos de los metabolitos subyacentes.

t-SNE

El conjunto completo de datos metabólicos se redujo a dos dimensiones usando t-SNE, ya que la dimensionalidad inherente de los datos fue significativamente menor que el número de metabolitos. Después de esta etapa de reducción de la dimensionalidad, se entrenó una máquina de vectores de soporte (SVM), con un núcleo lineal, para clasificar a los sujetos como con o sin conmoción cerebral. La validación cruzada del clasificador usando un enfoque de dejar uno fuera demostró un alto porcentaje de tasa de precisión en el diagnóstico de lesiones espinales, conmociones cerebrales, lesiones cerebrales por explosiones y psicológicas.

Tomando la precisión de la clasificación como nuestra estadística de prueba, la significancia de la precisión puede probarse mediante pruebas de permutación. Se puede generar una distribución nula mezclando aleatoriamente las etiquetas de clase; entrenar y probar un nuevo clasificador para cada conjunto de etiquetas mezcladas y registrar la tasa de clasificación.

El número de metabolitos necesarios para lograr una precisión de clasificación razonable puede minimizarse usando una prueba de Ji cuadrado para seleccionar metabolitos informativos de una manera univariada y observar el porcentaje de precisión de clasificación con un conjunto minimizado de metabolitos.

Como etapa final, los cuatro grupos diferentes pueden agruparse mediante comparación directa de sus perfiles metabolómicos, incluido el lipidoma. El coeficiente de correlación producto-momento de Pearson se puede calcular para cada par de perfiles metabólicos de sujetos (normalizados) para generar una matriz de correlación. Las agrupaciones se pueden identificar de manera óptima en esta matriz de correlación con agrupamiento jerárquico de enlace completo aglomerativo.

Se puede generar una curva operativa del receptor sobre una validación cruzada de 4 veces con un SVM, para demostrar el desempeño de un clasificador binario a medida que se varía su umbral de discriminación.

A través de las realizaciones que se ilustran y describen, se describe el mejor modo actualmente contemplado de hacer y usar la invención. Sin más elaboración, se cree que un experto en la técnica puede, con base en la descripción presentada en este documento, utilizar la presente invención en toda su extensión.

Aunque la descripción anterior contiene muchas especificidades, estas no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, sino simplemente como ilustraciones de algunas de las realizaciones actuales de esta invención

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método para diagnosticar una lesión cerebral traumática leve (mTBI) en un sujeto que comprende:

(a) obtener un perfil de metabolitos a partir de una muestra de prueba biológica del sujeto; y

(b) usar análisis estadístico multivariado y aprendizaje automático para comparar el perfil del sujeto con un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos de mTBI y un conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin mTBI para determinar si el sujeto tiene mTBI,

en el que el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos comprende metabolitos seleccionados de los metabolitos incluidos en las Tablas 2 y 3.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el perfil de metabolitos del sujeto y los conjuntos predeterminados de perfiles con mTBI y sin mTBI se proporcionan como conjuntos de datos metabolómicos multidimensionales, y en el que la etapa (b) comprende aplicar a los conjuntos de datos de metabolómicos multidimensionales (i) una reducción de dimensionalidad, (ii) una selección de características, o (iii) reducción de dimensionalidad y selección de características, para obtener un conjunto de datos de metabolómica reducido.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende normalizar el conjunto del perfil de metabolitos del sujeto y los conjuntos de perfiles de metabolitos predeterminados con mTBI y sin mTBI para obtener una matriz, y realizar análisis de componentes principales directamente en la matriz de metabolitos.

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el método comprende además:

(c) crear una matriz de correlaciones por pares entre el perfil de metabolitos del sujeto y el conjunto predeterminado de perfiles de mTBI y el conjunto predeterminado de perfiles sin mTBI e identificar grupos con mTBI y sin mTBI en la matriz de correlación; y

(d) determinar si el perfil del sujeto cae dentro del grupo con mTBI o el grupo sin mTBI.

5. El método de la reivindicación 1, en el que el sujeto es un paciente, y en el que la etapa (a) comprende obtener perfiles de metabolitos a partir de muestras de prueba biológicas del paciente en diferentes momentos durante una intervención médica del paciente; y

en el que la etapa (b) comprende usar el análisis estadístico multivariado y el aprendizaje automático para comparar los perfiles del paciente en cada uno de los diferentes momentos con el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos con mTBI y el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos sin mTBI para seguir la eficiencia de la intervención médica en el paciente.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el perfil predeterminado con mTBI y sin mTBI se emparejan para uno o más de: edad, sexo, actividad, nutrición, hábito corporal, fármacos y comorbilidad.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el perfil de metabolitos del sujeto y el conjunto predeterminado de perfiles de metabolitos se obtienen usando metabolómica.

8. El método de la reivindicación 7, en el que la metabolómica se realiza con uno o más de cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía en capa fina, análisis electroquímico, espectroscopia de masas (MS), espectroscopia de índice de refracción, espectroscopia ultravioleta, análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarrojo cercano, resonancia magnética nuclear (RMN), análisis de dispersión de luz, cromatografía de gases (GC) o GC acoplada con MS, inyección directa (DI) acoplada con LC-MS/MS.

9. El método de la reivindicación 1,2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, en el que los perfiles de metabolitos se obtienen de una muestra de prueba biológica seleccionada del grupo que consiste en: sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, saliva, líquido sinovial, orina, líquido cefalorraquídeo, lavado broncoalveolar, lágrimas, sudor y extractos.

10. El método de la reivindicación 9, en el que la muestra de prueba biológica es plasma sanguíneo.

11. El método de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en el que los perfiles de metabolitos incluyen además fosfolípidos, glicerofosfolípidos, lípidos, plasmalógenos de isómeros de lípidos, ácidos grasos, azúcares, aminoácidos, nucleótidos, productos intermedios formados durante procesos celulares o combinaciones de los mismos.

12. El método de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, en el que los perfiles de metabolitos comprenden además un lipidoma.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los perfiles de metabolitos incluyen los siguientes metabolitos:: C5, PC aa C32:1, PC aa C32:2, PC aa C36:5, PC aa C36:6, PC ae C34:0, PC ae C34:3, PC ae C36:0, PC ae C36:1, PC ae C36:2, PC ae C38:1, PC ae C38:2, PC ae C38:3, Putrescina, Formiato, Metanol y Succinato, y en el que mTBI es conmoción cerebral.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los perfiles de metabolitos incluyen los siguientes metabolitos: C5, PC aa C30:2, PC aa C32:0, PC aa C32:1, PC aa C32:2, PC aa C32:3, PC aa C34:4, PC aa C36:6, PC aa C42:6, PC ae C30:0, PC ae C30:1, PC ae C32:1, PC ae C34:0, PC ae C34:2, PC ae C34:3, PC ae C36:0, PC ae C36:2, PC ae C38:1, PC ae C38:3, SM C22:3, SM C24:0, SM C24:1, Ácido alfaaminoadípico, trans-OH-Prolina, Putrescina, Betaína, Formiato, Glucosa, Glicerol, Metanol y Serina, y en el que mTBI es conmoción cerebral.

15. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la mTBI es una lesión por conmoción cerebral o por onda expansiva.