ES2904847T3

ES2904847T3 - Ligasa de extremos romos termostable y métodos de uso

Info

Publication number: ES2904847T3
Application number: ES17206830T
Authority: ES
Inventors: Frederick Christians
Original assignee: Labrador Diagnostics LLC
Current assignee: Labrador Diagnostics LLC
Priority date: 2013-03-15
Filing date: 2014-03-15
Publication date: 2022-04-06
Anticipated expiration: 2034-03-15
Also published as: IL241073A0; EP2970922A4; US9719081B2; AU2014233213A1; PL2970922T3; CA2903873A1; EP3360958B1; EP3360958A1; WO2014145269A1; US20140273102A1; US20160186164A1; US9273301B2; EP2970922B1; ES2661662T3; US20170298338A1; CA2903873C; EP2970922A1; SG11201507264YA; IL241073B; US20170015989A1

Abstract

Un método para realizar una reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable, que comprende: combinar moléculas de ADN que se van a ligar y una ADN ligasa de extremos romos termoestable en una solución, en donde dicha ADN ligasa de extremos romos termoestable comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO: 19, y en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable se realiza a una temperatura de 60 °C o más.

Description

DESCRIPCIÓN

Ligasa de extremos romos termostable y métodos de uso

Antecedentes

Se conocen diversos métodos para la amplificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 4683 202) es un método popular para la amplificación de ácidos nucleicos. Para realizar exitosamente una reacción de PCR, la reacción debe realizarse a varias temperaturas diferentes. Esto requiere hardware u otros mecanismos para cambiar repetidamente la temperatura de la reacción de PCR. Otro método para la amplificación de ácidos nucleicos se denomina amplificación isotérmica mediada por bucle ("LAMP") (ver, por ejemplo, patente de Estados Unidos núm. 6410278). Las reacciones LAMP pueden realizarse isotérmicamente, pero típicamente implican el uso de cuatro cebadores diferentes que reconocen un total de seis secuencias distintas en el ácido nucleico diana.

Algunos métodos de amplificación utilizan ligación de ADN. La ligación de ADN es un método de biología molecular común para unir múltiples fragmentos de ADN. Las ligasas pueden sellar muescas de una sola hebra en el ADN dúplex, unir dos piezas con extremos "pegajosos" complementarios y, en algunos casos, unir dos piezas con extremos romos, no pegajosos. Estos métodos encuentran uso en la clonación molecular, diagnóstico/detección de ácidos nucleicos, amplificación de ácidos nucleicos, y actividades relacionadas. Las ligasas y métodos de ligación se describen, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos núm. 20120214208; patente de Estados Unidos núm. 7, 927, 853; de Lumley y otros, J. Mol. Biol. (2004) 339, 1059-1075; y Rolland y otros, FEMS Microbiol. Lett. (2004) 236, 267-273. El documento núm. WO2011/034449 describe proteínas de fusión entre dominios de unión a ADN y ADN-ligasas capaces de realizar ligaciones de extremos romos. Lauer y otros, (1991), Journal of Bacteriology, 173(3), 5047-5053, describe una ligasa termoestable natural. También el documento núm. WO94/02615 describe tal ligasa termoestable.

La ligación de dos cadenas de ADN con "extremos pegajosos" es posible, donde los sustratos que van a unirse ya se colocaron previamente en el caso del sellado de muescas de una sola cadena, y la afinidad de los extremos pegajosos entre sí ayuda a impulsar la ligación de extremos pegajosos. Sin embargo, dado que la ligación del ADN depende de la yuxtaposición de los dos sustratos que se van a unir, la ligación del ADN es más difícil en situaciones en las que la yuxtaposición de los dos sustratos es más difícil o es probable que las cadenas se desalineen o se separen fácilmente. Por esta razón, las ligaciones de extremos romos y de alta temperatura son dos tipos de ligaciones que son particularmente difíciles. La ligación de extremos romos, sin embargo, depende de interacciones aleatorias de los sustratos. Se suelen realizar dos ajustes en la ligación de extremos romos para impulsar las interacciones del sustrato: baja temperatura para ralentizar el movimiento molecular, de manera que las interacciones aleatorias duren más y, por tanto, le den a la ligasa una mejor oportunidad de unir los fragmentos; y reactivos moleculares de apiñamiento tales como polietilenglicol para incrementar las concentraciones locales de sustratos. Asimismo, las ligaciones a alta temperatura son un desafío porque las interacciones de los sustratos de ADN son más breves. El caso menos eficiente es, por tanto, una ligación de extremos romos a alta temperatura en la que no pueden usarse reactivos de apiñamiento molecular.

Se describió una ligasa termoestable, la ADN ligasa T4, que puede realizar ligaciones de extremos romos; sin embargo, se inactiva a una temperatura superior a aproximadamente 45 °C, de manera que el intervalo de temperatura en el que la ADN ligasa T4 es estable es relativamente pequeño. Se conocen algunos otros ejemplos de ligasas que pueden inducirse a unir fragmentos de extremos romos, pero estas ligasas parecen hacerlo solo en presencia de altas concentraciones de agentes moleculares de apiñamiento tales como polietilenglicol (PEG) al 50 %. Sin embargo, la utilidad de las ligasas que requieren tales agentes moleculares de apiñamiento no está clara, ya que el 50 % de PEG es la polimerización del ADN (que se requiere para la amplificación del ADN).

En consecuencia, para facilitar la generación de ácidos nucleicos amplificados para las numerosas y crecientes aplicaciones que usan ácidos nucleicos amplificados, son convenientes nuevos métodos y reactivos para la amplificación de ácidos nucleicos.

Resumen

La presente invención proporciona un método para realizar una reacción de la ligasa de extremos romos termoestable de acuerdo con la reivindicación 1 y sus reivindicaciones dependientes. Las "modalidades" descritas en los siguientes párrafos no deben considerarse modalidades de la presente invención, a menos que estén dentro del alcance de las reivindicaciones, sino que son aspectos de esta descripción que son útiles para comprender la invención.

Se proporcionan proteínas de fusión que tienen actividad ligasa de extremos romos termoestable. Tales ligasas de extremos romos termoestables son útiles para la amplificación de ADN, secuenciación, producción de ADN recombinante (por ejemplo, como resultado de tales fusiones de extremos romos) y proteínas de fusión recombinantes (por ejemplo, proteínas codificadas por ADN recombinante producido como resultado de tales fusiones de extremos romos), y para otros fines. Muchos esquemas de biología molecular involucran ligasas; tales esquemas se beneficiarían de la capacidad de realizar tales esquemas a temperaturas elevadas. Las ADN ligasas de extremos romos termoestables descritas en el presente documento son adecuadas para su uso en esquemas de ligación que se beneficiarían de al menos una incubación a temperatura elevada, tal como una incubación a aproximadamente 60-65 °C o más, que incluye esquemas de incubación a temperaturas tan altas como aproximadamente 94 °C. Una ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento sería útil para tales esquemas

Además, las ligasas de extremos romos termoestables como se describen en el presente documento pueden permitir la ligación de extremos romos a alta temperatura sin la necesidad de agentes moleculares de apiñamiento. En consecuencia, la ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento puede ser útil para muchos esquemas de ligación-amplificación de ácidos nucleicos, que incluyen los esquemas de ligaciónamplificación de ácidos nucleicos que operan a una temperatura uniforme (por ejemplo, a aproximadamente 60 °C o más), e incluyen esquemas de ligación-amplificación de ácidos nucleicos que requieren ciclos de temperatura tales como ciclos desde, por ejemplo, aproximadamente 94 °C hasta aproximadamente 60 °C (o más) durante uno, dos, tres, o más ciclos. Los esquemas de ligación-amplificación de ácidos nucleicos que pueden beneficiarse del uso de ADN ligasas de extremos romos termoestables descritos en el presente documento también pueden operar a otras temperaturas, por ejemplo, en dependencia de las características de resistencia a la temperatura de las nuevas proteínas de fusión descritas en el presente documento y los requisitos de los diferentes esquemas de ligaciónamplificación de ácidos nucleicos. Las ADN ligasas de extremos romos termoestables descritas en el presente documento brindan la capacidad de usar altas temperaturas en esquemas de ligación-amplificación de ácidos nucleicos y, por lo tanto, permiten una amplificación de la diana de mayor especificidad, por ejemplo, al permitir la desnaturalización por temperatura de las plantillas de ADN bicatenarias, así como la unión de cebadores específicos.

En consecuencia, el solicitante describe una ligasa de ácido nucleico de extremos romos termoestable que comprende una proteína de fusión que comprende una ligasa de ácido nucleico y una proteína de unión a ácido nucleico, en donde dicha ligasa de ácido nucleico de extremos romos termoestable es adecuada para su uso en una reacción de ligación de ácido nucleico de extremos romos realizada a una temperatura elevada. En las modalidades, una temperatura elevada comprende una temperatura de 60 °C o más. En las modalidades, una temperatura elevada comprende una temperatura de aproximadamente 65 °C, o aproximadamente 70 °C, o aproximadamente 75 °C, o aproximadamente 80 °C, o aproximadamente 85 °C, o aproximadamente 90 °C, o aproximadamente 95 °C, o más. El solicitante describe, además, un artículo de fabricación, que comprende tal ligasa de ácido nucleico de extremos romos termoestable, y un recipiente. En las modalidades, el artículo de fabricación comprende, además, un tampón. El solicitante describe, además, un método para ligar ácidos nucleicos de extremos romos a una temperatura elevada, que comprende el uso de una ligasa de ácido nucleico de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento, en donde el uso puede ser a una temperatura de aproximadamente 60 °C o más. El solicitante describe, además, un dispositivo para analizar una muestra que contiene ácidos nucleicos, que comprende una ligasa de ácido nucleico de extremos romos termoestable que comprende una proteína de fusión que comprende una ligasa de ácido nucleico y una proteína de unión a ácido nucleico, en donde dicha ligasa de ácido nucleico de extremos romos termoestable es adecuada para su uso en una reacción de ligación de ácido nucleico de extremos romos realizada a aproximadamente 60 °C o más.

En las modalidades, el solicitante describe en el presente documento una ADN ligasa de extremos romos termoestable que comprende una proteína de fusión que comprende una ADN ligasa y una proteína de unión a ADN, en donde dicha ADN ligasa de extremos romos termoestable es adecuada para su uso en una reacción de ligación de ADN de extremos romos realizada en un temperatura elevada, por ejemplo, a una temperatura de 60 °C o más. En las modalidades, la ADN ligasa de extremos romos termoestable comprende una ADN ligasa T4 con una fusión de p50 N-terminal.

En una modalidad particular, la ADN ligasa de extremos romos termoestable comprende la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1):

mghhhhhhhhhhssghiegrasadgpylqileqpkqrgfrfryvcegpshgglpgasseknkksypqvkicnyvgpak

vivqlvtngknihlhahslvgkhccdgictvtagpkdmvvgfanlgilhvtkkkvfctlcarmtcacirgyiipgllvhpdla ylqacgggdrqlgdrckelirqaalqqtkcmdlswrlmftaflpdstgsftrrlcpwsdaiydskapnasnlkivmidrtag cvtggcdyllcdkvqkddiqirfyccccnggvwcgfgdfsptdvhrqfaivfktpkykdinitkpasvfvqltrksdlctsc pkpflyypeikdkeevqrkrqkgssgtsgggsgggmtleearkrvnelrdliryhnyryyvladpeisdaeydrllrelkele erfpelkspdsptlqvgarpleatfrpvrhptrmysldnafnldelkafeerieralgrkgpfaytvehkvdglsvnlyyeegv lvygatrgdgevgeevtqnlltiptiprrlkgvperlevrgevympieaflrlneeleergerifknpmaaagslrqkdpritak rglratfyalglgleeveregvatqfallhwlkekgfpvehgyaravgaegveavyqdwlkkrralpfeadgvwkldelal wrclgytaraprfaiaykfpacckctrlldwfqvgrtgrvtpvgilcpvflcgscvsrvtlhncsyiccldirigdwvlvhkag gvipcvlrvlkcrrtgccrpirwpctcpccghrllkcgkvhrcpnplcpakrfcairhfasrkamdiqglgcklicrllckglv kdvadlyrlrkcdlvglcmngcksaqnllrqiccskkrglcrllyalglpgvgcvlamlaarfgnmdrllcaslccllcvccvg eltarailetlkdpafrdlvrrlkeagvemeakekggealkgltíVitgelsrpreevkallrrlgakvtdsvsrktsylwgenp gsklekaralgvptlteeelyrlleartgkkaeelv.

Una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento puede comprender una proteína de fusión que comprende un componente seleccionado de un enlazador peptídico, una adición N-terminal, una adición C-terminal, un péptido etiqueta, un D-aminoácido, y un péptido mimético. En las modalidades, una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento comprende una proteína de fusión que comprende un componente seleccionado de un azúcar y un polímero.

En las modalidades, una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento es adecuada para su uso en una reacción de ligación de ADN de extremos romos realizada a aproximadamente 75 °C.

En las modalidades, una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento es capaz de producir concatámeros en múltiples eventos de ligación en una reacción de ligación de ADN de extremos romos realizada a 60 °C o más.

En las modalidades, la ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento es adecuada para su uso en un esquema de amplificación de ácido nucleico que funciona a una temperatura uniforme de 60 °C o más.

En las modalidades, la ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento es adecuada para su uso en un esquema de amplificación de ácido nucleico que comprende ciclos de temperatura. En las modalidades, tal ciclo de temperatura comprende un ciclo de temperatura a temperaturas de 60 °C o más. En las modalidades, dicho ciclo de temperatura comprende un ciclo de temperatura de aproximadamente 94 °C a 60 °C. En las modalidades, tal ciclo de temperatura comprende dos o más ciclos de ciclos de temperatura y, en las modalidades, comprende tres o más ciclos de ciclos de temperatura.

El solicitante describe, además, un método para ligar ADN de extremos romos a temperatura elevada, que comprende usar una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento, en donde el uso puede ser a una temperatura elevada. En las modalidades, una temperatura elevada comprende una temperatura de 60 °C o más. En las modalidades, una temperatura elevada comprende una temperatura de aproximadamente 75 °C; y, en modalidades adicionales, puede comprender una temperatura superior a aproximadamente 75 °C.

El solicitante describe en el presente documento un artículo de fabricación, que comprende una ADN ligasa de extremos romos termoestable y un recipiente, en donde la ADN ligasa de extremos romos termoestable es una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento. El artículo de fabricación comprende, además, un tampón.

El solicitante describe en el presente documento un dispositivo para analizar una muestra que contiene ADN, que comprende una ADN ligasa de extremos romos termoestable, en donde la ADN ligasa de extremos romos termoestable es una ADN ligasa de extremos romos termoestable como se describe en el presente documento.

Breve descripción de la figura

La Figura 1 muestra un ejemplo de los resultados de una reacción de ligación de extremos romos realizada a 75 °C mediante el uso de una ADN ligasa de extremos romos, termoestable como se proporciona en el presente documento. El sustrato de ADN era un ADN dúplex de 49 pb elaborado por hibridación de los oligonucleótidos EE0139 (SEQ ID NO:20) y EE0140 (SEQ ID NO: 21).

Descripción detallada

En el presente documento se proporcionan ligasas de extremos romos termoestables. Como se describe en el presente documento, puede prepararse una ligasa de extremos romos termoestable mediante la fusión de una proteína de unión a ADN con una ligasa termoestable. Tales ligasas producidas por estas fusiones tienen características y capacidades que no proporcionan sus compuestos originales solos; las diferentes porciones de estas proteínas de fusión proporcionan actividades que, cuando se combinan, proporcionan nuevas capacidades y una actividad inesperadamente mejorada. La porción de la proteína de unión a ADN de tales proteínas de fusión es efectiva para aumentar la afinidad de la ligasa por los sustratos del ADN, lo que da como resultado una ligación mejorada en las difíciles condiciones de ligación de extremos romos, a alta temperatura. La porción de ADN ligasa retiene sorprendentemente su capacidad para ligar ADN cuando se combina con una proteína extraña (la porción de proteína de unión a ADN). Juntas, las porciones combinadas se unen en nuevas proteínas de fusión que son capaces de ligar sustratos de ADN de extremos romos incluso a altas temperaturas, y proporcionan una mayor actividad de ligación a altas temperaturas que no está disponible mediante el uso de las ligasas originales no modificadas.

Los métodos, reactivos, dispositivos, sistemas, y artículos de fabricación útiles para la práctica de los métodos y para el uso de reactivos, dispositivos, sistemas, y artículos de fabricación descritos en el presente documento se describen, por ejemplo, en el documento núm. WO 2014/145296.

Definiciones

Antes de que se divulguen y describan las presentes ligasas y métodos de ligación nuevos, debe entenderse que la terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir únicamente modalidades particulares y no pretende ser limitante. También debe entenderse que la presente descripción proporciona descripciones y ejemplos explicativos y ejemplares, de modo que, a menos que se indique lo contrario, las moléculas, composiciones, análisis, métodos, y kits descritos en el presente documento no se limitan a las modalidades específicas descritas en el presente documento.

Debe notarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto lo indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una sal" se refiere a una sola sal o mezclas de diferentes sales, y similares.

Como se usa en la descripción en el presente documento y a lo largo de las reivindicaciones que siguen, el significado de "en" incluye "en" y "sobre" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Como se usa en la descripción en el presente documento y a lo largo de las reivindicaciones que siguen, el significado de "o" incluye tanto el conjuntivo como el disyuntivo a menos que el contexto indique expresamente lo contrario. Por tanto, el término "o" incluye "y/o" a menos que el contexto indique expresamente lo contrario.

En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos, que se definirán para que tengan los siguientes significados:

El término "resto", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier composición particular de materia, por ejemplo, un fragmento molecular, una molécula intacta, o una mezcla de materiales.

El término "ácido nucleico" se refiere a nucleótidos y nucleósidos que componen, por ejemplo, macromoléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN) y macromoléculas de ácido ribonucleico (ARN). Los ácidos nucleicos pueden identificarse por la base unida al azúcar (por ejemplo, desoxirribosa o ribosa); como se usa en el presente documento, las siguientes abreviaturas para estas bases se usan para representar ácidos nucleicos en listados de secuencias que identifican y describen sus estructuras (pueden usarse mayúsculas o minúsculas).

Tabla 1a

Como se usa en el presente documento, un "polinudeótido" se refiere a una cadena polimérica que contiene dos o más nucleótidos. "Polinucleótidos" incluye cebadores, oligonucleótidos, cadenas de ácido nucleico, etcétera. Un polinucleótido puede contener nucleótidos estándar o no estándar. Típicamente, un polinucleótido contiene un fosfato 5' en un extremo ("extremo 5'") y un grupo hidroxilo 3' en el otro extremo ("extremo 3'") de la cadena. El nucleótido más hacia el extremo 5' de un polinucleótido puede denominarse en el presente documento como el "nucleótido terminal 5'" del polinucleótido. El nucleótido más hacia el extremo 3' de un polinucleótido puede denominarse en el presente documento como el "nucleótido terminal 3'" del polinucleótido.

El término "hacia el extremo 3'" como se usa en el presente documento en el contexto de un polinucleótido que contiene un nucleótido terminal 5' y un nucleótido terminal 3' se refiere a una posición en el polinucleótido que está más cerca del nucleótido terminal 3' que una posición de referencia en el polinucleótido. Por ejemplo, en un cebador que tiene la secuencia: 5' ATAAGC 3', la "G" está hacia el extremo 3' de la "T" y de todas las "A".

El término "hacia el extremo 5'" como se usa en el presente documento en el contexto de un polinucleótido que contiene un nucleótido terminal 5' y un nucleótido terminal 3', se refiere a una posición en el polinucleótido que está más cerca del nucleótido terminal 5' que una posición de referencia en el polinucleótido. Por ejemplo, en un cebador que tiene la secuencia: 5' ATAAGC 3', la "T" está hacia el extremo 5' de la "G", la "C", y las dos "A" más cercanas a la "G".

Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" incluye tanto ADN como ARN, que incluyen ADN y ARN que contienen nucleótidos no estándar. Un "ácido nucleico" contiene al menos un polinucleótido (una "cadena de ácido nucleico"). Un "ácido nucleico" puede ser monocatenario o bicatenario.

Como se usa en el presente documento, una molécula de ácido nucleico que se describe como que contiene la "secuencia" de una plantilla u otro ácido nucleico también puede considerarse que contiene la plantilla u otro ácido nucleico en sí mismo (por ejemplo, una molécula que se describe como que contiene la secuencia de una plantilla también puede describirse como que contiene la plantilla), a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Como se usa en el presente documento, un ácido nucleico o molécula "diana" se refiere a un ácido nucleico de interés. Un ácido nucleico/molécula diana puede ser de cualquier tipo, que incluye ADN o ARN monocatenario o bicatenario (por ejemplo, ARNm).

Como se usa en el presente documento, las secuencias "complementarias" se refieren a dos secuencias de nucleótidos que, cuando se alinean en antiparalelo entre sí, contienen múltiples bases de nucleótidos individuales que se emparejan entre sí. No es necesario que cada base de nucleótidos en dos secuencias se empareje entre sí para que las secuencias se consideren "complementarias". Las secuencias pueden considerarse complementarias, por ejemplo, si al menos 30 %, 40 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 %, o 100 % de las bases de nucleótidos en dos secuencias se emparejan entre sí. Además, las secuencias aún pueden considerarse "complementarias" cuando las longitudes totales de las dos secuencias son significativamente diferentes entre sí. Por ejemplo, un cebador de 15 nucleótidos puede considerarse "complementario" a un polinucleótido más largo que contiene cientos de nucleótidos si múltiples bases de nucleótidos individuales del cebador se emparejan con bases de nucleótidos en el polinucleótido más largo cuando el cebador se alinea en sentido antiparalelo a una región particular del polinucleótido más largo.

Como se usa en el presente documento, el término "aislado" aplicado a proteínas, ácidos nucleicos, u otras biomoléculas se refiere a una molécula que se purificó o separó de un componente de su entorno natural (por ejemplo, una proteína purificada de una célula en la que se produjo naturalmente). Una molécula "aislada" puede estar en contacto con otras moléculas (por ejemplo, como parte de una mezcla de reacción). Como se usa en el presente documento, las moléculas "aisladas" también incluyen proteínas o ácidos nucleicos producidos recombinantemente que tienen una secuencia de aminoácidos o nucleótidos que se produce naturalmente. Los ácidos nucleicos "aislados" incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos contenidas en células que normalmente expresan el polipéptido donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una ubicación cromosómica diferente a la de las células naturales. En algunas modalidades, los polipéptidos "aislados" se purifican hasta al menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, o 100 % de homogeneidad como se evidencia por SDS-PAGE de los polipéptidos seguido del método de tinción con azul Coomassie, plata, u otro método de tinción de proteínas.

Los términos "polipéptido" y "proteína" pueden usarse indistintamente para referirse a moléculas compuestas por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Los aminoácidos individuales pueden denominarse "residuos" de un polipéptido o proteína. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos descritos en el presente documento pueden identificarse mediante SEQ ID NO: presentada como una cadena de letras, donde las letras tienen los siguientes significados:

Tabla 1b

Los residuos de aminoácidos de origen natural se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de la cadena lateral:

(1) hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) hidrófilo neutro: cys, ser, thr;

(3) ácido: asp, glu;

(4) básico: asn, gln, his, lys, arg;

(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y

(6) aromático: trp, tyr, phe.

"Idéntico" o "identidad", como se usa en el presente documento en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje específico de residuos que son iguales en una región específica. El porcentaje puede calcularse al alinear óptimamente las dos secuencias, comparar las dos secuencias sobre la región especificada, determinar el número de posiciones en las que ocurre el residuo idéntico en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividir el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la región especificada y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. En los casos en los que las dos secuencias tienen longitudes diferentes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región de comparación especificada incluye solo una secuencia única, los residuos de la secuencia única se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo.

"Homología" u "homóloga" como se usa en el presente documento en el contexto de dos o más secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, puede significar que las secuencias tienen un porcentaje específico de residuos que son i) iguales o ii) sustituciones conservadoras del mismo residuo, sobre una región específica. Las sustituciones conservadoras incluyen sustituciones de un aminoácido por un aminoácido del mismo grupo e incluyen sustituciones de un aminoácido por un aminoácido identificado en la Tabla 1C como una sustitución ejemplar o preferida. Al determinar la homología de dos secuencias, los residuos idénticos y los residuos homólogos reciben el mismo peso. El porcentaje puede calcularse al alinear óptimamente las dos secuencias, comparar las dos secuencias en la región especificada, determinar el número de posiciones en las que se producen residuos idénticos u homólogos en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes posiciones por el número total de posiciones en la región especificada, y multiplicar el resultado por 100 para obtener el porcentaje de homología de secuencia. En los casos en los que las dos secuencias tienen longitudes diferentes o la alineación produce uno o más extremos escalonados y la región de comparación especificada incluye solo una secuencia única, los residuos de la secuencia única se incluyen en el denominador pero no en el numerador del cálculo.

Pueden prepararse polipéptidos variantes o modificados mediante la sustitución de uno o más residuos de aminoácidos por uno o más residuos de aminoácidos diferentes en la secuencia de aminoácidos del polipéptido. Las sustituciones conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de un grupo por otro miembro del mismo grupo; tales cambios tienden a no afectar significativamente la función de un polipéptido. Las sustituciones no conservadoras implicarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro grupo. Pueden lograrse modificaciones sustanciales de polipéptidos sin afectar significativamente las características funcionales de un polipéptido mediante la selección de sustituciones que mantengan una o más de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.

En modalidades particulares, las sustituciones conservadoras de interés se muestran en la Tabla 1C bajo los títulos de "sustituciones ejemplares" y "sustituciones preferidas". Tales sustituciones conservadoras pueden no dar como resultado cambios significativos en la actividad biológica.

Tabla 1c

Pueden realizarse más sustituciones y pueden identificarse sustituciones adecuadas mediante análisis de escaneo de aminoácidos, en el que se reemplaza un único aminoácido, o muy pocos aminoácidos, de una secuencia inicial. Entre los aminoácidos de escaneo preferidos se encuentran los aminoácidos neutros relativamente pequeños. Tales aminoácidos incluyen alanina, glicina, serina, y cisteína. La alanina es típicamente un aminoácido de escaneo preferido entre este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante [Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)].

Además, uno o más aminoácidos en una secuencia pueden sustituirse por un aminoácido no convencional. Los reemplazos conservadores que comprenden aminoácidos no convencionales sustituyen el aminoácido original con un aminoácido no convencional que se asemeja al original en una o más de sus propiedades características (por ejemplo, carga, hidrofobicidad, volumen esteárico; por ejemplo, puede reemplazarse Val con Nval). El término "aminoácido no convencional" se refiere a aminoácidos distintos de los aminoácidos convencionales e incluye, por ejemplo, isómeros y modificaciones de los aminoácidos convencionales (por ejemplo, D-aminoácidos), aminoácidos no proteicos, aminoácidos modificados postraduccionalmente, aminoácidos modificados enzimáticamente, construcciones o estructuras diseñadas para imitar aminoácidos (por ejemplo, .alfa., aminoácidos .alfa.-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, .beta.-alanina, naftilalanina, 3-piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, y norleucina), y péptidos que tienen el enlace amida --CONH-- natural reemplazado en uno o más sitios dentro de la cadena principal del péptido con un enlace no convencional tal como amida N-sustituida, éster, tioamida, retropéptido (--NHCO--), retrotioamida (--NHCS--), sulfonamido (--SO.sub.2 NH--), y/o enlaces peptoides (glicina N-sustituida).

Las proteínas homólogas y otras variantes de proteínas pueden proporcionarse por sustitución, inserción, deleción, o adición. Tal sustitución, inserción, deleción o adición puede incluir sustitución, inserción, deleción, o adición de un solo residuo; puede incluir sustitución, inserción, deleción, o adición de dos residuos; y puede incluir sustitución, inserción, deleción, o adición de tres o más residuos. Por ejemplo, la sustitución puede incluir reemplazar uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más residuos de aminoácidos por un residuo diferente. La sustitución puede ser, o puede incluir, una sustitución conservadora. Por ejemplo, la inserción puede incluir insertar uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más residuos de aminoácidos en una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la deleción puede incluir eliminar uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, la adición puede incluir la adición de uno, dos, tres, cuatro, cinco, o más residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal, en el extremo C-terminal, o ambos, de una secuencia de aminoácidos.

Una composición puede incluir un tampón. Los tampones incluyen, sin limitación, tampón fosfato, citrato, amonio, acetato, carbonato, tris(hidroximetil)aminometano (TRIS), ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS), ácido 3-morfolino-2-hidroxipropanosulfónico (MOPSO), ácido 2-(A/-morfolino)etanosulfónico (MES), ácido N-(2-acetamido)-iminodiacético (ADA), piperazin-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico) (PIPES), ácido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfónico (ACES), cloruro de colamina, ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico (BES), ácido 2-[[1,3-dihidroxi-2-(hidroximetil)propan-2-il]amino]etanosulfónico (TES), ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazin etanosulfónico (HEPES), acetamidoglicina, tricin (N-(2-hidroxi-1,1-bis(hidroximetil)etil)glicina), glicinamida, y bicin (ácido 2-(bis(2-hidroxietil)amino)acético). Los tampones incluyen otros tampones de ácidos orgánicos además de los tampones de fosfato, citrato, amonio, acetato, y carbonato mencionados explícitamente en el presente documento. Un artículo de fabricación puede comprender un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende una ligasa termoestable. Un artículo de fabricación puede comprender un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende una ligasa de extremos romos. Un artículo de fabricación puede comprender un recipiente; y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición comprende una ligasa de extremos romos termoestable. Los recipientes pueden formarse por una diversidad de materiales tales como vidrio o plástico, y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El artículo de fabricación puede comprender, además, una etiqueta o prospecto sobre o asociado con el recipiente que indica que la composición puede usarse para ligar ADN de extremos romos.

Las modalidades de los métodos proporcionados en el presente documento pueden describirse con referencia a la Figura 1.

Las nuevas ADN ligasas termoestables de extremos romos descritas en el presente documento comprenden la fusión de una proteína de unión a ADN con una ligasa termoestable. Tales proteínas de fusión como se describen en el presente documento pueden comprender, además, otros componentes, tales como, por ejemplo, enlazadores peptídicos, adiciones N-terminales o C-terminales, péptidos etiqueta, y otras secuencias de aminoácidos, que incluyen D-aminoácidos y miméticos de péptidos. Además, la proteína de fusión como se describe en el presente documento puede comprender, además, otros componentes, tales como, por ejemplo, azúcares (por ejemplo, las proteínas de fusión pueden glicosilarse), polímeros tales como polietilenglicol (por ejemplo, las proteínas de fusión pueden PEGilarse), restos orgánicos distintos de los aminoácidos, y otras adiciones vinculadas a las proteínas de fusión. La porción de la proteína de unión a ADN aumenta la afinidad de la ligasa por los sustratos del ADN, lo que da como resultado una ligación mejorada en las difíciles condiciones de ligación de extremos romos a alta temperatura. Son posibles muchas combinaciones de proteínas de unión y ligasas. Por ejemplo, la proteína de unión puede ser N-terminal o C-terminal con respecto a la ligasa.

Se entenderá que pueden unirse múltiples combinaciones de ADN ligasas y proteínas de unión a ADN para producir las proteínas de fusión descritas en el presente documento. Por ejemplo, se construyeron las siguientes 16 combinaciones (Tabla 2):

Tabla 2

Proteínas de fusión construidas

construcción N-terminal C -terminal

pEE0208 CTF T4

pEE0209 CTF Tth

pEE0210 CTF Pfu

pEE0211 CTF Pfu

pEE0212 T4 CTF

pEE0213 Tth CTF

pEE0214 Pfu CTF

pEE0215 Pfu CTF

pEE0216 p50 T4

pEE0217 p50 Tth

pEE0218 p50 Pfu

pEE0219 p50 Pfu

pEE0220 T4 p50

pEE0221 Tth p50

pEE0222 Pfu p50

pEE0223 Pfu

p50

*Las celdas que carecen de un color de fondo se refieren a la proteína de unión a ADN. Las descripciones de CTF y p50 se dan más abajo.

*Las celdas que tienen un fondo gris se refieren a la ligasa. T4=fago T4, Tth=Thermus thermophilus, Pfu=Pyrococcus furiosus, Pfu C23=Pfu con una deleción C-terminal de 23 aminoácidos.

Son posibles variaciones adicionales, que incluyen: (1) diferentes proteínas de unión a ADN, que incluyen proteínas termoestables; (2) otras ADN ligasas, que incluyen variantes de ADN ligasa T4 diseñadas para ser termoestables; (3) múltiples proteínas de unión a ADN por ligasa, o múltiples ligasas por proteína de unión a ADN; (4) enlaces no covalentes, transitorios entre la ligasa y la proteína de unión a ADN, en lugar de una fusión de proteínas, para permitir mejor múltiples eventos de ligación por molécula de ligasa; (5) dímeros o multímeros de orden superior de proteínas de fusión para aumentar la concentración local de ligasa una vez que se unen los sustratos de ADN; (6) diferentes grados de afinidad entre el sustrato de ADN y la proteína de unión a ADN, por ejemplo, mediante el uso de la secuencia diana natural de p50, GGGAATTCCC (SEQ ID NO: 6), en la diana de ADN, para permitir una afinidad picomolar baja; (7) otras enzimas modificadoras de ácidos nucleicos en lugar de la ADN ligasa para realizar otras reacciones moleculares.

Un método ejemplar para producir las proteínas de fusión descritas en el presente documento puede ser el siguiente. Las proteínas de fusión pueden prepararse mediante la inducción de E. coli para que exprese construcciones de ADN preparadas mediante métodos estándar de ADN recombinante, seguidos de métodos cromatográficos estándar de purificación de proteínas. Puede emplearse una etiqueta de afinidad tal como polihistidina para ayudar en la purificación de proteínas. En el caso de las proteínas termoestables, la purificación puede ser asistida mediante el empleo de calor para desnaturalizar la mayoría de las proteínas del huésped E. coli. La proteína de fusión purificada puede usarse de la misma manera que se usaría una ligasa estándar no termoestable en la aplicación/reacción de elección, por ejemplo, en un esquema que depende de la ligación de sustratos de ADN para hacer una plantilla para amplificación.

Los métodos descritos en el presente documento pueden incorporarse y usarse fácilmente en un dispositivo para procesar una muestra, o un sistema para procesar una muestra, que puede ser un dispositivo de análisis automatizado, o puede ser un sistema de análisis automatizado. Tales dispositivos de análisis y sistemas de análisis pueden comprender dispositivos y sistemas descritos, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos núm.

8,088,593; patente de Estados Unidos núm. 8,380,541; publicación de patente de Estados Unidos Núm. US 2013/0166343; documento núm. WO 2013/052318A1, presentado el 25 de septiembre de 2012; publicación de patente de Estados Unidos Núm. US 2013/0078624, presentada el 26 de septiembre de 2011; y documento núm. WO 2014/015199, presentado el 26 de septiembre de 2011.

Los dispositivos de análisis y los sistemas de análisis, que incluyen los dispositivos para procesar una muestra y los sistemas para procesar una muestra, que pueden ser dispositivos de análisis automatizados y sistemas de análisis automatizados, pueden ubicarse y pueden usarse en un lugar de punto de atención médica, y pueden ubicarse y pueden usarse en una pluralidad de lugares de puntos de atención médica. Los dispositivos de análisis y los sistemas de análisis, que incluyen los dispositivos para procesar una muestra y los sistemas para procesar una muestra, que pueden ser dispositivos de análisis automatizados y sistemas de análisis automatizados, pueden ubicarse y pueden usarse en un lugar de punto de atención médica, y pueden ubicarse y pueden usarse en una pluralidad de lugares de puntos de servicios.

Un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar análisis y mediciones como se describe en el presente documento puede ubicarse, y puede realizar tales análisis y mediciones, en un lugar de punto de atención médica, un lugar de punto de servicios, u otro lugar. Puede ubicarse un sistema de procesamiento de muestras para realizar análisis y mediciones como se describe en el presente documento, y pueden realizarse tales análisis y mediciones, en un lugar de punto de atención médica, un lugar de punto de servicios, u otro lugar.

Un sistema de puntos de atención médica puede usarse en un lugar de punto de servicios, tal como un lugar de un sujeto (por ejemplo, hogar o negocio o evento deportivo o control de seguridad o lugar de combate), el lugar de un proveedor de atención médica (por ejemplo, médico), una farmacia o minorista, una clínica, un hospital, una sala de emergencias, un hogar de ancianos, un centro de cuidados paliativos, o un laboratorio. Una minorista puede ser una farmacia (por ejemplo, farmacia minorista, farmacia clínica, farmacia hospitalaria), droguería, cadena de tiendas, supermercado, o tienda de comestibles. Los ejemplos de minoristas pueden incluir, entre otros, Walgreen's, CVS Pharmacy, Duane Reade, Walmart, Target, Rite Aid, Kroger, Costco, Kaiser Permanente o Sears. En algunas situaciones, un sistema de puntos de servicios (que incluye, entre otros, un sistema de atención médica) se implementa en cualquier lugar designado para su uso por una entidad certificadora u otorgante de licencias (por ejemplo, una entidad certificadora gubernamental). En otras situaciones, un sistema de puntos de servicios puede usarse o integrarse en un vehículo de transporte, tal como un automóvil, bote, camión, autobús, avión, motocicleta, camioneta, vehículo médico en viaje, unidad móvil, ambulancia, camión/máquina de bomberos, vehículo de cuidados intensivos, u otro vehículo configurado para transportar a un sujeto de un lugar a otro. Un sitio de recolección de muestras puede estar en un sitio de adquisición de muestras y/o evaluaciones de salud y/o lugares de tratamiento (que pueden incluir cualquiera de los sitios de recolección de muestras descritos en otras partes del presente documento, que incluyen, entre otros, salas de emergencia, consultorios médicos, atención de urgencia, tiendas de campaña para detección (que pueden estar en lugares remotos), un profesional de la salud que ingresa a la casa de alguien para brindar atención domiciliaria).

El sistema (dispositivo) o una combinación de sistemas (dispositivos) puede ubicarse/colocarse en puntos estratégicos de lugares de servicio. Los lugares pueden seleccionarse y optimizarse en función de una diversidad de objetivos, tales como, entre otros, la prevalencia de la enfermedad, tasas de desarrollo de la enfermedad, tasas de enfermedad proyectadas, riesgo estimado de brotes, demografía de la población, políticas y regulaciones gubernamentales, preferencias del cliente, médico y paciente, acceso a otras tecnologías en dichos lugares, estimaciones de seguridad y riesgo, amenazas a la seguridad, etc. Los dispositivos pueden reubicarse periódicamente para mejorar la utilidad general de manera frecuente, tal como diariamente, semanalmente, mensualmente, anualmente, etc. Los sistemas pueden actualizarse para mejorar el rendimiento y/o adicionar funcionalidad. Los sistemas pueden actualizarse módulo por módulo. Las actualizaciones del sistema pueden ocurrir a través de hardware y/o software. Los sistemas pueden actualizarse con un tiempo de inactividad mínimo a través de características que permiten la extracción e inserción de hojas y/o módulos.

Adicionalmente, un lugar de punto de servicios donde una muestra puede ser recolectada de un sujeto o proporcionada por un sujeto puede ser un lugar remoto a un laboratorio de análisis. El sitio de recolección de muestras puede tener una instalación separada del laboratorio. La muestra puede o no recolectarse fresca del sujeto en el lugar del punto de servicio. Alternativamente, la muestra puede recolectarse del sujeto en otro lugar y llevarse al lugar del punto de servicio. En algunas modalidades, no se proporciona ninguna etapa de preparación de la muestra en la muestra antes de proporcionarla al dispositivo. Por ejemplo, no es necesario preparar ningún portaobjetos antes de proporcionar una muestra al dispositivo. Alternativamente, pueden realizarse una o más etapas de preparación de la muestra en la muestra antes de proporcionarla al dispositivo.

Un sitio de recolección de muestras en un lugar de punto de servicio puede ser un centro de recolección de sangre o cualquier otro centro de recolección de fluidos corporales. El sitio de recolección de muestras puede ser un centro de recolección de muestras biológicas. En algunas modalidades, un sitio de recolección de muestras puede ser una minorista. Otros ejemplos de sitios de recolección de muestras pueden incluir hospitales, clínicas, oficinas de profesionales de la salud, escuelas, guarderías, centros de salud, residencias de vida asistida, oficinas gubernamentales, unidades de atención médica ambulantes, o el hogar. Por ejemplo, un sitio de recolección de muestras puede ser el hogar de un sujeto. Un sitio de recolección de muestras puede ser cualquier lugar donde el dispositivo reciba una muestra del sujeto. Un sitio de recolección puede ser un lugar en movimiento, como en o con un paciente o en una unidad móvil o vehículo o con un médico que viaja. Cualquier lugar puede designarse como sitio de recolección de muestras. La designación puede realizarla cualquier parte, que incluye, entre otras el laboratorio, entidad asociada con el laboratorio, agencia gubernamental u organismo regulador. Cualquier descripción en el presente documento relacionada con el sitio de recolección de muestras o el lugar de punto de servicios puede relacionarse o aplicarse a minoristas, hospitales, clínicas o cualquier otro ejemplo proporcionado en el presente documento y viceversa.

Un dispositivo puede ser parte de un sistema, un componente del cual puede ser un dispositivo de procesamiento de muestras. Un dispositivo puede ser un dispositivo de procesamiento de muestras. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para facilitar la recolección de una muestra, preparar una muestra para una prueba clínica, o realizar una reacción química con uno o más reactivos u otro procesamiento químico o físico, como se describe en el presente documento. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para obtener datos de una muestra. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para transmitir datos obtenidos de una muestra. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para analizar datos de una muestra. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para comunicarse con otro dispositivo, o un laboratorio, o una persona afiliada a un laboratorio, para analizar los datos obtenidos de una muestra.

Los sistemas de puntos de servicios descritos en el presente documento se configuran para procesar muestras en un lugar donde el usuario puede acceder al sistema de puntos de servicios. En un ejemplo, un sistema de puntos de servicios se ubica en el hogar de un sujeto y se recolecta una muestra de un sujeto y se procesa en el hogar del sujeto. En otro ejemplo, un sistema de puntos de servicios se ubica en una farmacia y se toma una muestra de un sujeto y se procesa en la farmacia. En otro ejemplo, un sistema de puntos de servicios se ubica en el lugar de un proveedor de atención médica (por ejemplo, el consultorio del médico) y se toma una muestra de un sujeto y se procesa en el lugar del proveedor de atención médica. En otro ejemplo, un sistema de puntos de servicios se ubica a bordo de un sistema de transporte (por ejemplo, un vehículo) y se recolecta una muestra de un sujeto y se procesa en el sistema de transporte.

En algunos ejemplos, el análisis del procesamiento posterior a la muestra, que incluye el diagnóstico y/o el tratamiento, lo realiza el sistema de puntos de servicios en el lugar del sistema de puntos de servicios. En otros ejemplos, el análisis posterior al procesamiento de la muestra se realiza de forma remota desde un lugar en el que se recolecta y procesa una muestra. En un ejemplo, el análisis posterior al procesamiento de la muestra se realiza en el lugar de un proveedor de atención médica. En otro ejemplo, el análisis de procesamiento posterior a la muestra se realiza en el lugar de un sistema de procesamiento. En otro ejemplo, el análisis del procesamiento posterior a la muestra se realiza en un servidor (por ejemplo, en la nube).

El análisis posterior al muestreo puede realizarse en un laboratorio o por una entidad afiliada a un laboratorio. Un laboratorio puede ser una entidad o instalación capaz de realizar una prueba clínica o analizar los datos recopilados. Un laboratorio puede proporcionar condiciones controladas en las que pueden realizarse investigaciones científicas, experimentos, y mediciones. El laboratorio puede ser un laboratorio médico o un laboratorio clínico donde pueden realizarse pruebas en muestras clínicas, o pueden realizarse análisis de datos recopilados de muestras clínicas, con el fin de obtener información sobre la salud de un paciente en lo que respecta al diagnóstico, pronóstico, y tratamiento y/o prevención de enfermedades. Una muestra clínica puede ser una muestra obtenida de un sujeto. Preferentemente, puede recolectarse una muestra clínica del sujeto en un sitio de recolección de muestras que esté en una instalación separada del laboratorio, como se describe con más detalle en otra parte del presente documento. La muestra clínica puede recolectarse del sujeto mediante el uso de un dispositivo, que se coloca en un sitio de recolección de muestras designado o en el sujeto.

Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para colocarse en o sobre un sujeto. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para aceptar una muestra de un sujeto, ya sea directa o indirectamente. Una muestra puede ser, por ejemplo, una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra obtenida de una punción en el dedo, o de una venopunción, o una muestra de sangre arterial), una muestra de orina, una muestra de biopsia, un corte de tejido, una muestra de heces u otra muestra biológica; una muestra de agua, una muestra de suelo, una muestra de un alimento, una muestra de aire; u otra muestra. Una muestra de sangre puede comprender, por ejemplo, sangre total, plasma, o suero. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede recibir una muestra del sujeto a través de una carcasa del dispositivo. La recolección de muestras puede ocurrir en un sitio de recolección de muestras, o en otro lugar. La muestra puede proporcionarse al dispositivo en un sitio de recolección de muestras.

En algunos ejemplos, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para aceptar o contener un cartucho. En algunos ejemplos, un dispositivo de procesamiento de muestras puede comprender un cartucho. El cartucho puede extraerse del dispositivo de procesamiento de muestras. En algunos ejemplos, puede proporcionarse una muestra al cartucho del dispositivo de procesamiento de muestras. Alternativamente, puede proporcionarse una muestra a otra parte de un dispositivo de procesamiento de muestras. El cartucho y/o dispositivo puede comprender una unidad de recolección de muestras que puede configurarse para aceptar una muestra.

Un cartucho puede incluir una muestra y puede incluir reactivos para su uso en el procesamiento o análisis de una muestra, desechables para su uso en el procesamiento o análisis de una muestra, u otros materiales. Después de la colocación de un cartucho, o la inserción de un cartucho, en un dispositivo de procesamiento de muestras, uno o más componentes del cartucho pueden ponerse en comunicación continua con otros componentes del dispositivo de procesamiento de muestras. Por ejemplo, si se recolecta una muestra en un cartucho, la muestra puede transferirse a otras partes del dispositivo de procesamiento de muestras. Similarmente, si se proporcionan uno o más reactivos en un cartucho, los reactivos pueden transferirse a otras partes del dispositivo de procesamiento de muestras, o pueden llevarse otros componentes del dispositivo de procesamiento de muestras a los reactivos. En algunos ejemplos, los reactivos o componentes de un cartucho pueden permanecer en el cartucho. En algunos ejemplos, no se incluyen líquidos que requieran tuberías o que requieran mantenimiento (por ejemplo, mantenimiento manual o automatizado).

Puede transferirse una muestra o un reactivo a un dispositivo, tal como un dispositivo de procesamiento de muestras. Puede transferirse una muestra o reactivo dentro de un dispositivo. Tal transferencia de muestra o reactivo puede lograrse sin proporcionar una vía de líquidos continua desde el cartucho al dispositivo. Tal transferencia de muestra o reactivo puede realizarse sin proporcionar una vía de líquidos continua dentro de un dispositivo. En ejemplos, tal transferencia de muestra o reactivo puede realizarse mediante un sistema de manipulación de muestras (por ejemplo, una pipeta); por ejemplo, una muestra, reactivo, o alícuota de estos puede aspirarse hacia un componente de transferencia de punta abierta, tal como una punta de pipeta, que puede conectarse operativamente a una unidad móvil que transfiere la punta, con la muestra, reactivo, o alícuota de estos contenida dentro de la punta, a una ubicación sobre o dentro del dispositivo de procesamiento de muestras. En algunos ejemplos, puede insertarse una punta del sistema de manipulación de muestras, al menos parcialmente, en el recipiente y/o cavidad de la muestra. La punta puede insertarse y retirarse del recipiente de muestra y/o la cavidad. La muestra, reactivo, o alícuota de estos puede depositarse en un lugar sobre o dentro del dispositivo de procesamiento de muestras. La muestra y el reactivo, o los reactivos múltiples, pueden mezclarse mediante el uso de un sistema de manipulación de muestras de manera similar. Uno o más componentes del cartucho pueden transferirse de forma automatizada a otras partes del dispositivo de procesamiento de muestras, y viceversa.

Un dispositivo, tal como un dispositivo de procesamiento de muestras, puede tener un sistema de manipulación de líquidos (que puede ser parte de un sistema de manejo de muestras). Un sistema de manipulación de líquidos puede realizar, o puede ayudar a realizar, transportar, diluir, extraer, dividir en alícuotas, mezclar, y otras acciones con un líquido, tal como una muestra. En algunos ejemplos, un sistema de manipulación de líquidos puede contenerse dentro de una carcasa del dispositivo. Un sistema de manipulación de líquidos puede permitir la recolección, entrega, procesamiento y/o transporte de un líquido, disolución de reactivos secos, mezcla de reactivos líquidos y/o secos con un líquido, así como la recolección, entrega, procesamiento y/o transporte de componentes, muestras, o materiales no líquidos. El líquido puede ser una muestra, un reactivo, diluyente, lavado, colorante, o cualquier otro líquido que pueda usarse por el dispositivo y puede incluir, entre otros, líquidos homogéneos, líquidos diferentes, emulsiones, suspensiones, y otros líquidos. También puede usarse un sistema de manipulación de líquidos, que incluye, entre otros, una pipeta, para transportar recipientes (con o sin líquido contenido en ellos) alrededor del dispositivo. El sistema de manipulación de líquidos puede dispensar o aspirar un líquido. La muestra puede incluir una o más partículas o materia sólida que flotan dentro de un líquido.

En ejemplos, un sistema de manipulación de líquidos puede comprender una pipeta, punta de pipeta, jeringa, capilar, u otro componente. El sistema de manipulación de líquidos puede tener una porción con una superficie interior y una superficie exterior y un extremo abierto. El sistema de manipulación de líquidos puede comprender una pipeta, que puede incluir un cuerpo de pipeta y una boquilla de pipeta, y puede comprender una punta de pipeta. La punta de una pipeta puede o no ser extraíble de una boquilla de pipeta. En las modalidades, un sistema de manipulación de líquidos puede usar una pipeta acoplada con una punta de pipeta; una punta de pipeta puede ser desechable. Una punta puede formar un sello hermético a los líquidos cuando se acopla con una pipeta. Una punta de pipeta puede usarse una, dos, o más veces. En las modalidades, un sistema de manipulación de líquidos puede usar una pipeta o dispositivo similar, con o sin punta de pipeta, para aspirar, dispensar, mezclar, transportar, o manipular el líquido de cualquier otra manera. El líquido puede dispensarse desde el sistema de manipulación de líquidos cuando sea conveniente. El líquido puede contenerse dentro de la punta de una pipeta antes de dispensarse, por ejemplo, desde un orificio en la punta de la pipeta. En las modalidades, o casos durante el uso, puede dispensarse todo el líquido; en otras modalidades, o casos durante el uso, puede dispensarse una porción del líquido dentro de una punta. Una pipeta puede aspirar selectivamente un líquido. La pipeta puede aspirar una determinada cantidad de líquido. La pipeta puede ser capaz de accionar mecanismos de agitación para mezclar el líquido dentro de la punta o dentro de un recipiente. La pipeta puede incorporar puntas o recipientes que creen bucles de flujo continuo para mezclar, incluidos materiales o reactivos que no están en forma líquida. Una punta de pipeta también puede facilitar la mezcla mediante el suministro medido de múltiples líquidos simultáneamente o en secuencia, tal como en reacciones de sustratos en 2 partes.

El sistema de manipulación de líquidos puede incluir una o más unidades hidráulicamente independientes o aisladas de forma continua. Por ejemplo, el sistema de manipulación de líquidos puede incluir una, dos, o más puntas de pipeta. Las puntas de pipeta pueden configurarse para aceptar y confinar un líquido. Las puntas pueden aislarse de forma continua o ser independientes hidráulicamente entre sí. El líquido contenido dentro de cada punta puede aislarse de forma fluida o independiente hidráulicamente de los líquidos en otras puntas y de otros líquidos dentro del dispositivo. Las unidades hidráulicamente independientes o aisladas de forma continua pueden ser móviles con respecto a otras partes del dispositivo y/o entre sí. Las unidades hidráulicamente independientes o aisladas de forma continua pueden moverse individualmente. Un sistema de manipulación de líquidos puede comprender una o más bases o soportes. Una base o soporte puede soportar una o más pipetas o unidades de pipetas. Una base o soporte puede conectar una o más pipetas del sistema de manipulación de líquidos entre sí.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar etapas o acciones de procesamiento en una muestra obtenida de un sujeto. El procesamiento de la muestra puede incluir la preparación de la muestra, que incluye, por ejemplo, dilución de la muestra, división de una muestra en alícuotas, extracción, contacto con un reactivo, filtración, separación, centrifugación, u otra acción o etapa de preparación o procesamiento. Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para realizar una o más acciones o etapas de preparación de muestras en la muestra. Opcionalmente, puede prepararse una muestra para una reacción química y/o una etapa de procesamiento físico. Una acción o etapa de preparación de la muestra puede incluir uno o más de los siguientes: centrifugación, separación, filtración, dilución, enriquecimiento, purificación, precipitación, incubación, pipeteo, transporte, cromatografía, lisis celular, citometría, pulverización, trituración, activación, ultrasonidos, procesamiento de microcolumnas, procesamiento con perlas magnéticas, procesamiento con nanopartículas, u otras acciones o etapas de preparación de muestras. Por ejemplo, la preparación de la muestra puede incluir una o más etapas para separar la sangre en suero y/o fracciones de partículas, o para separar cualquier otra muestra en varios componentes. La preparación de la muestra puede incluir una o más etapas para diluir y/o concentrar una muestra, tal como una muestra de sangre, u otras muestras biológicas. La preparación de la muestra puede incluir la adición de un anticoagulante u otros ingredientes a una muestra. La preparación de la muestra también puede incluir la purificación de una muestra. En ejemplos, todas las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de las muestras se realizan mediante un solo dispositivo. En ejemplos, todas las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de las muestras se realizan dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, la mayoría de las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras se realizan mediante un solo dispositivo, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, muchas acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras se realizan mediante un solo dispositivo, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En las modalidades, las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de la muestra pueden realizarse mediante más de un dispositivo.

Puede configurarse un dispositivo de procesamiento de muestras para ejecutar uno o más análisis en una muestra, y para obtener datos de la muestra. Un análisis puede incluir uno o más tratamientos físicos o químicos, y puede incluir ejecutar una o más reacciones químicas o físicas. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para que realice uno, dos o más análisis en una pequeña muestra de líquido corporal. Una o más reacciones químicas pueden tener lugar en una muestra que tiene un volumen, como se describe en otra parte del presente documento. Por ejemplo, una o más reacciones químicas pueden tener lugar en una cápsula que tiene volúmenes inferiores a femtolitros. En un caso, la unidad de recolección de muestras se configura para recibir un volumen de la muestra de fluido corporal equivalente a una sola gota o menos de sangre o líquido intersticial. En ejemplos, el volumen de una muestra puede ser un volumen pequeño, donde un volumen pequeño puede ser un volumen menor que aproximadamente 1000 pl, o menor que aproximadamente 50o pl, o menor que aproximadamente 250 pl, o menor que aproximadamente 150 pl, o menor que aproximadamente 100 pl, o menor que aproximadamente 75 pl, o menor que aproximadamente 50 pl, o menor que aproximadamente 40 pl, o menor que aproximadamente 20 pl, o menor que aproximadamente 10 pl, u otro volumen pequeño. En ejemplos, todas las acciones o etapas del análisis de muestras se realizan en una sola muestra. En ejemplos, todas las acciones o etapas del análisis de muestras se realizan mediante un solo dispositivo. En ejemplos, todas las acciones o etapas de análisis de muestras se realizan dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, la mayoría de las acciones o etapas de análisis de muestras se realizan mediante un solo dispositivo y pueden realizarse dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, muchas acciones o etapas de análisis de muestras se realizan mediante un solo dispositivo y pueden realizarse dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras pueden realizarse en más de un dispositivo.

Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para realizar una pluralidad de análisis en una muestra. En ejemplos, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para realizar una pluralidad de análisis en una sola muestra. En ejemplos, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para realizar una pluralidad de análisis en una sola muestra, donde la muestra es una muestra pequeña. Por ejemplo, una muestra pequeña puede tener un volumen de muestra que es un volumen pequeño menor que aproximadamente 1000 pl, o menor que aproximadamente 500 pl, o menor que aproximadamente 250 pl, o menor que aproximadamente 150 pl, o menor que aproximadamente 100 pl, o menor que aproximadamente 75 pl, o menor que aproximadamente 50 pl, o menor que aproximadamente 40 pl, o menor que aproximadamente 20 pl, o menor que aproximadamente 10 pl, u otro volumen pequeño. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede ser capaz de realizar múltiples análisis en una sola muestra. Pueden realizarse varios análisis simultáneamente; pueden ejecutarse secuencialmente; o algunos análisis pueden realizarse simultáneamente mientras que otros se realizan secuencialmente. También pueden incorporarse al dispositivo uno o más análisis de control y/o calibradores (por ejemplo, que incluyen una configuración con un control de un calibrador para el análisis/pruebas); los análisis de control y los análisis de calibradores pueden realizarse simultáneamente con análisis realizados en una muestra, o pueden realizarse antes o después de los análisis realizados sobre una muestra, o cualquier combinación de estos. En ejemplos, todas las acciones o etapas del análisis de muestras se realizan mediante un solo dispositivo. En ejemplos, la totalidad de una pluralidad de acciones o etapas de análisis se realizan dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, la mayoría de las acciones o etapas de análisis de muestras, de una pluralidad de análisis, se realizan mediante un solo dispositivo, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, muchas acciones o etapas de análisis de muestras, de una pluralidad de análisis, se realizan mediante un solo dispositivo, y pueden realizarse dentro de una carcasa de un solo dispositivo. En ejemplos, las acciones o etapas de procesamiento, preparación o análisis de muestras pueden realizarse en más de un dispositivo.

En ejemplos, la totalidad de una pluralidad de análisis puede realizarse en un período de tiempo corto. En ejemplos, tal período de tiempo corto comprende menos de aproximadamente tres horas, o menos de aproximadamente dos horas, o menos de aproximadamente una hora, o menos de aproximadamente 40 minutos, o menos de aproximadamente 30 minutos, o menos de aproximadamente 25 minutos, o menos de aproximadamente 20 minutos, o menos de aproximadamente 15 minutos, o menos de aproximadamente 10 minutos, o menos de aproximadamente 5 minutos, o menos de aproximadamente 4 minutos, o menos de aproximadamente 3 minutos, o menos de aproximadamente 2 minutos, o menos de aproximadamente 1 minuto, u otro período de tiempo corto.

Un dispositivo puede ser capaz de realizar todas las etapas en el equipo (por ejemplo, etapas o acciones realizadas por un solo dispositivo) en un corto período de tiempo. Un dispositivo puede ser capaz de realizar todas las etapas en el equipo en una sola muestra en un corto período de tiempo. Por ejemplo, desde la recolección de la muestra de un sujeto hasta la transmisión de datos y/o el análisis puede tomar aproximadamente 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, 50 minutos o menos, 45 minutos o menos, 40 minutos o menos, 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos, o 1 minuto o menos. La cantidad de tiempo desde la aceptación de una muestra dentro del dispositivo hasta la transmisión de datos y/o el análisis desde el dispositivo con respecto a tal muestra puede depender del tipo o número de etapas, pruebas o análisis realizados en la muestra. La cantidad de tiempo desde la aceptación de una muestra dentro del dispositivo hasta la transmisión de datos y/o el análisis desde el dispositivo con respecto a tal muestra puede tomar aproximadamente 3 horas o menos, 2 horas o menos, 1 hora o menos, 50 minutos o menos, 45 minutos o menos, 40 minutos o menos, 30 minutos o menos, 20 minutos o menos, 15 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 4 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos, o 1 minuto o menos.

Un dispositivo o sistema como se describe en el presente documento, tal como, por ejemplo, un dispositivo de punto de servicio o un sistema de puntos de servicios, puede procesar una muestra de acuerdo con una orden o programa de prueba. En algunas situaciones, un circuito de retroalimentación (junto con sensores) permite al dispositivo o sistema de puntos de servicios monitorear el progreso del procesamiento de la muestra y mantener o alterar el orden o programa de prueba. En un ejemplo, si el dispositivo o sistema detecta que el procesamiento toma más tiempo que el tiempo predeterminado establecido en el programa, el dispositivo o sistema acelera el procesamiento o ajusta cualquier proceso paralelo, tal como el procesamiento de muestras en otro módulo del dispositivo o sistema. El circuito de retroalimentación permite el monitoreo en tiempo real o seudorreal (por ejemplo, en caché). En algunas situaciones, el circuito de retroalimentación puede permitir la realización de pruebas reflejas, lo que puede provocar que las pruebas, análisis, etapas de preparación y/u otros procesos posteriores se inicien después de iniciar o completar otra prueba y/o análisis o detectar uno o más parámetros. Tales pruebas, análisis, etapas de preparación y/u otros procesos posteriores pueden iniciarse automáticamente sin ninguna intervención humana.

En algunos ejemplos, el sistema de puntos de servicios puede ceñirse a un orden o programa de prueba predeterminado en función de los parámetros iniciales y/o los efectos deseados. En otras modalidades, el programa y/o el orden de prueba pueden modificarse sobre la marcha. El cronograma y/o el orden de prueba pueden modificarse en función de una o más condiciones detectadas, uno o más procesos adicionales para ejecutar, uno o más procesos para dejar de ejecutarse, uno o más procesos para modificar, una o más modificaciones de utilización de recursos/componentes, uno o más errores detectados o condiciones de alerta, una o más indisponibilidad de un recurso y/o componente, una o más entradas o muestras posteriores proporcionadas por un usuario, datos externos, o cualquier otra razón.

En algunos ejemplos, pueden proporcionarse una o más muestras adicionales a un dispositivo después de proporcionar una o más muestras iniciales al dispositivo. Las muestras adicionales pueden ser del mismo sujeto o de diferentes sujetos. Las muestras adicionales pueden ser del mismo tipo de muestra que la muestra inicial o diferentes tipos de muestras (por ejemplo, sangre, tejido). Las muestras adicionales pueden proporcionarse antes, simultáneamente con, y/o después del procesamiento de una o más muestras iniciales en el dispositivo. Pueden proporcionarse las mismas y/o diferentes pruebas o criterios deseados para las muestras adicionales, en oposición entre sí y/o con las muestras iniciales. Las muestras adicionales pueden procesarse en secuencia y/o en paralelo con las muestras iniciales. Las muestras adicionales pueden usar uno o más de los mismos componentes que las muestras iniciales, o pueden usar componentes diferentes. Las muestras adicionales pueden o no solicitarse en vista de una o más condiciones detectadas de las muestras iniciales.

En algunos ejemplos, el sistema acepta una muestra con la ayuda de un módulo de recolección de muestras, tal como una lanceta, un bisturí, o un recipiente de recolección de líquidos. Después el sistema carga o accede a un protocolo para realizar una o más rutinas de procesamiento de una pluralidad de rutinas de procesamiento potenciales. En un ejemplo, el sistema carga un protocolo de centrifugación y un protocolo de citometría. En algunos ejemplos, el protocolo puede cargarse desde un dispositivo externo a un dispositivo de procesamiento de muestras. Alternativamente, el protocolo puede estar ya en el dispositivo de procesamiento de muestras. El protocolo puede generarse basado en uno o más criterios deseados y/o rutinas de procesamiento. En un ejemplo, generar un protocolo puede incluir generar una lista de una o más subtareas para cada uno de los procesos de entrada. En algunos ejemplos, cada subtarea debe realizarse por un solo componente de uno o más dispositivos. La generación de un protocolo también puede incluir generar el orden de la lista, el tiempo y/o la asignación de uno o más recursos. En un ejemplo, un protocolo proporciona detalles o especificaciones de procesamiento que son específicos de una muestra o un componente de la muestra. Por ejemplo, un protocolo de centrifugación puede incluir velocidad de rotación y tiempo de procesamiento que se adapte a una densidad de muestra predeterminada, lo que permite la separación dependiente de la densidad de una muestra de otro material que puede estar presente con un componente deseable de la muestra.

Se incluye un protocolo en el sistema, tal como en un repositorio de protocolos del sistema, o se recupera de otro sistema, tal como una base de datos, en comunicación con el sistema. En un ejemplo, el sistema está en comunicación unidireccional con un servidor de base de datos que proporciona protocolos al sistema a petición del sistema para uno o más protocolos de procesamiento. En otro ejemplo, el sistema está en comunicación bidireccional con un servidor de base de datos, lo que permite al sistema cargar rutinas de procesamiento específicas del usuario al servidor de base de datos para uso futuro por parte del usuario u otros usuarios que puedan tener uso para las rutinas de procesamiento específicas del usuario.

En algunos casos, el usuario puede ajustar un protocolo de procesamiento. En un ejemplo, un usuario puede generar un protocolo de procesamiento con la ayuda de un motor de protocolo que proporciona al usuario una o más opciones orientadas a adaptar el protocolo para un uso particular. La adaptación puede ocurrir antes del uso del protocolo. En algunos ejemplos, el protocolo puede modificarse o actualizarse mientras está en uso.

Con la ayuda de un protocolo, un sistema procesa una muestra, lo que puede incluir preparar la muestra, analizar la muestra y detectar uno o más componentes de interés en la muestra. En algunos casos, el sistema realiza análisis de datos con respecto a la muestra o una pluralidad de muestras después del procesamiento. En otros casos, el sistema realiza análisis de datos durante el procesamiento. En algunos ejemplos, el análisis de datos se realiza a bordo, es decir, en el sistema. En otros ejemplos, el análisis de datos se realiza mediante el uso de un sistema de análisis de datos que es externo al sistema. En tal caso, los datos se dirigen al sistema de análisis mientras se procesa la muestra o después del procesamiento.

Un dispositivo puede configurarse para preparar una muestra para su eliminación, o para eliminar una muestra, tal como una muestra biológica, después del procesamiento o análisis de una muestra.

En ejemplos, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para transmitir datos obtenidos de una muestra. En ejemplos, un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para comunicarse a través de una red. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede incluir un módulo de comunicación que puede interactuar con la red. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede conectarse a la red a través de una conexión por cable o de forma inalámbrica. La red puede ser una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN) tal como Internet. En algunos ejemplos, la red puede ser una red de área personal. La red puede incluir la nube. El dispositivo de procesamiento de muestras puede conectarse a la red sin requerir un dispositivo intermediario, o puede requerirse un dispositivo intermediario para conectar un dispositivo de procesamiento de muestras a una red. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede comunicarse a través de una red con otro dispositivo, que puede ser cualquier tipo de dispositivo en red, que incluye, entre otros, un ordenador personal, un ordenador servidor o un ordenador portátil; asistentes digitales personales (PDA) como un dispositivo con Windows CE; teléfonos tales como teléfonos móviles, teléfonos inteligentes (por ejemplo, iPhone, Android, Blackberry, etcétera) o teléfonos portátiles con reconocimiento de ubicación (como GPS); un dispositivo de itinerancia, tal como un dispositivo de itinerancia conectado a una red; un dispositivo inalámbrico, tal como un dispositivo de correo electrónico inalámbrico u otro dispositivo capaz de comunicarse de forma inalámbrica con una red informática; o cualquier otro tipo de dispositivo de red que pueda comunicarse posiblemente a través de una red y manejar transacciones electrónicas. Tal comunicación puede incluir proporcionar datos a una infraestructura de computación en la nube o cualquier otro tipo de infraestructura de almacenamiento de datos a la que puedan acceder otros dispositivos.

Un dispositivo de procesamiento de muestras puede proporcionar datos relacionados con una muestra, por ejemplo, a un profesional de la salud, una ubicación de un profesional de la salud, tal como un laboratorio, o una filial de este. Uno o más de un laboratorio, un profesional de la salud, o un sujeto pueden tener un dispositivo de red capaz de recibir o acceder a los datos proporcionados por el dispositivo de procesamiento de muestras. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para proporcionar datos relacionados con una muestra a una base de datos. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede configurarse para proporcionar datos relacionados con una muestra a un sistema de registros médicos electrónicos, a un sistema de información de laboratorio, a un sistema de automatización de laboratorio, u otro sistema o software. Un dispositivo de procesamiento de muestras puede proporcionar datos en la forma de un informe.

Un laboratorio, dispositivo, u otra entidad o software puede realizar análisis de datos relacionados con una muestra en tiempo real. Un sistema de software puede realizar análisis químicos y/o análisis patológicos, o estos pueden distribuirse entre combinaciones de personal de laboratorio, clínico, y especializado o experto. El análisis puede incluir la evaluación cualitativa y/o cuantitativa de una muestra. El análisis de los datos puede incluir una evaluación cualitativa y/o cuantitativa posterior de una muestra. Opcionalmente, puede generarse un informe basado en datos sin procesar, datos preprocesados, o datos analizados. Tal informe puede prepararse para mantener la confidencialidad de los datos obtenidos de la muestra, la identidad y otra información sobre el sujeto del que se obtuvo la muestra, el análisis de los datos, y otra información confidencial. El informe y/o los datos pueden transmitirse a un profesional de la salud. Los datos obtenidos mediante un dispositivo de procesamiento de muestras, o el análisis de tales datos o informes, pueden proporcionarse a una base de datos, un sistema de registros médicos electrónicos, un sistema de información de laboratorio, un sistema de automatización de laboratorio, u otro sistema o software.

Ejemplos

Ejemplo 1

Los ejemplos de componentes proteicos individuales adecuados para su uso en la provisión de proteínas de fusión como se describe en el presente documento incluyen (las secuencias de aminoácidos se proporcionan mediante el uso del código de una letra para los aminoácidos):

Tabla 3

(continuación)

A continuación se proporciona un ejemplo de una proteína de fusión que proporciona actividad de ADN ligasa de extremos romos termoestable:

fusión de ligasa Tth-p50, construcción Theranos EE0217, por ejemplo, preparación de proteína RDP0078, consta de un líder que contiene His10 (mghhhhhhhhhssghiegras, SEQ ID NO: 4), p50 (mostrada más abajo en texto en cursiva, comienza con adgpy... y termina con ... rkrqk, SEQ ID NO: 2), una secuencia flexible rica en glicina (gssgtsgggsggg, SEQ ID NO: 5), y la ADN ligasa Tth (mostrada más abajo en texto subrayado, SEQ ID NO: 3). Esta proteína de fusión tiene la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 1):

rrghhhhhhhhhhssghiegrasadgpylqileqpkqrgfrfryvcegpshgglpgasseknkksypqvkicnyvgpakvivqlvtngkni hlhahslvgkhcedgictv tagpkdm vvgfanlg ilhvtkkkvfetlearm teacirgynpgllvhpdlaylqaegggdrqigdrekelirqa alqqtkem dlsvvrlm ftaflpdstgsftrrlepvvsdaíydskapnasnlkivrm drtagcvtggeeiyllcdkvqkddiqírfyeeeenggv wegfgdfsptdvhrqfaivfktpkykdinitkpasvfvqlrrksdletsepkpflyypeikdkeevqrkrqkgssgtsgggsgggm tíeearkr vnelrdlirvhnvrvvvladpeisdaevdrllrelkeleerfpelkspdsptlqvgarpleatfrpvrhptrmvsldnafnldelkafeerierale rkgpfavtvehkvdglsvnlvveegvlvvgatrgdgevgeevtqnlltiptiprrlkgvperlevrgevvmpieaflrlneeleergerifknpr naaagslrqkdpritakrglratfvalglgleeveregvatqfallhwlkekgfpvehgvaravgaegveawqdwlkkrralpfeadgvvvkl delalwrelgvtaraprfaiavkfpaeeketrlldwfqvgrtgrvtpvgilepvflegsevsrvtlhnesvieeldirigdwvlvhkaggvipevl rv/lkerrtgeerpirwpetcpecghrllkegkvhrcpnplcpakrfeairhfasrkamdiqglgeklierllekglvkdvadlvrlrkedlvgler mgeksaqnllrgíeeskkrglerllvalglpgvgevlarnlaarfgnmdrlleasleelleveevgeltarailetlkdpafrdlvrrlkeagveme akekggealkgltfvitgelsrpreevkallrrlgakvtdsvsrktsvlvvgenpgsklekaralgvptlteeelyrlleartgkkaeelv

La secuencia de la proteína de fusión SEQ ID NO: 1 presentada anteriormente es un ejemplo de una proteína de fusión que puede representarse como "4-2-5-3" en la que "4" representa la SEQ ID NO: 4; "2" representa SEQ ID NO: 2; "5" representa SEQ ID NO: 5; y "3" representa SEQ ID NO: 3. Tales representaciones indican, en una orientación N-terminal a C-terminal, proteínas de fusión lineales compuestas por fusiones de la secuencia de aminoácidos indicada por los números (que a su vez indican las correspondientes SEQ ID NO:). Además, tales representaciones de proteínas de fusión se presentan más abajo.

Se proporciona un ejemplo de una reacción de ligación de extremos romos realizada a 75 °C más abajo. El sustrato de AdN era un ADN dúplex de 49 pb elaborado por hibridación de los oligonucleótidos EE0139 (SEQ ID NO: 20) y EE0140 (SEQ ID NO: 21). Este dúplex de extremos romos fue capaz de formar concatámeros en múltiples eventos de ligación. Los resultados de los productos de reacción se separaron por tamaño en un gel de agarosa, como se muestra en la Figura 1, demuestran que: (1) ligasa Tth sola (carriles 2-3), aunque se sabe que es capaz de sellar muescas de ADN a 75 °C, realizó muy poca o ninguna ligación de extremos romos en estas condiciones; (2) ADN ligasa de T4 con una fusión de p50 N-terminal (carriles 4-5) también realizó muy poca ligación de extremos romos en estas condiciones, aunque hubo alguna evidencia de más ligación que para la Tth sola. Se creía que esta observación era sorprendente dada la sensibilidad a la temperatura de la ligasa T4 sola; (3) la ADN ligasa Tth con una fusión de p50 N-terminal (carriles 6-7) demostró un nivel mucho más alto de ligación de extremos romos a 75 °C. Por tanto, los resultados mostrados en la Figura 1 demuestran que las proteínas de fusión como se describen en el presente documento proporcionan una actividad mejorada de ligación de extremos romos a alta temperatura. Se cree que las proteínas de fusión homólogas a SEQ ID NO: 1 proporcionan una actividad mejorada de ligación de extremos romos a alta temperatura. Por tanto, se cree que las proteínas de fusión que tienen más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia con SEQ ID NO: 1 proporcionan actividad de ligación de ADN de extremos romos a alta temperatura.

Ejemplo 2

La proteína de fusión de SEQ ID NO: 1 (y moléculas homólogas) es un ejemplo de una ADN ligasa de extremos romos termoestable. En la siguiente tabla se enumeran ejemplos de otras proteínas de fusión que tienen características estructurales similares (Tabla 4). Se cree que estas proteínas de fusión adicionales comparten no solo características estructurales, sino también características funcionales; por tanto, se cree que las proteínas de fusión enumeradas en la Tabla 4 son ligasas de extremos romos termoestables. Además, se cree que las proteínas homólogas a las proteínas de fusión de la Tabla 4 son ligasas de extremos romos termoestables. El primer ejemplo enumerado, SEQ ID NO: 1, se discutió anteriormente, y los resultados de los experimentos de ligación que usan la SEQ ID NO: 1 se muestran en la Figura 1. Como se discutió anteriormente, SEQ ID NO: 1 es una combinación de una secuencia líder que contiene HIS10 (SEQ ID NO: 4), la proteína de unión a ADN p50 (SEQ ID NO: 2), una secuencia flexible rica en glicina (SEQ ID NO: 5) y ADN ligasa Tth (SEQ ID NO: 3), en las que la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 se une covalentemente a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 que se une covalentemente a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 que se une covalentemente a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3; esta combinación se denomina "4-2-5-3" en la columna más a la izquierda de la Tabla 4. (El término "4-2-5-3" indica una proteína de fusión lineal en la que las secuencias SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 5, y SEQ ID NO: 3 se enlazan como se escribe, de N-terminal (izquierda) a C-terminal (derecha)). Otras combinaciones de tales componentes ilustran algunas de las muchas proteínas de fusión posibles que tienen las características descritas en el presente documento. Las otras proteínas de fusión enumeradas en la Tabla 4 incluyen combinaciones adicionales de secuencias líder (SEQ ID NO: 4) con una proteína de unión a ADN (por ejemplo, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 7), una secuencia flexible rica en glicina (SEQ ID NO: 5), y una ADN ligasa (sEq ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID nO: 9, o SEQ ID NO: 10). Por tanto, las proteínas de fusión ejemplares descritas en la Tabla 4 incluyen una secuencia de aminoácidos de una secuencia líder rica en histidina, una ADN ligasa, y una secuencia enlazadora flexible rica en glicina (es decir, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 12) unida covalentemente a una ligasa (por ejemplo, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10). Se cree que estas proteínas de fusión ejemplares proporcionan otras ligasas de ácidos nucleicos de extremos romos termoestables.

Tabla 4

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Las secuencias de proteínas de fusión indicadas anteriormente proporcionan ejemplos de ligasas de extremos romos que incluyen porciones de ADN-ligasa.

Como se discutió anteriormente, una segunda secuencia de aminoácidos que tiene homología de secuencia con una primera secuencia de aminoácidos puede diferir del primer aminoácido sólo por sustituciones conservadoras; es decir, un residuo en la segunda secuencia de aminoácidos es a) idéntico al residuo correspondiente en la primera secuencia de aminoácidos; b) un miembro del mismo grupo de aminoácidos que el residuo correspondiente en la primera secuencia de aminoácidos, donde el grupo se basa en propiedades comunes de la cadena lateral como se describe anteriormente: o c) una sustitución ejemplar o preferida (como se identificó anteriormente en Tabla 1C anterior).

Por ejemplo, las proteínas de fusión adecuadas incluyen proteínas de fusión que tienen más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 %, de homología de secuencia o identidad de secuencia con una proteína de fusión que tiene una composición 4-proteína de unión a ADN-5-ADN ligasa (escrito en la orientación N-terminal a C-terminal), donde "proteína de unión a ADN" indica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a ADN y "ADN ligasa" indica la secuencia de aminoácidos de una ADN ligasa que se incluye en la proteína de fusión. Como se discutió anteriormente, los ejemplos de proteínas de unión a ADN incluyen s Eq ID NO: 2 y SEQ ID NO: 7; los ejemplos de ADN ligasas incluyen SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y SEQ ID NO: 10.

Ejemplo 3

Otras proteínas de fusión que se cree que son útiles como ligasas de extremos romos, y que se cree que son útiles como ligasas de extremos romos de ácidos nucleicos termoestables, incluyen proteínas de fusión como se describe en el presente documento, donde la proteína de unión a ADN se reemplaza por una proteína de unión al ARN, y donde la ligasa comprende una proteína ARN-ligasa en proteínas de fusión que tienen una composición 4-proteína de unión a ARN-5-ARN ligasa (escrita en la orientación N-terminal a C-terminal), donde "proteína de unión a ARN" indica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión a ARN y "ARN ligasa" indica la secuencia de aminoácidos de una ARN ligasa que se incluye en la proteína de fusión. En las modalidades, la ARN ligasa puede ser una ARN ligasa termoestable. Por tanto, una proteína de fusión como se describe en el presente documento que tiene actividad ARN ligasa, y se cree que tiene actividad ARN ligasa termoestable, comprende un polipéptido lineal que tiene una composición que incluye las secuencias de aminoácidos unidas covalentemente (en el siguiente orden N-terminal a C-terminal) SeC. ID NO: 4, proteína de unión a ARN, SEQ ID NO: 5, ARN ligasa.

Además, las proteínas de fusión de ARN ligasa adecuadas incluyen proteínas de fusión de ARN ligasa que tienen más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia con una proteína de fusión que tiene una composición de 4-proteína de unión a ARN-5-ARN ligasa. Como se discutió anteriormente, una segunda secuencia de aminoácidos que tiene homología de secuencia con una primera secuencia de aminoácidos puede diferir del primer aminoácido sólo por sustituciones conservadoras; es decir, un residuo en la segunda secuencia de aminoácidos es a) idéntico al residuo correspondiente en la primera secuencia de aminoácidos; b) un miembro del mismo grupo de aminoácidos que el residuo correspondiente en la primera secuencia de aminoácidos, donde el grupo se basa en propiedades comunes de la cadena lateral como se describe anteriormente: o c) una sustitución ejemplar o preferida (como se identificó anteriormente en Tabla 1C anterior).

Ejemplo 4

Las proteínas que tienen las características descritas en el presente documento incluyen proteínas que son homólogas a cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento. Se cree que tales proteínas son adecuadas para su uso como ligasas de ácido nucleico, que incluye el uso como ligasas de ácido nucleico termoestables. Por ejemplo, se cree que tales proteínas son adecuadas para su uso como ADN ligasas de extremos romos, que incluye el uso como a Dn ligasas de extremos romos termoestables. Se cree, además, que tales proteínas son adecuadas para su uso como ARN ligasas de extremos romos, que incluye el uso como ARN ligasas de extremos romos termoestables.

Las proteínas que son homólogas a cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento pueden proporcionarse mediante la proporción de proteínas variantes que tienen más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia con una proteína de fusión descrita en el presente documento. Por ejemplo, las proteínas particulares que son homólogas a cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento pueden proporcionarse mediante la proporción de proteínas variantes que tengan más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, o SEQ ID NO: 19 (es decir, que tienen más de 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con una proteína de fusión de la Tabla 4).

Las proteínas de fusión como se describen en el presente documento incluyen una composición que tiene la forma general de una molécula lineal que tiene una secuencia líder rica en histidina unida covalentemente a una secuencia de proteína de unión a ácido nucleico que se une covalentemente a una secuencia flexible rica en glicina que se une covalentemente a una secuencia de ligasa de ácido nucleico. En las modalidades, tales proteínas de fusión pueden ser proteínas que incluyen una o más sustituciones, inserciones, deleciones, o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia de proteína de fusión proporcionada como una lista de secuencias en el presente documento. En las modalidades, tales proteínas de fusión pueden ser proteínas que incluyen una o más sustituciones, inserciones, deleciones, o adiciones de aminoácidos en comparación con una secuencia líder rica en histidina, una secuencia de proteína de unión a ácido nucleico, una secuencia flexible rica en glicina, o una secuencia de ligasa de ácido nucleico proporcionada como una lista de secuencias en el presente documento. Por ejemplo, las proteínas de fusión homólogas que tienen las características descritas en el presente documento pueden incluir secuencias líder ricas en histidina diferentes, aunque homólogas a, SEQ ID NO: 4; por ejemplo, que tiene secuencias líder ricas en histidina que tienen más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4. Se entenderá que tales secuencias líder ricas en histidina homólogas pueden incluir el mismo número, o pueden incluir un número mayor, o pueden incluir un número menor, de residuos de aminoácidos que la SEQ ID NO: 4.

Por ejemplo, las proteínas de fusión homólogas que tienen las características descritas en el presente documento pueden incluir secuencias ricas en glicina flexibles diferentes, aunque homólogas a, SEQ ID NO: 5; por ejemplo, que tiene secuencias ricas en glicina flexibles que tienen más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 5. Se entenderá que tales secuencias ricas en glicina flexibles homólogas pueden incluir el mismo número, o pueden incluir un número mayor, o pueden incluir un número menor, de residuos de aminoácidos que la SEQ ID NO: 5.

Por ejemplo, las proteínas de fusión homólogas incluyen proteínas de fusión que tienen composiciones homólogas a cualquiera de las proteínas descritas en el presente documento como 4-2-5-3, 4-2-5-8, 4-2-5-9, y 4-2-5-10, donde la secuencia "2" se reemplaza por una secuencia que tiene más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2; o donde la secuencia "3", "8", "9" o "10" se reemplaza por una secuencia que tiene más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con ^sE^qID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10. En las modalidades, tanto la secuencia "2" se reemplaza por una secuencia homóloga como la secuencia "3", "8", o "9" o "10" se reemplaza por una secuencia homóloga.

Además, las proteínas de fusión homólogas incluyen proteínas de fusión que tienen composiciones homólogas a cualquiera de las proteínas descritas en el presente documento como 4-7-5-3, 4-7-5-8, 4-7-5-9, y 4-7-5-10, donde la secuencia "7" se reemplaza por una secuencia que tiene más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con SEQ ID NO: 7; o donde la secuencia "3", "8", "9", o "10" se reemplaza por una secuencia que tiene más del 90 %, o más del 95 % o más del 99 % de homología de secuencia o identidad de secuencia con ^sE^qID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 10. En las modalidades, tanto la secuencia "7" se reemplaza por una secuencia homóloga como la secuencia "3", "8", o "9", o "10" se reemplaza por una secuencia homóloga.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para realizar una reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable, que comprende:

combinar moléculas de ADN que se van a ligar y una ADN ligasa de extremos romos termoestable en una solución, en donde dicha ^aDⁿligasa de extremos romos termoestable comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias de aminoácidos que consisten en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, y SEQ ID NO: 19, y en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable se realiza a una temperatura de 60 °C o más.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable se realiza a una temperatura uniforme.

3. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable se realiza a una temperatura de 60 °C a 65 °C.

4. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable se realiza a una temperatura de 75 °C.

5. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable comprende ciclos de temperatura.

6. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable comprende ciclos de temperatura de 94 °C a 60 °C.

7. El método de la reivindicación 1, en donde la reacción de ADN ligasa de extremos romos termoestable comprende dos o más ciclos de ciclos de temperatura.

8. El método de la reivindicación 1, que comprende, además, múltiples eventos de ligación efectivos para proporcionar concatámeros.