ES2902838T3 - El ácido glicólico protege contra los infartos - Google Patents

Abstract

Ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevención de los infartos.

Description

DESCRIPCIÓN

El ácido glicólico protege contra los infartos

La presente invención se refiere al uso del ácido glicólico o cualquiera de sus sales o ésteres farmacéuticamente aceptables en el tratamiento o la prevención del infarto. Una realización preferida de la invención se relaciona con un método para disminuir la muerte celular causada por la isquemia mediante la puesta en contacto del ácido glicólico o cualquiera de sus sales o ésteres farmacéuticamente aceptables con el tejido hipóxico, particularmente neuronas corticales o tejido miocárdico.

En esta especificación se citan una serie de documentos, entre ellos solicitudes de patentes y manuales del fabricante.

Antecedentes de la invención

Según la organización mundial de la salud (OMS), la isquemia cardiaca y cerebral son las causas más frecuentes de muerte o invalidez en el mundo. Son responsables de aproximadamente un 30% del total de muertes y menos del 50% de los pacientes volverán a tener una vida independiente en el año siguiente al evento isquémico [1]. Durante la isquemia, el flujo de sangre se reduce debido a la oclusión de los vasos por un trombo, dando lugar a una situación de hipoxia y a un déficit funcional. Por ejemplo, durante un isquemia cerebral, hay un área que recibe menos de 10 ml/100gr/min. de flujo sanguíneo (FSC). Esta área se necrosa en minutos y no puede ser salvada. Normalmente hay un área rodeando este área que recibe entre 20 y 50 ml/100gr/min. de f Sc a la que se denomina penumbra. Este área de penumbra solo puede tolerar un FSC tan bajo durante un periodo de tiempo limitado antes de que ocurra un daño celular permanente [2]. Un proceso similar es aplicable a cualquier tipo de isquemia, siendo la única diferencia el tiempo que transcurre hasta que se observa un daño irreversible. La recuperación de esta área es el objetivo principal de todos los tratamientos contra el infarto. Las estrategias de reperfusión son las terapias más efectivas en estos casos pero también pueden tener consecuencias perjudiciales. Existe una evidencia creciente que sugiere que el estrés oxidativo [3] y la inflamación [4] están implicados en la patología del daño por isquemia-reperfusión. Más aún, algunos estudios sugieren que este último factor podría estar regulado por el estrés oxidativo [5][6]. Hoy en día no hay ningún tratamiento disponible capaz de reducir la toxicidad de la reperfusión y de reducir el tamaño del área isquémica. Toyoda, Y. et al., Biology Open 3, 777-784, 2014 revela que el ácido glicólico incrementa la supervivencia de las neuronas primarias mesencefálicas en un modelo de la enfermedad de Parkinson.

En los humanos, factores medioambientales como una dieta rica en grasas, especialmente las que contienen acidos grasos saturados y trans, así como la adicción a ciertas sustancias como el tabaco y el alcohol incrementan el riesgo de sufrir un infarto cerebral o un infarto cardiaco. Hasta ahora, y a pesar de todos los métodos desarrollados para reducir el tamaño del daño isquémico, no hay sustancias en el mercado que tengan este tipo de efecto positivo. El parámetro principal que influye en las consecuencias funcionales de un infarto es el tamaño del tejido muerto durante la misma. Este se ve influenciado por el tiempo hasta el tratamiento (“tiempo es tejido” (time is tissue en inglés)), la edad del paciente y la existencia previa de colaterales arteriales irrigando ese área. Como se ha discutido más arriba, la identificación de compuestos capaces de reducir la muerte celular y el área afectada por la isquemia es importante, ya que estos podrían ayudar a incrementar la salud y el bienestar de pacientes que han sufrido y/o están en riesgo de sufrir una enfermedad isquémica.

Resumen de la invención

A la luz del estado de la técnica, el problema técnico subyacente a la presente invención es proporcionar medios alternativos y/o mejorados para la prevención y/o el tratamiento de la enfermedad isquémica. Por lo tanto, puede considerarse como otro objetivo de la invención la identificación de un compuesto que sea útil para tratar las lesiones isquémicas, en particular reduciendo la muerte celular y, de esta manera, reduciendo el tamaño de la zona isquémica,.

Este problema se resuelve a través de las características de las reivindicaciones independientes. Las realizaciones preferidas de la presente invención se proporcionan mediante las reivindicaciones dependientes.

La invención, por lo tanto, se refiere en un primer aspecto al ácido glicólico o a una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de los infartos.

En el presente documento también se describe un método correspondiente al tratamiento o prevención de infartos, dicho método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo a un sujeto que lo necesite.

En una realización, el infarto está asociado con la falta de suministro de sangre u oxígeno al tejido corporal de un sujeto. En una realización, el infarto se caracteriza por un aumento de la necrosis con apoptosis en el tejido hipóxico afectado en comparación con el tejido oxigenado.

En los ejemplos aquí descritos se probó el efecto del ácido glicólico en la supervivencia de las neuronas corticales de ratón 24 horas después de ser sometidas a isquemia. Los resultados experimentales muestran que el ácido glicólico disminuye significativamente la muerte de las células neuronales tras la administración de ácido glicólico en comparación con las neuronas corticales de control no tratadas sometidas a isquemia. Al leal saber y entender del inventor, ningún estudio previo ha intentado probar el efecto del ácido glicólico contra el daño isquémico y no se podía prever que el ácido glicólico proteja contra los infartos.

En una realización de la invención el infarto a tratar usando ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es el infarto cerebral. En una realización de la invención el isquemia a tratar usando ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es el infarto miocárdica. En una realización de la invención la isquemia a tratar utilizando ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es la enfermedad arterial periférica (también conocida como enfermedad vascular periférica). En una realización de la invención, la infarto a tratar con ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es el infarto intestinal. En una realización de la invención el infarto a tratar utilizando ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es un lesión isquémica aguda. En una realización de la invención, el infarto a tratar con ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es una lesión isquemia crónica.

En los ejemplos aquí descritos se probó el efecto del ácido glicólico en la supervivencia de las neuronas corticales de ratón 24 horas después de ser sometidas a isquemia. Los resultados muestran que el ácido glicólico protege contra diferentes grados de isquemia tanto cuando se aplica antes como después de la isquemia aguda. Lo más importante es que el ácido glicólico fue capaz de proteger contra la isquemia cuando se aplicó durante la reperfusión. Esto es particularmente ventajoso en la práctica clínica por dos razones: i) Es imposible prever cuándo se producirá un infarto agudo en el cerebro (ictus) u otro tipo de isquemia. Por lo tanto, en tales situaciones agudas sólo son posibles los tratamientos post-isquémicos. El hecho de que el ácido glicólico tenga un efecto protector incluso cuando se aplica después de un infarto lo hace ideal para su uso en la práctica clínica. ii) No existen tratamientos preventivos para reducir el tamaño del daño producido por un ictus u otro tipo de isquemia en los pacientes de riesgo. Los pacientes con un ictus o isquemia previa en la historia clínica o con enfermedades concomitantes como la hipertensión arterial, la obesidad, la apnea del sueño, las enfermedades periodontales, la inflamación, las infecciones, la aterosclerosis o las arritmias cardíacas, entre otros factores, tienen un mayor riesgo de sufrir un ictus [7, 8] o un infarto en cualquier otro órgano como el corazón [9], las extremidades [10] o el intestino [11]. En estos pacientes de riesgo se podría utilizar el ácido glicólico, solo o en combinación con otras sustancias como la aspirina, para prevenir complicaciones y reducir el tamaño de la lesión isquémica en el cerebro en caso de que se produzca un infarto.

En una realización de la invención, el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptables del mismo debe aplicarse por vía oral o intravenosa. Las formas de administración adecuadas para la administración oral o intravenosa son conocidas por un experto en la materia. En una realización de la invención el infarto a tratar usando ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo es un infarto en humanos.

El ácido glicólico (AG) se denomina ácido 2-hidroxietanoico según la Unión Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC por sus siglas en inglés) y su fórmula molecular es C2H4O3. El ácido glicólico se utiliza en el estado de la técnica, por ejemplo, en la industria textil como agente de teñido y curtido, en la elaboración de alimentos como agente aromatizante y como conservante, y en la industria farmacéutica como agente para el cuidado de la piel, en particular como agente exfoliante. El ácido glicólico también se encuentra en la remolacha azucarera, la caña de azúcar y diversas frutas. Trazas de ácido glicólico están presente, por ejemplo, en las uvas verdes o sin madurar. El ácido glicólico también se encuentra en la piña y en el cantalupo.

Una sal farmacéuticamente aceptable del ácido glicólico incluye, pero no se limita, a glicolato de potasio, glicolato de sodio, glicolato de calcio, glicolato de magnesio, glicolato de bario, glicolato de aluminio, oxalato, nitrato, sulfato, fosfato, fumarato, succinato, maleato, besilato, tosilato, tartrato y palmitato. La producción de sales de ácido glicólico y los ácidos necesarios utilizados durante la producción de dichas sales están dentro de las capacidades de una persona experta.

Un éster farmacéuticamente aceptable del ácido glicólico incluye, pero no se limita a: glicolato de metilo, glicolato de etilo, glicolato de butilo, glicolato de laurilo, ácido piperidil(2)-glicólico de etilo, ácido (3-tienil)-glicólico, glicolato de miristilo, glicolato de quinolilo y glicolato de cetilo [12-15]. Los ésteres de AG pueden ser determinados y sintetizados por una persona experta según se requiera sin un esfuerzo excesivo. En algunas realizaciones, el éster está destinado a permitir la escisión del éster in vivo, liberando así el GA como componente activo.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición que comprende ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, y un compuesto reductor de la isquemia adicional. El término "compuesto reductor de la isquemia" se refiere a cualquier compuesto conocido por exhibir un efecto terapéutico con respecto a la reducción o prevención de la lesión isquémica. En el presente documento se describen, a modo de ejemplo, una serie de compuestos que entran en esta categoría. Una persona experta es capaz de probar cualquier compuesto dado para su efecto sobre la lesión isquémica, por ejemplo, de acuerdo con la metodología divulgada en el presente documento, y por lo tanto no requiere ningún esfuerzo indebido.

En una realización preferida, la composición comprende un compuesto reductor de la isquemia, en el que el compuesto reductor de la isquemia es un antioxidante. En una realización el antioxidante puede ser uno o más de: la coenzima Q10, acetil-L-carnitina, ácido R-a-lipoico, selenio y QIAPI-1, en cualquier combinación dada. En otra realización, el compuesto reductor de la isquemia es un inductor del hipometabolismo. El inductor del hipometabolismo es preferentemente uno o más de los siguientes: grelina, el opioide sintético delta D-ala(2)-D-leu(5)-encefalina, rT3, activadores de la hibernación, antabolona y bombesina.

En una realización de la invención, la composición descrita en el presente documento se caracteriza porque el compuesto reductor de isquemia adicional es el D-lactato. En una realización de la invención, la composición descrita en el presente documento se caracteriza porque el compuesto reductor de isquemia adicional es el oxoalacetato. En una realización de la invención, la composición descrita en el presente documento se caracteriza porque el compuesto reductor de la isquemia adicional es un bloqueador de los canales de calcio. En una realización de la invención, la composición aquí descrita se caracteriza porque el bloqueador del calcio es uno o más de los siguientes: MK-801, verapamilo, budipina, nifedipina, niquel, 2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo[f]quinoxalina, NP10075, NBQX, PNQX, YM-90K y ZK200775.

Recientemente se ha demostrado que el D-Lactato protege contra el daño por isquemia/reperfusión actuando como agonista del receptor HCA-I [16]. Se ha demostrado que el oxalacetato reduce el daño isquémico mediante la reducción de la toxicidad del glutamato [17]. La inhibición de los canales de calcio es importante porque durante la isquemia/reperfusión se produce una sobrecarga tóxica de calcio en las células que desencadena la necrosis y la apoptosis. Hay diferentes tipos de canales de calcio que pueden bloquearse. Entre ellos se encuentran los canales de calcio dependientes de voltaje, los canales de calcio de tipo L, los canales de calcio de tipo N, los canales de calcio operados por almacenamiento (SOCE en inglés) o los canales de calcio dependientes de ligando, como los receptores NMDA o AMPA. Se ha demostrado que el bloqueo de los canales de calcio dependientes del glutamato, como el receptor NMDA, es neuroprotector durante el accidente cerebrovascular. Se ha demostrado que diferentes bloqueadores de los canales de calcio tienen este efecto al reducir la afluencia de calcio inducida por la excitotoxicidad por glutamato que se produce durante la isquemia o la hemorragia subaracnoidea [18,19]. Consideramos que la combinación de ácido glicólico con una o más de estas sustancias tiene el potencial de reducir aún más el daño isquémico mediante un mecanismo de acción sinérgico.

Tal y como se utiliza en el presente documento, "tratar" o el "tratamiento" de un sujeto afectado por un enfermedad, como una enfermedad isquémica, significa ralentizar, detener o revertir la progresión del trastorno, o los síntomas o consecuencias del mismo. En una realización preferida, tratar a un sujeto afectado por una enfermedad significa invertir la progresión del trastorno, idealmente hasta el punto de eliminar el propio trastorno. Tal y como se utiliza en el presente documento, mejorar un trastorno y tratar un trastorno son equivalentes.

El tratamiento de la presente invención puede también, o alternativamente, referirse a una administración profiláctica del componente terapéutico de la presente invención, concretamente el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo. Dicha administración profiláctica puede referirse a la prevención de cualquier trastorno médico dado, como la prevención de una lesión isquémica, o la prevención del desarrollo de dicho trastorno, aunque la prevención o profilaxis no debe interpretarse en sentido estricto en todas las condiciones como prevención absoluta. La prevención o profilaxis también puede referirse a la reducción del riesgo de que un sujeto desarrolle una determinada enfermedad, preferiblemente en un sujeto con riesgo de padecerla.

El tratamiento descrito en la presente invención, que comprende la administración de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, tiene por objeto que el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo sea uno de los agentes activos administrados a un sujeto. El ácido glicólico puede, por ejemplo, estar presente como componente estructural en nanopartículas u otros andamios biocompatibles con el fin de administrar otras sustancias terapéuticas. En una realización de la presente invención, el tratamiento descrito aquí no comprende la administración de nanopartículas, andamios biocompatibles u otros componentes estructurales potencialmente similares en los que esté presente el ácido glicólico. En tales casos, el ácido glicólico está presente simplemente como un componente estructural y no como un agente activo. La presente invención está relacionada con la administración de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo como agente activo, preferentemente en una forma que permita que el ácido glicólico libre, no unido y/o soluble sea captado por el sujeto a tratar o tratado.

Los términos "infarto", "enfermedad isquémica" o "trastorno isquémico" se utilizan indistintamente en el presente documento, y designan la interrupción aguda o subaguda del suministro de sangre a uno o más tejidos corporales. Como se ha comentado en este documento, los trastornos isquémicos suelen deberse a la oclusión de una arteria, ya sea por: i) arteriosclerosis, ii) la rotura de una placa arteriosclerótica o un aneurisma con o sin la formación in situ de un coágulo, iii) la rotura de una arteria que provoca una hemorragia o iv) un evento embólico en el que un coágulo (embolia arterio-arterial o venoso-arterial) una burbuja de aire (embolia gaseosa) o un tejido lipídico (embolia lipídica) formado en otro lugar es transportado en la sangre hasta ocluir una arteria de menor diámetro.

En una realización, la invención se refiere al tratamiento de la isquemia cerebral global. La isquemia cerebral global es una condición particular en la que hay un flujo sanguíneo insuficiente al cerebro para satisfacer la demanda metabólica. Esto conduce a un suministro deficiente de oxígeno o hipoxia cerebral y, por lo tanto, a la muerte del tejido cerebral o al infarto cerebral/ictus isquémico. Esta reducción general del suministro de sangre al cerebro se debe normalmente a un fallo cardíaco o a una caída drástica de la presión arterial. Los principales parámetros que influyen en el resultado funcional de un evento isquémico son la tasa de muerte celular y el tamaño del tejido dañado por la isquemia, estando ambos aspectos interrelacionados entre sí.

En realizaciones particulares de la invención la enfermedad isquémica a tratar y/o prevenir puede ser (a) isquemia cerebral, en particular ictus y hemorragia subaracnoidea, demencia vascular y/o demencia por infarto; (b) isquemia miocárdica, en particular una enfermedad coronaria y/o un infarto de miocardio; (c) enfermedades vasculares periféricas, en particular enfermedad arterial oclusiva periférica, (d) isquemia renal y/o intestinal, en particular infarto intestinal debido a la oclusión de las arterias celíacas o mesentéricas.

Con respecto a la prevención de la enfermedad isquémica en un paciente en riesgo de padecerla, el paciente en riesgo puede mostrar una o más de las siguientes señales (a) muestra síntomas o indicios de estar en riesgo de desarrollar una enfermedad isquémica, como niveles elevados de colesterol y triglicéridos en sangre, presión arterial alta (donde las referencias a niveles "elevados" se refieren a niveles superiores a los valores medios de la población), la presencia de diabetes y prediabetes, sobrepeso, tabaquismo, falta de actividad física, una dieta poco saludable y/o estrés; (b) presenta algún marcador de riesgo en pruebas ex vivo, en particular en muestras de sangre; (c) ha sufrido previamente una enfermedad isquémica, en particular ha tenido una isquemia cerebral o miocárdica; y/o (d) tiene una predisposición a desarrollar una enfermedad isquémica cardiovascular, en particular una predisposición genética.

El término "paciente de riesgo" puede referirse a cualquier sujeto que esté en riesgo de desarrollar una condición de enfermedad en el sentido de la presente invención, en particular con respecto a las señales de riesgo descritas anteriormente en (a) a (d). Preferiblemente, el riesgo de desarrollar una enfermedad para este sujeto es al menos del 5%, al menos del 10%, al menos del 25%, al menos del 50%, al menos del 75%, al menos del 100%, al menos del 150%, al menos del 200%, al menos del 300%, al menos del 500%, o más del 500%, más alta en comparación con el riesgo medio de toda la población. El paciente en el sentido de la presente invención puede ser cualquier sujeto que pueda desarrollar una enfermedad isquémica cardiovascular u otra condición en el sentido de la presente invención. Preferentemente, el paciente es un mamífero, en particular un ser humano

Las enfermedades isquémicas incluyen los trastornos circulatorios, las enfermedades cardiovasculares, las afecciones de las arterias o los vasos sanguíneos y/o las enfermedades o afecciones isquémicas obstructivas u oclusivas, u otros estados del tejido vascular en los que el flujo sanguíneo está, o puede estar, deteriorado o alterado con respecto a los niveles normales. Ejemplos de afecciones vasculares o enfermedades vasculares a las que se aplican los métodos de la invención son aquellas en las que la vasculatura del tejido o sistema afectado es senescente o está alterada de alguna manera, de modo que el flujo sanguíneo al tejido o sistema se reduce o corre el riesgo de reducirse o aumentar por encima de los niveles normales. Se refiere a cualquier trastorno en cualquiera de las diversas partes del sistema cardiovascular, que consiste en el corazón y todos los vasos sanguíneos que se encuentran en todo el cuerpo.

Las enfermedades del corazón pueden incluir la enfermedad de las arterias coronarias, la cardiomiopatía, la valvulopatía, la enfermedad pericárdica, la cardiopatía congénita (por ejemplo, coartación, defectos septales auriculares o ventriculares) y la insuficiencia cardíaca. Las enfermedades de los vasos sanguíneos pueden incluir la arteriosclerosis, la aterosclerosis, la hipertensión, el infarto cerebral, la demencia vascular, el aneurisma, la enfermedad arterial periférica, la claudicación intermitente, la vasculitis, la incompetencia venosa, la trombosis venosa, las varices y el linfedema. Los trastornos circulatorios pueden estar relacionados con diversos órganos como el cerebro, el corazón, el riñón, las suprarrenales y el pulmón. La enfermedad oclusiva arterial periférica (EAOP; también denominada enfermedad arterial periférica (EAP)) puede ser el resultado de procesos ateroscleróticos o inflamatorios que producen estenosis arterial, o de la formación de trombos asociados a la enfermedad aterosclerótica subyacente. Una localización habitual de la EAP es en las extremidades inferiores. Este proceso de aterosclerosis provoca un engrosamiento inicial y la formación de placas que invaden la luz arterial, disminuyendo el radio luminal efectivo de los segmentos arteriales afectados, lo que produce una obstrucción anatómica y a veces funcional del flujo sanguíneo.

El término "neurona", tal y como se utiliza aquí, es una célula especializada madura que transmite y procesa información dentro del sistema nervioso, tanto periférico como central. En los mamíferos, las neuronas se forman durante el desarrollo y no tienen la capacidad de dividirse y regenerar el tejido nervioso tras un daño. Un objeto de la invención es el tratamiento o la prevención de un efecto perjudicial no deseado producido de la isquemia en las neuronas mediante la administración de AG o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

Otros tipos de células que son incapaces de una regeneración efectiva también son objetivos del efecto terapéutico de la presente invención, Por ejemplo, los cardiomiocitos también muestran una capacidad de regeneración limitada y pueden ser dañados por la isquemia. Un objeto de la invención es tratar o prevenir un efecto perjudicial no deseado de la isquemia en los cardiomiocitos mediante la administración de AG o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una realización, la invención está dirigida al tratamiento de la lesión isquémica aguda. El término "lesión isquémica aguda", tal como se utiliza en el presente documento, se dirige a procesos fisiológicos o condiciones médicas, como las descritas en el presente documento, que se desarrollan en un marco de tiempo relativamente corto, por ejemplo dentro de las 24 horas desde el inicio, más preferiblemente dentro de las 12 horas desde el inicio. Una lesión isquémica puede dejar un daño duradero o permanente en el cerebro después de un tiempo muy corto, por ejemplo un daño irreversible, por ejemplo una necrosis, puede ocurrir en el plazo de una hora, pero puede ocurrir en periodos de tiempo más cortos, como al cabo de unos minutos, por ejemplo 5 minutos, 10 minutos o 30 minutos tras el inicio de la isquemia. En una realización, el tratamiento de la lesión isquémica aguda se refiere a un tratamiento de la lesión tan pronto como sea posible después del que se inicie una situación patológica, como por ejemplo en el plazo de 24 horas, 12 horas o 1 hora desde el inicio de la isquemia. Cada tejido tiene una resistencia diferente a la isquemia, dependiendo del tipo de célula y de la cantidad de irrigación colateral, pero incluso los tejidos más resistentes empiezan a desarrollar necrosis en las primeras horas (el tejido intestinal es uno de los más resistentes pero suele observar la presencia de síntomas y necrosis del tejido en las primeras 10 horas).

En una realización, la invención se dirige al tratamiento de la lesión isquémica crónica. El término "lesión isquémica crónica" se refiere a procesos fisiológicos o condiciones médicas que persisten más allá de 24 horas después de su inicio, y pueden persistir durante múltiples días, semanas, meses o años después de su inicio. Un ejemplo de lesión isquémica crónica es la demencia vascular.

De acuerdo con la presente invención, el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo puede estar comprendido en una formulación o composición farmacéutica. Una formulación preparada de acuerdo con la invención comprende al menos dos componentes en una relación adecuada entre sí, en la que al menos uno de los dos componentes es ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo. El segundo de los al menos dos componentes de una fórmula puede ser un simple vector, por ejemplo agua. Una formulación puede ser una mezcla o una estructura como un líquido, una cápsula, un polvo, un aerosol, una píldora, un comprimido o una emulsión, preparada según un procedimiento específico (denominado "fórmula"). Las fórmulas son un aspecto muy importante en la creación de medicamentos. Las fórmulas pueden garantizar, por ejemplo, que el ingrediente activo de un fármaco -que en la presente invención es el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo- se administre en la parte correcta del cuerpo, en la concentración adecuada y/o con la velocidad de liberación correcta (ni demasiado rápida ni demasiado lenta).

Por lo tanto, la formulación de la presente invención es preferentemente una formulación farmacéutica. De acuerdo con la presente invención, el término "formulación farmacéutica" o "composición farmacéutica" se refiere a una formulación para su administración a un mamífero, preferentemente un ser humano. La formulación farmacéutica de la invención puede, opcionalmente, comprender otras moléculas, por ejemplo, compuestos capaces de alterar las características de los compuestos de la invención, por ejemplo, estabilizando, modulando y/o activando su función. La formulación farmacéutica de la presente invención puede, opcional y adicionalmente, comprender un vector farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de vectores farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles, disolventes orgánicos, incluyendo DMSO, etc. Las formulaciones que comprenden dichos portadores pueden formularse por métodos convencionales bien conocidos. Estas formulaciones farmacéuticas pueden administrarse al sujeto en una dosis adecuada. El régimen de dosificación será determinado por el médico que atiende y factores clínicos. Como es bien sabido en las artes médicas, las dosis para cualquier tipo de mamífero dependen de muchos factores, entre ellos el tamaño del mamífero, la superficie corporal, la edad, el compuesto concreto que se va a administrar, el sexo, el momento y la vía de administración, el estado de salud general y administración de otros fármacos de manera simultánea. La cantidad terapéutica eficaz para una situación dada se determinará fácilmente mediante la experimentación rutinaria y está dentro de las habilidades y el juicio del clínico o médico ordinario.

El ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo de acuerdo a la presente invención puede administrarse por vía intravenosa, intradérmica, intraarterial, intraperitoneal, intralesional, intracraneal, intraarticular, intraprostatical, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intrarrectal, tópica, intratumoral, intramuscular, subcutánea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericárdica, intraocular, oral, tópica, local, inhalada (por ejemplo g., inhalación en aerosol), inyección, infusión, infusión continua, perfusión localizada bañando las células diana directamente, a través de un catéter, a través de un lavado, en cremas, en composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas), o por otro método o cualquier combinación de los anteriores como sería conocido de antemano por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado aquí por referencia).

La presente divulgación también incluye kits, paquetes y unidades compuestas por múltiples contenedores que contienen las formulaciones farmacéuticas descritas en el presente documento, ingredientes activos, y/o medios para administrar los mismos para su uso en la prevención y el tratamiento de enfermedades y otras condiciones en mamíferos.

El ácido glicólico (AG) está presente de forma natural en diversas frutas, verduras, carnes y bebidas, aunque en una cantidad inferior a 50 mg/kg (véase Harris y Richardson (1980), Investigative Urology, 18:106-109). 50 mg/kg corresponden al 0,005% (p/p). Por lo tanto, la formulación de la invención comprende preferentemente una cantidad/concentración mayor de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable correspondiente que la cantidad de ácido glicólico que se encuentra en los alimentos naturales.

El experto puede determinar la dosis adecuada de tales formulaciones, así como una dosis adecuada en caso de que el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo se administren directamente a un sujeto. Las cantidades administradas de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo, por un lado, tienen que ser suficientes para el tratamiento o la prevención de las lesiones isquémicas y, por otro lado, no deben ser tan elevadas como para generar una acidosis en el sujeto a tratar. La acidosis es un aumento de la acidez en la sangre y otros tejidos del cuerpo. Se dice que hay acidosis cuando el pH de la sangre, del suero o de los tejidos corporales desciende por debajo de 7,35. Los medios y métodos para determinar el pH en la sangre, el suero y el tejido corporal son bien conocidos. A continuación se discutirán las dosis adecuados.

El efecto tóxico de un exceso de ácido glicólico es conocido, por ejemplo, por el escándalo del vino con dietilenglicol de 1985. El escándalo afectó a un número limitado de bodegas austriacas que habían adulterado ilegalmente sus vinos utilizando la sustancia tóxica dietilenglicol (un ingrediente principal de algunas marcas de anticongelantes) para que los vinos parecieran más dulces y con más cuerpo. La principal causa de toxicidad no es el etilenglicol en sí, sino su principal metabolito, el ácido glicólico. La dosis tóxica mínima de dietilenglicol se estima en 0,14 mg de ácido glicólico por kg de peso corporal y la dosis letal se estima entre 1,0 y 1,63 g/kg. Por lo tanto, la dosis preferida de ácido glicólico y de una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se selecciona de forma que los niveles totales de glicolato no superen los 0,20 mg de glicolato por kg de peso corporal, preferiblemente no superen los 0,14 mg de glicolato por kg de peso corporal, y más preferiblemente no superen los 0,10 mg. Las cantidades inferiores preferidas para combinar con la cantidad máxima son, con preferencia creciente, 0,01, 0,03, 0,05, 0,075 y 0,1 mg de glicolato por kg de peso corporal.

La ruta de administración utilizada para el tratamiento o la prevención del daño isquémico no está limitada. Por lo tanto, la administración puede ser tópica (local), enteral (efecto en todo el sistema, pero administrado a través del tracto gastrointestinal) o parenteral (acción sistémica, pero administrada por vías distintas del tracto gastrointestinal). En cuanto a las aplicaciones sistémicas, se prefiere la vía oral o la intravenosa.

Sin embargo, se prefiere que el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se aplique directamente donde se desea su acción y, por lo tanto, por vía intravascular, más preferiblemente de manera que se ponga en contacto directamente con la arteria ocluida que causó la región de isquemia después de la recanalización para permitir la rápida administración de ácido glicólico a la zona afectada y evitar el daño por isquemia-reperfusión. Debe entenderse que las cantidades de glicolato por kg de peso corporal mencionadas anteriormente deben tenerse en cuenta en particular si el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se administran por vía enteral o parenteral. Las concentraciones y cantidades preferidas de ácido glicólico o una sal farmacéuticamente aceptable o un éster del mismo para estar presente localmente en la sangre que irriga la zona isquémica se discutirán más adelante. También los medios para poner en contacto directamente el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo con la región isquémica se proporcionan a continuación.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, la isquemia está asociada con la aparición de necrosis y apoptosis en el tejido.

Necrosis y apoptosis son los términos médicos para describir la muerte celular. La necrosis y la apoptosis son dos formas de muerte celular. En la necrosis las células mueren repentinamente liberando el contenido celular a la matriz extracelular e induciendo una reacción inflamatoria. La apoptosis es un proceso subagudo que se produce después de una alteración o una agresión que da lugar a la activación de un programa automático de muerte celular.

Es común a todas las enfermedades y lesiones isquémicas descritas en el presente documento que se caractericen por mostrar un aumento de la necrosis y la apoptosis en el tejido que presenta un flujo sanguíneo reducido con la hipoxia correspondiente. A la luz de los ejemplos proporcionados en el presente documento, de la divulgación escrita de la invención y de las capacidades de una persona experta en el tema, el tratamiento de la enfermedad isquémica como tal está suficientemente respaldado por el efecto técnico del ácido glicólico o de una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo sobre los componentes patológicos fundamentales (reducción de la muerte celular y reducción del tamaño de la zona isquémica) que son evidentes en una amplia gama de enfermedades isquémicas, por ejemplo, las que se divulgan en el presente documento.

Los dos aspectos analizados para diagnosticar la gravedad de la muerte neuronal tras la isquemia son: el porcentaje de núcleos apoptóticos (caracterizado por una disminución del tamaño nuclear en comparación con las condiciones de normoxia), y un recuento del número total de neuronas vivas tras 24 horas.

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo debe aplicarse dentro de la arteria ocluida durante la recanalización mecánica o sistémicamente junto con o después de la fibrinolisis sistémica. En el caso de isquemia cerebral global, el ácido glicólico también puede aplicarse únicamente durante el tratamiento para restaurar una función cardiovascular normal con el fin de proteger el tejido neuronal.

Para tratar o prevenir las consecuencias de un insulto isquémico reduciendo el tamaño del área isquémica, el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo preferiblemente entra en contacto directo con las neuronas corticales durante la recanalización. Esto puede hacerse administrando ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo al paciente de acuerdo con la realización preferida de la invención mencionada más arriba. De acuerdo con la realización preferida mencionada más arriba, el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se incluye preferentemente en la composición del disolvente que lleva el compuesto fibrinolítico (activador tisular del plasminógeno (tPA, también conocido como rtPA IV, administrado por vía intravenosa en el brazo) o se aplica a través de un catéter intraarterial después de la recanalización mecánica.

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, el isquemia es una isquemia en un ser humano.

De acuerdo con otra realización preferida de la invención, el ischemia es la isquemia en un animal doméstico mamífero, mamífero de zoológico o mamífero en peligro de extinción.

Además de la isquemia en humanos también el tratamiento de la isquemia en animales mamíferos de producción o animales domésticos mamíferos es de gran interés comercial. Ejemplos no limitantes de animales de producción o animales domésticos mamíferos son el gato, el perro, el ganado, el caballo, el burro, el ratón, la rata, el conejo, el cerdo, la oveja, la cabra y el cerdo de Guinea. Ejemplos no limitantes de un mamífero de zoológico o de un mamífero en peligro de extinción son los elefantes, los tigres, el leopardo, el león, los simios (por ejemplo, el gorila o el chimpancé), los monos (por ejemplo, el tamarino león), la jirafa, el rinoceronte, el oso polar, el búfalo, el delfín y la ballena.

De acuerdo con una realización preferida del método de la invención, el compuesto adicional es/son: (i) un antioxidante, preferentemente coenzima Q10, acetil-L-carnitina, ácido R-a-lipoico, selenio y QIAPI-1, (ii) sustancias que inducen el hipometabolismo, preferentemente grelina, el opioide delta sintético D-Ala(2)-D-Leu(5)-encefalina, rT3, activadores de la hibernación, antabolona, bombesina.

De acuerdo con una realización preferida de la invención, el ácido glicólico o una sal farmacéuticamente aceptable o un éster del mismo se utiliza/comprende al menos en una concentración de 1 mM, 2,5 mM, preferiblemente 5 mM, mejor 10 mM y aún mejor 20 mM. Las concentraciones de hasta 40 mM, o en algunos casos de hasta 60 mM, están comprendidas en algunas realizaciones de la presente invención.

De acuerdo con esta realización preferida y los ejemplos preferidos de la misma, la concentración indicada de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo designa la concentración final de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo en el tejido isquémico que se va a utilizar/tratar.

Para la inyección intra-arterial del compuesto durante la recanalización, esta concentración puede, en una realización, determinarse calculando el volumen de tejido afectado por la arteria, ya sea observando las imágenes de TC y/o RM, o estimando el volumen irrigado por la parte ocluida de la arteria basándose en los conocimientos de anatomía y datos experimentales obtenidos previamente. Una vez determinado el volumen, puede calcularse el volumen de ácido glicólico con una concentración determinada que debe administrarse para alcanzar la concentración final requerida.

Si se va a administrar ácido glicólico por vía sistémica, la cantidad administrada se determinará en función de la superficie corporal, un parámetro basado en una combinación de peso y estatura. Los siguientes cinco métodos para calcular la superficie corporal (BSA) son todos igualmente válidos para nuestro propósito:

Mosteller (Mosteller RD. Simplified Calculation of Body Surface Area. N Engl J Med. 1987 Oct 22;317(17):1098) : BSA (m2) = V (height (cm) x weight (kg)/3600).

DuBois & DuBois (DuBois D, DuBois EF. A formula to estimate the approximate surface area if height and weight be known. Arch Int Med 1916 17:863-71): BSA (m2) = 0.20247 x height (m)0725x weight (kg)0425.

Haycock (Haycock GB, Schwartz GJ, Wisotsky DH. Geometric method for measuring body surface area: A height weight formula validated in infants, children and adults. The Journal of Pediatrics 1978 (93):1:62-66): BSA (m2) = 0.024265 x height (cm)03964x weight (kg)05378.

Gehan & George (Gehan EA, George SL. Estimation of human body surface area from height and weight. Cancer Chemother Rep 197054:225-35): BSA (m2) = 0.0235 x height (cm)042246x weight (kg)051456.

Boyd (The growth of the surface area of the human body. Minneapolis: University of Minnesota Press, 1935): BSA (m2) = 0.0003207 x height (cm)0.3 x weight (grams)07285 -(°0188 x ^gfwe t^).

Como se desprende de los ejemplos y las figuras que se presentan a continuación, la concentración de ácido glicólico utilizada para los experimentos con neuronas corticales de ratón fue de 2,5 y 5 mM antes de la isquemia y de 10 y 20 mM durante la reperfusión. Además, como 10 mM de ácido glicólico aumentó la supervivencia de las neuronas corticales y disminuyó el área isquémica en las neuronas corticales de ratón, se puede suponer que esta concentración o una mayor también aumenta la supervivencia neuronal y reduce el área isquémica en otras especies de mamíferos, en particular en los seres humanos. También se puede considerar que concentraciones más bajas de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo de al menos 2,5 mM o de al menos 5 mM reducen el área isquémica al aumentar la tasa de supervivencia celular. En una realización, la tasa de supervivencia celular se calcula como el número de células vivas (medido como las células con un núcleo intacto de tamaño normal (>30 |-im2)) dividido por el número total de células (incluyendo las células con núcleos de tamaño normal y las células apoptóticas o necróticas con núcleos picnóticos (<30 jm2).

Con respecto a las realizaciones preferidas de la invención mencionadas más arriba, se prefiere que el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se utilice/comprenda como máximo en una concentración de entre 1 mM y 40 mM, como por ejemplo 20mM, preferiblemente 10mM, más preferiblemente 5mM. En cuanto a los rangos preferidos, las distintas concentraciones individuales mínimas y máximas indicadas pueden combinarse libremente. Por lo tanto, se contemplan en la presente invención, entre otros y con preferencia creciente rangos de concentración de 2,5mM a 30mM y de 5mM a 20mM.

El ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse o utilizarse al menos en cantidades de aproximadamente 10 jg /2 millones de neuronas corticales en peligro a 5000 jg /2 millones de neuronas corticales, preferiblemente 100 jg /2 millones de neuronas corticales a 2000 jg /2 millones de neuronas corticales, mejor aproximadamente 190,125 jg /2 millones de neuronas corticales, o aproximadamente 380,25 jg/2 millones de neuronas corticales, o alrededor de 760,5 jg /2 millones de neuronas corticales, y mejor aún alrededor de 1521 |jg/2 millones de neuronas corticales.

De acuerdo con esta realización preferida, la concentración indicada de ácido glicólico o de una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo designa la cantidad de ácido glicólico o de una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo en el tejido que se va a utilizar/tratar basándose en el valor medio de 2 millones de neuronas por ml de volumen de tejido. Las cantidades indicadas de ácido glicólico o de una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo son particularmente útiles en caso de que el infarto sea un infarto instaurado dentro de la última hora. Basándose en las cantidades de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo puestas como ejemplo para las neuronas corticales, el experto puede calcular las cantidades de ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable para otros mamíferos basándose en el valor medio de neuronas/ml de volumen de tejido en el mamífero respectivo.

En una realización, la invención también se refiere a un método ex vivo para aumentar la supervivencia de las neuronas corticales y reducir el tamaño y/o la gravedad de la lesión isquémica, que comprende el contacto del ácido glicólico o una sal farmacéuticamente aceptable o un éster del mismo con las neuronas corticales. En una realización, las neuronas corticales son neuronas corticales primarias de ratón.

Breve descripción de los dibujos

Las siguientes figuras se presentan para describir realizaciones particulares de la invención, demostrando una implementación práctica de la invención, sin limitar el alcance de la invención o de los conceptos aquí descritos. Las figuras muestran:

Figura 1: Tabla de frecuencias por tamaño nuclear durante la normoxia en cultivos de neuronas primarias corticales in vivo.

Figura 2: Tabla de frecuencias por tamaño nuclear tras la isquemia en cultivos de neuronas primarias corticales. La isquemia induce un desplazamiento del tamaño nuclear al aumentar el número de núcleos apoptóticos más pequeños. Este desplazamiento se invierte parcialmente con el pretratamiento con ácido glicólico 2,5 mM y 5 mM o con el tratamiento durante la reperfusión con ácido glicólico 10 y 20 mM.

Figura 3: El pretratamiento con 5 mM de ácido glicólico reduce el número de neuronas apoptóticas (tamaño nuclear < 30 mM) durante la isquemia. Efecto del pretratamiento con 5 mM de ácido glicólico sobre el tamaño nuclear de las neuronas corticales en comparación con las no tratadas durante la isquemia. p<0,05.

Figura 4: El tratamiento con 10 mM de ácido glicólico administrado durante la reperfusión reduce el número de neuronas apoptóticas (tamaño nuclear < 30 mM) tras la isquemia. Efecto del tratamiento con 10 mM de ácido glicólico durante la reperfusión sobre el tamaño nuclear de las neuronas corticales en comparación con las neuronas no tratadas durante la isquemia. p<0,01.

Figura 5: El tratamiento con 20 mM de ácido glicólico administrado durante la reperfusión reduce el número de neuronas apoptóticas (tamaño nuclear < 30 mM) después de la isquemia. Efecto del tratamiento con ácido glicólico 20 mM durante la reperfusión sobre el tamaño nuclear de las neuronas corticales en comparación con las neuronas no tratadas durante la isquemia. p<0,01.

Figura 6: El tratamiento con 10 mM o 20 mM de ácido glicólico administrados durante la reperfusión aumenta la tasa de supervivencia de las neuronas corticales de ratón medida 24 horas después de un insulto isquémico de 60 minutos de duración. P<0.001.

Figura 7: El tratamiento con 2,5 mM o 5 mM de ácido glicólico durante la reperfusión aumenta la tasa de supervivencia de las neuronas corticales de ratón medida 24 horas después de un insulto isquémico de 45 minutos. Las barras de error muestran la media ponderada. * significa P<0,05.

Figura 8: El tratamiento con 2,5 o 5 mM de ácido glicólico (2,5 o 5 mM rep. GA) durante la reperfusión después de la isquemia reduce la apoptosis (mostrada como una reducción en la concentración de LDH después de 24 horas en comparación con las neuronas isquémicas no tratadas) en neuronas corticales de ratón. El efecto fue medido 24 horas después de un insulto isquémico de 45 minutos. * significa p<0,05, *** significa p<0,001. Las barras de error muestran la desviación estándar.

Figura 9: Gráfico mostrando el efecto del ácido glicólico tras la normoxia. El efecto del ácido glicólico en mantener los niveles de LDH reducidos durante la isquemia es específico, ya que no puede observarse este efecto en condiciones de normoxia. n.s. significa no significativo.

Ejemplos ilustrando la invención

La invención además está descrita en los siguientes ejemplos. Los cuales no pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1- Materales y métodos

Modelos de ictus cerebral:

Modelo in vitro de infarto cerebral:

Para imitar la isquemia neuronal in vitro, se cultivaron neuronas corticales primarias in vitro durante 6 días. Después de este tiempo, se realizó una isquemia total o una isquemia parcial.

Isquemia total: el día de la isquemia se cambió el medio de cultivo por PBS (pH = 6,5) que había sido previamente burbujeado con N2 para eliminar todo el O2. En el caso de la isquemia total, para asegurar la ausencia total de oxígeno en el PBS, se añadió ditionita al PBS para capturar el O2 diluido restante. Este proceso garantizó la ausencia tanto de nutrientes como de O2, tal y como cabría esperar en el núcleo de un accidente cerebrovascular.

Penumbra: para imitar la penumbra, se cambió el medio normal por una mezcla de medio sin antioxidantes y PBS (50:50) y se burbujeó con N2 para eliminar el O2 diluido.

En ambos protocolos, las neuronas se colocaron en una cámara de gas llena de N2 y se dejaron allí durante 45 minutos (isquemia) o 1 hora (penumbra). Para imitar la reperfusión, se sustituyó el PBS o el medio/PBS por un medio sin antioxidantes y se dejó en la incubadora durante toda la noche.

Normoxia: para imitar la normoxia, se cambió el medio normal por medio normal sin antioxidantes y se colocó en la incubadora en condiciones normales durante 45 minutos o 1 hora. A continuación, se volvió a cambiar el medio por medio normal y se dejó toda la noche en la incubadora.

En todas las condiciones se fijaron las neuronas y se tiñeron con DRAQ5 (un marcador nuclear) y NeuN (un marcador neuronal) al día siguiente. Se tomaron imágenes con un microscopio OPERA y se analizaron con la ayuda del software de análisis de imágenes FIJI. El parámetro de resultado más fiable para detectar la apoptosis fue la superficie de los núcleos en pm2 y el número de neuronas vivas después de 24 horas. Como puede observarse en las Figuras 1 y 2, la distribución de frecuencias de los tamaños nucleares cambió drásticamente entre la normoxia y la isquemia sin tratamiento.

Además, se determinó la cantidad de LDH liberada al medio. La LDH se libera al medio durante la necrosis (muerte celular inmediata después de un insulto, de 0 a 6 horas después del insulto) y en las etapas tardías de la apoptosis in vitro (de 6 a 24 horas después del insulto) a través de la disrupción de la membrana plasmática [20]. Para ello utilizamos el ensayo de citotoxicidad PIERCE LDH de Life Technologies.

Modelo de infarto cerebral in vivo:

Modelo de oclusión transitoria de la ACM con un filamento (fMCAo por sus siglas en inglés): Los ratones se anestesian con isoflurano administrado en una mezcla de 30% de O2 y 70% de N2O. Se realiza una incisión entre la oreja y el ojo para exponer el hueso temporal. Se coloca una sonda Doppler láser en el cráneo, por encima del territorio de la arteria cerebral media (ACM), y los ratones se colocan en posición supina. Se realiza una incisión en la región de la línea media del cuello y se aíslan y ligan la arteria carótida común y la arteria carótida externa izquierda; se inserta un filamento de 2 mm recubierto de silicona (Doccol, #701912PKRe) en la arteria carótida interna y se confirma la oclusión de la ACM mediante la correspondiente disminución del flujo sanguíneo (es decir, una disminución de la señal de flujo del láser Doppler). Tras 60 minutos de oclusión, se retira el filamento y se inyecta el vehículo, o bien 5, 10, 20 o 40 mM de AG (concentración para el área total de infarto prevista). Durante el periodo de supervivencia, los ratones se mantienen en su jaula con acceso a agua y comida. Los ratones operados de forma simulada reciben el mismo procedimiento quirúrgico, excepto que no se inserta ningún filamento. La temperatura corporal se mantiene durante toda la cirugía mediante una almohadilla térmica controlada por retroalimentación. Se espera que los sujetos tratados con AG muestren una disminución menos severa del flujo sanguíneo.

Volumetría del infarto: Los cerebros se extraen 24 y 72 horas después de la inducción del ictus y se congelan en hielo seco pulverizado. Se cortan criosecciones coronales (de 20 pm de grosor) a intervalos de 400 pm. Las secciones se tiñen con violeta de cresilo de acuerdo con los protocolos estándar y se escanean a 600 dpi. El área del infarto se mide en cada sección utilizando el software ImageJ (NIH). En el modelo fMCAo se calcula una corrección de edema para el volumen del infarto mediante la siguiente fórmula (Área isquémica) = (Volumen de la lesión directa) -[(Hemisferio ipsilateral) - (Hemisferio contralateral)]. El volumen total del infarto se calcula integrando las áreas medidas y los intervalos entre las secciones. Se espera que el tratamiento con AG reduzca el tamaño del volumen del infarto.

Modelos de infarto miocárdico:

Modelo in vivo de infarto miocárdico:

Isquemia-reperfusión en corazones perfundidos: Se realiza la isquemia-reperfusión en corazones perfundidos. Para ello, tras una sobredosis de pentobarbital sódico (150 mg/kg i. p.), se extirpan rápidamente los corazones de los ratones y se perfunden a través de la aorta en un aparato de Langendorff con un tampón de bicarbonato de Krebs-Henseleit modificado (en mmol/l: 140 NaCl, 24 NaHCO3, 2,7 KCl, 0,4 KH2PO4, 1 MgSO4, 1,8 CaCl2 y 11 glucosa, 95 % O2-5 % CO2 a 37°C) a una presión de perfusión de flujo constante de 80 mmHg. La presión del ventrículo izquierdo (VI) se monitoriza con un globo de látex lleno de agua que se inserta en el VI y se infla para obtener una presión diastólica final (LVEDP por sus siglas en inglés) de 6-8 mmHg. La presión desarrollada del VI (LVdevP por sus siglas en inglés) se calcula como la diferencia entre la presión sistólica del VI y la LVEDP. Después de 30 minutos (min) de perfusión normotóxica, los corazones de los ratones se someten a 60 min de isquemia global normotérmica seguida de 60 min de reperfusión con vehículo o con ácido glicólico 5, 10, 20 o 40 mM. La actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) se mide espectrofotométricamente en muestras recogidas del efluente coronario en diferentes momentos del periodo de perfusión y se considera una medida indirecta de la necrosis. Tras 60 minutos de reperfusión, se incuban cortes de corazón en cloruro de trifeniltetrazolio al 1 % para delimitar la zona de necrosis. Los corazones sometidos a perfusión normóxica durante 120 min que sirven de serie de control temporal. Se comparan las áreas de necrosis entre los corazones normoxicados, los tratados con vehículo isquémico y los tratados con ácido glicólico isquémico. Se espera que el tratamiento con AG conduzca a una reducción de la necrosis en comparación con los controles.

Modelo in vitro de infarto miocárdico:

Isquemia-reperfusión en cardiomiocitos aislados: Los cardiomiocitos recién aislados se obtienen de corazones de ratón mediante perfusión retrógrada de colagenasa. Los cardiomiocitos con forma de bastón y tolerantes al calcio se seleccionan mediante centrifugación diferencial en un gradiente de albúmina y se colocan en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina (para estudios confocales) o en placas multipocillo pretratadas con suero de ternera fetal al 4%. Para simular la isquemia-reperfusión (IR) en los cardiomiocitos, se utilizan dos enfoques independientes: la estación de trabajo anóxica bajo una atmósfera controlada de 0 % de O2-5 % de H2 a 37°C (Invivo2 Workstation Ruskinn, Bridgend, Reino Unido) y la cámara de microperfusión adaptada al microscopio (RC-43C/BS4 64-0371 Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA). Para la estación de trabajo anóxica, los cardiomiocitos se colocan en placas de 96 pocillos, se introducen en la atmósfera anóxica y se incuban durante 15 minutos con tampón isquémico ácido sin glucosa (previamente desoxigenado en autoclave y burbujeado con N2 durante 20 minutos) que contiene (en mmol/l): 140 NaCl, 3. 6 KCl, 1,2 MgSO4, 1 CaCl2, 20 HEPES, pH 6,4, y complementado con 4 pmol/l de resazurina, 100 pmol/l de ácido ascórbico, 0,5 mmol/l de ditionita y 100 U/ml de superóxido dismutasa. Para la reperfusión, se lava el tampón isquémico y se añade un tampón de control oxigenado que contiene glucosa (pH 7,4) durante 10 minutos. Para simular la isquemia en la cámara de microperfusión, los cardiomiocitos fijados en laminina y colocados en la platina de un microscopio invertido se perfunden, con la ayuda de una bomba peristáltica, dentro de una cámara de microperfusión cerrada con tampón isquémico (véase más arriba) a pH 6,4, burbujeado continuamente con N2 durante 15 min. La reoxigenación se induce cambiando a una perfusión de control oxigenada y con glucosa, a pH 7,4. Se utilizan como parámetros para medir el resultado la distribución del tamaño de los núcleos y el número de cardiomiocitos vivos 24 horas después de la isquemia. Se espera que el tratamiento con AG conduzca a un mayor número de cardiomiocitos vivos 24 horas después de la isquemia en comparación con los controles.

Modelo de isquemia en extremidades:

Modelo in vivo de isquemia de las extremidades: Los ratones son sometidos a ligaduras femorales unilaterales durante unas horas (4-5) o unos días. El ácido glicólico o el vehículo se inyectan por vía sistémica cuando se retiran las ligaduras. Alternativamente, se administra ácido glicólico antes de la ligadura por vía sistémica. La isquemia se confirma mediante puntuaciones clínicas (daños tisulares y funcionales mediante análisis de la marcha) y escintigrafías de metoxi-isobutil-isonitrilo (MIBI por sus siglas en inglés) en diferentes días 0, 4, 6, 10, 20 y 30. También se realiza un análisis histológico para determinar la extensión de la isquemia. Se espera que el ácido glicólico reduzca la extensión de la isquemia y la muerte celular.

Modelos de isquemia intestinal:

Los conejos se anestesian con barbital al 3%, 30-35 mg/inyecciones intravenosas. El intestino delgado se separa a la izquierda de la incisión abdominal y luego se identifican la AMS (arteria mesentérica superior) y la VSM (vena mesentérica superior). La isquemia mesentérica se confirma cuando se pierde la pulsación mesentérica y el intestino se vuelve pálido. La ligadura se mantiene durante 2, 4 y 6 horas. Al retirar la ligadura, se inyectan el vehículo o el ácido glicólico al animal por vía intra-arterial en el punto de la ligadura de tal forma que se consiga una concentración final en el tejido como la mencionada anteriormente. Alternativamente, el ácido glicólico puede ser administrado sistémicamente antes de la ligadura. Después de retirar la ligadura, el animal se deja en libertad durante 1 y 3 días y luego es perfundido intracardialmente. Las muestras intestinales se embeben en parafina y las secciones se tiñen con una tinción nuclear. Se analiza la distribución del tamaño nuclear en diferentes zonas isquémicas y se compara con la de las zonas no isquémicas. Se espera que el ácido glicólico reduzca el número de núcleos apoptóticos y las zonas isquémicas.

Ejemplo 2 - Resultados experimentales

Los resultados muestran que, en este modelo de isquemia in vitro, la isquemia induce un cambio en el tamaño de los núcleos hacia núcleos más pequeños, como se observa en la apoptosis (ver Figura 1 y Figura 2). Este cambio se invierte parcialmente con un tratamiento previo de 4 días con 5 mM de ácido glicólico (véase la Figura 3) o tratando las neuronas con 10 y 20 mM de ácido glicólico (véanse las Figuras 4 y 5) durante la reperfusión, lo que da lugar a menos núcleos apoptóticos (tamaño nuclear< 30 pm2) y hasta un 65% más de núcleos de tamaño normal (superficie nuclear > 30 pm2) 24 horas después de la isquemia en comparación con las neuronas de control que se sometieron a la isquemia sin ningún tratamiento. Este efecto protector depende del grado de isquemia y alcanza el 100% de rescate en condiciones de penumbra.

Adicionalmente, se contó el número de neuronas corticales vivas 24 horas después de la isquemia. Al aplicar 10 mM y 20 mM de ácido glicólico en condiciones similares a la penumbra, el número de neuronas que sobrevivieron a la isquemia fue similar al número de neuronas observado en normoxia (véase la Figura 6). Esto sugiere que en condiciones de penumbra el ácido glicólico fue capaz de rescatar a todas las neuronas.

Curiosamente, incluso en condiciones de normoxia se observó que el pretratamiento con ácido glicólico 2,5 mM y 5 mM protege a las neuronas contra las condiciones adversas inherentes a un entorno in vitro.

El efecto de concentraciones menores de ácido glicólico se probó administrando estas durante la reperfusión y en un tiempo de administración adicional (1 hora después de la reperfusión). Los resultados muestran que 5 mM de AG administrado durante la reperfusión es suficiente para rescatar el efecto de la isquemia en las neuronas corticales de los ratones (Figura 7). Concentraciones más bajas de ácido glicólico administradas durante la reperfusión no aumentaron la supervivencia (datos no mostrados), pero disminuyeron la concentración de LDH en el medio (véase más adelante).

Por último, para comprobar si el ácido glicólico reducía la necrosis o la apoptosis (muerte celular programada más importante en la penumbra), se controló el aumento de la concentración de lactato deshidrogenasa (LDH) en el medio 24 horas después de la isquemia. La LDH es liberada por las células durante la muerte celular. El aumento de la concentración de LDH durante las primeras 24 horas después de la isquemia se debe a los procesos necróticos y a los eventos apoptóticos. Los resultados muestran que la adición de 2,5 mM y 5 mM de ácido glicólico durante la reperfusión son suficientes para disminuir la concentración de LDH significativamente (p<0,05) en comparación con los controles medido 24 horas después del insulto isquémico (Figura 8). Este efecto se observa sólo en la isquemia, ya que no observamos ninguna diferencia entre los tratamientos en normoxia (Figura 9), lo que también confirma la ausencia de toxicidad del ácido glicólico en las neuronas en estas concentraciones.

Conclusiones

Estos resultados muestran que el ácido glicólico protege a las neuronas de la isquemia. Esta protección se consigue tanto cuando es administrado como pretratamiento como cuando el ácido glicólico se administra durante la reperfusión. Esto tiene importantes implicaciones clínicas, no sólo en los accidentes cerebrovasculares, sino también, potencialmente, en los pacientes que sufren un infarto de miocardio u otras enfermedades isquémicas. El hecho de que el ácido glicólico sea capaz de proteger de la isquemia incluso cuando se administra durante la reperfusión lo convierte en un candidato ideal para tratar a los pacientes durante la fase aguda de la misma. En la clínica, los principales tratamientos del ictus son la recanalización mecánica y la fibrinólisis. La administración de ácido glicólico durante estos procedimientos tiene el potencial de reducir el tamaño del ictus protegiendo el núcleo y la penumbra, lo que conduce a un mejor resultado funcional

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13. W. WKaF: Synthesis of piperidyl(2)-glycolic acid ethyl ester. Arch Pharm Ber Dtsch Pharm Ges 1971, 4(304):248-253.

14. ROBBA M MR: Beta-Substituted Thiophene derivates. I. amino esters of (3-thienyl)-glycolic acids. Ann Pharm Fr 1965, 23:103-111.

15. ZYMALKOWSKI F SW: Preparation of various pyridyl- and quinolyl glycolic acid esters. Arch Pharm Ber Dtsch Pharm Ges 1957, 6(290/62):267-273.

16. Castillo X, Rosafio K, Wyss MT, Drandarov K, Buck A, Pellerin L, Weber B, Hirt L: A Probable Dual Mode of Action for Both L- and D-Lactate Neuroprotection in Cerebral Ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 2015, 35(10):1561-1569.

17. Campos F, Sobrino T, Ramos-Cabrer P, Argibay B, Agulla J, Pérez-Mato M, Rodríguez-González R, Brea D, Castillo J: Neuroprotection by glutamate oxaloacetate transaminase in ischemic stroke: An experimental study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 2011, 31(6):1378-1386.

18. Maniskas ME, Roberts JM, Aron I, Fraser JF, Bix GJ: Stroke neuroprotection revisited: Intra-arterial verapamil is profoundly neuroprotective in experimental acute ischemic stroke. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism 2016, 36(4):721-730.

19. Wang H, James ML, Venkatraman TN, Wilson LJ, Lyuboslavsky P, Myers SJ, Lascola CD, Laskowitz DT: pH-^{Sensitive NMDA Inhibitors Improve Outcome in a Murine Model of} SaH. ^{Neurocritical Care 2014, 20(1):119-131.}

20. Chan FK-M, Moriwaki K, De Rosa MJ: Detection of Necrosis by Release of Lactate Dehydrogenase (LDH) Activity. Methods in molecular biology (Clifton, NJ) 2013, 979:65-70.

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento y/o la prevención de los infartos.

2. Ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según la reivindicación 1, en el que el infarto está asociado a la falta de suministro de sangre u oxígeno a un tejido corporal de un sujeto.

3. Ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad isquémica se caracteriza por un aumento de la necrosis con apoptosis en el tejido hipóxico afectado en comparación con el tejido oxigenado.

4. Ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la isquemia es una isquemia cerebral, isquemia miocárdica, enfermedad periférica, infarto intestinal, una lesión isquémica aguda o una lesión isquémica crónica.

5. Ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se va a aplicar por vía oral o intravenosa.

6. Ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el infarto es un infarto en un ser humano.

7. Ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el infarto es un infarto en un animal de producción, un animal doméstico mamífero, un mamífero de zoológico o un mamífero en peligro de extinción.

8. Un método ex vivo para aumentar la supervivencia de las neuronas corticales y reducir el tamaño y/o la gravedad de la isquemia que comprende poner en contacto el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo con las neuronas corticales.

9. El método de la reivindicación 8, en el que las neuronas corticales son neuronas corticales primarias de ratón.

10. Una composición que comprende ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo y un compuesto adicional reductor del daño isquémico, en el que el compuesto adicional reductor del daño isquémico es - un antioxidante y el antioxidante es uno o más de la coenzima Q10, acetil-L-carnitina, ácido R-a-Lipoico, selenio y QIAPI-1,

- un inductor del hipometabolismo,

- D-Lactato,

- oxaloacetato, o

- un bloqueador de los canales de calcio.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que el inductor del hipometabolismo es uno o más de grelina, el opioide sintético delta D-Ala(2)-D-Leu(5)-encefalina, rT3, un desencadenante de la hibernación, antabolona y bombesina.

12. La composición de la reivindicación 10, en la que el bloqueador del calcio es uno o más de MK-801, budipina, nifedipina, niquel, 2,3-dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo[f]quinoxalina, NBQX, PNQX, YM-90K y ZK200775.

13. El ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el método de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, la composición de las reivindicaciones 10 a 12, en los que el ácido glicólico o una sal o un éster farmacéuticamente aceptable del mismo se administra o se utiliza al menos a una concentración de 2,5 mM, preferiblemente 10 mM, aún más preferiblemente 20 mM y más preferiblemente 40 mM.

14. El ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, el método de cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, la composición de las reivindicaciones 10 a 12, en la que el ácido glicólico o una sal o éster farmacéuticamente aceptable del mismo se administra o utiliza al menos en cantidades de aproximadamente 10 jg /2 millones de neuronas corticales a 5000 jg /2 millones de neuronas corticales, preferiblemente 100 jg /2 millones de neuronas corticales a 2000 jg /2 millones de neuronas corticales, más preferiblemente aproximadamente 190.125 jg /2 millones de neuronas corticales, o aproximadamente 380,25 |jg/2 millones de neuronas corticales, o alrededor de 760,5 jg /2 millones de neuronas corticales, y aún más preferiblemente alrededor de 1521 jg /2 millones de neuronas corticales.