ES2900149T3 - Combinaciones que comprenden antagonistas o inhibidores de AR para su uso en el tratamiento del glioblastoma - Google Patents

Abstract

Una combinación terapéutica de al menos un antagonista de receptor de andrógenos (AR) o inhibidor y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de la tirosina quinasa del receptor (RTK), para su uso en el tratamiento de un tumor glial en un sujeto que lo necesite, en donde el antagonista de AR es bicalutamida, el agente alquilante es carmustina o temozolomida y el inhibidor de RTK es erlotinib o afatinib, o en donde el antagonista de AR es enzalutamida y el inhibidor de RTK es afatinib.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinaciones que comprenden antagonistas o inhibidores de AR para su uso en el tratamiento del glioblastoma

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La invención se refiere al tratamiento del cáncer. Específicamente, la invención está dirigida al uso de combinaciones de fármacos para proporcionar una terapia mejorada para pacientes que padecen tumores gliales tales como glioblastomas como se define en las reivindicaciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] El glioblastoma multiforme (GBM, también conocido como glioblastoma y astrocitoma de grado IV) es un tumor extremadamente agresivo. Los síntomas son similares a los de otros tumores cerebrales y pueden incluir convulsiones, náuseas y vómitos, dolor de cabeza, pérdida de memoria, hemiparesia y memoria progresiva, personalidad o déficit neurológico debido a la afectación del lóbulo temporal y frontal. Aunque cualquier tumor cerebral puede causar convulsiones, su desarrollo se asocia más comúnmente con tumores neuroepiteliales, incluido el GBM. La incidencia de epilepsia en pacientes con GBM varía entre el 30% y el 62%, en aproximadamente dos tercios como síntoma de presentación y en un tercio se desarrolla durante el curso de la enfermedad (Kerkhof et al., 2013).

[0003] Es muy difícil tratar los glioblastomas, debido a varios factores de complicación. Las células tumorales GBM son generalmente muy resistentes a las terapias convencionales. Estos tumores contienen muchos tipos diferentes de células, en las que algunas células pueden responder bien a determinadas terapias, mientras que otras pueden no verse afectadas en absoluto. Otro factor de complicación es que las células cerebrales normales son relativamente susceptibles al daño debido a la terapia convencional, y el cerebro tiene una capacidad muy limitada para repararse a sí mismo en comparación con otros órganos. El hecho de que muchos fármacos no puedan atravesar la barrera hematoencefálica para actuar sobre el tumor limita aún más la gama de quimioterapias adecuadas para el tratamiento de pacientes con GBM.

[0004] El tratamiento para GBM típicamente implica cirugía y radioterapia, y el agente alquilante temozolomida puede usarse como parte del tratamiento de primera línea. Sin embargo, incluso con la quimiorradiación combinada con temozolomida, la mediana de supervivencia es de solo 14,6 meses. Por lo tanto, se requieren nuevos objetivos terapéuticos y formas de realización mejoradas para el tratamiento de GBM.

Receptores de andrógenos

[0005] Los andrógenos y los receptores de andrógenos (AR) desempeñan un papel fundamental en la expresión del fenotipo masculino. Varias enfermedades, como el síndrome de insensibilidad a los andrógenos y el cáncer de próstata (CP), se asocian con alteraciones en las funciones de la AR. De hecho, el bloqueo de andrógenos por fármacos que previenen la producción de andrógenos (terapia de privación de andrógenos) y/o bloquean la acción de AR (antagonistas de AR), se usa de forma rutinaria para inhibir el crecimiento del cáncer de próstata. Sin embargo, la resistencia a estos medicamentos a menudo ocurre dentro de 2-3 años a medida que los pacientes desarrollan cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). La resistencia se asocia típicamente con aberraciones de AR, incluida la regulación positiva de su expresión, la amplificación del gen AR, la expresión de variantes de empalme del receptor de andrógenos y/o mutaciones que dan como resultado receptores aberrantemente activos (p. ej., independientes de ligandos) (Wadosky y Koochekpour 2016).

[0006] El AR pertenece al grupo de hormonas esteroideas de los receptores nucleares. El gen AR (NR3C4, subfamilia 3 del receptor nuclear, grupo C, gen 4) se mapea en el brazo largo del cromosoma X (Xq 11-12). La proteína AR humana está codificada por 8 exones (1-8) y, de manera similar a otros receptores nucleares, consta de dominio regulador N-terminal (NTD), dominio de unión al ADN (DBD), una pequeña región de bisagra y dominio de unión a ligando (LBD). El dominio regulador N-terminal media la mayor parte de la actividad transcripcional de AR. Se han identificado dos isoformas de AR (87 kDa y 110 kDa) en las que el AR de 87 kDa tiene un extremo N truncado en comparación con el AR de longitud completa (Wadosky y Koochekpour 2016).

[0007] Normalmente, el AR es un factor de transcripción dependiente de ligando que controla la expresión de genes específicos. Es secuestrado en el citoplasma por proteínas de choque térmico y co-chaperonas. Al unirse a sus ligandos nativos 5a-dihidrotestosterona (DHT) o testosterona, las chaperonas se disocian, AR se dimeriza y se transloca al núcleo. Allí, se une al elemento de respuesta de andrógenos (ARE) en la región promotora de sus genes diana, que pueden variar según el tipo de célula en donde se expresa AR. También se ha informado que la AR ejerce efectos tanto positivos como negativos sobre los mecanismos de reparación del ADN inducidos por la irradiación, dependiendo de parámetros específicos, incluida la dosis y el momento del tratamiento (Lee et al., 2016). A diferencia de la AR (también conocida como AR "clásica", AR genómica o AR celular), los receptores de andrógenos de membrana (mAR) son un grupo de receptores acoplados a proteína G (GPCR) expresados en la superficie celular que alteran rápidamente la señalización celular mediante la modulación de cascadas de señalización intracelular. Los mAR conocidos o propuestos incluyen GPRC6A y ZIP9. Si bien existen algunas evidencias de que los mAR se unen y son activados por la testosterona y/u otros andrógenos, algunos estudios mostraron que los agonistas, como el R1881 (metiltrienolona) y la mibolerona, y los antiandrógenos, como la flutamida y el acetato de ciproterona, no se unen a los mAR o influyen en las acciones de los andrógenos no clásicos en muchas células. Por lo tanto, AR no está estructuralmente relacionado y es funcionalmente distinto de los mAR.

[0008] Las variantes de empalme de AR, que surgen principalmente a través de omisión de exón e inclusión críptica de exón y/o rangos estructurales del gen AR, tienen estructuras variables pero típicamente carecen todo o una parte del LBD (Wadosky y Koochekpour 2016, Lu et al., 2013). Algunas variantes de empalme se encuentran en tejidos normales, y se ha encontrado que las variantes que carecen de LBD se regulan positivamente en los tumores de próstata y mama y se ha demostrado que se activan en un mecanismo independiente del ligando. Se ha postulado que una de estas formas truncadas, AR-V7/AR3, es un importante impulsor independiente de andrógenos de la expresión génica regulada por AR en CRPC. Ciertas variantes de empalme de AR, que incluyen, entre otras, AR3, se han descrito en los documentos US 8,841422 y EP3062106.

[0009] Hickey et al. (2015) han identificado AR y variantes del mismo, incluido AR-7, en células de cáncer de mama, y han demostrado mediante experimentos ex vivo que la actividad de AR-V7 no se ve alterada significativamente por antagonistas de AR como enzalutamida. Hickey et al. también han demostrado que la expresión de AR-V7 está regulada por enzalutamida en los tumores de mama primarios. La publicación describe que AR puede ejercer efectos positivos o negativos sobre el crecimiento y la expansión de las células tumorales de mama, dependiendo del subtipo molecular del tumor y su expresión de efectores adicionales como el receptor de estrógeno, y además revela una diferencia sorprendente en el perfil de expresión génica inducida por AR-7 en tumores de próstata y mama. Los autores revelan además que sus datos plantean una nota de advertencia para explorar la terapia de privación de andrógenos (p. ej., con antagonistas de AR) en mujeres con cáncer de mama.

[0010] La activación independiente del ligando AR podría lograrse mediante diafonía con diferentes vías de señalización. Dichas vías incluyen receptores de tirosina quinasas (RTK), por ejemplo, los que implican la señalización a través del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF), factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) o erbB-2 (HER2), como consecuencia de activar los efectores posteriores, que incluyen, pero no se limitan a fosfoinositol 3 quinasa (PI3K)/AKT/mTOR. Se ha sugerido que estas vías independientes de AR promueven la supervivencia y el crecimiento de las células cancerosas en el cáncer de próstata (revisado en Tan, Li et al. 2015).

[0011] Las RTK como EGFR también juegan un papel importante en la regulación del crecimiento celular en muchos tumores, incluidos los gliomas (Wick, Weller et al. 2011). La activación de EGFR da como resultado una cascada de PI3K/Akt corriente abajo y facilita la supervivencia, proliferación y migración celular. Se han desarrollado varios inhibidores de EGFR como fármacos contra el cáncer. Por ejemplo, erlotinib (comercializado con el nombre comercial Tarceva) es un inhibidor de EGFR de molécula pequeña indicado para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) localmente avanzado o metastásico con mutaciones activadoras de EGFR, y en combinación con gemcitabina para el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas metastásico. Erlotinib es metabolizado principalmente por la enzima hepática CYP3A4, por lo que debe evitarse su coadministración con inductores de CYP3A4. Al igual que con otros inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña competitivos con ATP, los pacientes desarrollan rápidamente resistencia a erlotinib. Prados et al. (J Clin Oncol 27 (4): 579-584, 2009) se relaciona con un estudio de fase II de erlotinib más temozolomida durante y después de la radioterapia en pacientes con glioblastoma multiforme o gliosarcoma recién diagnosticado. La publicación informa sobre una mejora modesta en la supervivencia media en comparación con los estudios de control históricos, y sobre la necesidad de estudios adicionales.

[0012] El afatinib, un bloqueador irreversible de la familia ErbB (nombre comercial Gilotrif en los EE. UU. y Giotrif en Europa) se probó recientemente en un estudio de fase I/fase II aleatorizado con o sin temozolomida prolongada en adultos con glioblastoma recurrente. Aunque afatinib tiene un perfil de seguridad manejable, su actividad como agente único en pacientes con MBG recurrente no seleccionados fue limitada (Reardon, Nabors et al. 2015). Reardon et al., 2015 concluye además que la adición de afatinib a la temozolomida no mejoró la supervivencia sin progreso. En conclusión, las tasas de respuesta a muchos de estos inhibidores, incluidos erlotinib y afatinib, resultaron decepcionantes en los pacientes con GBM.

[0013] La AR se expresa en diversas células y tejidos, ejerciendo una diversa gama de acciones biológicas que incluyen el desarrollo y mantenimiento de los sistemas reproductivo, musculoesquelético, cardiovascular, inmunológico, neural y hematopoyético. La AR también se ha relacionado con el desarrollo de ciertos tumores, incluidos los de próstata, vejiga, hígado, riñón y pulmón. La expresión de AR también se ha informado en otros tumores como los meningiomas, con ciertas discrepancias y controversias en cuanto a su papel potencial en la tumorogénesis (Davey y Grossmann, 2016, Maxwell et al. 1993, Carroll et al., 1995b).

Células AR y gliales

[0014] Las hormonas esteroides juegan un papel clave en el desarrollo del cerebro y la diferenciación. Sin embargo, la expresión y la importancia de la AR en los gliomas es controvertida. Si bien la expresión de AR, ya sea a nivel de ARN o de proteína, se ha informado en ciertos tumores gliales, no se encontró que la expresión estuviera asociada con una supervivencia o pronóstico alterados. Por ejemplo, Carroll RS et.al. (1995) han observado un ARNm de AR de 9,6 kb en la mayoría de los tumores astrocíticos, mientras que en algunos tumores observaron un segundo ARNm de AR ligeramente más pequeño. También mostraron que en 4 de los 28 pacientes evaluados había una tinción inmunohistoquímica positiva para AR. La publicación no especifica si la expresión de AR fue mayor o menor que en el tejido cerebral normal. Chung YG et al (1996) evaluaron la expresión de AR mediante inmunohistoquímica en 32 astrocitomas y encontraron que la tinción AR positiva estaba presente en 12 de estos casos (38%). La publicación demuestra además que la expresión de AR no se correlacionó con el sexo, el patrón de ploidía del ADN o la supervivencia y, por lo tanto, concluye que no es probable que la expresión de AR esté correlacionada con el potencial proliferativo de los tumores gliales.

[0015] En el sistema nervioso central, los andrógenos pueden ejercer efectos protectores o bien estimulan el daño. De acuerdo con ello, se sugirieron los andrógenos y sus receptores para mediar efectos tanto positivos como negativos sobre las células gliales en el contexto de desarrollo del tumor.

[0016] Bing et al. (2015) examinaron el posible papel de los andrógenos en el desarrollo de la enfermedad de Alzheimer y encontraron que la DHT protegía una línea de células gliales de rata cultivada de la muerte apoptótica inducida por péptidos p-amiloides. La protección fue mediada en parte por la señalización PI3K/Akt. El efecto de los inhibidores de AR no se probó en este sistema.

[0017] Yu et al. (2015) han informado de que la activación de AR por DHT inhibió apoptosis inducida por TGFp y señalización del receptor TGFp en una línea celular de glioma. Los autores han detectado además la sobreexpresión de AR en tejido GBM en sujetos varones adultos y sugirieron que sus resultados proporcionaron evidencia para explicar la epidemiología específica de una mayor incidencia de GBM en hombres.

[0018] Cuando se examinó la muerte celular glial inducida por el ácido yodoacético de agente alquilante (IAA), se encontró que la activación de AR por DHT protegió a los astrocitos corticales primarios de la muerte celular inducida por IAA. La protección fue bloqueada por flutamida de antagonista de AR clásico (Gatson et al., 2007). Por tanto, se encontró que el uso de antagonistas de AR se asociaba con daño al tejido cerebral sano cuando se combinaba con quimioterapia por agentes alquilantes.

[0019] El documento US2012040914 describe una composición para mejorar simultáneamente la eficacia de uno o más agentes quimioterapéuticos y para proteger una o más células cerebrales, neuronas o ambas, en donde los agentes quimioterapéuticos tratan, mejoran los síntomas o retrasan la progresión de uno o más gliomas que comprenden: uno o más agentes quimioterapéuticos seleccionados del grupo que consiste en agentes alquilantes de dacarbazina, salinomicina, temozolomida, procarbazina, nitrosoureas, bis-cloronitrosourea, lomustina y agentes quimioterapéuticos basados en platino; y uno o más agentes activadores del receptor de andrógenos de membrana (mAR) y/o agonistas seleccionados del grupo que consiste en testosterona, DHT, metiltestosterona, metabolitos activos de testosterona, derivados sintéticos de testosterona, esteroides C-19 con una cadena lateral en C-17 y dos grupos metilo angulares, y todos los derivados androgénicos del ciclopentanoperhidrofenantreno. La publicación se refiere además a métodos para tratar, mejorar los síntomas, retrasar la progresión o combinaciones de los mismos del glioblastoma multiforme.

Antagonistas de AR

[0020] Varios antagonistas de AR se han desarrollado y se utilizan principalmente en el tratamiento de cáncer de próstata, e incluyen, por ejemplo, flutamida, nilutamida, bicalutamida (Casodex) y enzalutamida (Xtandi, MDV3100). Las composiciones y métodos de fabricación y uso de antagonistas de AR se describen, por ejemplo, en los documentos US2014100256, US2007004753, US2015239848 y US2015210649. El documento WO 2011050353 A1 se refiere a un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas AR positivas en un individuo diagnosticado o sospechoso de tener cáncer AR positivo, mediante la administración de un compuesto seleccionado de un grupo de compuestos identificados en el mismo como inhibidores de AR. La publicación sugiere además identificar sujetos candidatos para el tratamiento determinando la expresión de AR en el tejido canceroso.

[0021] Las combinaciones de antagonistas de AR con inhibidores de Akt se describen en los documentos US 2014329786 y WO 2015049650 A1. En particular, el documento WO 2015049650 A1 describe una combinación de enzalutamida en combinación con afuresertib para el tratamiento del cáncer.

[0022] La bicalutamida está indicada como un medio de terapia de privación de andrógenos para el tratamiento del cáncer de próstata metastásico en estadio D2 en combinación con castración (farmacológica con un análogo de GnRH o quirúrgica con una orquiectomía) o en una dosis más alta como monoterapia. Aunque es un antagonista puro o silencioso del AR en circunstancias normales, se ha encontrado que la bicalutamida, así como otros antiandrógenos anteriores como flutamida y nilutamida, poseen propiedades agonistas parciales débiles en el contexto de sobreexpresión de AR y actividad agonista en el caso de ciertas mutaciones en el dominio de unión a ligando del AR. Como ambas circunstancias pueden eventualmente ocurrir en el cáncer de próstata, generalmente se desarrolla resistencia a la bicalutamida y el medicamento tiene el potencial de estimular paradójicamente el crecimiento del tumor cuando esto sucede.

[0023] La enzalutamida es un antiandrógeno puro no esteroideo sintético desarrollado para el tratamiento del cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. A diferencia de la bicalutamida, la enzalutamida no promueve la translocación de AR al núcleo celular y además evita la unión de AR al ADN y AR a proteínas coactivadoras. Como en otros antagonistas de AR, se ha documentado la resistencia a enzalutamida con el uso continuo. El documento US2015265587 se refiere a variantes de AR resistentes a enzalutamida, que pueden contener una mutación que se correlaciona con la incidencia de cáncer de próstata resistente a la castración, seleccionada entre F876C, F876I, F876L, F876S, F876V, F876Y, E565K, E588K, S647G, E668K, C686Y, D695E, A699T, R726H, N727I, N771S, H776Y, C784R y/o K910E. Las variantes de AR adicionales, descritas como resistentes a los fármacos antiandrógenos disponibles, se describen en el documento US 8,841422.

[0024] La enzalutamida atraviesa la barrera hematoencefálica (BBB) y su actividad en el cerebro está asociada con el desarrollo de efectos adversos. Se encontró que el uso de enzalutamida en pacientes con cáncer de próstata estaba asociado con eventos adversos neuropsiquiátricos que incluyen convulsiones, deterioro de la memoria y alucinaciones, en los que los factores predisponentes incluían metástasis cerebrales. En consecuencia, se recomienda el uso de enzalutamida en pacientes que carecen de metástasis en el sistema nervioso central (SNC), antecedentes de convulsiones o que tienen otros factores predisponentes que podrían reducir el umbral de convulsiones (Rodríguez-Vida et al., 2015). Se sugirió que ciertos eventos adversos inducidos por enzalutamida estaban mediados por la unión fuera del objetivo y la inhibición del receptor GABAa en el SNC.

[0025] La enzalutamida es un inductor fuerte de CYP3A4 y un inductor moderado de CYP2C9 y CYP2C19, y es metabolizada por CYP2C8. En consecuencia, se recomienda evitar el uso concomitante de enzalutamida con medicamentos con un rango terapéutico estrecho que son sustratos de CYP3A4, CYP2C9 y CYP2C19, así como con inhibidores potentes de CYP2C8.

[0026] A pesar de los amplios esfuerzos realizados hasta ahora, el tiempo medio de supervivencia de los pacientes con GBM es todavía muy pobre, en parte debido a la falta de opciones terapéuticas adecuadas. Sigue existiendo una necesidad médica no satisfecha de tratamientos eficaces y seguros para los tumores cerebrales, como el GBM, que inhiben el desarrollo de tumores con efectos secundarios minimizados.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0027] La invención se refiere al tratamiento de tumores gliales, específicamente a una terapia mejorada para el glioblastoma (GBM) utilizando moduladores endocrinos específicos y combinaciones de fármacos. Las composiciones según formas de realización de la invención emplean el uso de inhibidores del receptor de andrógenos (AR) en combinación con inhibidores del receptor de tirosina quinasa (RTK) y/o agentes alquilantes, como se define en las reivindicaciones. Según determinadas formas de realización ventajosas, el uso del inhibidor de AR enzalutamida, opcionalmente en combinación con inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como erlotinib (Tarceva) y afatinib (Gilotrif) y agentes alquilantes como carmustina (BCNU) y temozolomida (TMZ), se contempla. La invención se refiere a una combinación terapéutica de al menos un antagonista o inhibidor del receptor de andrógenos (AR) y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de la tirosina quinasa del receptor (RTK), para su uso en el tratamiento un tumor glial en un sujeto que lo necesita, en donde el antagonista de AR es bicalutamida, el agente alquilante es carmustina o temozolomida y el inhibidor de RTK es erlotinib o afatinib, o en donde el antagonista de AR es enzalutamida y el inhibidor de RTK es afatinib.

[0028] Las referencias a métodos de tratamiento de esta descripción se han de interpretar como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) de la terapia (o diagnóstico).

[0029] La invención se basa, en parte, en el sorprendente descubrimiento de que las alteraciones genéticas en el locus AR se asocian con GBM y tumores cerebrales relacionados. Específicamente, un número de copias en todo el genoma y una matriz de pérdida de heterocigosidad realizada en el ADN extraído de muestras de tumores GBM de mujeres reveló una amplificación de la región AR (Xq12) en la mayoría de las muestras, que a menudo se acompañaba de pérdida de heterocigosidad (LOH) en el alelo restante. Los estudios de inactivación cromosómica realizados en muestras de GBM de 35 mujeres revelaron que el alelo inactivado de esta región se perdió en 34 muestras. También se identificó una expresión mejorada de AR tanto a nivel de ARNm como de proteína en muestras tumorales obtenidas de pacientes masculinos y femeninos. Además, se encontró inesperadamente que el 30% de las muestras expresaban una variante de empalme de AR que carece del dominio de unión al ligando (LBD), a saber, la variante 7 de AR (AR-7), que se informó que está asociada con el desarrollo de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC).

[0030] La invención se basa además, en parte, en el descubrimiento inesperado que la incubación con antagonistas AR bicalutamida o enzalutamida redujo la supervivencia celular de glioblastoma, en donde la enzalutamida fue más eficaz que la bicalutamida en todas las líneas celulares ensayadas. El efecto fue dependiente de la dosis y además varió dependiendo del nivel de expresión de la proteína AR. La reducción también se demostró sorprendentemente en líneas celulares GBM que expresan AR-7, así como en el tratamiento de tumores de glioblastoma de xenoinjerto in vivo.

[0031] Además, la invención se basa, en parte, en el descubrimiento sorprendente que las combinaciones de los antagonistas de AR enzalutamida y bicalutamida con inhibidores EGFR de antagonista RTK de erlotinib o afatinib, que comprende además opcionalmente el agente alquilante carmustina, a dosis subterapéuticas, disminuyó de manera sinérgica la viabilidad de líneas celulares de glioblastoma que expresan AR y AR-7.

[0032] Las composiciones de la invención son, en algunas formas de realización particularmente adecuadas para, y permiten el tratamiento de nuevas poblaciones de pacientes, hasta ahora no consideradas susceptibles para el tratamiento mediante la terapia convencional del cáncer o por la terapia hormonal. En otras formas de realización, las composiciones ventajosas de acuerdo con la invención proporcionan una eficacia mejorada y/o una seguridad mejorada.

[0033] Los tumores susceptibles para el tratamiento de acuerdo con formas de realización de la invención se caracterizan por la expresión del AR en al menos una parte de las células tumorales. En una forma de realización, el tumor es un astrocitoma. En otra forma de realización, dicho tumor es un glioma. Según diversas formas de realización, el tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma anaplásico, astrocitoma difuso, oligodendroglioma, oligodendroglioma anaplásico y tumores mixtos (p. ej., oligoastrocitoma u oligoastrocitoma anaplásico). Según formas de realización específicas, el tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma anaplásico, astrocitoma difuso y oligodendroglioma. En una forma de realización preferida, dicho tumor es glioblastoma. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0034] En otra forma de realización, el tumor se caracteriza por la amplificación en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. Según diversas formas de realización, dicha amplificación está asociada con un aumento (ganancia) del número de copias del gen AR de al menos uno, y típicamente hasta 20. En varias realizaciones específicas, dicha amplificación está asociada con un aumento de 1-3, 1-5, 1-10, 1-20, 2-4, 2-6, 5-10 o 5-20 en el número de copia del gen AR. Según otra forma de realización más, dicho tumor se caracteriza por la pérdida de heterocigosidad (LOH) en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. Según otra forma de realización más, dicho tumor se caracteriza por la amplificación de un alelo y LOH en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales.

[0035] En otra forma de realización dicho tumor se caracteriza por sobre-expresión de AR en al menos una parte de las células tumorales. En otras formas de realización, dicha sobreexpresión está asociada con una elevación de al menos 1,1 veces y típicamente hasta 150 veces en el nivel de proteína y/o hasta 350.000 veces en el nivel de ARNm (en comparación con el nivel respectivo en células no tumorales). Más típicamente, dicha sobreexpresión está asociada, en tumores susceptibles de tratamiento mediante los métodos de la invención, con una elevación de al menos 1,1-20 o 1,1-10 veces en el nivel de proteína y/o ARNm. En varias realizaciones específicas, dicha sobreexpresión está asociada con una elevación de 1,1-2, 1,2-3, 1,3-4, 1,2-1,6, 1,4-5 1,2-20 o 1,3-10 veces en los niveles de proteína AR.

[0036] En otra forma de realización dicho tumor se caracteriza por la expresión de al menos una variante AR en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, la variante se caracteriza por una deleción o mutación en el LBD (p. ej., debido a la exclusión del exón por corte y empalme alternativo). En otra forma de realización, la variante es una variante de empalme de AR independiente de ligando. En otra forma de realización dicha variante es AR-7. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la sobreexpresión de AR de tipo salvaje y por la expresión de al menos una variante de AR en al menos una porción de las células tumorales. Según otra forma de realización más, dicho tumor se caracteriza por la expresión de al menos una variante de AR y además se caracteriza por LOH en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR-V7 y además se caracteriza por LOH en el locus del gen AR, en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la sobreexpresión de AR de tipo salvaje y por la expresión de AR-V7 en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la sobreexpresión de AR y AR-V7 de tipo salvaje en al menos una parte de las células tumorales. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0037] En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR (o al menos una aberración AR como se describe en el presente documento, por ejemplo, la amplificación en el locus del gen AR, LOH, sobre­ expresión AR y/o la expresión de al menos una variante AR) en al menos una parte de las células tumorales, y se caracteriza además por la expresión de EGFR en al menos una parte de las células tumorales. En una forma de realización particular, dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR-V7 y EGFR.

[0038] En otra forma de realización, el sujeto es humano. En otra forma de realización, el sujeto es una mujer. En otra forma de realización, el sujeto es un hombre. En otra forma de realización, dicho sujeto no padece cáncer de próstata o cáncer de mama.

[0039] Mientras que los inhibidores de la AR como enzalutamida se describen en este documento como sorprendentemente eficaces en la gestión de GBM cuando se utiliza como un agente terapéutico individual, la invención describe además que tales agentes de forma inesperada se pueden usar en combinación con otras quimioterapias y agentes anti-cáncer, con daño minimizado o reducido a los tejidos circundantes y otros órganos. Según otras formas de realización, las combinaciones descritas en el presente documento exhiben efectos mejorados e incluso sinérgicos en comparación con cada tratamiento solo. Según formas de realización adicionales, los efectos mejorados exhibidos por las combinaciones de fármacos descritas en este documento permiten su uso en dosis más bajas que las aceptables para cada fármaco solo. Por tanto, las combinaciones de la invención pueden usarse en algunas formas de realización en pacientes que no son susceptibles de tratamiento con cada fármaco solo debido a una seguridad deteriorada y/o una eficacia insuficiente.

[0040] El antagonista o inhibidor de AR se administra en combinación (simultánea o secuencial) con al menos un agente contra el cáncer, tal como se define en las reivindicaciones. En otra forma de realización, el al menos un agente anticanceroso comprende un fármaco quimioterapéutico que es un agente alquilante, por ejemplo, carmustina o temozolomida. En otra forma de realización, el al menos un agente anticanceroso comprende un inhibidor de RTK. En una forma de realización particular, el inhibidor de RTK es un antagonista de EGFR, por ejemplo, erlotinib o afatinib. En otra forma de realización, dicho al menos un agente anticanceroso comprende al menos un agente alquilante y al menos un inhibidor de RTK. En otra forma de realización, dicho al menos un agente anticanceroso comprende al menos un agente alquilante y al menos un antagonista de EGFR. En un aspecto particular no reivindicado, los métodos de la divulgación comprenden administrar al sujeto enzalutamida en combinación con carmustina y erlotinib. En otra forma de realización particular, los métodos de la invención comprenden administrar al sujeto enzalutamida en combinación con carmustina y afatinib.

[0041] Por tanto, en un aspecto, se proporciona una combinación terapéutica de al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK, para su uso en el tratamiento de un tumor glial en un sujeto que lo necesita, en donde el antagonista de AR es bicalutamida, el agente alquilante es carmustina o temozolomida y el inhibidor de RTK es erlotinib o afatinib, o en donde el antagonista de AR es enzalutamida y el inhibidor de RTK es afatinib. Según formas de realización particulares, la combinación se selecciona del grupo que consiste en: (I) bicalutamida y erlotinib, (ii) bicalutamida, carmustina y erlotinib, y (iii) enzalutamida y afatinib.

[0042] Por ejemplo, según formas de realización de la invención, un tumor caracterizado por expresión de AR (en al menos una parte de las células tumorales) puede tratarse con un antagonista o inhibidor de AR como se describe en el presente documento. Un tumor caracterizado por la expresión de una variante de AR caracterizado por deleción o mutación en el LBD y/o una variante de corte y empalme de AR independiente de ligando puede tratarse mediante terapia de combinación como se describe en el presente documento. En un ejemplo particular, un tumor caracterizado por la expresión de la variante AR (p. ej., AR-V7) y EGFR puede tratarse ventajosamente mediante una combinación de un antagonista o inhibidor de AR (p. ej., enzalutamida) y un antagonista de EGFR (p. ej., afatinib).

[0043] En otro aspecto no reivindicado, se proporciona una combinación terapéutica para el tratamiento de tumores cerebrales, que comprende al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK. En otra forma de realización, la combinación está en forma de una composición farmacéutica que comprende además uno o más vehículos, excipientes o diluyentes. En otra forma de realización, la composición es formulada para administración oral.

[0044] En otro aspecto no reivindicado, dicha combinación es en forma de un kit que comprende además instrucciones para la administración de dicha combinación a un sujeto aquejado de un tumor neuroepitelial que expresa AR, por ejemplo GBM. Por tanto, en otro aspecto, se proporciona un kit para el tratamiento de un tumor neuroepitelial que expresa AR, que comprende un inhibidor de AR tal como enzalutamida o un derivado del mismo, en combinación con un agente alquilante y/o un antagonista de EGFR. En otro aspecto, el kit comprende además instrucciones para administrar el inhibidor de AR en combinación simultánea o secuencial con el agente alquilante y/o un antagonista de EGFR a un sujeto afectado por un tumor neuroepitelial que expresa AR, por ejemplo, glioblastoma.

[0045] En otro aspecto no reivindicado, la invención se refiere a enzalutamida o un derivado del mismo para uso en el tratamiento de un tumor neuroepitelial en un sujeto en necesidad del mismo, en donde la enzalutamida o derivado de la misma se utiliza en una cantidad terapéuticamente eficaz y el tumor se caracteriza por la expresión de AR en al menos una parte de las células tumorales.

[0046] En una forma de realización, dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma anaplásico, astrocitoma difuso, oligodendroglioma, oligodendroglioma anaplásico, oligoastrocitoma y oligoastrocitoma anaplásico. En una forma de realización particular, dicho tumor es glioblastoma. En otra forma de realización dicho tumor se caracteriza por: amplificación en el locus del gen AR, LOH en el locus del gen AR, sobreexpresión de AR y/o expresión de al menos una variante de AR, en al menos una porción de las células tumorales. En otra forma de realización, la amplificación está asociada con un aumento del número de copias del gen AR de 1 a 20. En otra forma de realización, dicha sobreexpresión está asociada con una elevación de 1,1 a 20 veces en el nivel de proteína AR. En otra forma de realización, la variante se selecciona del grupo que consiste en una variante caracterizada por deleción o mutación en el LBD y una variante de corte y empalme de AR independiente de ligando. En una forma de realización particular dicha variante es AR-V7. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR-V7 y además se caracteriza por al menos uno de: sobreexpresión de AR de tipo salvaje, sobreexpresión de AR-V7 y LOH en el locus del gen AR, en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, el sujeto es un ser humano y/o el sujeto es una mujer.

[0047] En otro aspecto no reivindicado, la descripción se refiere a una combinación terapéutica de al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK, para su uso en el tratamiento de un tumor glial caracterizado por expresión de AR en al menos una porción de las células tumorales en un sujeto que lo necesite. En otro aspecto, el antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida o un derivado de la misma, el agente alquilante se selecciona del grupo que consiste en temozolomida, carmustina y sus derivados y sales, y el inhibidor de RTK se selecciona del grupo que consiste en afatinib, erlotinib y derivados y sales de los mismos.

[0048] En otro aspecto no reivindicado, dicha combinación terapéutica está en forma de una composición farmacéutica que comprende el al menos un antagonista de AR o inhibidor y el al menos un agente anti-cáncer. En otra forma de realización, el antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida o un derivado de la misma, el agente alquilante se selecciona del grupo que consiste en temozolomida, carmustina y sus derivados y sales, y el inhibidor de RTK se selecciona del grupo que consiste en afatinib, erlotinib y derivados y sales de los mismos.

[0049] Preferiblemente, dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma anaplásico, el astrocitoma difuso, oligodendroglioma, oligodendroglioma anaplásico, oligoastrocitoma y oligoastrocitoma anaplásico. Más preferiblemente, dicho tumor es glioblastoma.

[0050] En otra forma de realización dicho tumor se caracteriza por la amplificación en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. Preferiblemente, dicho tumor está asociado con un aumento del número de copias del gen AR de 1 a 20. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por LOH en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por una sobreexpresión de AR en al menos una parte de las células tumorales. Preferiblemente, dicho tumor está asociado con una elevación de 1,1 a 20 veces del nivel de proteína AR. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de al menos una variante de AR en al menos una porción de las células tumorales, en donde la variante se selecciona del grupo que consiste en una variante caracterizada por deleción o mutación en el LBD y una variante de empalme independiente de ligando AR. Preferiblemente, dicha variante es AR-V7. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la sobreexpresión de AR de tipo salvaje y por la expresión de AR-V7 en al menos una parte de las células tumorales, o por la sobreexpresión de AR de tipo salvaje y la sobreexpresión de AR-V7 en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR-V7 y además se caracteriza por LOH en el locus del gen AR, en al menos una parte de las células tumorales. En otra forma de realización, el sujeto es un ser humano y/o el sujeto es una mujer.

[0051] En otra forma de realización, dicho antagonista de AR o inhibidor está adaptado para la administración en combinación concurrente o secuencial con al menos un agente anti-cáncer adicional. En otra forma de realización, el al menos un agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK.

[0052] En otra forma de realización en donde se ha determinado que la expresión de AR-V7 está presente en la muestra, dicho antagonista o inhibidor de AR es para su uso mediante la administración a dicho sujeto en combinación concurrente o secuencial con al menos un agente anti-cáncer adicional, como se define en las reivindicaciones. En otra forma de realización, el al menos un agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK. En otra forma de realización, el tratamiento comprende administrar a dicho sujeto al menos un antagonista o inhibidor de AR, al menos un agente alquilante y al menos un inhibidor de RTK. En otro aspecto, dicho al menos un agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en temozolomida, carmustina, afatinib, erlotinib y derivados y sales de los mismos. En otra forma de realización, el AR, un tagonista o inhibidor es enzalutamida o un derivado de la misma. En otro aspecto no reivindicado, el tratamiento comprende administrar a dicho sujeto enzalutamida, carmustina y erlotinib.

[0053] Además, dicho tumor puede haber sido determinado por estar caracterizado por la expresión de EGFR en al menos una parte de las células tumorales, y el tratamiento puede comprender administrar a dicho sujeto al menos un antagonista de AR o inhibidor en combinación concurrente o secuencial con al menos un antagonista de EGFR. El tratamiento puede comprender además administrar a dicho sujeto enzalutamida en combinación concurrente o secuencial con el antagonista de EGFR afatinib, o sales del mismo.

[0054] En otro aspecto la invención proporciona una composición farmacéutica para uso en el tratamiento de tumores gliales, que comprende al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK, como se define en las reivindicaciones. En otro aspecto no reivindicado, la composición comprende: (i) enzalutamida, (ii) carmustina o temozolomida, (iii) erlotinib o afatinib, y (iv) uno o más vehículos, excipientes o diluyentes. En otra forma de realización, dicha composición se formula para administración oral.

[0055] En otro aspecto, se proporciona un kit que comprende una combinación de al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK, que comprende además instrucciones para la administración de dicha combinación a un sujeto que padece un tumor neuroepitelial que expresa AR. En otra forma de realización, el tumor neuroepitelial es glioblastoma.

[0056] Otros objetos, características y ventajas de la presente invención quedarán claras a partir de la siguiente descripción y los dibujos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0057]

Figura 1. Aberraciones de ADN en glioblastoma. Se realizaron estudios de inactivación cromosómica basados en los patrones de metilación diferencial en muestras de GBM de 35 mujeres. Se utilizó el par de enzimas isosquizoméricas MspI/HpaII para analizar el estado de metilación del ADN en el locus AR. La amplificación de AR se demuestra como la curva de fusión del amplicón amplificado. La amplificación del ADN sin cortar se compara con los restringidos con HpaII/MspI como se indica en el gráfico.

Figuras 2A-2G. Expresión de ARN de AR en tumores en comparación con tejido normal. La Figura 2A representa el análisis de PCR cuantitativa (qPCR) de la expresión de ARNm de AR después de la normalización a HPRT en muestras de tumor de 30 GBM y líneas celulares de 3 GBM. Las Figuras 2B-2E representan la expresión del AR ARN analizada usando Oncomine™. Figura 2B, expresión de ARN de AR de GBM de la base de datos TCGA; Figura 2C, expresión de ARN de AR de GBM de la cohorte de Murat; Figura 2D, expresión de ARN de glioma AR de la cohorte Sun; Figura 2E, expresión de ARN de AR de meningioma de la cohorte Watson. Las Figuras 2F-2G representan análisis de la expresión de AR en el carcinoma de próstata en las cohortes Yu y Vanaja, respectivamente.

Figura 3. Expresión de la proteína AR en GBM. El análisis de transferencia Western, usando sondeo secuencial con anticuerpo policlonal contra carriles superiores AR (N20); o carriles Anti-P-Actin (AC-74) inferiores, en 16 muestras de GBM femeninas (F) o masculinas (M) y 1 cerebro normal (NB). Los histogramas representan las intensidades relativas cuantificadas.

Figuras 4A-4F. El efecto de dos antagonistas de AR, bicalutamida y enzalutamida sobre la supervivencia celular de tres líneas celulares de glioma (A172, U87MG y T98G). Figura 4A: supervivencia de las células A172. Figura 4B: supervivencia de células U87MG. Figura 4C: supervivencia de células T98G. Figura 4D: supervivencia de células PC3. Figura 4E: análisis de transferencia Western, usando sondeo secuencial con anticuerpo policlonal contra carriles superiores AR (N20); o carriles inferiores monoclonales anti-GAPDH (0411), en líneas celulares HEK 293, A172, U87MG y T98G. Figura 4F: Un análisis del ciclo celular de células de glioma tratadas con DHT 10 gm, solo o con enzalutamida 40 gm u 80 gm, en comparación con células tratadas con vehículo.

Figura 5. GBM expresan además del AR de tipo salvaje la variante de empalme AR 7 que carece del LBD. La variante AR 7 (A3) se analizó mediante qPCR en 20 muestras de GBM. Los fragmentos de 125 pb resultantes se sometieron a electroforesis en una metáfora al 3,5% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio (marcados con flechas).

Figuras 6A-6E. Terapias de combinación de agentes de señalización anti-AR junto con agentes que se dirigen a EGFR en la línea celular T98G que expresa una variante de empalme de AR independiente de ligando. Figura 6A: La variante 7 de AR (A3) se analizó mediante qPCR en líneas celulares A172, U87MG y T98G. Figura 6B: Se trataron células T98g durante 72 horas con Dh T (10 gm) y Tarceva (Tra, 1,25-10 gm) con o sin 20 gm de bicalutamida (BIC). Las células tratadas con DHT solo sirvieron como control. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo Crystal Violet y se expresó como porcentaje de células tratadas con vehículo. Figura 6C: Se trataron células T98G durante 72 horas con afatinib (Afa, 1,25-5 gm) con o sin 20 gm de enzalutamida (ENZ), y se determinó y calculó la viabilidad celular como en la Figura 6B. Figura 6D: Se trataron células U87MG durante 72 horas con 10 gm de DHT solo o en combinación con bicalutamida 20 gm (BIC), 2,5 gm de Tarceva (Tra), con 10 mg/ml de BCNU solo o con una combinación de los cuatro agentes. La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo Crystal Violet y se expresó como porcentaje de células tratadas con DHT.

Figura 7. Eficacia in vivo de la terapia con antiandrógenos (Enazlutamida - Xtandi) en xenoinjertos de glioblastoma humano U87MG. Cada punto representa el tamaño medio del tumor ± SEM.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0058] La invención se refiere al tratamiento de tumores gliales, específicamente a la terapia mejorada para el glioblastoma (GBM) utilizando moduladores endocrinos específicos y fármacos combinaciones. Las composiciones de acuerdo con las formas de realización de la invención emplean el uso de inhibidores del receptor de andrógenos (AR), solos o en combinación con inhibidores del receptor de tirosina quinasa (RTK) y/o agentes alquilantes, como se define en las reivindicaciones. Según ciertos aspectos ventajosos, el uso del inhibidor de AR enzalutamida, opcionalmente en combinación con inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) como erlotinib (Tarceva) y afatinib y agentes alquilantes como carmustina (BCNU) y temozolomida (TMZ), es contemplado.

[0059] En un aspecto no reivindicado, la descripción se refiere a enzalutamida o un derivado de la misma para uso en el tratamiento de un tumor neuroepitelial en un sujeto en necesidad del mismo, en donde el enzalutamida o derivado del mismo se utiliza en una cantidad terapéuticamente eficaz y la El tumor se caracteriza por la expresión de AR en al menos una porción de las células tumorales. En otro aspecto, la divulgación se refiere a al menos un antagonista o inhibidor de AR, para su uso en el tratamiento de un tumor glial en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar para el sujeto, al menos un antagonista o inhibidor de AR en una cantidad terapéuticamente eficaz.

[0060] Según la invención, se proporciona una combinación terapéutica de al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK, para su uso en el tratamiento de una glial tumor en un sujeto que lo necesita, en donde el antagonista de AR es bicalutamida, el agente alquilante es carmustina o temozolomida y el inhibidor de RTK es erlotinib o afatinib, o en donde el antagonista de AR es enzalutamida y el inhibidor de RTK es afatinib. Según formas de realización particulares, la combinación se selecciona del grupo que consiste en: (i) bicalutamida y erlotinib, (ii) bicalutamida, carmustina y erlotinib, y (iii) enzalutamida y afatinib.

[0061] En aún otro aspecto, la descripción se refiere a una combinación terapéutica para el tratamiento de tumores cerebrales, que comprende al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK. En otro aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores cerebrales, que comprende al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK. En otro aspecto, se proporciona un kit que comprende una combinación de al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK, que comprende además instrucciones para administrar dicha combinación a un sujeto afectado por un tumor neuroepitelial que expresa AR.

Enzalutamida y otros antagonistas e inhibidores de AR.

[0062] La enzalutamida es un inhibidor del receptor de andrógenos del nombre químico 4-{3-[4-ciano-3-(trifluorometil)fenil]-5,5-dimetil-4-oxo-2-sulfanilidenimidazolidin-1-il}-2-fluoro-N-metilbenzamida. La estructura de la enzalutamida está representada por la siguiente fórmula:

[0063] La enzalutamida está disponible comercialmente con el nombre comercial XTANDI, proporcionada como cápsulas de gelatina blanda rellenas de líquido para administración oral. Cada cápsula contiene 40 mg de enzalutamida como solución en polioxilglicéridos de caprilocaproilo. Los ingredientes inactivos son caprilocaproil polioxilglicéridos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, gelatina, solución de sorbitol sorbitán, glicerina, agua purificada, dióxido de titanio y óxido de hierro negro.

[0064] Derivados de enzalutamida se han descrito, por ejemplo en Bassetto et al. (2016) y US 7,709,517, que describen ciertos compuestos antagonistas de AR que incluyen derivados de enzalutamida. Los derivados de enzalutamida usados en las composiciones, métodos y kits de la divulgación son moléculas pequeñas relacionadas estructural y funcionalmente, cuya estructura química se basa en el armazón de enzalutamida con ciertas sustituciones o modificaciones, que retienen las funciones biológicas asociadas con la actividad de enzalutamida como se describe en este documento. Por ejemplo, las sustituciones o modificaciones pueden incluir la introducción/cambio de posición de grupos trifluorometilo y trifluorometoxi. Funcionalmente, los derivados preferidos se caracterizan como antagonistas de AR puros que tienen actividades agonistas mínimas o nulas. Los derivados de enzalutamida usados en aspectos de la divulgación son farmacológicamente equivalentes con enzalutamida. En un aspecto particular, el derivado de enzalutamida es apalutamida (también conocida como ARN-509 y JNJ-56021927).

[0065] Otros aspectos de la divulgación emplean el uso de compuestos adicionales, que son antagonistas de AR específicos o inhibidores. Como se usa en este documento, el término "antagonista de AR" o "inhibidor de AR" se usa indistintamente en este documento y se refiere a un agente que inhibe o reduce específicamente al menos una actividad de un polipéptido AR. Las actividades de AR ejemplares incluyen, pero no se limitan a unión de coactivador, unión de ADN, unión de ligando y translocación nuclear.

[0066] Los antagonistas e inhibidores de la AR incluyen diversos agentes que inhiben la actividad o expresión de AR y/o variantes de los mismos. Dichos agentes pueden incluir, sin limitación, moléculas pequeñas (p. ej., antagonistas de AR como enzalutamida y bicalutamida y otros agentes que inhiben la unión del ligando y/o la transcripción mediada por AR), ácidos nucleicos (p. ej., moléculas de interferencia de ARN que inhiben la expresión de AR) y anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes).

[0067] Varios agentes dirigidos a AR se han descrito, incluyendo, sin limitación, bicalutamida, nilutamida, flutamida, acetato de ciproterona, espironolactona, drospirenona, enzalutamida, hidroxiflutamida, ARN-509, ASC-J9 y AZD3514. Otros antagonistas o inhibidores de AR se ejemplifican por lo siguiente: BMS 641988, TRC 253 (anteriormente JNJ-63576253), Galeterona (TOK-001 o VN/124-1), SHR3680, EPI-506 y Proxalutamida (GT0918).

[0068] Se debe entender, que los agentes preferibles para uso en las composiciones de la invención son capaces de cruzar la Barrera hematoencefálica (BBB) después de la administración sistémica. Sin embargo, se pueden emplear otros agentes en determinadas realizaciones de la invención, por ejemplo, para la administración in situ durante la cirugía. Por ejemplo, la bicalutamida se ha descrito como un antiandrógeno selectivo periféricamente que no atraviesa la BHE, aunque hallazgos más recientes sugieren que este fármaco también puede tener funciones centrales. Según ciertas formas de realización preferidas, dicho antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida como se define en las reivindicaciones. En una forma de realización particular, dicho antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida.

Composiciones farmacéuticas, kits y combinaciones terapéuticas

[0069] Los antagonistas o inhibidores de la AR y otros agentes contra el cáncer, como se describe en el presente documento (en adelante denominado como ingredientes activos) se pueden administrar de acuerdo con aspectos de la divulgación en la forma de una composición farmacéutica, que comprende además uno o más vehículos, excipientes o diluyentes farmacológicamente aceptables. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas por un experto en la técnica. Los vehículos farmacéuticos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a cargas, desintegrantes, lubricantes, deslizantes y polímeros solubles e insolubles se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, A. Osol, un texto de referencia estándar en este campo.

[0070] Para la inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón salino fisiológico. Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los ingredientes activos pueden prepararse como suspensiones para inyección adecuadas, aceitosas o basadas en agua. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones inyectables acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos, para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para reconstituirlo con un vehículo adecuado, por ejemplo, una solución a base de agua estéril, libre de pirógenos, antes de su uso.

[0071] Para la administración oral, la composición farmacéutica puede formularse fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten formular la composición farmacéutica como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por parte de un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden hacer usando un excipiente sólido, opcionalmente triturando la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los auxiliares adecuados según se desee, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo, tal como alginato de sodio.

[0072] Las composiciones farmacéuticas que pueden usarse por vía oral incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste rápido pueden contener los ingredientes activos mezclados con cargas como lactosa, aglutinantes como almidones, lubricantes como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

[0073] De acuerdo con algunos aspectos de la divulgación, enzalutamida u otros antagonistas de AR o inhibidores como se describe en el presente documento pueden administrarse en combinación concurrente o secuencial con al menos un agente anti-cáncer adicional. Según otros aspectos, la divulgación se refiere a combinaciones terapéuticas de al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso como se describe en el presente documento. El al menos un agente anticanceroso se selecciona del grupo que consiste en agentes alquilantes e inhibidores de RTK. Estas combinaciones, opcionalmente formuladas en forma de una composición farmacéutica que comprende al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso, pueden usarse en aspectos de la divulgación como se describe con más detalle a continuación.

[0074] De acuerdo con ciertas formas de realización, se proporciona una combinación terapéutica de al menos un antagonista de AR o inhibidor y al menos un agente anti-cáncer seleccionado del grupo que consiste de un agente alquilante y un inhibidor de RTK, para uso en un método para tratar un tumor glial caracterizado por expresión de AR en al menos una porción de las células tumorales en un sujeto que lo necesite, como se define en las reivindicaciones. La invención también se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de tumores gliales, que comprende al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK, como se define en las reclamaciones. Según aspectos adicionales de la divulgación, se proporciona un kit que comprende una combinación de al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de RTK, que comprende además instrucciones para administrar dicha combinación a un sujeto que padece un tumor neuroepitelial que expresa AR.

[0075] Ventajosamente, dicho antagonista de AR o inhibidor es enzalutamida como se define en las reivindicaciones. Según formas de realización ventajosas particulares, dicho antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida. En otra forma de realización particular, dicho antagonista o inhibidor de AR se selecciona del grupo que consiste en enzalutamida y bicalutamida. En otra forma de realización particular más, dicho antagonista o inhibidor de AR es bicalutamida. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0076] Los términos antagonista e inhibidor como se usan en este documento con respecto a los receptores celulares (p. ej., RTK o EGFR) se refieren a moléculas que tienen la capacidad de inhibir específicamente una función biológica del receptor respectivo. La inhibición específica de la actividad significa que otras actividades celulares no mediadas por el receptor o asociadas con él no se inhiben sustancialmente. Normalmente, los inhibidores y antagonistas inducen una actividad inhibidora directa, es decir, uniéndose al receptor o su ligando. Otros agentes inhibidores incluyen aquellos que inhiben la expresión del receptor (p. ej., ARNip). Las actividades preferidas inhibidas específicamente por los antagonistas e inhibidores están asociadas con el desarrollo, crecimiento o diseminación de un tumor.

[0077] El término "inhibidor de tirosina quinasa receptor" o "inhibidor de RTK" significa un compuesto capaz de inhibir específicamente la actividad de un miembro de la familia RTK de las proteínas. Un inhibidor de RTK puede ser una molécula pequeña, proteína, polipéptido, péptido, ácido nucleico y combinaciones de los mismos. Ejemplos de dianas proteicas para inhibidores de RTK son miembros de las siguientes familias de RTK: receptor de efrina, receptor del factor de crecimiento epidérmico, receptor del factor de crecimiento de fibroblastos, receptor de insulina, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina (EGFR), receptores de neutrofina, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas y receptor del factor de crecimiento endotelial vascular. Una actividad preferida inhibida por un inhibidor de RTK está asociada con el desarrollo, crecimiento o diseminación de un tumor. Los ejemplos de inhibidores de RTK incluyen afatinib, axitinib, canertinib, cediranib, erlotinib, gefitinib, grandinin, imatinib, lapatinib, leflunomida, lestaurtinib, neratinib, pazopanib, quizartinib, regorafenib, semaxanibit, sorafeniblan, totanivo, anticuerpos monoclonales que se unen a RTK específicas.

[0078] El término "inhibidor de EGFR" o "antagonista de EGFR" como se usa en este documento se refiere a una molécula que tiene la capacidad de inhibir específicamente una función biológica de un receptor del factor de crecimiento epidérmico nativo (EGFR). Los inhibidores preferidos en el presente documento interactúan específicamente con (p. ej., se unen a) un EGFR. Una actividad biológica de EGFR preferida inhibida por un inhibidor de EGFR está asociada con el desarrollo, crecimiento o diseminación de un tumor. El término pretende incluir compuestos químicos, tales como inhibidores de molécula pequeña (p. ej., inhibidores de tirosina quinasa de molécula pequeña) y agentes biológicos, tales como anticuerpos, ARN interferente (ARNhc, ARNip), receptores solubles y similares. Los inhibidores de EGFR pueden incluir inhibidores de moléculas pequeñas clasificados en la técnica como inhibidores de EGFR de quinazolina, inhibidores de EGFR de pirido-pirimidina, inhibidores de EGFR de pirimidopirimidina, inhibidores de EGFR de pirrolo-pirimidina, inhibidores de EGFR de pirazolo-pirimidina, inhibidores de EGFR de fenilamino-pirimidina, inhibidores de EGFR de fenilamino-pirimidina, inhibidores de EGFR de oxipirimidina, inhibidores de EGFR de indolocarbazol, inhibidores de EGFR de ftalazina, inhibidores de EGFR de isoflavona, inhibidores de EGFR de quinalona e inhibidores de EGFR de tirfostina. Ejemplos de inhibidores de EGFR incluyen, [6,7-bis(2-metoxietoxi)-4-quinazolin-4-il]-(3-etinilfenil)amina (también conocida como OSI-774), erlotinib, CI-1033 (anteriormente conocida como PD183805), AG-M78, CGP-59326, PKI-166, EKB-569, lapatinib o ditosilato de lapatinib; afatinib, gefitinib, AG490 (una tirfostina), ARRY-334543, BIBW-2992, EKB-569, ZD6474, BMS-599626 (Bristol-Myers Squibb), cetuximab, panitumumab y MDX-447.

[0079] Según la invención, el antagonista de EGFR es una molécula pequeña seleccionada de erlotinib o afatinib. En una forma de realización particular, el antagonista de EGFR se selecciona del grupo que consiste en afatinib, erlotinib y sus sales. En otra forma de realización particular, dicho antagonista es afatinib o erlotinib. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.

[0080] El término "agente quimioterapéutico" tal como se utiliza aquí se refiere a un agente citotóxico o citostático químico o sustancia biológica que puede causar la muerte de las células cancerosas, o interferir específicamente con el crecimiento, división, reparación, y/o función de las células cancerosas.

[0081] El término "agente alquilante" tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva se refiere a un agente quimioterapéutico que da un grupo alquilo en la reacción de alquilación en donde un átomo de hidrógeno de un compuesto orgánico está sustituido con un grupo alquilo, que tiene actividad antitumoral. Este término puede ser ejemplificado por N-óxido de nitrógeno mostaza, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalán, busulfán, mitobronitol, carbocuona, tiotepa, ranimustina, nimustina, temozolomida y carmustina.

[0082] Como se usa en este documento, el término "agente inmunoterapéutico" se refiere a cualquier agente, compuesto o biológico que es capaz de modular el sistema inmune del huésped. Un agente inmunoterapéutico usado en las composiciones y métodos de la invención es capaz de provocar una estimulación del sistema inmunológico contra una célula tumoral.

[0083] Tal como se utiliza aquí, el término "agente anti-angiogénico" significa una molécula que reduce o evita la angiogénesis, que es el crecimiento y desarrollo de vasos sanguíneos. Los agentes anti-angiogénicos disponibles comercialmente incluyen, por ejemplo, angiostatina, endostatina y metastatina.

[0084] En ciertas formas de realización, las composiciones y combinaciones terapéuticas de la invención comprenden (o emplear el uso de) enzalutamida y al menos un antagonista de EGFR que es afatinib. El agente alquilante puede seleccionarse además del grupo que consiste en carmustina, temozolomida y sus sales. En otras formas de realización, el antagonista de AR es bicalutamida, el agente alquilante es carmustina o temozolomida y el inhibidor de RTK es erlotinib o afatinib. En otras formas de realización, el antagonista de AR es enzalutamida y el inhibidor de RTK es afatinib. En otras formas de realización, la combinación es bicalutamida y erlotinib. En otras formas de realización, la combinación es bicalutamida, carmustina y erlotinib. En otras formas de realización, la combinación es enzalutamida y afatinib.

[0085] En otra forma de realización, una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores gliales puede comprender: (i) enzalutamida, (ii) carmustina o temozolomida, (iii) afatinib, y (iv) uno o más vehículos, excipientes o diluyentes. En una forma de realización particular, la composición se formula para administración oral.

[0086] En otro aspecto no reivindicado, la descripción se refiere a un kit que comprende una combinación de al menos un antagonista de AR o inhibidor tal como enzalutamida, y al menos un agente alquilante tal como carmustina o temozolomida y al menos un inhibidor RTK tal como erlotinib o afatinib, que además comprenden instrucciones para administrar dicha combinación a un sujeto afectado por un tumor neuroepitelial que expresa AR. En otro aspecto, el kit comprende (i) enzalutamida, (ii) carmustina o temozolomida, (iii) erlotinib o afatinib y (iv) instrucciones para administrar dicha combinación a un sujeto afectado por un tumor neuroepitelial que expresa AR. En una forma de realización particular, el tumor neuroepitelial es glioblastoma.

Métodos terapéuticos y diagnósticos

[0087] En un aspecto no reivindicado de la descripción, la invención se refiere a enzalutamida o un derivado del mismo para uso en el tratamiento de un tumor neuroepitelial (p. ej. GBM) en un sujeto en necesidad del mismo, en donde la enzalutamida o derivado de la misma se usa en una cantidad terapéuticamente eficaz y el tumor se caracteriza por la expresión de AR en al menos una porción de las células tumorales.

[0088] En otro aspecto no reivindicado, la invención se refiere a al menos un antagonista de AR o inhibidor (p. ej. enzalutamida), para uso en un método para el tratamiento de un tumor glial (p. ej. GBM caracterizado por la expresión AR) en un sujeto necesidad del mismo, en una cantidad terapéuticamente eficaz.

[0089] En otro aspecto no reivindicado, la descripción se refiere a un antagonista de AR o inhibidor (p. ej. enzalutamida) para uso en el tratamiento de tumores en un sujeto aquejado de un tumor glial (p. ej. GBM), donde el sujeto se ha determinado a ser susceptible para el tratamiento con el antagonista o inhibidor de AR, mediante un método que comprende determinar la presencia de al menos una aberración de AR seleccionada del grupo que consiste en: amplificación en el locus del gen AR, LOH en el locus del gen AR, sobreexpresión de AR y/o expresión de al menos una variante de AR (p. ej., al menos una variante de AR seleccionada del grupo que consiste en una variante de AR caracterizada por deleción o mutación en el LBD y una variante de empalme de AR independiente de ligando), en una muestra del sujeto, en donde el la presencia de la al menos una aberración indica que dicho sujeto es susceptible de tratamiento con el antagonista o inhibidor de AR.

[0090] En otro aspecto donde la expresión de AR-V7 se ha determinado a estar presente en la muestra, dicho antagonista o inhibidor de AR (p. ej. enzalutamida) es para su uso mediante la administración a dicho sujeto en combinación concurrente o secuencial con al menos un agente anticuerpo contra el cáncer adicional (p. ej., un agente alquilante y/o un inhibidor de RTK). En otro aspecto, el tratamiento comprende administrar a dicho sujeto al menos un antagonista o inhibidor de AR (p. ej., enzalutamida), al menos un agente alquilante (p. ej., temozolomida o carmustina) y al menos un inhibidor de RTK (p. ej., afatinib o erlotinib).

[0091] Un sujeto en necesidad del mismo, susceptible de tratamiento de acuerdo con formas de realización de la invención, es un sujeto diagnosticado con (o se sospecha que tiene) un tumor cerebral caracterizado por la expresión AR, o aquejado de un tumor cerebral (p. ej., un tumor neuroepitelial tales como GBM) como se describe en este documento. Un tumor que expresa AR, también denominado en el presente documento como un tumor caracterizado por expresión de AR, denota un tumor caracterizado por la presencia de un polipéptido AR en al menos una parte de las células tumorales. Un sujeto que lo necesite puede identificarse como susceptible de tratamiento, determinando la presencia de al menos una aberración de AR como se describe en el presente documento en una muestra del sujeto. A menos que se indique lo contrario, el sujeto que lo necesita al que se hace referencia en este documento es un sujeto humano. En una forma de realización, el sujeto es un hombre. En otra forma de realización, el sujeto es una mujer.

[0092] Los métodos y medios para determinar la presencia de aberraciones al gen AR o su expresión se han descrito, e incluyen una variedad de ensayos moleculares (métodos basados en la amplificación por ejemplo, incluyendo, pero no limitado a métodos de reacción en cadena de la polimerasa y métodos, que incluyen, pero no se limitan a transferencia Northern y análisis de matriz) e inmunoensayos (p. ej., transferencia Western o ELISA). Los ejemplos no limitativos de tales ensayos se describen en la sección de Ejemplos a continuación. Los reactivos para implementar estos métodos están disponibles comercialmente y el experto en la materia puede proporcionarlos fácilmente basándose en secuencias conocidas del gen AR y productos del mismo.

[0093] Por ejemplo, una secuencia de gen AR humana puede ser como se describe en la adhesión n° NC_000023,11. Un transcrito de AR correspondiente a AR humano de tipo salvaje (canónico) y la proteína AR correspondiente pueden tener secuencias como se describe en el n° de acceso NM_000044. Las variantes de AR (incluidas las caracterizadas por deleción o mutación en el LBD y variantes de corte y empalme de AR independientes de ligando, por ejemplo, AR-V7) se describen, por ejemplo, en los nos de acceso. ACZ81436,1, FJ235916 y NM_001348061,1, por Lu y Luo (2013) y en US 8,841,422 y EP3062106.

[0094] Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de los productos génicos humanos pueden ser representados por la siguiente:

MEVQLGLGRV YPRPPSKTYR GAFQNLFQSV REVIQNPGPR HPEAASAAPP GASLLLLQQQ

QQQQQQQQQQ QQQQQQQQQQ ETSPRQQQQQ QGEDGSPQAH RRGPTGYLVL DEEQQPSQPQ

SALECHPERG CVPEPGAAVA ASKGLPQQLP APPDEDDSAA PSTLSLLGPT FPGLSSCSAD

LKDILSEAST MQLLQQQQQE AVSEGSSSGR AREASGAPTS SKDNYLGGTS TISDNAKELC

KAVSVSMGLG VEALEHLSPG EQLRGDCMYA PLLGVPPAVR PTPCAPLAEC KGSLLDDSAG

KSTEDTAEYS PFKGGYTKGL EGESLGCSGS AAAGSSGTLE LPSTLSLYKS GALDEAAAYQ

SRDYYNFPLA LAGPPPPPPP PHPHARIKLE NPLDYGSAWA AAAAQCRYGD LASLHGAGAA

GPGSGSPSAA ASSSWHTLFT AEEGQLYGPC GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGEAGAVAP

YGYTRPPQGL AGQESDFTAP DVWYPGGMVS RVPYPSPTCV KSEMGPWMDS YSGPYGDMRL

ETARDHVLPI DYYFPPQKTC LICGDEASGC HYGALTCGSC KVFFKRAAEG KQKYLCASRN

DCTIDKFRRK NCPSCRLRKC YEAGMTLGAR KLKKLGNLKL QEEGEASSTT SPTEETTQKL

TVSHIEGYEC QPIFLNVLEA IEPGWCAGH DNNQPDSFAA LLSSLNELGE RQLVHVVKWA

KALPGFRNLH VDDQMAVIQY SWMGLMVFAM GWRSFTNVNS RMLYFAPDLV FNEYRMHKSR

MYSQCVRMRH LSQEFGWLQI TPQEFLCMKA LLLFSIIPVD GLKNQKFFDE LRMNYIKELD

RIIACKRKNP TSCSRRFYQL TKLLDSVQPI ARELHQFTFD LLIKSHMVSV DFPEMMAEII

SVQVPKILSG KVKPIYFHTQ (SEQ ID NO: 1 ;' AR de tipo salvaje, transcrito variante 1, NM_000044);

y

MEVQLGLGRV YPRPPSKTYR GAFQNLFQSV REVIQNPGPR HPEAASAAPP GASLLLLQQQ

QQQQQQQQQQ QQQQQQQQQQ ETSPRQQQQQ QGEDGSPQAH RRGPTGYLVL DEEQQPSQPQ

SALECHPERG CVPEPGAAVA ASKGLPQQLP APPDEDDSAA PSTLSLLGPT FPGLSSCSAD

LKDILSEAST MQLLQQQQQE AVSEGSSSGR AREASGAPTS SKDNYLGGTS TISDNAKELC

KAVSVSMGLG VEALEHLSPG EQLRGDCMYA PLLGVPPAVR PTPCAPLAEC KGSLLDDSAG

KSTEDTAEYS PFKGGYTKGL EGESLGCSGS AAAGSSGTLE LPSTLSLYKS GALDEAAAYQ

SRDYYNFPLA LAGPPPPPPP PHPHARIKLE NPLDYGSAWA AAAAQCRYGD LASLHGAGAA

GPGSGSPSAA ASSSWHTLFT AEEGQLYGPC GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGEAGAVAP

YGYTRPPQGL AGQESDFTAP DVWYPGGMVS RVPYPSPTCV KSEMGPWMDS YSGPYGDMRL

ETARDHVLPI DYYFPPQKTC LICGDEASGC HYGALTCGSC KVFFKRAAEG KQKYLCASRN

DCTIDKFRRK NCPSCRLRKC YEAGMTLGEK FRVGNCKHLK MTRP (SEQ ID NO 2; AR-V7,

transcrito variante 3, NM_001348061.1).

[0095] Una "muestra del sujeto" se refiere a una muestra biológica derivada del sujeto, lo que facilita la determinación de la expresión del AR y/o aberraciones como se describe en este documento. La muestra puede obtenerse de un tejido u órgano de interés. Por ejemplo, pueden obtenerse biopsias de tumores o lesiones sospechosos mediante métodos convencionales. En otras formas de realización, la muestra puede ser una muestra de fluido, por ejemplo, sangre, suero, plasma, fluidos de enjuague tumor, muestras de orina y la saliva. La muestra de fluido es una muestra que contiene células, por ejemplo, una muestra de sangre o una muestra de enjuague tumoral. La muestra puede procesarse (p. ej., mediante centrifugación y/o filtración) para enriquecer su contenido relativo de células o para aislar la fracción libre de células. Por ejemplo, se sabe que las muestras de sangre contienen células tumorales circulantes, liberadas por lesiones tumorales primarias en la sangre. Las muestras que contienen células (obtenidas, por ejemplo, de biopsias de tejidos o fluidos biológicos) pueden procesarse adicionalmente mediante lisis y purificación de proteínas y/o ácidos nucleicos. Se contempla el uso de muestras de sangre sin células, a partir de las cuales se pueden aislar los ácidos nucleicos circulantes (sin células) (p. ej., ADN) liberados a la sangre por las células tumorales apoptóticas y necróticas. La muestra se puede obtener de forma no invasiva. Por ejemplo, sin limitación, las muestras de orina y saliva pueden usarse para detectar aberraciones genéticas. Los expertos en la técnica conocen métodos para obtener y procesar muestras biológicas.

[0096] El término "pérdida de heterocigosidad" o "LOH" como se usa en este documento significa la condición cromosómica en donde uno de un par de alelos heterocigotos se pierde debido a una deleción de ADN de uno de los pares de cromosomas en los que se ubica el alelo, dejando que solo se exprese el alelo restante y las células afectadas funcionalmente homocigóticas en el locus del gen donde se produjo la deleción. LOH en el locus del gen AR significa que se ha perdido una copia del par de alelos AR. La LOH puede manifestarse por la pérdida del alelo AR inactivado (p. ej. Metilado). La LOH puede ir acompañada de la amplificación del alelo restante.

[0097] El término "amplificación" con respecto a aberraciones cromosómicas se refiere a la presencia de un número mayor de lo normal de copias de una secuencia de ácido nucleico genómico. Un experto en la técnica entenderá que la presencia de múltiples copias de un gen dentro de un genoma puede resultar en la producción de una proteína correspondiente a niveles elevados. La amplificación en el locus del gen AR significa un aumento en el número de copias de al menos un alelo AR en una célula en comparación con las células normales (no tumorales).

[0098] El término "expresión" se refiere a un gen que se transcribe o traduce en un nivel detectable. Como se usa en el presente documento, la expresión también abarca "sobreexpresión", que se refiere a un gen que se transcribe o traduce a un nivel detectablemente mayor, normalmente en una célula cancerosa, en comparación con una célula normal. Como se describe con más detalle en el presente documento, la presencia o detección de expresión de AR (incluidas sus variantes) en una muestra denota la presencia de un polipéptido o transcrito AR a un nivel detectable para determinar que el sujeto del que se ha obtenido la muestra está afectado con un tumor que expresa AR. Como se menciona adicionalmente en el presente documento, la expresión de AR en una célula está asociada con al menos una función biológica de AR en la célula como se describe en el presente documento.

[0099] Los métodos de la invención pueden involucrar inmunoensayos tales como transferencia Western o ELISA usando anticuerpos dirigidos a AR (opcionalmente anticuerpos capaces de diferenciar entre diferentes variantes de empalme de AR), o ensayos basados en tecnología de tira reactiva o matriz de anticuerpos. Se pueden utilizar convenientemente sistemas ELISA automatizados como el procesador ELISA Quickstep® de Biotest, el analizador ELISA automatizado de micropocillos Maxmat (Maxmat SA, Francia) o el sistema de cuatro placas DSX™ (Dynex Technologies). Pueden emplearse otros ensayos que comprenden detección de AR mediante microscopía o ceitometría celular (p. ej., clasificación de células activada por fluorescencia, FACS, usando anticuerpos adecuados como se describió anteriormente). Tales técnicas son bien conocidas por el experto en la materia y se han descrito en muchos manuales y textos de inmunología estándar.

[0100] Además, varios métodos de amplificación también se pueden usar para determinar si el tumor o la célula expresa AR o si aberraciones AR están presentes en la muestra. Dichos métodos incluyen, sin limitación, PCR, RT-PCR y PCR in situ (todos los anteriores se refieren también a PCR "anidada" y RT-PCR anidada), LCR (reacción en cadena de ligasa) y 3SR (replicación de secuencia autosostenida). De acuerdo con ciertas formas de realización, se utilizan RT-PCR y RT-PCR anidada. Los productos de amplificación se identifican mediante métodos usados en la técnica, como por separación en un gel. Alternativamente, si se puede obtener una cantidad suficiente de las células apropiadas, se puede realizar un análisis de ARN estándar (p. ej., análisis Northern, protección de ARNasa o extensión de cebadores) para determinar el nivel de expresión de ARNm del gen de interés. La LOH y la amplificación de genes se pueden medir usando varias técnicas, que incluyen, entre otras, PCR cuantitativa y semicuantitativa o RT-PCR, transferencia de Southern, cuantificación de fluorescencia basada en PCR de alta resolución usando sistemas de electroforesis capilar, amplificación de microsatélites por PCR usando nucleótidos radiomarcados seguido de autorradiografía y secuenciación de próxima generación (Ion Torrent™, Life Technologies).

[0101] En algunas formas de realización, el tumor es un tumor neuroepitelial. En otras formas de realización, dicho tumor es un astrocitoma. En otras formas de realización, dicho tumor es un glioma. En otras formas de realización, dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma anaplásico, astrocitoma difuso, oligodendroglioma, oligodendroglioma anaplásico, oligoastrocitoma y oligoastrocitoma anaplásico. En otras formas de realización, dicho tumor es glioblastoma. En otras formas de realización, el tumor es meningioma.

[0102] El tumor puede ser caracterizado por la amplificación en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. La amplificación puede estar asociada con un aumento del número de copias del gen AR de 1 a 20. La amplificación puede estar asociada con un aumento del número de copias del gen AR de 1 -3, 1 -5, 1-10, 1 -20, 2-4, 2-6, 5-10 o 5-20. El tumor puede caracterizarse por la pérdida de heterocigosidad (LOH) en el locus del gen AR en al menos una parte de las células tumorales. Así, por ejemplo, el tumor puede caracterizarse por un número de copias de AR de 2-3, o hasta 5, como resultado, por ejemplo, de la amplificación de un alelo y LOH del otro alelo, en al menos una parte de las células tumorales. El tumor puede caracterizarse por la pérdida de un alelo AR inactivado (p. ej., por metilación) en al menos una parte de las células tumorales. El tumor puede caracterizarse por la sobreexpresión de AR en al menos una parte de las células tumorales. En otras formas de realización, dicha sobreexpresión está asociada con una elevación de 1,1 a 20 veces del nivel de proteína AR. En otras formas de realización, dicha sobreexpresión está asociada con 1,1-150, 1,1-100, 1,1-50, 1,1-20, 1,1-10, 1,1-2, 1,2-3, 1,3-4, 1,2­ 1,6, 1,4-5 1,2-20 o 1,3-10 veces la elevación del nivel de proteína AR. En otras formas de realización, dicha sobreexpresión está asociada con una elevación de 1,1-350.000, 2-3,500, 2,5-350, 3-100, 1,1-35, 1,1-20, 2-20, 2-10 o 1,1-10 elevación de veces del nivel de ARNm de AR.

[0103] En otras formas de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de al menos una variante AR en al menos una parte de las células tumorales, en donde la variante se selecciona del grupo que consiste en una variante caracterizada por deleción o mutación en el ligando de unión dominio (LBD) y una variante de empalme AR independiente de ligando. En otras formas de realización, dicha variante es la variante AR 7 (AR-V7). En otras formas de realización, el tumor auxiliar se caracteriza por la sobreexpresión de AR de tipo salvaje y por la expresión de AR-V7 en al menos una parte de las células tumorales. En otras formas de realización, dicho tumor se caracteriza por la sobreexpresión de AR de tipo salvaje y AR-V7 en al menos una parte de las células tumorales. En otras formas de realización, dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR-V7 y además se caracteriza por LOH en el locus del gen AR, en al menos una parte de las células tumorales.

[0104] La presencia de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco aberraciones AR seleccionadas del grupo que consiste en: la amplificación en el locus del gen AR, LOH en el locus del gen AR, sobre-expresión de AR y/o expresión de por lo menos una variante de AR, en una muestra de un sujeto, puede indicar que el sujeto es susceptible de tratamiento mediante las composiciones y kits de la invención. La presencia de al menos una, dos, tres, cuatro o cinco aberraciones AR como se describe en el presente documento en una muestra de un sujeto puede indicar que el sujeto es susceptible de tratamiento mediante las composiciones y kits de la divulgación. En otros aspectos, la muestra es una biopsia de tumor cerebral. En otros aspectos, la muestra es una muestra de sangre. En otros aspectos, dicha muestra es una muestra de sangre libre de células.

[0105] En otra forma de realización, el sujeto es humano. En otra forma de realización, el sujeto es una mujer. En otra forma de realización, el sujeto es un hombre. En otra forma de realización, dicho sujeto no padece concomitantemente un tumor de origen no neurológico, por ejemplo, cáncer de próstata o cáncer de mama.

[0106] El sujeto puede ser en tratamiento con al menos un agente anti-cáncer adicional. En otros aspectos de la divulgación, el antagonista o inhibidor de AR se administra en combinación simultánea o secuencial con al menos un agente anticáncer adicional. En otros aspectos, la divulgación se refiere a una composición o kit que comprende un antagonista o inhibidor de AR en combinación con al menos un agente anticáncer adicional.

[0107] El al menos un agente anti-cáncer adicional comprende un fármaco quimioterapéutico que es un agente alquilante. En otros aspectos de la divulgación, el agente alquilante se selecciona del grupo que consiste en temozolomida, carmustina y derivados y sales de los mismos. En otros aspectos, el al menos un agente anticanceroso comprende un inhibidor de RTK. En otros aspectos, el inhibidor de RTK es un antagonista de EGFR. En otros aspectos, el antagonista de EGFR se selecciona del grupo que consiste en afatinib, erlotinib y derivados y sales de los mismos. En otros aspectos, dicho al menos un agente anticanceroso comprende al menos un agente alquilante y al menos un antagonista de EGFR. En otros aspectos, el antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida o un derivado de la misma. En otras formas de realización, el antagonista o inhibidor de AR es enzalutamida. En otros aspectos de la divulgación, la composición comprende enzalutamida, carmustina y erlotinib. En otras formas de realización, la composición comprende enzalutamida, carmustina y afatinib.

[0108] Por ejemplo, sin limitación, un programa de tratamiento para un sujeto que lo necesita y que padece un GBM que expresa AR puede incluir tratamiento por irradiación seguido de tratamiento con temozolomida (p. ej., 150-200 mg/m 2/día PO) en los días 1-5 cada 28 días, durante seis a ocho ciclos. La enzalutamida se puede administrar de acuerdo con algunas formas de realización en combinación secuencial con la terapia adjunta, por ejemplo, en los días 6-28 de cada ciclo.

[0109] Como se usa en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de un compuesto eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de una enfermedad del sujeto a tratar, tales como el cáncer. Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente eficaz para usar en las formas de realización de la invención es una cantidad suficiente para inhibir el desarrollo de tumores o la supervivencia de las células tumorales en las condiciones utilizadas. La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada y los ejemplos proporcionados en este documento. En algunas formas de realización, se puede usar enzalutamida a dosis diarias de, por ejemplo, 160-600 mg. En otras formas de realización, las combinaciones de la invención emplean el uso de dosis (p. ej., del antagonista o inhibidor de AR, agente alquilante y/o inhibidor de RTK) que son al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% más bajos que los que se usan comúnmente para la terapia humana. Por consiguiente, una cantidad terapéuticamente eficaz de enzalutamida para administración oral a sujetos humanos, cuando se usa como único ingrediente activo, puede ser, por ejemplo, 160-600, 200-500, 200-400 o 300-600 mg/día. Una cantidad terapéuticamente eficaz de enzalutamida para administración oral a sujetos humanos, cuando se usa en combinación con al menos un agente anticanceroso, puede ser, por ejemplo, 150-570, 140-540, 130-480, 110-420 o 100-360 mg/día. Para la administración local, tópica o intratumoral, una cantidad terapéuticamente eficaz puede ser, por ejemplo, 20-160, 20-100 o 20-80 pm. Como se ejemplifica en el presente documento, las concentraciones de enzalutamida de al menos 20 pm son más eficaces en las formas de realización de la invención que reducir las concentraciones, tales como 10 pm.

[0110] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más plenamente algunas formas de realización de la invención. Sin embargo, de ninguna manera deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLOS

Métodos

Pacientes y tumores

[0111] Se realizó un estudio de ADN en tumores GBM incluidos en parafina de 35 mujeres. El estudio fue aprobado por el comité de ética de investigación institucional local y todos los pacientes firmaron formularios de consentimiento por escrito.

[0112] El estudio de la expresión se realizó en 30 tumores de GBM de las mujeres y los hombres de los pacientes sometidos a cirugía para el glioblastoma supratentorial primario. El grupo de estudio incluyó a pacientes con glioblastoma recién diagnosticado, de entre 18 y 75 años. Los criterios de exclusión incluyeron un diagnóstico previo de glioma de bajo grado y pacientes con tumores positivos para la mutación IDH1. Los pacientes participantes otorgaron su consentimiento informado por escrito de acuerdo con un protocolo aprobado por la junta de revisión institucional.

Extracción de ADN

[0113] Se extrajo ADN de la sección de muestras de GBM fijadas con formalina e incluidas en parafina utilizando ADN QlAamp (FFPE Tissue Kit QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de ADN se cuantificaron con el ensayo PicoGreen® (Life Technologies, EE. UU.).

[0114] Se extrajo ADN de alícuotas de sangre entera de 200-pl por Blood-DNA Mini Kit (Qiagen, Hildan, Alemania) según las instrucciones del fabricante.

Análisis de OncoScan

[0115] Para obtener el número de copias de todo el genoma y los perfiles de pérdida de heterocigosidad (LOH) a partir de muestras de tumor FFPE, se sometieron 80 ng de ADN derivado de FFPE a OncoScan FFPE Express 2,0 | Matriz de Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, EE. UU.). El ensayo se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron usando Nexus 6 Copy Number™ (Biodiscovery, CA).

Estudios de inactivación del cromosoma X :

[0116] Se usó el par de enzimas isosquizoméricas MspI/HpaII (New England Biolabs, Beverly, MA, EE. UU.) para analizar el estado de metilación del ADN en el locus AR. Mientras que MspI escinde la secuencia de reconocimiento 5'-CCGG independientemente del estado de metilación del C interno, la restricción por HpaII está bloqueada por la presencia de 5-MeC en este sitio. Muestras de ADN (0,2 pg) se incubaron durante 2 horas a 37°C con 20 unidades de HpalI o MspI (Life Technologies, Inc.) en un 20 pL de volumen de reacción. Se incubó la misma cantidad de cada ADN sin enzima en una reacción simulada. Se usó ADN de sangre como control para la restricción de HpalI. Las enzimas de restricción se inactivaron a 95°C durante 10 min. Este paso fue seguido por 40 ciclos de una reacción de PCR en tiempo real con cebadores que flanquean los sitios de restricción CCGG en el gen AR: AR-F: TGCGCGAAGTGATCCAGAA y AR-R: TCTGGGACGCAACCTCTCTC-3',SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente); Se usó GAPDH como control GAPDH-F: GTATTGGGCGCCTGGTCA; GAPDH-R: AGGGGTCATTGATGGCAACA (SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente) a una temperatura de recocido de 60°C (15 s). La forma de realización de la reacción simulada permitió la determinación del estado de metilación comparando los ciclos de cuantificación con y sin la digestión con HpaII. Se realizó un análisis de la curva de fusión para verificar la especificidad del producto de PCR.

Extracción de ARN, preparación de ADNc qPCR

Aislamiento de ARN

[0117] Se aisló ARN total de gliomas congelados instantáneamente o cultivos celulares usando reactivo TRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Sigma-Aldrich). Los ARN de control se tomaron de una mezcla comercial agrupado de 23 donantes (edad media 68 años; 13 machos y 10 hembras) (FirstChoice® Human Brain Reference Total RNA, Ambion Inc.)

ADNc

[0118] El ADNc se producen a partir de 0,2ug del total ARN utilizando el kit de síntesis de ADNc de microARN qScript (Quanta Biosciences), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Amplificación de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de y cuantificación relativa

[0119] La expresión de ARN de AR se analizó por RT PCR en tiempo real StepOne (Life Technologies). La mezcla de reacción incluía 1 pl de ADNc, concentraciones de 300 nmol/l de los siguientes cebadores (Syntezza, Israel): AR-F:ACCGAGGAGCTTTCCAGAATC, AR-R:AGGCTCTGGGACGCAACCT (SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente); HPRT-F:GATGGTCAAGGTCGCAAGC; HPRT-R:ATATCCTACAACAAACTTGTCTGGAA (SEQ ID NOs: 9 y 10, respectivamente) y 5 pl de SYBR green mix (Perfecta Syber Green Fast Mix ROX, Quanta Biosciences) en un volumen total de 10 pl según las instrucciones de fabricación. Los cambios de veces de los ARNm de AR se normalizaron a HPRT. Después de la normalización, se calcularon los cambios de veces de cada ARNm basándose en la relación entre la muestra de línea celular/tumor analizada y el cerebro normal o HEK 293 como se indica. El experimento se repitió tres veces por triplicado y los resultados se presentan como la media ± DE. La significación estadística de la inducción de la expresión génica en comparación con el control se calculó usando la prueba t de 2 colas.

Expresión de ARNm de variantes de empalme de receptores de andrógenos

[0120] La variante AR 7 (A3) se analizó mediante qPCR como se describe anteriormente usando los siguientes cebadores par: AR-7-F: CCATCTTGTCGTCTTCGGAAATGTTATGAAGC AR-7-R: TTTGAATGAGGCAAGTCAGCCTTTCT (SEQ ID NOs: 11 y 12, respectivamente). Los fragmentos de 125 pb resultantes también se sometieron a electroforesis en una metáfora al 3,5% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. La variante 5, 6 se amplificó mediante PCR y los fragmentos de 888 y 968 pb resultantes se analizaron en gel de agarosa al 1,5%.

Análisis de transferencia Western

[0121] Para los análisis de transferencia de Western, las muestras de tejidos o gránulos de líneas celulares se homogeneizaron en 500 ul de tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa (Thermo Fisher Scientific Inc). La concentración de proteína se determinó usando el ensayo de proteína de Bradford (Bio-Rad, Richmond, California). Los lisados de tejido/línea celular que contenían 100 pg de proteína se separaron con geles de SDS-PAGE de Tris-Glicina al 4%-20% (Thermo Fisher Scientific) y se evaluaron mediante análisis de transferencia Western, utilizando sondas secuenciales con anticuerpo policlonal contra AR (N20, 1:200 dilución); anti-GAPDH monoclonal (0411, diluido 1:10000) (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, California, EE. UU.) o Anti-P-Actin (AC-74 diluido 1:5000) Sigma como se indica y con la peroxidasa secundaria de rábano picante correspondiente. anticuerpo conjugado (Santa Cruz Biotechnologies).

Cultivo celular

[0122] Las líneas celulares A172, U87MG y T98G (glioblastoma), se obtuvieron de la American Type Culture Collection ^(VA, Ee. ^{UU.). Las células A172 y U87MG se cultivaron en medio DMEM-Eagle suplementado con 4 mmol/L de L-}glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 gg/ml de estreptomicina y 10% FBS Charcoal Stripped (Biological Industries, Israel). Las células T98G se cultivaron en medio esencial mínimo de Eagle suplementado con 4 mmol/L de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina y 100 gg/ml de estreptomicina. Para evitar la influencia de la hormona esteroide derivada de FBS sobre la AR, los medios celulares se suplementaron con FBS (despojado) tratado con carbón vegetal/dextrano al 10% (Biological Industries). Las células se mantuvieron en un incubador humidificado a 37°C en 5% de CO2.

Tratamiento con inhibidores de la AR y de EGFR

[0123] Las células 1 X 103 se sembraron por triplicado en placas de 24 pocillos, y se dejaron unir durante la noche. El medio de cultivo se reemplazó con medio que contenía DHT 10 gm (Sigma-Aldrich) y las concentraciones indicadas de inhibidores de AR, enzalutamida (tecnologías A2S) o bicalutamida (Sigma-Aldrich), el agente alquilante 1,3-bis(2-cloroetil)-1-nitrosourea (BCNU) (Sigma-Aldrich) y los inhibidores de EGFR, Tarceva (F. Hoffmann-La Roche Ltd), Cetuximab (Erbitux®) (Merck KGaA) (referencia) y afatinib (tecnologías A2S) durante 48 horas y 72h. Se eligió la concentración de DHT porque no tuvo ningún efecto sobre la viabilidad celular en ninguna de las líneas celulares en comparación con las células tratadas con vehículo (0,15% de ETOH).

Supervivencia de célula

[0124] El ensayo de unión de colorante Crystal Violet se utilizó para medir la viabilidad celular como sigue. Se añadió ^{violeta cristal al 0,5% (Sigma-Aldrich MO,} Ee. ^{UU.) A cada pocillo celular después de la fijación con paraformaldehído} al 4% (Gadot, Israel), el colorante se solubilizó con ácido acético al 10% (Gadot) y se leyó a 590 nm en un lector de microplacas con detectores multimodo DTX 880 (Beckman Coulter, Suiza). El valor medio de absorbancia del control se consideró como 100% y los porcentajes de la muestra tratada se calcularon comparando la absorbancia media de las muestras tratadas con la absorbancia media del control.

Análisis del ciclo celular

[0125] Líneas celulares de glioma A172 se trataron con vehículo (0,15% de EtOH), 10 gm de DHT con o sin 40 o 80 gm de enzalutamida durante 48 horas como se indicó anteriormente. Luego, las células se recolectaron con tripsina y se lavaron en PBS. A esto le siguió la fijación durante la noche a 0°C en etanol frío al 80%. Después de lavar las células en PBS y el tratamiento con 50 gL de un 100 gg/ml de RNasa, se añadió 200 gL de yoduro de propidio (PI) (de 50 gg/ml de solución madre). La intensidad de la fluorescencia de yoduro de propidio se midió mediante citometría de flujo usando FL2 y excitación láser de 488 nM.

Abreviaturas

[0126] En toda la memoria descriptiva y los dibujos, ENZ indica enzalutamida, BIC indica bicalutamida, U87 indica células U87MG, uM indica micromolar (gm), GAPDH indica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, DHT indica dihidrotestosterona, Afa, indica afatinib y Tra indica erlotinib (Tarceva).

Ejemplo 1. Amplificación del locus de ADN AR acompañada de pérdida de heterocigosidad (LOH)

[0127] Para dilucidar cambios genéticos desconocidos en GBM que podrían conducir a la identificación de nuevos candidatos a tratamiento, un número de copias en todo el genoma y pérdida de matriz de heterocigosidad (OncoScan FFPE Express, Affymetrix) se realizó en ADN extraído de 5 muestras de GBM incluidas en parafina fijadas con formalina de 5 mujeres. Además de las aberraciones genéticas conocidas, se reveló la amplificación de la región del receptor de andrógenos (AR) (Xq12) en 4 de las 5 muestras; en tres de estas muestras, la amplificación estuvo acompañada de pérdida de heterocigosidad (LOH) en el alelo restante. En una muestra no hubo cambios en la región AR.

Ejemplo 2. Estudios de inactivación de cromosomas

[0128] Los estudios de inactivación de cromosomas basados en los patrones de metilación diferencial de alelos activos e inactivos realizados en muestras de GBM de 35 mujeres, revelaron que el alelo inactivado de esta región se perdió en 34 muestras (Figura 1). En los experimentos descritos en la Figura 1, las muestras de ADN (0,2 gg) se incubaron durante 2 horas a 37°C con 20 unidades de HpaII o MspI en un volumen de reacción de 20 gl. Se incubó la misma cantidad de cada ADN sin enzima en una reacción simulada. Se usó ADN de sangre como control, así como GBM y muestras de sangre obtenidas de sujetos masculinos (indicados "tumor de hombre" y "sangre de hombre", respectivamente). Este paso fue seguido por 40 ciclos de una reacción de PCR en tiempo real con cebadores que flanquean los sitios de restricción CCGG en el gen AR. La amplificación de AR se demuestra como la curva de fusión del amplicón amplificado. La amplificación del ADN sin cortar se compara con los restringidos con HpaII/MspI como se indica en el gráfico. Muestras

[0129] El análisis focal de copia-número-variación (CNV) para la región AR cromosómica realizada por gotita-digital-PCR demostró la amplificación de AR en 27% de GBM de los varones (n=22) y en las mujeres (n=21), el alelo activo restante se duplicó al menos en 62% (Tabla 1).

Tabla 1 - AR CNV en GBM

Ejemplo 3. Expresión de AR en gliomas

[0130] La RT PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) y el análisis de transferencia Western en ARN y proteína (n=30 y 16, respectivamente) extraídos de muestras de GBM de hombres y mujeres demostraron una inducción significativa de Expresión AR ARN (2,76-315.984 veces de inducción) (Figura 2A) y de expresión de la proteína AR (1,7-106 veces de inducción) (Figura 3) en 93% y 87% respectivamente en comparación con células no tumorales independientemente del sexo del paciente (prueba t; análisis de ARN, p = 0,37; análisis de proteínas, p = 0,691). La Figura 2A representa el análisis de PCR cuantitativa (qPCR) de la expresión de ARNm de AR después de la normalización a HPRT en muestras de tumor de 30 GBM y líneas celulares de 3 GBM (T98G, U87 y A172). Se usó una mezcla comercial de ARN de 23 cerebros normales ("HUMAN") como control negativo.

[0131] Se usó Oncomine™ (Compendia Bioscience, Ann Arbor, MI) para analizar la amplificación de AR ARN de varias bases de datos. El análisis de la base de datos TCGA demostró una inducción de ARN AR de 1,74 veces en GBM (n=542) en comparación con el cerebro normal (n=10) (p = 1,05A10-6 Rango, 1861) (Figura 2B). El análisis de la cohorte de Murat (Murat, Migliavacca et al. 2008) demostró una inducción de AR ARN de 1,44 veces (p = 1,5810 -7, rango 660) en GBM (n=80) en comparación con el cerebro normal ("Control", N=4) (Figura 2C). El análisis de la cohorte en Sun (Sun, Hui et al, 2006) reveló que además de GBM (n=81) (cambio de veces = 2,12, p = 7,13A10-17, rango 322), la sobreexpresión de AR también se observa en otros gliomas como astrocitoma anaplásico (n=19) (cambio de veces 2,282, p = 5,11A10-7, rango 625), astrocitoma difuso (n=7) (cambio de veces = 1,511, p = 0,010, rango 495) y oligodendroglioma (n=50) (cambio de veces = 1,744, p = 7,47A10-10, rango 660), en comparación con el cerebro normal ("Cerebro", N=23) (Figura 2D). Esta sobreexpresión también se demostró en el meningioma utilizando la cohorte de Watson (Watson, Gutmann et al. 2002), incluidos 3 cerebros normales (Control) y 15 meningiomas (Figura 2E).

[0132] Utilizando las bases de datos de Yu (Yu, Landsittel et al. 2004) y Vanaja (Vanaja, Cheville et al. 2003), se comparó la expresión de AR en el carcinoma de próstata (adenocarcinoma, N=89 y 32 respectivamente) con tejido normal (" control ", N=23 y 8 respectivamente). Los resultados de este análisis han demostrado un cambio de veces de 1,88 y 1,4, p = 4,42A10-5 y 5,09A10-4, Rango = 467 y 631 respectivamente (FIGS. 2F-2G). Por tanto, se encontró sorprendentemente que los niveles de sobreexpresión en tumores cerebrales y cáncer de próstata eran similares (compare las Figuras 2B-2E con las Figuras 2F-2G).

Ejemplo 4. AR antagonizante en líneas celulares de glioma

[0133] Se probó el efecto de dos antagonistas de AR, bicalutamida y enzalutamida sobre la supervivencia celular en tres líneas celulares de glioma (A172, U87MG y T98G). Los resultados, presentados en las Figuras 4A-C, respectivamente, demuestran que estos dos inhibidores reducen la viabilidad celular de una manera dependiente de la dosis. En los experimentos representados en las Figuras 4A-C, las células se trataron con DHT solo (barras grises) o en combinación con 20 gm, 40 gm o 80 gm de bicalutamida (BIC, Barras negras) o enzalutamida (ENZ, Barras blancas). con puntos negros) (eje X), durante 48 h (izquierda) y 72 h (derecha). La viabilidad celular se determinó mediante el ensayo Crystal Violet y se expresó como porcentaje de células tratadas con DHT (eje Y). A las 72 horas siguientes al tratamiento, la viabilidad osciló entre el 90% a 20 uM (gm) y eL43% a 80 uM; 83% a 20 uM a 31% a 80 uM y 90% a 20 uM a 59% a 80 uM en células A172, U87MG y T98G tratadas con bicalutamida, respectivamente. En las células tratadas con enzalutamida, la viabilidad osciló entre el 58% a 20 uM y el 20% a 80 uM; 60% a 20 uM a 27% a 80 uM y 75% a 20 uM a 46% a 80 uM en células A172, U87MG y T98G respectivamente (FIGS. 4A-C respectivamente). Se utilizó como control negativo la línea celular de carcinoma de próstata PC3 que no expresa AR o sus variantes (Figura 4D), en donde las Barras blancas representan células tratadas con DHT y diferentes concentraciones de enzalutamida. Como puede verse en la Figura 4D, no se observó ningún efecto significativo en estas células. Por tanto, la enzalutamida demostró una tasa de eficacia más alta en comparación con la bicalutamida en todas las líneas celulares probadas con glioma (FIGS. 4A-4D). Se encontró que el efecto de la enzalutamida estaba inversamente correlacionado con el nivel de expresión de la proteína AR dentro de los rangos examinados (Figura 4E).

[0134] Un análisis del ciclo celular de células de glioma tratadas con enzalutamida demostraron un número dependiente de la dosis de células en fase sub-Gl, lo que sugiere la apoptosis como el mecanismo de la muerte celular (Figura 4F).

Ejemplo 5. Variante de empalme de AR que carece del dominio de unión de ligando en GBM

[0135] A continuación, se realizó un ensayo de qPCR para examinar la expresión de ARNm de variante de AR en muestras de glioblastoma (1-20) y líneas celulares de glioma (U87MG, T98G y A172). Como puede verse en la Figura 5, se encontró que el 30% de los tumores expresaban una variante de corte y empalme que carece del dominio de unión al ligando (variante 7), además de la expresión del alelo de tipo salvaje. Se encontró que las líneas celulares de glioma U87MG y T98G, pero no A172, expresaban un alelo variante. N.B: muestra de cerebro normal.

Ejemplo 6. Terapia de combinación con inhibidores de AR e inhibidores de EGFR

[0136] Se examinó el efecto de las terapias de combinación que implican agentes de señalización anti-AR junto con agentes que se dirigen a EGFR sobre la modulación de AR en células tumorales gliales que expresan una variante de empalme de AR independiente de ligando. Para ese propósito, las células T98G, que expresan altos niveles de AR variante 7 (Figura 6A) y altos niveles de EGFR (12,8 veces la inducción) se trataron durante 72 horas con concentraciones elevadas de Tarceva o Erbitux (referencia) (que van desde 1,25-10 gm) con o sin adición de 20 gm de bicalutamida.

[0137] Erbitux no tuvo influencia en la viabilidad de las células T98G en este sistema de ensayo, ya sea solo o en la terapia combinada. Esto puede atribuirse a una actividad alterada de Erbitux in vivo en comparación con su actividad in vitro, como se informó anteriormente. Específicamente, se ha sugerido que, a diferencia de los inhibidores de moléculas pequeñas, la actividad antitumoral de Erbitux puede requerir mecanismos inmunomediados u otros factores en el microambiente tumoral in vivo. En contraposición, como se muestra en la Figura 6B, la terapia combinada de Tarceva y bicalutamida fue más eficaz que cada fármaco como agente único contra estas células (viabilidad celular del 94% a 1,25 gm y del 63% a 10 gm con Tarceva solo y 76% y 31% respectivamente en la terapia combinada) y actuaron de manera sinérgica.

[0138] Se realizaron experimentos similares con concentraciones de elevación de afatinib (que van desde 1,25-5 gm) con o sin la adición de 20 gm de enzalutamida. Los resultados, que se muestran en la Figura 6C, demuestran que la combinación de afatinib y enzalutamida fue más eficaz para reducir la viabilidad celular que cada agente solo (viabilidad celular del 92% en 1,25 gm y 47% a 5 gm con afatinib solo y 57% y 30% respectivamente en la terapia combinada), y mostraron un efecto sinérgico.

[0139] Como puede verse en la Figura 6D, la terapia de combinación de concentraciones mínimas de la BCNU agente alquilante con Tarceva y bicalutamida también produjo mejores resultados que cada fármaco como monoterapia en células U87MG, que expresan niveles moderados de AR7.

[0140] En conjunto, los resultados presentados en este documento demuestran la participación de la AR en GBM en pacientes de ambos sexos, y presentan una base para la terapia de privación de andrógenos, en particular en combinaciones terapéuticas seleccionadas molecularmente como adyuvante al tratamiento estándar.

Ejemplo 7. Experimentos con animales

[0141] Para probar la eficacia de antagonistas de AR tales como enzalutamida en la reducción del crecimiento de glioblastoma en animales de laboratorio, se implantan células de glioma subcutáneas o intracraneales como xenoinjertos en ratones NOD (si se usan tumores humanos), o como injertos (si se utilizan tumores de ratón) y se monitoriza el desarrollo del tumor.

[0142] Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, NIH. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Facultad de Medicina de la Universidad Hebrea. Se inyectan células de glioma a ratones hembras desnudos atímicos (nu/nu) o c57bl/6 de 6 a 8 semanas de edad, ya sea por vía subcutánea (SC) o intracraneal. En los ratones del grupo SC, se inyectan células tumorales en la extremidad trasera derecha en un volumen de 100 gl de PBS y se controla el crecimiento del tumor con calibradores Vernier de mano (Scientific Products, McGraw, IL) dos veces por semana hasta que los tumores en el grupo de control alcanza los 1500 mm3 (largo X ancho X espesor/2). En el grupo de inyección intracraneal, las células tumorales se inyectan en el hemisferio cerebral derecho (1 mm posterior y 2,3 mm lateral al bregma, a una profundidad de 3 mm) para establecer un modelo de tumor cerebral. En este grupo, el criterio de valoración se considera como el número de días transcurridos desde la implantación del tumor hasta el día de los síntomas evidentes (pérdida de peso significativa, letargo o postura encorvada).

[0143] Los fármacos de prueba se disuelven en DMSO al 2% en PBS y se inyectan por vía intraperitoneal (IP). Cada grupo de ratones (n=7) se trata diariamente durante 28 días consecutivos con 1, 10 o 50 mg/kg de enzalutamida o bicalutamida o vehículo de control. Se establece la dosis de enzalutamida y se compara con la terapia combinada de enzalutamida con inhibidores de EGFR. Para ello, los ratones se tratan diariamente durante 28 días consecutivos con 2,5, 5 o 10 mg/kg de afatinib con o sin una dosis diaria de enzalutamida.

Ejemplo 8. La eficacia del tratamiento contra andrógenos en xenoinjertos de glioblastoma humano U87MG in vivo

[0144] Los ratones desnudos atímicos se inocularon por vía subcutánea con 5 X 106 células de glioblastoma (U87MG) en la zona interescapular. El crecimiento del tumor se controló con un calibre Vernier de mano dos veces por semana. El volumen tumoral se estimó mediante cálculo utilizando la fórmula: (ancho2 X largo)/2. El día 7, cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de aproximadamente 50 mm3, los ratones se distribuyeron aleatoriamente en dos grupos de tratamiento basándose en las medidas del calibre. Todos los ratones se trataron tres veces por semana mediante sonda oral usando 20 mg/kg de enzalutamida (Xtandi, adquirido en Astellas pharma, N=8) o vehículo (220 mg/kg de polioxilglicéridos de caprilocaproilo en solución salina, N=18). Los ratones se sacrificaron cuando su tumor alcanzó un tamaño de 800-1000 mm3 según lo solicitado por el comité de animales local para minimizar el sufrimiento de los ratones. Los resultados se presentan en la Figura 7, en donde cada punto representa el ± SEM de tamaño medio del tumor mostrado con ajuste de curva polinomial.

[0145] Como puede verse en la Figura 7, los ratones tratados con enzalutamida mostraron tumores significativamente más pequeños que los del grupo tratado con vehículo (p <0,01). Por tanto, se demostró que enzalutamida es marcadamente eficaz en el tratamiento de tumores de glioblastoma de xenoinjerto in vivo.

Ejemplo 9. Eficacia in vivo de enzalutamida y terapia de combinación sobre tumores implantados intracraneales

[0146] Se inyectan ratones desnudos atímicos (nu/nu) de 6 a 8 semanas de edad con la cantidad establecida de células de glioma U87MG. Después de 5 días cuando se ha establecido el tumor, los ratones portadores del tumor se asignan al azar en 3 grupos de tratamiento (n=10 por grupo) y cada grupo se trata mediante sonda oral durante 28 días consecutivos con vehículo (grupo de control) o con 25 o 50 mg/kg de enzalutamida Los ratones se sacrifican ante la aparición de síntomas evidentes (pérdida de peso significativa, letargo, postura encorvada u otros signos neurológicos). El criterio de valoración se considera como el número de días que transcurrieron desde la implantación del tumor hasta el día de los síntomas evidentes.

[0147] A continuación, la terapia de combinación de enzalutamida con inhibidores de EGFR o agentes alquilantes se evalúa en este modelo. Para ese propósito, un grupo de 70 ratones portadores de tumores (establecidos como se describió anteriormente) se aleatoriza en grupos de tratamiento, los ratones se tratan durante 28 días consecutivos con vehículo o con 2,5, 5 o 10 mg/kg de afatinib con o sin una dosis consecutiva de enzalutamida, o con 25, 50, 100 o 200 mg/Kg de temozolomida con o sin una dosis consecutiva de enzalutamida (referencia). El criterio de valoración se considera como se describe anteriormente.

Referencias

[0148]

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una combinación terapéutica de al menos un antagonista de receptor de andrógenos (AR) o inhibidor y al menos un agente anticanceroso seleccionado del grupo que consiste en un agente alquilante y un inhibidor de la tirosina quinasa del receptor (RTK), para su uso en el tratamiento de un tumor glial en un sujeto que lo necesite, en donde

el antagonista de AR es bicalutamida, el agente alquilante es carmustina o temozolomida y el inhibidor de RTK es erlotinib o afatinib, o en donde

el antagonista de AR es enzalutamida y el inhibidor de RTK es afatinib.

2. La combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en donde dicha combinación terapéutica está en forma de una composición farmacéutica que comprende al menos un antagonista o inhibidor de AR y al menos un agente anticanceroso.

3. La combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho tumor se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, astrocitoma anaplásico, astrocitoma difuso, oligodendroglioma, oligodendroglioma anaplásico, oligoasrocitoma y oligoastrocitoma anaplásico.

4. La combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en donde dicho tumor es un glioblastoma.

5. La combinación terapéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho tumor se caracteriza por una amplificación en el locus del gen AR asociado con un aumento del número de copias del gen AR de 1-20.

6. La combinación terapéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho tumor se caracteriza por la pérdida de heterocigosidad (LOH) en el locus de gen AR.

7. La combinación terapéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho tumor se caracteriza por una sobreexpresión de AR, en donde dicho tumor está asociado con una elevación de 1,1 a 20 veces del nivel de proteína AR.

8. La combinación terapéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho tumor se caracteriza por la expresión de al menos una variante de AR seleccionada del grupo que consiste en una variante caracterizada por deleción o mutación en el dominio de unión del ligando (LBD) y una variante de empalme de AR independiente de ligando.

9. La combinación terapéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicha variante es la variante 7 de AR (AR-V7).

10. La combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 9, en donde dicho tumor se caracteriza por una sobreexpresión de AR de tipo salvaje y por la expresión de AR-V7, o en donde dicho tumor se caracteriza por una sobreexpresión de AR de tipo salvaje y una sobreexpresión de AR de tipo salvaje expresión de AR-V7.

11. La combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 9, en donde dicho tumor se caracteriza por la expresión de AR-V7 y además se caracteriza por LOH en el locus del gen AR.

12. La combinación terapéutica para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en donde el sujeto es un ser humano y/o en donde el sujeto es una mujer.

13. La combinación terapéutica para su uso según la reivindicación 1, en donde la combinación se selecciona del grupo que consiste en: (i)

(i) bicalutamida y erlotinib,

(ii) bicalutamida, carmustina y erlotinib, y

(iii) enzalutamida y afatinib.