ES2900028T3 - Técnica de análisis de muestras de tejidos - Google Patents

Abstract

Un método de análisis cuantitativo de una muestra de tejido, que comprende: realizar una medición de ploidía en una pluralidad de núcleos de la muestra para determinar el tipo de ploidía de la muestra; realizar una medición de estroma en una sección de la muestra de tejido para determinar el tipo de estroma de la muestra al determinar si la muestra es un tipo de estroma alto que tiene un porcentaje de estroma por encima de un porcentaje de estroma predeterminado o un tipo de estroma bajo que tiene un porcentaje de estroma como el porcentaje de estroma máximo predeterminado; y caracterizado por generar una clasificación basada en el tipo de estroma y el tipo de ploidía; en el que la medición de la ploidía se lleva a cabo al: preparar una muestra del tejido de manera que los núcleos se liberen y se tiñen con una tinción específica de ADN; capturar una imagen de microscopio de la muestra de núcleos, segmentar la imagen en la imagen capturada para identificar los núcleos; para cada uno de una pluralidad de núcleos, obtener la densidad óptica integrada; y determinar la clasificación de ploidía del ADN para la muestra.

Description

DESCRIPCIÓN

Técnica de análisis de muestras de tejidos

Antecedentes de la invención

En muchos tipos de cáncer, en el momento del diagnóstico es difícil para el médico predecir el crecimiento y el comportamiento del tumor. Las predicciones realizadas en este momento afectan el tipo de tratamiento del paciente y, por tanto, pueden tener grandes consecuencias para el resultado futuro y su calidad de vida. El tratamiento del cáncer puede ser un estrés duro, y si el tumor del paciente es indolente, un tratamiento agresivo podría causar más dolor e incomodidad que el cáncer en sí. Separar los tumores agresivos de los indolentes en el momento del diagnóstico y, además, elegir el tratamiento adecuado, es un desafío principal en la atención del cáncer.

El análisis de imágenes digitales de núcleos celulares y otras estructuras es un método útil para obtener información cuantitativa del tejido. Pueden emplearse métodos que completen el análisis tanto de los núcleos celulares aislados como del tejido circundante. Como tal, existe una motivación para desarrollar sistemas automáticos que puedan capturar estos núcleos celulares del medio original, reunir una población significativa de núcleos y caracterizarlos. Puede apreciarse que los métodos que permiten la caracterización de núcleos celulares tienen aplicaciones médicas, clínicas y de descubrimiento de fármacos.

El uso de un enfoque de estroma para la clasificación de tumores es propuesto por Huijbers et al, “The proportion of tumor-stroma as a strong prognosticator for stage II and III colon cancer patients: validation in the VICTOR trial”, Annals of Oncology volumen 24 páginas 179 a 185 (2013), publicado en Internet el 2 de agosto de 2012. P E Carvalho et al, “Useful Prognostic Panel Markers to Express the Biological Tumor Status in Resected Lung Adenocarcinomas”, revista japonesa de oncología clínica, noviembre de 2000, analiza un análisis multivariado de variables que incluyen el estroma.

Resumen de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un método de análisis cuantitativo de una muestra de tejido de acuerdo con la reivindicación 1.

La clasificación puede ser una clasificación como “alto”, “ intermedio” o “bajo” riesgo o, alternativamente, la clasificación puede ser simplemente una combinación del tipo de estroma y el tipo de ploidía, por ejemplo, “diploide, estroma bajo”. De cualquier manera, se puede obtener un mejor pronóstico de lo que cabría esperar que utilizando solo el tipo de ploidía.

La medición de la ploidía se lleva a cabo al

preparar una muestra del tejido de modo que los núcleos se liberen y se tiñen con una tinción específica de ADN; capturar de una imagen microscópica de la muestra del núcleo,

segmentar la imagen en la imagen capturada para identificar los núcleos;

para cada uno de una pluralidad de núcleos, obtener la densidad óptica integrada; y

determinar la clasificación de ploidía del ADN de la muestra.

La medición del estroma puede realizarse al:

obtener una sección de tejido;

teñir la sección de tejido;

capturar una imagen microscópica de la sección de tejido teñida;

usar un algoritmo de agrupamiento para segmentar los píxeles de la imagen del microscopio en píxeles estroma y no estroma; y

calcular la fracción de píxeles del estroma en la imagen; y

determinar si la fracción de píxeles del estroma excede el porcentaje de estroma predeterminado.

El método por etapas puede incluir además convertir la imagen del microscopio capturada en tonos.

- saturación - coordenadas de color del valor antes de realizar la etapa de usar un algoritmo de agrupamiento.

La etapa de usar un algoritmo de agrupamiento puede incluir ajustar los píxeles de la imagen a dos curvas gaussianas, una curva gaussiana correspondiente al estroma y otra correspondiente a las regiones no estroma de la imagen. En un enfoque, el método para obtener una fracción de estroma incluye:

convertir la imagen capturada en una imagen de hemotoxilina normalizada que representa las áreas de la imagen teñidas con hemotoxilina y una imagen de hemotoxilina y eosina normalizada que representa las áreas de la imagen teñidas con hemotoxilina o eosina;

calcular una máscara de fondo de píxeles en la imagen normalizada de hemotoxilina y eosina que tiene una saturación por debajo de un primer nivel predeterminado y un valor por debajo de un segundo nivel predeterminado correspondiente al fondo de la imagen; y

calcular una máscara de tejido conectivo convirtiendo la imagen normalizada de hemotoxina a gris para obtener una imagen convertida a gris, en el que la etapa de utilizar un algoritmo de agrupamiento utiliza un algoritmo de agrupamiento y un umbral en la imagen convertida en gris para identificar píxeles de tejido conectivo.

El porcentaje de estroma predeterminado puede ser del 30 % al 70 %, por ejemplo, del 40 % al 60 %.

El método también puede incluir calcular un grupo de supervivencia del paciente a partir del tipo de estroma y el tipo de ploidía.

Una muestra de estroma alto de tipo estroma y un tipo de ploidía no diploide puede indicarse como de alto riesgo, una muestra de estroma de tipo estroma bajo y diploide de tipo ploidía puede indicarse como de bajo riesgo, y en las que las muestras que tienen un tipo de estroma de estroma bajo y un tipo de ploidía de tipo no diploide o un tipo de estroma de estroma alto y un tipo de ploidía de diploide pueden estar indicados como en un nivel de riesgo intermedio.

El análisis que se realiza mediante la presente invención permite la caracterización de muestras combinando la combinación de evaluación cuantitativa de la población de núcleos y la cantidad de tejido estromal dentro de una sección de tejido, donde una sección de tejido, típicamente obtenida de una biopsia, contiene muchos diferentes tipos de tejidos, epiteliales, estromas, musculares, lumen y zona mucinosa y otros.

La presente invención permite obtener información cuantitativa combinando información cuantitativa obtenida sobre núcleos de células individuales aisladas e información cuantitativa de secciones de tejido.

La muestra puede ser de tejido canceroso. En ejemplos particulares, el tejido canceroso puede ser tejido de colon, tejido rectal o tejido prostático.

También se describe un método para medir el porcentaje de estroma en un tejido al:

obtener una sección de tejido;

teñir la sección de tejido;

capturar una imagen microscópica de la sección de tejido teñida;

conversión de la imagen de microscopio capturada a coordenadas de color de valor de tono - saturación; ajustar el valor de tono de los píxeles de la imagen a dos curvas gaussianas, una curva gaussiana correspondiente al estroma y otra correspondiente a las regiones sin estroma de la imagen para segmentar los píxeles de la imagen del microscopio en píxeles estroma y no estroma; y

calcular la fracción de píxeles del estroma en la imagen.

De esta forma, el porcentaje de estroma puede obtenerse de forma fiable de forma automática sin necesidad de un médico.

El método puede comprender además determinar si la muestra es un tipo de estroma alto que tiene un porcentaje de estroma por encima de un porcentaje de estroma predeterminado o un tipo de estroma bajo que tiene un porcentaje de estroma como máximo del porcentaje de estroma predeterminado.

Se describe además un método para medir el porcentaje de estroma en un tejido a partir de una imagen microscópica capturada de una sección de tejido teñida mediante:

convertir la imagen capturada en una imagen de hemotoxilina normalizada que representa las áreas de la imagen teñidas con hemotoxilina y una imagen de hemotoxilina y eosina normalizada que representa las áreas de la imagen teñidas con hemotoxilina o eosina;

calcular una máscara de fondo de píxeles en la imagen normalizada de hemotoxilina y eosina que tiene una saturación por debajo de un primer nivel predeterminado y un valor por debajo de un segundo nivel predeterminado correspondiente al fondo de la imagen;

convertir la imagen normalizada de hemotoxina a gris para obtener una imagen convertida a gris;

uso de un algoritmo de agrupamiento y establecimiento de umbrales en la imagen convertida en gris para obtener una máscara de tejido conectivo que identifica píxeles de tejido conectivo; y

obtener el porcentaje de estroma a partir del porcentaje de tejido conectivo identificado por la máscara de tejido conectivo en la imagen excluyendo el fondo identificado por la máscara de fondo.

Breve descripción de los dibujos

Para una mejor comprensión de la invención, se describirán ahora realizaciones, puramente a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 muestra un diagrama de flujo que ilustra la realización de una medición de ploidía;

La Figura 2 muestra un aparato para realizar la medición de ploidía de la Figura 1;

La Figura 3 muestra un ejemplo de medición de ploidía de una muestra normal;

La Figura 4 muestra un ejemplo de medición de ploidía de una muestra anormal;

La Figura 5 ilustra una imagen de estroma después de seccionar y teñir;

La figura 6 muestra un diagrama de flujo que ilustra la realización de una medición del estroma;

La Figura 7 muestra un diagrama de flujo que ilustra un método combinado;

La Figura 8 muestra los resultados de supervivencia del paciente en un ejemplo que utiliza clasificaciones de ploidía y estroma;

La Figura 9 muestra los resultados de supervivencia del paciente utilizando solo una clasificación de ploidía;

La Figura 10 muestra los resultados de supervivencia del paciente en un ejemplo que utiliza clasificaciones de ploidía y estroma;

La Figura 11 muestra los resultados de supervivencia del paciente en un ejemplo que utiliza solo la clasificación de ploidía;

La Figura 12 muestra los resultados de supervivencia del paciente en un ejemplo que utiliza solo la clasificación del estroma;

La Figura 13 muestra los resultados de supervivencia del paciente en un ejemplo que utiliza clasificaciones de ploidía y estroma; y

La Figura 14 muestra los resultados de supervivencia del paciente en un ejemplo que utiliza solo la clasificación de ploidía.

Descripción

En una realización, las muestras de tejido extraídas previamente de una región cancerosa para biopsia se usan para preparar una sección de tejido usada para una medición de estroma y se usan más células de la muestra para una medición de ploidía. Estos se discuten en más detalle a continuación.

Medición de ploidía

Con referencia a las Figuras 1 y 2, el equipo de microscopía y el equipo de captura de imágenes digitales se utilizan para el análisis de núcleos celulares, específicamente la cromatina dentro de los núcleos con el fin de obtener información cuantitativa sobre la estructura de la cromatina dentro de los núcleos celulares. La realización usa los datos de intensidad de la escala de grises de los núcleos preparados para completar el análisis.

En primer lugar, se prepara una muestra de células a partir de la muestra de tejido usando procedimientos de laboratorio estándar para hacer una capa teñida de una sola capa en el portaobjetos 76 usando el método de Feulgen. El método es bien conocido y se describe, por ejemplo, en Ris y Mirsky, “Quantitative Cytochemical determination of desoxyribonucleic acid with the Feulgen nucleal reaction.”, The Journal of General Physiology, (1949) páginas 125 a 146 Tenga en cuenta que esta técnica incluye un homogeneizador o paso de liberación para que la muestra teñida resultante sea de un conjunto homogeneizado de células, no de una sección de células.

El portaobjetos 76 preparado se coloca sobre un microscopio 74, en particular sobre la platina controlada por ordenador 78. El microscopio 74 utiliza un dispositivo 70 de formación de imágenes. Un ordenador 72 personal programado por software de ordenador de acuerdo con la realización controla la electrónica 80 de control que controla la platina 78 para mover la platina y la muestra y, por lo tanto, la ubicación del portaobjetos bajo el microscopio. El ordenador 72 personal conduce la platina 78 a la posición requerida y la cámara digital se usa para capturar la imagen una vez que la muestra está en la ubicación requerida.

El ordenador se utiliza para controlar la cámara digital y también para completar el análisis posterior. El ordenador lleva a cabo el conjunto de etapas ilustradas en la Figura 1.

En primer lugar, (etapa 10) se calcula un nivel de fondo para la imagen en su conjunto, tomando un área de referencia libre de núcleos y otros artefactos.

A continuación, la etapa 78 se mueve a una primera posición de cuadro (etapa 12) y se captura una imagen (etapa 14).

A continuación, la imagen se procesa corrigiendo el tono (etapa 16) y segmentando los núcleos (etapa 18). En GB 1019429.8 se proporcionan más detalles del algoritmo de segmentación utilizado.

A continuación, se obtiene la densidad óptica integrada de cada núcleo (etapa 20). Si se han capturado suficientes núcleos, es decir, si el número de núcleos para los que la intensidad óptica integrada supera un número predeterminado, el método pasa a la etapa 24. Sin embargo, si se ha medido un número insuficiente de núcleos, el método vuelve a la etapa 12, donde el escenario se traslada a una nueva ubicación para capturar una imagen de otros núcleos. Estas etapas se repiten hasta que se haya medido toda la muestra o el número de núcleos supere el número predeterminado.

Entonces se puede obtener un histograma (etapa 24) para determinar el rango de densidades ópticas integradas. Esto se usa para determinar la clasificación de ploidía del ADN si la muestra es una muestra diploide con un solo pico grande en la posición 2C como se ilustra en la Figura 2 o no diploide como se ilustra en la Figura 3. Nótese que, en la práctica, el histograma no necesita calcularse o representarse como tal; todo lo que se requiere es que los datos de los núcleos estén almacenados y que el ordenador 72 personal pueda clasificar los datos como se indica a continuación.

Las Figuras 3 y 4 ilustran histogramas de dos muestras.

La Figura 3 muestra un histograma del número de núcleos con una variedad de densidades ópticas integradas, correspondiente a la ploidía de la muestra. La escala indica las densidades ópticas correspondientes al número haploide de 1c, 2c, 4c y 5c. Estas densidades ópticas corresponden al número de copias de cromosomas en la célula.

2c es una célula diploide y 4c es una célula en proceso de división.

La figura 4 muestra un histograma correspondiente para una muestra aneuploide. En este caso, además de un pico significativo en 2c, también hay un pico significativo en un valor aneuploide intermedio entre los picos 2c y 4c. Esto corresponde a una muestra no diploide.

En el ejemplo específico de la clasificación de la ploidía del ADN, un tumor se clasificó como diploide si solo estaba presente un pico G0/G1 (2c), el número de núcleos en el pico G2 (4c) no excedía el 10 % del número total de núcleos y el número de núcleos con un contenido de ADN superior a 5c no superó el 1 %.

Un tumor se definió como tetraploide si estaba presente un pico 4c (DI 1.9-2.1) (el número de núcleos en el pico 4c es mayor que la fracción de fase S y más del 10 % del total de núcleos), el número de núcleos en el pico G2 (8c) no superó el 10 % del número total de núcleos y el número de núcleos con contenido de ADN superior a 9c no superó el 1 %.

Un tumor se definió como poliploide cuando más del 10 % del número total de núcleos estaba presente en el pico 8c y/o el número de núcleos con un contenido de ADN superior a 9c excedía el 1 %.

Un tumor se definió como aneuploide cuando estaban presentes picos no euploides o el número de núcleos con un contenido de ADN superior a 5c, que no representaba poblaciones euploides, excedía el 1 %. Un tumor se clasificó como hiperdiploide si se demostró un pico aneuploide con un índice de ADN de 1.06-1.10.

Medición del estroma

Se obtiene una muestra de tejido, se secciona y se tiñe para obtener una imagen como se ilustra en la Figura 5. Se usa tinción con hematoxilina y eosina para preparar las secciones.

Luego, con referencia a la Figura 6, se captura una imagen en color de la sección usando un escáner de portaobjetos (etapa 40) y se carga a un ordenador. A continuación, la imagen se convierte en coordenadas de color con valor de saturación de tono (etapa 42).

A continuación, se elimina el fondo (etapa 46). Esto se hace identificando una región de la imagen sin tejido.

A continuación, se lleva a cabo un ajuste a dos gaussianos. Se establecen las condiciones iniciales (etapa 48) y luego se usa un algoritmo de agrupamiento (etapa 50) para ajustar dos colores diferentes a los datos, cada uno representado por un gaussiano diferente. Esto divide efectivamente la imagen entre estroma y no estroma. Este algoritmo de agrupamiento utiliza el valor de tono solo de la imagen en color.

A continuación, se eliminan áreas pequeñas por debajo de un cierto número de píxeles (etapa 52), y la imagen se pasa a través de un filtro mediano (etapa 54) para eliminar el ruido en la imagen.

A continuación, se calcula la fracción estromal (etapa 56). Las muestras se identifican como de estroma alto cuando la fracción de estroma está por encima de un valor predeterminado, por ejemplo, en el intervalo: 50 %, por ejemplo. Las otras muestras se clasifican como estroma bajo.

Combinación

La figura 7 ilustra el método combinado, partiendo de una muestra de tejido.

El histograma resultante del método ilustrado en la Figura 1 se clasifica como que tiene un tipo de ploidía diploide o no diploide (etapa 62). En este caso, cualquier resultado que sea tetraploide, poliploide o aneuploide se clasifica como no diploide. El experto en la materia se dará cuenta de que existen otros cálculos que pueden clasificar la muestra como diploide o no diploide sin requerir un histograma, y tales métodos son igualmente posibles.

La fracción de estroma resultante del método ilustrado en la Figura 6 también se clasifica como estroma alto o estroma bajo (etapa 64).

Luego, las clasificaciones combinadas se utilizan para calcular la tasa de recaída esperada después de un tiempo particular. De manera equivalente, los datos pueden usarse para capturar la tasa de supervivencia libre de recaídas. Alternativamente, se pueden capturar en su lugar datos relacionados con la supervivencia del paciente. Estos datos pueden proporcionar información útil para un médico que puede optar por una intervención más agresiva cuando la esperanza de vida es menor.

Las estimaciones de la tasa de recaída del paciente se pueden obtener mediante experimentos. Los inventores han descubierto que una combinación de los dos métodos da resultados inesperadamente buenos.

Se llevó a cabo un experimento en dos series de pacientes, una primera serie “V” que es una serie de 850 pacientes con cáncer colorrectal en estadio II o III inscritos en un ensayo en Oxford y una segunda serie “A” que es una serie de 587 pacientes con cáncer colorrectal en estadio I, II o III, en el hospital de la Universidad de Oslo. A todos los pacientes se les ha extirpado quirúrgicamente el tumor. Los pacientes con estadio III menores de 75 años han recibido quimioterapia adicional (adyuvante). Se ha realizado un seguimiento de todos los pacientes durante al menos 5 años o hasta la muerte.

Las muestras se clasificaron tanto en el método de ploidía de ADN descrito anteriormente como diploide o no diploide, como también en la medición del estroma descrita anteriormente y se clasificaron como estroma bajo o estroma alto. Las tasas de recaída se trazaron de diferentes formas. Los gráficos presentados están etiquetados como D para diploide o N para no diploide, H para estroma alto y L para estroma bajo.

La Figura 8 traza las tasas de supervivencia sin recaída durante varios años después de las mediciones de la serie A. Tenga en cuenta que la combinación de mediciones utilizando tanto el tipo de estroma como el tipo de ploidía proporciona una buena separación del estroma alto no diploide con una tasa de supervivencia libre de recaída a 5 años del 50 % y el estroma bajo diploide con una tasa de supervivencia sin recaídas de 5 años.

La separación de estos gráficos es mucho mejor que la ilustrada en la Figura 9 que muestra los resultados separados solo por el tipo de ploidía de diploide o no diploide (ploidía).

Por tanto, es evidente que la combinación de los dos métodos da resultados mucho mejores que simplemente mirar una clasificación basada en ploidía. Por tanto, al generar tanto la información relativa al tipo diploide como al tipo de estroma, se proporcionan datos de salida que permiten al médico estimar con mayor precisión el pronóstico, es decir, la tasa de supervivencia libre de recaídas y, por lo tanto, seleccionar el tratamiento apropiado.

La figura 10 proporciona los datos correspondientes para la serie V. Una vez más, este gráfico muestra una separación mucho mejor de la esperanza de vida y, por lo tanto, el poder de diagnóstico, que la Figura 11, que simplemente muestra los resultados basados en la clasificación por tipo de ploidía.

La figura 12 muestra los datos correspondientes a la figura 10 separados solo por tipo de estroma. Tenga en cuenta que los resultados de la Figura 10 también son mejores que los de la Figura 12 utilizando solo el tipo de estroma.

En otras palabras, la combinación de estroma y ploidía funciona mejor que cualquiera de los dos solos.

Los resultados anteriores se refieren al cáncer colorrectal. Sin embargo, el mismo enfoque funciona para otros tipos de cáncer.

La Figura 13 muestra los resultados de supervivencia sin recaída calculados de la misma manera para el cáncer de próstata usando una clasificación basada tanto en el tipo de estroma como en el tipo de ploidía.

La Figura 14 muestra un ejemplo comparativo que usa solo el tipo de ploidía. Tenga en cuenta que los resultados son mucho mejores si se usa el enfoque combinado que solo se usa ploidía.

Por tanto, la evidencia sugiere que el método es de aplicación general, no solo para el cáncer colorrectal.

Obsérvese que, en la mayoría de los casos, cuando se realizan diferentes mediciones en la misma muestra, se obtiene poca mejora en las estimaciones de supervivencia sin recaída combinando las estimaciones en lugar de utilizar simplemente la mejor de las diferentes mediciones. Sin embargo, en este caso de la medición de la ploidía y la medición del estroma descritas aquí, las diferentes mediciones dividen inesperadamente las muestras en poblaciones con resultados significativamente diferentes y, por lo tanto, el método brinda una utilidad mucho mejor en la toma de decisiones médicas posteriores que usar solo una de las mediciones. En particular, incluir la medición del estroma mejora significativamente los resultados en comparación con la medición de la ploidía sola.

Se describirá ahora un método adicional para identificar el estroma. El método descrito anteriormente usa una imagen convertida en coordenadas HSV, extrae automáticamente dos rangos de tono y usa un algoritmo de agrupamiento automático en los valores de tono. En cambio, en una disposición alternativa para identificar el estroma, se utilizan los valores de tono y saturación de la imagen convertida. A cada uno se le da la misma ponderación.

En detalle, el método de acuerdo con la alternativa es el siguiente:

En primer lugar, se escanea una diapositiva de una imagen teñida con una tinción de hematoxilina y eosina y se corrige el balance de blancos usando una versión del método de Huo como se enseña en Huo J, et al. “Robust Automatic White Balance Algorithm using Gray Color Points in Images”, IEEE transacciones en electrónica de consumo, 2006, volumen 52, número 2, páginas 541 a 546.

A continuación, la imagen se extrae y se vuelve a muestrear. En un ejemplo, el remuestreo se realizó con una proporción de 1/8 produciendo una imagen con una resolución lineal de aproximadamente 2 pm.

A continuación, los canales de color se extraen y normalizan utilizando el método enseñado por Macenko M, et al, “A method for normalising histology slides for quantitative analysis", Biomedical Imaging: From Nano to Macro 2009, IEEE international symposium on biomedical imaging ISBI 2009, páginas 1107 a 1110. De hecho, este proceso da como resultado dos imágenes, denominadas imagen de hematoxilina y la imagen de H y E. La imagen de hematoxilina es una imagen normalizada que se relaciona con la tinción de hematoxilina, no la tinción de eosina, y la imagen H y E es una imagen normalizada correspondiente a las tinciones de hematoxilina y eosina.

Estas imágenes se procesan usando datos de color en el espacio de color HSV de tono, saturación y valor.

A continuación, se crean dos máscaras, a saber, una máscara de fondo y una máscara de tejido conectivo.

Para obtener la máscara de fondo, se aplica un filtro de promedio de tamaño 7x7 a la imagen H&E normalizada. Luego, los píxeles con un Valor V <0.2 y una saturación media S < 0.4 se eliminan para crear la máscara de fondo.

Para obtener la máscara de tejido conectivo, la imagen normalizada de la hemotoxilina es gris y la mediana se filtra con una ventana de 9x9 para obtener una imagen mediana. Luego, esta imagen se procesa con un filtro de desviación estándar con un tamaño de núcleo de 17 para obtener una imagen filtrada con desviación estándar.

Estas dos imágenes, la imagen mediana y la imagen filtrada por desviación estándar se combinan por adición; tenga en cuenta que ambas imágenes están normalizadas. A continuación, se realiza el ajuste del histograma para ajustar la imagen de modo que el 1 % de los valores bajos y altos estén saturados. El resultado de esto es una imagen combinada.

Usando el método de Otsu para calcular un nivel de umbral, la imagen combinada tiene un umbral aplicado a 1.15 veces este valor de umbral calculado por Otsu. Luego, esta imagen se filtra para eliminar los objetos pequeños por debajo de 200 píxeles de área y se aplica un filtro de cierre con un núcleo de disco de tamaño 3 para obtener una máscara de tejido conectivo.

La máscara de tejido conectivo y la máscara de fondo se combinan luego usando una operación AND para obtener una máscara final. La fracción de estroma se calcula a partir de la fracción de tejido conectivo (es decir, el estroma) en una región de interés, es decir, el número de píxeles de tejido conectivo (no de fondo) dividido por el número total de píxeles (no de fondo).

Por tanto, en este caso, el método calcula eficazmente una máscara basada en dos máscaras separadas, una para excluir el tejido conectivo y otra para excluir el fondo, mejorando el método en comparación con el método anterior. Para probar los resultados del método, este método se aplicó a varios tumores que se clasificaron - los tumores con una fracción de estroma inferior al 50 % se clasificaron como estroma bajo y los tumores con una fracción de estroma del 50 % o superior se clasificaron alto.

El análisis multivariado mostró que el método tenía un valor particular en los tumores en etapa 3, y mostró que en la muestra los factores pronósticos relevantes eran estroma, ploidía y mutación, y etapa T. De acuerdo con lo anterior, proporcionar una herramienta para realizar análisis cuantitativos utilizando una fracción de estroma utilizando los métodos aquí enseñados, así como la ploidía, mejora significativamente la fiabilidad del diagnóstico en comparación con los métodos que utilizan la ploidía pero que no utilizan la fracción de estroma.

En particular, para la muestra analizada, se obtuvieron los siguientes factores multivariados. El cociente de riesgo es la razón de las tasas de riesgo descritas por dos condiciones, por lo que una razón de riesgo de 2 indica una duplicación del riesgo para el valor adverso en comparación con el valor positivo. En los resultados, la métrica utilizada fue la supervivencia libre de recurrencia a cinco años.

Estroma: Cociente de riesgo 2.0 (intervalo de confianza 1.4 a 2.9) y valor de p < 0.001

Ploidía: Cociente de riesgo 1.4 (intervalo de confianza de 0.9 a 2.2) y valor de p 0.14.

Etapa T: Cociente de riesgo 1.6 (intervalo de confianza 1.1 a 2.4) y valor p 0.019.

La selección de solo tumores en etapa 3 con T-etapa T3 dio valores aún mejores:

Estroma: Cociente de riesgo 2.1 (intervalo de confianza de 1.3 a 3.4) y valor de p 0.003.

Ploidía: Cociente de riesgo 2.0 (intervalo de confianza 1.1 a 3.3) y valor de p 0.013.

Por supuesto, el tamaño de muestra más pequeño da como resultado mayores intervalos de confianza relativa. Por tanto, la inclusión del estroma proporciona claramente mejores resultados, ya que los pacientes con un recuento de estroma alto tienen el doble de riesgo que los pacientes con un estroma bajo.

Aunque a primera vista el método no implica el tono de la imagen, el método utilizado para separar la imagen de hemotoxilina y la imagen de H&E utiliza el tono.

Los inventores han descubierto que el método de acuerdo con esta segunda realización da resultados más reproducibles, es decir, es más robusto frente a cambios en la tinción de la imagen y la captura de imagen, lo que por supuesto es un problema importante en dicho procesamiento de imágenes. Sin pretender imponer ninguna teoría, se considera que la normalización que tiene lugar para crear la imagen de hemotoxilina y la imagen de H&E es eficaz para normalizar las imágenes y reducir el efecto de tales cambios en la tinción de la muestra y en la captura de imágenes.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método de análisis cuantitativo de una muestra de tejido, que comprende:

realizar una medición de ploidía en una pluralidad de núcleos de la muestra para determinar el tipo de ploidía de la muestra;

realizar una medición de estroma en una sección de la muestra de tejido para determinar el tipo de estroma de la muestra al determinar si la muestra es un tipo de estroma alto que tiene un porcentaje de estroma por encima de un porcentaje de estroma predeterminado o un tipo de estroma bajo que tiene un porcentaje de estroma como el porcentaje de estroma máximo predeterminado;

y caracterizado por generar una clasificación basada en el tipo de estroma y el tipo de ploidía;

en el que la medición de la ploidía se lleva a cabo al:

preparar una muestra del tejido de manera que los núcleos se liberen y se tiñen con una tinción específica de ADN; capturar una imagen de microscopio de la muestra de núcleos,

segmentar la imagen en la imagen capturada para identificar los núcleos;

para cada uno de una pluralidad de núcleos, obtener la densidad óptica integrada; y

determinar la clasificación de ploidía del ADN para la muestra.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la medición del estroma se lleva a cabo al:

obtener una sección de tejido;

teñir la sección de tejido;

capturar una imagen de microscopio de la sección de tejido teñida;

usar un algoritmo de agrupamiento para segmentar los píxeles de la imagen de la imagen del microscopio en píxeles de estroma y no estroma; y

calcular la fracción de píxeles del estroma en la imagen; y

determinar si la fracción de píxeles del estroma excede el porcentaje de estroma predeterminado.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que usar un algoritmo de agrupamiento comprende ajustar los píxeles de la imagen a dos curvas gaussianas, una curva gaussiana correspondiente al estroma y otra correspondiente a las regiones no estroma de la imagen.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, que comprende además convertir la imagen de microscopio capturada en coordenadas de color de valor de tono-saturación antes de realizar la etapa de usar un algoritmo de agrupamiento.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la etapa de usar un algoritmo de agrupamiento incluye ajustar el valor de tono de los píxeles de la imagen a dos curvas gaussianas, una curva gaussiana correspondiente al estroma y otra correspondiente a regiones de la imagen que no son estroma.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la imagen capturada tiene una tinción de hemotoxilina y eosina, que además comprende:

convertir la imagen capturada en una imagen de hemotoxilina normalizada que representa las áreas de la imagen teñidas con hemotoxilina y una imagen de hemotoxilina y eosina normalizada que representa las áreas de la imagen teñidas con hemotoxilina o eosina;

calcular una máscara de fondo de píxeles en la imagen normalizada de hemotoxilina y eosina que tiene una saturación por debajo de un primer nivel predeterminado y un valor por debajo de un segundo nivel predeterminado correspondiente al fondo de la imagen; y

calcular una máscara de tejido conectivo convirtiendo la imagen normalizada de hemotoxiina en gris para obtener una imagen convertida en gris;

en el que la etapa de utilizar un algoritmo de agolpamiento utiliza un algoritmo de agolpamiento y un umbral en la imagen convertida en gris para identificar píxeles de tejido conectivo.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en el que el porcentaje de estroma predeterminado es del 30 % al 70 %.

8. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente que comprende, además:

calcular un grupo de supervivencia libre de recaídas a partir del tipo de estroma y el tipo de ploidía.

9. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que una muestra de estroma de tipo estroma alto y un tipo de ploidía no diploide se clasifica como de alto riesgo, una muestra de estroma de tipo estroma bajo y diploide de tipo ploidía indica un riesgo bajo, y en el que las muestras que tienen un tipo de estroma de estroma bajo y un tipo de ploidía de tipo no diploide o un tipo de estroma de estroma alto y un tipo de ploidía de diploide indican niveles intermedios de riesgo.

10. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra de tejido es de tejido canceroso y preferiblemente en el que el tejido canceroso es tejido de próstata, tejido de colon o tejido rectal.