ES2898676T3 - Agonistas selectivos de rar-alfa resistentes a CYP26 en el tratamiento del cáncer - Google Patents

Abstract

Una combinación para su uso en un método para tratar una neoplasia maligna hematológica, en donde la combinación comprende una dosis eficaz de un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARα) resistente a CYP26 y un inhibidor de la proteasoma y, opcionalmente, al menos un agente anticancerígeno adicional, en donde el agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARα) resistente a CYP26 es un compuesto que tiene la estructura de fórmula III **(Ver fórmula)** (IRX5183), y en donde el al menos un agente anticancerígeno adicional opcional se selecciona de la lista que consiste de etopósido, una antraciclina, idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, citarabina, una combinación de una antraciclina, citarabina y etopósido, un agente desmetilante, 5-azacitidina, decitabina, un inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de BCR-ABL, un inhibidor de Flt3, un inhibidor de cKit, un inhibidor de IDH1/2, un inhibidor de JAK2, un inhibidor de BTK, mAb anti-CD33, mAb anti- CD20, mAb anti-CD19, mAb anti-CD30, un inhibidor de PD1, un inhibidor de CTL4, lenolidamida, pomalidomida, ciclofosfamida, bevacizumab, vincristina, un corticosteroide, bleomicina, adriamicina, bendamustina, fludarabina, G-CSF, GM-CSF, Epo y combinaciones de los mismos, por lo cual, como resultado del tratamiento, se reduce la carga tumoral; en donde el método comprende la administración de dicha combinación a un sujeto que lo necesite; en donde el inhibidor de la proteasoma es bortezomib, y en donde la neoplasia maligna hematológica es mieloma múltiple.

Description

DESCRIPCIÓN

Agonistas selectivos de rar-alfa resistentes a CYP26 en el tratamiento del cáncer

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de patente provisional de Estados Unidos 62/260,098 presentada el 25 de noviembre de 2015.

Campo

La invención está definida mediante la reivindicación 1. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

Antecedentes

Las células madre hematopoyéticas (HSC) normales están preparadas para ser muy sensibles a los retinoides, pero se mantienen en un estado sin señalización de retinoides al aislarlas de los niveles fisiológicos de retinoides. El microambiente de la médula ósea, mediante la expresión de la enzima CYP26 inactiva metabólicamente el ácido retinoico, regula la exposición de la médula ósea a los retinoides. Este mecanismo (metabolismo de los retinoides mediado por CPY26) es dinámico y el estroma de la médula ósea lo usa para adaptar el comportamiento de las HSC a las necesidades fisiológicas. Por ejemplo, los niveles bajos de retinoides en estado estacionario en el nicho de la médula ósea mantienen las HSC en un estado inactivo, mientras que durante situaciones de estrés (es decir, exposición a radiación o quimioterapia) se mantienen niveles más altos de retinoides para reclutar las HSC en la división celular y rescatar la hematopoyesis.

En sujetos con neoplasias malignas hematológicas, las células madre hematopoyéticas del cáncer están protegidas de los retinoides mediante la CYP26 del estroma, de manera similar a la situación normal. Sin embargo, debido a otras alteraciones en el nicho de la médula ósea en las neoplasias malignas hematológicas, tales como las diferencias en la actividad del aldehído deshidrogenasa (ALDH), existe una ventana terapéutica para que los retinoides sean útiles en el tratamiento de las neoplasias malignas hematológicas. La expresión de CYP26 por el microambiente de la médula ósea contribuye a la protección de las células de leucemia mieloide aguda (AML) inmaduras del ácido retinoico todo trans (ATRA) y puede explicar por qué ATRA no es eficaz en el tratamiento de la AML. La exposición a concentraciones farmacológicas de ATRA que actúan a través del receptor gamma del ácido retinoico (RARy), induce la expresión de CYP26 en el microambiente de la médula ósea, así protege las células madre cancerosas de la actividad retinoide. Sin embargo, el uso de análogos de retinoides que no son inactivados por CYP26 permite que tales retinoides se diferencien de manera terminal y así eliminen las HSC cancerosas del nicho protector de la médula ósea. Dado que tal diferenciación está mediada por RARa, y el uso de análogos específicos de RARa, que son resistentes a CYP26, permite la actividad inductora de diferenciación terapéutica sin inactivación por la enzima CYP26.

BINGZONG LI Y OTROS: "The Nuclear Factor (Erythroid-derived 2)-like 2 and Proteasome Maturation Protein Axis Mediate Bortezomib Resistance in Multiple Myeloma", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 290, no. 50, 19 de octubre de 2015 (2015-10-19), páginas 29854-29868, describe que la combinación de ATRA con bortezomib muestra una actividad potenciada contra el mieloma múltiple, incluso contra el mieloma resistente a bortezomib. Resumen

La presente invención está dirigida a una combinación para su uso en un método para tratar una neoplasia maligna hematológica, en donde la combinación comprende una dosis eficaz de un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico resistente a CYP26 (RARa) y un inhibidor del proteasoma y, opcionalmente, al menos una agente anticancerígeno adicional, en donde el agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico resistente a CYP26 (RARa) es IRX5183, y en donde al menos un agente anticancerígeno adicional opcional se selecciona de la lista que consiste en etopósido, una antraciclina, idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, citarabina, una combinación de una antraciclina, citarabina y etopósido, un agente desmetilante, 5-azacitidina, decitabina, un inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de BCR-ABL, un inhibidor de Flt3, un inhibidor de cKit, un inhibidor de IDH1/2, un inhibidor de JAK2, un inhibidor de BTK, mAb anti-CD33, mAb anti-CD20, mAb anti-CD19, mAb anti-CD30, un inhibidor de PD1, un inhibidor de CTL4, lenolidamida, pomalidomida, ciclofosfamida, bevacizumab, vincristina, un corticosteroide, bleomicina, adriamicina, bendamustina, fludarabina, G-CSF, GM-CSF, Epo y combinaciones de los mismos, por lo que, como resultado del tratamiento, se reduce la carga tumoral; en donde el método comprende la administración de dicha combinación a un sujeto que lo necesite; en donde el inhibidor del proteasoma es bortezomib, y en donde la neoplasia maligna hematológica es mieloma múltiple. Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer con agonistas selectivos del receptor alfa (RARa) del ácido retinoico (RAR) resistentes a CYP26 y su uso en el tratamiento de neoplasias malignas al actuar sobre células madre cancerosas residentes en la médula ósea.

Por tanto, un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar una neoplasia maligna hematológica que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26, mediante el cual, como resultado del tratamiento, la carga tumoral se reduce en el sujeto.

En algunos aspectos no reivindicados, la administración de una dosis eficaz del agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 da como resultado la eliminación de la enfermedad residual mínima o de las células madre cancerosas del nicho de la médula ósea del sujeto, lo que deja así al sujeto sustancialmente libre de cáncer. En determinados aspectos no reivindicados, la administración de una dosis eficaz del agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 da como resultado la sensibilización de la enfermedad residual mínima a otros agentes anticancerígenos, por lo que la combinación del agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 con otros agentes anticancerígenos da como resultado la eliminación de enfermedad residual mínima o de las células madre cancerosas del nicho de la médula ósea del sujeto, lo que deja así al sujeto sustancialmente libre de cáncer.

En determinados aspectos no reivindicados, la célula madre cancerosa es una célula madre cancerosa hematológica (HSC). En algunos aspectos no reivindicados, la neoplasia maligna hematológica es leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), CML acelerada, fase blástica de CML (CML-BP), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad de Hodgkin (HD), linfoma no Hodgkin (NHL), linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de células B, linfoma de células T, mieloma múltiple (MM), macroglobulinemia de Waldenstrom, un síndrome mielodisplásico (MDS), anemia refractaria (RA), anemia refractaria con sideroblastos anillados (RARS), anemia refractaria con exceso de blastos (RAEB), RAEB en transformación (RAEB-T) o un síndrome mieloproliferativo.

El agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 de la invención es

En otros aspectos no reivindicados, el agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es tamibaroteno (AM80), AM580 o Re 80.

En algunas modalidades, como resultado de la administración, el sujeto permanece en remisión más de 5 años.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar una neoplasia maligna de tumor sólido que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 y al menos un agente anticancerígeno adicional, por lo que, como resultado del tratamiento, la carga tumoral se reduce en el sujeto.

En determinadas modalidades, la administración de una dosis eficaz de un agonista de RARa que no es metabolizado por CYP26 da como resultado la eliminación de la enfermedad residual mínima o de las células madre cancerosas en el nicho de la médula ósea del sujeto, lo que deja así al sujeto sustancialmente libre de cáncer.

En algunos aspectos no reivindicados, la neoplasia maligna de tumor sólido es un tipo de cáncer que típicamente hace metástasis en la médula ósea. En algunos aspectos no reivindicados, el agente anticancerígeno adicional es un agente enumerado en la Tabla 1. En determinados aspectos no reivindicados, la neoplasia maligna de tumor sólido es cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y de cuello, melanoma, cáncer neuroendocrino, cáncer de cerebro, cáncer de huesos o sarcoma de tejidos blandos.

En algunos aspectos no reivindicados, el agente anticancerígeno adicional se selecciona de las combinaciones de la Tabla 1. En determinados aspectos no reivindicados, el agente anticancerígeno adicional es trastuzumab, tamoxifeno, anastrazol, exemestrano, letrozol, crizotinib, aberatrona, enzalutamida, bicalutemida, bortezomib o talidomida.

En algunas modalidades, como resultado de la administración, el sujeto permanece en remisión más de 1 año, más de 2 años, más de 3 años, más de 4 años o más de 5 años.

En algunas modalidades, como resultado de la administración, el sujeto permanece en remisión durante al menos 1 año (por ejemplo, 1-2 años, 1-3 años, 1-4 años, 1-5 años, 2-3 años, 2-4 años, 2-5 años, 3-4 años, 3-5 años o 4-5 años).

En algunas modalidades, como resultado de la administración, el sujeto permanece en remisión durante 1-2 años, 1­ 3 años, 1-4 años o 1-5 años.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARa) resistente a CYP26 y bortezomib.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARa) resistente a CYP26 y bortezomib.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARa) resistente a CYP26 y bortezomib, por lo que, como resultado del tratamiento, la carga tumoral se reduce en el sujeto.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el mieloma múltiple que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARa) resistente a CYP26 y bortezomib, por lo que, como resultado del tratamiento, la carga tumoral se reduce en el sujeto.

También se describen en la presente descripción métodos para tratar el mieloma múltiple que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un IRX5183 y bortezomib, por lo que, como resultado del tratamiento, se reduce la carga tumoral en el sujeto.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite IRX5183 y bortezomib.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un IRX5183 y bortezomib.

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer, que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una dosis eficaz de un IRX5183 y bortezomib, por lo que, como resultado del tratamiento, se reduce la carga tumoral en el sujeto.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-H representa la concentración relativa de marcadores plasmáticos BCL6 (Figura 1A y E), BLIMP-1 (Figura 1B y F), XBPS-1 (Figura 1C y G) y CHOP (Figura 1D y H) y en las líneas celulares de mieloma múltiple (MM) H929 (Figura 1A-D) o células de MM CD138+ de tres muestras de pacientes diferentes (Figura 1E-H) incubadas durante 5 días en ausencia de estroma (líquido), con o sin AGN (antagonista del receptor de RA AGN194310, 1 j M), o cocultivadas con células mesenquimales de la BM (Estroma), con o sin R115 (inhibidor de CYP26 R115866, 1 j M) o IRX (retinoide resistente a CYP26 IRX5183, 1 ^j M). La expresión en condiciones líquidas sin tratar se fijó en 1. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes con resultados similares y representan la media ± SEM. * P < 0,05 y ** P < 0,01, mediante ANOVA unidireccional de mediciones repetidas para la determinación de la significancia estadística entre grupos; Los valores de P se corrigieron para comparaciones múltiples mediante el uso de la prueba de Dunnett. Ctrl, control; máx, máximo.

La Figura 2A-B representa la recuperación clonogénica (CFU) de células H929 (Figura 2A) o la recuperación celular de células de MM CD138+ primarias de 3 muestras de pacientes diferentes (Figura 2B). Las células de MM se trataron con BTZ (2,5 nM) durante 48 horas después de incubarlas durante 5 días, ya sea en ausencia de estroma (líquido), con o sin el inhibidor de pan-RAR AGN (1 j M), o en presencia de células mesenquimales de la BM (Estroma), con o sin el inhibidor de CYP26 R115 (1 j M) o el retinoide resistente a CYP26 IRX (1 j M). La recuperación clonogénica o celular se normalizó para cada condición en ausencia de BTZ.

La Figura 3 representa la recuperación clonogénica de células H929 tratadas con BTZ (2,5 nM). Las células de MM se incubaron durante 5 días en ausencia (Líquido) o presencia de células mesenquimales de la BM (Estroma), con o sin R115 (1 ^j M). Después de esta preincubación, las células H929 se separaron del estroma de la BM, se cultivaron en medio fresco durante 0 a 48 horas y a continuación se trataron con BTZ (2,5 nM) durante 48 horas. La recuperación clonogénica se normalizó para cada condición en ausencia de BTZ.

la Figura 4 representa imágenes bioluminiscentes de xenoinjertos sistémicos de MM. Después del injerto de células H929 Luc+, los ratones se trataron con IRX (n = 4), BTZ (n = 5) o una combinación de ambos (n = 5) durante 4 semanas. Los datos representan la media ± SEM del cambio en veces en la bioluminiscencia (fotones/segundo) desde el día 0.

La Figura 5A-C representa los efectos de las células de MM sobre la expresión de CYP26A1 en el estroma de la BM. La cuantificación relativa de ARNm de CYP26A1 en células mesenquimales de la BM humana incubadas durante 24 horas en ausencia (Ctrl) o presencia (Cocultivo o Transwell) de células de MM (H929[Figura 5A], MM1s [Figura 5B], U266 [Figura 5C]). La expresión en el estroma de la BM sin tratar (Ctrl) se fijó arbitrariamente en 1.

La Figura 6A-C representa la cuantificación relativa de ARNm de CYP26A1 en el estroma de ratón de tipo salvaje (WT) o Smo-KO BM incubado durante 24 horas en ausencia (Ctrl) o presencia (Cocultivo o Transwell) de células de MM (H292, MM1s, U266). La expresión en el estroma de WT o Smo-KO sin tratar se fijó arbitrariamente en 1 para las condiciones tratadas respectivas. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. * P < 0,05 y ** P < 0,01, mediante la prueba t de Student de 2 colas no pareado.

La Figura 7 representa imágenes bioluminiscentes de ratones que muestran carga tumoral durante 4 semanas de tratamiento con IRX (10 mg/kg), BTZ (0,5 mg/kg) o la combinación. Los tumores anteriores consistieron en una combinación de células de MM1S luciferasa+ y células del estroma de la BM SmoFI/FI transducidas con un vector de control (estroma de la BM WT). Los tumores posteriores consistieron en una combinación de células de MM1S luciferasa+ y células del estroma de la BM SmoFI/FI transducidas con Cre-recombinasa (estroma de la BM Smo KO). La Figura 8 representa el cambio en veces en la bioluminiscencia (fotones/segundo) de los tumores durante 4 semanas de tratamiento. El cambio en la bioluminiscencia para cada tumor el día 1 se normalizó al cambio en la bioluminiscencia el día 14 y al final del tratamiento (día 28).

La Figura 9A-H representa la cuantificación relativa de BCL6 (marcador de células B), BLIMP, XBP1s y CHOP (marcadores de PC) en células H929 (Figura 9A) y en células de MM CD138+ primarias (Figura 9B) de 3 muestras de pacientes diferentes incubadas durante 5 días en ausencia de estroma (Ctrl) o cocultivadas con células del estroma WT o Smo-KO. La expresión en condiciones líquidas sin tratar se fijó en 1. Los datos representan la media ± SEM. * P < 0,05 y ** P < 0,01, mediante ANOVA unidireccional de mediciones repetidas para determinar la significancia estadística entre los grupos de tratamiento; Los valores de P se corrigieron para comparaciones múltiples mediante el uso de la prueba de Dunnett.

La referencia a la Figura 10A-C representa el bloqueo del estroma de la diferenciación y eliminación de AML mediada por ATRA, pero no inducida por AM80 o IRX5183. (Figura 10A) los experimentos CFU con células NB4 tratadas con ATRA l0 -7 M, IRX5183 o AM8010-8 M; (Figura 10B) células OCI-LAM3 y (Figura 10C) células Kasumi-1 tratadas con ATRA 10-6 M, IRX5183 o AM80 10-7 M mostraron una disminución en el crecimiento clonogénico comparado con el control con AM80 y IRX5183 tanto fuera como en el estroma. Datos de tres experimentos independientes.

Descripción detallada

Un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer con agonistas selectivos del receptor alfa (RARa) del ácido retinoico (RAR) resistentes a CYP26 y su uso en el tratamiento de neoplasias malignas al actuar sobre células madre cancerosas residentes en la médula ósea.

Muchas, si no la mayoría, de las neoplasias malignas surgen de una población rara de células que mantienen exclusivamente la capacidad de autorrenovarse y de sostener el tumor. Estas células madre cancerosas suelen ser biológicamente distintas de la mayor parte de las células cancerosas diferenciadas que caracterizan la enfermedad. Por ejemplo, la leucemia mieloide crónica (CML) se produce a nivel de las células madre hematopoyéticas y, al igual que sus contrapartes normales, las células madre de la CML se diferencian ordenadamente. Por tanto, la mayor parte de la masa leucémica en la CML consiste en células sanguíneas diferenciadas, mientras que las células raras responsables del mantenimiento de la enfermedad se asemejan a las células madre hematopoyéticas normales. De manera similar, en el mieloma múltiple, que se caracteriza por células plasmáticas neoplásicas, estas células parecen diferenciarse terminalmente como sus contrapartes normales. Las células plasmáticas de mieloma que forman la mayor parte del tumor surgen de una población de células madre cancerosas menos diferenciadas que se asemejan a las células centrales post-germinales. Se ha demostrado que otros cánceres, que incluyen, pero no se limitan a, neoplasias malignas hematológicas, síndrome mielodisplásico, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de ovario, melanoma, cánceres de piel no melanoma y cánceres de cerebro, surgen de las células madre cancerosas correspondientes.

Por tanto, un aspecto no reivindicado se refiere a métodos para tratar el cáncer con agentes que pueden dirigirse a las células madre cancerosas en el nicho de la médula ósea protegida mediante la inducción de la diferenciación de las células madre cancerosas en células cancerosas maduras que son susceptibles a las terapias estándar. La administración de agonistas selectivos de RARa resistentes a CYP26 que pueden actuar sobre las células madre cancerosas en el nicho de la médula ósea (porque no son inactivadas por CYP26) es uno de tales enfoques. En determinados aspectos no reivindicados, la eficacia de la terapia con un agonista selectivo de RARa descrito en la presente descripción provoca a una disminución sustancial del número de células madre cancerosas en la médula ósea.

Las células madre cancerosas se pueden enumerar mediante diversos mecanismos y se puede medir la reducción de su número como resultado de la administración de un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26. En aspectos no reivindicados, descritos en la presente descripción, como resultado de la administración de un agonista selectivo de RARa, las células madre cancerosas en la médula ósea se reducen en más de aproximadamente 0,5 log, más de aproximadamente 1 log, más de aproximadamente 1,5 log, más de aproximadamente 2,0 log, más de aproximadamente 2,5 log, más de aproximadamente 3,0 log, más de aproximadamente 3,5 log, más de aproximadamente 4,0 log, más de aproximadamente 4,5 log o más de aproximadamente 5,0 log.

Los compuestos con actividad retinoide (vitamina A y sus derivados) tienen actividad en los procesos de proliferación y diferenciación celular. Muchos efectos biológicos de los retinoides están mediados por la modulación de los receptores nucleares del ácido retinoico (RAR). Los RAR activan la transcripción mediante la unión a elementos de la secuencia de ADN, conocidos como elementos de respuesta RAR (RARE), en forma de un heterodímero con uno de los receptores X de retinoides (conocidos como RXR). Se han identificado y descrito tres subtipos de RAR humanos: RARa, RARp y RAR^y.

Como se usa en la presente descripción, el término "agonista de RARa" es sinónimo de "agonista selectivo de RARa" y se refiere a un compuesto que se une selectivamente a RARa. Como se usa en la presente descripción, el término "se une selectivamente", cuando se hace en referencia a un agonista selectivo de RARa, se refiere a la unión discriminatoria de un agonista selectivo de RARa al RARa diana indicado, de modo que el agonista selectivo de RARa no se une sustancialmente a receptores no diana como un RARp o un RARy.

La unión selectiva de un agonista selectivo de RARa a un RARa incluye propiedades de unión tales como, por ejemplo, afinidad de unión y especificidad de unión. La afinidad de unión se refiere al período de tiempo que un agonista selectivo de RARa reside en su sitio de unión a RARa, y puede verse como la fuerza con la que un agonista selectivo de RARa se une a su RARa. La especificidad de unión es la capacidad de un agonista selectivo de RARa para discriminar entre un RARa y un receptor que no contiene su sitio de unión, tal como, por ejemplo, un RARp o un RARy. Una forma de medir la especificidad de unión es comparar la velocidad de asociación de un agonista selectivo de RARa para su RARa relativo a la velocidad de asociación de un agonista de RARa para un receptor que no contiene su sitio de unión; por ejemplo, al comparar la constante de velocidad de asociación de un agonista selectivo de RARa para su RARa relativo a un RARp y/o un RAR^y.

En algunos aspectos no reivindicados, un agonista selectivo de RARa tendrá una relación de actividad en un RARa relativo a un RARp y/o un RAR^y de, por ejemplo, al menos 5 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 15 veces mayor, al menos 20 veces mayor o al menos 10000 veces mayor. Un agonista pan de RAR tendrá actividad en un RARa, un RARp y un RAR^y, es decir, una potencia similar en un RARa, un RARp y un RAR^y.

La especificidad de unión de un agonista selectivo de RARa que se une selectivamente a un RARa también se puede caracterizar como una relación de actividad que tal agonista selectivo de RARa puede ejercer a través de la unión a su RARa relativo a un receptor que no comprende su sitio de unión, tal como, por ejemplo, un RARp o un RAR^y. En algunos aspectos no reivindicados, un agonista selectivo de RARa que se une selectivamente a un RARa tiene una relación de actividad a través de su RARa relativo a un receptor que no comprende su sitio de unión de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 64:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1 o al menos 40:1. En algunos aspectos no reivindicados, un agonista selectivo de RARa que se une selectivamente a un RARa tiene una relación de actividad a través de su RARa relativo a un RARp y/o un RARy de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 64:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1 o al menos 40:1. En algunos aspectos no reivindicados, un agonista selectivo de RARa que se une selectivamente a un RARa tiene una relación de actividad a través de su RARa relativo a un receptor que no comprende su sitio de unión de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, al menos al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1 o al menos 40:1. En algunos aspectos no reivindicados, un agonista selectivo de RARa que se une selectivamente a un RARa tiene una relación de actividad a través de su RARa relativo a un RARp y/o un RARy de, por ejemplo, al menos 2:1, al menos 3:1, en al menos 4:1, al menos 5:1, al menos 6:1, al menos 7:1, al menos 8:1, al menos 9:1, al menos 10:1, al menos 15:1, al menos 20:1, al menos 25:1, al menos 30:1, al menos 35:1 o al menos 40:1.

Los agonistas selectivos de RARa útiles en los métodos descritos en la presente descripción son agonistas selectivos de RARa que no son metabolizados por CYP26. CYP26 es una monooxigenasa del citocromo P450 que metaboliza el ácido retinoico en sustancias inactivas o menos activas que también se pueden eliminar fácilmente de las células y regula los niveles celulares de ácido retinoico. Los agonistas selectivos de RARa que son fácilmente metabolizados por CYP26 no están dentro del alcance de los presentes métodos.

En un aspecto no reivindicado, un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es un compuesto que tiene la estructura de la fórmula I,

en donde R1 es H o alquilo C1-6;

R2 y R3 son independientemente H o F; y

R4 es un halógeno.

En algunos aspectos no reivindicados, de la fórmula I, el halógeno es F, Cl, Br o I. En algunos aspectos no reivindicados, de la fórmula I, el halógeno es F. En algunos aspectos no reivindicados, de la fórmula I, el halógeno es Cl. En algunos aspectos no reivindicados, de la fórmula I, el halógeno es Br. En algunos aspectos no reivindicados, de la fórmula I, el halógeno es I.

En aspectos no reivindicados, un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es un compuesto que tiene una estructura de fórmula II

en donde R1 es H o alquilo Ci-6.

En la presente invención, el agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es el compuesto que tiene la estructura de la fórmula III

En otro aspecto no reivindicado, un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es tamibaroteno (AM80; ácido 4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) carbamoil]benzoico). En otro aspecto no reivindicado, un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es AM580 (ácido 4-[(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil) carboxamido]benzoico). En otro aspecto no reivindicado, un agonista selectivo de RARa resistente a CYP26 es Re 80 (ácido 4-[1-hidroxi-3-oxo-3-(5,6,7,8-tetrahidro-3-hidroxi-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]benzoico).

Como se usa en la presente descripción, el término "resistente a CYP26" se refiere a agonistas selectivos de RARa que no son metabolizados, degradados o inactivados de otra manera por la enzima CYP26 y tienen actividad dentro de la médula ósea.

Los ensayos mediante los cuales se puede probar un compuesto y establecer si es o no un agonista selectivo de RARa se describen en numerosas publicaciones y patentes de la técnica anterior. Por ejemplo, un ensayo de transactivación de receptor quimérico que prueba la actividad de tipo agonista en los subtipos de receptores RARa, RARp, RAR^y, RXRa, se describe en detalle en la Patente de Estados Unidos 5,455,265.

Los compuestos y composiciones farmacéuticas descritos en la presente descripción son particularmente útiles para el tratamiento del cáncer. Como se usa en la presente descripción, el término "cáncer" se refiere a un trastorno celular caracterizado por proliferación celular descontrolada o desregulada, diferenciación celular disminuida, capacidad inapropiada para invadir el tejido circundante y/o capacidad para establecer un nuevo crecimiento en sitios ectópicos. El término "cáncer" incluye, pero no se limita a, tumores sólidos y tumores hematológicos. El término "cáncer" abarca enfermedades de la piel, tejidos, órganos, huesos, cartílagos, sangre y vasos. El término "cáncer" abarca además cánceres primarios y metastásicos. Dentro del término "cáncer" se incluyen las células madre cancerosas.

En determinados aspectos no reivindicados, el cáncer es una neoplasia maligna hematológica. Los ejemplos no limitantes de neoplasia maligna hematológica incluyen leucemia mieloide aguda (AML), leucemia mielógena crónica (CML), incluida CML acelerada y fase blástica de CML (CML-BP), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL), enfermedad de Hodgkin (HD), linfoma no Hodgkin (NHL), incluidos linfoma folicular y linfoma de células del manto, linfoma de células B, linfoma de células T, mieloma múltiple (MM), macroglobulinemia de Waldenstrom, síndromes mielodisplásicos (MDS), incluidos anemia refractaria (RA), anemia refractaria con sideroblastos anillados (RARS), (anemia refractaria con exceso de blastos (RAEB) y RAEB en transformación (RAEB-T) y síndromes mieloproliferativos. En determinados aspectos no reivindicados, cuando el cáncer es una neoplasia maligna hematológica, el agonista selectivo de RARa podría administrarse como una terapia independiente en ausencia de otros tratamientos anticancerígenos o en combinación con otras terapias, que incluyen, pero no se limitan a, las que se enumeran a continuación en la Tabla 1.

En algunos aspectos no reivindicados, el cáncer es un tumor sólido. En otros aspectos no reivindicados, el cáncer es un tumor sólido que puede hacer metástasis al hueso. Los ejemplos no limitantes de tumores sólidos que pueden tratarse mediante los métodos descritos incluyen cáncer de páncreas; cáncer de vejiga; cáncer colorrectal; cáncer de mama, que incluye cáncer de mama metastásico; cáncer de próstata, que incluye el cáncer de próstata dependiente de andrógenos e independiente de andrógenos; cáncer renal, que incluye, por ejemplo, carcinoma de células renales metastásico; cáncer hepatocelular; cáncer de pulmón, que incluye, por ejemplo, cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), carcinoma bronquioloalveolar (BAC) y adenocarcinoma de pulmón; cáncer de ovario, que incluye, por ejemplo, cáncer peritoneal primario o epitelial progresivo; cáncer de cuello uterino; cáncer gástrico; cáncer de esófago; cáncer de cabeza y cuello, que incluye, por ejemplo, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; melanoma; cáncer neuroendocrino, que incluye tumores neuroendocrinos metastásicos; tumores cerebrales, que incluyen, por ejemplo, glioma, oligodendroglioma anaplásico, glioblastoma multiforme del adulto y astrocitoma anaplásico del adulto; cáncer de hueso; y sarcoma de tejidos blandos. En determinados aspectos no reivindicados, cuando el cáncer es un tumor sólido, el agonista selectivo de RARa se usa en combinación con un agente citotóxico u otro agente anticancerígeno.

Un compuesto descrito en la presente descripción, o una composición que comprende tal compuesto, generalmente se administra a un individuo como una composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante la combinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un compuesto como se describe en la presente descripción, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo, como un ingrediente activo, con excipientes farmacéuticos convencionales aceptables y mediante la preparación de formas de dosificación unitarias adecuadas para uso terapéutico. Como se usa en la presente descripción, el término "composición farmacéutica" y se refiere a una concentración terapéuticamente eficaz de un compuesto activo, tal como, por ejemplo, cualquiera de los compuestos descritos en la presente descripción. Preferiblemente, la composición farmacéutica no produce una reacción adversa, alérgica u otra reacción no conveniente o no deseada cuando se administra a un individuo. Una composición farmacéutica descrita en la presente descripción es útil para aplicaciones médicas y veterinarias. Se puede administrar una composición farmacéutica a un individuo sola o en combinación con otros compuestos activos, agentes, fármacos u hormonas suplementarios. Las composiciones farmacéuticas se pueden fabricar mediante el uso de cualquiera de una variedad de procesos, que incluyen, sin limitación, mezcla, disolución, granulación, preparación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento y liofilización convencionales. La composición farmacéutica puede tomar cualquiera de una variedad de formas que incluyen, sin limitación, una solución, suspensión, emulsión, liofilizado, tableta, píldora, gránulo, cápsula, polvo, jarabe, elixires estériles o cualquier otra forma de dosificación adecuada para la administración.

Las formas de dosificación líquidas adecuadas para inyección parenteral pueden comprender soluciones, dispersiones, suspensiones o emulsiones acuosas o no acuosas estériles fisiológicamente aceptables y polvos estériles para la reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. Los ejemplos de portadores, diluyentes, disolventes o vehículos acuosos y no acuosos adecuados incluyen agua, etanol, polioles (propilenglicol, polietilenglicol (PEG), glicerol y similares), mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales (tales como aceite de oliva) y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos. En formulaciones líquidas, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto descrito en la presente descripción típicamente está entre aproximadamente de 0,0001 % (p/v) a aproximadamente 50 % (p/v), aproximadamente de 0,001 % (p/v) a aproximadamente 10,0 % (p/v), o aproximadamente de 0,01 % (p/v) a aproximadamente 1,0 % (p/v).

Las formas de dosificación sólidas adecuadas para la administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo puede mezclarse con al menos un excipiente (o portador) inerte habitual tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico o (a) rellenos o extensores, como por ejemplo almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico, (b) aglutinantes, como por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga, (c) humectantes, como por ejemplo, glicerol, (d) agentes desintegrantes, como por ejemplo, agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, determinados silicatos complejos y carbonato de sodio, (e) retardadores de solución, como por ejemplo, parafina, (f) aceleradores de la absorción, como por ejemplo, compuestos de amonio cuaternarios, (g) agentes humectantes, como por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol, (h) adsorbentes, como por ejemplo, caolín y bentonita, y (i) lubricantes, como por ejemplo, talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio o mezclas de los mismos. En el caso de cápsulas, tabletas y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes.

Una composición farmacéutica descrita en la presente descripción puede incluir opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable que facilita el procesamiento de un compuesto activo en composiciones farmacéuticamente aceptables. Como se usa en la presente descripción, el término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del juicio médico sólido, son adecuados para el contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin una toxicidad, irritación, respuesta alérgica excesivas u otras complicaciones problemáticas acordes con una relación beneficio/riesgo razonable. Como se usa en la presente descripción, el término "portador farmacológicamente aceptable" es sinónimo de " portador farmacológico" y se refiere a cualquier portador que sustancialmente no tiene un efecto perjudicial permanente o a largo plazo cuando se administra y abarca términos tales como "vehículo, estabilizador, diluyente, aditivo, auxiliar o excipiente farmacológicamente aceptable." Generalmente, tal portador se mezcla con un compuesto activo o se permite que diluya o encierre el compuesto activo y puede ser un agente sólido, semisólido o líquido. Se entiende que los compuestos activos pueden ser solubles o pueden administrarse como una suspensión en el portador o diluyente deseado. Puede usarse cualquiera de una variedad de portadores farmacéuticamente aceptables que incluyen, sin limitación, medios acuosos tales como, por ejemplo, agua, solución salina, glicina, ácido hialurónico y similares; portadores sólidos tales como, por ejemplo, almidón, estearato de magnesio, manitol, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, lactosa, trehalosa, carbonato de magnesio y similares; disolventes; medios de dispersión; revestimientos; agentes antibacterianos y antifúngicos; agentes isotónicos y retardadores de la absorción; o cualquier otro ingrediente inactivo. La selección de un portador farmacológicamente aceptable puede depender del modo de administración. Excepto en la medida en que cualquier portador farmacológicamente aceptable sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en composiciones farmacéuticamente aceptables. Se pueden encontrar ejemplos no limitantes de usos específicos de tales portadores farmacéuticos en los documentos Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel y otros, eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7a ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20a ed. 2000); Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman y otros, eds., McGraw-Hill Professional, 10a ed. 2001); y Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe y otros, Publicaciones APhA, 4a edición 2003). Estos protocolos son rutinarios y cualquier modificación está dentro del alcance de un experto en la técnica y de la enseñanza en la presente descripción.

Una composición farmacéutica descrita en la presente descripción puede incluir opcionalmente, sin limitación, otros componentes farmacéuticamente aceptables (o componentes farmacéuticos), que incluyen, sin limitación, tampones, conservantes, ajustadores de la tonicidad, sales, antioxidantes, agentes para ajustar la osmolalidad, sustancias fisiológicas, sustancias farmacológicas, agentes de carga, agentes emulsionantes, agentes humectantes, agentes edulcorantes o saborizantes y similares. Se pueden usar varios tampones y medios para ajustar el pH para preparar una composición farmacéutica descrita en la presente descripción, siempre que la preparación resultante sea farmacéuticamente aceptable. Tales tampones incluyen, sin limitación, tampones de acetato, tampones de borato, tampones de citrato, tampones de fosfato, solución salina tamponada neutra y solución salina tamponada con fosfato. Se entiende que se pueden usar ácidos o bases para ajustar el pH de una composición según sea necesario. Los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, metabisulfito de sodio, tiosulfato de sodio, acetilcisteína, hidroxianisol butilado e hidroxitolueno butilado. Los conservantes útiles incluyen, sin limitación, cloruro de benzalconio, clorobutanol, timerosal, acetato fenilmercúrico, nitrato fenilmercúrico, una composición de oxicloro estabilizada, tal como, por ejemplo, clorito de sodio y quelantes, tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida, DTPA de calcio, y CaNaDTPA-bisamida. Los ajustadores de la tonicidad útiles en una composición farmacéutica incluyen, sin limitación, sales tales como, por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de potasio, manitol o glicerina y otros ajustadores de la tonicidad farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica se puede proporcionar como una sal y se puede formar con muchos ácidos, que incluyen, pero no se limitan a, clorhídrico, sulfúrico, acético, láctico, tartárico, málico, succínico, etc. Las sales tienden a ser más solubles en disolventes acuosos u otros protónicos que las correspondientes formas de base libres. Se entiende que estas y otras sustancias conocidas en la técnica de la farmacología pueden incluirse en una composición farmacéutica útil en los métodos reivindicados.

"Administrar", como se usa en la presente descripción, se refiere a proporcionar un agente o composición farmacéutica a un sujeto, e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional médico y la autoadministración. La administración incluye, pero no se limita a, administración oral, administración nasal, administración pulmonar, administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intratumoral, administración intracavitaria, administración intravítrea, administración dérmica y administración transdérmica, etc.

En dependencia del tipo de cáncer y del paciente a tratar, así como de la vía de administración, los agonistas selectivos de RARa descritos pueden administrarse en dosis terapéuticamente eficaces variables a un paciente que lo necesite.

Sin embargo, la dosis administrada a un mamífero, en particular a un ser humano, en el contexto de los presentes métodos, debería ser suficiente para producir una respuesta terapéutica en el mamífero durante un período de tiempo razonable. Un experto en la técnica reconocerá que la selección de la dosis y composición exactas y el régimen de administración más apropiado también se verán influidos por, entre otras cosas, las propiedades farmacológicas de la formulación, la naturaleza y gravedad de la afección tratada, y la condición física y agudeza mental del receptor, así como la potencia del compuesto específico, la edad, el estado, el peso corporal, el sexo y la respuesta del paciente a tratar, y la etapa/gravedad de la enfermedad.

Como un ejemplo no limitante, cuando se administra un agonista selectivo de RARa descrito en la presente descripción a un mamífero, una cantidad terapéuticamente eficaz generalmente puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 mg/m2/día a aproximadamente 100 mg/m2/día. En algunas modalidades, una cantidad eficaz de un agonista selectivo de RARa descrito en la presente descripción puede ser de aproximadamente 5 mg/m2/día a aproximadamente 90 mg/m2/día, de aproximadamente 10 mg/m2/día a aproximadamente 80 mg/m2/día, de aproximadamente 15 mg/m2/día a aproximadamente 70 mg/m2/día, de aproximadamente 20 mg/m2/día a aproximadamente 65 mg/m2/día, de aproximadamente 25 mg/m2/día a aproximadamente 60 mg/m2/día, o de aproximadamente 30 mg/m2/día a aproximadamente 55 mg/m2/día. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o una composición descrita en la presente descripción puede ser de al menos 10 mg/m2/día, al menos 15 mg/m2/día, al menos 20 mg/m2/día, al menos 25 mg/m2/día, al menos 30 mg/m2/día, al menos 35 mg/m2/día, al menos 40 mg/m2/día, al menos 45 mg/m2/día, al menos 50 mg/m2/día, al menos 55 mg/m2/día, al menos 60 mg/m2/día, al menos 65 mg/m2/día o al menos 75 mg/m2/día. En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente eficaz de un agonista selectivo de RARa descrito en la presente descripción puede ser como máximo 15 mg/m2/día, como máximo 20 mg/m2/día, como máximo 25 mg/m2/día, como máximo 30 mg/m2/día, como máximo 35 mg/m2/día, como máximo 40 mg/m2/día, como máximo 45 mg/m2/día, como máximo 50 mg/m2/día, como máximo 55 mg/m2/día, como máximo 60 mg/m2/día, como máximo 65 mg/m2/día, como máximo 70 mg/m2/día, como máximo 80 mg/m2/día, como máximo 90 mg/m2/día o como máximo 100 mg/m2/día.

La administración puede ser continua o intermitente. La dosis también puede determinarse por el tiempo y la frecuencia de administración. Por lo tanto, los agonistas selectivos de RARa descritos en la presente descripción se pueden administrar de forma diaria, semanal o mensual durante un período de tiempo, seguido de un período de descanso del fármaco opcional (período libre de fármaco) y que este ciclo de administración del fármaco/descanso del fármaco se puede repetir como sea necesario.

En determinadas modalidades, el agonista selectivo de RARa se administra en combinación con uno o más agentes anticancerígenos adicionales. Los agentes anticancerígenos incluyen fármacos citotóxicos, que incluyen, pero no se limitan a, paclitaxel, docetaxel y similares y mezclas de los mismos. Los agentes anticancerígenos adicionales incluyen adriamicina, dactinomicina, bleomicina, vinblastina, cisplatino, acivicina, aclarubicina, clorhidrato de acodazol, acronina, adozelesina, aldesleucina, altretamina, ambomicina, acetato de ametantrona, aminoglutetimida, amsacrina, anastrozol, antramicina, asparaginasa, asperlina, azacitidina, azetepa, azotomicina, batimastat, benzodepa, bicalutamida, clorhidrato de bisantreno, dimesilato de bisnafida, bizelesina, sulfato de bleomicina, brequinar sódico, bropirimina, busulfán, cactinomicina, calusterona, caracemida, carbetímero, carboplatino, carmustina, clorhidrato de carubicina, carzelesina, cedefmgol, clorambucil, cirolemicina, cladribina, mesilato de crisnatol, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, clorhidrato de daunorrubicina, decitabina, dexormaplatino, dezaguanina, mesilato de dezaguanina, diaziquona, doxorrubicina, clorhidrato de doxorrubicina, droloxifeno, citrato de droloxifeno, propionato de dromostanolona, duazomicina, edatrexato, clorhidrato de eflornitina, elsamitrucina, enloplatino, enpromato, epipropidina, clorhidrato de epirubicina, erbulozol, clorhidrato de esorrubicina, estramustina, fosfato de estramustina sódico, etanidazol, etopósido, fosfato de etopósido, etoprina, clorhidrato de fadrozol, fazarabina, fenretinida, floxuridina, fosfato de fludarabina, fluorouracil, flurocitabina, fosquidona, fostriecina sódica, gemcitabina, clorhidrato de gemcitabina, hidroxiurea, clorhidrato de idarrubicina, ifosfamida, ilmofosina, interleucina 2, interferón alfa-2a, interferón alfa-2b, interferón alfa-nl, interferón alfa-n3, interferón beta-la, interferón gamma-Ib, iproplatino, clorhidrato de irinotecán, acetato de lanreotida, letrozol, acetato de leuprolida, clorhidrato de liarozol, lometrexol sódico, lomustina, clorhidrato de losoxantrona, masoprocol, maytansina, clorhidrato de mecloretamina, acetato de megestrol, acetato de melengestrol, melfalán, menogaril, mercaptopurina, metotrexato, metotrexato sódico, metoprina, meturedepa, mitindomida, mitocarcina, mitocromina, mitogilina, mitomalcina, mitomicina, mitosper, mitotano, clorhidrato de mitoxantrona, ácido micofenólico, nocodazol, nogalamicina, ormaplatino, oxisurano, pegaspargasa, peliomicina, pentamustina, sulfato de peplomicina, perfosfamida, pipobromano, piposulfán, clorhidrato de piroxantrona, plicamicina, plomestano, porfimer sódico, porfiromicina, prednimustina, clorhidrato de procarbazina, puromicina, clorhidrato de puromicina, pirazofurina, riboprina, rogletimida, safingol, clorhidrato de safingol, semustina, simtrazeno, esparfosato sódico, esparsomicina, clorhidrato de espirogermanio, espiromustina, espiroplatino, estreptonigrina, estreptozocina, sulofenur, talisomicina, tecogalan sódico, tegafur, clorhidrato de teloxantrona, temoporfina, tenipósido, teroxirona, testolactona, tiamiprina, tioguanina, tiotepa, tiazofurina, tirapazamina, citrato de toremifeno, acetato de trestolona, fosfato de triciribina, trimetrexato, glucuronato de trimetrexato, triptorelina, clorhidrato de tubulozol, uracilo mustard, uredepa, vapreotida, verteporfina, sulfato de vinblastina, sulfato de vincristina, vindesina, sulfato de vindesina, sulfato de vinepidina, sulfato de vinglicinato, sulfato de vinleurosina, tartrato de vinorelbina, sulfato de vinrosidina, sulfato de vinzolidina, vorozol, zeniplatino, zinostatina y clorhidrato de zorrubicina.

En algunas modalidades, el agente anticancerígeno incluye, pero no se limita a: 5-fluorouracilo, 20-epi-I, 25 dihidroxivitamina D3, 5-etiniluracilo, abiraterona, aclarubicina, acilfulveno, adecipenol, adozelesina, aldesleucina, antagonistas de ALL-TK, altretamina, ambamustina, amidox, amifostina, ácido aminolevulínico, amrubicina, amsacrina, anagrelida, anastrozol, andrografólida, inhibidores de la angiogénesis, antagonista D, antagonista G, antarelix, proteína morfogenética anti-dorsalizante-1, antiandrógeno, carcinoma prostático, antiestrógeno, antineoplaston, oligonucleótidos antisentido, glicinato de afidicolina, moduladores de genes de la apoptosis, reguladores de la apoptosis, ácido apurínico, ara-CDP-DL-PTBA, arginina desaminasa, asulacrina, atamestano, atrimustina, axinastatina 1, axinastatina 2, axinastatina 3, azasetrona, azatoxina, azatirosina, derivados de baccatina III, balanol, batimastat, antagonistas de BCR/ABL, benzoclorinas, benzoilstaurosporina, derivados de betalactámicos, beta-aletina, betaclamicina B, ácido betulínico, inhibidor de bFGF, bicalutamida, bisantreno, bisaziridinilespermina, bisnafida, bistrateno A, bizelesina, breflato, bropirimina, budotitano, butionina sulfoximina, calcipotriol, calfostina C, derivados de camptotecina, capecitabina, carboxamida-amino-triazol, carboxiamidotriazol, CaRest M3, CARN 700, inhibidor derivado del cartilago, carzelesina, inhibidores de la caseína cinasa (ICOS), castanospermina, cecropina B, cetrorelix, clorinas, cloroquinoxalina sulfonamida, cicaprost, cis-porfirina, cladribina, análogos de clomifeno, clotrimazol, collismicina A, colismicina B, combretastatina A4, análogos de combretastatina, conagenina, crambescidina 816, crisnatol, criptoficina 8, derivados de criptoficina A, curacina A, ciclopentantraquinonas, cicloplatam, cipemicina, ocfosfato de citarabina, factor citolítico, citostatina, dacliximab, decitabina, dehidrodidemnina B, deslorelina, dexametasona, dexifosfamida, dexrazoxano, dexverapamil, diaziquona, didemnina B, didox, dietilnorespermina, dlhidro-5-azacitidina, 9-dioxamicina, difenil espiromustina, docosanol, dolasetrón, doxifturidina, droloxifeno, dronabinol, duocarmicina SA, ebselen, ecomustina, edelfosina, edrecolomab, eflornitina, elemene, emitefur, epirubicina, epristerida, análogo de estramustina, agonistas de estrógeno, antagonistas de estrógeno, etanidazol, fosfato de etopósido, exemestano, fadrozol, fazarabina, fenretinida, filgrastim, finasterida, flavopiridol, flezelastina, fluasterona, fludarabina, clorhidrato de fluorodaunorunicina, forfenimex, formestano, fostriecina, fotemustina, gadolinio texafirina, nitrato de galio, galocitabina, ganirelix, inhibidores de la gelatinasa, gemcitabina, inhibidores del glutatión, hepsulfam, heregulina, hexametileno bisacetamida, hipericina, ácido ibandrónico, idarrubicina, idoxifeno, idramantona, ilmofosina, ilomastat, imidazoacridonas, imiquimod, péptidos inmunoestimulantes, inhibidor del receptor del factor de crecimiento 1 similar a la insulina, agonistas del interferón, interferones, interleucinas, iobenguano, yododoxorubicina, ipomeanol, iroplact, irsogladina, isobengazol, isohomohalicondrina B, itasetron, jasplakinolida, kahalalida F, lamelarina-N triacetato, lanreotida, leinamicina, lenograstim, sulfato de lentinán, leptolstatina, letrozol, factor inhibidor de la leucemia, alfa interferón de leucocitos, leucovorina, leuprolida+estrógeno+progesterona, leuprorelina, levamisol, liarozol, análogo lineal de poliamina, péptido de disacárido lipófilo, compuestos de platino lipófilo, lissoclinamida 7, lobaplatino, lombricina, lometrexol, lonidamina, losoxantrona, lovastatina, loxoribina, lurtotecán, texafirina de lutecio, lisofilina, péptidos líticos, maitansina, mannostatina A, marimastat, masoprocol, maspina, inhibidores de matrilisina, inhibidores de metaloproteinasa de matriz, menogaril, merbarona, meterelina, metioninasa, metoclopramida, inhibidor de MIF, mifepristona, miltefosina, mirimostim, ARN bicatenario no adaptado, mitoguazona, mitolactol, análogos de mitomicina, mitonafido, factor de crecimiento de fibroblastos mitotoxínicos-saporina, mitoxantrona, mofaroteno, molgramostim, gonadotropina coriónica humana, monofosforil lípido A pared celular de miobacteria sk, mopidamol, inhibidor de genes de resistencia a múltiples fármacos, terapia basada en el supresor de tumores múltiples 1, agente anticancerígeno mostaza, micaperóxido B, extracto de pared celular de micobacterias, miriaporona, N-acetildinalina, benzamidas N-sustituidas, nafarelina, nagrestip, naloxona pentazocina, napavina, nafterpina, nartograstim, nedaplatino, nemorubicina, ácido neridrónico, endopeptidasa neutra, nilutamida, nisamicina, moduladores del óxido nítrico, nitróxido antioxidante, nitrulina, O6-bencilguanina, octreotido, okicenona, oligonucleótidos, onapristona, ondansetron, oracina, inductor de citocina oral, ormaplatino, osaterona, oxaliplatino, oxaunomicina, palauamina, palmitoilrhizoxina, ácido pamidrónico, panaxitriol, panomifeno, parabactina, pazeliptina, pegaspargasa, peldesina, polisulfato de pentosano sódico, pentostatina, pentrozol, perflubrona, perfosfamida, alcohol perililo, fenazinomicina, fenilacetato, inhibidores de la fosfatasa, picibanil, clorhidrato de pilocarpina, pirarrubicina, piritrexim, placetina A, placetina B, inhibidor del activador del plasminógeno, complejo de platino, compuestos de platino, complejo de platino-triamina, porfímero sódico, porfiromicina, prednisona, propil bis-acridona, prostaglandina J2, inhibidores del proteasoma, inmunomodulador basado en proteína A, inhibidor de la proteína cinasa C, microalgas, inhibidores de la proteína tirosina fosfatasa, inhibidores de la purina nucleósido fosforilasa, purpurinas, pirazoloacridina, conjugado de polioxietileno de hemoglobina piridoxilada, antagonistas de raf, raltitrexed, ramosetrón, inhibidores de la proteína transferasa ras farnesil, inhibidores de ras, inhibidor de ras-GAP, retelliptina demetilada, rhenium Re 186 etidronato, rhizoxina, ribozimas, RII retinamida, rogletimida, rohitucina, romurtida, roquinimex, rubiginona BI, ruboxil, safmgol, saintopina, SarCNU, sarcofitol A, sargramostim, miméticos de Sdi 1, semustina, inhibidor del derivado de la senescencia 1, oligonucleótidos sentido, inhibidores de la transducción de señales, moduladores de la transducción de señales, proteína monocatenaria de unión a antígenos, sizofirán, sobuzoxano, borocaptato de sodio, fenilacetato de sodio, solverol, proteína de unión a somatomedina, sonermina, ácido esparfósico, espicamicina D, espiromustina, esplenopentina, espongistatina 1, escualamina, inhibidor de células madre, inhibidores de la división de células madre, estipiamida, inhibidores de estromelisina, sulfinosina, antagonista del péptido intestinal vasoactivo superactivo, suradista, suramina, swainsonina, glucosaminoglicanos sintéticos, talimustina, metyoduro de tamoxifeno, tauromustina, tazaroteno, tecogalán sódico, tegafur, telurapirilio, inhibidores de la telomerasa, temoporfina, temozolomida, tenipósido, tetraclorodecaóxido, tetrazomina, thaliblastina, tiocoralina, trombopoyetina, mimético de la trombopoyetina, timalfasina, agonista del receptor de timopoyetina, timotrinano, hormona estimulante de la tiroides, etil etiopurpurina de estaño, tirapazamina, bicloruro de titanoceno, topsentina, toremifeno, factor de células madre totipotente, inhibidores de la traducción, tretinoína, triacetiluridina, triciribino, trimetrexato, triptorelina, tropisetron, turosterida, inhibidores de tirosina cinasa, tirfostinas, inhibidores de UBC, ubenimex, factor inhibidor del crecimiento derivado del seno urogenital, antagonistas del receptor de urocinasa, vapreotida, variolina B, sistema de vectores, terapia génica de eritrocitos, velaresol, veramina, verdinas, verteporfina, vinorelbina, vinxaltina, vitaxina, vorozol, zanoterona, zeniplatino, zilascorb y zinostatina stimalamer.

En algunas modalidades, el agente anticancerígeno es uno o más de una antraciclina (por ejemplo, doxorrubicina o epirrubicina), ciclofosfamida, un agente de platino (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino), un taxano (por ejemplo, paclitaxel o docetaxel), metotrexato, 5-fluorouracilo, trastuxumab, pertuzumab, vinorelbina, capecitabina, gemcitabina, mitoxantrona, ixabepilona, reibulina, una terapia anti-hormonal (por ejemplo, tamoxifeno, anastrazol, exemestrano, letrozol), etopósido, irinotecán, vinblastina, pemetrexed, bevacizumab, cetuximab, un inhibidor de EGFR (por ejemplo, erlotinib), un inhibidor de la cinasa EML4-ALK (por ejemplo, crixotinil), estramustina, citarabina, un agente desmetilante (por ejemplo, 5-azacitidina, decitabina), un inmunomodulador (por ejemplo, lenolidamida, pomalidomida), un corticosteroide, bleomicina, adriamicina, benamustina, fludarabina, un factor de crecimiento (G-CFS, GM-CSF, EPO).

Las combinaciones específicas de agonistas selectivos de RARa y agentes anticancerígenos adicionales útiles en el tratamiento del cáncer se enumeran a continuación en la Tabla 1. Las combinaciones de fármacos enumeradas se pueden administrar al mismo tiempo, en diferentes tiempos, en la misma composición, en diferentes composiciones, en tiempos alternos (1 semana de agonista selectivo de RARa seguida de 1 semana de otro agente anticancerígeno, etc.), o en cualquier esquema de administración establecido por un profesional de la salud.

Tabla 1

La eficacia de la terapia contra el cáncer se mide típicamente en términos de "respuesta". Las técnicas para monitorear las respuestas pueden ser similares a las pruebas usadas para diagnosticar el cáncer, tales como, pero que no se limitan a:

• Un bulto o tumor que afecta algunos ganglios linfáticos se puede palpar y medir externamente mediante un examen físico.

• Algunos tumores de cáncer internos aparecerán en una radiografía o una tomografía computarizada y se pueden medir con una regla.

• Se pueden realizar análisis de sangre, incluidos los que miden la función de los órganos.

• Se puede realizar una prueba de marcadores tumorales para determinados cánceres.

Independientemente de la prueba usada, ya sea análisis de sangre, recuento de células o prueba de marcadores tumorales, se repite a intervalos específicos para que los resultados se puedan comparar con pruebas anteriores del mismo tipo.

La respuesta al tratamiento del cáncer se define de varias formas:

Respuesta completa: todo el cáncer o tumor desaparece; no hay evidencia de la enfermedad. Un marcador tumoral (si corresponde) puede estar dentro del intervalo normal.

• Respuesta parcial: el cáncer se ha reducido en un porcentaje, pero la enfermedad persiste. Es posible que haya caído un marcador tumoral (si corresponde), pero persiste la evidencia de la enfermedad.

• Enfermedad estable: el cáncer no ha crecido ni se ha reducido; la cantidad de la enfermedad no ha cambiado. Un marcador tumoral (si corresponde) no ha cambiado significativamente.

• Progresión de la enfermedad: el cáncer ha crecido; hay más enfermedad ahora que antes del tratamiento. Una prueba de marcador tumoral (si corresponde) muestra que ha aumentado un marcador tumoral.

Hay dos métodos estándar para la evaluación de la respuesta al tratamiento del cáncer sólido con respecto al tamaño del tumor (carga tumoral), los estándares de la OMS y RECIST. Estos métodos miden un tumor sólido para comparar un tumor actual con mediciones pasadas o para comparar cambios con mediciones futuras y realizar cambios en un régimen de tratamiento. En el método de la OMS, se miden los ejes largo y corto del tumor sólido y a continuación se calcula el producto de estas dos mediciones; si hay múltiples tumores sólidos, se calcula la suma de todos los productos. En el método RECIST, solo se mide el eje largo. Si hay múltiples tumores sólidos, se calcula la suma de todas las medidas de los ejes largos. Sin embargo, con los ganglios linfáticos, se mide el eje corto en lugar del eje largo.

En algunas modalidades del método actual, la carga tumoral de un paciente tratado se reduce en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 % aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 100 % o cualquier otro intervalo limitado por estos valores.

En otras modalidades, la tasa de supervivencia a 1 año del individuo ser tratado aumenta en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 % aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 100 % o cualquier otro intervalo limitado por estos valores.

En otras modalidades, la tasa de supervivencia a 5 años del individuo ser tratado aumenta en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 % aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 100 % o cualquier otro intervalo limitado por estos valores.

En otras modalidades, la tasa de supervivencia a 10 años del individuo ser tratado aumenta en aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 35 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 45 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 55 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 65 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 100 % o cualquier otro intervalo limitado por estos valores.

En otras modalidades más, el sujeto tiene una remisión sostenida de al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 14 meses, al menos 16 meses, al menos 18 meses, al menos 20 meses, al menos 22 meses, al menos 24 meses, al menos 27 meses, al menos 30 meses, al menos 33 meses, al menos 36 meses, al menos 42 meses, al menos 48 meses, al menos 54 meses o al menos 60 meses o más.

Como se usa en la presente descripción, el término "sustancialmente libre de cáncer" se refiere a un sujeto que no tiene evidencia clínica de cáncer o células cancerígenas, o células madre cancerígenas.

En otros aspectos no reivindicados, el método puede ayudar a tratar o aliviar afecciones, síntomas o trastornos relacionados con el cáncer. En algunos aspectos no reivindicados, estas afecciones o síntomas pueden incluir, pero no se limitan a, anemia, astenia, caquexia, síndrome de Cushing, fatiga, gota, enfermedad de las encías, hematuria, hipercalcemia, hipotiroidismo, hemorragia interna, caída del cabello, mesotelioma, náuseas, sudores nocturnos, neutropenia, síndromes paraneoplásicos, pleuritis, polimialgia reumática, rabdomiólisis, estrés, inflamación de los ganglios linfáticos, trombocitopenia, deficiencia de vitamina D o pérdida de peso. En otras modalidades, la administración del agonista selectivo de RARa prolonga la supervivencia del individuo que es tratado.

Ejemplos

Ejemplo 1. El nicho de la médula ósea induce una resistencia a bortezomib en el mieloma múltiple

El mieloma múltiple (MM) se caracteriza por la proliferación de células plasmáticas malignas (CP) dentro de la BM y su producción de inmunoglobulina monoclonal (Ig). Las terapias novedosas, incluidos los inhibidores de la proteasoma, han extendido significativamente la supervivencia de los pacientes con MM, pero no han logrado una cura. La creciente evidencia demuestra que las interacciones con el microambiente de la BM juegan un papel crítico en la supervivencia de las células de mM durante la quimioterapia. Sin embargo, los mecanismos que median esta quimioprotección dependiente del nicho de la BM no se comprenden completamente y son un área crítica de investigación.

Existen células de MM que se asemejan a las células B maduras y son resistentes al bortezomib (BTZ). Como sus homólogos de células B normales, estas células CD138- MM son capaces de tener un crecimiento clonogénico y de diferenciarse en PC CD138+. Además, estas células se enriquecen durante la enfermedad residual mínima (mRd), lo que sugiere un papel crítico en la recaída de la enfermedad. La sensibilidad diferencial a BTZ de las células de MM CD138+ y CD138- puede explicarse por su actividad secretora. Como resultado de su abundante producción de Ig, las PC CD138+ son altamente dependientes de una vía de la proteasoma intacta para degradar proteínas plegadas incorrectamente. Las condiciones que interrumpen la degradación de proteínas mediante la proteasoma activan una vía de estrés celular conocida como la respuesta de proteína desplegada (UPR), que contrarresta el estrés del RE al disminuir la síntesis de proteínas y promover la degradación de proteínas. Si no se puede restablecer la homeostasis, la activación de la UPR eventualmente provoca la apoptosis. Por otro lado, las células CD138- MM exhiben una producción limitada de Ig y un bajo estrés del RE y son menos dependientes de la degradación de proteínas mal plegadas mediada por la proteasoma.

Métodos

Cultivos celulares. Todas las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection. Se cultivaron células H929, MM1s y U266 en RPMI 1640 con FCS al 10 % (Sigma-Aldrich), L-glutamina 2 mM y 100 pg/mL de penicilina-estreptomicina (P/S). Las células OP-9 se cultivaron en a-MEM, FCS al 20 %, L-glutamina y P/S. Las líneas celulares se autenticaron mediante un perfil de repetición en tándem corto.

Las células de MM primarias se obtuvieron de pacientes con MM recién diagnosticado o en recaída según un protocolo aprobado por el IRB en la Universidad Johns Hopkins. Brevemente, se aislaron células mononucleares de aspirados de la BM frescos mediante centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll-Paque); a continuación, se seleccionaron células CD138+ mediante perlas y columnas magnéticas y se incubaron en RPMI 1640, FCS al 10 %, L-glutamina y P/S a 37 °C.

Las células del estroma de la BM humana primarias se obtuvieron de aspirados recolectados de donantes sanos según un protocolo aprobado por el IRB en Johns Hopkins. Brevemente, las células mononucleares totales aisladas de aspirados de la BM se cultivaron en medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) suplementado con suero de caballo al 10 %, FCS al 10 %, 21-hemisuccinato de hidrocortisona 10-5 M, P/S y p-mercaptoetanota 0,1 mM (p-ME) (medio FBMD1). Al día siguiente, las células en suspensión se retiraron mediante lavado dos veces con PBS y se sustituyeron los medios. Las células del estroma unidas se incubaron a 33 °C hasta que se obtuvo una monocapa confluente. Se aislaron células del estroma de la BM primarias de ratón con el mismo protocolo, después del aislamiento de células mononucleares de la BM totales de fémures de ratón.

Vectores y sobrenadantes virales. Para generar el estroma Smo-KO y WT, las células del estroma de la BM se derivaron de ratones Smofl/fl y se transdujeron con el vector retroviral PIG-Cre que codifica la recombinasa Cre (Addgene; catálogo 50935) o un vector de control (Addgene; catálogo 18751), respectivamente. Las células infectadas con éxito se seleccionaron mediante el uso de 4 pg/mL de puromicina durante 5 días y se confirmaron mediante la expresión de GFP mediante citometría de flujo. Se usó el vector lentiviral pLenti-CMV-LUC-Puro (plásmido 17477) para generar células H929 Luc+.

Para generar células del estroma que sobreexpresan CYP26A1, se transdujeron células del estroma WT y Smo-KO con el vector lentiviral pBABE-neo (Addgene; catálogo 1767) que había sido diseñado para codificar CYP26A1. Brevemente, se amplificó el ADNc de Cyp26a1 (Origene) mediante PCR mediante el uso de cebadores que incorporan los sitios de restricción BamHI y EcoRI y se clonó en el vector pCR2.1. El ADNc de Cyp26a1 se confirmó mediante secuenciación de Sanger, y el fragmento se aisló después de la digestión con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI y se subclonó en los sitios correspondientes del vector pBABE. Las partículas lentivirales se produjeron como se describió previamente. Se seleccionaron las células del estroma infectadas con éxito mediante el uso de 3 pg/mL de G-418 durante 10 días, y la expresión de Cyp26a1 se confirmó mediante qRT-PCR.

Experimentos de cocultivo. Se recubrieron placas de 24 pocillos con gelatina al 0,1 % en PBS durante 30 min a 37 °C. La solución de gelatina se retiró y las células del estroma se cultivaron durante la noche a una densidad de 5 x 104 células/pocillo para obtener una monocapa confluente. En ese momento, se añadieron las líneas celulares de MM o células de Mm primarias (1 x 105 en 2 mL) a los cultivos de estroma. Los cocultivos de estroma se incubaron a 37 °C en RPMI que contenía FCS al 10 %, L-glutamina y P/S, con o sin AGN19194310 (1 pM durante 5 días), R115866 (1 pM durante 5 días), IRX5183 (1 pM durante 5 días) o BTZ (2,5 nM durante 48 h).

Experimentos de Transwell. Para los experimentos de Transwell, se recubrieron placas de 6 pocilios con gelatina al 0,1 % en PBS durante 30 min a 37 °C. La solución de gelatina se retiró y las células del estroma se cultivaron durante la noche en medios FBMD1 a una densidad de 10 x 104 células/pocillo en 2 mL de medio para obtener una monocapa confluente. En ese momento, se colocaron insertos de Transwell (Corning) sobre los cultivos de estroma y se sembraron líneas de células de MM (1 x 106 en 1 mL) en el Transwell durante 24 h a 37 °C. Después de esta incubación, se retiraron las células de MM y del Transwell, y las células del estroma se desprendieron de los pocillos y se analizaron mediante qRT-PCR para determinar la expresión de CYP26.

Experimentos de movilización. Las células de MM se separaron de las células del estroma de la BM al pipetear suavemente varias veces alrededor del pocillo. Las células desprendidas se centrifugaron, se resuspendieron en medio fresco y se incubaron en una placa de 24 pocillos durante 1 h a 37 °C. Durante este breve período de incubación, las células del estroma contaminantes se adhirieron al pocillo, mientras que las células de MM permanecieron en suspensión. A continuación, se recuperaron las células de MM al pipetear suavemente. Este protocolo se usó para experimentos de cocultivo de CFU y qRT-PCR. La pureza lograda mediante el uso de este protocolo se confirmó mediante citometría de flujo en 98 %-99 % de células de MM y menos del 2 % de estroma contaminantes.

Ensayos clonogénicos. Después del tratamiento, se recolectaron las células de MM, se lavaron con PBS y se sembraron a una densidad de 5000 células/mL en 1 mL de metilcelulosa al 1,32 % suplementado con FBS al 30 %, BSA al 10 %, L-glutamina, P/S y p-ME 0,1 mM. Las células se sembraron en placas de cultivo de 35 mm por triplicado, se incubaron a 37 °C y se puntuaron para determinar la presencia de colonias 14 días después.

qRT-PCR. El ARN total se extrajo mediante el uso del RNeasy Mini Kit (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó mediante transcripción inversa mediante el uso del Kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad). La qRT-PCR se realizó con iTaq SYBR Green Supermix (Bio-Rad) mediante el uso de cebadores específicos de secuencia. La expresión génica se normalizó a GAPDH y la cuantificación relativa se calculó mediante el uso de AACt. Todos los experimentos se realizaron por duplicado y se realizaron en la máquina Bio-Rad CFX96.

Citometría de flujo. Después del tratamiento, se recolectaron las células de MM, se lavaron con PBS y se tiñeron durante 15 min a temperatura ambiente con anti-CD138 conjugado con ficoeritrina (conjugado con PE). Las células se lavaron para retirar el anticuerpo no unido y se evaluaron en un sistema FACSCalibur (BD Biosciences). Las células del estroma se identificaron mediante la expresión de GFP y las células viables se identificaron mediante el uso de 7-aminoactinomicina D (7-AAD). Para calcular el número de células, las células GFP-vivas se normalizaron a perlas de calibración.

Xenoinjertos de ratón. 1 * 106 células H929 Luc+ y 1 x 106 células del estroma de la BM de ratón se resuspendieron en 100 pL de Matrigel, se diluyeron con RPMI (1:1), y se inyectaron por vía subcutánea en ratones NSG machos de 16 semanas de edad. Después de 4 días, se inició el tratamiento con BTZ (0,5 mg/kg i.p. dos veces por semana) e IRX (10 mg/kg i.p. diariamente). La carga tumoral se evaluó mediante bioluminiscencia mediante el uso del sistema de imágenes in vivo (PerkinElmer). Para la obtención de las imágenes, los ratones se expusieron a 120 mg/kg de D-luciferina mediante inyección intraperitoneal 10-5 min antes de la obtención de las imágenes y se anestesiaron mediante el uso de isoflurano. Las imágenes se analizaron con Living Image Software, versión 2.5 (PerkinElmer), y los datos se cuantificaron como fotones/segundo.

Para el modelo de MM sistémica, 2 * 106 células H929 Luc+/GFP+ se inyectaron a través de la vena de la cola en ratones NSG machos de 16 semanas de edad. Después del injerto, determinado mediante un aumento exponencial en la bioluminiscencia, los ratones se trataron con BTZ (0,5 mg/kg i.p.) dos veces por semana y con IRX (10 mg/kg) una vez al día. La carga tumoral se evaluó mediante bioluminiscencia, como se indicó anteriormente.

Estadísticas. Lo primero que se evaluó fue si los grupos de tratamiento eran diferentes de los controles mediante el uso de ANOVA de 1 vía. Si la prueba ANOVA arrojó un resultado estadísticamente significativo, a continuación, se evaluó la diferencia entre el grupo de control y cada grupo de tratamiento, con los valores de P ajustados para comparaciones múltiples mediante el uso de la prueba de Dunnett. Para los experimentos en los que solo se analizaron 2 conjuntos de datos, se evaluó la significación estadística mediante el uso de una prueba t de Student de 2 colas no pareada. El valor R de Pearson para la correlación y los valores P se calcularon mediante el uso de GraphPad Prism 7 (software GraphPad).

Resultados

El nicho de la BM limita la diferenciación de PC mediante la modulación de la señalización de retinoides. Una población de progenitores de MM, fenotípicamente similar a las células B, es intrínsecamente resistente a BTZ y contribuye a la MRD y la recaída. Para investigar si el nicho de la BM juega un papel en la determinación del fenotipo de las células de MM, la expresión de ARNm de las células B y los marcadores de PC en líneas celulares MM H929 (Figura 1A-D) y de las células primarias MM CD138+ (Figura 1E-H) se analizó después del cocultivo con estroma de la BM de ratón mediante el uso de cebadores específicos para humanos. El linfoma 6 de células B (BCL6), un represor transcripcional que promueve la autorrenovación de las células B del centro germinal y previene la diferenciación de PC, se reguló positivamente en presencia de células del estroma de la BM (Figura 1A, 1E). Por el contrario, el cocultivo de células de MM con estroma de la BM disminuyó la expresión de ARNm de la proteína 1 de maduración inducida por linfocitos B (BLIMP1) y la proteína 1 de unión a la caja X empalmada (XBP1s) (Figura 1B, C, F, G), que son mediadores críticos de la diferenciación de PC. De manera similar, la proteína homóloga de C/EBP (CHOP), un componente clave de la vía de UPR, se reguló negativamente en presencia de células del estroma de la BM (Figura 1D, H).

El nicho de la BM regula la diferenciación de células madre hematopoyéticas (HSC) mediante la expresión de la enzima CYP26 que inactiva retinoides. Las enzimas CYP26 se expresaron altamente en células mesenquimales de la BM, mientras que su expresión fue apenas detectable en células de MM. Dado que la señalización de retinoides promueve la diferenciación de PC y potencia la secreción de Ig, se determinó si la CYP26 del estroma es responsable de inducir un fenotipo de células B en células de MM. Con este fin, las condiciones de cocultivo se trataron con el inhibidor de CYP26 R115866 (R115) o el retinoide selectivo del receptor a de RA (selectivo de RARa) resistente a CYP26 IRX5183 (IRX). La incubación de cocultivos del estroma con R115 o IRX restauró todos los marcadores a niveles comparables a los de las condiciones de control líquido (Figura 1A-H). Además, el tratamiento de células de MM con el antagonista pan-RAR AGN194310 (AGN) imitó los cambios inducidos por las células del estroma de la BM (Figura 1A-H), lo que limitó la diferenciación de PC.

La expresión de CD138 es un sello distintivo de la diferenciación normal de PC y MM PC. De acuerdo con los niveles de ARNm de los marcadores de PC, la expresión de CD138 de superficie disminuyó notablemente mediante el cocultivo con células del estroma de la BM o la incubación con AGN. La incubación de cocultivos de células del estroma de la BM con R115 o IRX restauró la expresión de CD138 en células de MM. R115 no afectó significativamente la expresión de marcadores de diferenciación en condiciones líquidas mediante PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) o citometría de flujo, mientras que IRX indujo cambios comparables, independientemente de la presencia o ausencia del estroma de la BM. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la señalización de retinoides promueve la diferenciación de células de MM por PC y que este proceso está bloqueado por el metabolismo de RA mediado por CYP26 del estroma.

Un microambiente bajo en RA induce resistencia a BTZ. Para determinar si la disminución de la señalización de retinoides contribuye a la resistencia a BTZ dentro del nicho de la BM, se incubaron líneas celulares MM y células primarias MM CD138+ con estroma de la BM durante 5 días, seguido de tratamiento con BTZ. En ausencia de estroma de la BM (líquido), las células de MM fueron altamente sensibles a BTZ (Figura 2A-B). Sin embargo, la incubación con estroma de la BM indujo resistencia a BTZ, que fue superada por la inhibición de CYP26 a través de R115 o por el retinoide IRX resistente a CYP26. Además, el tratamiento de las células de MM con el antagonista pan-RAR AGN imitó los cambios inducidos por las células del estroma de la BM (Figura 3), lo que disminuyó la sensibilidad a BTZ.

Las estrategias para superar la quimioprotección dependiente del microambiente se han enfocado en la movilización de células cancerígenas desde el nicho de la BM hacia la circulación periférica. Se analizó si el cambio en el fenotipo y la subsiguiente resistencia a BTZ de las células de MM se perdieron al separarse del estroma de la BM, un proceso que imita la movilización. Con este fin, las células H929 se separaron de las células mesenquimales de la BM después de un cocultivo de estroma de 5 días, se incubaron en medio fresco (RPMI con FBS al 10 %) durante 0 a 48 h y a continuación se trataron con BTZ. Interesantemente, las células de MM permanecieron parcialmente resistentes a BTZ durante hasta 48 horas después del desprendimiento del estroma (Figura 3). Además, el tratamiento de las condiciones de cocultivo con R115 evitó el desarrollo de un fenotipo resistente a BTZ (Figura 3). Por tanto, la resistencia a BTZ dependiente del microambiente inducida por el cambio en el fenotipo de las células de MM puede no revertirse inmediatamente mediante la movilización del tumor.

Para probar si los retinoides pueden potenciar la actividad de BTZ en MM, se desarrolló un xenoinjerto de MM sistémico mediante la inyección de 2 * 106 células H929 luciferasa+ (Luc+) a través de la vena de la cola de ratones KO para el receptor y de IL-2 con inmunodeficiencia combinada grave, diabéticos y no obesos. Los animales se asignaron al azar para recibir IRX, BTZ o una combinación de ambos, y la carga de la enfermedad se siguió semanalmente mediante imágenes de bioluminiscencia (Figura 4). Los ratones tratados con BTZ mostraron una disminución del crecimiento tumoral en comparación con los controles no tratados; sin embargo, algunas células de MM permanecieron resistentes a BTZ, como lo demuestra el aumento continuo en la bioluminiscencia. De manera similar, los ratones tratados con la monoterapia de IRX mostraron una disminución en la carga tumoral en comparación con los ratones no tratados. Lo más importante es que IRX sensibilizó a las células de MM a BTZ, lo que provocó una disminución significativa (P < 0,01) en la carga de la enfermedad. En conjunto, estos datos sugieren que un microambiente bajo en RA creado por la CYP26 del estroma induce un fenotipo resistente a BTZ, que se mantiene incluso después del desplazamiento del nicho de la BM.

Las células de MM inducen CYP26 en el estroma. Loa estudios recientes han demostrado la existencia de una diafonía bidireccional, en la que no solo las células del estroma proporcionan un microambiente protector, sino que también las células cancerígenas se adaptan activamente y construyen un nicho reforzado. Por lo tanto, se determinó si las células de MM refuerzan un microambiente protector al fortalecer la capacidad del estroma de la BM para inactivar los retinoides. La expresión de CYP26 en el estroma se analizó mediante qRT-PCR en células mesenquimales de la BM después de un cocultivo de 24 h con células de MM. La isoenzima CYP26A1 fue altamente regulada positivamente por todas las 3 líneas celulares de MM probadas (Figura 5A-C). Por el contrario, la isoenzima CYP26B1 mostró pocos o ningún cambio en los niveles de ARNm. Los medios acondicionados derivados de células de MM también regularon positivamente CYP26A1 en células del estroma de la BM, aunque en menor grado. Esto podría explicarse por la presencia de interacciones físicas en los experimentos de cocultivo, o la falta de producción continua de ligandos solubles por las células de MM en experimentos de medios acondicionados. De acuerdo con el último, la CYP26A1 del estroma estuvo altamente regulada positivamente cuando las células del estroma de la BM y MM se separaron mediante un Transwell que impedía el contacto físico, pero permitía la difusión de factores solubles (Figura 5A-C).

Las células de MM producen una variedad de factores solubles que incluyen citocinas (IL-1, IL-3, IL-6, TNF-a), así como ligandos de Hedgehog tales como sonic hedgehog (SHH), que podrían afectar el compartimento del estroma de la BM. Por lo tanto, se determinó si alguno de estos factores era responsable de la regulación al alta observada de CYP26A1 en las células del estroma de la BM. De los factores solubles probados, solo SHH produjo una sobreexpresión sostenida de CYP26A1, mientras que IL-1, IL-3, IL-6 y TNF-a no tuvieron efectos significativos. Mientras que el SHH se expresa por las células del estroma de la BM y, por tanto, puede ser capaz de activar la vía Hedgehog de forma autocrina, su expresión fue considerablemente mayor en las células de MM en comparación con la detectada en el estroma de la Bm, lo que sugiere que la activación paracrina puede desempeñar un papel dominante. De acuerdo con esto, hubo una correlación estadísticamente significativa entre los niveles de ARNm de SHH en las células de MM y la activación de la señalización de Hedgehog en el estroma determinada por la expresión del homólogo 1 de la proteína parchada (PTCH1). Además, la activación de Hedgehog en el estroma se correlacionó significativamente con la regulación al alta de CYP26A1. Específicamente, las células de MM1S con la expresión más alta de SHH también indujeron la expresión más alta de PTCH1 y CY26A1 en las células del estroma. SHH tiene una vida media de menos de 1 hora, lo que puede explicar el efecto reducido de los medios acondicionados con MM sobre la expresión de CYP26A1 en el estroma en comparación con la observada en los experimentos de cocultivo y Transwell.

Para confirmar el papel de Hedgehog paracrino en esta interacción, el suavizado (Smo), un receptor de membrana que transduce la señalización de SHH, se inactivó a nivel genómico en el compartimento mesenquimal. Para ello, se transdujeron células mesenquimales de la BM derivadas de ratones Smofl/fl con un vector retroviral que codifica la recombinasa Cre (estroma Smo-KO). Como un control se usaron células del estroma de ratón Smofl/fl transducidas con un vector retroviral vacío (estroma WT). Las células del estroma de la BM transducidas se cocultivaron con células de MM durante 24 h. Como se esperaba, el estroma Smo-KO tuvo una capacidad disminuida para regular positivamente Cyp26a1 en respuesta a las células de MM en comparación con el estroma WT (Figura 6A-C). De manera similar, el inhibidor de SMO ciclopamina superó parcialmente la regulación al alta de Cyp26a1 en el estroma por las células de MM. Estos datos sugieren que las células de MM modulan la expresión de CYP26 en el estroma al menos en parte a través de SHH paracrino.

El Hedgehog paracrino producido por las células de MM refuerza un microambiente protector. Dadas las observaciones de que la actividad de CYP26 en el estroma puede ser responsable de la resistencia a BTZ en las células de MM, se evaluó si el Hedgehog paracrino secretado por las células de MM refuerza un nicho quimioprotector mediante la regulación del metabolismo de los retinoides. Primero se investigó si la modulación de la señalización de Hedgehog era paralela a los fenotipos dependientes de retinoides observados anteriormente. La interrupción de la señalización paracrina de Hedgehog en cocultivos del estroma Smo-KO restauró parcialmente la diferenciación de PC (regulación a la baja de BCL6 y regulación al alta de BLIMP1, XBP1 y CHOP) en células H929 (Figura 9A-D) y MM primarias CD138+ (Figura 9E-H). La expresión superficial de CD138 también se restauró en presencia del estroma Smo-KO. Como era de esperar, estos hallazgos se asociaron con una mayor sensibilidad a BTZ de las células de MM tratadas en presencia del estroma Smo-KO en comparación con el estroma WT.

Para demostrar que el Hedgehog paracrino induce un fenotipo resistente a BTZ al aumentar la capacidad del estroma de la BM para inactivar retinoides, se rescató la expresión de Cyp26a1 en el estroma Smo-KO mediante transferencia de genes mediada por lentivirus (pBABE-Cyp26a1) para lograr niveles comparables de CYP26A1 en células del estroma WT (WT-Cyp26a1) y Smo-KO (Smo-KO-Cyp26a1). Si el papel de Hedgehog paracrino fuera independiente de la señalización de retinoides, la incapacidad relativa del estroma Smo-KO para inducir un fenotipo de células B y resistencia a BTZ debería haber persistido incluso después de la regulación al alta de Cyp26a1. Sin embargo, la sobreexpresión de Cyp26a1 rescató la capacidad del estroma Smo-KO para inducir un fenotipo de células B y restauró la expresión de marcadores de diferenciación y la resistencia a BTZ a niveles comparables a los detectados en condiciones de cocultivo del estroma WT y WT-Cyp26a1. Este hallazgo es consistente con la hipótesis de que Hedgehog paracrino refuerza un nicho protector a través de la regulación al alta de Cyp26a1.

Para estudiar en qué grado un ambiente bajo en RA creado por el estroma de la BM y potenciado por las células de MM a través de la señalización de Hedgehog paracrina contribuye a la resistencia a BTZ, se desarrolló un modelo de xenoinjerto de interacciones nicho-MM. Cada ratón portó 2 tumores subcutáneos que consistían en células H929 Luc+ y WT (tumores anteriores) o estroma Smo-KO (tumores posteriores). Los ratones se trataron con IRX (10 mg/kg i.p. diariamente), BTZ (0,5 mg/kg i.p. dos veces por semana) o una combinación de ambos. El crecimiento de tumores con estroma WT o Smo-KO no fue diferente en los grupos tratados con IRX o sin tratar (Figuras 7 y 8). De acuerdo con los datos in vitro, los tumores con estroma WT fueron refractarios al tratamiento con BTZ, según lo determinado por un aumento exponencial en la bioluminiscencia, mientras que los tumores que portaban el estroma Smo-KO mostraron una respuesta significativa (Figura 8). Además, la combinación de IRX y BTZ dio como resultado una respuesta significativa y equivalente, independientemente del fenotipo del compartimento del estroma (Figura 8). Si bien algunos tumores en el grupo de tratamiento que recibió IRX y BTZ combinados parecían haber retrocedido completamente, incluso después del estudio anatómico, este no fue el caso para todos los ratones de este grupo. Los análisis de citometría de flujo de los tumores después del tratamiento no revelaron diferencias en el crecimiento in vivo del estroma WT o Smo-KO. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que e1Hedgehog paracrino secretado por las células de MM modula la señalización de retinoides y la sensibilidad a BTZ en el nicho de la BM a través de la regulación al alta de CYP26A1.

Dada su alta secreción de Ig, los CP son particularmente sensibles a la inhibición de la proteasoma, y esto explica las altas tasas de remisión alcanzadas en pacientes con MM tratados con esta familia de fármacos. No obstante, BTZ no ha logrado curar. Una población de células de MM, fenotípicamente similar a las células B, sobrevive al tratamiento con BTZ y es capaz de diferenciarse en PC y recapitular la enfermedad original. A pesar de la eliminación eficaz de MM PC, estas células B de MM sobreviven al tratamiento con BTZ y se convierten en la población celular predominante durante la MRD. En consecuencia, se requieren nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a las células B de MM. Un microambiente con bajo contenido de retinoides creado por la CYP26 del estroma mantuvo un fenotipo inmaduro resistente a BTZ en el MM. Por lo tanto, estos datos revelan una oportunidad terapéutica para superar la resistencia a BTZ en el microambiente de MM mediante el uso de retinoides resistentes a CYP26.

A pesar de estar ampliamente estudiado en muchas neoplasias malignas hematológicas, el uso de retinoides como terapia de diferenciación ha demostrado ser beneficioso solo en pacientes con leucemia promielocítica aguda (APL). La expresión de CYP26 por las células del estroma de la BM puede explicar la falta de un beneficio clínico de los retinoides naturales, a pesar de su actividad in vitro. Los estudios recientes han destacado la eficacia de los retinoides sintéticos resistentes a CYP en la diferenciación de las células cancerígenas y la sensibilización a la terapia dirigida. Por ejemplo, AM80 diferencia las células de leucemia mieloide aguda (AML) con duplicación interna en tándem (FLT3/ITD) de la tirosina cinasa 3 similar a FMS y aumenta su sensibilidad a los inhibidores de FLT3. De manera similar, los retinoides sintéticos invierten un fenotipo de células madre en linfoblastos leucémicos BCR-ABL1+ y aumentan sustancialmente su capacidad de respuesta a la terapia con el inhibidor de tirosina cinasa (TKI) in vivo. Estas estrategias para evitar la CYP26 del estroma podrían ampliar la eficacia clínica de la terapia con retinoides.

Las células de MM utilizan contactos físicos para mantener la resistencia a los fármacos y sobrevivir dentro del nicho de la BM. Por tanto, las estrategias terapéuticas para superar la quimioprotección del estroma se han enfocado en la movilización de células malignas del nicho de la BM al dirigirse a moléculas de adhesión o quimiocinas tales como CXCR4. Las células de MM expuestas a un microambiente bajo en retinoides adquieren un fenotipo resistente a BTZ que se mantiene incluso después de que estas células se desplazan de su nicho. Los estudios clínicos iniciales han demostrado tasas de respuesta mejoradas en pacientes con recaída/refractarios que reciben el inhibidor de CXCR4 plerixafor en combinación con BTZ; sin embargo, estos datos sugieren que tales enfoques de movilización pueden ser insuficientes para eliminar las células B de MM.

Los estudios recientes han demostrado la existencia de una comunicación bidireccional, en la que no solo las células del estroma proporcionan un nicho quimioprotector, sino que también las células cancerígenas moldean y refuerzan activamente su microambiente. El papel del Hedgehog paracrino se ha estudiado ampliamente en neoplasias malignas sólidas. En este sistema, los ligandos secretados por las células cancerígenas activan la vía Hedgehog en las células del estroma vecinas, lo que potencia sus propiedades quimioprotectoras a través de mecanismos que no se comprenden completamente. Estos datos sugieren que el Hedgehog paracrino puede funcionar, al menos en parte, al aumentar la capacidad del estroma para inactivar los retinoides mediante la regulación a la alta de CYP26 y, por lo tanto, para mantener un fenotipo resistente a BTZ en el MM. Interesantemente, la regulación a la alta de CYP26 se asocia con un "subtipo de estroma activado" y un pronóstico significativamente peor en pacientes con cáncer de páncreas, una enfermedad en la que la señalización de Hedgehog paracrina está bien establecida. Se desconoce hasta qué grado los ligandos de Hedgehog producidos por las células cancerígenas contribuyen a este fenotipo de estroma "activado" y niveles elevados de CYP26. Además, las células mesenquimales de la b M migran y se convierten en una población celular relevante en el compartimento del estroma de estos tumores.

La región endóstica es el nicho primario de MM, AML y la enfermedad micrometastásica de tumores sólidos. Dentro de la región osteoblástica, estas células cancerígenas mantienen un fenotipo de células madre inactivo y están protegidas de la apoptosis inducida por quimioterapia. Es probable que estas células cancerígenas se basen en las mismas señales del microambiente de la BM que las células madre hematopoyéticas normales para sobrevivir a la quimioterapia y perpetuar la enfermedad. El microambiente de la BM protegió a las células de MM y AML mediante la inactivación directamente de varios agentes de quimioterapia mediante la expresión de CYP3A4 y otras enzimas desintoxicantes. Ahora se demuestra otro mecanismo potencial de resistencia a los fármacos mediada por el microambiente: la creación de un nicho bajo en retinoides que mantiene un fenotipo de células B resistentes a los fármacos. Un retinoide resistente a CYP26 que potenció la actividad de BTZ contra MM en el nicho de la BM proporciona una oportunidad terapéutica para evitar este mecanismo de resistencia.

Ejemplo 2. Los agonistas de RARa resistentes a CYP26 superan la protección de la médula ósea (BM) de la AML por CYP26 (ejemplo de referencia)

El ácido retinoico todo trans (ATRA), que actúa a través de RARa, provoca la diferenciación terminal y la apoptosis de las células de la AML que no son APL in vitro, pero es clínicamente ineficaz contra la AML. El estroma de la BM, que expresa niveles indudablemente altos de CYP26, inactiva metabólicamente ATRA y proporciona un ambiente protegido para las células madre cancerígenas de la AML. Los agonistas sintéticos de RARa resistentes a CYP26, tales como IRX5183 y AM80, deberían poder evitar la protección de las células de AML mediada por el estroma y diferenciar las células madre cancerígenas que residen en el ambiente protegido del nicho de la médula ósea. Para probar estas hipótesis, se llevaron a cabo experimentos de crecimiento clonogénico en las líneas celulares de AML no APL OCI-^a M^l 3 y Kasumi-1 y en células APL NB4, que se trataron con ATRA, IRX5183 y AM80 en presencia o ausencia de estroma. ATRA inhibió el crecimiento clonogénico sólo en ausencia de estroma. Por el contrario, IRX5183 inhibió el crecimiento clonogénico en un grado similar en presencia o ausencia de estroma (Figura 10A-C). AM80 también inhibió el crecimiento clonogénico en presencia de estroma, pero no tan eficazmente como IRX5183. Estos datos indican que los agonistas de RARa resistentes a CYP26, tales como IRX5183, pueden ser tratamientos eficaces para la AML al superar los mecanismos del estroma de resistencia a los fármacos.

Ejemplo 3. Ensayo clínico de fase I/II de IRX5183 en neoplasias malignas mieloides refractarias y en recaída (ejemplo de referencia)

La leucemia mieloide aguda (AML) se trata con éxito sólo en el 30-40 % de los pacientes más jóvenes y en muy pocos pacientes mayores con regímenes de quimioterapia estándar. Dada la actividad clínica del ácido todo-trans retinoico (ATRA; ácido retinoico, RA) en la leucemia promielocítica aguda (APL), ATRA se consideró una estrategia terapéutica atractiva para otros subtipos de AML. La APL y la mayoría de las AML que no son APL se someten a diferenciación terminal y, por lo tanto, se tratan con éxito con ATRA in vitro. Sin embargo, ATRA no ha demostrado su eficacia en las AML que no son APL en ensayos clínicos.

El ácido retinoico (RA) juega un papel importante en la diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSC). La enzima CYP26 del citocromo P450, expresada en las células del estroma de la médula ósea (BM), inactiva el RA, lo que limita la diferenciación de las HSC. Varias líneas celulares de AML, tanto APL como no APL, son sensibles a la diferenciación inducida por RA, pero este efecto se anuló en presencia del estroma de la BM. Por tanto, puede resultar útil tratar la AML con un retinoide resistente al metabolismo mediado por la vía CYP26. IRX5183 es un agonista selectivo de RARa resistente al metabolismo de CYP26. El uso de IRX5183 en la AML proporciona un nuevo enfoque dirigido a esta enfermedad, que tiene el potencial de cambiar el pronóstico de esta y otras neoplasias malignas hematológicas. Por lo tanto, se llevará a cabo un ensayo clínico de fase I/II de IRX5183 en la AML en recaída/refractaria y el síndrome mielodisplásico de alto riesgo (HR-MDS).

Objetivos del estudio

Objetivos primarios de la fase de escalada de dosis:

1) Evaluar la seguridad y toxicidad asociadas con la administración de IRX5183 en pacientes con AML en recaída y refractaria mediante la determinación de las toxicidades limitantes de la dosis (DLT) y la dosis máxima tolerada (MTD).

2) Determinar los parámetros farmacocinéticos (PK) de IRX5183 en la sangre periférica.

Objetivos secundarios de la fase de escalada de dosis;

1) Determinar los parámetros PK de IRX5183 en la médula ósea.

2) Definir perfiles de diferenciación asociados con IRX5183, concentraciones de retinoides celulares de la BM, recuentos de blastocitos y citogenética a diferentes niveles de dosis.

Objetivos primarios de la fase de expansión de dosis:

1) Definir marcadores de diferenciación, concentraciones de retinoides de la BM, recuentos de blastocitos y citogenética en pacientes con AML y HR-MDS al nivel de dosis óptima.

2) Obtener datos preliminares de eficacia de IRX5183 en términos de respuesta completa (CR), respuesta parcial (PR) y mejoría hematológica (HI) en ambas cohortes de pacientes.

Objetivos secundarios de la fase de expansión de dosis;

1) Definir perfiles de toxicidad de IRX5183 a la dosis óptima en ambas cohortes de pacientes.

2) Obtener datos sobre las correlaciones entre la diferenciación inducida por IRX5183 y la toxicidad y las respuestas clínicas.

Criterios de elegibilidad de la determinación de la escalada de dosis. Esta fase sólo reclutará pacientes con AML:

1. Los pacientes deben poder comprender y firmar voluntariamente un formulario de consentimiento informado.

2. Edad 18-70 años al momento de firmar el consentimiento informado.

3. Capaces de cumplir con el esquema de visitas del estudio y otros requerimientos del protocolo.

4. Esperanza de vida superior a 6 meses.

5. Debe tener AML patológicamente confirmada con uno o dos ciclos previos de quimioterapia de inducción o terapia con agentes hipometilantes o recaída después de la remisión completa, antes o después de un trasplante alogénico de médula ósea, Y no tener planes para más quimioterapia intensiva.

6. Los pacientes no deben haber recibido ningún otro tratamiento para su enfermedad (aparte de hidroxiurea para el control del recuento de blastocitos en pacientes con AML), incluidos los factores de crecimiento hematopoyéticos, dentro de las tres semanas posteriores al inicio del ensayo, y deben haberse recuperado de todas las toxicidades del tratamiento anterior (para grado 0 o 1).

7. Estado funcional ECOG de < 2 al inicio del estudio, o Karnofsky > 60 %.

8. Resultados de las pruebas de laboratorio dentro de estos intervalos:

a. Aclaramiento de creatinina calculado por MDRD (CrCL) > 50 mL/min/1,73 metro cuadrado b. Bilirrubina total < 2,0 mg/dL a menos que se deba al síndrome de Gilbert, hemólisis o hematopoyesis ineficaz AST (SGOT) y ALT (SGPT) < 3 x ULN

9. Las mujeres en edad fértil deben tener una prueba de embarazo negativa.

10. Los pacientes no deben tener evidencia clínica de leucostasis pulmonar o del CNS, coagulación intravascular diseminada o leucemia del CNS.

11. Los pacientes no deben tener afecciones médicas graves o incontroladas.

Criterios de elegibilidad de la expansión de la dosis. Esta fase reclutará pacientes con AML en recaída/refractaria (cohorte 1) y pacientes con HR-MDS que no responden a los agentes hipometilantes (cohorte 2) y seguirá los criterios de elegibilidad indicados anteriormente (aparte del #5 anterior en pacientes con MDS), que incluye CMML o MDS patológicamente confirmados con características de alto riesgo en el momento de la derivación según lo definido por:

1. INT-2 o puntuación IPSS alta

2. MDS secundario

3. MDS INT-1 con exceso de blastocitos (> 5 % de blastocitos en la BM) o dependencia de la transfusión de plaquetas o RBC

4. CMML con > 5 % de blastocitos medulares, o dependencia de transfusión de plaquetas o RBC, cariotipo anormal o características proliferativas

Se requiere que todos los pacientes con HR-MDS hayan fracasado o recaído después de una respuesta inicial a los agentes hipometilantes o se hayan negado a recibir la terapia hipometilante. La falta de respuesta se define como no lograr una CR, PR o HI después de al menos 4 ciclos de terapia de hipometilación.

Plan de tratamiento

Para la fase de escalada de la dosis, el IRX5183 se administra por vía oral en dosis diarias de forma continua en ciclos de 28 días hasta la toxicidad o la progresión de la enfermedad. Las pruebas de médula ósea durante cada uno de los primeros 4 ciclos determinan el estado y la respuesta de la médula ósea. Sólo los pacientes con leucemia mieloide aguda en recaída o refractaria se inscriben en la fase de escalada de la dosis. La dosis inicial (DL1) del agente único IRX5183 es de 30 mg/m2/día, y los niveles de dosificación individuales se indican a continuación:

La parte de expansión de fase del estudio usa la dosis óptima identificada en la parte de escalada de fase del estudio e incluye dos brazos separados; uno para pacientes con AML y otro para HR-MDS, y cada uno de estos dos brazos reclutará a 26 pacientes.

Los niveles de dosis se exploran de acuerdo con un diseño tradicional 3+3, con el objetivo de inscribir a 3 sujetos a la vez para determinar el perfil de toxicidad de IRX5183 en pacientes con AML. Si ninguno de los tres pacientes que reciben DL1 experimenta DLT, otros tres pacientes serán tratados con el siguiente nivel de dosis más alto. Sin embargo, si uno de los tres primeros pacientes experimenta una DLT, tres pacientes más serán tratados con el mismo nivel de dosis. La escalada de la dosis continuará hasta que al menos dos pacientes de un cohorte de 3-6 pacientes experimenten DLT. Si dos o más pacientes experimentan DLT en DL1, el siguiente paciente será reclutado para DL (-1). La MTD del agente único IRX5183 será la dosis más alta a la que se observe 0 o 1 DLT en un cohorte de seis sujetos.

Para el cohorte de expansión de dosis de fase 2, los pacientes con AML continúan inscritos en el MTD, con el objetivo de inscribir a 26 pacientes (incluidos los pacientes tratados en el MTD en la primera fase del ensayo). Los pacientes continúan con el agente único IRX5183 hasta que experimentan toxicidad o progresión de la enfermedad. Si los pacientes logran una remisión completa, tienen la opción de consolidar con trasplante, quimioterapia y/o continuar con el IRX5183 de mantenimiento. Si los pacientes logran una respuesta parcial o una mejoría hematológica, tienen la opción de obtener una terapia de rescate en combinación con IRX5183. Para los pacientes con MDS, el cohorte de expansión de dosis de fase 2 reclutará a 26 pacientes quienes recibirán IRX5183 como agente único en el MTD de la primera fase del ensayo. Ellos también continúan hasta una toxicidad indebida o progresión de la enfermedad. Los pacientes que logran una mejoría hematológica o mejor tienen la opción de consolidar con el trasplante, combinar con la terapia con un agente desmetilante o continuar con el IRX5183 de mantenimiento.

Análisis farmacocinéticos

Las concentraciones plasmáticas de IRX5183 se evalúan para las fases de escalada y expansión, lo que apunta a niveles de retinoides seguros y eficaces mediante farmacocinética mediante el uso de LCM-MS (cromatografía líquida-espectroscopía de masas en tándem). Apuntar a niveles máximos de 1 pM debería evitar la toxicidad sistémica, al tiempo que presumiblemente preserva los niveles de retinoides del nicho local de la BM. La concentración plasmática de IRX5183 se obtiene mediante el uso de una única muestra de sangre de 2 mL, antes de la dosis el día 14. Las muestras son enviadas y analizadas por el laboratorio analítico designado.

Análisis de farmacodinámica

Además de evaluar los criterios de respuesta clínica estándar, se determinan las concentraciones de células de la BM (HSC y LSC normales), recuentos de blastocitos en sangre periférica y médula ósea, marcadores de diferenciación, apoptosis y crecimiento clonogénico. Se obtienen un aspirado de médula ósea y una biopsia al inicio del estudio, el día 14 y al final de cada uno de los primeros 4 ciclos de terapia. La diferenciación se evalúa mediante citometría de flujo, al comparar la expresión de marcadores de diferenciación en células positivas para CD45 y LSC de ALDHint en la médula del día 14 frente a la línea base. El análisis FISH también se realiza después de cada ciclo para pacientes con anomalías en la línea base para determinar si el clon leucémico todavía está presente el día 14. Resultados esperados: los pacientes que reciben agonistas selectivos de RARa se monitorean para determinar los criterios de respuesta basados en parámetros hematológicos que incluyen hemogramas completos y porcentaje de blastocitos leucémicos en la sangre periférica y en la médula ósea. Se considera que los pacientes con mejor recuento de neutrófilos, menor necesidad de transfusión de glóbulos rojos y plaquetas junto con un porcentaje reducido de blastocitos en la médula ósea e inducción de la diferenciación y apoptosis de estos blastocitos malignos responden al tratamiento. Se evalúan parámetros de calidad de vida como el dolor, el estado funcional y la participación en las actividades de la vida diaria y las actividades instrumentales de la vida diaria para evaluar el impacto de esta terapia en los pacientes del estudio. Se espera que el uso de este agonista selectivo de RARa mejore los parámetros hematológicos y de calidad de vida en pacientes con MDS/AML y neoplasias malignas sólidas. Además, el uso del agonista de RARa que es resistente a CYP26 puede dar como resultado la diferenciación y, por lo tanto, la eliminación de la enfermedad residual mínima en la médula ósea de estos pacientes. El objetivo final es desarrollar mejores tratamientos para los pacientes con AML en recaída/refractaria y este estudio proporcionará información valiosa sobre el uso de nuevos retinoides en este entorno.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, y así sucesivamente, usados en la especificación y las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "alrededor". Como se usa en la presente descripción, los términos "alrededor" y "aproximadamente" significan entre el 10 y el 15 %, preferiblemente entre el 5 y el 10 %. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la especificación y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar en dependencia de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debe interpretarse a la luz del número de dígitos significativos informados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo habituales. A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se indican con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente determinados errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.

Los términos "un", "una", "el" y referencias similares usadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en la presente descripción o sea claramente contradicho por el contexto. La recitación de intervalos de valores en la presente descripción está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en la presente descripción, cada valor individual se incorpora en la especificación como si se recitara individualmente en la presente descripción. Todos los métodos descritos en la presente descripción se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otro modo. El uso de todos y cada uno de los ejemplos o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, "tal como") proporcionado e en la presente descripción está destinado simplemente a iluminar mejor la invención y no supone una limitación en el alcance de la invención reivindicada de otro modo.

En la presente descripción se describen determinadas modalidades de esta invención, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, las variaciones de estas modalidades descritas resultarán evidentes para los expertos en la técnica al leer la descripción anterior.

Las modalidades específicas descritas en la presente descripción pueden estar además limitadas en las reivindicaciones que usan el lenguaje que consiste en o que consiste esencialmente en. Cuando se usa en las reivindicaciones, ya sea como presentado o añadido por enmienda, el término de transición "que consiste en" excluye cualquier elemento, etapa o ingrediente no especificado en las reivindicaciones. El término de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de una reivindicación a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan materialmente la(s) característica(s) básica(s) y novedosa(s). Las modalidades de la invención así reivindicadas se describen y habilitan inherente o expresamente en la presente descripción.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Una combinación para su uso en un método para tratar una neoplasia maligna hematológica, en donde la combinación comprende una dosis eficaz de un agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARa) resistente a CYP26 y un inhibidor de la proteasoma y, opcionalmente, al menos un agente anticancerígeno adicional,

   en donde el agonista selectivo del receptor alfa del ácido retinoico (RARa) resistente a CYP26 es un compuesto que tiene la estructura de fórmula III

   

   (IRX5183), y

   en donde el al menos un agente anticancerígeno adicional opcional se selecciona de la lista que consiste de etopósido, una antraciclina, idarrubicina, daunorrubicina, mitoxantrona, citarabina, una combinación de una antraciclina, citarabina y etopósido, un agente desmetilante, 5-azacitidina, decitabina, un inhibidor de tirosina cinasa, un inhibidor de BCR-ABL, un inhibidor de Flt3, un inhibidor de cKit, un inhibidor de IDH1/2, un inhibidor de JAK2, un inhibidor de BTK, mAb anti-CD33, mAb anti-CD20, mAb anti-CD19, mAb anti-CD30, un inhibidor de PD1, un inhibidor de CTL4, lenolidamida, pomalidomida, ciclofosfamida, bevacizumab, vincristina, un corticosteroide, bleomicina, adriamicina, bendamustina, fludarabina, G-CSF, GM-CSF, Epo y combinaciones de los mismos, por lo cual, como resultado del tratamiento, se reduce la carga tumoral;

   en donde el método comprende la administración de dicha combinación a un sujeto que lo necesite; en donde el inhibidor de la proteasoma es bortezomib, y

   en donde la neoplasia maligna hematológica es mieloma múltiple.