ES2897552T3 - Mutantes de la ADN polimerasa theta, métodos para producir estos mutantes y sus usos - Google Patents

Mutantes de la ADN polimerasa theta, métodos para producir estos mutantes y sus usos Download PDF

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Abstract

Una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta (Pol theta) capaz de realizar una extensión de ácido nucleico sin molde, o un fragmento funcional de dicha polimerasa, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2322, 2328, 2334, 2335, 2384, 2387 y 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCIÓN
Mutantes de la ADN polimerasa theta, métodos para producir estos mutantes y sus usos
Sector de la técnica
En el campo de las biotecnologías terapéuticas, los ácidos nucleicos han demostrado ser una herramienta útil para la regulación de la expresión génica, el diagnóstico médico, la modulación de rutas biológicas, las estrategias de reconocimiento molecular o el diseño de fármacos. Se han desarrollado estrategias clave que han demostrado su eficacia durante varios años, como los ácidos nucleicos antisentido1,2, ribozimas y ribointerruptores34 y aptámeros56. Sin embargo, sigue siendo necesario algún avance innovador en la generación de moléculas basadas en aptámeros para competir con la química médica y/o los anticuerpos biológicos.
Estado de la técnica
Los aptámeros de ácido nucleico consisten en ADN monocatenario (ADNmc) o ARN que presenta estructuras 3D definidas debido a su propensión a formar pares de bases complementarias. Su capacidad para plegarse en varias estructuras secundarias y terciarias7 abre la posibilidad de diseñar diferentes conformaciones que sean capaces de un reconocimiento molecular específico de sus dianas afines. Los aptámeros de ARN son propensos a generar estructuras 3D más complejas que los aptámeros de ADN y, por lo general, muestran una mayor afinidad y especificidad de unión6. Los triples pares de bases, las interacciones hidrófobas y electrostáticas, las fuerzas de van der Waals, la complementariedad de la forma y el apilamiento de bases se combinan para generar estructuras plegadas y sitios activos protegidos que determinan su afinidad y especificidad de unión. Por todos estos motivos, los aptámeros se encuentran entre las clases más importantes de moléculas de fármacos y su desarrollo se ve facilitado por la evolución sistemática de ligandos mediante estrategias de enriquecimiento exponencial (SELEX)89. Este método eficaz de producir aptámeros de alta afinidad se basa en la generación de una biblioteca combinatoria de oligonucleótidos (alrededor de 1015). Estas bibliotecas deben contener una gran cantidad de oligonucleótidos de secuencia aleatoria para maximizar las posibilidades de seleccionar buenos candidatos. Como alternativa a la síntesis química de oligonucleótidos aleatorios en la primera etapa de la selección de aptámeros, la ingeniería de ADN polimerasas diseñadas para sintetizar ácidos nucleicos (ARN y ADN) de manera aleatoria puede convertirse en la vanguardia de SELEX.
In vivo, las ADN polimerasas son cruciales para la replicación del ADN y el mantenimiento del genoma y, por lo tanto, su papel es fundamental para la propagación de la información genética. Todas las ADN polimerasas que se encuentran en eucariotas, procariotas, arqueas y virus se han clasificado en subfamilias según su estructura y similitud de secuencia primaria1011. Por su función inherente, las ADN polimerasas replicativas copian el ADN molde con alta fidelidad y, en consecuencia, su actividad nativa es de uso limitado para aplicaciones en biología sintética moderna, que busca construir polímeros de ácidos nucleicos novedosos y versátiles. De hecho, las ADN polimerasas tienen un sitio activo que está configurado para incorporar los cuatro desoxirribonucleótidos canónicos y excluir nucleótidos "alterados" o modificados durante el metabolismo celular.
Los miembros representativos de la familia A con una estructura cristalina conocida son la ADN Pol I de£. coli11 y la ADN Pol I de T. aquaticus 12 en procariotas y la ADN Pol del fago T713 en virus; en eucariotas, Pol theta (Pol 0) participa en la reparación de las roturas de doble cadena (DSB) del ADN en el proceso denominado Unión de extremos no homólogos (NHEJ))14-16, pol nu (pol v) en la reparación de los entrecruzamientos del ADN que ocurren durante la recombinación homóloga (HR) y Pol gamma (Pol y) está implicada en la replicación del ADN mitocondrial17. Muy recientemente, se ha descrito que la Pol theta humana muestra una fuerte actividad de transferasa terminal que es patente cuando cambia entre tres mecanismos diferentes durante la unión de extremos alternativos (alt-EJ)1819. De hecho, la Pol theta humana es capaz de realizar la extensión del ADN sin molde, así como la replicación instruida que está basada en cis o en trans de las DSB. El mismo estudio reveló que la actividad de la transferasa sin molde aumenta en presencia de iones divalentes de manganeso y puede combinarse aleatoriamente con la extensión del molde en el extremo 3' de un cebador de ácido nucleico.
La otra familia de ADN polimerasas que tiene alguna actividad nucleotidiltransferasa significativa es la familia pol X, especialmente en eucariotas (Pol beta (Pol p), Pol lambda (Pol A), Pol mu (Pol |j), y TdT)2021. Esta actividad suele potenciarse en presencia de iones de metales de transición. Entre ellos, se describe la TdT (desoxinucleotidiltransferasa terminal) para catalizar la adición aleatoria de nucleótidos sin molde en las uniones V(D)J para aumentar la diversidad del receptor de antígeno182223 Además de esta propiedad, estudios previos revelaron que la TdT incorpora indiscriminadamente ribonucleótidos (NTP) y desoxirribonucleótidos (dNTP)2425 pero luego no logra extenderlo más allá de 4-5 nucleótidos porque el cebador ya no es un ADN sino un ARN. Esta observación es compatible con la estructura cristalina conocida de la TdT murina en la que ninguno de los residuos de proteína parecía actuar como barrera estérica cerca de la posición 2' o 3' del azúcar ddATP25. Sin embargo, diseñar TdT para que acepte un cebador de ARN parece todo un desafío, dada la conformación del cebador en la estructura del complejo terciario, donde la conformación de la hebra del cebador es un B-ADN, al contrario de lo que se esperaría para un cebador de ARN (A-ADN).
Los NTP se diferencian de los dNTP solo por la presencia de un grupo hidroxilo adicional en la posición 2' de la ribosa. Se demostró que la Pol theta humana incorporaba los NTP mejor que la TdT18 y permitió la síntesis de polímeros largos de ARN, aunque con bajos rendimientos. La predisposición conjunta de tales ADN polimerasas (Pol theta y TdT), para i) realizar la incorporación aleatoria de nucleótidos sin molde y ii) la posibilidad de tolerar tanto NTP como dNTP y otros nucleótidos modificados, abre el camino para crear una nueva máquina sintética de ácido nucleico. Esto sugiere que la biblioteca de ARN aleatoria podría generarse enzimáticamente mucho más fácilmente sin la necesidad de la etapa de transcripción inversa de los fragmentos de ADN durante SELEX.
Existe una necesidad en la técnica de algunos mutantes theta de la ADN polimerasa capaces de incorporar una gran diversidad de análogos nucleicos y generar polímeros largos de ácidos nucleicos, capaces de aumentar el muestreo así como mejorar la estabilidad, la afinidad y la especificidad de ácidos nucleicos funcionales tales como aptámeros de ARN.
Objeto de la invención
La invención se refiere a ADN polimerasas mutantes de la subfamilia Pol theta capaces de realizar una extensión de ácido nucleico sin molde, o un fragmento funcional de dicha polimerasa, métodos para producir estas ADN polimerasas mutantes y usos y métodos de uso de estas ADN polimerasas mutantes.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2322, 2328, 2334, 2335, 2384, 2387 y 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1. En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: una sustitución de Prolina (P) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2322, una sustitución de Alanina (A) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2328, una sustitución de Leucina (L) por un aminoácido alifático en la posición 2334, una sustitución de Ácido glutámico (E) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2335, una sustitución de Glutamina (Q) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2384, una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2387, y una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2322, en donde el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2322, en donde el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2328, en donde el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Glicina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2328, en donde el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2334, en donde el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2335, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2335, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2384, en donde el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por una Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2384, en donde el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Asparagina (N), Serina (S) y T reonina (T), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2387, en donde el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y T riptófano (W), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2387, en donde el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2391, en donde el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y T riptófano (W), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2391, en donde el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), y sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones 2334 y 2335, determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1. En diversas realizaciones, el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A), y preferentemente por una Metionina (M). En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G), Alanina (A), Treonina (T) y Serina (S), y preferentemente por una Glicina (G).
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende una doble sustitución de aminoácidos L2334M y E2335G, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma, un vector de ADN que comprende estos ácidos nucleicos y una célula hospedadora que comprende estos vectores.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta o un fragmento funcional de la misma, que comprende sustituir al menos un aminoácido en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2322, 2328, 2334, 2335, 2384, 2387 y 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca el uso de los ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras de la invención para producir una ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para producir una ADN polimerasa mutante cultivando la célula hospedadora de la invención en condiciones de cultivo que permitan la expresión del polinucleótido que codifica dicho mutante y, opcionalmente, recuperar dicho mutante así expresado del medio de cultivo o células hospedadoras.
En una realización, la invención abarca un método para incorporar nucleótidos sin molde que comprende incubar la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma con nucleótidos trifosfato en condiciones que permiten la incorporación de nucleótidos en ausencia de un molde.
En una realización, la invención abarca el uso de la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma, para la incorporación de nucleótidos sin molde.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para producir secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias que comprende incubar la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma con nucleótidos trifosfato en condiciones que permitan la incorporación de nucleótidos degenerados o aleatorios para producir secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. En algunas realizaciones, se puede añadir una secuencia de nucleótidos fija al extremo 3' de las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. En algunas realizaciones, se pueden amplificar las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. En algunas realizaciones, las secuencias amplificadas se pueden clonar en un vector para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
En una realización, la invención abarca el uso de la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma para generar una biblioteca de aptámeros.
En diversas realizaciones, la invención abarca un kit para generar una biblioteca de aptámeros que comprende la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma. En algunas realizaciones, el kit comprende reactivos para la incorporación de nucleótidos degenerados o aleatorios. En algunas realizaciones, el kit comprende un vector para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
Descripción de las figuras
Figura 1A-B. Alineamiento de secuencia del subdominio Dedos (restos 2333-2474) de la Pol theta (Pol0) y las polimerasas de la familia A relacionadas.
(a) Los restos estrictamente conservados se muestran resaltados y los motivos conservados están encuadrados en un rectángulo. Los asteriscos indican el aspartato catalítico estrictamente conservado (D2330 y D2540) y el glutamato (E2541) del subdominio palma que coordina el catión divalente en la pol theta (pol 0) humana (Zahn et al. 2015). Los triángulos indican los restos conservados que fueron mutados en este estudio y aquellos que son potencialmente mutables para conferir actividad nucleotidiltransferasa a la pol theta (pol 0) humana. Las estructuras secundarias basadas en el id. del PDB. (4X0P) de la pol theta (pol 0) humana se representan en la parte superior del alineamiento múltiple. Pol theta humana (N.° de registro de UniProtKB/Swiss-Prot 075417.2; SEQ ID NO: 1); Pol theta de ratón (N.° de registro de UniProtKB/Swiss-Prot Q8CGS6.2; SEQ ID NO: 2); Pol theta del pez cebra (N.° de registro de NCBI XP_021329106.1; SEQ ID NO: 3); Pol theta mus308 de la mosca de la fruta UniProtKB/Swiss-Prot: 018475,1; SEQ ID NO: 4); Pol nu humana (N.° de registro de UniProtKB/Swiss-Prot Q7Z5Q5.2; SEQ ID NO: 5); Pol nu de ratón (N.° de registro de UniProtKB/Swiss-Prot Q7TQ07.2; SEQ ID NO: 6); Taq pol I (N.° de registro de GenBank BAA06033.1; SEQ ID NO: 7); ADN pol I de Geobacillus stearothermophilus (GenBank: AAC37139.1; SEQ ID NO: 8); Fragmento Klenow de la ADN Pol de E. coli (N.° de registro de PDB 1D8Y_A; SEQ ID NO: 9); ADN pol de E. coli (N.° de registro de UniProtKB/Swiss-Prot P00582.1; SEQ ID NO: 10).
(b) Comparación de secuencia del motivo A de Taq pol I y pol theta (pol 0) humana, se menciona el resto inmutable D610 mientras que los restos que toleran un amplio espectro de sustitución se muestran según la naturaleza del aminoácido que aceptan. Taq pol I motivo A (LlVAl Dy SQIELRVLAH; SEQ ID NO: 11). Pol theta humana motivo A (SILAADYSQLELRILAH; SEQ ID NO: 12).
Figura 2A-C. Estructura del dominio de la polimerasa pol theta (pol 6) humana (restos 1792-2590).
(a) Representación de la superficie de la pol theta (pol 0) humana (PDB 4X0P) que muestra el patrón de plegado de una mano derecha con los tres subdominios: los dedos, la palma y el pulgar. Se inserta un cebador de ADN entre la palma y los dedos y donde se alargará en el sitio catalítico. También se muestra el dominio de tipo exo N-terminal.
(b) Superposición de Taq pol I (1QSY) y pol theta (pol0) humana (4X0P) donde ambas enzimas se muestran en modelos de barras. Una vista estéreo ampliada del subdominio de los dedos muestra los restos E615 (1QSY) en comparación con E2335 (4X0P) en la proximidad cerrada del nucleótido entrante (ddATP) frente a los cebadores de ADN (para 4X0P y para 1Qs Y).
(c) Diagrama en cinta de la estructura ddATP-Ca2+ del subdominio dedos alrededor del sitio catalítico. Los carboxilatos estrictamente conservados (D2330, D2540 y E2541) que coordinan los cationes metálicos, los restos mutables (L2334, E2335, Q2384, Y2387 e Y2391) se muestran como barras. El ddATP entrante se muestra en modelos de bola y barra y se muestra el cebador de ADNmc (extremo 3').
Figura 3. Actividad desoxinucleotidiltransferasa de la pol theta (pol 0)WT humana y sus respectivos mutantes.
Gel desnaturalizante que muestra variantes de pol 0 en presencia de cationes Mn2+ y cada uno de los cuatro dNTP (A, T, C, G) y la mezcla (N). Un ADNmc de 14 nucleótidos (5'TACGCATTAGCAt A; SEQ ID NO: 13) sirve como cebador que se extiende y forma homopolímeros o heteropolímeros largos que llegan hasta 150-200 nt. La extensión del cebador de tres mutantes (NM11, CS13 y GC10) también se muestra en las mismas condiciones que la pol theta (pol 0) WT. Las reacciones se detuvieron después de 30 minutos de incubación.
Figura 4A-D. Actividad ribonucleotidiltransferasa de la pol theta (pol 0)WT humana y sus respectivos mutantes.
(a) y (c) Gel desnaturalizante que muestra variantes de pol 0 en presencia de cationes Mn2+ y cada uno de los cuatro NTP (A, U, C, G, 0,5 mM cada uno) y la mezcla (N, 0,5 mM cada uno). Un ADNmc de 14 nucleótidos (5'TACGCATTAGCATA; SEQ ID NO: 13) sirve como cebador que se extiende y forma homopolímeros o heteropolímeros largos que llegan hasta 150-200 nt. La extensión con cebador de cuatro mutantes: NM11, CS13, GC10 y DW9 (a) o cinco mutantes: NM11, CS13, GC10, DW9 y MC15 (c) también se muestran en las mismas condiciones que la pol 0WT. Las reacciones se detuvieron después de 30 minutos de incubación. (b) y (d) Evolución temporal de un cebador de ADNmc de 14 nucleótidos (5'TACGCATTAGCATA; SEQ ID NO: 13) por el mutante CS13 en presencia de una mezcla estequiométrica de los cuatro NTP (0,5 mM cada uno). En cada tiempo indicado: 0 s a 30 min (b) o 0 s a 60 min (d), la reacción se detuvo mediante la adición de azul de formamida.
Figura 5A-C. Representaciones en cinta del bolsillo de unión a nucleótidos del dominio de la polimerasa pol theta (pol 0) humana (4X0P).
(a) Estructura ddATP-Ca2+-pol theta (pol0)WT que muestra la posición de E2335 hacia el nucleótido entrante.
(b) Modelo teórico de la estructura ATP-Mn2+-pol theta (pol0)WT que representa el impedimento estérico entre el resto E2335 y el resto de azúcar del nucleótido.
(c) Modelo teórico de la estructura ATP-Mn2+-pol theta (pol0)E2335G que muestra el espaciado del bolsillo de unión de nucleótidos cuando el resto de glutamato se sustituye por un resto de glicina.
Figura 6A-J. Fragmentación por HPLC de los ribonucleósidos obtenidos tras la hidrólisis enzimática de ARN sintéticos.
(a) y (f) Cromatograma de las soluciones patrón de los cuatro ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina y citidina a concentraciones de 0,1 mM (a) o 0,25 mM (f) en tampón de digestión), los tiempos de retención y la base correspondiente a cada pico se muestran en la parte superior de cada pico.
(b) e (i) Hidrolizado de ARN obtenido de una mezcla equimolar de ATP y CTP.
(c) y (j) Hidrolizado de ARN obtenido de una mezcla equimolar de GTP y UTP.
(d) y (g) Hidrolizado de ARN obtenido de una mezcla equimolar de los cuatro NTP.
(e) y (h) Hidrolizado de ARN obtenido de una mezcla que contiene ATP/CTP/GTP/UTP en una proporción molar de 1:1:1:10.
Figura 7A-D. Análisis estadístico TruSeq 1: Ocurrencias de las lecturas en cada condición de síntesis ilustradas por un gráfico de diagrama de dispersión log-log.
(a) Condición 'N', mezcla de cuatro nucleótidos en una proporción de 1:1:1:1 (500 pM cada uno).
(b) Condición '10U' con 500 pM de ATP, CTP y GTP, y 5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:10).
(c) Condición '5U5C' con 500 pM de ATP y GTP y 2,5 mM de CTP y u Tp (proporción de 1:1:5:5).
(d) Condición '5U' con 500 pM de ATP, c Tp y g Tp y 2,5 mM de u Tp (proporción de 1:1:1:5).
Figura 8A-D. Análisis estadístico TruSeq 2: Frecuencia de nucleótidos por lectura representada mediante un gráfico de caja.
(a) Condición 'N', mezcla de cuatro nucleótidos en una proporción de 1:1:1:1 (500 pM cada uno).
(b) Condición '10U' con 500 pM de ATP, CTP y GTP, y 5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:10).
(c) Condición '5U5C' con 500 pM de ATP y GTP y 2,5 mM de CTP y u Tp (proporción de 1:1:5:5).
(d) Condición '5U' con 500 pM de ATP, c Tp y g Tp 2,5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:5).
Figura 9A-D. Análisis estadístico TruSeq 3: Proporción de nucleótidos por ciclo de incorporación ilustrada por un gráfico de barras apiladas.
(a) Condición 'N', mezcla de cuatro nucleótidos en una proporción de 1:1:1:1 (500 pM cada uno).
(b) Condición '10U' con 500 pM de ATP, CTP y GTP, y 5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:10).
(c) Condición '5U5C' con 500 pM de ATP y GTP y 2,5 mM de CTP y UTP (proporción de 1:1:5:5).
(d) Condición '5U' con 500 pM de ATP, c Tp y g Tp 2,5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:5).
Figura 10A-D. Análisis estadístico TruSeq 4: Matriz de transición de nucleótidos que ilustra la proporción de AICIGIU añadidos después de un nucleótido dado, gráfico de barras apiladas horizontalmente.
(a) Condición 'N', mezcla de cuatro nucleótidos en una proporción de 1:1:1:1 (500 pM cada uno).
(b) Condición '10U' con 500 pM de ATP, CTP y GTP, y 5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:10).
(c) Condición '5U5C' con 500 pM de ATP y GTP y 2,5 mM de CTP y u Tp (proporción de 1:1:5:5).
(d) Condición '5U' con 500 pM de ATP, c Tp y g Tp 2,5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:5).
Figura 11. Incorporación de nucleótidos modificados por la theta (pol0) CS13. Los siguientes análogos se aceptaron con éxito y se pueden dividir en dos clases; los que formaron polímeros: (1) 2'-Fluoro-dUTP, (2) 2'-Fluoro-dATP, (3) 2'-Fluoro-dCTP, (4) 2'-Fluoro-dGTP, (5) 2'-Fluoro-dTTP, (6) 2'-Amino-dATP, (7) 5-metil-UTP, (8) Ara-ATP (vidarabina trifosfato), (9) Ara-CTP (citarabina trifosfato), (10) 2'-O-metil-ATP, (11) 2'-O-metil-CTP, (12) épsilon(£)-ATP, (13) 2-Aminopurina, (14) FAnA, (15) 5EUTP, (16) Control sin NTP; y los que se detuvieron después de una incorporación (debido a la falta de un 3'OH y/o la presencia de un grupo 3' modificado o bloqueado): (17) O-CH3-ddTTP, (18) 2'-Amino-dTTP, (19) 3'-Amino-ddGTP, (20) N3-ddGTP, (21) N3-ddTTP, (22) 3'-desoxi-ATP, (23) 3'-desoxi-UTP, (24) 3'-desoxi-CTP, (25) 3'-desoxi-GTP, (26) 3'-desoxi-NTP. Las reacciones se realizaron en las mismas condiciones que con los NTP naturales en presencia de Mn2+ usando un cebador de ADNmc de 14 nucleótidos (5'TACGCATTAGCATA; SEQ ID NO: 13).
Figura 12. Distribución del ribonucleósido en función de la composición del sustrato de ribonucleótido añadido al mutante CS13.
Figura 13. Ligación de una región constante al extremo 3' del conjunto de ARN sintetizados por la pol 0-DW9 mutante y usando una ARN ligasa de T4. Evolución temporal de la elongación de un cebador de ARNmc de 15 nucleótidos por el mutante DW9 en presencia de una mezcla estequiométrica de los cuatro NTP (0,5 mM cada uno) y separados en un gel de acrilamida al 8 % desnaturalizante. En cada tiempo indicado (5 s, 30 s, 1 min, 5 min y 15 min), la reacción se detuvo mediante la adición de azul de formamida. (1) Control: cebador de ARN ARNlig sin enzima. (2) Control de elongación después de 5 seg. (3) Control de elongación después de 30 seg. (4) Control de elongación después de 1 min. (5) Control de elongación después de 5 min. (6) Control de elongación después de 15 min. (7) Ligación después de elongación de 5 seg (+15). (8) Ligación después de elongación de 30 seg (+15). (9). Ligación después de elongación de 1 min (+15). (10). Ligación después de elongación de 5 min (+15). (11). Ligación después de elongación de 15 min (+15). (12) Control de autoligación.
(AlexaFluor488) La señal de fluorescencia muestra la presencia y la elongación de todos los fragmentos de ARN que contienen el cebador de ARN marcado con 5'Alexa-fluor (AlexaFluor488-UACGCAUUAGCAAUG; SEQ ID NO: 14).
(CY5) La señal de fluorescencia muestra los fragmentos que se han ligado con la región constante (oligonucleótido ARNlig-Cy5 5'P-UUAUGCUAAUGUCCC-3'-CY5; SEQ ID NO: 15) en el extremo 3' por la ARN ligasa de T4. (Fusionadas) Las señales de Alexa-fluor y CY5 se han fusionado para evaluar mejor la calidad de las reacciones (elongación ligación).
Figura 14. Incorporación de nucleótidos modificados por pol theta (pol0) WT en comparación con la pol0 CS13.
Se ensayaron los siguientes análogos para determinar la elongación del cebador de ADNmc (5'TACGCATTAGCATA; SEQ ID NO: 13) por la pol0 CS13 comparado con pol0. (1) 2'-Amino-dATP, (2) 2'-AminodUTP, (3) 2'-Amino-dCTP, (4) 2'-Amino-dGTP, (5) mezcla de 2'-Amino-dATP/dUTP/dCTP/dGTP, (6) 2'-O-metildATP, (7) 2'-0-metil-dUTP, (8) 2'-0-metil-dCTP, (9) 2'-0-metil-dGTP, (10) mezcla de 2'-0-metildATP/dUTP/dCTP/dGTP, (11) 2'-azido-2'-dATP, (12) 2'-azido-2'-dUTP, (13) 2'-azido-2'-dCTP, (14) 2'-azido-2'-dGTP, (15) mezcla de 2'-azido-2'-dATP/dUTP/dCTP/dGTP, (16) 2'-Fluoro-dATP, (17) 2'-Fluoro-dUTP, (18) 2'-Fluoro-dCTP, (19) 2'-Fluoro-dGTP, (20) 2'-Fluoro-dTTP, (21) mezcla de 2'-Fluoro-dATP/dUTP/dCTP/dGTP (22) Ara-ATP (vidarabina trifosfato), (23) Ara-CTP (citarabina trifosfato), (24) mezcla de Ara-ATP y Ara-CTP, (25) épsilon(£)-ATP, (26) 2-aminopurina ribósido trifosfato. Las reacciones se realizaron en las mismas condiciones que con los NTP naturales en presencia de Mn2+.
Figura 15. Incorporación de nucleótidos modificados por pol0 DW9. Se ensayaron los siguientes análogos para determinar la elongación del cebador de ADNmc (5'TACGCATTAGCATA; Se Q ID NO: 13) por la pol0 DW9 comparado con pol0. (1) 2'-Amino-dATP, (2) 2'-Amino-dUTP, (3) 2'-Amino-dCTP, (4) 2'-Amino-dGTP, (5) mezcla de 2'-Amino-dATP/dUTP/dCTP/dGTP, (6) 2'-0 -metil-dATP, (7) 2'-0 -metil-dUTP, (8) 2'-0 -metil-dCTP, (9) 2'-0 -metil-dGTP, (10) mezcla de 2'-0-metil-dATP/dUTP/dCTP/dGTP, (11) 2'-azido-2'-dATP, (12) 2'-azido-2'-dUTP, (13) 2'-azido-2'-dCTP, (14) 2'-azido-2'-dGTP, (15) mezcla de 2'-azido-2'-dATP/dUTP/dCTP/dGTP, (16) 2'-Fluoro-dATP, (17) 2'-Fluoro-dUTP, (18) 2'-Fluoro-dCTP, (19) 2'-Fluoro-dGTP, (20) 2'-Fluoro-dTTP, (21) Ara-ATP (vidarabina trifosfato), (22) Ara-CTP (citarabina trifosfato), (23) épsilon(£)-ATP (24) 2,6-diaminopurina ribósido trifosfato. Las reacciones se realizaron en las mismas condiciones que con los NTP naturales en presencia de Mn2+.
Descripción detallada de la invención
La solicitud se refiere a la materia objeto de estudio según se define en las reivindicaciones presentadas y descritas en el presente documento. En la solicitud, a menos que se especifique lo contrario o que el contexto indique lo contrario, todos los términos tienen su significado ordinario en el campo o campos relevantes.
Los ácidos nucleicos funcionales, en particular los aptámeros de ácidos nucleicos, pueden presentar ventajas y propiedades valiosas en comparación con las terapias de proteínas en términos de tamaño, accesibilidad sintética, afinidad y especificidad. Como estas moléculas pueden seleccionarse de grupos de oligonucleótidos de secuencia aleatoria, la ingeniería de ADN o ARN polimerasas sigue siendo la base de la síntesis enzimática exitosa de análogos de ácidos nucleicos funcionales.
La presente invención proporciona mutantes de ADN polimerasa de la familia A que pueden incorporar de manera eficiente nucleótidos naturales o modificados, particularmente, ribonucleótidos en el extremo 3' de un ácido nucleico, lo que da como resultado polímeros largos que podrían servir como biblioteca para la selección de ácidos nucleicos funcionales, en particular aptámeros o ribozimas. Se generaron cinco mutantes de ADN polimerasa (denominados CS13, DW9, MC15, NM11 y GC10) y las mutaciones se centraron en los restos ubicados en las proximidades del sitio catalítico.
Se ha realizado la caracterización funcional de cada mutante y dos candidatos prometedores (CS13 y DW9) pudieron mostrar una eficiencia mejorada para incorporar los cuatro ribonucleótidos naturales (ATP, UTP, CTP y GTP) en comparación con el tipo silvestre.
Como resultado, se obtuvieron homopolímeros o heteropolímeros largos de ribonucleótidos cuya longitud es muy variable (20-300 nt) y puede controlarse por la duración de la reacción, que necesita iones Mn2+. El análisis por HPLC de los ribonucleósidos resultantes obtenidos después de la digestión enzimática del ARN recién sintetizado también mostró la misma probabilidad de incorporación de los cuatro ribonucleótidos y la aleatoriedad de las secuencias se confirmó después de la secuenciación del ARN. Además, también se ha investigado la incorporación de desoxi y ribonucleótidos. Los siguientes análogos fueron aceptados con éxito por al menos un mutante prometedor: 2'-FluorodNTP (2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, y mezclas de los mismos); 2'-Amino-dNTP (2'-Amino-dATP, 2'-Amino-dUTP, 2'-Amino-dTTP; 2'-Amino-dCTP, 2'-Amino-dGTP, y mezclas de los mismos); 2-O-metil-dNTP (2-O-metil-dATP, 2'-0-metil-dUTP, 2'-0-metil-dCTP, 2'-0-metil-dGTP, y mezclas de los mismos), 2'-N3-dNTP (2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP, y mezclas de los mismos); O-CH3-ddTTP, 3'-Amino-ddGTP, N3-ddGTP, N3-ddTTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, 3'-desoxi-ATP, 3'-desoxi-UTP, 3'-desoxi-CTP, 3'-desoxi-GTP, 3'-desoxi-NTP, épsilon(£)-ATP, 2-Aminopurina ribósido trifosfato, FANA (9-(2'-Fluoro-2'-desoxi-p-D-arabinofuranosil) adenina), 5-etinil-UTP, y 5-metil-UTP. Estas propiedades de la ADN polimerasa contribuirán a ampliar la aplicabilidad de los ácidos nucleicos modificados químicamente en la biología del ARN, el diagnóstico médico y las estrategias de reconocimiento molecular. Con este trabajo, puede surgir una caja de herramientas versátil para la funcionalización del ARN y el ADN y para el diseño de aptámeros.
Mutantes de pol theta con nuevas propiedades
Las ADN polimerasas contienen un sitio activo con motivos altamente conservados que se pueden superponer estructuralmente dentro de cada familia. Varios estudios mostraron que la mayoría de las ADN polimerasas comparten dos regiones conservadas, motivos A y C, que se encuentran en el subdominio de la palma28. El motivo A contiene un aspartato estrictamente conservado en la unión de una cadena beta (p) y una hélice alfa (a), mientras que el motivo C contiene dos restos de carboxilato (Asp o Glu) en un motivo estructural beta-vuelta-beta10. En el caso de la pol theta (pol0) humana, el aspartato catalítico conservado estrictamente (D2330) se encuentra entre beta12 (p12) y alfa9 (a9) y forma parte de un motivo estrictamente conservado (DYSQLELR) en las diferentes pol theta (pol 0) (Figura 1a). Este aspartato catalítico corresponde a D610 en la Taq ADN polimerasa I que interactúa con el dNTP entrante y estabiliza el estado de transición que conduce a la formación de enlaces fosfodiéster29. Este motivo de secuencia (DYSQLELR) está excepcionalmente bien conservado en las polimerasas de la familia A y dentro de la familia Pol I13 como se describe en la Figura 1 para pol theta (pol 0), pol nu (pol v) y pol I bacteriana. Estudios anteriores demostraron que la mutación del aspartato catalítico (D610) alteraba completamente la actividad de la polimerasa y era inmutable mientras que las mutaciones sistemáticas de los otros 13 restos (605 a 617) incluyendo la región más conservada (DYSQLELR) del motivo A de la Taq ADN pol I mostraban que algunas posiciones toleraban un amplio espectro de sustituciones (L605, L606, V607, a 608, l609, S612, 1614, R617). Por otra parte, los restos restantes toleraron principalmente sustituciones conservadoras (Y611, Q613, E615 y L617). El resto S612 era altamente mutable y aceptaba sustituciones que son de diversos tamaños e hidrofobicidad manteniendo la actividad de tipo WT28. El alineamiento de las secuencias de pol theta (pol0) humana y Taq pol I (Figura 1b) ilustra la conservación del DYSQLELR y muestra los restos principales correspondientes a la secuencia de pol theta (pol0) (D610 corresponde a D2330, D615 a D2335). Los mismos autores describieron que los restos Y611, q 613, E615 y L617 estaban involucrados en la unión de dNTP, y especialmente E615 que forma un enlace de hidrógeno con Y671 (un resto ubicado en la hélice O dentro del motivo dedos y se apila con el resto base del dNTP entrante). Los inventores siguen esta línea de razonamiento para la pol theta (pol 0) humana con el objetivo de ampliar su especificidad de sustrato para aceptar NTP naturales y modificados. De hecho, buenos candidatos para mutaciones dirigidas al sitio son L2334, E2335, A2328 dentro del motivo A y también el resto Y2387 en el motivo B (correspondiente a Y671 en Taq pol I).
La estructura cristalina del dominio polimerasa de pol theta (pol 0) (restos 1792-2590; PDB 4X0P)1526 revela la misma topología de tipo mano derecha que se observa en los homólogos bacterianos y fagos. La representación de la superficie de pol theta (pol 0) (Figura 2a) ilustra los tres subdominios (dedos, palma y pulgar) y un subdominio exonucleasa N-terminal. La hebra de ADN se desliza en el sitio catalítico entre los dedos y la palma, donde los restos del motivo A constituyen la unión entre las dos partes. Cuando pol theta (pol 0) se superpone con Taq pol I (1QSY) (Figura 2b), ambas estructuras mostraron una conformación general cerrada. Los restos E6l5 (1QSY) y E2335 (4X0P) están orientados de manera similar hacia el nucleótido entrante y pueden interactuar con el resto de azúcar del nucleótido. Taq pol I ha sido ampliamente estudiada y diversificada para aumentar su capacidad de incorporar NTP y nucleótidos modificados30. Se generaron bibliotecas de Taq pol I diversificando los restos 611-617 que incluyen el bolsillo de unión de nucleótidos y el resto de puerta estérica E615. Entre los diferentes mutantes de Taq pol I, I614K y un mutante de múltiples sitios SFR3 (A597T, W604R, L605Q, I614K, E615G) mostraron la capacidad de incorporar NTP después de la selección de autorreplicación compartimentalizada de parches cortos (spCSR)30 mientras que no se observó extensión del cebador detectable por la Taq pol I wt. Sin embargo, el mejor mutante pudo incorporar hasta 6 NTP en presencia de Mg2+ y hasta 14 NTP cuando se usa Mn2+ en lugar de Mg++.
A la luz de la estrecha similitud de la región descrita de Taq pol I y pol theta (pol 0) humana (Figura 1b), los inventores se centraron en el resto de puerta estérica correspondiente E2335 y el resto inmediatamente próximo L2334. A continuación, los inventores también analizaron los restos ubicados en la región proximal del bolsillo de unión de nucleótidos (P2322, A2328, Q2384, Y2387 y Y2391). La representación de cinta de la pol theta (pol 0) humana (Figura 2c) representa la organización espacial del sitio catalítico con los carboxilatos estrictamente conservados (D2330, D2540 y E2541) que quelan el ion metálico. En la proximidad inmediata de la tríada catalítica, los restos E2335 se enfrentan al nucleótido entrante donde su grupo carboxilato es susceptible de interactuar con el C2' de la ribosa del nucleótido (ddATP) y de formar también un enlace de hidrógeno con el resto Y2387 y/o Y2391. El papel de E2335 como puerta estérica puede residir en el hecho de que existiría una restricción estérica si el C2' de la ribosa contiene un grupo hidroxilo (Figura 5). Asimismo, la propiedad polar de E2335 puede desempeñar un papel en la formación de un puente salino. Por otra parte, se ha descrito que el resto Y2387 interactúa con el fosfato beta (p) del nucleótido entrante15 y el ciclo aromático se apila junto a la base de nucleótido.
Incorporación de NTP de los mutantes diseñados: el papel fundamental del resto de la puerta estérica
Ya se ha descrito que la pol theta (pol 0) WT humana tiene la capacidad de incorporar NTP18 sin molde desde el extremo 3' de un cebador de ADNmc o ARNmc, aunque con un bajo rendimiento. Sin embargo, ya es evidente que la pol theta (pol 0) humana muestra una actividad nucleotidiltransferasa mejorada en comparación con la desoxinucleotidiltransferasa terminal (TdT) en presencia de NTP, la cual detuvo la elongación después de 5-6 adiciones.
Con el objetivo de seleccionar el mejor mutante de pol theta (pol 0) humana con una incorporación mejorada de NTP, los inventores procedieron a evaluar la capacidad para alargar un cebador de ADNmc a través de un ensayo de nucleotidiltransferasa. Se realizó mutagénesis dirigida a uno o dos sitios que condujo a la generación de los siguientes mutantes: NM11 (Y2387F), CS13 (E2335G), GC10 (P2322V), DW9 (L2334M-E2335G) y MC15 (A2328V).
Las bacterias que contienen estos mutantes se depositaron en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 París, FR, el 14 de septiembre de 2017, con los números de depósito CNCM I-5238 (E.coli A1-1791_CS13); CNCM I-5239 (E.coli A1-1791_DW9); CNCM I-5240 (E.coli A1-1791_MC15); y CNCM 1-5241 (E.coli A1-1791_NM11).
La actividad de tipo wt se probó primero con los dNTP (Figura 3) y todos los mutantes probados retuvieron la actividad nativa ya que incorporaron los cuatro dNTP naturales y generaron fragmentos de longitud de hasta 200 nt como la pol theta (pol 0) WT en presencia de 5 mM de Mn2+. Cuando los dNTP se sustituían por cada NTP (ATP, UTP, CTP, g Tp ) la pol theta (pol 0)Wt mostraba resultados similares a los previamente descritos18. ATP y GTP (bases de purina) son bien toleradas por la pol 0WT y se obtuvieron homopolímeros de longitud media de A y G (hasta 50-70 nt). Se incorporaron u Tp y CTP pero la elongación se detuvo después de algunas adiciones. Los mutantes NM11 y GC10 no pudieron incorporar más de 3 o 4 NTP. Sorprendentemente, el mutante CS13 fue particularmente eficaz ya que se incorporaron fácilmente más de 50 de cada ribonucleótido, excepto UTP que formó homopolímeros de U cuya longitud alcanzó sólo hasta 15 nt, una longitud mayor de lo que añadiría la pol 0WT. Asimismo, cuando los cuatro NTP se mezclaron, la elongación mejoró claramente en comparación con la enzima de tipo silvestre, ya que el 100 % del cebador se extendió y los heteropolímeros sintetizados alcanzaron más de 200 nt en 30 min (Figura 4a y 4c). Los mutantes DW9 y MC15 también se probaron para determinar su tasa de incorporación de NTP: MC15 no mostró una mejor eficiencia que el tipo silvestre (Figura 4c) mientras que DW9 mostró una eficiencia comparable al mutante CS13 (Figura 4a y 4c). En general, los mejores mutantes son CS13 y DW9, que portan ambos la mutación E2335G, con una especificidad de sustrato significativamente alterada hacia los ribonucleótidos y con una procesividad mejorada de la extensión de la molécula de ARN en comparación con la pol 0WT. También abre el camino para investigar la incorporación de nucleótidos modificados por los mismos mutantes.
En la perspectiva de generar una biblioteca de secuencias aleatorias de ARN con longitudes de fragmentos controladas, la cinética de extensión del cebador se realizó en las mismas condiciones y se permitió controlar la longitud de los productos en función del tiempo de reacción. En el caso de los fragmentos de ARN de 20-30 nt, 1 min de reacción es suficiente para completar la síntesis, lo que acorta significativamente el proceso SELEX de ensamblaje de aptámeros (Figura 4b y 4d).
Modelo estructural de incorporación de ribonucleótidos por el mutante CS13
El mutante CS13 presentó una actividad eficiente (ribo)nucleotidiltransferasa al extender un cebador de ADNmc de 14 nucleótidos en presencia de Mn2+. Este nuevo atributo lo proporciona la sustitución del resto de glutamato cargado E2335 por el resto de glicina pequeño y flexible. El resto de la puerta estérica E2335 se encuentra muy cerca del resto de azúcar del nucleótido entrante. En el caso de la estructura ddATP-pol theta (pol 0) (código 4X0P PDB), el grupo carboxilato del glutamato no interfiere con el posicionamiento del nucleótido (Figura 5a). En el caso de los NTP, la presencia del grupo hidroxilo en la posición C2' crea obstáculos estéricos y restricciones electrostáticas entre el resto de azúcar y el bolsillo formado por los restos E2335, Y2387 y Y2391 (Figuras 2c y 5b). La mutación E2335G obviamente agranda el bolsillo de unión de nucleótidos y, de hecho, es compatible con una mayor capacidad de incorporar un ribonucleótido en el extremo 3' del cebador del ADNmc (Figura 5c). Se describieron observaciones similares para la ADN polimerasa del fago T7 de E. coli, el resto de ribosa del nucleótido entrante está alojado entre el anillo aromático del resto Y526 y los carbonos alifáticos de la cadena lateral E480, la cual a su vez está enlazada con hidrógeno al hidroxilo del Y53013 estrictamente conservado. La orientación espacial de estos restos forma un bolsillo hidrófobo en la posición C2' de la ribosa que podría excluir los ribonucleótidos del sitio activo, proporcionando así una base estructural para la fuerte discriminación contra la incorporación de ribonucleótidos por las ADN polimerasas13
El mutante CS13 incorpora igualmente los cuatro ribonucleótidos y genera una biblioteca de secuencias aleatorias de ARNmc.
El éxito de un método SELEX se basa en la calidad de la biblioteca de ácidos nucleicos inicial. Por lo tanto, la posibilidad de acceder a una gran colección de fragmentos de ARN o ADN de secuencia aleatoria es esencial. El mutante CS13 demostró una capacidad sobresaliente para alargar el cebador de ADN con ribonucleótidos. Para confirmar su valor añadido, la tasa de incorporación de los cuatro NTP se ha evaluado mediante análisis HPLC de la composición básica global de los ARN recién sintetizados. Los ARN se digirieron completamente en ribonucleósidos de acuerdo con un protocolo publicado27 antes de la separación por HPLC. El cromatograma de las soluciones patrón de los cuatro ribonucleósidos (adenosina, guanosina, uridina y citidina a concentraciones de 0,1 mM o 0,25 mM en el tampón de digestión) mostró cuatro picos eluidos a 5,55-5,60 min, 6,36-6,39 min, 7,82-7,90 min, 9,74-9,75 min respectivamente para citidina, uridina, guanosina y finalmente adenosina (Figura 6a y 6f). Los inventores estaban interesados en determinar si la composición de los NTP sustratos de ribonucleótidos iniciales en la mezcla de reacción de elongación tenía un efecto sobre la propensión de la polimerasa a incorporar un ribonucleótido a expensas de otro. Los geles desnaturalizantes de los productos generados por el mutante CS13 (Figura 4a y 4c) indicaron que en presencia de una proporción igual de los cuatro NTP (1:1:1:1 a 0,5 mM cada uno), se sintetizaban polímeros largos de ARN, pero no dan ninguna indicación sobre la distribución de cada NTP a lo largo de la secuencia. Sin embargo, la incorporación de cada uno de los cuatro NTP mostró diferentes tendencias cuando se usaron a 0,1 mM cada uno, ya que el UTP parecía ser menos integrado por la enzima. Estas diferencias ya no se observaron cuando se usaron los cuatro nucleótidos a 0,25 mM cada uno. Por consiguiente, los productos de reacción de los NTP (1:1:1:1) se limpiaron e hidrolizaron, y los ribonucleósidos resultantes se analizaron por HPLC (Figura 6d y 6 g). Asimismo, se preparó otra condición de síntesis que contenía UTP diez veces mayor (1:1:1:10) y se analizó de la misma forma (Figura 6e y 6h). Para ambas condiciones, se observaron cuatro picos, correspondientes al tiempo de retención de los cuatro nucleósidos, pero las áreas de pico calculadas de cada componente revelaron distribuciones diferentes (Tabla I, Figura 1). La mezcla inicial de los NTP 1:1:1:1 dio como resultado una dispersión global de 21 %mol C, 41 %mol G, 16 %mol A y 19 %mol U (Figura 6d) o 24,8 %mol C, 24,6 %mol G, 22,1 %mol A y 28,6 %mol U (Figura 6g), mientras que la mezcla inicial de NTP 1:1:1:10 dio 18 %mol C, 24 %mol G, 14 %mol A y 49 %mol U (Figura 6e) o 7,6 %mol C, 9,0 %mol G, 7,6 %mol A y 75,9 %mol U (Figura 6h). Este resultado puso de relieve la posibilidad de modificar la composición inicial del sustrato para modular o favorecer la incorporación de uno o varios nucleótidos especificados en los productos finales. Además, vale la pena señalar que la combinación equimolar de solo dos NTP (A/C; Figura 6b y 6i y U/G;
Figura 6c y 6j) presentaban una probabilidad igual de incorporación de ambos sustratos (aproximadamente 49 %mol C, 47 %mol A y 57 %mol G, 34 %mol U (Figura 6c); aproximadamente 55,8 %mol C, 44,2 %mol A y 51,9 %mol G, 48,1 %mol U (Figura 6j).
En resumen, los análisis de HPLC ayudaron a confirmar que el mutante CS13 acepta aproximadamente por igual los cuatro NTP naturales, lo que garantiza la aleatoriedad de la secuencia de cada fragmento sintetizado.
La secuenciación de los productos de ARN reveló más detalles sobre el comportamiento de incorporación de ribonucleótidos del mutante CS13. Para las diferentes condiciones probadas, la biblioteca de ARN mostró entre 5 y 14 millones de lecturas. Para toda la biblioteca, se estimó la ocurrencia de las diferentes secuencias y se representó como se ilustra en la Figura 7. Entre 12.733.722 lecturas en la muestra 'N', 8.766.652 lecturas tenían una secuencia única (ocurrencia = 1), lo que representa casi el 70 % del total de lecturas en la biblioteca (Figura 7a). El resto se dispersa entre 2 (1.441.628 otras lecturas con secuencias repetidas dos veces) y 2000 ocurrencias (1 secuencia). Cuando la proporción de UTP se ha incrementado en la mezcla de síntesis (muestras '10U', '5U' y '5C5U'), el número de lecturas únicas disminuyó drásticamente, multiplicando el número de lecturas repetidas. De cualquier modo, la mayoría de las lecturas tuvieron un número moderado de ocurrencias que oscilaron entre 2 y 100 para las tres condiciones (Figuras 7b, 7c y 7d). Estos resultados demostraron la aleatoriedad de cada grupo de ARN y aseguraron un tamaño de biblioteca inicial de 106-107 , que representa el tamaño típico utilizado para SELEX31. Otro parámetro estadístico que se ha evaluado es la frecuencia de cada ribonucleótido por lectura y por ciclo de incorporación (Figuras 8 y 9). En total, las cuatro condiciones de síntesis indicaron una frecuencia ligeramente equivalente (20-25 % cada una; 26,7 % A, 25 % C, 24 % G y 24,3 % U) para los cuatro nucleótidos. Después de los 65 ciclos, la proporción global de nucleótidos agregados permaneció constante con un valor incrementado para UTP cuando se agregó un exceso de UTP ('10U' y '5U') en detrimento de la incorporación de CTP (Figuras 9b y 9c). Cuando CTP se concentra 5 veces ('5C5U'), la cantidad de incorporación de CTP también se incrementa.
Finalmente, se ha estimado la probabilidad de añadir un nucleótido (A/C/G/U) en la posición N después de un nucleótido dado en la posición N-1 para las cuatro mismas condiciones. Este parámetro podría indicar la frecuencia de formación de dinucleótidos en cada secuencia. Entre los 16 posibles dinucleótidos, GC parecía ser el más plausible cuando está presente una proporción equimolar de ribonucleótidos, al contrario, es menos probable que se formen dinucleótidos UC y GG en el mismo caso (Figura 10a). El aumento de la cantidad de UTP en las otras condiciones pareció aumentar la probabilidad de incorporación de U después de un U (dinucleótido UU) solo cuando está presente en un exceso de 10 veces (Figura 10b). Cuando UTP y CTP estaban presentes en un exceso de 5 veces (Figura 10c), se produjo un equilibrio del comportamiento de transición para todos los nucleótidos (todos los escenarios son posibles). Por último, un aumento de 5 veces de la cantidad de UTP (Figura 10d) pareció promover la formación de dinucleótido GU en comparación con la condición 'N'.
En conjunto, estos resultados demostraron la aleatoriedad de la síntesis del conjunto de ARN y el tamaño adecuado de las bibliotecas generadas, lo que valida su uso para los procedimientos SELEX.
Incorporación de nucleótidos modificados por los mutantes CS13 y DW9
El principal inconveniente de los aptámeros es su relativa inestabilidad y sensibilidad a la hidrólisis en fluidos biológicos. La solución para evitar este punto es producir moléculas de ARN resistentes a las nucleasas mediante diferentes enfoques32-34. Se pueden intentar modificaciones en el resto de azúcar del nucleótido, el enlace covalente fosfodiéster o en la base.
También se ha investigado en este estudio la incorporación de desoxi y ribonucleótidos. Los siguientes análogos se aceptaron con éxito y dieron lugar a polímeros largos: 2'-Fluoro-dNTP (2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-FluorodCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, y mezclas de los mismos), 2'-Amino-dNTP (2'-Amino-dATP, 2'-Amino-dCTP, 2'-Amino-dGTP, 2'-Amino-dUTP, 2'-Amino-dTTP, y mezclas de los mismos), 2'-0-metil-dNTP (2'-0-metil-dATP, 2'-0-metil-dUTP, 2'-0-metil-dCTP, 2'-0-metil-dGTP, y mezclas de los mismos), 2'-azido-2'-dNTP (2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP, y mezclas de los mismos), 5-metil-UTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, épsilon(£)-ATP, 2-Aminopurina, FANA, 5-etinil-UTP.
Todos los nucleótidos modificados con 2'-fluoro (Figura 11, carriles 1-5; Figura 14, carriles 16 a 21) y 2'-amino (Figura 11, carril 9; Figura 14, carriles 1 a 15) se incorporaron eficientemente (Figura 11 y Figura 14). Se ha descrito que la tasa de incorporación de ribonucleótidos modificados con fluoro por la ARN polimerasa T7 fue diez veces menor que la de los sustratos naturales33. El mutante CS13 mostró una alta tolerancia para estos sustratos modificados, ya que se sintetizaron homopolímeros largos (hasta 200 nt) en las mismas condiciones experimentales que la extensión del cebador mediante NTP o dNTP naturales, con una eficacia mucho mayor que la pol 0 WT. Esta modificación es adecuada para el desarrollo de ribozimas y la selección de aptámeros, ya que los oligonucleótidos modificados con fluoro tienen una mejor resistencia a las ribonucleasas35,36. La incorporación de nucleótidos modificados con 2'-fluoro por ADN polimerasas ya fue evaluada en varios estudios37 y la tasa de incorporación de nucleótidos modificados por síntesis enzimática permanece relativamente limitada en comparación con la síntesis química. De esa manera, todavía se están dedicando muchos esfuerzos a la especificidad de sustrato de las ADN polimerasas para beneficiarse de las propiedades atractivas de diferentes tipos de oligonucleótidos modificados.
El mutante CS13 no logró alargar el cebador del ADNmc en presencia de nucleótidos modificados con 2'-O-metilo más allá de unos pocos nucleótidos (Figura 11, carriles 13 y 14; Figura 14, carriles 6 a 10). El ARN modificado con 2'-O-metilo muestra una mejor estabilidad frente a la hidrólisis básica y las ribonucleasas, así como valores aumentados de Tm. Este atributo puede ser útil para preservar la conformación 3D y ampliar la diversidad de aptámeros funcionales38.
La incorporación de 2'-amino dATP y 2'-amino dGTP (Figura 14, carriles 1-5) pareció ser eficiente con el mutante CS13, más que el 2'-amino dUTP y 2'-amino dCTP. Para el 2'-N3 (azido) dNTP, la incorporación fue muy buena con el mutante CS13, casi tan buena como los derivados 2'-F, lo que permite la posibilidad de llevar a cabo experimentos de química clic con compuestos que contienen un grupo alquino (Figura 14, carriles 11-15).
El eteno-ATP (Figura 11, carril 15; Figura 14, carril 25) formó también polímeros largos con el mutante CS13. Este nucleótido modificado con base es fluorescente en solución y se usa a menudo en aplicaciones de extinción de fluorescencia o estudios FRET sobre cambios conformacionales.
Por otra parte, el FANA (Figura 11, carril 17) (2-desoxi-2-fluoroarabinonucleótido) parecía ser aceptado por el mutante CS13 pero no logró alargar los cebadores en polímeros largos. Se ha descrito que los aptámeros de FANA mostraron una mayor estabilidad térmica, resistencia a las nucleasas y una unión más fuerte a sus dianas, tales como la trombina o, la transcriptasa inversa del VIH-139 para la cual la afinidad de unión está en el intervalo picomolar y demostró una actividad eficiente in vitro. Se probaron dos análogos fluorescentes de nucleótidos de adenina: eteno-adenina (Figura 14, carril 25; Figura 11, carril 12) y 2-aminopurina (Figura 14, carril 26; Figura 11, carril 13). Ambos se incorporaron en el mutante CS13 pero formaron solo polímeros cortos.
Para los nucleótidos modificados que fueron incorporados débilmente por mutantes CS13 (FANA, 5-etinil-UTP, 5-metil-UTP, Ara-NTP) en diferentes condiciones de reacción (tampón, iones metálicos, pH) y otros mutantes como Y2387F (NM11) se puede demostrar que pueden ampliar la especificidad del sustrato en función de sus modificaciones. El mutante DW9 (L2334M-E2335G) ya se ha probado con el mismo panel de nucleótidos modificados, pero mostró el mismo comportamiento que el mutante CS13. Además, las hipótesis de los inventores que explican cómo el mutante CS13 acepta bien los ribonucleótidos y algunos nucleótidos modificados se basan en un modelo estructural en el que el ddATP fue reemplazado por ATP y el resto de glutamato simplemente fue reemplazado por glicina. Para corroborar este modelo, la estructura cristalina del mutante CS13 se puede realizar para visualizar las reordenaciones espaciales del bolsillo de unión de nucleótidos.
Se observaron resultados similares para el mutante DW9 para los nucleótidos 2'-Amino, 2'-Fluoro y 2'-Azido ya que se formaban polímeros largos (Figura 15; respectivamente carriles 1-5, carriles 11-15 y carriles 16-20). Por otra parte, se observó una incorporación mejorada de 2'-O-metilo con el mutante DW9 en comparación con el mutante CS13 (Figura 15; carriles 6-10). Asimismo, se puede observar una mejor incorporación de épsilon-ATP (Figura 15; carril 23), en comparación con el mutante CS13 mientras que DW9 no incorporó los nucleótidos Ara-ATP y Ara-CTP (carriles 21 y 22).
Creación de bibliotecas de aptámeros de ARN para SELEX
Los mutantes de pol theta (pol 0) humana CS13 y DW9 demostraron una capacidad confiable para realizar síntesis aleatoria de ARN e incorporar un gran panel de nucleótidos modificados. La procesividad y la aleatoriedad de su actividad se han evaluado cuantitativamente y esta nueva maquinaria enzimática debería ser útil para aplicaciones terapéuticas. De esa manera, la búsqueda continua de fármacos basados en ácidos nucleicos ultraeficaces, selectivos y no tóxicos sigue siendo la fuerza impulsora de las estrategias de diseño de aptámeros. Este trabajo ofrece una alternativa biológica viable a la generación de secuencias aleatorias de ARN mediante síntesis química y diseño de bibliotecas. Al establecer un procedimiento SELEX enzimático eficiente, los costos del ensayo se reducirán al mismo tiempo que la duración del ciclo de selección. El conjunto resultante de ARN obtenidos con mutantes CS13 y DW9 sirvió como candidatos de partida para la biblioteca de aptámeros. Para ese fin, se añadió un fragmento fijo de ARN al final de cada ARN sintetizado. Este fragmento puede servir como hebra de matriz para amplificar el aptámero seleccionado después de cada ciclo de SELEX. Los inventores decidieron implementar una ligación del fragmento fijo a cada ARN sintetizado explotando la actividad ARN ligasa I de T4. Los resultados muestran que se produce la ligación de estos oligonucleótidos fijos (Figura 13), lo que demuestra que es posible añadir una región constante al conjunto de ARN sintético y que, por tanto, la biblioteca de ARN se puede cribar o amplificar para diferentes aplicaciones, en particular para la selección de aptámeros.
ADN polimerasas mutantes de la familia Pol theta
La invención se refiere a ADN polimerasas mutantes de la subfamilia Pol theta capaces de realizar una extensión del ácido nucleico sin molde, o un fragmento funcional (es decir, capaz de realizar la extensión del ácido nucleico sin molde) de dicha polimerasa, métodos para producir estas ADN polimerasas mutantes y usos y métodos de uso de estas ADN polimerasas mutantes.
La expresión "ADN polimerasa theta" o "pol theta" o "pol0" se refiere a una proteína codificada por el gen POLQ en el genoma de mamífero. Esta ADN polimerasa de baja fidelidad está implicada en una vía de reparación de DSB (roturas de doble hebra) denominada "unión de extremos alternativa" (alt-EJ) de "unión de extremos mediada por Theta". Esta vía se caracteriza por la unión de las colas de ADN monocatenario 3' que se produce cuando una ruptura del ADN no puede repararse eficazmente mediante la unión de extremos no homólogos dependiente de Ku40. La polimerasa es capaz de replicarse de manera eficiente a través de un sitio básico al funcionar como un insertador de pares incorrectos y como un extensor de pares incorrectos41. La ADN polimerasa theta tiene un dominio de ADN polimerasa C-terminal característico unido a través de una región central a un dominio tipo ADN helicasa N-terminal2842 Pol theta tiene la capacidad de cambiar moldes y cebar a partir de homologías, pero también puede extender algunos sustratos de ADN monocatenario43,44. Cuando los cationes de manganeso (Mn2+) están presentes en concentraciones fisiológicas pol theta no tiene actividad transferasa terminal independiente del molde28 mientras que con proporciones elevadas de Mn2+ y Mg2+ la polimerasa parece desencadenar una extensión independiente del molde. Se ha demostrado que los iones de Mn2+ relajan la especificidad del molde en muchas polimerasas45. Los ejemplos representativos de pol theta incluyen, sin limitación, las formas humana (ID. gen 10721), rata (ID. gen 288079), pollo (ID. gen 418326), canina (ID.
gen 488003), pez cebra (ID. gen 566079), mus308 de la mosca de la fruta (ID. gen 41571) y ratón (ID. gen 77782).
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2322, 2328, 2334, 2335, 2384, 2387 y 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: una sustitución de Prolina (P) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2322, una sustitución de Alanina (A) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2328, una sustitución de Leucina (L) por un aminoácido alifático en la posición 2334, una sustitución de Ácido glutámico (E) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2335, una sustitución de Glutamina (Q) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2384, una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2387, y una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2322, en donde el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2322, en donde el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2328, en donde el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Glicina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2328, en donde el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2334, en donde el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2335, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2335, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos en las posiciones 2334 y 2335, determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1. En diversas realizaciones, el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A), y preferentemente por una Metionina (M). En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G), Alanina (A), Treonina (T) y Serina (S), y preferentemente por una Glicina (G).
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2384, en donde el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por una Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2384, en donde el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Asparagina (N), Serina (S) y T reonina (T), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2387, en donde el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y T riptófano (W), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2387, en donde el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2391, en donde el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y T riptófano (W), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido en la posición 2391, en donde el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), y sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1. En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende una única sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F), y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa theta (Pol theta) mutante o un fragmento funcional de la misma comprende una doble sustitución de aminoácidos L2334M y E2335G, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma comprende al menos una sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), y sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1. Los términos "mutante" y "variante" pueden usarse indistintamente y constituyen el mismo significado y propósito dentro de la presente invención. Un mutante o una variante significa un polipéptido derivado de ADN polimerasas de la subfamilia pol theta, o derivado de un fragmento funcional de tales ADN polimerasas, y en particular de una secuencia de ADN polimerasa theta humana de acuerdo con la secuencia SEQ ID NO: 1, y que comprende al menos una sustitución y tiene actividades de ADN polimerasa y nucleotidiltransferasa terminal. Las variantes se pueden obtener mediante diversas técnicas bien conocidas en la técnica.
El término "sustitución" significa que el aminoácido en la posición particular ha sido reemplazado por otro aminoácido diferente al de la ADN polimerasa de tipo silvestre (wt). Preferentemente, el término "sustitución" se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido con otro seleccionado de los 20 restos naturales de aminoácidos estándar, restos de aminoácidos raros de origen natural (por ejemplo hidroxiprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 6-N-metil-lisina, N-etilglicina, N-metilglicina, N-etilasparagina, aloisoleucina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, piroglutamina, ácido aminobutírico, ornitina) y restos de aminoácidos no naturales (por ejemplo, norleucina, norvalina y ciclohexil-alanina). Preferentemente, el término "sustitución" se refiere al reemplazo de un resto de aminoácido por otro seleccionado de los 20 restos de aminoácidos estándar. Por ejemplo, una sustitución de P por V en la posición 2322 significa el reemplazo de la prolina (P) en la posición 2322 por una valina, determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
Los restos de aminoácidos se representan por el código de una letra o de tres letras de acuerdo con la siguiente nomenclatura: A: Ala, alanina; C: Cys, cisteína; D: Asp, ácido aspártico; E: Glu, ácido glutámico; F: Phe, fenilalanina; G: Gly, glicina; H: His, histidina; I: Ile, isoleucina; K: Lys, lisina; L: Leu, leucina; M: Met, metionina; N: Asn, asparagina; P: Pro, prolina; Q: Gln, glutamina; R: Arg, arginina; S: Ser, serina; T: Thr, treonina; V: Val, valina; W: Trp, triptófano; Y: Tyr, tirosina.
La expresión "aminoácido alifático" se refiere a restos que tienen una cadena lateral que contienen solo átomos de carbono o hidrógeno y permanecen dentro de las proteínas. El grupo de aminoácidos alifáticos comprende los restos Glicina (G), Alanina (A), Valina (V), Leucina (L) e Isoleucina (I). El resto de metionina se puede considerar como un aminoácido alifático, aunque su cadena lateral contiene un átomo de azufre que es en gran parte no reactivo, de modo que la metionina se sustituye eficazmente con los aminoácidos estrictamente alifáticos.
La expresión "aminoácido polar" se refiere a restos que tienen un grupo polar en su cadena lateral. Esto permite que estos restos formen enlaces de hidrógeno y enlaces covalentes con otros sustituyentes que pueden modificar la estructura de la proteína. Los restos Treonina (T), Serina (S), Cisteína (C), Prolina (P), Asparagina (N) y Glutamina (Q) constituyen el grupo de aminoácidos polares.
La expresión "aminoácido aromático" se refiere a restos que contienen un anillo aromático. En general, los sistemas de anillos aromáticos son planos y los electrones se comparten en toda la estructura del anillo. El grupo de aminoácidos aromáticos comprende Fenilalanina (F), Triptófano (W) y Tirosina (Y).
Por "comprende al menos una sustitución", se entiende que la ADN polimerasa mutante tiene una o más sustituciones de aminoácidos como se indica con respecto a la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1, pero puede tener otras modificaciones, incluyendo sustituciones, deleciones o adiciones de restos de aminoácidos.
La ADN polimerasa mutante puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o todas las mutaciones enumeradas anteriormente. Todas estas posibles combinaciones se contemplan específicamente.
Preferentemente, la ADN polimerasa mutante tiene al menos un tamaño de 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1725, 1750, o 1775 aminoácidos. Preferentemente, el mutante contiene al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones en el subdominio Dedos (restos 2333-2474) o la secuencia de aminoácidos de longitud completa de pol theta (pol0) humana, pol theta (pol0) de ratón, pol theta (pol0) de pez cebra, o pol theta (pol0) mus308 de la mosca de la fruta o en una pol theta homóloga (pol0).
Preferentemente, el mutante está contenido en los plásmidos dentro de la bacteria depositada como CNCM I-5238 (E.coli A1-1791_CS13); CNCM I-5239 (E.coli A1-1791_DW9); CNCM I-5240 (E.coli A1-1791_MC15); y CNCM 1-5241 (E.coli A1-1791_NM11).
Preferentemente, el mutante contiene al menos 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones en el subdominio Dedos (restos 2333­ 2474) o la secuencia de aminoácidos de longitud completa de pol theta (pol0) humana, pol theta (pol0) de ratón, pol theta (pol0) de rata, pol theta (pol0) de pollo, pol theta (pol0) canina, pol theta (pol0) de pez cebra, o pol theta (pol0) mus308 de la mosca de la fruta o en una pol theta homóloga (pol0).
El término "homóloga" se refiere a las secuencias que tienen similitud de secuencia. La expresión "similitud de secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos. En el contexto de la invención, dos secuencias de aminoácidos son "homólogas" cuando al menos 80 %, como alternativa al menos 81 %, como alternativa al menos 82 %, como alternativa al menos 83 %, como alternativa al menos 84 %, como alternativa al menos 85 %, como alternativa al menos 86 %, como alternativa al menos 87 %, como alternativa al menos 88 %, como alternativa al menos 89 %, como alternativa al menos 90 %, como alternativa al menos 91 %, como alternativa al menos 92 %, como alternativa al menos 93 %, como alternativa al menos 94 %, como alternativa al menos 95 %, como alternativa al menos 96 %, como alternativa al menos 97 %, como alternativa al menos 98 %, como alternativa al menos 99 % de los aminoácidos son idénticos al subdominio Dedos (restos 2333-2474) o la secuencia de aminoácidos de longitud completa de pol theta (pol0) humana (ID. gen 10721), pol theta (pol0) de ratón (ID. gen 77782), pol theta (pol0) de pez cebra (ID. gen 566079), o pol theta (pol0) mus308 de la mosca de la fruta (ID. gen 41571).
Preferentemente, la ADN polimerasa mutante tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con la siguiente secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1):
1 mnllrrsgkr rrsesgsdsf sgsggdssas pqflsgsvls pppglgrclk aaaageckpt 61 vpdyerdkll lanwglpkav lekyhsfgvk kmfewqaecl llgqvlegkn lvysaptsag 121 ktlvaellil krvlemrkka lfilpfvsva kekkyylqsl fqevgikvdg ymgstspsrh 181 fssldiavct ieranglinr lieenkmdll gmvvvdelhm lgdshrgyll ellltkicyi 241 trksascqad lasslsnavq ivgmsatlpn lelvaswlna elyhtdfrpv pllesvkvgn 301 siydssmklv refepmlqvk gdedhvvslc yeticdnhsv llfcpskkwc ekladiiare 361 fynlhhqaeg lvkpsecppv ileqkellev mdqlrrlpsg ldsvlqktvp wgvafhhagl 421 tfeerdiieg afrqglirvl aatstlssgv nlparrviir tpifggrpld iltykqmvgr 481 agrkgvdtvg esilicknse kskgiallqg slkpvrsclq rregeevtgs miraileiiv 541 ggvastsqdm htyaactfla asmkegkqgi qrnqesvqlg aieacvmwll enefiqstea 601 sdgtegkvyh pthlgsatls sslspadtld ifadlqramk gfvlendlhi lylvtpmfed 661 wttidwyrff clweklptsm krvaelvgve egflarcvkg kvvarterqh rqmaihkrff 721 tsiviidiis evplreinqk ygcnrgqiqs Iqqsaavyag mitvfsnrIg whnmeiiisq 781 fqkrltfgiq relcdlvrvs llnaqrarvl yasgfhtvad laraniveve vilknavpfk 841 sarkavdeee eaveerrnmr tiwvtgrkgl tereaaaliv eearmilqqd lvemgvqwnp 901 callhsstcs lthsesevke htfisqtkss ykkltsknks ntifsdsyik hspnivqdln 961 ksrehtssfn cnfqngnqeh qtcsifrark rasldinkek pgasqnegkt sdkkvvqtfs 1021 qktkkaplnf nsekmsrsfr swkrrkhlkr srdssplkds gacrihlqgq tlsnpslced 1081 pftldekkte frnsgpfakn vslsgkekdn ktsfplqikq ncswnitltn dnfvehivtg 1141 sqsknvtcqa tsvvsekgrg vaveaekine vliqngsknq nvymkhhdih pinqylrkqs 1201 heqtstitkq kniierqmpc eavssyinrd snvt inceri klnteenkps hfqalgddis 1261 rtvipsevlp sagafskseg qhenflnisr lqektgtytt nktknnhvsd lglvlcdfed 1321 sfyldtqsek iiqqmatena klgakdtnla agimqkslvq qnsmnsfqke chipfpaeqh 1381 plgatkidhl dlktvgtmkq ssdshgvdil tpespifhsp illeenglf1 kknevsvtds 1441 qlnsflqgyq tqetvkpvil lipqkrtptg vegeclpvpe tslnmsdsll fdsfsddylv 1501 keqlpdmqmk eplpsevtsn hfsdslclqe dlikksnvne nqdthqqltc sndesiifse 1561 mdsvqmveal dnvdifpvqe knhtvvspra lelsdpvlde hhqgdqdggd qderaekskl 1621 tgtrqnhsfi wsgasfdlsp glqrildkvs spleneklks mtinfsslnr kntelneeqe 1681 visnletkqv qgisfssnne vkskiemlen nanhdetssl lprkesnivd dnglipptpi 1741 ptsaskltfp giletpvnpw ktnnvlqpge sylfgspsdi knhdlspgsr ngfkdnspis 1801 dtsfslqlsq dglqltpass sseslsiidv asdqnlfqtf ikewrckkrf sislacekir 1861 sltssktati gsrfkqassp qeipirddgf pikgcddtlv vglavcwggr dayyfslqke 1921 qkhseisasl vppsldpslt lkdrmwylqs clrkesdkec svviydfiqs ykilllscgi 1981 sleqsyedpk vacwlldpds qeptlhsivt sflphelpll egmetsqgiq slglnagseh 2041 sgryrasves ilifnsmnql nsllqkenlq dvfrkvemps qyclalleln gigfstaece 2101 sqkhimqakl daietqayql aghsfsftss ddiaevlfle lklppnremk nqgskktlgs 2161 trrgidngrk lrlgrqfsts kdvlnklkal hplpglilew rritnaitkv vfplqrekcl
2221 npflgmeriy pvsqshtatg ritftepniq nvprdfeikm ptlvgespps qavgkgllpm 2281 grgkykkgfs vnprcqaqme eraadrgmpf sismrhafvp fpggsilaad ysqlelrila 2341 hlshdrrliq vlntgadvfr siaaewkmie pesvgddlrq qakqicygii ygmgakslge 2401 qmgikendaa cyidsfksry tginqfmtet vknckrdgfv qtilgrrryl pgikdnnpyr 2461 kahaerqain tivqgsaadi vkiatvniqk qletfhstfk shghregmlq sdqtglsrkr 2521 klqgmfcpir ggffilqlhd ellyevaeed vvqvaqivkn emesavklsv klkvkvkiga 2581 swgelkdfdv.
Los mutantes, homólogos, fragmentos funcionales de ADN polimerasas de la familia Pol theta pueden prepararse mediante técnicas de rutina en la técnica y seleccionarse según la actividad (es decir, capaz de realizar la extensión de ácido nucleico sin molde) usando los ensayos descritos en el presente documento u otros ensayos similares.
Los ácidos nucleicos, vectores y células
En diversas realizaciones, la invención abarca ácidos nucleicos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma, un vector que comprende estos ácidos nucleicos y una célula hospedadora que comprende estos vectores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y ácidos nucleicos modificados.
El término "vector" en el presente documento significa el vehículo mediante el cual se puede introducir una secuencia de ADN o ARN heteróloga (por ejemplo, mutante o sintética) en una célula hospedadora para transformarla y promover la expresión de la secuencia introducida. Preferentemente, el vector es un vector de ADN. Los vectores pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, fagos y virus y se describen más detalladamente más adelante. De hecho, se puede usar cualquier tipo de plásmido, cósmido, YAC o vector viral para preparar una construcción de ácido nucleico recombinante. Por ejemplo, vectores víricos, tal como lentivirus, retrovirus, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Los métodos para construir y usar vectores virales son conocidos en la técnica (véase, Miller and Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992).
Para las células que no son de vertebrados, los vectores preferidos son los arbovirus, siendo particularmente preferido el virus del Nilo Occidental, que son vectores artrópodos. Otros vectores que se sabe que se expresan eficazmente en células que no son de vertebrados son los baculovirus.
Para las células de vertebrado se prefieren los vectores lentivirales, VAA, baculovirales y adenovirales. Los vectores adecuados para la expresión en células hospedadoras de mamíferos también pueden ser de origen no viral (por ejemplo, ADN plasmídico). Los vectores de expresión adecuados incluyen, sin limitación, pREP4, pCEP4 (Invitrogene), pCI (Promega), pCDM8 y pMT2PC, pVAX y pgWiz.
Para las células procariotas se prefieren vectores plasmídicos, bacteriófagos y cósmidos. Los vectores adecuados para su uso en sistemas procariotas incluyen, sin limitación, vectores pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), p Poly, pTrc; pET 11d; pIN; y pGEX.
Para las células vegetales, se prefieren los vectores de expresión de plásmidos, como los plásmidos Ti, y los vectores de expresión de virus, como el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y el virus del mosaico del tabaco, TMV.
La expresión de proteínas recombinantes en células de levadura se puede realizar utilizando tres tipos de vectores: vectores de integración (YIp), plásmidos episomales (YEp) y plásmidos centroméricos (YCp): Vectores adecuados para la expresión en levadura (por ejemplo, S. cerevisiae) incluyen, pero no se limitan a pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.) y pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product código: P03303).
Una secuencia que codifica un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima; es decir, la secuencia de nucleótidos "codifica" ese ARN o codifica la secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima.
En el contexto de la presente invención, las células "hospedadoras" son cualquier célula que se pueden usar para producir proteínas recombinantes, tales como células de "no vertebrado" (o invertebrado), células de vertebrado, células vegetales, células de levadura o células procariotas. Son preferentemente células de no vertebrado y vertebrado.
Los no vertebrados (también conocidos como invertebrados) comprenden diferentes filos, siendo los más famosos los Insecta, Arachnida, Crustacea, Mollusca, Annelida, Cirripedia, Radiata, Coelenterata e Infusoria. Actualmente se clasifican en más de 30 filos, desde organismos simples como esponjas marinas y gusanos planos hasta animales complejos como artrópodos y moluscos. En el contexto de la invención, las células que no son de vertebrados son preferentemente células de insectos, tales como células de Drosophila o Mosquito, más preferentemente células S2 de Drosophila.
Los ejemplos de células derivadas de organismos vertebrados que son útiles como líneas de células hospedadoras incluyen células madre embrionarias no humanas o derivados de las mismas, por ejemplo, células EBX de aves; línea CVI de riñón de mono transformada por secuencias de SV40 (COS-7, ATCC c Rl 1651); una línea de riñón embrionario humano (293); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO); células de Sertoli de ratón (TM4); células de riñón de mono (CVI, ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma de cuello de útero humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células de hepatoma de rata (HTC, MI.5); YB2/O (ATCC n.° CRL1662); NIH3T3; células HEK y TRI. En el contexto de la invención, las células de vertebrado, son preferentemente células EBX, CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3 o derivadas de las mismas.
Las células vegetales que se pueden utilizar en el contexto de la invención son los cultivares de tabaco Bright Yellow 2 (BY2) y Nicotiana Tabaccum 1 (NT-1).
Las células de levadura que se pueden usar en el contexto de la invención son: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, y Hansenula polymorpha, así como levaduras metilotrópicas como Pichia pastoris y Pichia methanolica.
Las células procariotas que se pueden usar en el contexto de la invención, son normalmente bacterias E.Coli o bacterias Bacillus Subtilis.
En diversas realizaciones, la célula hospedadora de la invención es la célula hospedadora depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Instituto Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 París, FR, el 14 de septiembre de 2017 con los números de depósito CNCM I-5238 (E.coli A1-1791_CS13).
En diversas realizaciones, la célula hospedadora de la invención es la célula hospedadora depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Instituto Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 París, FR, el 14 de septiembre de 2017 con el número de depósito CNCM I-5239 (E.coli A1-1791_DW9).
En diversas realizaciones, la célula hospedadora de la invención es la célula hospedadora depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Instituto Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 París, FR, el 14 de septiembre de 2017 con el número de depósito CNCM I-5240 (E.coli A1-1791_MC15).
En diversas realizaciones, la célula hospedadora de la invención es la célula hospedadora depositada en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Instituto Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 París, FR, el 14 de septiembre de 2017 con el número de depósito CNCM 1- 5241 (E.coli A1-1791_NM11).
En diversas realizaciones, la invención abarca el uso de los ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras de la invención para producir una ADN polimerasa mutante.
Métodos para producir ADN polimerasas mutantes
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta o un fragmento funcional de la misma que comprende sustituir al menos un aminoácido en una ADN polimerasa de la familia Pol theta en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2322, 2328, 2334, 2335, 2384, 2387 y 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde la al menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste en: una sustitución de Prolina (P) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2322, una sustitución de Alanina (A) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2328, una sustitución de Leucina (L) por un aminoácido alifático en la posición 2334, una sustitución de Ácido glutámico (E) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2335, una sustitución de Glutamina (Q) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2384, una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2387, y una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2322 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2322 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2328 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Glicina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2328 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2334 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2335 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G) y Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2335 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos dos aminoácidos en las posiciones 2334 y 2335 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta. En diversas realizaciones, el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A), y preferentemente por una Metionina (M, En algunas realizaciones, el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G), Alanina (A), Treonina (T) y Serina (S), y preferentemente por una Glicina (G).
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2384 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por una Alanina (A), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2384 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Asparagina (N), Serina (S) y T reonina (T), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2387 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y Triptófano (W), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2387 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2391 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y Triptófano (W), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en la posición 2391 en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V), determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde la al menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde la al menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), y sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir un solo aminoácido en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde la sustitución de un solo aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F), y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir la doble sustitución de aminoácidos L2334M y E2335G, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para generar una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta que comprende sustituir al menos un aminoácido en una ADN polimerasa de la subfamilia Pol theta, en donde la al menos una sustitución se selecciona del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), y sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); y sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
Estas sustituciones se pueden hacer usando métodos de rutina conocidos en la técnica, tales como los descritos en los Ejemplos. Preferentemente, las sustituciones se realizan con respecto a un ácido nucleico que tiene toda o parte de la secuencia de ADN que codifica la pol theta (pol0) humana, pol theta (pol0) de ratón, pol theta (pol0) de pez cebra, 0 pol theta (pol0) mus308 de la mosca de la fruta o una pol theta (pol0) homóloga. Preferentemente, la ADN polimerasa tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. El ácido nucleico puede tener un tamaño de al menos 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000 o 5000, etc., nucleótidos y puede corresponder al subdominio Dedos (restos 2333­ 2474) o la secuencia de aminoácidos de longitud completa.
En una realización preferida, el mutante se prepara a partir de una ADN polimerasa que tiene al menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y sustituyendo los aminoácidos dentro de esta ADN polimerasa.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para producir una ADN polimerasa mutante cultivando la célula hospedadora de la invención en condiciones de cultivo que permitan la expresión del polinucleótido que codifica dicho mutante y, opcionalmente, recuperar dicho mutante así expresado del medio de cultivo o células hospedadoras.
Métodos para incorporar nucleótidos
El término "aproximadamente" se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, una temperatura y similar, y se entiende que abarca variaciones no limitantes de /- 40 % o /- 20 % o /- 10 % o /- 5 % 0 /- 1 % o /- 0,1 % respecto al valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas.
En una realización, la invención abarca un método para incorporar nucleótidos sin molde que comprende incubar la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma, con nucleótidos trifosfato en condiciones que permiten la incorporación de nucleótidos en ausencia de un molde.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma está en una concentración de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 50 pM, preferentemente en una concentración de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, preferentemente en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 10 pM, y preferentemente en una concentración de aproximadamente 5 pM.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma se incuba en presencia de al menos un metal divalente. En una realización, el metal divalente es manganeso (Mn2+), cobalto (Co2+), magnesio (Mg2+) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el metal divalente es manganeso (Mn2+), magnesio (Mg2+) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el metal divalente está a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el metal divalente está a una concentración de aproximadamente 5 mM. De manera similar, en una realización, la invención abarca el uso de la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma para incorporar nucleótidos sin molde. Las condiciones de Ejemplo se exponen en los Ejemplos.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma se incuba en presencia de cloruro de sodio (NaCl) a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, y preferentemente a una concentración de aproximadamente 150 mM.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma se incuba en presencia de Mn2+ 5 mM, Tris/HCl 20 mM pH 8, glicerol al 10 %, NaCl 150 mM, IGEPAL C6-30 al 0,01 %, 0,1 mg.mM de BSA (seroalbúmina bovina). En diversas realizaciones, la incubación es de al menos 1 minuto para generar un fragmento de 20-30 nucleótidos.
En diversas realizaciones, la incubación se realiza a una temperatura de aproximadamente 25 °C a 50 °C, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 42 °C.
Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos naturales, ribonucleótidos naturales, nucleótidos modificados o cualquier combinación de nucleótidos naturales y nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido es dATP, dGTP, dCTP, dTTP, o dUTP. En algunas realizaciones, el ribonucleótido es ATP, GTP, CTP, o UTP. En determinadas realizaciones no limitantes, el nucleótido modificado puede ser:
cy3-dUTP, Digoxigenina-dUTP, Biotina-16AA-dUTP, Rojo Texas-5-dCTP, Cianina 3-AA-UTP, 4-Tio-UTP, Biotina-16-AA-dCTP, Trifosfato de ganciclovir, N6-(6-Azido)hexil-adenosina-5'-trifosfato, 5-Hidroximetil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato;
nucleótidos modificados en 2': 2'-Fluoro-dNTP: 2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP; 2'-amino-dNTP: 2'-Amino-dATP, 2'-Amino-dTTP, 2'-Amino-dCTP, 2'-Amino-dGTP y 2'-AminodUTP; preferentemente, 2'-Amino-dATP o 2'-Amino-dGTP; 2'-0-metil-dNTP: 2'-0-metil-dATP, 2'-0-metil-dUTP, 2'-O-metil-dCTP, 2-O-metil-dGTP; 2'-N3-dNTP: 2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP; 2'-O-metil-ATP y 2'-O-metil-CTP;
Nucleótidos modificados con azúcar: Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), y FANA; Nucleótidos modificados con base: 5-metil-UTP, Eteno-ATP, 2-Aminopurina, y 5-etinil-UTP; y
nucleótidos modificados en 3': 3'-azido-ddATP, 3'-azido-ddCTP, 3'-O-metil-ATP, 3'-O-metil-CTP, 3'-O-(2-nitrobencil)-2'-dATP, 3'-O-NH2-dATP, 3'-O-NH2-dTTP, 3'-O-NH2-dCTP y 3'-O-NH2-dGTP y otros. Otros nucleótidos modificados en 3' incluyen en particular terminadores reversibles y terminadores irreversibles. Tales tipos de terminadores son bien conocidos en la técnica. Los terminadores reversibles incluyen, por ejemplo, nucleótidos 3'-O-azidometil (Palla et al., RSC ADV., 2014, 4, 49342-) y 3'-(2-nitrobencil)nucleótidos. Los terminadores irreversibles incluyen por ejemplo 3'-O-metil dNTP, Los nucleótidos modificados preferidos incluyen: 2'-FluorodUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, 2'-Amino-dATP, 5-metil-UTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, Eteno-ATP, 2-Aminopurina, FANA, y 5-etinil-UTP.
En diversas realizaciones, la invención abarca un método para producir secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias que comprende incubar la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma con nucleótidos trifosfato en condiciones que permitan la incorporación de nucleótidos degenerados o aleatorios para producir secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. Las condiciones de Ejemplo se exponen en los Ejemplos.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma está en una concentración de aproximadamente 0,5 pM a aproximadamente 50 pM, preferentemente en una concentración de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 30 pM, preferentemente en una concentración de aproximadamente 2 pM a aproximadamente 10 pM, y preferentemente en una concentración de aproximadamente 5 pM.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma se incuba en presencia de al menos un metal divalente. En una realización, el metal divalente es manganeso (Mn2+), cobalto (Co2+), magnesio (Mg2+) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el metal divalente es manganeso (Mn2+), magnesio (Mg2+) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el metal divalente está a una concentración de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. En algunas realizaciones, el metal divalente está a una concentración de aproximadamente 5 mM.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma se incuba en presencia de cloruro de sodio (NaCl) a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 300 mM, y preferentemente a una concentración de aproximadamente 150 mM.
En diversas realizaciones, la ADN polimerasa mutante o un fragmento funcional de la misma se incuba en presencia de Mn2+ 5 mM, Tris/HCl 20 mM pH 8, glicerol al 10 %, NaCl 150 mM, IGEPAL C6-30 al 0,01 %, 0,1 mg.ml-1 de BSA (seroalbúmina bovina).
En diversas realizaciones, la incubación es de al menos 1 minuto para generar un fragmento de 20-30 nucleótidos.
En diversas realizaciones, la incubación se realiza a una temperatura de aproximadamente 25 °C a 50 °C, preferentemente a una temperatura de aproximadamente 42 °C.
Los nucleótidos pueden ser desoxirribonucleótidos naturales, ribonucleótidos naturales, nucleótidos modificados o cualquier combinación de nucleótidos naturales y nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido es dATP, dGTP, dCTP, dTTP, o dUTP. En algunas realizaciones, el ribonucleótido es ATP, GTP,
CTP, o UTP. En ciertas realizaciones no limitantes, el nucleótido modificado puede ser cy3-dUTP, Digoxigenina-dUTP, Biotina-16AA-dUTP, Rojo Texas-5-dCTP, Cianina 3-AA-UTP, 4-Tio-UTP, Biotina-16-AA-dCTP, Trifosfato de ganciclovir, N6-(6-Azido)hexil-adenosina-5'-trifosfato, 5-Hidroximetil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, 2'-Amino-dATP, 2'-Amino-dTTP, 2'-Amino-dCTP, 2'-Amino-dGTP, 2'-Amino-dUTP; 2'-0-metil-dUTP, 2'-0-metil-dGTP, 2'-Na-dATP, 2'-Na-dCTP, 2'-Na-dGTP, 2'-N3-dTTP,
2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP, 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP; 3'-azidoddATP, a'-azido-ddCTP, 3'-O-metil-ATP, 3'-O-metil-CTP, 3'-O-(2-nitrobencil)-2'-dATP, 3'-O-NH2-dATP, 3'-O-NH2-dTTP, 3'-O-NH2-dCTP, 3'-O-NH2-dGTP, 5-metil-UTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato),
2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, £-ATP, 2-Aminopurina, FANA, y 5-etinil-UTP. Los nucleótidos modificados preferidos incluyen: 2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, 2'-Amino-dATP, 2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP, 5-metil-UTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, £-ATP, 2-Aminopurina, FANA, 5-etinil-UTP, y terminadores de nucleótidos modificados en 3' reversibles e irreversibles como se ha definido anteriormente. Las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias pueden contener al menos una proporción molar de 0 %, 10 %, 20 %, 30 %,
40 % o 50 % entre desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos.
En algunas realizaciones, se puede añadir una secuencia de nucleótidos fija al extremo 3' de las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. En algunas realizaciones, se pueden amplificar las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. En algunas realizaciones, las secuencias amplificadas se pueden clonar en un vector para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
Generación de bibliotecas de ácidos nucleicos funcionales
En una realización, la invención abarca el uso de la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma para generar una biblioteca de ácido nucleico funcional y preferentemente una biblioteca de aptámeros.
En diversas realizaciones, la invención abarca un kit para generar una biblioteca de ácido nucleico funcional, en particular una biblioteca de aptámeros que comprende la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma. En algunas realizaciones, el kit comprende reactivos para la incorporación de nucleótidos degenerados o aleatorios. En algunas realizaciones, el kit comprende un vector para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
De forma habitual, los procedimientos SELEX comprenden una etapa en la que los candidatos a aptámeros se amplifican antes de la siguiente etapa de selección. Dado que los ARN recién sintetizados no tienen una región fija en
ambos extremos, esta región se puede agregar enzimáticamente en el extremo 3' de cada fragmento de ARN (el extremo 5' contiene la secuencia del cebador conocida constante).
En diversas realizaciones, el uso de la reacción de ligación40 se puede usar para añadir una región 3' fija. Para ese
fin, pueden ser adecuadas enzimas comerciales tales como la ARN ligasa I de T4 o RtcB ligasa (de New England Biolabs). Se ha utilizado ARN ligasa I de T4 en el ejemplo de acuerdo con el protocolo comercial.
En diversas realizaciones, se puede añadir una región fija en el extremo 3' de cada fragmento de ARN. El proceso
para sintetizar la región fija puede ser como se describe en la solicitud de patente WO2015/159023 (AU2015248673), que se incorpora aquí como referencia.
Para preparar una biblioteca de ácido nucleico funcional, opcionalmente una biblioteca de aptámeros, pueden amplificarse los candidatos a ácido nucleico funcional, por ejemplo por PCR, antes de la selección.
En diversas realizaciones, la etapa de autoamplificación se puede realizar usando la ADN polimerasa theta mutante
de la presente invención o un fragmento funcional de la misma. Al usar la misma enzima, sería posible ejecutar todo
el procedimiento SELEX en un sistema todo en uno.
En diversas realizaciones, la etapa de autoamplificación se puede realizar a través de una reacción isotérmica de una
sola etapa41 mediante la ARN replicasa de Norovirus (NV3Dpol). Los ácidos nucleicos amplificados se pueden insertar
(es decir, clonar) en cualquier vector que pueda contener ADN o ARN circularizado para la construcción de una biblioteca. En algunas realizaciones, se puede generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias. La biblioteca puede contener al menos 105 , 106 , 107 , 108 , 109 , 1010, 1011, 1012, 1013, secuencias diferentes.
Kits
En una realización, la invención abarca un kit para realizar cualquiera de los métodos descritos anteriormente, en donde el kit comprende la ADN polimerasa mutante de la invención o un fragmento funcional de la misma.
En diversas realizaciones, el kit comprende un cebador de ácido nucleico con un extremo 3'OH. En alguna realización, el cebador de ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en: ADN monocatenario, ADN bicatenario con un saliente 3'-OH monocatenario y ARN monocatenario.
En diversas realizaciones, el kit comprende al menos un metal divalente. En algunas realizaciones, el metal divalente es manganeso (Mn2+), cobalto (Co2+), magnesio (Mg2+) o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el metal divalente es manganeso (Mn2+ ), magnesio (Mg2+) o una combinación de los mismos.
En diversas realizaciones, el kit comprende una mezcla de nucleótidos. En algunas realizaciones, los nucleótidos son desoxirribonucleótidos naturales, ribonucleótidos naturales, nucleótidos modificados o cualquier combinación de nucleótidos naturales y nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, el desoxirribonucleótido es dATP, dGTP, dCTP, dATP, o dUTP. En algunas realizaciones, el ribonucleótido es ATP, GTP, CTP, o UTP. En ciertas realizaciones no limitantes, el nucleótido modificado puede ser cy3-dUTP, Digoxigenina-dUTP, Biotina-16AA-dUTP, Rojo Texas-5-dCTP, Cianina 3-AA-UTP, 4-Tio-UTP, Biotina-16-AA-dCTP, Trifosfato de ganciclovir, N6-(6-Azido)hexil-adenosina-5'-trifosfato, 5-Hidroximetil-2'-desoxiuridina-5'-trifosfato, 2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-FluorodGTP, 2'-Fluoro-dTTP, 2'-Amino-dATP, 2'-Amino-dTTP, 2'-Amino-dCTP, 2'-Amino-dGTP, 2'-Amino-dUTP; 2'-0-metildUTP, 2'-0-metil-dGTP, 2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP, 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP; 3'-azido-ddATP, 3'-azido-ddCTP, 3'-O-metil-ATP, 3'-O-metil-CTP, 3'-O-(2-nitrobencil)-2'-dATP, 3'-O-NH2-dATP, 3'-O-NH2-dTTP, 3'-O-NH2-dCTP, 3'-O-NH2-dGTP, 5-metil-UTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, £-ATP, 2-Aminopurina, FANA, y 5-etinil-UTP. Los nucleótidos modificados preferidos incluyen: 2'-Fluoro-dUTP, 2'-Fluoro-dATP, 2'-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, 2'-Amino-dATP, 2'-azido-2'-dATP, 2'-azido-2'-dUTP, 2'-azido-2'-dCTP, 2'-azido-2'-dGTP, 5-metil-UTP, Ara-ATP (vidarabina trifosfato), Ara-CTP (citarabina trifosfato), 2'-O-metil-ATP, 2'-O-metil-CTP, £-ATP, 2-Aminopurina, FANA, 5-etinil-UTP, y terminadores de nucleótidos modificados en 3' reversibles e irreversibles como se ha definido anteriormente.
En diversas realizaciones, el kit comprende un tampón de reacción.
En diversas realizaciones, el kit comprende instrucciones de uso.
Aplicaciones
La ADN polimerasa Pol theta mutante de la presente invención, o un fragmento funcional de la misma, puede usarse en una amplia variedad de protocolos y tecnologías. Por ejemplo, en determinada realización, la ADN polimerasa Pol theta mutante de la presente invención, o un fragmento funcional de la misma, se usa en los campos de la biología molecular, genómica, transcriptómica, epigenética, síntesis de ácido nucleico, secuenciación de ácido nucleico y similares. La ADN polimerasa Pol theta mutante de la presente invención, o un fragmento funcional de la misma, se puede usar en muchas plataformas de tecnología, incluyendo pero sin limitación micromatrices, perlas y citometría de flujo, y serán útiles en numerosas aplicaciones, como la investigación genómica, validación de dianas de fármacos, el descubrimiento de fármacos, identificación de biomarcadores de diagnóstico y evaluación terapéutica.
Ejemplos
Materiales y reactivos
T odos los productos químicos y reactivos se adquirieron en Sigma Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, Francia) o Thermo Fisher Scientifics (Courtaboeuf, Francia) y eran de la más alta pureza. Las enzimas comerciales polinucleótido quinasa de T4, ADN ligasa de T4 y ARN ligasa 1 de T4 se obtuvieron en New England Biolabs (NEB). Las enzimas utilizadas para la digestión de nucleósidos, nucleasa Benzonase®, Fosfodiesterasa I del veneno de Crotalus adamenteus y fosfatasa alcalina de la mucosa intestinal bovina se adquirieron en Sigma Aldrich.
Análogos de nucleótidos
Nucleótidos comerciales
Los siguientes nucleótidos se adquirieron en Jena Bioscience: 5-etinil-UTP, 2-Aminopurina-ribósido-5'-trifosfato, 2'-O-metil-CTP, 2'-O-metil-ATP, ara-CTP, ara-ATP, épsilon (e)-ATP.
Los siguientes se adquirieron en Trilink Biotechnologies: grupo 3'-Desoxinucleótidos (3'-dATP, 3'-dCTP, 3'-dGTP, 3'-Desoxi-5-metil-UTP, 3'-dUTP), 5-metil-UTP, ATP, CTP, UTP, GTP, 2-Fluoro-dATP, 2-Fluoro-dCTP, 2'-Fluoro-dGTP, 2'-Fluoro-dTTP, 2'-Fluoro-dUTP, 2'-amino-dATP, 2'-amino-dUTP, 2'-amino-dCTP, 2'-amino-dCTP, 2'-amino-dGTP, 2'-O-metil-dATP, 2'-O-metil-dUTP, 2'-O-metil-dCTP, 2'-O-metil-dGTP, 2'-Azido-dATP, 2'-Azido-dUTP, 2'-Azido-dCTP, 2'-Azido-dGTP.
Nucleótidos sintéticos personalizados
El nucleótido FANA fue sintetizado por M. Hollenstein del Instituto Pasteur, Unite de Chimie Bioorganique des acides nucleiques, CNRS UMR 3523.
Purificación de proteínas
La Pol theta (Pol 0) WT (restos 1792-2590) se expresó a partir de la construcción pSUMO326 (de S. Doublie & S. Wallace, plásmido Addgene N.° 78462) en células BL21 CodonPlus (DE3) RIPL (Agilent technologies). La expresión se realizó por autoinducción en caldo Terrific EZMix™ suplementado con a-lactosa (2 g/l), D-glucosa (0,5 g/l), glicerol (8 ml.l'1), 100 jg .m l'1 de ampicilina y 50 jg .m l'1 de cloranfenicol. Se inocularon 6 l de medio de autoinducción (DO600 de partida, 0,05) y el cultivo se hizo crecer durante 60 h a 20 °C, con cultivos saturados que alcanzaron una DO600 final entre 5 y 8. Las siguientes etapas se realizaron a 4 °C. Las células se recogieron y se resuspendieron en una proporción de 2,5-3 ml por gramo de sedimento celular en tampón de lisis (HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 300 mM, glicerol al 10 %, TCEP 1 mM, imidazol 5 mM, IGEPAL C6-30 al 1,5 % (v/v), CaCb 5 mM, PIe Rc E™ comprimidos de inhibidor de la proteasa sin EDTA y Benzonase® nucleasa 500U. La lisis celular se realizó usando una prensa francesa a 137,89 MPa (20.000 psi). Después de la clarificación por ultracentrifugación a 17.000 rpm durante 1 h, se realizaron dos etapas de purificación en columna. El sobrenadante se aplicó a una resina de Ni-NTA a través de una columna HisTrap HP (GE Healthcare Life sciences) que se equilibró con tampón A (HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM, IGEPAL C6-30 al 0,005 % (v/v), TCe P 1 mM, glicerol al 10 % (v/v)), y se eluyó con un gradiente hasta 500 mM de imidazol con tampón B (HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 300 mM, imidazol 500 mM, IGEPAL C6-30 al 0,005 % (v/v), TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (v/v). Las fracciones de cromatografía Ni-NTA que contenían pol 0 se aplicaron luego a cromatografía de afinidad con heparina después de una dilución doble del contenido de NaCl con tampón de dilución C (HEPES 50 mM pH 7,4, IGEPAL C6-30 al 0,005% (v/v), TCEP 1 mM, glicerol al 10 % (v/v). La columna de heparina HiTrap (GE Healthcare Life sciences) se equilibró con tampón D (HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 50 mM, IGEPAL C6-30 al 0,005% (v/v), TCEP 1 mM y glicerol al 10 % (v/v), y se eluyó con un gradiente hasta 2 M de NaCI con tampón E (HEPES 50 mM pH 7,4, NaCl 2 mM, IGEPAL C6-30 al 0,005 % (v/v), TCEP 1 mM y glicerol al 10 % (v/v). A continuación, la fracción de proteína se concentró y se congeló rápidamente en un baño de nitrógeno líquido antes de almacenarla a -80 °C.
Generación de mutantes
Se generaron construcciones variantes de pol theta (pol 0) mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit Quick-Change II XL (tecnologías Agilent) y se purificaron siguiendo el protocolo descrito anteriormente. Los oligonucleótidos utilizados para la mutagénesis se enumeran en la Tabla II suplementaria.
Oligonucleótidos
Los oligonucleótidos se adquirieron en Eurogentec con pureza RP-HPLC y se disolvieron en agua libre de nucleasas. Las concentraciones se midieron mediante absorbancia UV usando el coeficiente de absorción £ a 260 nm proporcionado por Eurogentec.
Radiomarcaje del cebador de ADNmc
Los oligonucleótidos se marcaron como se indica a continuación: Se incubaron 40 jM del cebador de ADNmc (14 nucleótidos) con [y-32P]ATP (Perkin Elmer, 3000 Ci.mM'1) y polinucleótido quinasa de T4 (New England Biolabs) durante 1 h a 37 °C en un volumen total de 25 jl. La reacción se detuvo calentando la polinucleótido quinasa de T4 a 75 °C durante 10 min. Se añadieron 25 jM de cebador de ADNmc sin marcaje a la mezcla y se calentó durante 5 min hasta 90 °C y se enfrió lentamente a temperatura ambiente durante la noche.
Ensayo de nucleotidiltransferasa radiactiva
Se incubaron 5 jM de Pol 0 con 50 nM de ADNmc marcado en 5' con 32P durante 0 a 30 min a 42 °C en presencia de 5 mM de MnCb en un volumen total de 10 j l de tampón de actividad (T ris 20 mM pH 8, NaCI 150 mM, glicerol al 10 %, IGEPAL C6-30 al 0,01 %, 0,1 mg.ml'1 de BSA). La reacción se inició mediante la adición de 500 jM de NTP canónicos o modificados y se detuvo después de 15 min a 42 °C mediante la adición de EDTA 10 mM y formamida al 98 %. Los productos de la reacción se resolvieron mediante electroforesis en gel sobre un gel de acrilamida al 15 % y urea 8 M. El gel de 0,4 mm de ancho se pasó durante 3-4 horas a 40 V/cm y se escaneó con un lector fosforimager Storm 860 Molecular Dynamics (GE Healthcare).
Ensayo de nucleotidiltransferasa no radiactiva
Se probaron diferentes proporciones de nucleótidos para verificar que cada ribonucleótido canónico fuera igualmente incorporado por la polimerasa. Se incubaron 5 jM de enzima con 500 nM de cebador de ADNmc no marcado (o ADNmc, o cebador de ARNmc marcado con ATTO488 en su extremo 5') y una proporción de 1:1:1:1 de los cuatro ribonucleótidos (500 pM cada uno ) o con 500 pM de ATP, CTP y GTP, y 5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:10) o con 500 pM de ATP, CTP y GTP y 2,5 mM de UTP (1:1:1:5) o 500 pM de ATP y GTP y 2,5 mM de CTP y UTP (1:1:5:5). Se prepararon mezclas adicionales con ATP/CTP y UTP/GTP (500 pM cada uno). La reacción se realizó en el mismo tampón de actividad en presencia de 5 mM de MnCh en un volumen total de 100 pl. Los fragmentos de ARN sintético se limpiaron y se usaron inmediatamente para el análisis de HPLC y para la secuenciación de ARN, para la construcción de bibliotecas de aptámeros o se almacenaron a -80 °C.
Hidrólisis de ARN sintético a nucleósidos y análisis HPLC
Los ARN sintéticos obtenidos después de la extensión del cebador de ADNmc no radiactivo se hidrolizaron de acuerdo con el protocolo anterior27 con una ligera modificación. Primero se limpiaron de 5 a 80 pg de ARN usando el kit RNA Clean & concentrator™-5 (Zymo Research). La limpieza se realizó en dos etapas para permitir la purificación de pequeños fragmentos de ARN de tamaño entre 17 y 200 nt y al mismo tiempo ARN grandes (> 200 nt). El conjunto de ARN purificados se trató con nucleasa Benzonase® (20 U), fosfatasa alcalina (1 U), fosfodiesterasa I (0,05 U) en 50 pl de tampón de digestión (Tris-HCl 50 mM pH 8, MgCh 1 mM, 0,1 mg.ml-1 de BSA). La mezcla se incubó a 37 °C durante 3 h y la digestión se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente para asegurar una lisis total. A continuación, se limpiaron los ribonucleósidos utilizando un concentrador centrífugo Vivaspin®-500 de 10.000 MWCO (Sartorius) y se centrifugaron durante 10 min a 4 °C. Los filtrados se transfirieron a un tubo de inserción para vial de 100 pl para ser analizados adicionalmente por HPLC. Se utilizó una columna Kromasil 100-5-C18 (150 x 4,6 mm) (Sigma Aldrich) para el análisis de HPLC y la muestra se eluyó con un gradiente de 0 a 20 % de 10-3 M Acetonitrilo/TEAAc en 15 min. Se inyectaron soluciones 0,1 mM de los cuatro ribonucleósidos como patrones.
Preparación y secuenciación de la biblioteca de ARN TruSeq
Usamos 100 ng de ARN sintético total y construimos las bibliotecas de secuenciación usando el kit TruSeq Stranded mRNA LT (Illumina, RS-122-2101, San Diego, CA) según lo recomendado por el fabricante, excepto que se omitió la etapa de fragmentación. Todos los reactivos se agregaron a la reacción pero no se realizó la incubación a 94 °C. Las bibliotecas direccionales se controlaron en chips Bioanalyzer DNA1000 (Agilent Technologies, N.° 5067-1504, Santa Clara, CA) y la concentración se determinó utilizando el kit QuBit dsDNA HS (Q32854, Thermo Fisher Scientific). Se secuenciaron en un secuenciador Illumina Hiseq 2500 utilizando un kit de clúster HiSeq SR v4 cBot HS (Illumina, N.° GD-401-4001) y un kit HiSeq SBS v4 de 50 ciclos (Illumina, N.° FC-401-4002) para tener alrededor de 50 millones de lecturas finales únicas de 65 bases por muestra.
Se analizaron diferentes composiciones de bases antes de la secuenciación del ARN. Un conjunto de los cuatro nucleótidos en una proporción de 1:1:1:1 (500 pM cada uno, muestras indicadas como 'N') o con 500 pM de ATP, CTP y GTP y 5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:10, muestras indicadas como '10W) o con 500 pM de a Tp , CTP y GTP y 2,5 mM de UTP (proporción de 1:1:1:5, muestra indicada como '5U') o 500 pM de ATP y GTp y 2,5 mM de CTp y UTp (proporción de 1:1:5:5, muestra indicada como '5U5C').
Análisis estadístico de las lecturas TruSeq
Se realizó un análisis FastQC para comprobar la calidad (puntuación Fret) de las lecturas para cada condición. Por consiguiente, los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software R v3.3.2, el software Shortread v1.32.0 y el software Biostrings v2.42.1. Se utilizó el software Cutadapt v1.14 para eliminar las secuencias del adaptador TruSeq de las lecturas.
Construcción de la biblioteca de aptámeros
El conjunto de ARN sintéticos, obtenido después del ensayo de nucleotidiltransferasa no radiactiva, se utilizó para construir la biblioteca de aptámeros. La síntesis de ARN se detuvo mediante la adición de EDTA 10 mM y los ARN se limpiaron con el kit RNA Clean & concentrator™-5 (N.° R1015, Zymo Research) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante para la purificación de fragmentos de ARN de 17-200 nt. Se ha utilizado la a Rn ligasa I de T4 (N.° M0204L, New England Biolabs) para ligar un fragmento de ARNmc fosforilado en 5' marcado con Cy5 y preferentemente bloqueado en su extremo 3' con ddC para evitar la autoligación (oligonucleótido ARNlig-Cy5) a los ARN recién sintetizados (aceptor de ARN marcado con ATT0488 en su extremo 5'). La mezcla de reacción comprendía 1-20 pmol (preferentemente 10-20 pmol) de aceptor de ARN y 5-40 pmol (preferentemente 20 pmol) de Cy5-ARNlig, ATP 1 mM, 15-25 % (v/v) (preferentemente 20% (v/v) de PEG8000 y RNAsin 1U en un volumen total de 20 pl de tampón de ARN ligasa I de T4 suministrado en el kit del fabricante (New England Biolabs). La mezcla se incubó durante 16 h o durante la noche a 16 °C.
Los productos de la reacción se resolvieron mediante electroforesis en gel sobre un gel de acrilamida al 8 % o 15 % y urea 8 M. El gel de 0,4 mm de ancho se pasó durante 3-4 h a 40 V/cm y se escaneó con un lector Typhoon (GE Healthcare). Se ha realizado una captura de doble imagen utilizando el filtro Alexa488, para la detección de la longitud del ARN aceptor y el filtro Cy5 para la detección de la ligación del Cy5-ARNlig. Durante los procedimientos SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment) es fundamental controlar la etapa de amplificación de aptámeros de ácidos nucleicos que se han unido a la molécula diana. De hecho, es importante tener regiones constantes en los extremos 5' y 3' a cada lado de la secuencia central aleatorizada. Estas regiones deben ser útiles para la reacción de transcripción inversa con el fin de obtener el ADN complementario y realizar la PCR para enriquecer el conjunto para el siguiente ciclo. Las mismas regiones tampoco deben interactuar o formar estructuras secundarias indeseables e influir en la conformación 3D del futuro aptámero.
Los mutantes CS13 y DW9 presentaron una valiosa capacidad para sintetizar secuencias aleatorias de ARN incorporando nucleótidos canónicos o modificados a los extremos 3' de los fragmentos de ADNmc. El conjunto resultante de ARN sirvió como candidatos iniciales para la biblioteca de aptámeros. Para ese fin, se añadió un fragmento fijo de ARN al final de cada ARN sintetizado. Este fragmento puede servir como hebra de matriz para amplificar el aptámero seleccionado después de cada ciclo de SELEX. Los inventores decidieron implementar una ligación del fragmento fijo a cada ARN sintetizado explotando la actividad ARN ligasa I de T4. Los resultados indican que se produce la ligación de estos oligonucleótidos fijos.
Como se explicó anteriormente, la región constante del extremo 5' de cada ARN sintético está constituida por el ARN (15 nucleótidos) o el cebador de ADN (18 nucleótidos) utilizado para iniciar la reacción de elongación. En una segunda etapa, se ha añadido la región constante del extremo 3' mediante ligación de un oligonucleótido de ARN después de la polimerización del cebador. La detección de doble fluorescencia realizada en el mismo gel permitió observar tanto la calidad de la elongación del cebador (fluorescencia verde) como la eficacia de la reacción de ligación (fluorescencia roja). La Figura 13 presenta la tasa de elongación del cebador del mutante DW9 mediante la adición de ribonucleótidos naturales en el extremo 3' de un cebador de ARN. El carril 1 muestra las señales de fluorescencia tanto del cebador de ARN (antes de la elongación) como del ARNlig (antes de la ligación) y dio una idea de la calidad de la detección de la señal obtenida en las condiciones del ensayo. Los carriles 2 a 6 muestran la elongación del cebador en función del tiempo de incubación (5 segundos a 15 minutos) y demuestran un aumento exponencial de la longitud del ARN con la duración de la incubación. Los carriles 7 a 11 corresponden al mismo ARN recién sintetizado que ha adquirido la región constante de 15 nucleótidos por ligación. La eficacia de la ligación se ha evaluado mediante la presencia de fluorescencia verde y roja, lo que da como resultado un color amarillo a lo largo del gel y que corresponde a un tamaño de fragmento de ARN variado. Asimismo, se observa una banda gruesa exactamente a 15, que corresponde a la ligación de la región constante a los cebadores de ARN no alargados que han permanecido en la masa de reacción. Finalmente, el carril 12 muestra la ausencia de autoligación cuando los fragmentos de ARNlig están en presencia de ARN ligasa de T4. De hecho, ninguna banda es visible excepto la "+0" que corresponde a la longitud del propio ARNlig. Esto demuestra además (o confirma) que es posible añadir una región constante al conjunto de ARN sintéticos y que, por tanto, la biblioteca de ARN se puede cribar o amplificar para diferentes aplicaciones, en particular para la selección de aptámeros.
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Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una ADN polimerasa mutante de la subfamilia Pol theta (Pol theta) capaz de realizar una extensión de ácido nucleico sin molde, o un fragmento funcional de dicha polimerasa, que comprende al menos una sustitución de aminoácido en una posición seleccionada del grupo que consiste en: 2322, 2328, 2334, 2335, 2384, 2387 y 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
2. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con la reivindicación 1, o un fragmento funcional de la misma, en donde la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: una sustitución de Prolina (P) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2322, una sustitución de Alanina (A) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2328, una sustitución de Leucina (L) por un aminoácido alifático en la posición 2334, una sustitución de Ácido glutámico (E) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2335, una sustitución de Glutamina (Q) por un aminoácido alifático o un aminoácido polar en la posición 2384, una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2387, y una sustitución de Tirosina (Y) por un aminoácido aromático o un aminoácido alifático en la posición 2391, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
3. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o un fragmento funcional de la misma, en donde:
- el aminoácido en la posición 2322 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Alanina (A) o por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S);
- el aminoácido en la posición 2328 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Valina (V) y Glicina (G) o por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S);
- el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Metionina (M), Isoleucina (I) y Alanina (A);
- el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Glicina (G) y Alanina (A) o por un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Treonina (T) y Serina (S);
- el aminoácido en la posición 2384 está sustituido por una Alanina (A) o un aminoácido polar seleccionado del grupo que consiste en: Asparagina (N), Serina (S) y Treonina (T);
- el aminoácido en la posición 2387 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y Triptófano (W), o por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V);
- el aminoácido en la posición 2391 está sustituido por un aminoácido aromático seleccionado del grupo que consiste en: Fenilalanina (F) y Triptófano (W), o por un aminoácido alifático seleccionado del grupo que consiste en: Alanina (A) y Valina (V); determinándose la posición indicada por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
4. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o un fragmento funcional de la misma, en donde el aminoácido en la posición 2334 está sustituido por una Metionina (M).
5. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o un fragmento funcional de la misma, en donde el aminoácido en la posición 2335 está sustituido por una Glicina (G).
6. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o un fragmento funcional de la misma, en donde la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
7. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con la reivindicación 6, o un fragmento funcional de la misma, en donde la al menos una sustitución de aminoácido se selecciona del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), y sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
8. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un fragmento funcional de la misma, en donde el mutante o un fragmento funcional del mismo comprende una única sustitución de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en: sustitución P por V en la posición 2322 (P2322V), sustitución A por V en la posición 2328 (A2328V), sustitución L por M en la posición 2334 (L2334M), sustitución E por G en la posición 2335 (E2335G), sustitución Q por N en la posición 2384 (Q2384N), sustitución Y por F en la posición 2387 (Y2387F), y sustitución Y por F en la posición 2391 (Y2391F); determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
9. La ADN polimerasa Pol theta mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, o un fragmento funcional de la misma, en donde el mutante o un fragmento funcional del mismo comprende una doble sustitución de aminoácidos L2334M y E2335G, determinándose las posiciones indicadas por alineamiento con la SEQ ID NO: 1.
10. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la ADN polimerasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento funcional de la misma.
11. Un vector de ADN que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 10.
12. Una célula hospedadora que comprende el vector de la reivindicación 11, que se ha depositado en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) del Institut Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, 75724 París, FR, el 14 de septiembre de 2017 con el número de depósito CNCM I-5238 (E.coli A1-1791_CS13), CNCM I-5239 (E.coli A1-1791_DW9), CNCM I-5240 (E.coli A1-1791_MC15) o CNCM I-5241 (E.coli A1-1791_NM11).
13. Un método para incorporar nucleótidos sin molde que comprende incubar la ADN polimerasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento funcional de la misma, con nucleótidos trifosfato en condiciones que permiten la incorporación de nucleótidos en ausencia de un molde.
14. Un método para producir secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias que comprende incubar la ADN polimerasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento funcional de la misma, con nucleótidos trifosfato en condiciones que permiten la incorporación de nucleótidos degenerados o aleatorios para producir secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
15. El método de la reivindicación 14, que además comprende añadir una secuencia de nucleótidos fija al extremo 3' de las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
16. El método de la reivindicación 14 ó 15, que además comprende amplificar las secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias, y eventualmente comprende además clonar las secuencias amplificadas en un vector para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
17. Un kit para generar una biblioteca de ácido nucleico funcional que comprende la ADN polimerasa mutante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un fragmento funcional de la misma, y que eventualmente comprende además reactivos para la incorporación de nucleótidos degenerados o aleatorios y/o un vector para generar una biblioteca de secuencias de nucleótidos degeneradas o aleatorias.
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