ES2896108T3 - Biomarcadores de microARN en sangre para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de diagnóstico ex vivo de la enfermedad de Alzheimer y/o una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer, en un sujeto, caracterizado porque el procedimiento implica las siguientes etapas: - evaluación in vitro de un nivel de al menos hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) como microARN biomarcadores en la muestra de sangre del sujeto, y - comparación del nivel evaluado de cada microARN biomarcador con su nivel medio observado en un control sin demencia.

Description

DESCRIPCIÓN

Biomarcadores de microARN en sangre para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer

Campo técnico

La presente invención proporciona un procedimiento para diagnosticar ex vivo la enfermedad de Alzheimer y/o una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto.

Antecedentes de la técnica

La causa más común de demencia relacionada con la edad en todo el mundo es la enfermedad de Alzheimer (EA), un trastorno neurodegenerativo que deteriora progresiva e irreversiblemente la memoria y la cognición, y eventualmente conduce a una pérdida masiva de neuronas cerebrales y la muerte. Con una tendencia mundial de envejecimiento entre las poblaciones, el número de casos de EA está creciendo rápidamente. En 2013, se estimaron 44,4 millones de personas con demencia en todo el mundo. Este número aumentará a un estimado de 75,6 millones en 2030 [1]. Los costos globales relacionados con la EA son similares a la carga financiera de la enfermedad cardíaca y el cáncer, lo que coloca a la EA entre los principales problemas de salud no resueltos [2]. A pesar de la intensa investigación en todo el mundo, no existen tratamientos eficaces para la EA porque su(s) causa(s) sigue(n) sin estar clara(s). Una de las principales razones es la falta de biomarcadores y pruebas fácilmente disponibles que hagan posible el diagnóstico temprano y confiable de la EA, aunque la evidencia creciente indica que la efectividad de las modalidades terapéuticas depende fundamentalmente del diagnóstico temprano de la EA, antes de que produzca una pérdida masiva de neuronas.

Los avances en el conocimiento de los investigadores de la EA han demostrado que los síntomas clínicos de la EA generalmente se desarrollan después de un procedimiento patogénico preclínico de varias décadas de duración, definido como la etapa preclínica asintomática [3]. A esta etapa le sigue la etapa clínica temprana de EA, que se presenta en algunos pacientes con deterioro cognitivo leve (DCL). Los problemas de memoria en el DCL pueden ser mínimos o leves, pero con el tiempo los pacientes con DCL se convierten en EA a una tasa de aproximadamente el 10 % al 15 % por año [4, 5]. Después de la etapa inicial, la EA clínica progresa de leve a moderada a severa, etapa tardía. Los avances en la comprensión de los investigadores de las etapas de la enfermedad se reflejan en los criterios de diagnóstico e investigación recientemente actualizados para la EA [6-8]. No existen herramientas lo suficientemente sensibles para diagnosticar la EA preclínica. Los criterios de diagnóstico clínico básicos actualizados solo permiten el diagnóstico de EA probable o posible en pacientes con demencia clínica y en pacientes con DCL (DCL atribuible a EA; EA temprana). En la actualidad, un diagnóstico definitivo de EA sólo es posible basándose en el examen histopatológico post mortem del cerebro.

En la práctica clínica actual, el diagnóstico de EA comienza con pruebas neuropsicológicas como el Mini Examen del Estado Mental (MMSE). Sin embargo, los ensayos neuropsicológicos no pueden, por ejemplo, detectar la EA temprana en pacientes con deterioro cognitivo subjetivo (DCS) que resuelven las pruebas con puntuaciones altas debido a sus capacidades cognitivas generalmente altas, pero que observan subjetivamente una disminución en su eficiencia mental. Actualmente, los diagnósticos de Ea pueden ser respaldados por un ensayo bioquímico en líquido cefalorraquídeo (LCR) de la proteína tau "total" e hiperfosforilada (niveles aumentados en el LCR) y la isoforma de 42 aminoácidos del péptido Ap (niveles disminuidos en el LCR), lo que refleja la patología cerebral. Los procedimientos de imágenes cerebrales, como la tomografía por emisión de positrones (PET) y la resonancia magnética estructural (sMRI), pueden respaldar aún más el diagnóstico. Todos estos ensayos de EA tienen importantes barreras de costo y acceso a la atención. Los costos y requisitos enormemente altos para equipos sofisticados representan una barrera fundamental para la aplicación de imágenes cerebrales como una herramienta de detección de EA a gran escala en la mayoría de los entornos clínicos. Aunque el LCR parece reflejar los cambios bioquímicos que se producen en el cerebro y, por lo tanto, se considera el fluido biológico más adecuado para estudiar enfermedades neurodegenerativas, los análisis de LCR también implican altos costos, requieren una punción lumbar que es un procedimiento invasivo, incómodo y relativamente riesgoso. Además, no siempre son factibles, especialmente en los ancianos. Debido a los límites involucrados en las punciones lumbares múltiples y frecuentes, las pruebas de LCR tampoco son adecuadas para la monitorización simultánea de ensayos terapéuticos, eficacia de fármacos y estudios longitudinales. Por lo tanto, si bien el desarrollo reciente de tecnologías que abordan el 'identificador de EA' en el LCR refleja un progreso significativo en el diagnóstico de EA, los biomarcadores de LCR no cumplen ni es probable que cumplan los criterios de diagnóstico óptimos para la práctica clínica.

Según lo indicado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA), un biomarcador preferible para aplicaciones clínicas debe estar disponible en muestras biológicas que sean fáciles de obtener en un procedimiento seguro y no invasivo, y los procedimientos de laboratorio deben ser confiables, estables, y rentables. A la luz de los criterios de biomarcadores preferibles, queda claro que el progreso en el diagnóstico de EA se basa en gran medida en la identificación de nuevos biomarcadores de diagnóstico de EA de sensibilidad y especificidad mejoradas, en tejidos de diagnóstico más fácilmente disponibles, como la sangre [8, 9]. En consecuencia, los esfuerzos de investigación en crecimiento exponencial se han centrado recientemente en el desarrollo y la validación de biomarcadores sanguíneos no invasivos y generalizables. Todos los paradigmas de la biología sistémica se han utilizado como modalidades en la búsqueda de identificadores moleculares de EA sanguíneos, incluidas proteómica, lipidómica, transcriptómica, metabolómica y epigenética [9]. Sin embargo, esta investigación se enfrenta a múltiples obstáculos y en la actualidad no se ha aprobado para la práctica clínica ninguna prueba definida basada en biomarcadores sanguíneos.

Una de las estrategias más prometedoras para la identificación de biomarcadores de EA sanguíneos se concentra en los microARN circulantes (miARN) [9-11]. Los microARN representan una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes, de aproximadamente 22 pb de longitud, que reprimen principalmente la expresión génica en el nivel postranscripcional al unirse e inhibir dianas de ARNm particulares. Hasta ahora, se han identificado más de 2000 miARN en el genoma humano y parece que >60 % de los genes codificadores de proteínas humanas están regulados por miARN. El estudio de la posible aplicación de miARN como biomarcadores de EA fue impulsado por la creciente evidencia de las importantes funciones reguladoras de miARN en diferentes patologías, incluida la neurodegeneración, y la expresión alterada de miARN informada en muchos estados patológicos en biofluidos [12-14]. Los miARN son abundantes en el torrente sanguíneo y pueden operar tanto en las células adyacentes como en áreas más distantes del cuerpo a través de un mecanismo similar a las hormonas [13-15]. Se ha informado que los miARN se transportan en la sangre en exosomas, lipoproteínas de alta densidad y en complejos con proteínas como Argonaute2, protegiéndolos de la degradación [16-19]. Las entradas de bases de datos basadas en miARN circulantes han aumentado drásticamente en los últimos años, lo que sugiere que la identificación de miARN circulantes como biomarcadores de enfermedades es uno de los temas más candentes en la investigación de miARN [12]. Sin embargo, a pesar de varias investigaciones, hasta el momento no se han aprobado biomarcadores de miARN eA.

Parte de la técnica anterior describe el uso de la detección de miARN para diagnosticar la EA [9-11, 20-30], pero ninguna técnica anterior describió un procedimiento basado en los identificadores de miARN informados en esta solicitud. Además, ninguna técnica anterior ha descrito hasta ahora un panel de miARN basado en plasma sanguíneo, que se determinaron en pacientes con EA y DCL diagnosticados tanto por pruebas neuropsicológicas como por biomarcadores de LCR (líquido cefalorraquídeo) (biomarcadores de miARN identificados en relación con los biomarcadores de LCR), y además, que se adhieren a las directrices actuales para la estandarización de variables preanalíticas para biomarcadores sanguíneos [31]. Además, ninguna técnica anterior informa de miARN que puedan detectar la eA temprana en pacientes con DCS. Además, ninguna técnica anterior informa de miARN que puedan diferenciar etapas iniciales de etapas tardías en la EA.

Hasta ahora, la búsqueda de biomarcadores de miARN confiables para la EA en sangre periférica ha sido un gran desafío debido a las dificultades con la estandarización de los procedimientos analíticos y la baja reproducibilidad de los resultados. La falta de éxito en la identificación de biomarcadores de miARN sanguíneos adecuados y reproducibles se considera actualmente, en un alto grado, el resultado de una variabilidad sustancial entre varios centros de diagnóstico en los factores preanalíticos, analíticos y posanalíticos, refiriéndose a ambos los diagnósticos de los pacientes reclutados para los estudios y la metodología de manipulación de sangre y análisis de miARN [31, 32]. Para responder a la necesidad de una estandarización extensa de materiales y procedimientos, en su estudio, los inventores emplearon las directrices actuales para la estandarización de variables preanalíticas para biomarcadores sanguíneos [31]. Además, la selección de los sujetos de estudio implicó diagnósticos de EA basados en pruebas neuropsicológicas y examen neurológico en cumplimiento de los estándares de oro actuales [6, 7], así como basados en marcadores de LCR, que se determinaron en pacientes con DCL, DCS y EA según las recomendaciones actuales y utilizando los ensayos estandarizados de LCR recomendados por el consorcio europeo JPND BIOMARKAPD [31]. Solo dos estudios previamente informados de miARN circulante en la EA se realizaron en pacientes con EA en los que los resultados de las pruebas neuropsicológicas se confirmaron mediante otras pruebas bioquímicas, en particular mediante un ensayo bioquímico de LCR [23, 29]. Ninguno de los estudios informados anteriormente se realizó en pacientes con DCL en los que se realizó un ensayo de LCR que indicó una etapa temprana de la EA.

Descripción de la invención

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Se describe un panel de microARN biomarcadores para su uso en un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) basado en un perfil de microARN específicos que están presentes en la sangre. Más específicamente, el panel se puede utilizar para detectar una etapa temprana de EA en sujetos con deterioro cognitivo leve (DCL) debido a la enfermedad de Alzheimer o con deterioro cognitivo subjetivo debido a la enfermedad de Alzheimer y para diagnosticar EA en pacientes con demencia clínica.

Se describe un panel de microARN biomarcadores para su uso en un procedimiento de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer y/o deterioro cognitivo leve (DCL) debido a la enfermedad de Alzheimer y/o deterioro cognitivo subjetivo (DCS) debido a la enfermedad de Alzheimer, en particular para la detección de una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en sujetos con deterioro cognitivo leve o con deterioro cognitivo subjetivo y/o para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en pacientes con demencia clínica en un sujeto, donde el panel comprende al menos uno seleccionado de entre hsa-miR-151a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa-miR-30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-320c (Se Q ID NO: 9) ) y el procedimiento implica evaluar el nivel de dichos microARN biomarcadores en la muestra de sangre del sujeto.

El panel puede comprender al menos un microARN biomarcador adicional seleccionado de entre el grupo que consiste en hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO 14), hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa- miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16), hsamiR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18), hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19).

El panel puede comprender al menos uno de hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5)y/o hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3). Por tanto, se describe un panel de microARN biomarcadores que comprende hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsamiR-486-5p (SEQ ID NO: 3) para los usos descritos en esta invención, por ejemplo, para usos en un procedimiento para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y/o el deterioro cognitivo leve (DCL) debido a la enfermedad de Alzheimer y/o el deterioro cognitivo subjetivo (DCS) debido a la enfermedad de Alzheimer, en particular para la detección de una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en sujetos con deterioro cognitivo leve o con deterioro cognitivo subjetivo y/o para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en pacientes con demencia clínica en un sujeto, y donde el procedimiento implica evaluar el nivel de dichos microARN biomarcadores en una muestra de sangre del sujeto.

El panel puede comprender al menos dos, preferentemente tres, preferentemente cuatro, preferentemente cinco, preferentemente seis, preferentemente siete, preferentemente ocho, preferentemente los nueve microARN biomarcadores seleccionados de entre hsa-miR-151a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa-miR-30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa -miR-320c (SEQ ID NO: 9).

El uso puede incluir el diagnóstico de la progresión de la enfermedad.

El panel puede incluir hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y el nivel de hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) se usa para evaluar la progresión de la enfermedad.

El uso puede incluir diferenciar si el sujeto padece la enfermedad de Alzheimer o un deterioro cognitivo leve debido a la enfermedad de Alzheimer.

En un aspecto adicional, el panel puede incluir adicionalmente al menos uno de los microARN hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11) y/o hsa-miR-22-5p (SEQ ID NO: 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13).

La muestra de sangre utilizada para la evaluación puede tener un volumen de como máximo aproximadamente 0,6 ml.

La evaluación del nivel de dichos microARN biomarcadores puede realizarse mediante un procedimiento de qRT-PCR. El sujeto puede ser un humano.

También se describe un kit para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y/o el deterioro cognitivo leve (DCL) debido a la enfermedad de Alzheimer y/o el deterioro cognitivo subjetivo (DCS) debido a la enfermedad de Alzheimer, en particular para la detección de una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en sujetos con deterioro cognitivo leve o con deterioro cognitivo subjetivo y/o para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en pacientes con demencia clínica en un sujeto, donde el kit comprende:

- Instrucciones de uso

- medios para separar el plasma de las células sanguíneas para evitar la hemólisis;

- medios para el aislamiento de ARN y preferentemente controles de aislamiento de ARN;

- medios para la síntesis de ADNc por transcripción inversa, preferentemente con un control de síntesis de ADNc para evaluar la reacción; y

- un panel, preferentemente un panel qPCR, de cebadores para miARN que se utilizarán como biomarcadores donde el(los) miARN que se utilizarán como biomarcadores incluyen al menos uno de hsa-miR-151a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa-miR-30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR- 486-5p (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-320c (SEQ ID NO: 9),

preferentemente adicionalmente al menos uno de hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18), hsamiR-1260a (SEQ ID NO: 19), y/o

preferentemente al menos uno de hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11) y/o hsamiR-22-5p (SEQ ID NO: 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13).

También se describe un panel de microARN biomarcadores para su uso en un procedimiento de discriminación de las etapas tempranas frente a las tardías de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, caracterizado porque el panel comprende al menos uno, preferentemente dos microARN seleccionados de entre hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11) hsa-miR-22-5p (SEQ ID NO: 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13); y el procedimiento implica evaluar el nivel de dichos microARN biomarcadores en la muestra de sangre del sujeto. El objetivo de la invención es un procedimiento de diagnóstico ex vivo de la enfermedad de Alzheimer y/o una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer, en un sujeto, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: - evaluación in vitro de un nivel de al menos hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) como microARN biomarcadores en la muestra de sangre del sujeto, y

- comparación del nivel evaluado de los microARN biomarcadores con el nivel observado para un control sin demencia. Otro objetivo de la invención es el uso de un panel de microARN biomarcadores que comprende hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y/o una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto mediante el análisis del nivel de dichos microARN biomarcadores ex vivo en una muestra de sangre de dicho sujeto.

Preferentemente, en un procedimiento o uso, se evalúa adicionalmente un nivel de al menos un microARN biomarcador adicional, donde el microARN biomarcador adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa- miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18), hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19), donde preferentemente los microARN biomarcadores evaluados incluyen hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18).

Preferentemente, el procedimiento o uso implica evaluar adicionalmente el nivel de

(a) al menos uno, preferentemente dos, preferentemente tres, preferentemente cuatro, preferentemente cinco, preferentemente seis, preferentemente los siete, microARN biomarcadores seleccionados de entre un grupo de hsamiR-151a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa- miR-30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-320c (SEQ ID NO: 9), y/o (b) hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16), hsamiR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18) y hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19).

Preferentemente, el procedimiento incluye una evaluación adicional de un nivel de al menos uno de los microARN biomarcadores hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11) y/o hsa-miR-22-5p (SEQ ID NO: 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13).

Preferentemente, la muestra de sangre tiene un volumen de como máximo aproximadamente 0,6 ml.

Preferentemente, la evaluación del nivel de dichos microARN biomarcadores se realiza mediante un procedimiento de qRT-PCR.

Preferentemente, el sujeto es un ser humano.

También se describe un procedimiento para discriminar las etapas tempranas frente a las tardías de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que implica las siguientes etapas:

- evaluación in vitro de un nivel de al menos uno de los microARN biomarcadores en una muestra de sangre de un sujeto, donde los microARN biomarcadores se seleccionan de entre un grupo de hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11), hsa-miR-22-5p (SEQ ID 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID 13)

- comparación del nivel evaluado de los microARN biomarcadores con el nivel observado para un control sin demencia.

El sujeto puede ser un humano.

También se describe el uso de un panel de microARN biomarcadores que comprende al menos uno de hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11) y/o hsa-miR-22-5p (SEQ ID NO: 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13) para discriminar las etapas tempranas frente a las tardías de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto mediante el análisis de una muestra de sangre de dicho sujeto.

El sujeto puede ser un humano.

La expresión "enfermedad de Alzheimer tardía", "etapa tardía de la enfermedad de Alzheimer" o "EA tardía" significa cualquier etapa de la enfermedad de Alzheimer que esté más avanzada que la EA temprana en el deterioro cognitivo leve e incluye etapas moderadas y avanzadas de la EA.

El procedimiento puede detectar la etapa temprana de la EA en pacientes con DCL y en pacientes con DCS. Además, la prueba puede identificar la EA en pacientes con demencia clínica.

La prueba supera las barreras de alto costo y acceso a la atención de los ensayos de diagnóstico de EA actualmente disponibles y cumple con los criterios óptimos indicados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para la práctica clínica.

- La prueba es mucho menos costosa, significativamente más simple de manejar, mucho más fácil de usar y más inmediatamente implementable en entornos clínicos que cualquiera de los ensayos bioquímicos o de imágenes cerebrales existentes.

- La prueba se puede realizar en muestras de sangre, que son fáciles de obtener en un procedimiento clínico seguro y no invasivo (actualmente no existen pruebas de sangre aprobadas para el diagnóstico de EA).

- La prueba se puede realizar con un volumen de sangre muy pequeño: solo se requieren 0,6 ml de sangre.

- En comparación con las pruebas basadas en LCR que se realizan actualmente, que requieren un procedimiento invasivo de punción lumbar y, a menudo, no son factibles en pacientes de edad avanzada, la prueba propuesta minimiza el riesgo y la incomodidad para los pacientes y, por lo tanto, amplía su aplicación en una población que envejece.

- Debido a las características anteriores, la prueba puede convertirse en la herramienta principal en una campaña de diagnóstico de EA a gran escala y una primera etapa en un procedimiento de diagnóstico de EA de varias etapas, para identificar a aquellos que deben someterse a más pruebas, lo que implica procedimientos más costosos y equipos sofisticados.

- La prueba puede ser útil para diagnósticos a gran escala y rentables en clínicas, que carecen de equipos especializados, lo que constituye una ventaja clave para las capacidades de los laboratorios de diagnóstico en la amenaza cada vez más global de la EA.

- La prueba podría ser útil para monitorear intervenciones terapéuticas, especialmente para medidas repetidas. - La prueba también se puede utilizar para el cribado de segunda línea, para la confirmación de los diagnósticos de EA obtenidos en base a otras herramientas de diagnóstico.

- Este es el primer panel de miARN sanguíneos que puede detectar la EA temprana en pacientes con DCS.

- La prueba ofrece la posibilidad de diagnosticar EA temprana en pacientes con DCL y DCS. Se necesitan desesperadamente biomarcadores circulantes fácilmente disponibles para la EA temprana porque la creciente evidencia indica que la efectividad de las modalidades terapéuticas depende fundamentalmente del diagnóstico temprano de la EA.

- La prueba se basó en el protocolo preanalítico de sangre universal recomendado y, por lo tanto, facilita una mayor reproducibilidad mediante la eliminación de la variabilidad preanalítica entre los centros de diagnóstico. La prueba también fomenta la validación cruzada entre cohortes y laboratorios. El procedimiento detallado empleado para la recolección de muestras de sangre se adhiere a las directrices actuales para la estandarización de variables preanalíticas para biomarcadores sanguíneos [18]. La falta de éxito en la identificación de biomarcadores de EA sanguíneos adecuados se considera actualmente en gran parte el resultado de una variabilidad sustancial entre las metodologías de manipulación de sangre en varios centros de diagnóstico [18].

- La prueba también ofrece una mayor probabilidad de reproducibilidad porque el identificador de EA en sangre basado en miARN se determinó en sujetos con EA y DCL, en los que el diagnóstico de EA se basó no solo en pruebas neuropsicológicas, sino que también se vio respaldado por los resultados del ensayo de LCR.

- Los miARN identificados pueden separar a los pacientes con EA de los individuos de control sin demencia, así como a los pacientes con DCL con EA temprana de los de control sin demencia con la sensibilidad y especificidad adecuadas.

- Este es el primer panel sanguíneo y el procedimiento que puede diferenciar las etapas tempranas de las etapas tardías de la EA. Se requieren biomarcadores para diferenciar la EA temprana de la eA tardía con el fin de controlar la eficacia de las terapias existentes y nuevas, y también para el reclutamiento adecuado de pacientes con EA para los ensayos clínicos en la etapa en la que una intervención farmacológica aún es posible y podría ser beneficiosa.

Se describe un procedimiento para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (EA) en pacientes con deterioro cognitivo leve (DCL), en pacientes con deterioro cognitivo subjetivo (DCS) y también en pacientes con demencia clínica. Más específicamente, los inventores encontraron 9 miARN que no se han informado previamente en sangre en ningún contexto relacionado con la EA, que muestran un patrón de expresión constantemente cambiado en el plasma sanguíneo durante las etapas tempranas y tardías de la EA, en pacientes con DCL, EA y DCS en comparación con muestras de sangre de sujetos sin demencia de la misma edad. Por lo tanto, un panel de biomarcadores de miARN sanguíneos de EA consiste en: hsa-miR-151a-5p, hsa-miR-30b-5p, hsa-miR-486-5p, hsa-miR-33a-5p, hsa-miR-483 -5p, hsa-miR-18a-5p, hsa-miR-320a, hsa-miR-320b, hsa-miR-320c (Tabla 1). El ensayo de detección de miARN en plasma sanguíneo se basó en la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real (qRT-PCR). La fiabilidad de la metodología de los inventores para la evaluación de los niveles de miARN en sangre se confirmó usando 6 miARN de control que se informaron previamente como vinculados con la patología de la EA (Tab. 1); estos miARN se informaron previamente en 4 estudios diferentes como miARN cuyos niveles se modificaron en pacientes con EA: 4 miARN en sangre de pacientes con EA (hsa-miR-502-3p [28], hsa-miR-103a-3p [22], hsa-miR-301a-3p y hsa-miR-142-3p [21]); y 2 miARN en cerebro con EA (hsa-miR-200a-3p y hsa-miR-1260a [33]. Los inventores encontraron que estos 6 miARN estaban de hecho desregulados en muestras de sangre de pacientes con EA en comparación con controles de la misma edad sin demencia.

El nuevo hallazgo en el estudio de los inventores es también la identificación de 4 miARN hsa-miR-423-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-22-5p y hsa-miR-335-3p en suero sanguíneo que puede diferenciar claramente a los pacientes en una etapa de EA temprana frente a una etapa tardía, es decir, pacientes con DCL debido a EA (DCL-EA) de pacientes en una etapa de EA (EA) más avanzada (más tardía) (Tab. 1, EA frente a DCL-EA).

Tab. 1. El panel de biomarcadores de miARN san uíneos de la EA.

La presente invención proporciona un procedimiento novedoso para determinar si una persona padece EA incluso en la etapa temprana de la enfermedad. Este procedimiento es menos invasivo, menos costoso, más rápido y más disponible en un entorno clínico que cualquier otro procedimiento aprobado para respaldar el diagnóstico de EA, como los ensayos bioquímicos convencionales de LCR o las técnicas de imágenes cerebrales. Además, los inventores han presentado el primer procedimiento disponible para diferenciar entre las etapas tempranas y tardías de la EA basándose en un ensayo bioquímico de los fluidos corporales.

La prueba para identificar a los pacientes con EA temprana y/o tardía implica las siguientes etapas: obtener la muestra de prueba mediante la extracción de tan solo 0,6 ml de sangre de un paciente, obtener una muestra de plasma/suero mediante centrifugación, aislando miARN y realizando un análisis de cualquiera de los 9 miARN identificados en este estudio o cualquier combinación de los mismos utilizando qRT-PCR.

La prueba para discriminar la EA en etapa temprana o tardía utiliza el mismo procedimiento para obtener plasma sanguíneo y aislamiento de miARN y también se basa en un análisis de qRT-PCR de cuatro niveles de miARN adicionales: hsa-miR-423-5p y hsa-miR- 126-5p, hsa-miR-22-5p y hsa-miR-335-3p. Estos se expresan diferencialmente en la EA completamente desarrollada en comparación con la EA temprana de una manera que permite separar a los pacientes con EA temprana de la tardía con la especificidad y sensibilidad adecuadas.

Uno de los aspectos novedosos del estudio fue que todos los pacientes involucrados, incluidos los pacientes con DCL, fueron diagnosticados basándose no solo en las pruebas neuropsicológicas, el examen neurológico y la neuroimagen, sino también mediante el uso de biomarcadores canónicos de EA LCR. En los estudios previos de identificadores de EA de miARN en sangre, la evaluación de marcadores de LCR estuvo en su mayoría ausente [20-22; 24-28,30] o disponible solo para pacientes con EA [23,29]. La estrategia de diagnóstico en el presente estudio permitió el análisis de miARN en el plasma sanguíneo no solo en las etapas tardías de la EA, sino también en la etapa temprana de la EA, que es un aspecto aún más novedoso de este estudio. Este es el primer estudio con la participación de pacientes con DCL en la etapa temprana de la EA, es decir, DCL con una alta probabilidad de que el DCL se deba a la EA según lo confirman los niveles de marcadores del LCR (pacientes denominados como DCL-EA). Los inventores compararon a los pacientes con EA temprana (DCL-EA) así como a los pacientes con EA tardía (EA) con dos grupos de control separados, sin demencia, de la misma edad. El panel de biomarcadores de miARN identificados en la EA y en pacientes con DCL-EA se verificó adicionalmente en los pacientes con DCL con bajas indicaciones de EA (grupo denominado DCL) y en pacientes con deterioro cognitivo subjetivo (DCS) con dos biomarcadores de EA en LCR ligeramente positivos.

Los resultados obtenidos indicaron un panel de 9 nuevos miARN en sangre que separaban claramente a los pacientes con EA, así como a los pacientes con DCL-EA de los sujetos de control sin demencia. Además, el panel de los 9 nuevos miARN sanguíneos distinguió a los pacientes con DCL con baja indicación de EA de los sujetos de control sin demencia. Además, el panel de los 9 nuevos miARN sanguíneos distinguió también a los pacientes con deterioro cognitivo subjetivo (DCS) con dos marcadores de EA LCR ligeramente positivos de sujetos de control sin demencia. Por lo tanto, los resultados sugieren que el panel sanguíneo de miARN puede reemplazar los marcadores de LCR para la identificación de EA temprana y tardía. Además, puede detectar eA temprana en pacientes con DCS con leve indicación de EA y en pacientes con DCL con baja indicación de EA según los niveles del biomarcador de LCR.

El diseño del estudio se muestra esquemáticamente en la Fig. 1. El estudio consistió en dos etapas principales de perfilado de miARN en muestras de plasma sanguíneo: el experimento piloto (Etapa 1, conjunto de trenes) y el experimento de verificación (Etapa 2, conjunto de pruebas). En la primera etapa (experimento piloto), los inventores utilizaron microarrays Exicon basados en qRT-PCR para evaluar los niveles en plasma sanguíneo de 178 miARN. Estos 178 miARN se encontraron previamente en el plasma sanguíneo humano total y se seleccionaron en función de los datos recopilados en la base de datos Exicon. El experimento piloto se realizó en tres grupos de individuos: en sujetos sanos no dementes de la misma edad que los pacientes (grupo de control 1, CTR1), en pacientes diagnosticados de EA (EA1) y en pacientes con EA temprana, es decir, diagnosticados con DCL con alta probabilidad de que el DCL se debiera a la EA (DCL-EA1), (Tab. 2.). Este experimento piloto condujo a la identificación de 15 miARN expresados diferencialmente, con los cambios más grandes diferenciando tanto EA1 frente a CTR1 de control, y DCL-EA1 frente a CTR1 de control (grupo de control 1), con significancia estadística evaluada usando una prueba t y ANOVA. Entre estos 15 miARN, 9 miARN no se informaron previamente en el contexto de la EA y, en particular, no se notificaron como posibles biomarcadores sanguíneos de EA. Los 15 miARN se eligieron para su validación en la segunda etapa del estudio, en grupos de sujetos posteriores separados.

Además, durante la comparación del perfil de miARN del grupo DCL-EA1 en la etapa temprana de la EA con el grupo EA1 en la etapa tardía de la EA, los inventores encontraron que cuatro miARN se expresaron de manera diferencial con los cambios más altos entre los pacientes de la EA temprana y la tardía. Por lo tanto, estos cuatro miARN también se pueden usar en el procedimiento, lo que permite una diferenciación adicional y un análisis del progreso de la enfermedad.

Además, los miARN identificados por los inventores en esta invención se vincularon a un grupo de genes/proteínas diana aguas abajo conocido por contribuir a la patogénesis de la EA. La red de dianas se centró en las proteínas clave para la patogénesis de la EA, incluida la proteína MAPT (tau), la proteína precursora de amiloide (APP) y las enzimas involucradas en la producción del amiloide tóxico. Además, las dianas incluían proteínas de la cadena respiratoria mitocondrial (Cxi, CxIV, CxV) que estaban implicadas en el estrés oxidativo en la patología de la EA, y varias otras proteínas que se sabe que ocupan un lugar central en la señalización celular aberrante en la patología de la EA, como MAPK, el receptor del factor de crecimiento de la insulina I (IGFR I), proteínas p53 y Bcl-2 relacionadas con la apoptosis y proteínas implicadas en la autofagia, endocitosis, regulación del citoesqueleto y señalización del calcio (Tab. 8, 9 y Fig. 8, 9). Se sabe que la EA es una enfermedad compleja y heterogénea con varias vías de señalización deterioradas que contribuyen a su mecanismo patológico, como se muestra esquemáticamente en la Fig. 9. Debido a la heterogeneidad de la EA, además de algunas características comunes de la EA como la amiloidosis y la tauopatía, los pacientes individuales muestran endofenotipos de la enfermedad que difieren en la composición de las vías de señalización/proteínas que contribuyen a la enfermedad. Por tanto, los miARN identificados se validan y corroboran además como particularmente relevantes y adecuados para los propósitos de diagnóstico descritos en esta invención, ya que pueden estar relacionados con las dianas moleculares que son relevantes para el endofenotipo de EA individual de un paciente. Por lo tanto, el análisis de los miARN y los grupos y paneles de los mismos, como se describe en esta invención, no solo sirven como identificadores moleculares básicos relacionados con la EA, sino también como un reflejo de la patología compleja de la EA. Así, por ejemplo, los miARN, grupos y paneles de los mismos como se describen en esta invención permiten que los pacientes se subclasifiquen para terapias dirigidas y/o personalizadas adicionales y para monitorear la efectividad del tratamiento.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra el esquema de diseño del estudio.

La Fig.2 muestra el nivel de cambios en los niveles de expresión determinados por qRT-PCR en la Etapa 1 del estudio para los 15-miARN con el nivel de cambios más alto entre: (A) pacientes con EA tardía EA1 frente a controles sin demencia CTR1 y (B) pacientes con EA temprana DCL-EA1 frente a controles sin demencia CTR1. La Fig. 2C muestra los datos para pacientes con EA tardía y temprana frente al control sin demencia en un gráfico (EA1 y DCL-EA1 frente a CTR1).

La Fig. 3 muestra el nivel de cambios en los niveles de expresión obtenidos por qRT-PCR para los cuatro miARN: hsa-miR-423-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-22-5p y hsa-miR- 335-3p diferenciando muestras de EA tardía frente a EA temprana (pacientes con EA1 frente a pacientes con DCL-EA1).

La Fig. 4. muestra que los cuatro miARN: hsa-miR-423-5p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-22-5p y hsa-miR-335-3p se distinguen claramente entre la EA temprana y la tardía como se muestra en las curvas de característica operativa del receptor (ROC). Se prepararon curvas ROC basadas en los niveles de expresión de miARN en pacientes con EA temprana (grupo DCL-EA1) frente a pacientes en etapas tardías de EA (grupo EA1).

La Fig. 5. muestra el nivel de cambios en los niveles de expresión obtenidos por qRT-PCR en la Etapa 2 del estudio para los identificadores de 15 miARN que diferencian los grupos de pacientes del grupo de control sin demencia CTR2. (A) Pacientes con EA EA2 frente a controles CTR2, (B) Pacientes con EA temprana DCL-EA2 frente a controles CTR2, (C) Pacientes con DCL con baja indicación de EA frente a controles CTR2, (D) Pacientes con DCS con leve indicación de EA frente a controles CTR2.

La Fig. 6 muestra la comparación del nivel de cambios en los niveles de expresión obtenidos por qRT-PCR para los identificadores de 15-miARN que diferenciaban a los pacientes con EA2, DCL-EA2, DCL y DCS frente a los controles CTR2 sin demencia.

La Fig. 7. muestra que los dos miARN de ejemplo: hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14) se distinguen claramente con una alta sensibilidad y especificidad tanto en pacientes con EA temprana como en pacientes con EA tardía de controles sin demencia. Las curvas de características operativas del receptor (ROC) se prepararon para dos conjuntos de muestras llamados conjunto de trenes (línea discontinua; datos de la Etapa 1, experimento piloto) y conjunto de prueba (línea continua; datos de la Etapa 2, experimento de verificación) para confirmar la capacidad de cada miARN para separar adecuadamente las muestras. Los parámetros de la curva ROC para los 15 miARN analizados se muestran en la Tab. 7. EA, muestras de todos los pacientes con EA; DCL-EA, muestras de todos los pacientes con DCL debido a EA (en etapa temprana de EA); CTR, muestras de control de todos los individuos sin demencia. Fig. 7A, C, comparación de muestras de control con muestras de EA (A - hsa-miR-483-5p, SEQ ID NO: 5; C - hsa-miR-502-3p, SEQ ID NO: 14); Fig. 7B, D, comparación de muestras de control con muestras de DCL-EA (B - hsa-miR-483-5p, SEQ ID NO: 5; D - hsa-miR-502-3p, SEQ ID NO: 14).

La Fig. 8 muestra esquemáticamente la red reguladora de 15 miARN biomarcadores de EA y sus efectores celulares. Las dianas putativas se identificaron mediante la búsqueda en la base de datos MirTarBase (versión 6) que contiene genes diana de miARN validados experimentalmente, seguida de una búsqueda en la base de datos de KEGG de las vías que contribuyen a las enfermedades neurodegenerativas y las vías del sistema nervioso. En A, el círculo interior contiene dianas comunes para al menos 4 y hasta 6 miARN, la capa intermedia contiene dianas comunes para 3 miARN y la capa exterior contiene dianas para 2 miARN. En B, las dianas que se muestran son para 2 miARN. Se destacan los miARN con un mayor número de aciertos en supuestas dianas proteicas.

La Fig. 9 muestra esquemáticamente la contribución de diferentes proteínas y vías de señalización celular al mecanismo patológico complejo de la enfermedad de Alzheimer. Se muestran las proteínas identificadas como dianas de los miARN de 15 biomarcadores sanguíneos.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: cribado piloto de biomarcadores de miARN

El experimento piloto se realizó en los siguientes tres grupos de sujetos (Tab. 2): en 7 pacientes diagnosticados de EA clínica (EA1), en 7 pacientes diagnosticados de DCL debido a EA (EA temprana, DCL-EA1) (Tab. 11) y en 6 individuos sanos sin demencia de la misma edad (CTR1).

Tab. 2. Características de los grupos de sujetos inscritos en los experimentos de la Etapa 1. Los datos de diagnóstico ll l i n m r n n l T . 11

En la primera etapa (experimento piloto), los inventores utilizaron microarrays Exiqon basados en qRT-PCR que permiten la evaluación de 178 niveles de miARN (panel de enfoque miRCURY LNA). Estos 178 miARN en el panel de enfoque se seleccionaron cuidadosamente en función de más de 1 millón de puntos de datos de muestras de suero/plasma sanguíneo humano recolectadas de individuos sanos y enfermos disponibles en Exiqon y en fuentes colaborativas. Para la selección de los miARN relevantes para este panel, se utilizaron datos de expresión de miARN de varios tipos de cáncer, trastornos neurológicos/enfermedades neurodegenerativas y alergias/inflamación. Es importante destacar que la base de datos de Exiqon se basa en gran medida en miARN total extraído de suero o plasma sanguíneo humano, lo que significa que un miARN circulante particular puede ser detectado por el panel de enfoque aplicado independientemente de si está preferentemente unido a proteínas, se encuentra en exosomas, micro vesículas o de otra manera compartimentado, lo que da como resultado un panel que permite un análisis de miARN en sangre muy completo.

T odas las muestras de miARN aisladas de cada sujeto se analizaron mediante la metodología estandarizada de Exiqon en el panel miRCURY LNA mediante qRT-PCR utilizando Roche Lightcycler 480.

El análisis de los resultados del estudio piloto mostró que se detectó un promedio de 170 miARN de 178 por muestra. El número mínimo de miARN identificados en una muestra fue 153. Para la normalización de los datos, los inventores aplicaron el promedio de los ensayos detectados en todas las muestras. (n=20 muestras), y este fue el normalizador estable. Los inventores realizaron una prueba por pares entre los tres grupos y una prueba ANOVA. El análisis identificó diferencias entre los grupos analizados. Al comparar los grupos en 'Clase' usando un ANOVA de una vía, se encontró que 32 miARN se expresaban diferencialmente usando un punto de corte de valor p de < 0,05.

La comparación del perfil de miARN entre el grupo de EA1 y el grupo de control (CTR1) indicó 30 miARN expresados diferencialmente usando un punto de corte de la prueba t del valor p < 0,05 (Tab. 3.). A su vez, al comparar el perfil de miARN del grupo DCL-EA1 (EA temprana) con el grupo de control, se encontró que 38 miARN se expresaban diferencialmente usando un punto de corte del valor p < 0,05 (Tab. 3).

Tab. 3. miARN encontrados usando un punto de corte de la prueba t del valor p < 0,05 para expresarse diferencialmente entre los siguientes grupos: pacientes con EA (EA1), DCL debido a pacientes con EA (DCL-EA1), controles sanos sin demencia de la misma edad rupo de control 1, CTR1.

Los inventores finalizaron este análisis mediante la identificación de 15 miARN expresados diferencialmente y con el mayor nivel de cambios entre los grupos EA1 frente a CTR1, y DCL-EA1 frente al CTR1, con significancia estadística tanto en la prueba t como en el análisis ANOVA (Fig. 2) . Es importante destacar que todos estos 15 miARN mostraron el mismo patrón de cambios, es decir, la dirección del cambio (regulación a la baja o a la baja) y el nivel de cambio en las muestras de EA1 y DCL-EA1 en comparación con CTR1. Entre estos 15 miARN seleccionados, se identificaron 9 miARN recientemente, que no se informaron previamente como diferenciadores de la sangre de pacientes con EA o DCL con respecto a los controles sin demencia: hsa-miR-151a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa-miR -30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-483-5p ( SEQ ID NO: 5), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa- miR-320c (SEQ ID NO: 9). Además, entre los 15 miARN seleccionados, había 6 miARN que se informaron previamente en 4 estudios diferentes como miARN cuyos niveles se modificaron en pacientes con eA en comparación con los controles: 4 miARN en sangre de pacientes con EA: hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14) [28], hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15) [22], hsa-miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16) y hsa-miR-142-3p (SEQ ID NO: 17) [21]; y 2 miARN en cerebro con EA: hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18) y hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19) [33].

Por lo tanto, estos 15 miARN se eligieron para su validación en la siguiente etapa del estudio de los investigadores.

Además, la comparación del perfil de miARN del grupo DCL-EA1 en la etapa temprana de la EA con el grupo EA1 en la etapa tardía de la EA indicó varios miARN que se expresaron diferencialmente. La Fig. 3 muestra los 4 miARN que se expresaron diferencialmente con el nivel de cambios más alto entre los pacientes con EA temprana y tardía: hsamiR-423-5p (SEQ ID NO: 10) hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11 ), y hsa-miR-22-5p (SEQ ID NO: 12) se regularon al alza mientras que hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13) se reguló a la baja en etapas EA más avanzadas (tardías). De ellos, dos miARN se expresaron diferencialmente con significancia estadística utilizando un punto de corte del valor p < 0,05 (hsa-miR-423-5p (SEQ ID NO: 10), hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11), Tab. 4). Lo más probable es que los miARN expresados diferencialmente entre pacientes con EA temprana y tardía y sin desear estar ligados a la teoría reflejen la progresión de la patogénesis de la EA y su complejidad. Las curvas de características operativas del receptor (ROC) (Fig. 4) y los parámetros de la curva r Oc se muestran en la Tab. 4. Documentar que estos cuatro miARN expresados diferencialmente separan claramente a los pacientes con EA temprana de los pacientes con EA más avanzada (tardía) con una buena precisión.

Tab. 4. Parámetros de la curva de la característica operativa del receptor (ROC), nivel de cambio y significancia estadística (valores de P) para los cuatro miARN que separan a los pacientes con EA en etapa temprana y tardía (DCL-EA1 frente a EA1). Los parámetros se calcularon basándose en las curvas ROC mostradas en la Fig. 4. AUC, área bao la curva ROC.

Ejemplo 2: Experimento de verificación de biomarcadores de miARN en los siguientes grupos de sujetos

En la segunda etapa experimental, los inventores utilizaron la misma metodología para validar los resultados del experimento piloto mediante el análisis de los niveles de los 15 miARN diferenciales seleccionados en la primera etapa: hsa-miR-151a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa-miR-30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR -483-5p (SEQ ID NO: 5), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-320c (SEQ ID NO: 9), hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301a- 3p (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18), hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19). Para un control adicional, se analizaron los 5 miARN más estables (hsamiR-185-5p (SEQ ID NO: 20), hsa-miR-128-3p (SEQ ID NO: 21), hsa-miR-130b-3p (SEQ ID NO: 22), hsa-miR-15a-5p (SEQ ID NO: 23), hsa-miR-425-3p (SEQ ID NO: 24). Los niveles de estos 20 miARN se han analizado en tres nuevos grupos de sujetos separados (Tab. 5).

Tab. 5. Características de los grupos de sujetos inscritos en los experimentos de la Etapa 2. Los datos de diagnóstico ll l i n m r n n l T . 1 T . 11

Como grupo de control 2 (CTR2), en esta etapa los inventores emplearon muestras de pacientes hipertensos de la misma edad sin demencia. Los criterios de inclusión/exclusión se proporcionan en la Tab. 12. Dado que la hipertensión es uno de los factores de riesgo de la EA y, a menudo, representa una de las comorbilidades en los pacientes con EA, un grupo de control de este tipo podría llevar a la exclusión de miARN común para ambas enfermedades y reducir el panel de miARN a más específicos de EA. Los inventores analizaron 15 perfiles de miARN en el segundo grupo de pacientes con EA (EA2) en el que los diagnósticos de EA fueron confirmados por marcadores de LCR y en dos grupos siguientes de pacientes con d CL: un grupo diagnosticado con EA temprana basado en los niveles de los marcadores de LCR (DCL-EA2) y un segundo grupo diagnosticado de DCL con baja indicación de EA, en el que los niveles de biomarcadores de eA en LCR no se modificaron claramente (DCL) (Tab. 5, Tab. 10, Tab. 11). Además, los inventores también incluyeron un grupo de pacientes con deterioro cognitivo subjetivo (DCS-LCR), con una ligera indicación de EA según dos marcadores de LCR ligeramente positivos (Tab. 5, Tab. 10).

En este ejemplo, la preparación de la muestra y la metodología de análisis de miARN usando el panel de enfoque para el ensayo qPCR-RT de los 15 miARN fueron idénticas a las usadas en los experimentos preliminares, descritos en el Ejemplo 1. Para la normalización de los datos, como en el Ejemplo 1, los inventores aplicaron el promedio de los ensayos detectados en todas las muestras ya que se encontró que este era el normalizador más estable. En un análisis ANOVA de una vía, los inventores obtuvieron una clara separación del grupo de control de EA y DCL-EA, de manera similar al experimento preliminar en la Etapa 1. Además, los inventores obtuvieron la separación del grupo de control de los pacientes con DCL y DCS con baja/débil evidencia de la demencia por EA.

Este experimento independiente del Ejemplo 2 confirmó la desregulación de los 15 miARN seleccionados en el plasma sanguíneo, incluidos 9 nuevos biomarcadores de miARN identificados en el Ejemplo 1 de este estudio (Fig. 5).

Cuando los inventores compararon los resultados conjuntos del experimento de verificación, los datos de los 15 miARN demostraron ser muy consistentes (Fig. 6). Significativamente, los 9 miARN recientemente informados se verificaron como un nuevo panel de biomarcadores de EA que se puede usar como un panel completo en la prueba de diagnóstico de EA. Además, cualquiera de los 9 miARN individuales y/o cualquier combinación de marcadores de panel de miARN se pueden emplear para tal prueba de diagnóstico de eA. Además, el panel puede incluir cualquiera de los 15 miARN confirmados como valiosos en el diagnóstico de EA.

Lo importante es que los resultados del experimento de verificación fueron consistentes con el experimento preliminar. Cabe destacar que en todos nuestros grupos de prueba (EA, DCL-EA, DCL, DCS) comparando con dos grupos de control diferentes (CTR1 y CTR2), los datos para los 9 miARN, o más preferentemente los 15 miARN del panel de diagnóstico, son consistentes en términos de la dirección de los cambios en los niveles de miARN (regulación al alza y regulación a la baja) y en el nivel de cambios (Tab. 6, Fig. 6, Fig. 2C). Dos de los 9 nuevos miARN mostraron el nivel de cambios más alto (en el intervalo de 4-13) y la mayor significancia estadística: hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) y hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5). En particular, en el experimento de verificación que se realizó en grupos de sujetos más grandes, el nivel de cambio en el caso de hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) fue extremadamente alto, en el intervalo 8-13 (Fig.6). En la bibliografía sobre EA publicada hasta ahora, no se notificaron miARN con un nivel de cambios por encima de 6, al comparar pacientes con EA con controles, y solo se notificaron muy pocos miARN con un nivel de cambios en el intervalo de 3-6 (5 miARN, es decir, 6,3 % de todos los miARN informados). Por tanto, estos 2 miARN identificados en el estudio de los investigadores: hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) y particularmente hsamiR-483-5p (SEQ ID NO: 5) son los indicadores más significativos de EA. Además, el nivel de cambio de hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) demostró corresponder bien con los resultados de los biomarcadores de LCR y la progresión de la enfermedad: el nivel de cambio más alto se detectó en el grupo EA2, un nivel de cambio más bajo en la EA temprana en DCL-EA2 y en grupos DCS con dos marcadores de LCR ligeramente positivos, y el menor en el grupo de DCL con baja indicación de EA según marcadores de LCR (Fig. 6). Además, se ha observado una regulación al alza muy consistente y altamente estadísticamente significativa de hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14) tanto en la Etapa 1 como en la Etapa 2 del estudio, con niveles aproximadamente dos veces mayores de este miARN en EA y en muestras de DCL-EA en comparación con controles sin demencia (Fig. 6, Fig. 2, Tab. 6).

Es importante destacar que seis miARN de control: hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18) y hsamiR-1260a (SEQ ID NO: 19) también se demostraron diferenciando las muestras de control de EA y DCL-EA tanto en los experimentos primarios de los investigadores como de verificación. Estos miARN aún no se han aceptado como biomarcadores que permitan el diagnóstico de la EA temprana o tardía a partir de la sangre.

Tab. 6. Direcciones de cambios ( i disminución, f aumento) en el nivel de 15 miARN diferenciales detectados en el Ejemplo 1 (experimento preliminar) y confirmado en el Ejemplo 2 (experimento de verificación). Para 6 miARN que se informaron en estudios anteriores, la dirección de los cambios también se comparó con los resultados publicados (referencias incluidas). Los datos de 9 miARN se informan aquí por primera vez, ya que los biomarcadores de EA no tienen referencias (n/c). Significancia estadística: (valor p): * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001; **** P < 0,0001. A r vi r : r z r f. r z r fr n l hi m . hi m .

Para probar aún más la idoneidad de cada uno de los 15 miARN en el panel como biomarcadores de EA, los inventores calcularon las curvas de características operativas del receptor (ROC). Este análisis demostró que los 15 miARN separan claramente las muestras de EA y DCL-EA de las muestras de control con valores de especificidad, sensibilidad y precisión (área bajo ROC, AUC) dados para cada miARN en la Tab. 7. Además, la Fig. 7 muestra las curvas ROC de dos miARN seleccionados de ejemplo: de hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) para los cuales el nivel de aumento fue extremadamente alto al comparar pacientes con EA y DCL-EA con controles sin demencia (nivel de cambio de 8-13 veces), y de hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14) que representa miARN de menor nivel de aumento en pacientes con EA y DCL-EA en comparación con los controles (nivel de cambio de aprox. 2) . La Tab. 7 y la Fig.7 indican que estos dos miARN separaron a los pacientes con EA de los controles, así como a los pacientes con DCL-EA (EA temprana) de los controles con alta precisión (AUC superior a 0,9), repetidamente tanto en los estudios preliminares (tren) como en los de verificación (prueba). Por tanto, basándose en parámetros de curva ROC consistentemente altos, los miARN hsa-miR-483-5p (Se Q ID n O: 5) y hsa-miR-502-3p (Se Q ID NO: 14) representan biomarcadores especialmente prometedores.

Las curvas ROC y AUC se consideran un procedimiento objetivo para evaluar clasificadores binarios. Las curvas ROC ilustran el desempeño de un clasificador en el intervalo de umbrales de sensibilidad y especificidad. La sensibilidad es la parte de las observaciones positivas correctamente clasificadas y la especificidad es la parte de las observaciones negativas correctamente clasificadas. El AUC es la medida de resumen de precisión que incorpora sensibilidad y especificidad en una sola medida y cuantifica la capacidad de clasificación de un valor de clasificación (es decir, en este caso, el nivel de expresión de un miARN único). Va de 0 a 1. Un AUC más alto significa una mejor clasificación. Un clasificador perfecto tendrá una curva ROC que pasa por (1,1) y un AUC de 1 (esquina superior izquierda del gráfico). Se espera que el adivinador aleatorio sea diagonal y AUC de 0,5. El punto de precisión equilibrada (umbral de funcionamiento óptimo) en la curva ROC es el punto de la curva para el que la suma de sensibilidad y especificidad es máxima. Se calcularon la sensibilidad y la especificidad de todos los miARN para este punto.

Tab. 7. Parámetros de la curva de características operativas del receptor (ROC) para los 9 nuevos biomarcadores de miARN de EA y los 6 miARN informados anteriormente que separan a todos los pacientes con EA en etapa temprana y tardía frente a todos los controles sin demencia: EA frente a CTR (EA1 y EA2 frente a CTR1 y CTr 2) y d Cl-EA frente a CTR (DCL-EA1 y DCL-EA2 frente a CTR1 y CTR2). AUC: área bajo la curva ROC. El análisis se realizó con dos conjuntos separados de muestras llamados conjunto de trenes (datos de la Etapa 1, experimento piloto) y conjunto de rueba datos de la Eta a 2 ex erimento de verificación .

Ejemplo 3: Papel funcional de los miARN en el mecanismo patológico de la EA

Para probar y validar aún más la idoneidad de los miARN en el panel como biomarcadores para la EA, los inventores mapearon funcionalmente los miARN investigados a proteínas involucradas en el mecanismo patológico de la EA. Los 15 miARN biomarcadores mostraron efectores funcionales comunes (de 6 a 2 miARN) entre las proteínas directamente relacionadas con la patología de la EA, como APP, BACE, MAPT, PSEN2, así como otras proteínas que se sabe que contribuyen a la EA, incluidas las proteínas de la cadena oxidativa mitocondrial, cinasas de ciclo celular y destino celular MAPK, ERK y JNK, proteínas reguladoras del ciclo celular y apoptosis p53 y Bcl-2, IGFRI de señalización de insulina, proteínas reguladoras de autofagia y endocitosis, proteínas citoesqueléticas y proteínas de señalización/homeostasis de calcio (Tab. 8, Tab. 9, Fig. 8, Fig. 9). Estos datos apoyan el papel de los miARN en la regulación de la red y la contribución a la EA de varias vías de señalización, según la hipótesis mitocondrial, la hipótesis del ciclo celular, la EA como hipótesis de diabetes tipo 3, la hipótesis de autofagia/endocitosis y otras hipótesis postuladas por acumulación de evidencia.

La Tab. 8 presenta los resultados de una búsqueda in silico realizada con el software Targetscan 7.1 para identificar ARNm diana entre los ARNm que codifican la proteína tau asociada a microtúbulos (MAPT), así como proteínas clave de la escisión amiloidogénica de la proteína precursora amiloide (APP) en péptido amiloide tóxico (BACE, PSEN). El amiloide tóxico y el MAPT son dos características fundamentales de la patología de la EA. Es importante destacar que este análisis mostró que proteínas EA tan importantes como APP, BACE 1 y tau (MAPT) pueden ser reguladas por más de un miARN de los 15 miARN investigados. Es de destacar que hasta 4 de los 15 miARN tienen sitios de unión en el ARNm de APP. Además, hsa-miR-483-5p, que se encontró como uno de los miARN más desregulados en la detección temprana de EA, tiene un sitio de unión en el ARNm de tau, junto con otros 4 miARN de los 15 biomarcadores candidatos. Dado que se sabe que los miARN funcionan en redes reguladoras complementarias, los múltiples sitios de unión en los ARNm estrechamente relacionados con la patología de la EA para varios miARN de los 15 que diferencian la EA de los controles confirma que estos miARN son relevantes en la patogénesis de la EA.

Un grupo de posibles genes/proteínas diana aguas abajo que se sabe que contribuye a la patogénesis de la EA también se identificó en una estrategia independiente basada en la búsqueda de MiRTarBase, que comprende genes diana de miARN validados experimentalmente, seguido de una búsqueda en la base de datos KEGG de vías de señalización en enfermedades neurodegenerativas y en el sistema nervioso regulado por los 15 miARN analizados (Tab.9, Fig.8). Las proteínas diana se agruparon desde las reguladas por 6 miARN hasta las reguladas por 2 miARN de los 15 miARN (Tab. 8, Fig. 9). Como se muestra en la Fig. 8, el análisis indicó una red de dianas centradas alrededor de la cadena respiratoria de las mitocondrias que estaban implicadas en el estrés oxidativo en la patología de la EA según una gran cantidad de informes independientes. También se sabe que MAPK ocupa un lugar central en la señalización celular aberrante en la patología de la EA. Los efectores potenciales aguas abajo regulados por 3 o 2 de los miARN analizados incluyen otras proteínas que se sabe que contribuyen a la patogénesis de la EA, como el receptor del factor de crecimiento de la insulina (IGFR I), proteínas relacionadas con la apoptosis como p53 y Bcl-2, y proteínas implicadas en la endocitosis y señalización intracelular (Rab5, ERK) - Fig.9.

Tab. 8. Sitios de unión en las transcripciones relacionadas con la EA para los 15 miARN diferenciales en el plasma de la EA. La búsqueda se realizó con el software Targetscan 7.1. APP- Proteína precursora beta amiloide; BACE 1 - Enzima de escisión de proteínas precursoras de amiloide de sitio beta 1; BACE 2- Enzima de escisión de proteínas precursoras de amiloide de sitio beta 2; MAPT - Proteína Tau Tau asociada a microtúbulos ; PSEN2-Presenilina 2.

Tab. 9. Efectores celulares de 15 miARN biomarcadores identificados mediante la búsqueda en MirTarBase y en la base de datos de enfermedades neurodegenerativas y vías del sistema nervioso KEGG. Se muestran todas las proteínas diana que tuvieron al menos 2 o más aciertos en las bases de datos. Se incluyen varios ejemplos de genes diana para un solo miARN.

PROCEDIMIENTOS

Características de los sujetos del estudio

Se obtuvieron muestras de sangre de pacientes inscritos en la sala de Alzheimer de1Hospital Clínico Central del Ministerio del Interior y Administración (MSWiA) en Varsovia. Los protocolos experimentales utilizados para la obtención y análisis de muestras de plasma sanguíneo fueron aprobados por el Comité de Ética para Estudios en Sujetos Humanos del Hospital Clínico Central del Ministerio del Interior en Varsovia, Polonia, y cumplen con la legislación nacional y de la Unión Europea y el Código de Principios Éticos para la Investigación Médica que Involucra a Sujetos Humanos de la Asociación Médica Mundial. Las muestras de sangre periférica se recogen de todos los sujetos después de obtener el consentimiento informado por escrito de los pacientes o de sus representantes legales.

Todos los diagnósticos clínicos se realizaron según los criterios del Manual Diagnóstico y Estadístico de Trastornos Mentales, 4a edición (DSM-IV), el NINCDS-ADRDA (Criterios del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Comunicativos y Accidentes Cerebrovasculares y la Enfermedad de Alzheimer y la Asociación de Trastornos relacionados) y según las recomendaciones de los grupos de trabajo del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento -Asociación de Alzheimer sobre pautas de diagnóstico para la enfermedad de Alzheimer [6, 7]. Los pacientes fueron diagnosticados por neurólogos, neuropsicólogos y otros miembros cualificados del personal de la clínica. El diagnóstico se basó en una entrevista, la prueba Mini examen del estado mental (MMSE), la prueba de Clasificación de demencia clínica (CDR) y las pruebas radiológicas (MRI). Los diagnósticos de los pacientes con EA reclutados para el estudio de los investigadores fueron apoyados adicionalmente por los resultados de los análisis de líquido cefalorraquídeo (LCR) basados en los niveles de los siguientes marcadores estándar: péptido Ap, t-tau (proteína tau "total") y p-tau (forma fosforilada de la proteína tau). Las características de los pacientes se presentan en la Tab. 10 y 11. El grupo de pacientes denotados como EA (EA1 y EA2) estaba compuesto por 20 pacientes con evidencia clara de procedimiento patológico de EA desarrollado según los niveles de los marcadores del LCR, los resultados de MMSE > 11 < 26 y los valores de CDR > 1 (Tab. 10). El grupo de DCL con una alta probabilidad de que el DCL se debiera a EA se denominó DCL-EA (DCL-EA1 y DCL-EA2) y estaba compuesto por 15 pacientes en etapa temprana de EA, según lo confirmado por los niveles de biomarcadores de EA LCR, pero con indicadores de demencia más bajos. (Resultados MMSE > 21 < 29 y clasificación CDR = 0,5). Otro grupo denotado como DCL consistió en 10 pacientes diagnosticados como DCL sobre la base de la evaluación neurológica, resultados de MMSE > 24 < 30, CDR = 0,5, pero con baja probabilidad de EA según las pruebas de LCR. 3 pacientes con DCS se caracterizaron por una evidencia muy leve de demencia: MMSE > 27 < 29 y CDR = 0 y por alguna probabilidad de EA temprana basada en los valores ligeramente positivos de dos marcadores de LCR.

Los dos grupos de control comprendieron sujetos de la misma edad sin demencia; un grupo consistió en 6 asistentes de las Universidades de la Tercera Edad, seleccionados como un grupo de personas con bajo riesgo de demencia por actividad intelectual, y que no tomaban ningún medicamento. El segundo grupo de control consistió en 9 pacientes con hipertensión inscritos en el Hospital Clínico Central Público Independiente de la calle Banacha en Varsovia, pero sin problemas de memoria y sin antecedentes familiares de EA, que recibieron medicamentos antihipertensivos. Los criterios de inclusión para el grupo de control se dan en la Tab. 12.

Tab.10. Características de los pacientes en grupos completos incluidos en el estudio. Se muestran los valores medios /-DE; t-tau, tau total; p-tau, tau fosforilado. MMSE- Mini examen del estado mental, CDR- Clasificación de demencia clínica. Resultados de las pruebas de LCR Ap42, beta amiloide 42; t-tau, tau total; p-tau, tau fosforilada; se muestran los valores medios /-DE

Tab. 11. Características de los pacientes de los grupos de sujetos con EA y DCL-EA incluidos, respectivamente, en la etapa 1 y la etapa 2 del estudio. MMSE- Mini examen del estado mental, CDR- Clasificación de demencia clínica. Resultados de las pruebas de LCR: Ap42, beta amiloide 42; t-tau, tau total; p-tau, tau fosforilada; se muestran los valores medios /-DE. Todos los pacientes mostraron lesiones neuronales de tipo EA en el hipocampo en sus MRI.

Tab. 12. Criterios de inclusión exclusión ara la inscri ción en los ru os de control CTR1 CTR2

Recolección y procesamiento de muestras de sangre

Se extrajeron muestras de sangre de todos los sujetos del estudio mediante punción venosa en tubos BD Vacutainer con EDTa y un gel que separa el plasma de las células sanguíneas para evitar la hemólisis. Las muestras se centrifugaron inmediatamente. Se almacenaron alícuotas de plasma a -80 °C. El procedimiento se llevó a cabo en cumplimiento detallado de los SOP (Procedimiento operativo estándar) establecidos en el marco del proyecto internacional JPND BIOMARKAPD y aceptado por la Red de investigación de detección temprana (EDRN) del NCI, y conforme a las recomendaciones de Exiqon.

Aislamiento de ARN

El aislamiento de miARN de muestras de plasma sanguíneo recolectadas se realizó utilizando el kit de aislamiento de ARN miRCURY™ (Biofluids) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, los controles de aislamiento de ARN (UniSp2, UniSp4 y UniSp5) se agregaron a la etapa de purificación para detectar cualquier diferencia en la eficiencia de extracción. El miARN aislado se almacenó a -80 °C hasta su uso y se transportó en hielo seco.

PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

La síntesis de ADNc y qRT-PCR se realizó según el Panel de PCR QC de microARN de "miRCURY™ - Manual de instrucciones v1.1", según las instrucciones de EXIQON. Todos los miARN se transcribieron de forma inversa en ADNc en una sola etapa de reacción. El control de la síntesis de ADNc (UniSp6) se añadió en la reacción de transcripción inversa dando la oportunidad de evaluar la reacción de RT. El ADNc y la mezcla maestra Exilent SYBR Green se transfirieron al panel qPCR precargado con cebadores (EXIQON), utilizando un robot de pipeteo. La amplificación se realizó en un Roche Lightcycler 480. Se exportaron los valores de Cp sin procesar y los puntos de fusión, detectados por el software del ciclador. Las reacciones con varios puntos de fusión, o con puntos de fusión que no están dentro de las especificaciones del ensayo, se marcaron y eliminaron del conjunto de datos. También se eliminaron las reacciones con una eficacia de amplificación por debajo de 1,6. Las reacciones que dieron valores de Cp dentro de los valores de 5 Cp de los controles negativos se eliminaron del conjunto de datos. Además, todos los datos se normalizaron para corregir las posibles diferencias generales entre las muestras. Se incluyó una muestra "sin plantilla" en la etapa de RT como control negativo.

Se realizó una etapa adicional en el análisis de PCR en tiempo real para evaluar la especificidad de los productos de amplificación mediante la generación de una curva de fusión para cada reacción. Una fuente importante de variación en las muestras de plasma y suero es la contaminación con miARN potencial derivado de células, especialmente por hemólisis [34]. La evaluación de la hemólisis de las muestras en este proyecto no mostró signos de contaminación de glóbulos rojos.

Análisis bioinformático y estadístico

La normalización se realizó en base al promedio de los ensayos detectados en todas las muestras, ya que se demostró que esta es la mejor normalización para los estudios de qPCR que involucran numerosos ensayos [35]. Para el presente estudio, esto incluyó 153 ensayos. La estabilidad del promedio de 153 miARN es más alta que la de cualquier miARN individual en el conjunto de datos medido por el software NormFinder [36]. Las fórmulas utilizadas para calcular los valores de Cq normalizados son:

Cq normalizados = Cq medio (n) - Cq ensayados (muestra)

Un valor más alto indica, por tanto, que el miARN es más abundante en la muestra particular.

Todos los grupos se compararon mediante una prueba t. Se utilizó la prueba de Shapiro-Wilk para verificar si los datos tienen una distribución normal. Cuando los datos no estaban distribuidos normalmente, se utilizó la prueba de hipótesis estadística no paramétrica de Wilcoxon. Se utilizó una prueba de chi-cuadrado para identificar miARN solo detectables en un grupo. Para analizar los resultados del estudio piloto, los inventores también utilizaron ANOVA. Los valores p se muestran según los estándares Prism e InStat, de la siguiente manera:

Símbolo Significado

ns P > 0,05

* P < 0,05

** P < 0,01

*** P < 0,001

**** P < 0,0001

Las curvas de la característica operativa del receptor (ROC) y el área bajo la curva ROC (AUC) de los miARN individuales se trazaron y calcularon utilizando el paquete pROC en un entorno R como se describió anteriormente [37]. Los valores de especificidad y sensibilidad se calcularon para el punto de precisión equilibrado (umbral operativo óptimo) en las curvas ROC.

Identificación de efectores celulares de miARN

Los genes diana para los miARN se obtuvieron a partir de dos análisis de bases de datos diferentes. La base de datos T argetScan (versión 7.1) [38] fue utilizada para explorar posibles/previstas interacciones miARN-ARNm para identificar ARNm diana entre los ARNm que codifican la proteína tau y proteínas clave de la cascada amiloide. Además, la base de datos MirTarbase (versión 6.0) que contiene genes diana de miARN validados experimentalmente [39] se utilizó para explorar dianas de genes de miARN que posteriormente se mapearon en las vías de KEGG [40]. Se analizaron las vías que contribuyen a las enfermedades neurodegenerativas y las vías del sistema nervioso en busca de dianas de miARN. El mapeo de miARN a genes diana en vías se realizó con el paquete R Bioconducor pathview [41 ]. Para la construcción de una red reguladora de miARN solo se consideraron genes/proteínas diana que tenían 2 o más aciertos.

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Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento de diagnóstico ex vivo de la enfermedad de Alzheimer y/o una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer, en un sujeto, caracterizado porque el procedimiento implica las siguientes etapas:

- evaluación in vitro de un nivel de al menos hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) como microARN biomarcadores en la muestra de sangre del sujeto, y

- comparación del nivel evaluado de cada microARN biomarcador con su nivel medio observado en un control sin demencia.

2. Uso de un panel de microARN biomarcadores que comprende hsa-miR-483-5p (SEQ ID NO: 5) y hsa-miR-486-5p (SEQ ID NO: 3) para diagnosticar la enfermedad de Alzheimer y/o una etapa temprana de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto mediante el análisis del nivel de dichos microARN biomarcadores ex vivo en una muestra de sangre de dicho sujeto.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o el uso de la reivindicación 2, donde se evalúa adicionalmente un nivel de al menos un microARN biomarcador adicional, donde el microARN biomarcador adicional se selecciona de entre el grupo que consiste en hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa- miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301 a-3p (SEQ ID NO: 16), hsa-miR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18), hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19), donde preferentemente los microARN biomarcadores evaluados incluyen hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18).

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3 o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde este implica evaluar adicionalmente el nivel de

(a) al menos uno, preferentemente dos, preferentemente tres, preferentemente cuatro, preferentemente cinco, preferentemente seis, preferentemente los siete, microARN biomarcadores seleccionados de entre un grupo de hsamiR-151 a-5p (SEQ ID NO: 1), hsa- miR-30b-5p (SEQ ID NO: 2), hsa-miR-33a-5p (SEQ ID NO: 4), hsa-miR-18a-5p (SEQ ID NO: 6), hsa-miR-320a (SEQ ID NO: 7), hsa-miR-320b (SEQ ID NO: 8), hsa-miR-320c (SEQ ID NO: 9), y/o b) hsa-miR-502-3p (SEQ ID NO: 14), hsa-miR-103a-3p (SEQ ID NO: 15), hsa-miR-301a-3p (SEQ ID NO: 16), hsamiR-142-3p (SEQ ID NO: 17), hsa-miR-200a-3p (SEQ ID NO: 18) y hsa-miR-1260a (SEQ ID NO: 19).

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, donde el uso o procedimiento incluye adicionalmente la evaluación de un nivel de al menos uno de los microARN biomarcadores hsa-miR -423-5p (s Eq ID NO: 10) y/o hsa-miR-126-5p (SEQ ID NO: 11) y/o hsa-miR-22-5p (SEQ ID NO: 12) y/o hsa-miR-335-3p (SEQ ID NO: 13).

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-5, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-5, donde la muestra de sangre tiene un volumen de como máximo aproximadamente 0,6 ml.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-6, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, donde la evaluación del nivel de dicho microARN biomarcador se realiza mediante un procedimiento de qRT-PCR.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3-7, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, caracterizado porque el sujeto es un ser humano.