ES2895256T3

ES2895256T3 - Polipéptidos para inhibir la activación del complemento

Info

Publication number: ES2895256T3
Application number: ES16828743T
Authority: ES
Inventors: Stefan Michelfelder; Karsten Häffner
Original assignee: Eleva GmbH
Current assignee: Eleva GmbH
Priority date: 2015-12-23
Filing date: 2016-12-23
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2036-12-23
Also published as: IL260182B1; SI3394089T1; IL260182A; JP2020167999A; BR112018012844A2; MX2018007392A; CA3009393C; US20190300589A1; KR20180091097A; US20200277347A1; CN108699121B; EP3394089A1; HUE056019T2; EP3394089B1; WO2017109208A1; PL3394089T3; HRP20211608T1; CA3009393A1; JP2019508022A; AU2016375183B2

Abstract

Polipéptido que comprende repeticiones de consenso cortas (SCR) 1 a 4 de factor H (FH), SCR1 y SCR2 de proteína 1 relacionada con el factor H (FHR1), y un dominio que es capaz de unirse a las superficies celulares.

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos para inhibir la activación del complemento

El campo de la presente invención se refiere a polipéptidos para inhibir la activación del complemento.

Antecedentes de la Invención

El sistema complemento es una parte integral de la inmunidad innata y contribuye al reconocimiento y la eliminación de patógenos, eliminación de células apoptóticas o complejos inmunitarios y la modulación de la respuesta inmunitaria adaptativa (Ricklin et al. 2010, Carroll et al. 2011). El complemento está compuesto por un número de proteínas plasmáticas producidas principalmente por el hígado, normalmente circulando como zimógenos, o como proteínas de membrana y opera en el plasma, en tejidos, o dentro de las células. La activación de las tres vías del complemento, la clásica (CP), la lectina (LP) o la vía alternativa (AP) da como resultado cada una la formación de C3 convertasas (C4b2a en la CP, LP o C3bBb en la AP) que cataliza la escisión del componente central del sistema complemento, C3, en el producto de activación C3b y el péptido anafiláctico C3a. Posteriormente y en una reacción activada de tipo cascada, los patógenos se marcan para destrucción y se induce una serie de respuestas inflamatorias que reclutan células inmunitarias para luchar contra la infección y mantener la homeostasis (revisado en (Merle et al. 2015)). Ambas, la ineficiente activación o la ineficiente regulación del complemento pueden causar o contribuir a un número de infecciones o enfermedades no infecciosas, incluyendo inmunodeficiencia, autoinmunidad, inflamación crónica, microangiopatía trombótica, rechazo a injerto, así como enfermedades renales y retinianas tales como síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), glomerulopatías C3 (C3G) y degeneración macular relacionada con la edad (AMD) (Holers 2008).

La vía alternativa (AP)

A pesar de que la CP y la LP se activan por medio de ciertas moléculas de reconocimiento, la AP está permanentemente activa a un bajo nivel. Esto se da por un mecanismo denominado “al ralentí” ("tick-over"), que se inicia por hidrólisis del tioéster C3 interno de la molécula de tipo C3b C3(H2O) para formar su forma bioactiva. Junto con el factor B soluble (FB) y el factor D (FD), que escinden C3(H2O) unido a FB, se generan los complejos de C3 convertasa de fase de fluido (C3b(H2O)Bb) y las moléculas C3 nativas se escinden y activan. El C3b activado se une covalentemente, a través de un dominio que contiene tioéster (dominio TED o C3d), a grupos hidroxilo de cualquier superficie adyacente. En los patógenos, se acumula C3b en la proximidad inmediata al sitio de su generación y además se forman las C3 convertasas (C3bBb), amplificando por lo tanto la activación del complemento. La unión de un segundo C3b a la C3 convertasa lleva a la generación de la C5 convertasa (C3bBbC3b) que inicia la escisión de C5 en la potente molécula efectora inmunitaria C5a y C5b. C5b recluta componentes de complemento C6, C7, C8 y C9 formando el complejo de ataque de membrana terminal C5b-9 (MAC) que da como resultado la lisis de los patógenos (Ricklin et al. 2010, Carroll et al. 2011).

Regulación de la AP

La AP debe ser regulada precisamente para permitir la rápida eliminación de células y patógenos opsonizados y para minimizar la activación de AP sin restricciones que puede causar daño al tejido hospedador. Las células hospedadoras sanas usualmente están protegidas del ataque mediado por el complemento por un número de proteínas unidas a la membrana o solubles del regulador de la familia de activación del complemento (RCA) que actúan sobre diferentes niveles de activación de la cascada, algunos de ellos con funcionalidad de superposición, mientras otros presentan unas propiedades reguladoras de complemento únicas (Zipfel et al. 2009).

La generación del nuevo C3b está estrictamente controlada por proteínas RCA que actúan como cofactores para la degradación irreversible mediada por el factor I (FI) de C3b en iC3b o por la desestabilización de los complejos de C3bBb convertasa (actividad de aceleración de deterioro, DAA). Además, las RCA pueden interferir en la actividad de la C5 convertasa, controlando por lo tanto la escisión de C5 en sus productos de activación C5a y C5b o por factores que se unen a los compuestos del complejo de complemento terminal (TCC), por lo tanto previniendo la inserción del complejo MAC en la membrana. Junto con la proteína del cofactor de membrana (MCP o CD46), el receptor 1 de complemento (CR1 o CD35), el factor de aceleración de deterioro (DAF o CD55), el inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL, CD59) y los factores solubles de vitronectina y clusterina y otros, los miembros de la familia de proteínas del factor H/FHR, en particular FH, soportan la regulación del complemento en circulación y sobre las superficies a las cuales se unen específicamente.

Familia de proteínas del factor H/FHR

La familia de proteínas del factor H/FHR comprende un grupo de proteínas plasmáticas altamente relacionadas que incluye las cinco proteínas relacionadas con el factor H de complemento (f Hr ), FHR1, FHR2, FHR3, FHR4, FHR5, factor H (FH) y la proteína 1 de tipo factor H variante empalmada (FHL-1). Cada gen individual de los miembros de la familia se localiza en un segmento diferente en el cromosoma humano 1q32 dentro del complejo génico (“gene cluster”) RCA (Skerka et al. 2013). A pesar de que FH es el regulador principal de la vía alternativa, las funciones de los FHR no se entienden completamente. Se ha sugerido que la interacción de las proteínas FHR modulan la actividad reguladora del complemento en las superficies celulares (Jozsi et al. 2015). Además, su habilidad para la homo- y heterooligomerización puede aumentar la avidez de FHR1, FHR2 y FHR5 para sus ligandos. Esto ha sido propuesto como un mecanismo de ajuste en el reconocimiento y la modulación de la activación del complemento (Jozsi et al.

2015). Sin embargo, algunas propiedades reguladoras del complemento independientes y únicas del FH también se han descrito para FHR1 FHR2. Dado que FH, FHR1 y FHR2 pueden reducir la activación del complemento, se han propuesto como candidatos prometedores para modular la activación del complemento bajo condiciones patológicas (Licht et al. 2005, Licht et al. 2006, Skerka et al. 2013, Haffner et al. 2015).

De entre la familia de proteínas FH/FHR, FH es la proteína de complemento más abundante en circulación en el plasma a concentraciones de ~350-600 |jg ml. Con peso molecular de 155 kDa, la glicoproteína monomérica FH regula la AP y el ciclo de amplificación de las vías del complemento. FH consiste en 20 dominios de repetición de consenso cortos (SCR) repetitivos y regula la activación de C3 convertasas en fase de fluido así como sobre superficies celulares. Los dominios N-terminal SCR1-4 contienen la región reguladora del complemento de la proteína. FH SCR1-4 se une a C3b y por lo tanto evita la formación de las C3 y C5 convertasas y facilita el desensamblaje de las convertasas ya formadas compitiendo con FB para la unión de C3b (Weiler et al. 1976). Adicionalmente, estos dominios son relevantes para que FH actúe como un cofactor para la inactivación de C3b mediada por F1 (Gordon et al. 1995, Rodriguez de Cordoba et al. 2004, Alexander et al. 2007, de Cordoba et al.

2008). El extremo C-terminal de FH (SCR 19-20) principalmente representa el dominio de reconocimiento de unión que interactúa con C3b, C3d, pentraxinas, la matriz extracelular y las superficies celulares (Jarva et al. 1999, Oppermann et al. 2006, Hebecker et al. 2013). La unión de FH sobre las superficies celulares o membranas biológicas está mediada por estructuras polianiónicas de tipo glicosaminoglicanos (GAG) (por ejemplo, heparina) o ácidos siálicos, y regula la activación del complemento local en células endógenas, tales como células endoteliales glomerulares o la membrana de basamento glomerular (GBM) (Jozsi et al. 2004, Ferreira et al. 2006, Jozsi et al. 2007, Blaum et al. 2015).

El FHR1 está compuesto por cinco SCR (Skerka et al. 1991) y presenta dos isoformas. Dos formas glicosiladas (FHR1a ~41 y FHR1I3 ~37 de kDa) con ya sea una o dos cadenas laterales carbohidratadas circulan en el plasma humano con una concentración de aproximadamente 100 jg ml. FHR1 presenta una alta homología de secuencia C-terminal para FH y SCR1 y SCR2 C-terminales presentan una alta identidad de aminoácido para SCR1 y SCR2 de FHR2 (97% y 100%, respectivamente) y para SCR1 y SCR2 de FHR5 (91% y 83%, respectivamente). FHR1 regula la actividad de C5-convertasa e inhibe la activación del complemento mientras no se influye en la actividad de C3-convertasa. SCR1-2 N-terminal se une a C5 y C5b6, mientras SCR3-5 C-terminal se une a C3b, C3d y heparina. Supuestamente, FHR inhibe la activación de C5 y la escinde en C5a y C5b por medio de la unión de SCR1-2 a C5. Además FHR1 es un regulador de la vía terminal e inhibe el ensamblaje de MAC, presumiblemente mediante la unión de SCR1-2 al complejo C5b6 (Heinen et al. 2009).

El FHR2 consiste en cuatro SCR (Skerka et al. 1992) que exhiben la identidad del aminoácido a SCR 6-7 y 19-20 de FH. El SCR1 N-terminal de FHR2 es casi idéntico a FHR1 y FHR5 y permite la formación de homodímeros y heterodímeros con FHR1, pero no con FHR5. FHR2 circula en el plasma humano a concentraciones de aproximadamente 50 jg/ml. FHR2 regula la activación del complemento, presumiblemente vía un mecanismo en el cual FHR2 unido a las C3 convertasas no escinde el sustrato C3. De manera interesante, FHR2 compite severamente con el factor H desactivado de C3b. FHR2 no compite con el FH para la unión con C3b a concentraciones fisiológicas (Goicoechea de Jorge et al. 2013).

El FHR1 como FHR2 y FHR5 cada uno contiene una interfaz de dimerización conservada integrada de los residuos Tyr34, Ser36 y Tyr39 ubicados en SCR1 que ejercen un papel principal en el ensamblaje y facilitan la formación del homo- y heterodímero transmitido por una hermética unión antiparalela del extremo N-terminal. Además de estas funciones reguladoras, los FHR evitan la unión de FH (o compiten con el FH desactivado) a C3b o las superficies de células hospedadoras/de patógeno bajo ciertas condiciones que causan una desregulación (activación) del complemento (Jozsi et al. 2015). La formación de complejos FHR multiméricos podría aumentar la concentración local por lo tanto aumentando la avidez y/o afinidad hacia su sustrato o hacia superficies que van a ser reguladas por f Hr . Se ha sugerido que la desregulación puede intensificarse bajo condiciones patofisiológicas, por ejemplo debido a la multimerización anormal de las f Hr en glomerulopatías C3 que mejoran la unión del ligando y la competencia de FH (Goicoechea de Jorge et al. 2013).

Enfermedades asociadas con la AP

La desregulación de la AP causada por mutaciones, polimorfismos disfuncionales en componentes complemento y reguladores tales como FH o anticuerpos que promueven la activación de la AP se asocian altamente con enfermedades tales como síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS) (Noris et al. 2009) o glomerulopatías C3 (C3G) (Barbour et al. 2013) degeneración macular relacionada con la edad (AMD) (Kawa et al. 2014) o hemoglobinuria nocturna paroxística (PNH) (Holers 2008). Aparte de estos, se ha mostrado o postulado un papel patógeno para la AP para nefropatía IgA (Maillard et al. 2015), lupus sistémico eritematoso - (SLE) (Wilson et al.

1976), daño por isquemia-reperfusión (IR) o rechazo al trasplante, artritis reumatoide (RA) y muchas otras (Holers 2008) (Ricklin et al. 2013).

El HUS atípico y C3G son modelos maestros para la enfermedad relacionada con la AP En el aHUS, las mutaciones en cualquier componente de la AP o sus reguladores (C3, FB, F1, FH, FHR1 o MCP) o los anticuerpos anti-FH llevan a la activación del complemento sin control y finalmente a la formación de C5b-9 y el daño de la célula endotelial. Esto está acompañado por microangiopatía trombótica glomerular y fallo renal agudo, históricamente resultando en la muerte o fallo renal terminal en más de 60% de los pacientes.

En C3G, que avanza a fallo renal terminal en más de 50% de los pacientes dentro de 10 años, los depósitos del complemento se encuentran en o sobre la membrana de basamento glomerular. La activación de la AP en C3G también es causada por mutaciones en los genes de complemento, especialmente FH, o por los autoanticuerpos (factor nefrítico C3) afectando a la C3 convertasa (Loirat et al. 2011, Sethi et al. 2012).

Opciones terapéuticas en enfermedades relacionadas con el complemento

Las opciones terapéuticas establecidas en el tratamiento de aHUS o C3G están limitadas e incluyen plasmaféresis o la sustitución con plasma congelado fresco (FFP), tratamiento inmunosupresor y trasplante renal con un alto riesgo de recurrencia de la enfermedad subyacente (Braun et al. 2005, Lu et al. 2012, Cataland et al. 2014, Masani et al. 2014). Actualmente, están bajo investigación un número de productos terapéuticos dirigidos al complemento y podrían ofrecer opciones de tratamiento en el futuro (Wagner et al. 2010, Ricklin et al. 2013). Entre éstos, eculizumab, un anticuerpo anti-C5 monoclonal humanizado, bloquea la formación de TCC y ha sido recientemente aprobado para el tratamiento de aHUS (Zimmerhackl et al. 2010). Para C3G, aún no se ha establecido ningún régimen terapéutico (Masani et al. 2014). La aplicación de eculizumab en pacientes C3G lleva a una respuesta parcial en únicamente algunos pacientes (Bomback et al. 2012).

El bloqueo de las funciones efectoras tardías del complemento puede obtenerse si se evita la escisión de C5 por la C5 convertasa. El anticuerpo monoclonal terapéutico eculizumab se une a C5 humano e inhibe su activación dentro de la potente anafilatoxina C5a y el iniciador de la vía de complemento terminal C5b por C5 convertasa (Parker et al.

2007). Por lo tanto, eculizumab bloquea la señalización inflamatoria y la lisis celular por medio de la formación MAC, pero deja las C3 convertasas y la producción sin control de C3a sin afectar. Eculizumab demostró una mejora significativa en el resultado clínico y ha sido aceptado para el tratamiento de enfermedades mediadas por el complemento incluyendo hemoglobinuria nocturna paroxística (PNH) (Hillmen et al.2006) y aHUS (Zuber et al. 2012).

La posición central de C3 en la cascada de complemento la convierte en una diana atractiva para intervenciones terapéuticas, en consecuencia los inhibidores que actúan al nivel de C3 también han sido diseñados. La compstatina es un pequeño péptido de 13 aminoácidos que se ha ensayado preclínicamente (Mastellos et al.

2015). Los estudios estructurales han revelado que la compstatina se une a la cadena-13 de C3 y C3b y bloquea la interacción con C3 convertasas. Por lo tanto, la compstatina inhibe la activación de C3 y también la amplificación adicional de la cascada y evita la formación en corriente debajo de los efectores del complemento. La compstatina no evita la escisión de C3 por medio de las proteasas tales como trombina ni la “activación” de C3 en C3(H2O) vía "al ralentí" (Ricklin et al. 2015) y ha demostrado eficacia en el bloqueo del complemento in vitro y en modelos de animal incluyendo la circulación extracorpórea, la sepsis, y PNH. Otro método es la explotación de nuestro panel natural de RCA como FH o CR1 soluble o para mejorar su eficacia mediante la combinación de módulos de dominio seleccionados (Ricklin et al. 2013). TT30, que contiene FH SCR1-5 y CR2 SCR1-4 se diseña para acumularse preferentemente en sitios ya bajo el ataque mediado por el complemento. TT30 interactúa simultáneamente con C3b y C3d fusiona la funcionalidad del f H en fase fluida que une a C3b con la interacción de CR2 para C3d en la superficie de las células hospedadoras. TT30 mostró una mejora significativa en modelos de a Md , lesión por isquemia/reperfusión, y PNH (Merle et al. 2015,). Las moléculas mini-FH, que contienen SCR1-4 o SCR1-5 y SCR19-20 unen C3b y C3d con alta afinidad y muestran una mejor eficacia comparadas con FH nativo en modelos in vitro aHUS y PNH (Hebecker et al. 2013, Schmidt et al. 2013). Sin embargo, en ratones con FH deficiente, que muestran un fenotipo de tipo C3G, los efectos terapéuticos de mini-FH y un análogo murino de TT30 en el control de vía alternativa en plasma fueron comparativamente modestos, en asociación con una corta vida útil (Nichols et al. 2015, Ruseva et al. 2015).

El eculizumab se aprueba para aplicación en aHUS y PNH. Este bloquea la escisión de C5 por medio de C5 convertasa no específicamente. Los pacientes bajo terapia con eculizumab están en riesgo de desarrollar severas enfermedades infecciosas, especialmente infecciones meningocócicas como meningitis. Por el otro lado, el bloqueo de la formación de TCC no influye en la activación de la C3 convertasa. Esto podría llevar a una producción sostenida de anafilatoxina C3a en pacientes tratados y a la deposición continua de productos de la escisión de C3 en riñones, como se ve en pacientes de C3G bajo terapia con eculizumab. Adicionalmente, se encontraron depósitos de anticuerpos eculizumab en biopsias de riñón en pacientes tratados con eculizumab (Herlitz et al.

2012). Hasta ahora, los efectos a largo plazo de estos depósitos no se han investigado.

El bloqueo de solamente la C5 convertasa podría no ser suficiente en todas las enfermedades relacionadas con la AP Los informes de casos individuales sobre la efectividad de eculizumab en pacientes C3G mostró solamente beneficios en algunos pacientes en su mayor parte como una remisión parcial (Bomback et al. 2012, Legendre et al. 2013).

Los nuevos reguladores del complemento como compstatina, mini-FH o TT30 tratan de influir en la activación del complemento al nivel de la C3 convertasa. Estos desarrollos están bajo investigación en un estadio preclínico. El eculizumab y otros reguladores que están actualmente bajo desarrollo se dirigen a ya sea la C5 convertasa o la C3 convertasa.

Sumario de la invención

Los inventores de esta solicitud encontraron que la activación del complemento puede bloquearse efectivamente actuando sobre múltiples sitios efectores en la cascada del complemento (inhibición de C3/C5-convertasas, inhibición de la escisión de C5 y formación de TCC) simultáneamente. Esto lleva a una regulación más efectiva de la actividad de AP (y CP), permitiendo un ajuste entre la reducción de la AP (CP) y la prevención de la liberación de la anafilatoxina, por lo tanto reduciendo presumiblemente los efectos secundarios indeseados.

Además, los inventores encontraron que un motivo de dimerización dentro de un regulador, formado por módulos de dominio seleccionados, 1) aumenta la actividad reguladora por la formación de complejos multiméricos y 2) es resistente a la desregulación mediada por FHR.

La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: estructura y caracterización de MFHR1. A) Ensamblaje estructural de MFHR1. MFHR1 es una proteína de fusión compuesta de SCR1-2 de FHR1 (FHR1 1-2) N-terminalmente enlazada a SCR1-4 y SCR19-20 de hFH denominada FH1-4 y FH19-20, respectivamente. Se usó una etiqueta de penta-histidina (N-terminal) como medios para purificación. FHR1-2 contiene un motivo de dimerización, inhibe la actividad de C5 convertasa y el ensamblaje MAC. FH presenta actividad de cofactor y aceleración de deterioro (FH1-4) y los sitios de unión para C3b y superficies celulares (FH 19-20). B) La tinción por SDS-PAGE y Coomassie (izquierda) o plata (derecha) de MFHR1 purificado de sobrenadantes de células SF9 infectadas con baculovirus vía Ni-afinidad y cromatografía de exclusión de tamaño. MFHR1 aparece con el peso molecular calculado de 58.65 kDa bajo condiciones de reducción. Una movilidad más rápida de MFHR1 bajo condiciones no de reducción (tinción Coomassie, carril derecho) indica la presencia de enlaces de disulfuro. C) Inmunodetección usando FH anti-humano policlonal, anti-FH1-4 o los anticuerpos anti-C18 y anti-FHR1-2 monoclonales indica la integridad correcta de FHR1-2, FH1-4 y FH20 en MFHR1 recombinante (I.). FH1-4 Recombinante; 19-20 (II.), FHR1 (III.) de longitud completa, FH1-4 (IV.) o hFH (V.) derivado de plasma humano sirvieron como controles.

Figura 2. MFHR1 se une a C3b, exhibe la actividad del cofactor y disocia las C3 convertasas. A) Se analizó la interacción de MFHR1 con C3b por medio de ELISA. C3b se inmovilizó en placas de microtitulación y se agregaron diluciones seriales de MFHR1 o hFH y la unión se detectó usando anticuerpos anti-FH primarios y anticabra secundarios marcados con HRP. Los pocillos recubiertos con BSA se usaron como controles. Los datos son media ± SD de n=3 experimentos. La unión máxima de hFH a C3b se determinó como de 100% de unión relativa. B) MFHR1 eficientemente disocia los complejos de C3bBb (C3 convertasa). Las convertasas se ensamblaron en placas de microtitulación en presencia de C3b, factor B (FB) y factor D (FD) y se agregó hFH o MFHR1 e incubaron a 37°C. El C3bBb intacto y la disociación de estos complejos se midieron por la cantidad relativa de FB. Los valores DO450 de los pocillos de control (C3b+FB+FD sin reguladores) se fijaron en 100%. El control negativo se llevó a cabo sin la adición de FD. Los datos son la media ± SD de n=3 experimentos. C) MFHR1 exhibe la actividad del cofactor. La prueba del cofactor se realizó por medio de la incubación de C3b y el factor I (FI) con concentraciones en aumento de MFHR1 o hFH (5-250 nM) durante 30 min a 37°C. Se usó la tinción SDS-PAGE y azul Coomassie para visualizar una escisión de cadena a y los fragmentos a'68, a'437 a'46. D) Para la cuantificación de la actividad del cofactor, se determinó la intensidad de una banda de la cadena a C3b por densitometría y la cadena a C3b intacta se normalizó a la cadena 13 y se fijó en 100%. Los datos representan los valores medios ± SD de n=5 experimentos.

Figura 3. MFHR1 se une a C5 y regula la activación de la vía terminal por medio de la inhibición de la C5 convertasa/escisión de C5 y la formación MAC. A) MFHR1 se une a C5 según se determina por ELISA. Se inmovilizaron cantidades equimolares de MFHR1, FHR1 de longitud completa, hFH o BSA (133 nM) en placas Nunc y se incubaron con concentraciones en aumento (10, 20, 40 pg/ml) de C5. La unión se detectó usando anticuerpos C5 monoclonales y anticuerpos secundarios marcados con HRP. Los datos son la media ± SD de n=3 experimentos. B) MFHR1 inhibe la activación de la AP por medio del bloqueo de la escisión de C5. El factor de veneno de cobra (CVF) C5 convertasa se generó en eritrocitos de oveja (sE) después de la adición del factor B (FB) y el factor D (FD). La hemólisis se indujo después de la adición de los componentes C5, C6, C7, C8 y C9 y se detectó a 414 nm. La preincubación de C5 con FHR1, MFHR1 o eculizumab inhibió significativamente la hemólisis mientras hFH o BSA no mostraron ninguna inhibición. Los controles sin CVF convertasa (-FB/FD) o C5 no indujeron hemólisis. C) MFHR1 inhibe la formación del complejo de ataque de membrana (MAC) en sE. La formación de MAC en sE se indujo por incubación con los componentes C5b6, C7, C8 y C9 y se detectó por la hemólisis de las células. La preincubación de C5b6 con MFHR1, FHR1 o eculizumab inhibió la hemólisis a niveles significativos comparados con hFH o BSA. Las muestras sin C9 no inducen la hemólisis. En el control B y C sin regulador (w/o) se determinó como 100%. Todos los datos representan valore medios ± SD de 3 experimentos separados. ***P<0.001 vs. w/o control, ANOVA de una vía con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni.

Figura 4. MFHR1 inhibe la vía alternativa del complemento (AP) y la activación de la vía clásica (CP) y reduce la liberación de anafilatoxina en suero humano a niveles clínicamente relevantes. Se agregó MFHR1, hFH, FHR1 o eculizumab en suero humano y A) deposiciones de C3b o B) la formación del complejo C5b-9 se midió después de que la activación de la vía alternativa (AP) avanzó por medio de LPS usando condiciones reguladoras del pH específicas. A) MFHR1 reduce las deposiciones de C3b en la superficie con una mayor eficiencia que hFH según se ha medido por ELISA usando C3 anti-humano C3 y anticuerpos secundarios marcados con HRP. Como se esperaba, eculizumab no inhibió las deposiciones de C3b. B) MFHR1 inhibe C5b-9 con mayor eficiencia que hFH o eculizumab según se ha determinado usando AP-ELISA de complemento (WIESLAB®). El suero sin tratamiento se fijó en 100% para cada experimento individual. Los datos representan valores individuales de n=4 ensayos ±SEM usando suero de 4 donadores individual sanos. Además, MFHR1 eficientemente bloquea la generación de C) C3a y D) C5a según ensayados en el sobrenadante de suero activado en la AP usando C3a específico, ELISA C5a (Quidel) (n=3 ensayos ± SEM). E) La inhibición de la vía clásica (CP) por MFHR1 se evaluó usando CP-ELISA de complemento (W iESLAB®). La actividad de la AP del suero de control sin tratamiento se estableció en 100% para cada experimento individual. Los datos representan valores individuales de n=3 ensayos ± SEM usando suero de 3 donadores sanos individuales. Ver la tabla 1 para los valores IC50 calculados.

Figura 5. Los complejos multiméricos aumentan la actividad reguladora de la AP de MFHR1 en suero humano. A) Cromatografía de exclusión de tamaño (Superdex 200 10/300 GL) de albúmina de suero de bovino (BSA), FH (hFG) derivado de plasma sérico y MFHR1. Las tres composiciones de la mezcla BSA presentaron diferentes volúmenes de retención sobre la base de la masa molecular, que fue I. trímero BSA (198 kDa, 10.35 ml), II. dímero BSA (132 kDa, 11.45 ml) y III. monómero BSA (66 kDa, 13.4 ml). Bajo la misma condición, hFH (9.3 ml) mostró que el pico de las especies proteínicas migra como proteínas diméricas a aproximadamente 300 kDa. MFHR1 mostró un pico (I.) a un volumen de retención de 10 ml, lo que indica que MFHR1 migra predominantemente en un estado multimérico en la fase de fluido. El trímero teórico (II. 10.7), dímero (III. 11.4), intermedios (IV.-V.) o monomérico (IV. 13.5) de MFHR1 se indican en el perfil de elución. B) Análisis de MFHR1 después de la elución de la columna SEC según se realiza en A). Se cargaron 20 pl de proteína de las fracciones en SDS-PAGE al 10% y se tiñeron con plata. C) A continuación, se agregaron fracciones MFHR1 SEC individuales o agrupadas en suero humano a 10 nM y se procedió a la activación de la AP por incubación en pocillos cubiertos con LPS usando condiciones reguladoras de pH específicas de AP. La eficiencia reguladora de las fracciones MFHR1 se analizó midiendo la formación del complejo C5b-9. La actividad de la AP del suero de control sin tratamiento se determinó al 100%.

Figura 6. MFHR1 es resistente a la desregulación por medio de FHR1 y FHR5. A) MFHR1 que se une a C3b no se inhibe competitivamente por FHR1 o FHR5. MFHR1 (triángulos) o hFH (cuadro) (denominado como proteína de prueba) se agregó a placas de microtitulación recubiertas con C3b solo o con concentraciones en aumento de FHR1 (línea negra) o FHR5 (línea gris) en el intervalo de cantidades equimolares a un exceso de 100 veces. MFHR1 o hFH unido a C3b se detectó usando anticuerpos específicos. Se muestra el promedio de 3 ensayos independientes con SD. B) La protección mediada por MFHR1 de eritrocitos de oveja (sE) de la activación de la AP inducida con suero no se atenúa por FHR5, mientras que la función reguladora de la AP de hFH fue desregulada dependiente de la dosis por FHR5. Se usó MFHR1 o hFH a concentraciones que reducen la lisis inducida con suero consumido por FH de sE a 50% y se agregaron concentraciones en aumento de FHR5 en el intervalo de cantidades equimolares a un exceso de 100 veces. La hemólisis se determinó a 414 nm y los datos se expresaron como un aumento relativo sobre las muestras en las que no se agregó FHR5. Los datos representan valores individuales de n=3 ensayos ± SEM.

Figura 7. MFHR1 reduce la activación del complemento sin control en el tratamiento del modelado del síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS) y glomerulopatía C3 (C3G). A) Las mutaciones en FH pueden ser las causantes de aHUS familiar y la pérdida de la regulación del complemento en sueros de la hemólisis mediada de estos pacientes si se agregan a eritrocitos de oveja (sE). El MFHR1 agregado al suero de un paciente aHUS (paciente #1 FH R1215Q (Gerber et al. 2003)) protege sE de la formación de MAC mediada por el complemento y la lisis con mayor eficiencia que eculizumab. Los datos representan valores medios ± SD de n=3 experimentos. B) El suero C3 aumenta de manera ubicua en C3G debido a la excesiva activación del complemento y la inhibición de la actividad sin control del complemento pueden ofrecer una opción de tratamiento alternativa en C3G. MFHR1 agregado al suero de un paciente C3Neph positivo inhibe eficazmente la activación de la AP y la formación de C5b-9 después de la estimulación de LPS.

Figura 8. MFHR1 muestra un beneficio terapéutico significativo frente a la activación del complemento sin control en glomerulopatía C3 (C3G) in vivo. A-C) Los ratones con FH deficiente (FH-/-) desarrollan acumulación de C3 glomerular y bajos niveles de C3 sérico debido a la sobreactivación de la AP, proporcionando así un modelo C3G útil para el ensayo de la eficiencia terapéutica de fármacos dirigidos al complemento. A) MFHR1 aumenta significativamente los niveles C3 séricos en puntos en el tiempo indicados después de inyección intraperitoneal de 0.5 mg de MFHR1 a niveles comparables con hFH. Los valores medios se muestran como barras con puntos de datos individuales mostrados en gráfico. B) MFHR1 reduce significativamente la acumulación de C3 glomerular anormal. La intensidad fluorescente C3 glomerular se determinó a las 24 horas después de la administración de MFHR1, hFH o ratones FH-/-tratados con PBS. Las secciones de ratones de tipo salvaje sin tratamiento se usaron como control negativo. Las medias se muestran como barras ± SD con puntos de datos individuales mostrados en gráfico expresados como unidades de fluorescencia arbitrarias (AFU). C) Imágenes representativas de deposiciones C3 glomerulares. Barras a escala; 50 |jm. ***P<0.001 vs. Grupo PBS, ANOVA de una vía con la prueba de Bonferroni.

Descripción detallada de la invención

La invención divulga un polipéptido que comprende un dominio efector inhibidor de C3 convertasa, un dominio efector inhibidor de C5 convertasa (dominio de unión C5), y opcionalmente un dominio inhibidor de formación de TCC y/o un motivo de dimerización. El polipéptido según la invención comprende repeticiones de consenso cortas (SCR) 1 a 4 de factor H (FH), SCR1 y SCR2 de proteína 1 relacionada con factor H (FHR1), y un dominio que es capaz de unirse a las superficies celulares.

Un "dominio efector inhibidor de C3 convertasa" en conexión con la presente invención se refiere a una secuencia de aminoácidos capaz de inhibir la C3 convertasa, es decir, de inhibir la formación de C3 convertasa. La inhibición de la C3 convertasa típicamente se presenta si se inhibe la deposición de C3b o si existe una formación reducida de C3a después de la activación de la vía alternativa del complemento con relación a un control. La formación de C3b y C3a puede determinarse en ensayos como se describe en la figura 4A o figura 4C, respectivamente. En otra forma de realización, el dominio efector inhibidor de C3 convertasa presenta una actividad de aceleración de decaimiento de C3 convertasa y actividad del cofactor. La actividad de aceleración de decaimiento de C3 convertasa puede determinarse en un ensayo como se describe en la figura 2B. La actividad del cofactor puede determinarse en un ensayo como se describe en las figuras 2C-2D.

El dominio efector inhibidor de C3 convertasa es un fragmento de FH. De acuerdo con la presente invención, FH denota una proteína que presenta por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:1. Preferentemente, FH presenta una identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC iD N°:1 de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%. Todavía más preferentemente, FH comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:1.

La comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad (y porcentaje de similitud) entre dos secuencias de aminoácido puede lograrse usando cualquier programa adecuado, por ejemplo el programa "BLAST 2 SEQUENCES (blastp)" (Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174, 247-250) con los siguientes parámetros: Matriz BLOSUM62; hueco abierto 11 y penalidades de hueco 1 de extensión; hueco x_dropoff50; tamaño de palabra 3, esperado 10.0; Filtro: ninguno.

El dominio efector de C3 convertasa preferentemente comprende o consiste en SCR1-4 de FH. En una forma de realización, el dominio efector de C3 convertasa comprende o consiste en los aminoácidos 19-264 de SEC ID N°:1.

En una divulgación, el dominio efector inhibidor de C3 convertasa es el fragmento de FHR2. De acuerdo con la divulgación, FHR2 denota una proteína que presenta por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:3. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de FHR2 presenta una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:3 de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%. Todavía más preferentemente, FHR2 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:3.

En una divulgación, el dominio efector de C3 convertasa puede comprender o consistir en SCR1-4 de FHR2. En una forma de realización divulgada, el dominio efector de C3 convertasa comprende o consiste en los aminoácidos 22-268 de SEC ID N°:3.

Un “dominio efector inhibidor de C5 convertasa” en conexión con la presente invención se refiere a una secuencia de aminoácidos capaz de inhibir la C5 convertasa. La inhibición de la C5 convertasa (prevención de la escisión de C5) está típicamente presente si existe una formación reducida de C5a. La formación de C5a puede determinarse en un ensayo como se representa en la figura 4D. En un enfoque experimental alternativo se muestra la unión de un dominio efector inhibidor para C5 (figura 3A). Esto evita la escisión de C5 en C5a y C5b por C5 convertasas experimentales e inhibe la formación de MAC y la lisis de las células como se representa en la (figura 3B).

El dominio efector inhibidor de C5 convertasa es el fragmento de FHR1. De acuerdo con la presente invención, FHR1 denota una proteína que presenta por lo menos 70% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:2. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de FHR1 presenta una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:2 de por lo menos 80%, más preferentemente de por lo menos 90%, más preferentemente de por lo menos 95%. Todavía más preferentemente, FHR1 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:2. Aparte de la unión a C5 y la prevención de la escisión de C5 por C5 convertasas, SCR 1-2 de FHR1 comprenden un motivo de dimerización, que lleva a la multimerización de la función amplificadora de MFHR1 del polipéptido como se muestra en la figura 5. Aparte de la inhibición de la C5 convertasa, SCR 1-2 FHR1 inhibe la formación de MAC por medio de la unión de C5b-6 (figura 3C).

El dominio efector inhibidor de C5 convertasa comprende o consiste en SCR1 y SCR2 de FHR1. En una forma de realización, el dominio efector inhibidor de C5 convertasa comprende o consiste en los aminoácidos 22-142 de SEC ID N°:2.

El dominio efector inhibidor de C3 convertasa, el dominio de convertasa C5 inhibidor y el dominio efector de la formación de MAC inhibidor pueden fusionarse directamente o a través de un enlazador. El enlazador puede ser un enlazador peptídico o un enlazador no peptídico. Preferentemente, el enlazador consiste en 1 a 100 aminoácidos, más preferentemente en 1 a 50 aminoácidos, más preferentemente en 1 a 20 aminoácidos, más preferentemente en 1 a 10 aminoácidos, todavía más preferentemente en 1 a 5 aminoácidos. La secuencia del enlazador es típicamente heteróloga a la secuencia de aminoácidos del dominio efector de C3 convertasa y a la secuencia de aminoácidos del dominio efector inhibidor de C5 convertasa.

El polipéptido divulgado puede presentar la estructura A-B, en el que A es el dominio efector de C3 convertasa como se define en la presente memoria, y B es un dominio efector de C5 convertasa como se define en la presente memoria. En otra forma de realización, el polipéptido divulgado puede presentar la estructura B-A, en el que A es el dominio efector de C3 convertasa como se define en la presente memoria, y B es un dominio efector de C5 convertasa como se define en la presente memoria.

En una divulgación particular, el polipéptido de la invención comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SEC ID N°:4, SEC ID N°:5, SEC ID N°:6 y SEC ID N°:7.

El polipéptido de la invención comprende un tercer dominio, presentando dicho tercer dominio unas propiedades de unión de superficie celular. Preferentemente, dicho tercer dominio comprende o consiste en un fragmento de FH. Más preferentemente, el tercer dominio comprende o consiste en SCR19 y SCR20 de FH. En una forma de realización, el tercer dominio comprende o consiste en los aminoácidos 1107-1230 de SEC ID N°:1.

El polipéptido de la invención puede presentar la estructura A-B-C, en el que A es el dominio efector de C5 convertasa como se define en la presente memoria, B es un dominio efector de C3 convertasa como se define en la presente memoria, y C es el tercer dominio como se define en la presente memoria. En otra forma de realización, el polipéptido de la invención puede presentar la estructura A-C-B, B-A-C, B-C-A, C-A-B, o C-B-A, en el que los significados de A, B y C son como se define en la presente memoria. El orden de las letras A, B y C indica la secuencia del extremo N-terminal al C-terminal del polipéptido, por ejemplo en A-B-C, el dominio A está en el extremo N-terminal, y el dominio C está en el extremo C-terminal.

El tercer dominio puede fusionarse directamente al dominio efector de C3 convertasa y/o al dominio efector C5 y al domino efector MAC, o a través de un enlazador como se define en la presente memoria anteriormente.

En una forma de realización particular, el polipéptido de la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:8. En otra forma de realización, el polipéptido de la invención comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID N°:9.

El polipéptido de la invención puede utilizarse para tratar o prevenir trastornos relacionados con y/o asociados con el sistema complemento. Estos trastornos incluyen, pero no se limitan a, síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), microangiopatía trombótica (TMA), glomerulopatía C3 (C3G), nefropatía IgA, nefritis de lupus eritematoso sistémico, rechazos humorales en pacientes con trasplante de riñón, daño tisular después de eventos de isquemiareperfusión, por ejemplo después de trasplante renal, activación excesiva del complemento, daño tisular, por ejemplo bajo hemodiálisis, hemoglobinuria nocturna paroxística (PNH), degeneración macular relacionada con la edad (AMD), enfermedades infecciosas, sepsis, SIRS, lesión traumática, infarto de miocardio, son enfermedades y afecciones en las que la activación del complemento se hace responsable de daño local o sistémico adicional.

Preferentemente, el trastorno que se debe tratar o prevenir se selecciona de entre el grupo que consiste en aHUS, TMA, C3G, nefropatía IgA, nefritis de lupus eritematoso sistémico, PNH y AMD.

La invención proporciona además ácidos nucleicos que codifican el polipéptido de la invención, que pueden insertarse en plásmidos y vectores adecuados para la expresión en células hospedadoras.

El ácido nucleico que codifica el polipéptido que se debe expresar puede prepararse de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica. Sobre la base de las secuencias de ADNc de FH (secuencia de referencia NCBI: NM_000186.3) FHR1 (secuencia de referencia NCBI: NM_0021 13.2) y FHR2 (secuencia de referencia NCBI: NP_005657.1) el ADN recombinante que codifica los polipéptidos mencionados anteriormente puede diseñarse y generarse.

Los constructos en los que el ADNc contiene todo el marco de lectura abierto insertado en la orientación correcta en un plásmido de expresión pueden usarse para la expresión de la proteína. Los vectores de expresión típicos contienen promotores que dirigen la síntesis de grandes cantidades de ARNm correspondientes al ácido nucleico insertado en las células que llevan el plásmido. Pueden asimismo incluir un origen de la secuencia de replicación que permite su replicación autónoma dentro del organismo hospedador, y las secuencias que aumentan la eficiencia con la cual el ARNm sintetizado se traduce. Los vectores a largo plazo estables pueden mantenerse como entidades de replicación libres mediante el uso de elementos reguladores de, por ejemplo, virus (por ejemplo, las secuencias OriP del genoma del virus Epstein Barr). Las líneas celulares también pueden producirse presentando el vector integrado en el ADN genómico, y de esta manera el producto génico se produce sobre una base continua. Típicamente, las células que se deben proporcionar se obtienen mediante la introducción del ácido nucleico que codifica el polipéptido en células hospedadoras adecuadas. Cualquier célula hospedadora adecuada para el cultivo celular y para la expresión de polipéptidos puede usarse de acuerdo con la presente invención. En ciertas formas de realización, la célula hospedadora es de mamífero. En otras formas de realización, la célula hospedadora es una célula de insecto, por ejemplo una célula Sf9), o una célula physcomitrella (por ejemplo physcomitrella patens). Alternativamente, la célula hospedadora puede ser una célula bacteriana.

En general, será típicamente deseable aislar y/o purificar glicoproteínas expresadas de acuerdo con la presente invención. En ciertas formas de realización, la glicoproteína expresada se secreta en el medio y de esta forma las células y otros sólidos pueden eliminarse, como por centrifugación o filtración por ejemplo, como una primera etapa en el proceso de purificación.

El polipéptido purificado puede aislarse y purificarse por métodos estándares, incluyendo, pero no limitándose a, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio de ion, de afinidad, de exclusión de tamaño y de hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación, o solubilidad diferencial, precipitación en etanol y/o por medio de cualquier otra técnica disponible para la purificación de las proteínas (ver, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2a Edición, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. y Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M. P, Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol. 182), Academic Press, 1997).

Un experto en la materia apreciará que la técnica de purificación exacta variará dependiendo del carácter del polipéptido que se debe purificar, el carácter de las células a partir de las cuales se expresa el polipéptido, y/o la composición del medio en el cual se cultivan las células.

Otro aspecto de la invención es una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la invención, y un excipiente o portador farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender el polipéptido en una cantidad efectiva para tratar o prevenir un trastorno relacionado con el complemento en un sujeto.

Las formulaciones terapéuticas del polipéptido de la invención adecuadas en los métodos descritos en la presente memoria pueden prepararse para almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando la glicoproteína que presenta el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables típicamente utilizados en la técnica (a los que se hace referencia en su totalidad en la presente memoria como “portadores”), es decir, agentes reguladores del pH, agentes estabilizantes, conservantes, isotonificantes, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos misceláneos. Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición (Osol, ed. 1980). Tales aditivos deben ser no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones utilizadas.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden formularse para administración oral, sublingual, intranasal, intraocular, rectal, transdérmica, mucosal, tópica o parenteral. La administración parenteral puede incluir inyección o infusión intradérmica, subcutánea, intramuscular (i.m.), intravenosa (i.v.), intraperitoneal (i.p.), intraarterial, intramedular, intracardíaca, intraarticular (articulación), intrasinovial, intracraneal, intraespinal, e intratecal (fluidos espinales), preferentemente inyección intraperitoneal (i.p.) en ratones e intravenosa (i.v.) en humanos. Cualquier dispositivo adecuado para inyección o infusión parenteral de las formulaciones de fármaco puede usarse para tal administración. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede estar contenida en una jeringa prellenada estéril.

La determinación de la dosis efectiva, el número total de dosis, y la longitud del tratamiento con un polipéptido soluble de la invención está dentro de las capacidades de los expertos en la materia, y puede determinarse usando un estudio de aumento de dosis estándar. La dosis de un polipéptido soluble de la invención que se debe administrar variará de acuerdo con el polipéptido soluble particular, el sujeto, y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, la condición física del sujeto, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico), y la vía de administración seleccionada; la dosis apropiada puede determinarse fácilmente por un experto en la materia.

Sumario de las secuencias de aminoácido:

Ejemplos

MFHR1 consiste en los dominios activos reguladores de FH N-terminal SCR1-4 (actividad de cofactor y de aceleración de C3/C5 convertasa) con los dominios de reconocimiento de superficie C-terminal (SCR19-20) de FH en combinación con los dominios N-terminales de FHR1 (SCR1-2) [figura 1]. El FHR1 es el único regulador de complemento endógeno conocido de la C5 convertasa. FHR1 SCR1-2 se une a C5 y por lo tanto inhibe la escisión de C5 en C5a y C5b. Adicionalmente, FHR1 SCR1-2 inhibe la vía del complemento terminal por la unión a C5b6. A través de la combinación de estos dominios, la activación del complemento se inhibe en múltiples sitios efectores de la cascada (degradación de C3b, inhibición de C3/C5-convertasas, inhibición de la escisión de C5 y la formación de C5b-9). Esto también lleva a la supresión y formación de anafilatoxinas C3a y C5a, que se creen contribuyen al avance de la enfermedad en enfermedades relacionadas con la AP

Para producir MFHR1, se amplificaron fragmentos de ADNc con la secuencia solicitada de los dominios FH y FHR1 mencionados anteriormente por PCR y posteriormente se ensamblaron por PCR de solapamiento de autoimprimación. El ADN se clonó en el vector de expresión pFastbac gp67-10xHis baculo y MFHR1 se expresó en células de insecto SF9. La secuencia de aminoácidos de MFHR1 se muestra en SEC ID N°:8. La purificación de la proteína se llevó a cabo por cromatografía por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. SDS-PAGE y la tinción con gel Commassie o plata mostró una sola banda de 58.65 kDa correspondiente al peso molecular calculado de MFHR1 [figura 1B]. La exitosa fusión de FHR1 SCR1-2 y FH SCR 1-4 y SCR 19-20 se confirmó por inmunodetección usando anticuerpos específicos para la detección de los dominios SCR1-2 derivados de FHR1, anti-FH1-4 para la detección de los dominios 1-4 derivados de FH, anti-C18 monoclonales para la detección del dominio 20 derivado de FH y los anticuerpos FH policlonales [figura 1C].

MFHR1 se une a C3b [figura 2A], disocia C3 convertasas [figura 2B] y exhibe la actividad del cofactor [figuras 2C-2D]. En contraste con el FH purificado del plasma (FHplasma), FHR1 y MFHR1 muestran la habilidad de unirse a C5, mediada por SCR1-2 de FHR1 [figura 3A]. FHR1 y MFHR1 regulan la activación de la vía terminal por medio de la inhibición de la C5 convertasa/escisión de C5 [figura 3B] y la formación de MAC [figura 3C]. Esto demuestra que la presente nueva proteína de fusión MFHR1 no solamente retiene la actividad reguladora del complemento de FH [figuras 2A-2D] y FHR1 [figuras 3A-3C], sino que además, combina las propiedades de ambas. MFHR1 inhibe la hemólisis inducida por suero aHUS de eritrocitos de oveja más eficientemente que eculizumab, demostrando que, además de su actividad reguladora, el reconocimiento de la superficie derivado de los dominios FH 19-20 se retiene en MFHR1 [figura 7A]. La alta potencia de MFHR1 además se enfatizó en ensayos de la actividad del complemento basados en ELISA. Después de la activación de la cascada complemento en suero humano potenciado con MFHR1, su actividad reguladora AP se determinó midiendo las deposiciones de C3b [figura 4A] o C5b6-9 [figura 4B] y su eficiencia reguladora CP se determinó midiendo C5b6-9 usando WIESLAB® CP-ELISA [figura 4E]. La adición de MFHR1 a suero humano normal (NHS) o suero de un paciente C3G (paciente bajo recaída, autoanticuerpo C3Nef positivo) eficientemente inhibe la activación del complemento de una manera dependiente de la dosis [figuras 4A-4B, 4E, 7B]. Como en el ensayo hemolítico, MFHR1 mostró una mayor eficiencia inhibidora sobre una base molar que hFH (tabla 1), eculizumab y otros inhibidores relevantes que están bajo investigación en un estadio preclínico (los valores IC50 se resumen en la tabla 1). Además, se demuestra que MFHR1 inhibe la generación de C3a [figura 4C] y C5a [figura 4D] en suero humano más eficientemente que el eculizumab. La utilización de un motivo de dimerización (mediado por SCR1 de FHR1) facilita la generación de complejos multiméricos de MFHR1. Se demostró que los complejos multiméricos presentan una más alta actividad reguladora, presumiblemente por el aumento de la concentración local de los reguladores [figuras 5A-5C]. Además, MFHR1 es resistente a la desregulación mediada por FHR [figuras 6A-6B].

El valor terapéutico de MFHR1 se demostró en dos métodos de tratamiento de modelado in vitro y un modelo murino de c 3g in vivo. La adición de MFHR1 reduce eficientemente la activación del complemento sin control en sueros de pacientes con aHUS [figura 7A] y C3G [figura 7B]. En ratones con FH-/- deficiente, que muestran un fenotipo de tipo C3G, la administración de MFHR1 dio como resultado la rápida normalización de niveles de C3 en plasma [figura 8A] y la resolución de la deposición de C3 glomerular [figuras 8B-8C].

Tabla l: Sumario de los valores de IC50 estimados para la actividad inhibidora en suero humano

Tomados conjuntamente, los presentes resultados demuestran que los métodos combinados para interceptar la activación del complemento en múltiples sitios efectores en la cascada de complemento (degradación de C3b, inhibición de C3/C5-convertasas, inhibición de la escisión de C5 y formación de TCC) simultáneamente y por su habilidad para multimerizar (o respectivamente ambos) presentan varias ventajas beneficiosas comparados con métodos “convencionales” con el fin de mejorar los reguladores de la activación del complemento. MFHR1, que comprende diferentes propiedades funcionales de FH y FHR1 regula la actividad del complemento al nivel de C3 y C5 convertasas y mediante el bloqueo de la vía de complemento terminal y probablemente es más activa comparada con FH o eculizumab u otros inhibidores de complemento relevantes clínicos publicados. Especialmente, MFHR1 es particularmente resistente a la desregulación por FHR1 y FHR5 y los complejos multiméricos pueden aumentar su eficiencia reguladora.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Polipéptido que comprende repeticiones de consenso cortas (SCR) 1 a 4 de factor H (FH), SCR1 y SCR2 de proteína 1 relacionada con el factor H (FHR1), y un dominio que es capaz de unirse a las superficies celulares.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que dicho dominio que es capaz de unirse a superficies celulares comprende SCR19 y SCR20 de FH.

3. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho polipéptido es un multímero, preferentemente en el que dicho polipéptido comprende por lo menos un motivo de dimerización de SCR1 de FHR1.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho polipéptido es capaz de inhibir la formación de TCC (C5b-9), preferentemente uniendo el polipéptido a C5b-6.

5. Polipéptido que presenta la estructura A-B-C, en el que A comprende o consiste en SCR1 y SCR2 de FHR1, B comprende o consiste en SCR 1 a 4 de FH, y C es un dominio que es capaz de unirse a las superficies celulares como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, preferentemente en el que A y B son fusionados directamente o mediante un enlazador y/o en el que B y C son fusionados directamente o mediante un enlazador.

6. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las SCR 1 a 4 de FH consisten en los aminoácidos 19-264 de SEC ID n°: 1.

7. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las SCR1 y SCR2 de FHR1 consisten en los aminoácidos 22-142 de SEC ID n°: 2.

8. Polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores para la utilización en el tratamiento o la prevención de un trastorno relacionado a o asociado con el sistema complemento.

9. Polipéptido para la utilización según la reivindicación 8, en el que dicho trastorno relacionado a o asociado con el sistema complemento se selecciona de entre el grupo que consiste en síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), microangiopatía trombótica (TMA), glomerulopatía C3 (C3G), nefropatía IgA, nefritis de lupus eritematoso sistémico, rechazo al trasplante, hemoglobinuria nocturna paroxística (PNH), degeneración macular relacionada con la edad (AMD), enfermedades infecciosas, sepsis, SIRS, lesión traumática, daño por isquemia/reperfusión e infarto de miocardio.

10. Ácido nucleico que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

11. Plásmido o vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 10.

12. Célula que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 10 o el plásmido o el vector según la reivindicación 11.

13. Método de producción del polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende cultivar las células según la reivindicación 12 en un medio de cultivo bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido, y recuperar el polipéptido de las células o del medio de cultivo.