ES2893451T3

ES2893451T3 - ARN para el tratamiento de enfermedades autoinmunes

Info

Publication number: ES2893451T3
Application number: ES18717580T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin; Sebastian Kreiter; Christina Krienke; Jutta Petschenka; Lena Mareen Kranz; Mustafa Diken
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2018-04-10
Publication date: 2022-02-09
Anticipated expiration: 2038-04-10
Also published as: CY1124767T1; KR102824942B1; JP7444924B2; JP2024059794A; SG10202111163VA; RS62582B1; US11701413B2; BR112019020667A8; IL290980A; JP7078641B2; IL269793B; CN110719787B; EP3609529A1; KR20240042138A; DK3609529T3; BR112019020667A2; EP3609529B1; AU2018253352A1; US20200061166A1; PT3609529T

Abstract

Una composición farmacéutica para uso en terapia, comprendiendo dicha composición ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno, en el que el ARN no inmunogénico se vuelve no inmunogénico mediante la incorporación de 1-metilpseudouridinas y mediante la eliminación de ARNbc.

Description

DESCRIPCIÓN

ARN para el tratamiento de enfermedades autoinmunes

La presente enseñanza describe ARN no inmunogénico. Este ARN forma la base para el desarrollo de agentes terapéuticos para inducir tolerancia hacia un autoantígeno y, por tanto, para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Antecedentes

La evolución del sistema inmunológico dio lugar a vertebrados en una red altamente eficaz basada en dos tipos de defensa: la inmunidad innata y la adaptativa. En contraste con el antiguo sistema inmunológico innato evolutivo que se basa en receptores invariantes que reconocen patrones moleculares comunes asociados con patógenos, la inmunidad adoptiva se basa en receptores de antígenos altamente específicos en las células B (linfocitos B) y células T (linfocitos T) y la selección clonal. Mientras que las células B generan respuestas inmunes humorales mediante la secreción de anticuerpos, las células T median las respuestas inmunitarias celulares que conducen a la destrucción de células reconocidas y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células en humanos y animales.

Las células T maduras reconocen y responden al antígeno a través de sus receptores específicos de antígeno (TCR) que interactúan con péptidos inmunogénicos (epítopos) unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y presentados en la superficie de las células diana. Por ejemplo, las células T citotóxicas responden a un antígeno que se presenta en asociación con proteínas del MHC-I. Las células T colaboradoras reconocen el antígeno presentado en las proteínas del MHC-II. La consecuencia más inmediata de la activación del TCR es el inicio de vías de señalización que dan como resultado la expansión clonal de las células T, la sobrerregulación de los marcadores de activación en la superficie celular, la diferenciación en células efectoras, la inducción de citotoxicidad o secreción de citocinas e inducción de apoptosis. El TCR es parte de una compleja maquinaria de señalización, que incluye el complejo heterodimérico de las cadenas a y p del TCR, el correceptor CD4 o c D8 y el módulo de transducción de señales CD3. Mientras que las cadenas CD3 transfieren la señal de activación dentro de la célula, el heterodímero a/p de TCR es el único responsable del reconocimiento del antígeno.

Además de las funciones críticas que desempeñan las células T en la respuesta inmunitaria, las células dendríticas (DC) son igualmente importantes. Las DC son células presentadoras de antígenos profesionales que tienen un papel regulador clave en el mantenimiento de la tolerancia a los autoantígenos y en la activación de la inmunidad innata y adaptativa contra antígenos extraños.

El sistema inmunológico también puede producir efectos indeseables. Por ejemplo, los trastornos autoinmunitarios se caracterizan por la pérdida de tolerancia frente a autoantígenos (antígenos propios), activación de linfocitos reactivos frente a autoantígenos y daño patológico en órganos diana.

Las terapias actuales para los trastornos autoinmunitarios se concentran principalmente en la respuesta sintomática y en la mitigación del sistema inmunológico en su conjunto. La terapia con antígeno específico ha surgido recientemente como una terapia potencial para los trastornos autoinmunes, pero ha resultado difícil obtener respuestas inmunes apropiadas y estas terapias han tenido un éxito limitado.

Por ejemplo, Lobell et al., 2003 (J. Immunol. 170, 1806-13) describen que una vacuna de ADN que codifica un autoantígeno derivado de la glicoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), denominada MOG91-108, suprime los signos clínicos de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en ratas al mejorar una respuesta de tipo Th1. El documento WO 2013/120626 A1 se refiere a ácidos nucleicos, incluidos los ARN, que comprenden al menos un tallo-bucle de histona. Andries et al., 2015 (J. Control. Release 217, 337-344) muestran que la presencia de 1-metilpseudourina hace que el ARN que codifica la luciferasa sea menos inmunogénico y aumenta su expresión in vivo.

En vista de la técnica anterior, todavía existe la necesidad de una terapia eficaz de enfermedades autoinmunes.

El objeto de la presente enseñanza era proporcionar agentes para una terapia de enfermedades autoinmunes. Este objeto se logra de acuerdo con la enseñanza de la materia de las reivindicaciones.

La presente enseñanza abarca composiciones, métodos y usos para inducir tolerancia a un autoantígeno. De acuerdo con la enseñanza, los autoantígenos contra los cuales una respuesta inmune es característica de enfermedades autoinmunes se administran en forma de ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende el autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento. El ARN que se va a administrar en una realización preferida se vuelve no inmunogénico incorporando en el ARN nucleótidos modificados que suprimen la activación mediada por ARN de los receptores inmunes innatos y eliminando el ARN bicatenario (ARNbc). Se demuestra de acuerdo con la enseñanza que la inmunización de ratones con ARN no inmunogénico bloqueó completamente cualquier signo de la enfermedad autoinmune. También se demuestra que puede ser suficiente la administración de un único epítopo que conduce a la enfermedad.

Un aspecto de la enseñanza se refiere a un método para tratar una enfermedad autoinmune en un sujeto, que comprende administrar al sujeto ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento.

En una realización, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune mediada por células T.

Un aspecto de la enseñanza se refiere a un método para inducir tolerancia a células T autorreactivas en un sujeto, que comprende administrar al sujeto ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento.

En una realización, el sujeto tiene una enfermedad autoinmune. En una realización, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune mediada por células T. En una realización, las células T son autorreactivas con el autoantígeno o las células que expresan y preferiblemente presentan el autoantígeno.

En una realización de los métodos de la enseñanza, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del SNC. En una realización de los métodos de la enseñanza, la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple.

En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico cuando se administra no da como resultado la activación de células dendríticas, activación de células T y/o secreción de IFN-alfa.

En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se vuelve no inmunogénico mediante la incorporación de nucleótidos modificados y la eliminación del ARNbc. En una realización, los nucleótidos modificados suprimen la activación mediada por ARN de los receptores inmunes innatos. En una realización, los nucleótidos modificados comprenden un reemplazo de una o más uridinas con un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En una realización, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada se selecciona del grupo que consiste en 3-metil-uridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tiopseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uridina (ho5U), 5-aminoalil-uridina, 5-halo-uridina (por ejemplo, 5-yodouridina o 5-bromo-uridina), ácido 5-oxiacético uridina (cmo5U), éster metílico del ácido 5-oxiacético uridina (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetil-uridina (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 1-etil-pseudouridina, 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propiniluridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tiouridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4Y), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3Y), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deazapseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tio-dihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 y ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tio-uridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metil-uridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetiluridina (m3Um), 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1 -tio-uridina, deoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil)uridina, y 5-[3-(1-E-propenilamino)uridina. En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada es pseudouridina (y ), Nl-metil-pseudouridina (m1^ ) o 5-metiluridina (m5U). En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada es 1-metil-pseudouridina.

En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico es ARNm. En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico es ARN transcrito in vitro.

En una realización de los métodos de la enseñanza, el autoantígeno está asociado con una enfermedad autoinmune. En una realización de los métodos de la enseñanza, el autoantígeno es un antígeno de célula T. En una realización de los métodos de la enseñanza, el autoantígeno es derivado del SNC. En una realización de los métodos de la enseñanza, el autoantígeno es un antígeno de mielina. En una realización de los métodos de la enseñanza, el autoantígeno es la glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG). En una realización de los métodos de la enseñanza, el péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento comprende los aminoácidos 35 a 55 de la glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG).

En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se expresa transitoriamente en células del sujeto.

En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se administra a células dendríticas. En una realización, las células dendríticas son células dendríticas inmaduras.

En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se formula en un vehículo de administración. En una realización, el vehículo de administración comprende partículas. En una realización, el vehículo de administración comprende un lípido. En una realización, el lípido comprende un lípido catiónico. En una realización, el lípido forma un complejo con y/o encapsula el ARN no inmunogénico. En una realización de los métodos de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se formula en liposomas.

Un aspecto de la enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento.

En una realización, el ARN no inmunogénico cuando se administra no da como resultado la activación de las células dendríticas, la activación de las células T y/o la secreción de IFN-alfa.

En una realización, el ARN no inmunogénico se vuelve no inmunogénico mediante la incorporación de nucleótidos modificados y la eliminación del ARNbc. En una realización, los nucleótidos modificados suprimen la activación mediada por ARN de los receptores inmunes innatos. En una realización, los nucleótidos modificados comprenden un reemplazo de una o más uridinas con un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En una realización, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada se selecciona del grupo que consiste en 3-metil-uridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uridina (ho5U), 5-aminoalil-uridina, 5-halo-uridina (por ejemplo, 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), ácido 5-oxiacético uridina (cmo5U), éster metílico del ácido 5-oxiacético uridina (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetil-uridina (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetil-uridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 1-etil-pseudouridina, 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1-propinilpseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridina, 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^), 4-tio-1 -metilpseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3Y), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-1-deaza-pseudouridina, 2-tio-1 -metil-1- deaza-pseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tiodihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2- tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 y ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tiouridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1 -tio-uridina, deoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil)uridina, y 5-[3-(1-E-propenilamino)uridina. En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada es pseudouridina (y ), Nl-metil-pseudouridina (m1Y) o 5-metil-uridina (m5U). En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada es 1-metil-pseudouridina.

En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el ARN no inmunogénico es ARNm. En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el ARN no inmunogénico es ARN transcrito in vitro.

En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el autoantígeno está asociado con una enfermedad autoinmune. En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el autoantígeno es un antígeno de células T. En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el autoantígeno es derivado del SNC. En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el autoantígeno es un antígeno de mielina. En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el autoantígeno es la glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG). En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento comprende los aminoácidos 35 a 55 de la glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG).

En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se expresa transitoriamente en células de un sujeto al que se administra la composición farmacéutica.

En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se administra a las células dendríticas de un sujeto al que se administra la composición farmacéutica. En una realización, las células dendríticas son células dendríticas inmaduras.

En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se formula en un vehículo de administración. En una realización, el vehículo de administración comprende partículas. En una realización, el vehículo de administración comprende un lípido. En una realización, el lípido comprende un lípido catiónico. En una realización, el lípido forma un complejo con y/o encapsula el ARN no inmunogénico. En una realización de la composición farmacéutica de la enseñanza, el ARN no inmunogénico se formula en liposomas.

Un aspecto de la enseñanza se refiere a la composición farmacéutica de la enseñanza para su uso en los métodos de la enseñanza.

Otras características y ventajas de la presente enseñanza resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.

Descripción detallada

La presente invención está dirigida al objeto expuesto en las reivindicaciones adjuntas.

Aunque la presente enseñanza se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta enseñanza no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en este documento, ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende limitar el alcance de la presente enseñanza, que estará limitada únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.

A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con realizaciones específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier manera y en cualquier número para crear realizaciones adicionales. Los ejemplos descritos de forma diversa y las realizaciones preferidas no deben interpretarse como que limitan la presente enseñanza a solo las realizaciones descritas explícitamente. Debe entenderse que esta descripción apoya y engloba realizaciones que combinan las realizaciones descritas explícitamente con cualquier número de los elementos descritos y/o preferidos. Además, cualquier permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deben considerarse divulgadas por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferiblemente, los términos usados en este documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente enseñanza empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura en el campo (véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende" y variaciones tales como "que comprende" implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de ningún otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas aunque en algunas realizaciones dicho otro elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas puede ser excluido, es decir, el objeto consiste en la inclusión de un elemento, número entero o etapa o grupo de elementos, números enteros o etapas indicados. Los términos "un" y "uno, una" y "el, la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la enseñanza (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o sea claramente contradicho por el contexto. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento.

Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o bien que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o ejemplo de expresión (por ejemplo, "tal como"), proporcionado en el presente documento está destinado simplemente a ilustrar mejor la enseñanza y no supone una limitación en el alcance de la enseñanza reivindicada de otro modo. Ninguna expresión en la memoria descriptiva debe interpretarse como que indica algún elemento no reivindicado esencial para la práctica de la enseñanza.

Se citan varios documentos a lo largo del texto de esta memoria descriptiva. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la enseñanza no tiene derecho a ser anterior a dicha divulgación en virtud de la enseñanza anterior.

La presente enseñanza prevé el tratamiento o la prevención de enfermedades autoinmunes induciendo la tolerancia del sistema inmunológico a un autoantígeno asociado con la enfermedad autoinmunitaria. La tolerancia al autoantígeno se induce mediante la administración de ARN no inmunogénico. El ARN no inmunogénico comprende secuencias que codifican un péptido o polipéptido que comprende el autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento que suprime una respuesta inmune a dicho autoantígeno cuando se administra a un sujeto.

En varias realizaciones, el ARN no inmunogénico descrito en este documento tiene una longitud de entre 200 a 20000 nucleótidos, 500 a 5000 nucleótidos, 500 a 2500 nucleótidos, en particular 600 a 2500 nucleótidos u 800 a 2000 nucleótidos.

De acuerdo con la enseñanza, se prefiere administrar el ARN no inmunogénico descrito en el presente documento formulado en portadores o vehículos de administración tales como en una formulación en nanopartículas, en particular una formulación lipoplejo. Por consiguiente, las moléculas de ARN no inmunogénicas descritas en el presente documento pueden estar presentes formuladas en portadores o vehículos de administración tales como nanopartículas o una formulación en nanopartículas, en particular una formulación lipoplejo, como se describe en el presente documento.

En una realización, se pueden usar vehículos de administración que liberan las moléculas de ARN no inmunogénicas a células presentadoras de antígenos tales como células dendríticas (DC) en el bazo después de la administración sistémica. Por ejemplo, formulaciones de ARN en nanopartículas con un tamaño de partícula definido en las que la carga neta de las partículas es cercana a cero o negativa, tal como lipoplejos eléctricamente neutros o cargados negativamente de ARN y liposomas, por ejemplo los lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE o DOTMA y colesterol, conducen a un suministro sustancial de ARN a las DC del bazo después de la administración sistémica. Particularmente preferida de acuerdo con la enseñanza es una formulación de ARN en nanopartículas en la que la relación de carga de cargas positivas a cargas negativas en las nanopartículas es 1,4:1 o menos y/o el potencial zeta de las nanopartículas es 0 o menos. En una realización, la relación de carga de cargas positivas a cargas negativas en las nanopartículas está entre 1,4:1 y 1: 8, preferiblemente entre 1,2:1 y 1: 4, por ejemplo entre 1:1 y 1:3 tal como entre 1:1.2 y 1:2, 1:1.2 y 1:1.8, 1:1.3 y 1:1.7, en particular entre 1:1.4 y 1:1.6, tal como aproximadamente 1:1,5. En una realización, el potencial zeta de las nanopartículas es -5 o menos, -10 o menos, -15 o menos, -20 o menos o -25 o menos. En varias realizaciones, el potencial zeta de las nanopartículas es -35 o mayor, -30 o mayor o -25 o mayor. En una realización, las nanopartículas tienen un potencial zeta de 0 mV a -50 mV, preferiblemente de 0 mV a -40 mV o de -10 mV a -30 mV. En una realización, las cargas positivas son aportadas por al menos un lípido catiónico presente en las nanopartículas y las cargas negativas son aportadas por el ARN. En una realización, las nanopartículas comprenden al menos un lípido auxiliar. El lípido auxiliar puede ser un lípido neutro o aniónico.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de 10:0 a 1:9, preferiblemente de 8:2 a 3:7, y más preferiblemente de 7:3 a 5:5 y en la que la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es 1.8:2 a 0.8:2, más preferiblemente 1.6:2 a 1:2, incluso más preferiblemente 1.4:2 a 1.1:2 e incluso más preferiblemente alrededor de 1.2:2.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y colesterol en una proporción molar de 10:0 a 1:9, preferiblemente de 8:2 a 3:7, y más preferiblemente de 7:3 a 5:5 y en la que la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es 1.8:2 a 0.8:2, más preferiblemente 1.6:2 a 1:2, incluso más preferiblemente 1.4:2 a 1.1:2 e incluso más preferiblemente alrededor de 1.2:2.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTAP y DOPE en una relación molar de 10:0 a 1:9, preferiblemente de 8:2 a 3:7, y más preferiblemente de 7:3 a 5:5 y en la que la relación de carga de cargas positivas en DOTMA a cargas negativas en el ARN es 1.8:2 a 0.8:2, más preferiblemente 1.6:2 a 1:2, incluso más preferiblemente 1.4:2 a 1.1:2 e incluso más preferiblemente alrededor de 1.2:2.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y DOPE en una relación molar de 2:1 a 1:2, preferiblemente de 2:1 a 1:1, y en la que la relación de carga de las cargas positivas en DOTMA a las cargas negativas en el ARN es 1,4:1 o menos.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTMA y colesterol en una relación molar de 2:1 a 12, preferiblemente 2:1 a 1:1, y en la que la relación de carga de las cargas positivas en DOTMA a las cargas negativas en el ARN es 1,4:1 o menos.

En una realización, las nanopartículas son lipoplejos que comprenden DOTAP y DOPE en una relación molar de 2:1 a 1:2, preferiblemente 2:1 a 1:1, y en la que la relación de carga de las cargas positivas en DOTAP a las cargas negativas en el ARN es 1,4:1 o menos.

En una realización, el ARN no inmunogénico de acuerdo con la enseñanza se formula en liposomas F12 o F5, preferiblemente liposomas F12.

De acuerdo con las enseñanzas, el término "F12" designa liposomas que comprenden DOTMA y DOPE en una proporción molar de 2:1 y lipoplejos con ARN que se forman usando tales liposomas.

De acuerdo con las enseñanzas, el término "F5" designa liposomas que comprenden DOTMA y colesterol en una relación molar de 1:1 y lipoplejos con ARN que se forman usando tales liposomas.

Como se usa en este documento, el término "nanopartícula" se refiere a cualquier partícula que tiene un diámetro que hace que la partícula sea adecuada para la administración sistémica, en particular parenteral, en particular de ácidos nucleicos, típicamente un diámetro de menos de 1000 nanómetros (nm ). En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 600 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro de menos de 400 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro promedio en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 1000 nm, preferiblemente de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 400 nm, preferiblemente de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, tal como de aproximadamente 150 nm a aproximadamente 200 nm. En algunas realizaciones, una nanopartícula tiene un diámetro en el intervalo de aproximadamente 200 a aproximadamente 700 nm, de aproximadamente 200 a aproximadamente 600 nm, preferiblemente de aproximadamente 250 a aproximadamente 550 nm, en particular de aproximadamente 300 a aproximadamente 500 nm o de aproximadamente 200 a aproximadamente 400 nm.

Como se usa en este documento, el término "formulación en nanopartículas" o términos similares se refieren a cualquier sustancia que contenga al menos una nanopartícula. En algunas realizaciones, una formulación de nanopartículas es una colección uniforme de nanopartículas. En algunas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas son dispersiones o emulsiones. En general, se forma una dispersión o emulsión cuando se combinan al menos dos materiales inmiscibles.

El término "lipoplejo" o "lipoplejo de ácido nucleico", en particular "lipoplejo de ARN", se refiere a un complejo de lípidos y ácidos nucleicos, en particular ARN. Los lipoplejos se forman espontáneamente cuando los liposomas catiónicos, que a menudo también incluyen un lípido "auxiliar" neutro, se mezclan con ácidos nucleicos.

51 la presente enseñanza se refiere a una carga tal como una carga positiva, una carga negativa o una carga neutra o un compuesto catiónico, un compuesto negativo o un compuesto neutro, esto generalmente significa que la carga mencionada está presente a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Por ejemplo, el término "lípido catiónico" significa un lípido que tiene una carga neta positiva a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. El término "lípido neutro" significa un lípido que no tiene carga neta positiva o negativa y puede estar presente en forma de ión anfótero neutro o sin carga a un pH seleccionado, tal como un pH fisiológico. Por "pH fisiológico" en el presente documento se entiende un pH de aproximadamente 7,5.

Los vehículos en nanopartículas tales como los vehículos lipídicos contemplados para su uso en la presente enseñanza incluyen cualquier sustancia o vehículo con el que se pueda asociar un ácido nucleico como el ARN, por ejemplo formando complejos con el ácido nucleico o formando vesículas en las que el ácido nucleico está encerrado o encapsulado. Esto puede resultar en una mayor estabilidad del ácido nucleico en comparación con el ácido nucleico desnudo. En particular, se puede incrementar la estabilidad del ácido nucleico en sangre.

Los lípidos catiónicos, los polímeros catiónicos y otras sustancias con cargas positivas pueden formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente. Estas moléculas catiónicas se pueden usar para complejar ácidos nucleicos, formando de ese modo por ejemplo los denominados lipoplejos o poliplejos, respectivamente, y se ha demostrado que estos complejos suministran ácidos nucleicos a las células.

Las preparaciones de ácidos nucleicos en nanopartículas para su uso en la presente enseñanza pueden obtenerse mediante varios protocolos y a partir de diversos compuestos complejantes de ácidos nucleicos. Los lípidos, polímeros, oligómeros o anfífilos son agentes complejantes típicos. En una realización, el compuesto complejante comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en protamina, polietilenimina, una poli-L-lisina, una poli-L-arginina o una histona.

De acuerdo con las enseñanzas, la protamina es útil como agente portador catiónico. El término "protamina" se refiere a cualquiera de varias proteínas fuertemente básicas de peso molecular relativamente bajo que son ricas en arginina y se encuentran asociadas especialmente con ADN en lugar de histonas somáticas en los espermatozoides de varios animales (como peces). En particular, el término "protamina" se refiere a proteínas que se encuentran en el esperma de pescado que son fuertemente básicas, son solubles en agua, no se coagulan por el calor y producen principalmente arginina tras la hidrólisis. En forma purificada, se utilizan en una formulación de insulina de acción prolongada y para neutralizar los efectos anticoagulantes de la heparina. De acuerdo con las enseñanzas, el término "protamina" como se usa en este documento pretende comprender cualquier secuencia de aminoácidos de protamina obtenida o derivada de fuentes nativas o biológicas incluyendo fragmentos de la misma y formas multiméricas de dicha secuencia de aminoácidos o fragmento de la misma. Además, el término abarca polipéptidos (sintetizados) que son artificiales y están diseñados específicamente para propósitos específicos y no pueden aislarse de fuentes nativas o biológicas. La protamina usada de acuerdo con la presente enseñanza puede ser protamina sulfatada o clorhidrato de protamina. En una realización preferida, la fuente de protamina usada para la producción de las nanopartículas descritas en este documento es protamina 5000 que contiene protamina a más de 10 mg/ml (5000 unidades neutralizadoras de heparina por ml) en una solución salina isotónica.

Los liposomas son vesículas lipídicas microscópicas que a menudo tienen una o más bicapas de un lípido formador de vesículas, tal como un fosfolípido, y son capaces de encapsular un fármaco. Pueden emplearse diferentes tipos de liposomas en el contexto de la presente enseñanza, que incluyen, sin limitarse a ellos, vesículas multilaminares (MLV), vesículas unilaminares pequeñas (SUV), vesículas unilaminares grandes (LUV), liposomas estabilizados estéricamente (SSL), vesículas multivesiculares (MV) y vesículas multivesiculares grandes (LMV) así como otras formas bicapa conocidas en la técnica. El tamaño y la lamelaridad del liposoma dependerán de la forma de preparación y la selección del tipo de vesículas a utilizar dependerá del modo de administración preferido. Existen varias otras formas de organización supramolecular en las que los lípidos pueden estar presentes en un medio acuoso, que comprenden fases lamelares, fases hexagonales y hexagonales inversas, fases cúbicas, micelas, micelas inversas compuestas de monocapas. Estas fases también pueden obtenerse en combinación con ADN o ARN, y la interacción con ARN y ADN puede afectar sustancialmente al estado de la fase. Las fases descritas pueden estar presentes en las formulaciones de ácidos nucleicos en nanopartículas de la presente enseñanza.

Para la formación de lipoplejos de ácido nucleico a partir de ácido nucleico y liposomas, puede usarse cualquier método adecuado para formar liposomas siempre que proporcione los lipoplejos de ácido nucleico previstos. Los liposomas se pueden formar usando métodos estándar tales como el método de evaporación inversa (REv ), el método de inyección de etanol, el método de deshidratación-rehidratación (DRV), sonicación u otros métodos adecuados.

Después de la formación de los liposomas, los liposomas se pueden dimensionar para obtener una población de liposomas que tienen un intervalo de tamaño sustancialmente homogéneo.

Los lípidos que forman bicapas tienen típicamente dos cadenas de hidrocarburos, particularmente cadenas de acilo, y un grupo de cabeza, polar o apolar. Los lípidos formadores de bicapas están compuestos de lípidos naturales o de origen sintético, incluidos los fosfolípidos, como fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, ácido fosfátido, fosfatidilinositol y esfingomielina, en los que las dos cadenas de hidrocarburos están típicamente entre aproximadamente 14-22 átomos de carbono de longitud y tienen diversos grados de insaturación. Otros lípidos adecuados para usar en la composición de la presente enseñanza incluyen glicolípidos y esteroles tales como colesterol y sus diversos análogos que también pueden usarse en los liposomas.

Los lípidos catiónicos tienen típicamente una fracción lipófila, tal como un esterol, una cadena de acilo o diacilo, y tienen una carga neta positiva global. El grupo de cabeza del lípido normalmente porta la carga positiva. El lípido catiónico tiene preferiblemente una carga positiva de 1 a 10 valencias, más preferiblemente una carga positiva de 1 a 3 valencias y más preferiblemente una carga positiva de 1 valencia. Los ejemplos de lípidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, propano de 1,2-di-O-octadecenil-3-trimetilamonio (DOTMA); dimetildioctadecilamonio (DDAB); propano de 1,2-dioleoil-3-trimetilamonio (DOTAP); propano de 1,2-dioleoil-3-dimetilamonio (DODAP); propanos de 1,2-diaciloxi-3-dimetilamonio; propanos de 1,2-dialquiloxi-3-dimetilamonio; cloruro de dioctadecildimetilamonio (DODAC), 1,2-dimiristoiloxipropil-1,3-dimetilhidroxietil-amonio (DMRIE) y trifluoroacetato de 2,3-dioleoiloxi-N-[2(espermina carboxamida)etil]-N,N-dimetil-1-propanamonio (d Os PA). Se prefieren DOTMA, DOTAP, DODAC y DOSPA. El más preferido es DOTMA.

Además, las nanopartículas descritas en el presente documento preferiblemente incluyen además un lípido neutro en vista de la estabilidad estructural y similares. El lípido neutro puede seleccionarse apropiadamente en vista de la eficacia de suministro del complejo de ácido nucleico-lípido. Los ejemplos de lípidos neutros incluyen, entre otros, 1,2-di-(9Z-octadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), diacilfosfatidilcolina, diacilfosfatidil etanol amina, ceramida, esfingoemielina, cefalina, esterol y cerebrósido. Se prefiere DOPE y/o DOPC. El más preferido es DOPE. En el caso de que un liposoma catiónico incluya tanto un lípido catiónico como un lípido neutro, la relación molar del lípido catiónico al lípido neutro se puede determinar de forma apropiada en vista de la estabilidad del liposoma y similares.

De acuerdo con una realización, las nanopartículas descritas en el presente documento pueden comprender fosfolípidos. Los fosfolípidos pueden ser un glicerofosfolípido. Los ejemplos de glicerofosfolípidos incluyen, sin limitarse a ellos, tres tipos de lípidos: (i) fosfolípidos zwiteriónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina (PC), fosfatidilcolina de yema de huevo, PC derivada de soja en forma natural, parcialmente hidrogenada o totalmente hidrogenada, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), esfingomielina (SM); (ii) fosfolípidos cargados negativamente: que incluyen, por ejemplo, fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilglicerol (PG), dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); derivados sintéticos en los que el conjugado produce un fosfolípido bipolar cargado negativamente, tal es el caso de metoxi-polietileno, glicol-diestearoil fosfatidiletanolamina (mPEG-DSPE); y (iii) fosfolípidos catiónicos, que incluyen, por ejemplo, fosfatidilcolina o esfingomielina, de los cuales el fosfomonoéster era O-metilado para formar los lípidos catiónicos.

La asociación de ácido nucleico al portador lipídico puede ocurrir, por ejemplo, por el ácido nucleico que llena los espacios intersticiales del portador, de modo que el portador atrapa físicamente al ácido nucleico, o por enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, o por mediante adsorción por enlaces inespecíficos.

El término "respuesta inmune" se refiere a una reacción del sistema inmune, preferiblemente a un antígeno, y preferiblemente se refiere a una respuesta inmune celular, una respuesta inmune humoral o ambas. De acuerdo con la enseñanza, el término "respuesta inmune a" o "respuesta inmune contra" con respecto a una diana, tal como un antígeno, célula o tejido, se refiere a una respuesta inmune dirigida contra la diana.

El sistema inmunológico se divide en dos partes, los sistemas innato y adaptativo. La respuesta inmune adaptativa depende de los linfocitos B y T que son específicos para antígenos particulares. El sistema inmunológico innato responde a estructuras comunes compartidas por una gran mayoría de amenazas. Estas estructuras comunes se denominan patrones moleculares asociados a patógenos, o PAMp , y son reconocidas por los receptores tipo toll o TLR. Además de los TLR celulares, una parte importante del sistema inmunológico innato es el sistema del complemento humoral que opsoniza y mata a los patógenos a través del mecanismo de reconocimiento de PAMP. Estas proteínas solubles y unidas a la membrana altamente conservadas se denominan colectivamente receptores de reconocimiento de patrones (PRR), y es la interacción PAMP/PRR la que desencadena el sistema inmunológico innato.

Los TLR son proteínas transmembrana expresadas por células del sistema inmunológico innato, que reconocen microbios invasores y activan vías de señalización que lanzan respuestas inmunes e inflamatorias para destruir a los invasores. Los diferentes TLR sirven como receptores para diversos ligandos, incluidos los componentes de la pared celular bacteriana, el ARN bicatenario viral y los compuestos inmunomoduladores o antivirales de molécula pequeña. En los seres humanos, los TLR3, 7, 8 y 9 responden principalmente a los PAMP basados en ácidos nucleicos de virus y bacterias.

Los términos "respuesta inmune celular", "respuesta celular", "inmunidad mediada por células" o términos similares pretenden incluir una respuesta celular dirigida a células caracterizadas por la expresión de un antígeno y/o presentación de un antígeno con MHC de clase I o de clase II. La respuesta celular se relaciona con las células llamadas células T o linfocitos T que actúan como "colaboradores" o "asesinos". Las células T colaboradoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central regulando la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) matan células tales como como células enfermas.

El término "respuesta inmune humoral" se refiere a un proceso en organismos vivos en el que se producen anticuerpos en respuesta a agentes y organismos, que finalmente neutralizan y/o eliminan. La especificidad de la respuesta de anticuerpos está mediada por células T y/o B a través de receptores asociados a la membrana que se unen al antígeno de una sola especificidad. Después de la unión de un antígeno apropiado y la recepción de varias otras señales de activación, los linfocitos B se dividen, lo que produce células B de memoria, así como clones de células plasmáticas que secretan anticuerpos, cada uno de los cuales produce anticuerpos que reconocen el epítopo antigénico idéntico al reconocido por su receptor de antígeno. Los linfocitos B de memoria permanecen inactivos hasta que posteriormente son activados por su antígeno específico. Estos linfocitos proporcionan la base celular de la memoria y la escalada resultante en la respuesta de anticuerpos cuando se vuelven a exponer a un antígeno específico.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de inmunoglobulina, que es capaz de unirse específicamente a un epítopo de un antígeno. En particular, el término "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y combinaciones de cualquiera de los anteriores. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). Las regiones variables y las regiones constantes también se denominan aquí dominios variables y dominios constantes, respectivamente. Las regiones VH y VL pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, ordenados desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los CDR de un VH se denominan HCDR1, HCDR2 y HCDR3, las CDR de una VL se denominan LCDR1, LCDR2 y LCDR3. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de un anticuerpo comprenden la región constante de la cadena pesada (CH) y la región constante de la cadena ligera (CL), en la que CH puede subdividirse en el dominio constante CH1, una región bisagra y los dominios constantes CH2 y CH3 (dispuestos a partir del terminal amino al terminal carboxilo en el siguiente orden: CH1, CH2, CH3). Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluidas diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas intactas derivadas de fuentes naturales o de fuentes recombinantes y pueden ser porciones inmunoactivas de inmunoglobulinas intactas. Los anticuerpos son típicamente tetrámeros de moléculas de inmunoglobulina. Los anticuerpos pueden existir en una variedad de formas que incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, Fv, Fab y F(ab)2, así como anticuerpos monocatenarios y anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos IgA tales como IgA1 o IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM e IgD. En varias realizaciones, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1, más particularmente un IgG1, kappa o IgG1, isotipo lambda (es decir, IgG1, k, A), un anticuerpo IgG2a (por ejemplo, IgG2a, k, A), un anticuerpo IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, A), un anticuerpo IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, a) o un anticuerpo IgG4 (por ejemplo, IgG4, k, A)

El término "inmunoglobulina" se refiere a proteínas de la superfamilia de inmunoglobulinas, preferiblemente a receptores de antígenos tales como anticuerpos o el receptor de células B (BCR). Las inmunoglobulinas se caracterizan por un dominio estructural, es decir, el dominio de inmunoglobulina, que tiene un pliegue de inmunoglobulina (Ig) característico. El término abarca inmunoglobulinas unidas a membrana así como inmunoglobulinas solubles. Las inmunoglobulinas unidas a membrana también se denominan inmunoglobulinas de superficie o inmunoglobulinas de membrana, que generalmente forman parte de la BCR. Las inmunoglobulinas solubles se denominan generalmente anticuerpos. Las inmunoglobulinas generalmente comprenden varias cadenas, típicamente dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas mediante enlaces disulfuro. Estas cadenas se componen principalmente de dominios de inmunoglobulina, tales como el dominio Vl (cadena ligera variable), el dominio Cl (cadena ligera constante), el dominio Vh (cadena pesada variable) y los dominios Ch (cadena pesada constante) Ch1, Ch2, Ch3 y Ch4. Hay cinco tipos de cadenas pesadas de inmunoglobulinas de mamíferos, es decir, a, 8, £, y y H que explican las diferentes clases de anticuerpos, es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A diferencia de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas solubles, las cadenas pesadas de inmunoglobulinas de membrana o de superficie comprenden un dominio transmembrana y un dominio citoplásmico corto en su extremo terminal carboxilo. En los mamíferos hay dos tipos de cadenas ligeras, es decir, lambda y kappa. Las cadenas de inmunoglobulinas comprenden una región variable y una región constante. La región constante se conserva esencialmente dentro de los diferentes isotipos de las inmunoglobulinas, en la que la parte variable es muy diversa y explica el reconocimiento de antígenos.

De acuerdo con la enseñanza, el término "antígeno" o "inmunógeno" cubre cualquier sustancia, preferiblemente un péptido o proteína, que sea un objetivo de una respuesta inmune y/o que provoque una respuesta inmune. En particular, un "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que reacciona específicamente con anticuerpos o linfocitos T (células T). De acuerdo con la presente enseñanza, el término "antígeno" comprende cualquier molécula que comprenda al menos un epítopo tal como un epítopo de célula B o célula T. Preferiblemente, un antígeno en el contexto de la presente enseñanza es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmune, que preferiblemente es específica para el antígeno o las células que expresan el antígeno. Los antígenos pueden incluir o pueden derivarse de alérgenos, virus, bacterias, hongos, parásitos y otros agentes infecciosos y patógenos o un antígeno también puede ser un antígeno tumoral.

Un "antígeno propio" o "autoantígeno" es un antígeno derivado de un organismo que en circunstancias normales no es reconocido por el sistema inmunológico de ese organismo, pero que puede convertirse en un objetivo de un ataque inmunológico, dando como resultado una enfermedad autoinmune.

En una realización preferida, un autoantígeno está asociado con una enfermedad autoinmune. El término "autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune" se refiere a un autoantígeno que tiene importancia patológica para una enfermedad autoinmune. En una realización, un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune es una molécula que contiene al menos un epítopo contra el cual se dirige una reacción inmune en un paciente que tiene una enfermedad autoinmune.

Un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento que se proporciona de acuerdo con las enseñanzas a un sujeto mediante la administración de ARN no inmunogénico que codifica el péptido o polipéptido debe dar como resultado una respuesta inmune reducida al autoantígeno. Por tanto, un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento proporcionado de acuerdo con las enseñanzas, puede corresponder o comprender un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune, o una variante de la misma (incluidos fragmentos del autoantígeno y variantes de los mismos). En una realización, tales fragmentos o variantes son inmunológicamente equivalentes a un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune en que, similar al autoantígeno, su provisión da como resultado tolerancia a las células T autorreactivas que se dirigen al autoantígeno o células que expresan el autoantígeno y que opcionalmente presentan el autoantígeno en el contexto de las moléculas del MHC. Por tanto, un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento proporcionado de acuerdo con las enseñanzas puede ser idéntico a un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune, puede comprender un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune o un porción o fragmento del mismo o puede comprender un antígeno que sea homólogo a un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune o una porción o fragmento del mismo. Si un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento proporcionado de acuerdo con la enseñanza comprende una porción o fragmento del autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune o una porción o fragmento de un antígeno que es homólogo a un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune, dicha porción o fragmento puede comprender un epítopo del autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune, en particular un epítopo del autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune a la que se dirigen las células T autorreactivas. Por tanto, de acuerdo con la enseñanza, un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento puede comprender un fragmento inmunogénico de un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune tal como un fragmento peptídico de un autoantígeno asociado con una enfermedad autoinmune. Un "fragmento inmunogénico de un autoantígeno" de acuerdo con las enseñanzas se refiere preferiblemente a una porción o fragmento de un autoantígeno que es capaz de estimular una respuesta de células T. Dicha porción o fragmento, cuando se proporciona de acuerdo con las enseñanzas, también puede ser capaz de inducir tolerancia a las células T autorreactivas. Un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento proporcionado de acuerdo con las enseñanzas puede ser un péptido o polipéptido recombinante y/o ARN no inmunogénico que lo codifica de acuerdo con las enseñanzas puede ser ARN recombinante.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico. En el contexto de la presente enseñanza, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferiblemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicos de los antígenos o variantes de antígenos.

En una realización de la enseñanza, un péptido o polipéptido proporcionado de acuerdo con la enseñanza mediante la administración de ARN no inmunogénico comprende al menos un epítopo de un autoantígeno, que preferiblemente es un autoantígeno reconocido en una condición de enfermedad autoinmune, tal como una condición de enfermedad autoinmune descrita en este documento. En una realización, un péptido o polipéptido proporcionado de acuerdo con las enseñanzas comprende un epítopo al que un sujeto es autorreactivo.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que es reconocida, es decir, unida, por el sistema inmunológico, por ejemplo, que es reconocida por un anticuerpo o receptor de células T. Por ejemplo, los epítopos son los sitios tridimensionales discretos en un antígeno, que son reconocidos por el sistema inmunológico. Los epítopos normalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. Preferiblemente, el término se refiere a una porción inmunogénica de un antígeno que comprende el epítopo. Un epítopo de una proteína comprende preferiblemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y tiene preferiblemente entre 5 y 100, preferiblemente entre 5 y 50, más preferiblemente entre 8 y 30, lo más preferiblemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferiblemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. Se prefiere que el epítopo en el contexto de la presente enseñanza sea un epítopo de células T.

Como se usa en este documento, el término "epítopo de células T" se refiere a un péptido que se une a una molécula del MHC en una configuración reconocida por un receptor de células T. Normalmente, los epítopos de células T se presentan en la superficie de una célula presentadora de antígeno. Preferiblemente, los epítopos de células T son péptidos presentados por el MHC de clase I y/o clase II. Preferiblemente, los epítopos de células T comprenden una secuencia de aminoácidos que se corresponde sustancialmente con la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferiblemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por el MHC de clase I y/o clase II. Un péptido que es adecuado para unirse a una molécula del m Hc , en particular una molécula del MHC de clase I, preferiblemente tiene una longitud de 7-20 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 7-12 aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 8-11 aminoácidos, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud. En una realización, un epítopo de células T cuando se presenta en el contexto del MHC, tal como el MHC de células presentadoras de antígenos, es reconocido por un receptor de células T. El epítopo de la célula T, si es reconocido por un receptor de la célula T, puede ser capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, la expansión clonal de la célula T que porta el receptor de la célula T reconociendo específicamente el epítopo de la célula T.

De acuerdo con la enseñanza, un epítopo tal como un epítopo de células T de un autoantígeno puede estar presente en un péptido o polipéptido proporcionado de acuerdo con la enseñanza mediante la administración de ARN no inmunogénico como parte de una entidad más grande, como una secuencia que comprende más de un autoantígeno que solo el epítopo y/o un polipéptido que comprende más de un epítopo de uno o más de un autoantígenos. El péptido o epítopo de células T presentado se produce siguiendo un procesamiento adecuado. Además, los epítopos de células T pueden modificarse en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de TCR o para la unión al MHC. Dichos epítopos de células T modificados pueden considerarse inmunológicamente equivalentes.

El ARN no inmunogénico descrito en el presente documento se puede personalizar para diversas enfermedades que requieren tolerancia inmunitaria tales como enfermedades autoinmunes y también se puede personalizar para pacientes individuales. Existen varios inmunoensayos para determinar si las células inmunes que circulan en la sangre en un paciente determinado desarrollan una respuesta inmunitaria a los péptidos particulares analizados. Alternativamente, los antígenos o epítopos seleccionados pueden basarse en la reactividad más común observada en una clase de pacientes.

La "superficie celular" se usa de acuerdo con su significado normal en la técnica y, por lo tanto, incluye el exterior de la célula que es accesible para la unión de proteínas y otras moléculas. Un antígeno se expresa en la superficie de las células si está ubicado en la superficie de dichas células y es accesible para unirse por ejemplo a anticuerpos específicos de antígeno añadidos a las células. En una realización, un antígeno expresado en la superficie de las células es una proteína de membrana integral que tiene una porción extracelular.

El término "porción extracelular" o "exodominio" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una parte de una molécula tal como una proteína que se enfrenta al espacio extracelular de una célula y preferiblemente es accesible desde el exterior de dicha célula, por ejemplo, uniendo moléculas tales como anticuerpos localizados fuera de la célula. Preferiblemente, el término se refiere a uno o más bucles o dominios extracelulares o un fragmento de los mismos.

Los términos "porción" o "parte" se usan indistintamente en este documento y se refieren a un elemento continuo o discontinuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. El término "fragmento" se refiere a un elemento continuo de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos. Una porción, parte o fragmento de una estructura comprende preferiblemente una o más propiedades funcionales, por ejemplo propiedades antigénicas, inmunológicas y/o de unión de dicha estructura. Una porción o parte de una secuencia de proteína comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50, o al menos 100 aminoácidos consecutivos y/o no consecutivos de la secuencia de proteínas. Un fragmento de una secuencia proteica comprende preferiblemente al menos 6, en particular al menos 8, al menos 12, al menos 15, al menos 20, al menos 30, al menos 50 o al menos 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia proteica.

El término "inmunogenicidad" se refiere a la efectividad relativa de un antígeno para inducir una reacción inmunitaria.

El término "inmunoestimulador" se usa en este documento para referirse al aumento de la respuesta inmune general.

La "tolerancia inmune", "tolerancia inmunológica" o simplemente la "tolerancia" describen un estado de falta de respuesta del sistema inmunológico a sustancias o tejidos que tienen la capacidad de provocar una respuesta inmunitaria. La tolerancia inmunológica, que evita que se desarrolle una respuesta inmunogénica tras el autorreconocimiento, está mediada por varios mecanismos, que involucran principalmente la presentación de péptidos "propios" a las células T CD4+ o c D8+ de una manera que da como resultado la eliminación, inhibición o conversión de las células T autorreactivas que de otro modo atacarían potencialmente a las células y tejidos que son la fuente de autoantígenos y/o apoyan la producción por las células B de anticuerpos que reaccionan contra estos autoantígenos. Los mecanismos mediante los cuales se establece la tolerancia son distintos, pero el efecto resultante es similar. La inducción insuficiente de tolerancia a autoantígenos de tejidos particulares es la principal causa de enfermedades autoinmunes específicas de tejidos. En condiciones normales, los autoantígenos específicos de tejido son presentados por células inductoras de tolerancia (tolerogénicas), que programan cualquier célula T reactiva para que sufra muerte celular, falta de respuesta o conversión a un tipo de Treg. En las enfermedades autoinmunes, estos mismos autoantígenos no se presentan lo suficiente, lo que limita la participación de las células T autorreactivas para la instrucción, o se presentan incorrectamente, indicando a las células T específicas que monten una respuesta inmune en lugar de tolerar el antígeno como si fueran propias. Las terapias específicas de antígeno que administran estos autoantígenos a células tolerogénicas potentes, de forma sistemática o mediante la mucosa, son parcialmente capaces de restablecer la tolerancia en parte mediante la generación de células T supresoras capaces de contrarrestar las células T patógenas activadas incorrectamente.

El término "diana" significa un agente tal como una célula, que es una diana para una respuesta inmune. Los objetivos incluyen células que presentan un antígeno o un epítopo de antígeno, es decir, un fragmento de péptido derivado de un antígeno a través del procesamiento de antígeno.

El "procesamiento de antígenos" se refiere a la degradación de un antígeno en productos de procesión, que son fragmentos de dicho antígeno (por ejemplo, la degradación de una proteína en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas del MHC para su presentación por células, preferiblemente células presentadoras de antígeno a células T específicas.

Una célula presentadora de antígeno (APC) es una célula que presenta antígeno en el contexto del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en su superficie. Las células T pueden reconocer este complejo utilizando su receptor de células T (TCR). Las células presentadoras de antígenos procesan los antígenos y los presentan a las células T. Una célula presentadora de antígenos incluye, pero no se limita a, monocitos/macrófagos, células B y células dendríticas (DC). De acuerdo con la enseñanza, el término "célula presentadora de antígeno" incluye células presentadoras de antígeno profesionales y células presentadoras de antígeno no profesionales.

Las células presentadoras de antígeno profesionales son muy eficaces para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula del MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas del MHC de clase II de antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, que conduce a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales.

Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen el intervalo más amplio de presentación de antígenos, y son probablemente las células presentadoras de antígenos, macrófagos, células B y ciertas células epiteliales activadas más importantes.

Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II necesarias para la interacción con células T no modificadas; estas se expresan solo tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citocinas tales como IFNy.

Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a células T a través de vías de presentación de antígenos del MHC de clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunes y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad.

Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que pueden usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación.

Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor de Fcy y del receptor de manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una menor expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de las moléculas de la superficie celular responsables de la activación de las células T, tal como el MHC de clase I y clase II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB).

La maduración de las células dendríticas se denomina el estado de activación de las células dendríticas en el que dichas células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por las células dendríticas inmaduras da como resultado tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de las células dendríticas por CD40L, y sustancias liberadas por las células que sufren una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden obtener cultivando células de médula ósea in vitro con citocinas, tal como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula que presenta un antígeno" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula presentadora de antígeno que presenta un antígeno o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo por procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas del MHC, en particular moléculas del MHC de clase I. De manera similar, los términos "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" denotan una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I.

El término "célula inmunorreactiva" o "célula efectora" en el contexto de la presente enseñanza se refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una "célula inmunorreactiva" preferiblemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la expresión y/o presentación de un antígeno o un epítopo y mediar una respuesta inmune. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, matan microbios, secretan anticuerpos, reconocen células infectadas o cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T colaboradoras, células T que infiltran tumores), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas.

Preferiblemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un epítopo con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas del MHC tales como en la superficie de células presentadoras de antígeno. Preferiblemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un epítopo sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (célula T CD4+) que porta receptores que reconocen un antígeno o un epítopo en el contexto de moléculas del MHC de clase II, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos (CTL) CD8+ y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis de células mediada por perforina. De acuerdo con las enseñanzas, la capacidad de respuesta de los CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citocinas tal como IFN-y y TNF-a, sobrerregulación de marcadores de activación como CD44 y CD69, y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de CTL también se puede determinar usando un informador artificial que indique con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Dichos CTL que reconocen un antígeno o un epítopo y son sensibles o reactivos también se denominan aquí "CTL sensibles a antígenos". Si la célula es una célula B, dicha capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.

El término "célula T" o "linfocito T" se refiere a células derivadas del timo que participan en una variedad de reacciones inmunitarias mediadas por células e incluye células T colaboradoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+) que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, como las células B y las células asesinas naturales por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T colaboradoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, incluida la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T colaboradoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas del MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmune activa.

Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+, ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus objetivos al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas de péptidos separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a-TCR y p-TCR. Las células T y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T y6, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 6. Este grupo de células T es mucho menos común (2% del total de células T) que las células T ap.

La estructura del receptor de células T es muy similar a los fragmentos Fab de inmunoglobulina, que son regiones definidas como la cadena ligera y pesada combinadas de un brazo de anticuerpo. Cada cadena del TCR es un elemento de la superfamilia de inmunoglobulinas y posee un dominio variable (V) de inmunoglobulina (Ig) en el terminal N, un dominio constante (C) de Ig, una región transmembrana/membrana celular y una cola citoplasmática corta en el extremo terminal C. El dominio variable tanto de la cadena a como de la cadena p de TCR tiene tres regiones determinantes de complementariedad o hipervariables (CDR), mientras que la región variable de la cadena p tiene un área adicional de hipervariabilidad (HV4) que normalmente no contacta con el antígeno y por lo tanto, no se considera una CDR. La CDR3 es la principal CDR responsable de reconocer el antígeno procesado, aunque también se ha demostrado que la CDR1 de la cadena a interactúa con la parte terminal N del péptido antigénico, mientras que la CDR1 de la cadena p interactúa con la parte terminal C del péptido. Se cree que CDR2 reconoce el MHC. No se cree que CDR4 de la cadena p participe en el reconocimiento de antígenos, pero se ha demostrado que interactúa con superantígenos. El dominio constante del dominio TCR consta de secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma enlaces disulfuro, que forman un enlace entre las dos cadenas.

El término "célula B" o "linfocito B" se refiere a un tipo de glóbulo blanco del subtipo de linfocitos que funcionan en la inmunidad humoral secretando anticuerpos. Además, las células B presentan antígeno y se clasifican como células presentadoras de antígeno profesionales (APC) y secretan citocinas. Las células B expresan receptores de células B (BCR) en su membrana celular. Los BCR permiten que la célula B se una a un antígeno específico, contra el cual iniciará una respuesta de anticuerpos. El receptor de células B se compone de dos partes, una molécula de inmunoglobulina unida a la membrana de un isotipo (IgD, IgM, IgA, IgG o IgE) que, con la excepción de la presencia de un dominio de membrana integral, son idénticas a sus formas secretadas y una fracción de transducción de señales: un heterodímero llamado Ig-a/Ig-p (CD79), unidos por puentes disulfuro. Cada elemento del dímero atraviesa la membrana plasmática y tiene una cola citoplasmática que lleva un motivo de activación inmunorreceptor basado en tirosina (ITAM).

La activación de las células B se produce en los órganos linfoides secundarios, como el bazo y los ganglios linfáticos. Una vez que las células B maduran en la médula ósea, migran a través de la sangre a los órganos linfoides secundarios, que reciben un suministro constante de antígeno a través de la linfa circulante. La activación de las células B comienza cuando la célula B se une a un antígeno a través de su BCR. Diferentes subconjuntos de células B se someten a activación dependiente de células T o activación independiente de células T.

El término "complejo principal de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluye moléculas del MHC de clase I y MHC de clase II y se refieren a un complejo de genes que se encuentra en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas del MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunes, en las que las proteínas o moléculas del MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto autoantígenos (fragmentos de péptidos de la propia célula) como no autoantígenos (por ejemplo, fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.

La región del MHC se divide en tres subgrupos, clase I, clase II y clase III. Las proteínas del MHC de clase I contienen una cadena a y una microglobulina p2 (que no forma parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmentos de antígeno a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmunológico, específicamente en las células presentadoras de antígenos, las proteínas del MHC de clase II contienen cadenas a y p y presentan fragmentos de antígeno a las células T colaboradoras. La región del MHC de clase III codifica otros componentes inmunitarios, como los componentes del complemento y algunos que codifican citoquinas.

En los seres humanos, los genes de la región del MHC que codifican proteínas presentadoras de antígeno en la superficie celular se denominan genes de antígeno leucocitario humano (HLA). Sin embargo, la abreviatura MHC se usa a menudo para referirse a productos génicos HLA. Los genes HLA incluyen los nueve genes del MHC denominados clásicos: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA y HLA-DRB1.

En una realización preferida de todos los aspectos de la enseñanza, una molécula del MHC es una molécula de HLA.

El término "funciones efectoras inmunes" o "funciones efectoras" en el contexto de la presente enseñanza incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunológico que dan como resultado, por ejemplo, la muerte de células. Preferiblemente, las funciones efectoras inmunes en el contexto de la presente enseñanza son funciones efectoras mediadas por células T. Dichas funciones comprenden en el caso de una célula T colaboradora (célula T CD4+) el reconocimiento de un antígeno o un péptido de antígeno derivado de un antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase II por receptores de células T, la liberación de citocinas y/o la activación de linfocitos CD8+ (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL, el reconocimiento de un antígeno o un péptido antigénico derivado de un antígeno en el contexto de moléculas del MHC de clase I por receptores de células T, eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas del MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas como IFN-y y TNF-a, y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos.

El término "receptor de tipo toll" o "TLR" se refiere a una clase de proteínas que desempeñan un papel clave en el sistema inmunológico innato. Son receptores únicos, no catalíticos, que atraviesan la membrana y que generalmente se expresan en células centinela como macrófagos y células dendríticas, que reconocen moléculas conservadas estructuralmente derivadas de microbios. Una vez que estos microbios han traspasado las barreras físicas, como la piel o la mucosa del tracto intestinal, son reconocidos por los TLR, que activan las respuestas de las células inmunitarias.

En una realización de la enseñanza, se administra a un sujeto ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento. Se puede formar un producto de traducción del ARN en las células del sujeto y el producto se puede presentar al sistema inmunológico para inducir tolerancia a las células T autorreactivas que se dirigen al autoantígeno.

Alternativamente, la presente enseñanza prevé realizaciones en las que se introduce ARN no inmunogénico que expresa un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento en células tales como células presentadoras de antígeno ex vivo, por ejemplo las células presentadoras de antígeno tomadas de un paciente, y las células, opcionalmente propagadas ex vivo por clonación, se trasplantan de nuevo al mismo paciente. Las células transfectadas pueden reintroducirse en el paciente usando cualquier medio conocido en la técnica, preferiblemente en forma estéril mediante administración intravenosa, intracavitaria o intraperitoneal. Las células adecuadas incluyen células presentadoras de antígenos. La célula presentadora de antígeno es preferiblemente una célula dendrítica, un macrófago, una célula B, una célula estromal mesenquimatosa, una célula epitelial, una célula endotelial y una célula fibroblástica, y lo más preferiblemente es una célula dendrítica. Por tanto, la enseñanza también incluye un método para tratar una enfermedad autoinmune, que comprende administrar a un sujeto que lo necesite células presentadoras de antígeno aisladas que expresan el ARN no inmunogénico descrito en el presente documento. Las células pueden ser autólogas, alogénicas, singénicas o heterólogas para el sujeto.

El término "ácido nucleico", como se usa en este documento, pretende incluir ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN) tal como ADNc, ARNm, moléculas producidas recombinantemente y sintetizadas químicamente. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario. De acuerdo con la enseñanza, el ARN incluye ARN transcrito in vitro (ARN TIV) o ARN sintético. De acuerdo con la enseñanza, un ácido nucleico es preferiblemente un ácido nucleico aislado. Además, los ácidos nucleicos descritos en este documento pueden ser moléculas recombinantes.

El término "ácido nucleico aislado" significa, de acuerdo con las enseñanzas, que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo de forma recombinante mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y separación mediante electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Puede emplearse un ácido nucleico para la introducción, es decir, la transfección de células, por ejemplo, en forma de ARN que puede prepararse mediante transcripción in vitro a partir de una plantilla de ADN. Además, el ARN se puede modificar antes de la aplicación mediante la estabilización de las secuencias, la protección y la poliadenilación.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "ADN" se refiere a una molécula que comprende residuos de desoxirribonucleótidos y preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de desoxirribonucleótidos. "Desoxirribonucleótido" se refiere a un nucleótido que carece de un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término "ADN" comprende ADN aislado tal como ADN parcial o completamente purificado, ADN esencialmente puro, ADN sintético y ADN generado de manera recombinante e incluye ADN modificado que se diferencia del ADN de origen natural por adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, como en el o los extremos de un ADN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ADN. Los nucleótidos en las moléculas de ADN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos sintetizados químicamente. Estos ADN alterados pueden denominarse análogos o análogos de ADN de origen natural.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende residuos de ribonucleótidos y que preferiblemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótidos. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-D-ribofuranosilo. El término incluye ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado tal como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido de manera recombinante, así como ARN modificado que difiere del ARN natural por la adición, eliminación o sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Tales alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como en el o los extremos de un ARN o internamente, por ejemplo en uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN también pueden comprender nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos de origen no natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden denominarse análogos o análogos de ARN de origen natural. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "ARN" incluye y preferiblemente se refiere a "ARNm" que significa "ARN mensajero" y se refiere a una transcripción que puede producirse usando ADN como plantilla y codifica un péptido o proteína. El ARNm comprende típicamente una región 5' no traducida (5'-UTR), una región que codifica proteína o péptido y una región 3' no traducida (3'-UTR). El ARNm tiene un tiempo medio limitado en las células e in vitro. Preferiblemente, el ARNm se produce mediante transcripción in vitro utilizando una plantilla de ADN. En una realización de la enseñanza, el ARN se obtiene mediante transcripción in vitro o síntesis química. El experto en la materia conoce la metodología de transcripción in vitro. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.

De acuerdo con las enseñanzas, la estabilidad y la eficacia de traducción del ARN pueden modificarse según se requiera. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse y su traducción aumentada mediante una o más modificaciones que tienen efectos estabilizadores y/o un aumento de la eficiencia de traducción del ARN. Para aumentar la expresión del ARN utilizado de acuerdo con la presente enseñanza, se puede modificar dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresados, preferiblemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresados, para aumentar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, por lo tanto, mejorar la traducción en las células.

El término "modificación" en el contexto del ARN usado en la presente enseñanza incluye cualquier modificación de un ARN que no está presente de forma natural en dicho ARN.

En una realización de la enseñanza, el ARN utilizado de acuerdo con la enseñanza no tiene 5'-trifosfatos no protegidos. La eliminación de dichos 5'-trifosfatos sin protección se puede lograr tratando el ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con las enseñanzas puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con las enseñanzas, la 5-metilcitidina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por citidina. Alternativa o adicionalmente, en una realización, en el ARN usado de acuerdo con las enseñanzas, la pseudouridina se sustituye parcial o completamente, preferiblemente completamente, por uridina.

En una realización, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con un protector de 5' o análogo protector de 5'. El término "protector de 5'" se refiere a una estructura de protección que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y generalmente consiste en un nucleótido de guanosina conectado al ARNm a través de un enlace trifosfato inusual de 5' con 5'. En una realización, esta guanosina está metilada en la posición 7. El término "protección de 5' convencional" se refiere a una protección de 5' de ARN de origen natural, preferiblemente al protector de metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente enseñanza, el término "protector de 5'" incluye un análogo de protector de 5' que se asemeja a la estructura de protección del ARN y se modifica para poseer la capacidad de estabilizar el ARN y/o mejorar la traducción del ARN si está unido al mismo preferiblemente in vivo y/o en una célula.

El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN usado en la presente enseñanza puede ser una extensión o truncamiento de la cola de poli(A) de origen natural o una alteración de las regiones 5' o 3' no traducidas (UTR) tal como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región que codifica dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente con o la inserción de una o más, preferiblemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tal como alfa2-globina, alfal-globina, betaglobina, preferiblemente beta-globina, más preferiblemente beta-globina humana.

El ARN que tiene una secuencia de poli-A no enmascarada se traduce de manera más eficaz que el ARN que tiene una secuencia de poli-A enmascarada. El término "cola de poli(A)" o "secuencia de poli-A" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que normalmente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia de poli-A no enmascarada" significa que la secuencia de poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia de poli-A y no es seguida por nucleótidos distintos de A ubicado en el extremo 3', es decir, secuencia abajo, de la secuencia de poli-A. Además, una secuencia de poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficiencia de traducción óptimas del ARN.

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con la presente enseñanza, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia de poli-A, preferiblemente con una longitud de 10 a 500, más preferiblemente de 30 a 300, incluso más preferiblemente de 65 a 20o y especialmente de 100 a 150 residuos de adenosina. En una realización especialmente preferida, la secuencia de poli-A tiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con las enseñanzas, se puede desenmascarar la secuencia de poli-A.

El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. La "vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad o número de moléculas. En el contexto de la presente enseñanza, la vida media de un ARN es indicativa de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influir en la "duración de la expresión" del ARN. Se puede esperar que el ARN que tenga una vida media larga se exprese durante un período de tiempo prolongado.

Por supuesto, si de acuerdo con la presente enseñanza se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos descritos anteriormente aumentando la estabilidad y/o eficiencia de traducción del ARN.

El ARN que se va a administrar de acuerdo con las enseñanzas no es inmunogénico. El término "ARN no inmunogénico", como se usa en este documento, se refiere a ARN que no induce una respuesta del sistema inmunológico tras la administración, por ejemplo, a un mamífero, o induce una respuesta más débil de la que habría inducido el mismo ARN que solo difiere en el sentido de que no ha sido sometido a las modificaciones y tratamientos que hacen que el ARN no inmunogénico no sea inmunogénico. En una realización preferida, el ARN no inmunogénico se vuelve no inmunogénico incorporando nucleótidos modificados que suprimen la activación mediada por ARN de los receptores inmunes innatos en el ARN y eliminando el ARN bicatenario (ARNbc).

Para convertir el ARN no inmunogénico en no inmunogénico mediante la incorporación de nucleótidos modificados, se puede usar cualquier nucleótido modificado siempre que disminuya o suprima la inmunogenicidad del ARN. Son particularmente preferidos los nucleótidos modificados que suprimen la activación mediada por ARN de los receptores inmunes innatos. En una realización, los nucleótidos modificados comprenden un reemplazo de una o más uridinas con un nucleósido que comprende una nucleobase modificada. En una realización, la nucleobase modificada es un uracilo modificado. En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada se selecciona del grupo que consiste en 3-metil-uridina (m3U), 5-metoxi-uridina (mo5U), 5-aza-uridina, 6-aza-uridina, 2-tio-5-aza-uridina, 2-tio-uridina (s2U), 4-tio-uridina (s4U), 4-tio-pseudouridina, 2-tio-pseudouridina, 5-hidroxi-uridina (ho5U), 5-aminoaliluridina, 5-halo-uridina (por ejemplo, 5-yodo-uridina o 5-bromo-uridina), ácido 5-oxiacético uridina (cmo5U), éster metílico del ácido 5-oxiacético uridina (mcmo5U), 5-carboximetil-uridina (cm5U), 1-carboximetil-pseudouridina, 5-carboxihidroximetil-uridina (chm5U), éster metílico de 5-carboxihidroximetil-uridina (mchm5U), 5-metoxicarbonilmetiluridina (mcm5U), 5-metoxicarbonilmetil-2-tio-uridina (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridina (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridina (mnm5U), 1-etil-pseudouridina, 5-metilaminometil-2-tio-uridina (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridina (mnm5se2U), 5-carbamoilmetil-uridina (ncm5U), 5-carboximetilaminometil-uridina (cmnm5U), 5-carboximetilaminometil-2-tio-uridina (cmnm5s2U), 5-propinil-uridina, 1-propinil-pseudouridina, 5-taurinometil-uridina (Tm5U), 1-taurinometil-pseudouridina, 5-taurinometil-2-tio-uridina (Tm5s2U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridina, 5-metil-2-tio-uridina (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridina (m1s4^), 4-tio-1-metil-pseudouridina, 3-metil-pseudouridina (m3^), 2-tio-1-metil-pseudouridina, 1-metil-l-deaza-pseudouridina, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridina, dihidrouridina (D), dihidropseudouridina, 5,6-dihidrouridina, 5-metil-dihidrouridina (m5D), 2-tiodihidrouridina, 2-tio-dihidropseudouridina, 2-metoxi-uridina, 2-metoxi-4-tio-uridina, 4-metoxi-pseudouridina, 4-metoxi-2-tio-pseudouridina, Nl-metil-pseudouridina, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina (acp3 y ), 5-(isopentenilaminometil)uridina (inm5U), 5-(isopentenilaminometil)-2-tiouridina (inm5s2U), a-tio-uridina, 2'-O-metil-uridina (Um), 5,2'-O-dimetil-uridina (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridina (^m), 2-tio-2'-O-metil-uridina (s2Um), 5-metoxicarbonilmetil-2'-O-metil-uridina (mcm5Um), 5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina (ncm5Um), 5-carboximetilaminometil-2'-O-metil-uridina (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridina (m3Um), 5-(isopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridina (inm5Um), 1-tio-uridina, deoxitimidina, 2'-F-ara-uridina, 2'-F-uridina, 2'-OH-ara-uridina, 5-(2-carbometoxivinil)uridina, y 5-[3-(1-E-propenilamino)uridina. En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada es pseudouridina (y ), Nl-metil-pseudouridina (m1Y) o 5-metil-uridina (m5U). En una realización, el nucleósido que comprende una nucleobase modificada es 1-metil-pseudouridina.

La estructura de un ejemplo de nucleósido que comprende una nucleobase modificada es 1-metilpseudouridina m1^ :

En una realización, el reemplazo de una o más uridinas con un nucleósido que comprende una nucleobase modificada comprende un reemplazo de al menos 1%, al menos 2%, al menos 3%, al menos 4%, al menos 5%, al menos 10 %, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o 100% de las uridinas.

Durante la síntesis de ARNm mediante transcripción in vitro (TIV) usando ARN polimerasa T7, se producen cantidades significativas de productos aberrantes, incluido ARN bicatenario (ARNbc) debido a la actividad no convencional de la enzima. El ARNbc induce citocinas inflamatorias y activa enzimas efectoras que conducen a la inhibición de la síntesis de proteínas. El ARNbc se puede eliminar del RNA tal como el ARN TIV, por ejemplo, mediante HPLC de fase inversa de pares iónicos usando una matriz de poliestireno-divinilbenceno C-18 no porosa o porosa (PS-DVB). Alternativamente, se puede usar un método de base enzimática que usa RNasa III de E. coli que hidroliza específicamente el ARNbc pero no el ARNmc, eliminando así los contaminantes de ARNbc de las preparaciones de a Rn TIV. Además, el ARNbc se puede separar del ARNmc utilizando un material de celulosa. En una realización, una preparación de ARN se pone en contacto con un material de celulosa y el ARNmc se separa del material de celulosa en condiciones que permiten la unión de ARNbc al material de celulosa y no permiten la unión de ARNmc al material de celulosa.

Como se usa el término en este documento, "eliminar" o "remover" se refiere a la característica de que una población de primeras sustancias, como ARN no inmunogénico, se separa de la proximidad de una población de segundas sustancias, como ARNbc, en el que la población de las primeras sustancias no está necesariamente desprovista de la segunda sustancia, y la población de las segundas sustancias no está necesariamente desprovista de la primera sustancia. Sin embargo, una población de primeras sustancias caracterizada por la eliminación de una población de segundas sustancias tiene un contenido considerablemente menor de segundas sustancias en comparación con la mezcla no separada de la primera y la segunda sustancias.

Los ácidos nucleicos se pueden transferir a una célula huésped por medios físicos, químicos o biológicos.

Los métodos físicos para introducir un ácido nucleico en una célula huésped incluyen precipitación con fosfato cálcico, lipofección, bombardeo de partículas, microinyección, electroporación y similares.

Los métodos biológicos para introducir un ácido nucleico de interés en una célula huésped incluyen el uso de vectores de ADN y ARN. Los vectores virales, y especialmente los vectores retrovirales, se han convertido en el método más utilizado para insertar genes en células de mamíferos, por ejemplo, humanas. Otros vectores virales pueden derivarse de lentivirus, poxvirus, virus del herpes simple I, adenovirus y virus adenoasociados y similares.

Los medios químicos para introducir un ácido nucleico en una célula huésped incluyen sistemas de dispersión coloidal, tales como complejos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal preferido para usar como vehículo de administración in vitro e in vivo es un liposoma (es decir, una vesícula de membrana artificial). La preparación y el uso de tales sistemas es bien conocido en la técnica.

"Codificación" se refiere a la propiedad inherente de secuencias específicas de nucleótidos en un ácido nucleico para servir como plantillas para la síntesis de otros polímeros y macromoléculas en procesos biológicos que tienen una secuencia definida de nucleótidos o una secuencia definida de aminoácidos. Por tanto, un ácido nucleico codifica una proteína si la expresión (traducción y opcionalmente transcripción) del ácido nucleico produce la proteína en una célula u otro sistema biológico.

El término "expresión" se usa de acuerdo con las enseñanzas en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos o polipéptidos, por ejemplo por transcripción y/o traducción. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o polipéptidos. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

En el contexto de la presente enseñanza, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en el que el código genético en una secuencia de ADN se transcribe en ARN. Posteriormente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente enseñanza, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en el que el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en el que el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferiblemente usando extractos celulares apropiados. Preferiblemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcripciones. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y, de acuerdo con la presente enseñanza, están abarcados por el término "vector". De acuerdo con la presente enseñanza, el ARN usado en la presente enseñanza es preferiblemente ARN transcrito in vitro (ARN TIV) y puede obtenerse mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN apropiado. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, t 3 y SP6. Preferiblemente, la transcripción in vitro de acuerdo con las enseñanzas está controlada por un promotor T7 o SP6. Puede obtenerse una plantilla de ADN para la transcripción in vitro clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para la transcripción in vitro. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.

El término "traducción" de acuerdo con la enseñanza se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para producir un péptido o polipéptido.

De acuerdo con las enseñanzas, se prefiere que un ácido nucleico como el ARN que codifica un péptido o proteína una vez absorbido o introducido, es decir, transfectado o transducido, en una célula cual puede estar presente in vitro o en un sujeto da como resultado expresión de dicho péptido o proteína. La célula puede expresar el péptido o la proteína codificados de forma intracelular (por ejemplo, en el citoplasma y/o en el núcleo), puede secretar el péptido o la proteína codificados, o puede expresarlo en la superficie.

De acuerdo con la enseñanza, términos como "que expresa ácido nucleico" y "que codifica ácido nucleico" o términos similares se usan indistintamente en este documento y con respecto a un péptido o polipéptido particular significa que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido.

Los términos como "transferir", "introducir", "transfectar" o "transducir" se usan indistintamente en este documento y se refieren a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, tales como ARN en una célula. De acuerdo con la presente enseñanza, la célula puede estar presente in vitro o in vivo, por ejemplo la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo. De acuerdo con la enseñanza, la transfección puede ser transitoria o estable. Para algunas aplicaciones de transfección, es suficiente si el material genético transfectado solo se expresa transitoriamente. Dado que el ácido nucleico introducido en el proceso de transfección generalmente no se integra en el genoma nuclear, el ácido nucleico extraño se diluirá mediante mitosis o se degradará. Las líneas celulares que permiten la amplificación episomal de ácidos nucleicos reducen en gran medida la velocidad de dilución. Si se desea que el ácido nucleico transfectado permanezca realmente en el genoma de la célula y sus células hijas, debe producirse una transfección estable. El ARN se puede transfectar en células para expresar transitoriamente su proteína codificada.

De acuerdo con la presente enseñanza, el término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferiblemente 3 o más, preferiblemente 4 o más, preferiblemente 6 o más, preferiblemente 8 o más, preferiblemente 10 o más, preferiblemente 13 o más, preferiblemente 16 o más, preferiblemente 21 o más y hasta preferiblemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos.

El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, es decir, polipéptidos, preferiblemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son sinónimos y se usan indistintamente en este documento.

La presente enseñanza también incluye "variantes" de los péptidos, proteínas o secuencias de aminoácidos tales como autoantígenos descritos en el presente documento.

En el sentido de la presente enseñanza, las "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprenden variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tienen una inserción, uno o más residuos de aminoácidos se insertan en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque también es posible una inserción aleatoria con un cribado apropiado del producto resultante.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones al terminal amino y/o carboxilo de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos.

Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1,2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 o más aminoácidos. Las eliminaciones pueden estar en cualquier posición de la proteína. Las variantes de eliminación de aminoácidos que comprenden la eliminación en el extremo terminal N y/o terminal C de la proteína también se denominan variantes de truncamiento del terminal N y/o terminal C.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan porque se elimina al menos un residuo en la secuencia y se inserta otro residuo en su lugar. Se da preferencia a que las modificaciones se encuentren en posiciones en la secuencia de aminoácidos que no se conserven entre proteínas o péptidos homólogos y/o al reemplazo de aminoácidos por otros que tengan propiedades similares. Preferiblemente, los cambios de aminoácidos en variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservadores, es decir, sustituciones de aminoácidos cargados o no cargados de manera similar. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos naturales se dividen generalmente en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), apolares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y aminoácidos polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferiblemente, el grado de similitud, preferiblemente identidad entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos aproximadamente del 60%, 65%, 70%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para una región de aminoácidos que es al menos aproximadamente el 10%, al menos aproximadamente el 20%, al menos aproximadamente el 30%, al menos aproximadamente el 40%, al menos aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 60%, al menos aproximadamente el 70%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 90% o aproximadamente el 100% de la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se da preferiblemente para al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 40, al menos aproximadamente 60, al menos aproximadamente 80, al menos aproximadamente 100, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 140, al menos aproximadamente 160, al menos aproximadamente 180 o aproximadamente 200 aminoácidos, preferiblemente aminoácidos continuos. El grado de similitud o identidad se da preferiblemente para un segmento de al menos 80, al menos 100, al menos 120, al menos 150, al menos 180, al menos 200 o al menos 250 aminoácidos. En realizaciones preferidas, el grado de similitud o identidad se da para toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de secuencia, preferiblemente la identidad de secuencia, se puede realizar con herramientas conocidas en la técnica, preferiblemente usando la mejor alineación de secuencia, por ejemplo, usando Align, usando configuraciones estándar, preferiblemente EMBOSS::needle, Matriz: Blosum62, Apertura de hueco 10.0, Extensión de hueco 0.5.

La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos o que representan sustituciones conservadoras de aminoácidos. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias.

El término "% de identidad" pretende referirse, en particular, a un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos en un alineamiento óptimo entre dos secuencias a comparar, siendo dicho porcentaje puramente estadístico, y las diferencias entre los dos secuencias pueden distribuirse aleatoriamente en toda la longitud de la secuencia y la secuencia a comparar puede comprender adiciones o eliminaciones en comparación con la secuencia de referencia, para obtener un alineamiento óptimo entre dos secuencias. Las comparaciones de dos secuencias se realizan habitualmente comparando dichas secuencias, después de un alineamiento óptimo, con respecto a un segmento o "ventana de comparación", con el fin de identificar regiones locales de secuencias correspondientes. La alineación óptima para una comparación puede llevarse a cabo manualmente o con la ayuda del algoritmo de homología local de Smith y Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, con la ayuda del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, y con la ayuda del algoritmo de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 o con la ayuda de programas informáticos que utilicen dichos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se obtiene determinando el número de posiciones idénticas en las que se corresponden las secuencias a comparar, dividiendo este número por el número de posiciones comparadas y multiplicando este resultado por 100.

Las secuencias de aminoácidos homólogas presentan de acuerdo con la enseñanza al menos el 40%, en particular al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90% y preferiblemente al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% de identidad de los residuos de aminoácidos.

De acuerdo con la enseñanza, una variante, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene preferiblemente una propiedad funcional de la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado, es decir es funcionalmente equivalente. En una realización, una variante, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado. En una realización, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.

La enseñanza incluye derivados de los péptidos o proteínas descritos en este documento que están comprendidos por los términos "péptido" y "proteína". De acuerdo con la enseñanza, los "derivados" de proteínas y péptidos son formas modificadas de proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones, eliminaciones y/o adiciones únicas o múltiples de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una realización, los "derivados" de proteínas o péptidos incluyen aquellos análogos modificados que resultan de glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivatización, introducción de grupos protectores/bloqueantes, escisión proteolítica o unión a un anticuerpo u otro ligando celular. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferiblemente, un péptido modificado tiene mayor estabilidad y/o mayor inmunogenicidad.

El término "derivado" significa de acuerdo con la enseñanza que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos, especialmente regiones de secuencias particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos o de una secuencia de ácidos nucleicos en la que está presente.

El término "célula" o "célula huésped" es preferiblemente una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, orgánulos o material genético. Una célula intacta es preferiblemente una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferiblemente, dicho término se refiere de acuerdo con la enseñanza a cualquier célula que pueda transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye, de acuerdo con la enseñanza, células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura y células de insectos). El ácido nucleico exógeno se puede encontrar dentro de la célula (i) libremente disperso como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o ADN mitocondrial. Se prefieren particularmente las células de mamíferos, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivarse de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares.

Una célula que comprende un ácido nucleico, por ejemplo que ha sido transfectado con un ácido nucleico, preferiblemente expresa el péptido o proteína codificada por el ácido nucleico.

El término "expansión" se refiere a un proceso en el que se multiplica una entidad específica. En una realización de la presente enseñanza, el término se usa en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferiblemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

"Aislado", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de otras moléculas, como otro material celular. El término "recombinante" en el contexto de la presente enseñanza significa "elaborado mediante ingeniería genética". Preferiblemente, un "objeto recombinante" tal como una célula recombinante o un ácido nucleico en el contexto de la presente enseñanza no se produce de forma natural.

El término "de origen natural", como se usa en este documento, se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluidos los virus) y que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural.

Los términos como "reducir", "inhibir" o "disminuir" se refieren a la capacidad de causar una disminución general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, más preferiblemente del 50% o más, y lo más preferiblemente del 75% o más, en el nivel. Estos términos incluyen una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Los términos como "aumentar", "mejorar", "promover", "estimular" o "inducir" se refieren a la capacidad de provocar un aumento general, preferiblemente del 5% o más, del 10% o más, del 20% o más, del 50% o más, del 75% o más, del 100% o más, del 200% o más, o del 500% o más, en el nivel. Estos términos pueden relacionarse con un aumento, mejora, promoción, estimulación o inducción desde cero o un nivel no medible o no detectable hasta un nivel de más de cero o un nivel que es medible o detectable. Alternativamente, estos términos también pueden significar que hubo un cierto nivel antes de un aumento, mejora, promoción, estimulación o inducción y después del aumento, mejora, promoción, estimulación o inducción, el nivel es mayor.

Los agentes y composiciones descritos en este documento son útiles en métodos para suprimir una respuesta inmune en un mamífero para el tratamiento o prevención de una enfermedad autoinmune. En particular, los agentes y composiciones descritos en este documento pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad autoinmune caracterizada por la presencia de una reacción inmune contra un autoantígeno. De acuerdo con la enseñanza, se administra al sujeto ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende el autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento.

El término "enfermedad" se refiere a una condición anormal que afecta el cuerpo de un individuo. Una enfermedad se suele interpretar como una afección médica asociada con signos y síntomas específicos. Una enfermedad puede ser causada por factores originalmente de una fuente externa, como una enfermedad infecciosa, o puede ser causada por disfunciones internas, como enfermedades autoinmunes. En los seres humanos, "enfermedad" se usa a menudo de manera más amplia para referirse a cualquier condición que cause dolor, disfunción, angustia, problemas sociales o la muerte del individuo afectado, o problemas similares para quienes están en contacto con el individuo. En este sentido más amplio, a veces incluye lesiones, discapacidades, trastornos, síndromes, infecciones, síntomas aislados, conductas desviadas y variaciones atípicas de estructura y función, mientras que en otros contextos y para otros fines pueden considerarse categorías distinguibles. Las enfermedades generalmente afectan a las personas no solo físicamente, sino también emocionalmente, ya que contraer y vivir con muchas enfermedades puede alterar la perspectiva de vida y la personalidad. De acuerdo con la enseñanza, el término "enfermedad" incluye enfermedades autoinmunes.

Una enfermedad que se va a tratar de acuerdo con las enseñanzas es preferiblemente una enfermedad que implica un autoantígeno o que está asociada con un autoantígeno.

El término "enfermedad autoinmune" o "trastorno autoinmune" se refiere a cualquier enfermedad/trastorno en el que el cuerpo produce una respuesta inmunogénica (es decir, sistema inmunológico) a algún constituyente de su propio tejido. En otras palabras, el sistema inmunológico pierde su capacidad para reconocer algún tejido o sistema dentro del cuerpo como si fuera propio y lo ataca como si fuera extraño. Las enfermedades autoinmunes se pueden clasificar en aquellas en las que predomina un órgano afectado (por ejemplo, anemia hemolítica y tiroiditis antiinmunitaria) y aquellas en las que el proceso de la enfermedad autoinmunitaria se difunde a través de muchos tejidos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico). Por ejemplo, se cree que la esclerosis múltiple es causada por células T que atacan los revestimientos que rodean las fibras nerviosas del cerebro y la médula espinal. Esto resulta en pérdida de coordinación, debilidad y visión borrosa. Ejemplos de enfermedades autoinmunes incluyen, pero no se limitan a, enfermedad de Addision, alopecia areata, espondilitis anquilosante, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, diabetes (tipo I), epidermólisis ampollosa distrófica, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo vulgar, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, vasculitis, vitiligo, mixoderma, anemia perniciosa, colitis ulcerosa y diabetes mellitus tipo I, entre otras.

A continuación se muestra una lista de antígenos que se sabe que están asociados con ciertas enfermedades autoinmunes. Los epítopos de estos antígenos se pueden incluir en un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo, o una variante del autoantígeno o fragmento de acuerdo con las enseñanzas.

Esclerosis múltiple (MS)/(+ modelo animal de EAE (encefalomielitis autoinmune experimental))

Los posibles autoantígenos candidatos en la MS incluyen antígenos de mielina, antígenos neuronales y antígenos derivados de astrocitos. Componentes proteicos de las proteínas de mielina como la proteína básica de mielina (MBP) (por ejemplo, MBP84-102, MBP83-99, MBP13-32, MBP144-163, MBP143-168, MBP151-170), proteína proteolipídica (PLP) (por ejemplo, PLP139 -151), glucoproteína de oligodendrocitos de mielina (MOG), glucoproteína asociada a mielina (MAG), proteína básica de oligodendrocitos asociada a mielina (MOBP), CNPasa (3'-fosfodiesterasa del nucleótido 2',3'-cíclico), proteína S100p y transaldolasa H son de particular interés para su uso de acuerdo con la enseñanza.

Artritis reumatoide (AR)

Los posibles autoantígenos candidatos en la AR incluyen colágeno tipo II, glicoproteína 39 del cartílago humano y agrecano G1.

Diabetes tipo 1

Los posibles autoantígenos candidatos en la diabetes tipo 1 incluyen insulina, proinsulina, descarboxilasa 65 del ácido glutámico (GAD65), proteína 2 asociada a insulinoma (IA-2), proteína 2 beta asociada a insulinoma (IA-2beta), autoantígeno de células de los islotes (HSP), glima 38, autoantígeno de células de los islotes (ICA69), p52, transportador 8 de zinc (ZnT8), proteína relacionada con la subunidad catalítica de glucosa-6-fosfatasa específica de los islotes (IGRP) y cromogranina A.

Miastenia grave

Los posibles autoantígenos candidatos en la miastenia grave incluyen nAChR, MuSK y LRP4.

Otros autoantígenos, en enfermedades tales como MS, RA, diabetes tipo 1, miastenia grave, IBD y psoriasis, algunos de los cuales se enumeran en este documento, y otros también conocidos en la técnica, se contemplan para su uso con la enseñanza. Está aumentando el número de autoantígenos y epítopos autoinmunes conocidos. También se contempla para su uso con la enseñanza cualquiera de estos antígenos y epítopos que se conozcan en el futuro.

El término "enfermedad asociada con un autoantígeno" o "enfermedad que implica un autoantígeno" se refiere a cualquier enfermedad que implica un autoantígeno, por ejemplo una enfermedad que se caracteriza por la presencia de una reacción inmune contra un autoantígeno o células que expresan un autoantígeno.

El término "tratamiento" o "tratamiento terapéutico" se refiere a cualquier tratamiento que mejora el estado de salud y/o prolonga (aumenta) la vida útil de un individuo. Dicho tratamiento puede eliminar la enfermedad en un individuo, detener o retrasar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, inhibir o retrasar el desarrollo de una enfermedad en un individuo, disminuir la frecuencia o severidad de los síntomas en un individuo y/o disminuir la recurrencia en un individuo que actualmente tiene o que previamente ha tenido una enfermedad.

Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se refieren a cualquier tratamiento destinado a evitar que una enfermedad se produzca en un individuo, en particular un individuo que tiene riesgo de contraer la enfermedad. Los términos "tratamiento profiláctico" o "tratamiento preventivo" se utilizan aquí indistintamente.

Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica con una probabilidad mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que tiene actualmente, una enfermedad es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que dicho sujeto puede continuar desarrollando una enfermedad.

El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.

El término "individuo" o "sujeto" se refiere a vertebrados, particularmente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente enseñanza son humanos, primates no humanos, mamíferos domesticados como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio como ratones, ratas, conejillos de indias, etc., así como animales en cautiverio como animales de zoológicos. El término "sujeto" también se refiere a vertebrados no mamíferos tales como aves (particularmente aves domesticadas tales como pollos, patos, gansos, pavos) y peces (particularmente peces de cultivo, por ejemplo, salmón o bagre). El término "animal" como se usa en este documento también incluye humanos. Preferiblemente, el término "paciente" se refiere a un individuo enfermo.

El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "autotrasplante" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de otro modo da como resultado el rechazo.

El término "alogénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de diferentes individuos de la misma especie. Se dice que dos o más individuos son alogénicos entre sí cuando los genes en uno o más loci no son idénticos.

El término "singénico" se usa para describir cualquier cosa que se derive de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos, es decir, gemelos idénticos o animales de la misma cepa consanguínea, o sus tejidos.

El término "heterólogo" se usa para describir algo que consta de múltiples elementos diferentes. Por ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a otro individuo constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta al sujeto.

Los agentes descritos en el presente documento se pueden administrar en forma de cualquier composición farmacéutica adecuada. El término "composición farmacéutica" se refiere a una formulación que comprende un agente terapéuticamente eficaz o una sal del mismo, preferiblemente junto con excipientes farmacéuticos tales como tampones, conservantes y modificadores de tonicidad. Dicha composición farmacéutica es útil para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno mediante la administración de dicha composición farmacéutica a un individuo. Una composición farmacéutica también se conoce en la técnica como formulación farmacéutica. La composición farmacéutica se puede administrar de forma local o sistémica.

El término "administración sistémica" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de manera que el agente se distribuya ampliamente en el cuerpo de un individuo en cantidades significativas y desarrolle un efecto biológico. De acuerdo con la presente enseñanza, se prefiere que la administración sea por vía parenteral.

El término "administración parenteral" se refiere a la administración de un agente terapéuticamente eficaz de modo que el agente no pase por el intestino. El término "administración parenteral" incluye la administración intravenosa, la administración subcutánea, la administración intradérmica o la administración intraarterial, pero no se limita a las mismas.

Los métodos de la enseñanza también comprenden preferiblemente proporcionar adicionalmente al sujeto un compuesto inmunoinhibidor. Si el compuesto inmunoinhibidor es un péptido o polipéptido, se puede proporcionar al sujeto administrando el compuesto inmunoinhibidor o ácido nucleico tal como ARN, en particular ARN no inmunogénico tal como el ARN descrito en este documento, que codifica el compuesto inmunoinhibidor. El compuesto inmunoinhibidor se puede seleccionar del grupo que consiste en factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interleucina 10 (IL-10), antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1RA), interleucina 4 (IL-4), interleucina 27 (IL-27), interleucina 35 (IL-35), ligando 1 de muerte programada (PD-L1), ligando coestimulador inducible de células T (ICOSL), B7-H4, CD39, CD73, FAS, FAS-IL, indolamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO1), indolamina 2,3-dioxigenasa 2 (IDO2), acetaldehído deshidrogenasa 1 (ALDHl)/retinaldehído deshidrogenasa (RALDH), arginasa 1 (ARG1), arginasa 2 (ARG2), óxido nitroso sintasa (NOS2), galectina 1, galectina 9, semaforina 4A y cualquier combinación de los mismos. Además, las composiciones descritas en el presente documento pueden comprender dicho compuesto inmunoinhibidor o ácido nucleico tal como ARN que codifica dicho compuesto inmunoinhibidor.

La composición farmacéutica de acuerdo con la presente enseñanza se aplica generalmente en una "cantidad farmacéuticamente eficaz" y en "una preparación farmacéuticamente aceptable".

El término "cantidad farmacéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular, la reacción deseada se refiere preferiblemente a la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad también puede ser un retraso del inicio o una prevención del inicio de dicha enfermedad o dicha condición. Una cantidad eficaz de las composiciones descritas en este documento dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la afección fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de terapia acompañante (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. Por consiguiente, las dosis administradas de las composiciones descritas en este documento pueden depender de varios de dichos parámetros. En el caso de que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial, se pueden usar dosis más altas (o dosis efectivamente más altas logradas por una vía de administración diferente, más localizada).

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a la no toxicidad de un material que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica.

Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden contener sales, tampones, agentes conservantes, vehículos y opcionalmente otros agentes terapéuticos. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza comprenden uno o más vehículos, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "excipiente" pretende indicar todas las sustancias en una composición farmacéutica que no son ingredientes activos tales como aglutinantes, lubricantes, espesantes, agentes tensioactivos, conservantes, emulsionantes, tampones, agentes aromatizantes o colorantes.

El término "diluyente" se refiere a un agente diluyente y/o que vuelve menos densa una solución. Además, el término "diluyente" incluye uno cualquiera o más de suspensiones y/o medios de mezcla fluidos, líquidos o sólidos.

El término "vehículo" se refiere a una o más sólidos o rellenos líquidos o diluyentes compatibles, que son adecuados para su administración a un ser humano. El término "vehículo" se refiere a un componente orgánico o inorgánico natural o sintético que se combina con un componente activo para facilitar la aplicación del componente activo. Preferiblemente, los componentes del vehículo son líquidos estériles como agua o aceites, incluidos los que se derivan de aceite mineral, animales o plantas, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite de sésamo, aceite de girasol, etc. Soluciones salinas y dextrosa acuosa y también se pueden usar soluciones de glicerina como compuestos portadores acuosos.

Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica farmacéutica y se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro edit. 1985). Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azúcar, lactosa, pectina, dextrina, almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, una cera de bajo punto de fusión, manteca de cacao y similares. Los ejemplos de diluyentes adecuados incluyen etanol, glicerol y agua.

Los vehículos, excipientes o diluyentes farmacéuticos pueden seleccionarse con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica estándar. Las composiciones farmacéuticas de la presente enseñanza pueden comprender como, o además de, el portador(es), excipiente(s) o diluyente(s) cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento adecuados y/o agente(s) solubilizantes. Ejemplos de aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa, lactosa anhidra, lactosa de flujo libre, beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas, tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa y polietilenglicol. Los ejemplos de lubricantes adecuados incluyen oleato de sodio, estearato de sodio, estearato de magnesio, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro de sodio y similares. En la composición farmacéutica se pueden proporcionar conservantes, estabilizadores, colorantes e incluso agentes saborizantes. Los ejemplos de conservantes incluyen benzoato de sodio, ácido sórbico y ésteres de ácido phidroxibenzoico. También se pueden usar antioxidantes y agentes de suspensión.

En una realización, la composición es una composición acuosa. La composición acuosa puede comprender opcionalmente solutos, por ejemplo sales. En una realización, la composición está en forma de composición liofilizada. Una composición liofilizada se puede obtener liofilizando una composición acuosa respectiva.

La presente enseñanza se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos que no deben interpretarse como limitantes del alcance de la enseñanza.

Figuras

Figura 1: Activación de células inmunes esplénicas, liberación de citocinas y expresión de proteína después de la administración de luciferasa-ARN complejado con liposomas F12. Se inyectaron ratones BALB/c (n = 7) por vía intravenosa en el plexo retroorbital con l0 |jg de ARNm-LPX de LUC no inmunogénico y se investigaron 24 horas después (A) para determinar el estado de maduración de las células dendríticas (n = 3) (revelado por sobrerregulación de CD86), células T, células B y células NK (reveladas por sobrerregulación de CD69). Seis horas después de la inyección de ARNm-LPX en ratones BALB/c (B) se evaluó la concentración en suero de IFNa. (C) Determinación de la actividad luciferasa in vivo 6, 24, 48 y 72 h después de la inyección de ARNm-LPX en ratones BALB/c (n = 4) de ARN luciferasa mediante imágenes de bioluminiscencia in vivo. Los datos se representan como la media ± DE de n = 3 ratones/grupo. LLOD = límite inferior de detección.

Figura 2: Análisis de transferencia de puntos de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico purificado mediante tratamiento con celulosa o purificación por HPLC. Tiempo de exposición 20 seg.

Figura 3: La presentación del antígeno MOG35-55 por las DC induce tolerancia a la EAE. La EAE se indujo activamente mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (días 0 y 2) en ratones C57BL/6. Se inyectó por vía intravenosa ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, purificado por celulosa o por método de HPLC, en el plexo retroorbital el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE. Los ratones de control recibieron NaCl 150 mM. Los datos se representan como la media. n = 6 ratones/grupo.

Figura 4: La presentación del antígeno MOG35-55 por APC induce la proliferación de células T específicas de antígeno. Se transfirieron adoptivamente células T no modificadas, marcadas con violeta CellTrace (CTV), Thy1.1 2D2+ CD4+ a ratones de control C57BL/6 Thy1.2+. Al día siguiente, los ratones se inmunizaron con 10, 20 o 40 mg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico. Los ratones de control se trataron con 20 mg de ARNm de control irrelevante no inmunogénico. Un segundo grupo de control recibió además NaCl 150 mM. 4 días después, se sacrificaron los ratones y se analizó el bazo para determinar la proliferación de células Thy1.1+. Los datos se representan como una media de ± DE de n = 3 ratones/grupo.

Figura 5: Supresión in vitro de la proliferación de células T MOG35-55 por células Treg específicas de antígeno inducidas. (A, B) Se inmunizaron ratones 2D2 Foxp3-eGFP 4 veces (d0, d3, d6, d9) con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico. Los ratones de control se trataron con ARNm que codifica MOG35-55 inmunogénico o ARNm de control irrelevante no inmunogénico. Un tercer grupo de control recibió además NaCl 150 mM. Cuatro días después del último tratamiento con ARNm, los ratones fueron sacrificados y se analizaron células CD4+ específicas de MOG35-55 para la expresión de Foxp3-eGFP (C). Células de cada grupo de tratamiento (supresores) se cocultivaron con células T CD4+ 2D2 marcadas con CTV de ratones sin tratamiento previo (células que responden) y reestimularon in vitro con BMDC cargadas con péptido MOG35-55 durante 72 h. La proliferación de células que responden se determinó mediante dilución de Ct V por FACS (controlado en células CTV+). La capacidad inhibidora de las células supresoras se midió en 4 proporciones diferentes a las células que responden. Los datos se representan como una media de ± DE de n = 4 ratones/grupo. El análisis estadístico de la frecuencia de las células CD4+ Foxp3+ se evaluó mediante ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Tukey, *** p < 0.001.

Figura 6: La presentación del antígeno MOG35-55 por las DC induce tolerancia a la EAE. La EAE se indujo activamente mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (días 0 y 2) en ratones C57BL/6. El ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, así como el ARNm irrelevante no inmunogénico, se inyectaron por vía intravenosa en el plexo retroorbital el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE. Los ratones de control recibieron NaCl 150 mM. Los datos se representan como la media. n = 6-8 ratones/grupo. El análisis estadístico de la puntuación de EAE máxima de cada ratón por grupo se determinó mediante ANOVa de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey. Se utilizó el área bajo la curva (AUC) para determinar la significancia estadísticamente a través de ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Tukey de las diferentes curvas de desarrollo de la enfermedad EAE.

Figura 7: La presentación del antígeno MOG35-55 por las DC induce tolerancia a la EAE en un entorno terapéutico real. La EAE se indujo activamente mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (días 0 y 2) en ratones C57BL/6. El ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, así como el ARNm irrelevante no inmunogénico, se inyectaron por vía intravenosa en el plexo retroorbital después de que los ratones alcanzaran una puntuación de EAE de 1-2. Los ratones de control recibieron NaCl 150 mM. Los datos se representan como la media. n = 6-9 ratones/grupo. El análisis estadístico de la puntuación de EAE máxima de cada ratón por grupo se evaluó mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey. El área bajo la curva (AUC) se utilizó para determinar la significación estadística mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey de las diferentes curvas de desarrollo de la enfermedad EAE.

Figura 8: La presentación de antígenos por DC induce tolerancia a la EAE. Se indujo activamente EAE mediante inmunización con MOG35-55-CFA en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 20 |jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico o NaCl 150 mM. El día 16 después de la inducción de la enfermedad, se tomaron órganos de ratones afectados por EAE y tratados con ARNm y se cultivaron en presencia del péptido MOG35-55 durante 6 h en presencia de Brefeldina A. La expresión de CD40L se examinó mediante tinción con citocinas intracelulares de células T CD4+ CD44+. Los datos se representan como la media ± DE de n = 4 ratones/grupo. El análisis estadístico de las células T efectoras CD4+ se evaluó mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey, * p < 0.05.

Figura 9: Las células Th1 y Th17 específicas del péptido MOG35-55 se reducen significativamente en ratones tratados terapéuticamente (día 7/día 10). Se indujo activamente EAE mediante inmunización con MOG35-55-CFA en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico o NaCl 150 mM. El cerebro y la médula espinal se recogieron el día 16 después de la inducción de EAE y las células se reestimularon in vitro en presencia del péptido MOG35-55 durante 6 h en presencia de Brefeldina A. A continuación, se analizaron las células T CD4+ para determinar su expresión de IPNy y se calcularon IL-17A mediante tinción con citocinas intracelulares y los porcentajes de la células T CD4+ IFNy+ e IL-17A+. Los datos se representan como la media ± DE de n = 4 ratones/grupo. El análisis estadístico se evaluó mediante ANOVA de una vía y prueba de comparación múltiple de Tukey, * p < 0.05.

Figura 10: Activación de células inmunes esplénicas y liberación de citocinas después de la administración de diferentes mezclas de ARNm de MOG35-55 de ARNm no inmunogénico (m1Y) e inmunogénico (U) complejado con liposomas F12. Se inyectaron ratones C57BL/6 por vía intravenosa en el plexo retroorbital con 20 |jg de ARNm-LPX MOG35-55 total y se investigó 24 horas después para determinar el estado de maduración de las células dendríticas (revelado por la sobrerregulación de CD86), células T y células NK (revelado por sobrerregulación de CD69). Seis horas después de la inyección de ARNm-LPX en ratones C57BL/6, se evaluó la concentración en suero de IFNa. Los datos se representan como la media ± DE de n = 3 ratones/grupo.

Figura 11: Análisis de transferencia de puntos de diferentes mezclas de ARNm de MOG35-55 de ARNm no inmunogénico e inmunogénico. Tiempo de exposición 20 seg. La línea discontinua se establece como el 100% de la intensidad del punto para 320 pg de ARNbc.

Figura 12: El ARNm de MOG35-55 no inmunogénico induce tolerancia total a la EAE. La EAE se indujo activamente mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (días 0 y 2) en ratones C57BL/6. Se inyectaron intravenosamente diferentes mezclas de ARNm codificantes de MOG35-55 no inmunogénico (m1Y) e inmunogénico (U) en el plexo retroorbital el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE. Los ratones de control recibieron NaCl 150 mM. Los datos se representan como la media. n = 6-8 ratones/grupo. El análisis estadístico de la puntuación de EAE máxima de cada ratón por grupo se evaluó mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey, ** p < 0,01.

Figura 13: La modificación de nucleósidos sola no induce una pérdida de reconocimiento. Activación de las células inmunes esplénicas y liberación de citocinas después de la administración de diferentes ARNm modificados con nucleósidos complejados con liposomas F12. Se inyectaron ratones C57BL/6 por vía intravenosa en el plexo retroorbital con 10 jg de ARNm-LPX total y 24 horas después se investigó el estado de maduración de las células dendríticas (revelado por la sobrerregulación de CD86), células T y células NK (revelado por sobrerregulación de CD69). Seis horas después de la inyección de ARNm-LPX en ratones C57BL/6, se evaluó la concentración en suero de IFNa. Los datos se representan como la media ± DE de n = 3 ratones/grupo.

Figura 14: El tratamiento de ARNm-LPX que codifica MOG35-55 no inmunogénico no conduce a la expansión de células efectoras CD4+ específicas de antígeno. Se trataron ratones C57BL/6 sin tratamiento previo el día 0, 3, 7 y 10 con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico. Los ratones de control se trataron con 20 jg de ARNm de control irrelevante no inmunogénico. Un segundo grupo de control recibió NaCl 150 mM. El día 13 después del primer tratamiento con ARNm, se sacrificaron los ratones y se analizaron los esplenocitos para determinar la secreción de citocinas pro y antiinflamatorias mediante ELISpot (A) de IFNy y la detección de citocinas mediante ELISA Múltiplex en el sobrenadante de células reestimuladas con péptido MOG35-55. (B y C). Los datos se representan como la media ± DE de n = 4-5 ratones/grupo.

Figura 15: Las moléculas coinhibidoras se regulan positivamente tras el tratamiento con ARNm-LPX no inmunogénico que codifica MOG35-55. Se trataron ratones C57BL/6 sin tratamiento previo el día 0, 3, 7 y 10 con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico. Los ratones de control se trataron con 20 jg de ARNm de control irrelevante no inmunogénico. Además, un segundo grupo de control recibió NaCl 150 mM. El día 13 después del primer tratamiento con ARNm, se sacrificaron los ratones y se analizaron las células T CD4+ MOG35-55 del bazo mediante citometría de flujo para determinar la sobrerregulación de las moléculas coinhibidoras. Los datos se representan como la media ± DE de n = 4-5 ratones/grupo. El análisis estadístico se evaluó mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Figura 16: La vacunación terapéutica con ARNm-LPX que codifica MOG35-55 no inmunogénico reduce la infiltración de linfocitos en el SNC. Se transfirieron adoptivamente células T CD4+ 2D2 Thy1.1+ sin tratamiento previo a ratones Thy1.2 C57BL/6 en d-1. La EAE se indujo activamente al día siguiente mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (días 0 y 2) y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 20 jg de MOG35-55 no inmunogénico. ARNm codificante, 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o NaCl 150 mM. El día 16 después de la inducción de la enfermedad, se tomaron órganos de ratones tratados de forma diferente. Se examinó la infiltración de células específicas Thy1.1 CD4+ MOG35-55 y se determinó el número total de células infiltrantes mediante citometría de flujo utilizando tubos TrucountMR. Los datos se representan como la media ± DE de n = 4 ratones/grupo. El análisis estadístico de células T efectoras CD4+ infiltradas se evaluó mediante ANOVA unidireccional y la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Figura 17: Las células Th1 y Th17 específicas de MOG35-55 se reducen significativamente en ratones tratados terapéuticamente (día 7/día 10). Se indujo activamente EAE mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (día 0 y 2) en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o NaCl 150 mM. El cerebro y la médula espinal se recogieron el día 16 después de la inducción de EAE y las células se reestimularon in vitro en presencia del péptido MOG35-55 durante 6 h en presencia de Brefeldina A. Las células T CD4+ se analizaron luego mediante citometría de flujo para determinar su expresión de IFNy e IL-17A mediante tinción de citocinas intracelulares y se calcularon los porcentajes de IFNy+ e IL-17A+ de células T CD4+. Los datos se representan como la media ± DE de n = 4 ratones/grupo. El análisis estadístico se evaluó mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Figura 18: Las moléculas coinhibidoras se regulan positivamente en células T CD4+ específicas de MOG35-55 tras un tratamiento exitoso de ARNm-LPX específico de MOG35-55 no inmunogénico. Se indujo activamente EAE mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (día 0 y 2) en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 20 |jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o NaCl 150 mM. El día 16 después de la inducción de la enfermedad, se diseccionaron los bazos de los grupos tratados de manera diferente. Se aislaron células T CD4+ específicas de MOG35-55 mediante MACS específico de tetrámero y se analizaron fenotípicamente mediante citometría de flujo mediante tinción con tetrámero. Los datos se representan como la media ± DE de n = 4 ratones/grupo. El análisis estadístico se evaluó mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey.

Figura 19: Se requieren PD-1 y CTLA-4 para el mantenimiento de la tolerancia específica de antígeno inducida por ARNm no inmunogénico. Se indujo activamente EAE mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (día 0 y 2) en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico o 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico (n = 8 ratones/grupo). Los ratones tratados con ARNm se trataron concomitantemente con anticuerpos bloqueantes anti-PD-1 o anti-CTLA-4 o controles de IgG correspondientes. El desarrollo de EAE se evaluó mediante un seguimiento diario del estado de salud. Se utilizó el área bajo la curva de EAE (AUC) para determinar la significación estadística mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey de las diferentes curvas de desarrollo de la enfermedad.

Figura 20: La inducción de tolerancia específica de antígeno por tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico es independiente del modelo de enfermedad de EAE. (A) La vacunación terapéutica con ARNm-LPX que codifica PLP139-151 no inmunogénico induce tolerancia a la EAE remitente-recidivante. La EAE se indujo activamente mediante inmunización con PLP139-151-CFA (día 0) y toxina pertussis (días 0 y 2) en ratones SJL. Se inyectaron 20 jg en forma iv de ARNm que codifica PLP139-151 no inmunogénico así como ARNm irrelevante no inmunogénico en el plexo retroorbital 2 veces por semana a partir del día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE. (B) La vacunación terapéutica con ARNm-LPX que codifica múltiples epítopos no inmunogénicos induce tolerancia en un EAE complejo. La EAE se indujo activamente mediante inmunización con MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191, MBP84-104 y MOBP15-36-CFA (día 0) y toxina pertussis (día 0 y 2) en ratones híbridos F1 de C57BL/6 y SJL/JRj. Se inyectaron 40 jg en forma iv de ARNm que codifica múltiples epítopos no inmunogénicos, 20 jg de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico y 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico en el plexo retroorbital 2 veces por semana a partir del día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE. El desarrollo de EAE se evaluó mediante un seguimiento diario del estado de salud. Los datos se representan como la media. n = 6-8 ratones/grupo. Se utilizó el área bajo la curva (AUC) de EAE para determinar la significación estadística mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey de las diferentes curvas de desarrollo de la enfermedad.

Figura 21: La coadministración de citocinas mediante ARNm no inmunogénico mejora la potencia tolerogénica del tratamiento con ARNm-LPX no inmunogénico específico de antígeno en el modelo eA e . La EAE se indujo activamente mediante inmunización con MOG35-55-CFA (día 0) y toxina pertussis (día 0 y 2) en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con 5 jg de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico junto con 15 jg de ARNm de mIL-10 (A) o mIL-27 (B) no inmunogénico, respectivamente. Los ratones de control recibieron 5 jg de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico junto con 15 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico, 15 jg de ARNm que codifica citocinas no inmunogénico o 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico. El desarrollo de EAE se evaluó mediante un seguimiento diario del estado de salud. Los datos se representan como la media. n = 6-8 ratones/grupo. Se utilizó el área bajo la curva de EAE (AUC) para determinar la significación estadística mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey de las diferentes curvas de desarrollo de la enfermedad.

Ejemplos

Ejemplo 1: Material y métodos

Animales

Se adquirieron ratones C57BL/6, BALB/c, SJL/JRj de tipo silvestre y ratones híbridos F1 de C57BL/6 y SJL/JRj de ENVIGO RMS gmbH, Países Bajos y Janvier Laboratories, Francia, respectivamente. Los ratones C57BL/6 transgénicos Thy1.1+ 2D2 TCR MOG, que expresan un receptor de células T que reconoce MOG35-55 en el contexto del MHC clase II (I-Ab), así como los ratones transgénicos c 57BL/6 Thy1.1+ 2D2 Foxp3-eGFP TCR MOG que además incluyen el gen Foxp3-eGFP, fueron amablemente proporcionados por el laboratorio del Prof. Dr. Ari Waisman. Se utilizaron animales de la misma edad y sexo a lo largo de los experimentos y los ratones se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos (SPF) en las instalaciones para animales de BioNTech AG Mainz.

Constructos de ARN y transcripción in vitro

La transcripción in vitro de LUC-ARNm se basó en la cadena principal del plásmido pST1-hAg-CDS-FI-A30LA70, que contiene una UTR de alfa globina humana 5' (hAg), un elemento FI 3' y una cola de poli(A) de 100 nucleótidos, con un enlazador después de 30 nucleótidos. El constructo de LUC contiene el gen de luciferasa de luciérnaga. Los constructos MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 y MBP84-104 se diseñaron basándose en la misma cadena principal de plásmido (pST1-hAg-FI-A30LA70) y además contenían una secuencia mmsec(opt) y mmMITD(opt) antes y después de las secuencias codificantes de MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 y MBP84-104 (pST1-hAg-mmsec (opt)-CDS-mmMITD(opt)-A30LA70), respectivamente. La adición de un péptido guía y una señal de trato del MHC (MITD) mejora fuertemente la presentación de antígenos por APC (Kreiter, S. et al., 2007, J. Immunol. 180, 309-318). Todas las secuencias de antígeno contienen adicionalmente siete aminoácidos flanqueantes antes y después del epítopo relevante de la enfermedad para facilitar la presentación del antígeno. La glicoproteína de oligodendrocitos de mielina de secuencia de antígeno (MOG) tiene la secuencia peptídica: MOG27-63: SPGKNATGMEVGWYRSPFS-RVHLYRNGKDQDAEAQP. Para la proteína proteolípida del péptido de mielina de ratón PLP139-151 también se añadieron siete aminoácidos flanqueantes para una mejor presentación del péptido (PLP131-159: AHSLERVCHCLG-KWLGHPDKFVGITYALT). La proteína proteolípida PLP178-191 incluye los aminoácidos PLP170-199: AVPVYIYFN-TWTTCQSIAFPSKTSASIGSL y la proteína básica de mielina (MBP) 84-104 incluye los aminoácidos MBP76-112: RTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGLSLSRFS. Para la inmunización de control con ARNm, se utilizó un vector vacío, que no codifica una secuencia de antígeno específica (pST2-hAg-mmsec(opt)-vacío-mmMITD(opt)-2hBg-A30LA70). También se sintetizaron ARNm que codifican citoquinas para la interleucina 10 murina (mIL-10) y la interleucina 27 murina (mIL-27) basándose en la cadena principal del plásmido pST1-hAg-CDS-FI-A30LA70. El ARN se generó mediante transcripción in vitro como describen Kreiter et al., 2007 (Cancer Immunol. Immunother. 56, 1577 87). El ARNm purificado se eluyó en H2O y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. La transcripción in vitro de todos los constructos de ARNm descritos fue llevada a cabo por BioNTech RNA Pharmaceuticals GmbH.

Generación de ARNm no inmunogénico

Para generar el ARNm no inmunogénico usado, se utilizó 1-metil-pseudouridina durante la transcripción in vitro en lugar del nucleósido uridina normal, y el ARNm se purificó adicionalmente mediante HPLC o tratamiento con celulosa. Para la purificación por HPLC se adaptó el protocolo de Weissman et al., 2013 (Methods Mol Bio. 969, 43-43), y se realizó la elución del ARNm con un gradiente de 38%-70% de tampón B. De todos los ARNm generados se realizaron controles de calidad (Bioanalyser y análisis de transferencia de puntos) para asegurar la pureza e integridad del ARNm. Para generar el ARNm inmunogénico usado, se utilizó el nucleósido normal Uridina para la transcripción in vitro y el ARNm no se purificó más mediante HPLC o tratamiento con celulosa.

Para investigar la influencia de la purificación por HPLC o el tratamiento con celulosa sobre la activación de esplenocitos, se usó ARNm modificado con pseudouridina (pU-ARNm), que recibió una purificación adicional por HPLC (ARNm de pU-HPLC) o no. El ARNm correspondiente se generó como ya se describió.

Análisis de transferencia de puntos para el control de calidad del ARNm de TIV

Se analizó el ARNm transcrito, modificado y purificado por HPLC in vitro en busca de ARNm bicatenario (ARNbc) mediante transferencia de puntos. Se cargó 1 |jg de diferentes constructos de ARNm en una membrana NYTRAN SPC (GE Healthcare), se bloqueó y luego se incubó con anticuerpo J2 (SCICONS English y Scientific Consulting) para la detección de ARNbc. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti-ratón conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) y se analizaron las membranas con un BioRad ChemiDoc.

Preparación e inyección de ARN-lipoplejos

Se prepararon ARN-lipoplejos (ARN-LPX) en condiciones estériles y libres de RNasa. Se utilizó HEPES (10 mM)/EDTA (0,1 mM) para diluir el ARN hasta una concentración de 1 mg/ml. Se añadió NaCl 1,5 M (solución madre de NaCl 5 M; Ambion) hasta un volumen específico de ARN para obtener una concentración final de NaCl 150 mM. Después de agitar brevemente con agitación tipo vórtice, se agregó un volumen específico de liposomas F12 y la mezcla de ARN-liposomas (RNA-LPX) se volvió a agitar brevemente con agitación tipo vórtice y finalmente se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir la formación de ARN-LPX (Kranz et al. 2016, Nature 16, 396-401). Se inyectaron 200 j l de solución de ARN-LPX por ratón por vía intravenosa en el plexo retroorbital de los ratones.

Análisis de citometría de flujo

Se adquirieron anticuerpos intracelulares y de superficie de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) a través de eBioscience o BD Pharmingen y se usaron de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los anticuerpos utilizados fueron los siguientes: CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD4, CD44, CD40L, CD49b, CD69, CD8, CD86, CD90.1, Foxp3. ICOS, IPNy, IL-17A, Lag-3, PD-1, TIGIT y Tim-3.

Se tiñeron suspensiones de células individuales de diferentes órganos durante 30 min a 4 °C para marcadores extracelulares. Para la tinción de citocinas intracelulares de IFNy, IL-17A y CD40L, las células se aislaron como se describió y adicionalmente se estimularon en medio de cultivo que contenía péptido MOG35-55 (concentración 15 jg/ml), Monensina (GolgiStop, BD-Bioscience) y Brefeldina A en 37 °C, 5% de CO2 durante 6 h. Después de realizar la tinción de vivas-muertas (tinte de viabilidad eFluor® 506, eBioscience) y la tinción de marcadores de superficie celular, las células se fijaron y permeabilizaron usando Cytofix/Cytoperm y tampón Perm/Wash de BD Biosciences de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se incubaron durante 30 min a 4 °C con anticuerpos intracelulares y se lavaron dos veces en Perm/Wash antes del análisis FACS. Las muestras se adquirieron en un BD LSR Fortessa o BD FACS Canto II y se analizaron con el software FlowJo 7.6.5 o FlowJo 10.4 (Tree Star).

Para la tinción intracelular de Foxp3, se utilizó el juego de tampones de tinción del factor de transcripción Foxp3 (Thermo Fisher Scientific) para la fijación y permeabilización. Todas las etapas se realizaron de acuerdo con la recomendación del fabricante después de la tinción extracelular.

Se detectaron células T CD4+ específicas de MOG35-55 mediante tinción con tetrámero. El tetrámero de pMHC de clase II conjugado con APC específico de MOG35-55 se obtuvo de las instalaciones centrales de tetrámero de los Institutos Nacionales de Salud. Se incubaron suspensiones de células individuales de esplenocitos de ratón con tetrámero conjugado con APC MOG35-55 durante 1 h a temperatura ambiente en medio DC completo (para la composición del medio véase "Generación de DC derivadas de médula ósea (BMDC)"). Las células se lavaron y se tiñeron anti-APC y se realizaron MACS subsiguientes. Las células se incubaron con anticuerpos extracelulares o intracelulares como se describió anteriormente.

Para la determinación de los recuentos absolutos de células específicas de CD4+ MOG35-55 (células T CD4+ 2D2 Thy1.1+) en el bazo, el cerebro y la médula espinal, se utilizaron tubos TrucountMR (BD Biosciences). Las suspensiones de células individuales se tiñeron como se describió anteriormente, posteriormente se transfirieron a tubos TrucountMR y se determinaron los recuentos absolutos de células mediante citometría de flujo.

Imágenes de bioluminiscencia in vivo (BLI)

Se investigó la eficacia de traducción de ARNm no inmunogénico en células del bazo usando el sistema de formación de imágenes in vivo Xenogen IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). 6 h, 24 h, 48 h y 72 h después de la inmunización con ARN-LPX de LUC-ARNm no inmunogénico, los ratones se inyectaron en forma ip con una solución acuosa de D-luciferina (250 pl, 1,6 mg en PBS) (BD Biosciences). Después de 5 minutos, las intensidades de la señal del bazo se definieron y midieron mediante bioluminiscencia in vivo en regiones de interés (ROI) y se cuantificaron como flujo total (fotones/seg) utilizando el software IVIS Living Image 4.0. El tiempo de adquisición fue de 1 min en binning 4. Durante la formación de imágenes bioluminiscentes de los ratones vivos, los ratones se anestesiaron con una dosis de una mezcla de isoflurano/oxígeno al 2,5%. La intensidad de la señal LUC de los fotones emitidos de animales vivos se representó como una imagen en escala de grises, en la que el negro es la señal de bioluminiscencia menos intensa y el blanco la más intensa. Las imágenes de ratones se analizaron utilizando el software IVIS Living Image.

Clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)

Células T CD4+ 2D2 Thy1.1+ de ratones C57BL/6 transgénicos Thy1.1+ 2D2 TCR MOG o ratones C57BL/6 transgénicos Thy1.1+ 2D2 Foxp3-eGFP TCR MOG, se aislaron del bazo y los ganglios linfáticos mediante selección positiva utilizando MACS (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células T CD4+ se purificaron usando microperlas CD4 (L3T4).

Las células T CD4+ específicas de MOG35-55 se enriquecieron con MACS después de la tinción con tetrámero de pMHC clase II conjugado con APC específico de MOG35-55 usando microperlas anti-APC. El enriquecimiento se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Generación de DC derivadas de la médula ósea (BMDC)

Se extrajeron células de médula ósea (BM) de fémur y tibia de ratones C57BL/6 y se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos a 37 °C en medio RPMI 1640 GlutaMAX-I (Gibco) suplementado con FBS al 10% (Biochrom), piruvato de sodio al 1% 100x (Gibco), MEM NEAA al 1% 100x (Gibco), penicilina-estreptomicina al 0,5% (Gibco), 2-mercaptoetanol 50 pM (Life Technologies) y 1000 U/ml de factor de diferenciación de células dendríticas (DC) del factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) (Peprotech). El día 6, se preincubaron 2 x 106 DC/ml durante 3 horas a 37 °C con péptido MOG35-55 (15 pg/ml) y luego se cocultivaron con células T en un volumen total de 200 pl de medio en una placa de 96 pocillos.

Ensayo de supresión de Treg in vitro

Para estudios de supresión de Treg in vitro, se cocultivaron células T CD4+ 2D2 transgénicas (Thy1.1+) (3 x 104 células por pocillo) marcadas con CTV (kit de proliferación celular CellTrace Violet, Thermo Fisher Scientific) con células T transgénicas CD4+ 2D2-Foxp3-eGFP aisladas y marcadas con CFSE (5 pM) de ratones inmunizados repetidamente con ARNm en diferentes proporciones de células T supresoras y respondedores 2D2 (1:1, 2:1, 4:1, 8:1). Los ratones 2D2-Foxp3-eGFP se inyectaron por vía intravenosa en el plexo retroorbital el día 0, el día 3, el día 6 y el día 9 con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico e inmunogénico, así como con ARNm y solución salina irrelevantes no inmunogénicos. La proliferación de células T 2D2 respondedoras marcadas con CTV se analizó mediante citometría de flujo 72 horas después de la reestimulación con BMDC cargadas con péptido MOG35-55 (concentración final 15 pg/ml de péptido MOG35-55).

Transferencia de células T adoptivas y ensayo de proliferación in vivo

Para los estudios de proliferación, las células T CD4+ 2D2 transgénicas enriquecidas (Thy1.1+) se marcaron con CTV (kit de proliferación celular CellTrace Violet, Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se contaron y se inyectaron 7 x 106 células en forma iv en el plexo retroorbital en 200 pl de PBS en ratones receptores C57BL/6 (Thy1.2+) sin tratamiento previo bajo anestesia. Al día siguiente, se inmunizaron ratones C57BL/6 con 10, 20 o 40 pg de ARNm no inmunogénico que codifica el epítopo MOG35-55. Los ratones de control recibieron 20 pg de ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. Cuatro días después de la transferencia de células T, se sacrificaron los ratones y se analizó la proliferación de las células mediante citometría de flujo.

Para la determinación del recuento absoluto de células T específicas de CD4+ MOG35-55 en el bazo, el cerebro y la médula espinal, así como el análisis fenotípico de estas células después del tratamiento exitoso con ARNm el día 7 y el día 10 de ratones EAE, se aislaron células T CD4+ transgénicas 2D2 (Thy1.1+) de ratones C57BL/6 transgénicos Thy1.1 2D2 TCR MOG, enriquecidas para células CD4 por MACS y se obtuvieron 7-10 x 106 células en 200 pl de PBS inyectado en forma iv en el plexo retroorbital en ratones receptores C57BL/6 (Thy1.2+) sin tratamiento previo bajo anestesia usando un vaporizador de oxígeno-isoflurano (isoflurano/oxígeno al 2,5%). Al día siguiente, se indujo activamente EAE en ratones C57BL/6.

ELISA

La detección de IFN-a de ratón se realizó mediante ELISA (PBL) 6 horas después de la inmunización con ARN en sueros de ratón usando un ensayo ELISA estándar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las citocinas Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 y Treg presentes en los sobrenadantes de cultivos celulares de esplenocitos reestimulados de ratones tratados repetidamente con ARNm se cuantificaron usando un kit de ensayo ELISA de ratón 17-plex (Thermo Fisher Scientific). Se estimularon suspensiones de células individuales de esplenocitos (5 x 105 células) aisladas de ratones durante 72 horas con 0, 5, 10, 20 o 100 pg/ml de péptido MOG35-55, y se analizó el contenido de citocinas de los sobrenadantes.

Ensayo de mancha inmune ligada a enzimas de IFNy (ELISpot)

Las frecuencias de las células T que responden a MOG35-55 se examinaron mediante ELISpot de interferón y (IFNy). Los ratones se trataron los días 0, 3, 7 y 10 con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico, ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. El día 13 después del primer tratamiento, se aislaron bazos de diferentes grupos de tratamiento y se prepararon suspensiones de células individuales. Las células T CD4+ se purificaron mediante MACS usando microperlas CD4 (L3T4). La cuantificación de las células T específicas de antígeno que responden a IPNy se realizó tras la reestimulación con el péptido MOG35-55 usando el kit de ELISpot. Se recubrieron placas ELISpot de 96 pocillos (placa de filtro IP MultiScreenHTS, Merck Millipore) durante la noche con anticuerpo de captura específico de IFNy (anticuerpo anti-IFNY de ratón, Mabtech). Después del bloqueo con medio completo, se lavaron las placas y se sembraron en placa 5 x 105 células T CD4+junto con 1 x 105 BMDC cargadas con péptido MOG35-55 (concentración de péptido 15 pg/ml). Como control, se incubaron células T CD4+ con BMDC cargadas con péptidos irrelevantes. Todas las células se cultivaron durante 16 horas en una incubadora humidificada con CO2 al 5% a 37 °C. Las células se lavaron e incubaron durante 2 horas a 37 °C y CO2 al 5% con el anticuerpo de detección anti-IFNy biotinilado (anticuerpo biotinilado anti-IFNY de ratón, Mabtech). Este anticuerpo secundario se visualizó agregando ExtrAvidinfosfatasa alcalina (Sigma) y después de la incubación durante 1 hora, se agregó sustrato líquido BCIP/NBT (Sigma) y la reacción se detuvo después de 1-3 min enjuagando la placa con agua corriente. La cuantificación de las manchas se realizó en un lector de ELISpot (S6 Macro Analyzer; c Tl ).

Inducción de EAE y tratamiento de ratones con ARNm

Se indujo activamente EAE en ratones hembra C57BL/6 de ocho a diez semanas de edad con 50 pg de péptido MOG35-55 (secuencia de aminoácidos: MEVGWYRSPFSRVHLYRNGK) emulsionado en CFA (Difco Laboratories) suplementado con 10 mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37RA inactivado por calor (Difco Laboratories) por vía subcutánea (sc) en la base de la cola. Los ratones recibieron 150 ng de toxina pertussis (List Biological Laboratories, INC., Campbell, CA) por vía intraperitoneal (ip) el día de la inmunización y 2 días después. Los ratones se pesaron y puntuaron diariamente comenzando el día 10 después de la inmunización de acuerdo con los siguientes criterios: 0, sin enfermedad; 1, tono de cola disminuido; 2, reflejo de enderezamiento alterado; 3, parálisis parcial de las patas traseras; 4, parálisis completa de las patas traseras; 5, parálisis de las extremidades posteriores con parálisis parcial de las extremidades anteriores; y 6, moribundo o muerto.

Además, la EAE se indujo activamente en ratones hembra SJL/JRj (8-10 semanas) con 200 pg de péptido PLP139-151 (secuencia de aminoácidos: HSLGKWLGHPDKF) emulsionado en CFA suplementado con 10 mg/ml de H37RA de Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor por vía sc en la base de la cola. Los ratones recibieron 200 ng de PTX ip el día de la inmunización y 2 días después. Los ratones se pesaron y puntuaron diariamente a partir del día 8 después de la inmunización de acuerdo con los criterios de puntuación ya descritos.

Se indujo activamente un EAE compleja en ratones híbridos F1 hembra de C57BL/6 y SJL/JRj (8-10 semanas) con 250 pg de mezclas de péptidos (MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 (secuencia de aminoácidos: NTWTTCQSIAFPSK), MBP84-104 (secuencia de aminoácidos: VHFFKNIVTPRTPPPSQGKGR), MOBP15-36 (secuencia de aminoácidos: QKFSEHFSIHCCPPFTFLNSKR)). De cada péptido se utilizaron 50 pg. La mezcla de péptidos se emulsionó en CFA suplementado con 10 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra inactivado por calor y se inyectó sc en la base de la cola. Los ratones recibieron 200 ng de PTX ip el día de la inmunización y 2 días después. Los ratones se pesaron y puntuaron diariamente a partir del día 8 después de la inmunización de acuerdo con los criterios de puntuación ya descritos.

Para determinar la inmunidad protectora en ratones C57BL/6, los ratones se trataron el día 7 y el día 10 o con una puntuación de EAE de 1-2 después de la inducción de la enfermedad con 20 |jg de ARNm de control que codifica MOG35-55 no inmunogénico, 20 jg de ARNm de control irrelevante no inmunogénico o solución salina.

El tratamiento terapéutico de EAE remitente-recurrente en ratones SJL se realizó con 20 jg de ARNm de PLP139-151 no inmunogénico 2 veces por semana comenzando desde el día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE. Los ratones de control recibieron 20 jg de ARNm de control irrelevante no inmunogénico.

En experimentos que compararon el tratamiento con ARNm de un solo epítopo no inmunogénico con el tratamiento con múltiples epítopos no inmunogénicos, se trataron ratones con EAE compleja con 40 jg de ARNm que codifica múltiples epítopos no inmunogénicos (10 jg de cada ARNm que codifica un epítopo no inmunogénico (MOG35 -55, PLP139-151, PLP178-191, MBP84-104), 20 jg de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico o 20 jg de ARNm de control irrelevante no inmunogénico. Se inyectó ARNm 2 veces por semana a partir del día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE.

Para probar los efectos combinatorios del ARNm que codifica citocinas y el tratamiento con ARNm específico de antígeno, se inyectaron 5 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico junto con 15 jg de ARNm que codifica mIL-10 o mIL-27 no inmunogénico el día 7 y día 10 después de la inducción de EAE. Los ratones de control recibieron 5 jg de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico junto con 15 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico, 15 jg de ARNm que codifica citocinas no inmunogénico o 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico.

Para todos los experimentos se inyectó ARNm iv en el plexo retroorbitario bajo anestesia usando un vaporizador de oxígeno-isoflurano (2,5% de isoflurano/oxígeno).

Tratamiento con anticuerpos

Se trataron ratones C57BL/6 con PD-1 (primer tratamiento 500 jg , 250 jg los siguientes tratamientos, clon RMP1-14, BioXcell) o CTLA-4 (primer tratamiento 500 jg , 250 jg los siguientes tratamientos, clon 9H10, BioXcell) de bloqueo de anticuerpos o anticuerpos de control de isotipo coincidente (IgG2a de rata e IgG de hámster sirio, BioXCell) los días 7, 10, 14 y 17 después de la inducción de EAE. Los anticuerpos se diluyeron en PBS y se aplicaron en forma ip.

Aislamiento de infiltrados esplénicos, LN y SNC

Todos los análisis basados en células se realizaron en suspensión de células individuales de bazo, ganglios linfáticos y órganos del SNC. En resumen, los bazos y los LN se incubaron con 1 mg/ml de colagenasa D y 0,1 mg/ml de DNasa I durante 15 min y luego se machacaron a través de un colador de células de 70 jm mientras se enjuagaba con PBS. La lisis de eritrocitos (tampón de lisis hipotónico: 1 g de KHCO3 y 8,25 g de NH4Cl disueltos en 1 litro de H2O y 200 j l de EDTA 0,5 M) se realizó en una suspensión de células individuales de esplenocitos. Después de una etapa de lavado adicional con PBS, las células se contaron con el contador de células Vi-Cell (Beckman Coulter).

Para el aislamiento de los infiltrados del SNC del cerebro y la médula espinal, los ratones se anestesiaron con Ketamina-Rompun y se perfundieron con NaCl al 0,9% a través del ventrículo izquierdo del corazón. El cerebro y la médula espinal se extrajeron manualmente, se cortaron en trozos pequeños y se digirieron en PBS++ (PBS con calcio y magnesio, Gibco) que contenía colagenasa D (1 mg/ml) y DNasa I (0,1 mg/ml) durante 20 min a 37 °C. A continuación, el tejido digerido se homogeneizó manualmente aspirando los trozos de tejido con una jeringa y presionando de nuevo contra la pared de un tubo Falcon de 15 ml. Esto se realizó hasta 10 veces, hasta que no se observaron pedazos. La suspensión de células individuales se resuspendió en Percoll al 70% y se colocó en capas bajo un gradiente de Percoll 30:37. El gradiente de Percoll final fue 30:37:70% y se centrifugó a 300 g durante 40 min a temperatura ambiente. La capa de células mononucleares que se encuentra en la interfase entre el 70% y el 37% de Percoll se lavó con FCS/PBS al 2% antes de realizar análisis adicionales.

Análisis estadístico

La significancia estadística se evaluó usando el software GraphPad Prism 7 (Graphpad Software, Inc.) empleando ANOVA de una vía corregido con el factor de prueba de comparación de Tukey cuando se compararon más de dos grupos. Las curvas de desarrollo de EAE se compararon calculando el área bajo la curva (AUC) de desarrollo de la enfermedad para ratones individuales. Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos; * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001. Las pruebas empleadas se mencionan en las respectivas leyendas de las figuras.

Ejemplo 2: Examen de ARNm no inmunogénico con respecto a la activación de esplenocitos

Para analizar la activación de esplenocitos y la eficiencia de traducción del ARNm no inmunogénico usado, se inyectaron ratones BALB/c por vía intravenosa en el plexo retroorbital con luciferasa-ARNm (10 jg ) complejado con liposomas F12. Las actividades de luciferasa se evaluaron mediante imágenes in vivo 6, 24, 48 y 72 horas después de la inyección de ARN-LPX y los ratones representativos se muestran en la Figura 1C. La inmunización de ratones con ARNm no inmunogénico condujo a una alta traducción duradera del LUC-ARNm. En consecuencia, la expresión de la proteína LUC podría detectarse hasta 72 horas después de la inmunización con ARNm.

Además, como se observa en la Figura 1A, la inmunización de ratones con ARNm no inmunogénico no condujo a una sobrerregulación de los marcadores de activación CD86 en DC y CD69 en linfocitos como en ratones de control no tratados. En ratones inmunizados con LUC-ARNm no inmunogénico tampoco se pudo detectar IFNa en la sangre 6 horas después de la inmunización con ARNm (Figura 1B).

Ejemplo 3: Caracterización de ARNm no inmunogénico

Se usa ARNm no inmunogénico para administrar antígenos relevantes para enfermedades específicas a células dendríticas para asegurar la presentación de antígenos sin activación inmune en aplicaciones terapéuticas. Se ha demostrado que la incorporación de 1-metilpseudouridina en el ARNm mejora la expresión de proteínas en las células y reduce la inmunogenicidad del ARNm en líneas celulares de mamíferos, así como in vivo en ratones (Andries et al., 2015, J Control Release. 217, 337-344). Este efecto se basa muy probablemente en la mayor capacidad del ARNm para evadir la activación de los receptores endosomales tipo Toll y la señalización inmune innata posterior (Andries et al., 2015). Además del uso de 1-metilpseudouridina en lugar del nucleósido uridina para la incorporación en el ARNm durante la transcripción in vitro, la purificación por HPLC del ARNm sintético elimina además la activación inmune y mejora la traducción del ARNm que codifica proteínas modificado con nucleósidos (Kariko et al., 2011, Nucleic Acids Res. 39, e142). Mediante la purificación por HPLC, los contaminantes restantes del ARNm bicatenario se eliminan después de la transcripción del ARNm in vitro, lo que da como resultado un ARNm que no induce la señalización del interferón ni las citocinas inflamatorias (Kariko et al., 2011). Un método alternativo para la purificación del ARNm purificado con nucleósidos es la purificación con celulosa (PCT/EP2016/059056).

Para investigar si el ARNm utilizado para la aplicación terapéutica es realmente no inmunogénico, se realizaron análisis con Bioanalyzer y transferencia de puntos para asegurar la integridad y pureza del ARNm. La Figura 2 muestra el análisis de transferencia de puntos de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico purificado mediante tratamiento con celulosa o purificación por HPLC. El anticuerpo J2, específico para ARNbc, no mostró señal después de la purificación con celulosa o HPLC del ARNm de MOG35-55 analizado en un intervalo de 40 ng hasta 1 |jg de ARNm usado. Este control de calidad asegura características de ARNm no inmunogénico, ya que para ambos lotes de ARNm se podrían lograr efectos terapéuticos positivos en el tratamiento de EAE. La EAE se indujo activamente en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de la enfermedad con ARNm no inmunogénico que codifica MOG35-55 específico de antígeno purificado por celulosa o método de HPLC. Ambos grupos fueron completamente resistentes a la inducción de EAE (Figura 3). En los siguientes ejemplos se explicará una descripción más detallada sobre la vacunación terapéutica con ARNm específico de antígeno no inmunogénico.

Ejemplo 4: Efectos de la inmunización de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico sobre la proliferación de células T específicas de antígeno

Para estudiar si la inmunización de ARNm-LPX de MOG35-55 no inmunogénico da como resultado la presentación del antígeno MOG35-55 por las DC a las células T, se investigó la proliferación de células T CD4+ específicas de antígeno (células T CD4+ 2D2) que albergan el receptor de células T específico de la glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG). Las células T CD4+ 2D2 específicas de Thy1.1+ MOG35-55 marcadas con CellTrace Violet (CTV) se transfirieron a ratones C57BL/6 Thy1.2+. Veinticuatro horas más tarde, los ratones receptores fueron inmunizados con diferentes concentraciones (10, 20 o 40 jg de ARNm) de ARNm no inmunogénico que codifica el epítopo MOG35-55 y otros 4 días después se analizaron las células T CD4+ 2D2 específicas de MOG35-55 para determinar su proliferación. Los ratones de control recibieron 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. Las células T 2D2 proliferaron cuando los ratones fueron tratados con ARNm de MOG35-55 no inmunogénicos en comparación con los ratones de control (Figura 4), lo que indica que las células presentadoras de antígeno (APC) traducen y procesan el ARNm no inmunogénico que codifica el antígeno de la manera correcta y presentan el péptido MOG35-55. Además, la inmunización de ratones con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico con dosis crecientes de 10 a 40 jg también mostró un aumento en la población de células T específicas de antígeno.

Ejemplo 5: La inmunización con ARNm no inmunogénico específico de antígeno induce el desarrollo de células T reguladoras en ratones sin tratamiento previo

Las Treg son fundamentales para controlar diversas respuestas inmunitarias y son importantes para la inducción y el mantenimiento de la tolerancia. Los estudios preclínicos en modelos animales muestran que la transferencia adoptiva de las Treg puede prevenir o curar varias enfermedades mediadas por células T, incluidas las enfermedades autoinmunes, al restaurar la tolerancia inmunitaria a los propios antígenos. Se han descrito varias células T reguladoras CD4+ (Shevach, E.M., 2006, Immunity 25, 195-201) y se han categorizado en dos subgrupos principales: las Treg naturales e inducibles, que se generan en la periferia bajo diversas condiciones tolerogénicas. Las células Treg regulan el cebado de las células T autorreactivas limitando su expansión y diferenciación (Sakaguchi, S. et al., 2008, Cell 133, 775-87).

Para investigar más a fondo los efectos de la inmunización con ARNm no inmunogénico específico de antígeno en el fenotipo de célula T correspondiente, se ha transfectado una proteína de fusión 2D2-Foxp3-eGFP en células T de ratones positivos para Th1.1. Estos ratones se inmunizaron repetidamente (d0, d3, d6 y d9) con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico e inmunogénico, así como con ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. La inmunización de los ratones con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico condujo al desarrollo de células Foxp3+ en los ratones, analizadas 4 días después del último tratamiento con ARNm (d13). Los ratones tratados con ARNm específico de antígeno inmunogénico o ARNm no inmunogénico irrelevante no mostraron ningún aumento en la población de células Foxp3 y tenían una frecuencia de células positivas para Foxp3 como los ratones de control tratados con solución salina (Figura 5A y B).

Se evaluó si las células Foxp3+ inducidas actúan como supresoras mediante un ensayo de supresión in vitro (Figura 5C). Por lo tanto, las células CD4+ totales de ratones inmunizados se marcaron con CFSE y se cultivaron conjuntamente durante 72 horas en diferentes proporciones de supresor a respondedor con células T CD4+ 2D2 específicas de MOG35-55 no modificadas que se marcaron adicionalmente con CTV. Es importante destacar que las células reguladoras inducidas de ratones inmunizados con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico mediaban una supresión dependiente de la dosis de la proliferación de células T efectoras 2D2 en presencia de BMDC cargadas con péptido MOG35-55. Por el contrario, todos los demás grupos no ejercieron actividad supresora.

Tomados en conjunto, estos resultados indican que la presentación de antígenos específicos de APC en condiciones no inflamatorias medió el desarrollo de células T reguladoras funcionales.

Ejemplo 6: Influencia de la vacunación terapéutica con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico en el modelo de enfermedad EAE

Para dilucidar el efecto tolerogénico de la inmunización con ARNm con ARNm no inmunogénico específico de antígeno en un modelo de enfermedad, se indujo EAE activamente en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de la enfermedad con ARNm no inmunogénico que codifica MOG35-55 específico de antígeno, así como ARNm irrelevante no inmunogénico. El tratamiento se inició en un momento en el que ya habían tenido lugar fuertes señales de activación y maduración de DC, así como el primer cebado de células T. La inmunización con ARN con ARNm específico de antígeno no inmunogénico bloqueó completamente cualquier signo de EAE (Figura 6) y ningún ratón de los 6 ratones inmunizados con ARNm desarrolló la enfermedad.

Al mismo tiempo, el tratamiento de ratones con ARNm no inmunogénico que codifica un epítopo irrelevante no protegió a los ratones de la enfermedad y 5/6 ratones desarrollaron una EAE (Figura 6). Estos hallazgos muestran que la presentación de MOG por DC inmaduras puede submodular la EAE y solo los animales tratados con ARNm específico de antígeno no inmunogénico son completamente resistentes a la inducción de EAE. Además, se investigó si la EAE se puede tratar durante los puntos temporales posteriores de la progresión de la enfermedad, cuando los síntomas de la enfermedad son visibles y los ratones alcanzaron una puntuación de la enfermedad de 1-2. Sorprendentemente, se pudo demostrar que después de la inmunización con ARN con ARNm no inmunogénico que codifica MOG35-55, los ratones con EAE no desarrollaron una EAE grave y los síntomas se pudieron reducir cuando se trataron con una puntuación 1 (Figura 7). Incluso cuando se trató a los ratones con una puntuación de 2, se pudo detener la progresión rápida de la enfermedad. Los ratones solo mostraron una puntuación máxima de enfermedad de 2-3, mientras que casi todos los ratones de control no tratados desarrollaron una la EAE completa con una puntuación máxima de 4. En comparación con los ratones con EAE tratados con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, el tratamiento terapéutico con ARNm inmunogénico irrelevante no tuvo ningún efecto positivo sobre la progresión de la enfermedad y los animales desarrollaron EAE similar a los ratones de control no tratados.

Para estudiar el mecanismo molecular de la tolerancia inducida por el tratamiento con ARNm y para ver si la inmunización con ARNm con ARNm específico de antígeno no inmunogénico y, por lo tanto, la presentación de MOG35-55 por las DC influye directamente en las células T efectoras (T efectoras), se indujo EAE nuevamente en ratones C57BL/6, los animales se trataron con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico el día 7 y el día 10 después de la inducción de la enfermedad y 6 días después del último tratamiento con ARNm, se aislaron el bazo, el LN, el cerebro y la médula espinal. Las células de los diferentes órganos se reactivaron in vitro con péptido MOG35-55 durante 6 horas y luego se activaron en células T efectoras del ligando CD40 (CD40L). El CD40L se expresa rápidamente en las células T después de la activación y, por lo tanto, se usó como marcador para las células T efectoras específicas de MOG. Como se observa en la Figura 8, la administración de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico conduce a una disminución significativa en la frecuencia de células T CD4+ específicas de antígeno en los grupos tratados con ARNm específico de antígeno no inmunogénico en cerebro y médula espinal. A nivel funcional, se pudo demostrar que las células T CD4+ secretan significativamente menos interferón y (IFNy) en el cerebro e interleucina 17A (IL-17A) en la médula espinal en ratones tratados con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico en comparación con ratones de control no tratados (Figura 9). Estos datos indican que el tratamiento con ARNm con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico puede inactivar las células T de memoria y las células T efectoras, lo que conduce a una reducción de estas células.

Ejemplo 7: Influencia de la pureza del ARNm en la eficacia del tratamiento de EAE

Los experimentos con combinaciones de ARNm inmunogénico que contiene uridina (U) y ARNm no inmunogénico que contiene 1-metilpseudouridina y que se purifica mediante purificación con celulosa (m1Y) revelaron que la activación de esplenocitos (examinada por sobrerregulación del marcador de activación CD86 en DC y CD69 en linfocitos), así como la secreción de IFNa se correlaciona con la cantidad de ARNm inmunogénico usado. Casi no se logró activación con ARNm no inmunogénico (20 |jg de ARNm de m1Y MOG35-55) y la activación aumentó de manera constante mediante la adición de ARNm inmunogénico (ARNm de U MOG35-55) (Figura 10). 5 jg de ARNm de U 15 jg de ARNm de m1Y mostraron solo una activación ligeramente menor que 20 jg de ARNm de U, mientras que 20 jg de ARNm de m1Y de nuevo no activaron el sistema inmunológico en absoluto. El análisis transferencia de puntos correspondiente de las diferentes mezclas de ARNm también reveló que solo el 100% del ARNm no inmunogénico (m1Y) no muestra señal para el ARNbc (Figura 11).

Para investigar más a fondo la influencia de la pureza del ARNm usado sobre la eficacia del tratamiento de EAE, se usaron las mismas mezclas de ARNm para tratar una EAE en curso. De nuevo, la EAE se indujo activamente en ratones C57BL/6 y los ratones se trataron el día 7 y el día 10 después de la inducción de la enfermedad con ARNm específico de antígeno. En este experimento se utilizaron las mismas mezclas de ARNm de ARNm de MOG35-55 no inmunogénico e inmunogénico que en el experimento de "activación" anterior. A diferencia del ARNm 100% no inmunogénico (m1Y), la mezcla de ARNm no inmunogénico e inmunogénico (2,5 |jg de U 17,5 |jg de ARNm m1Y MOG35-55 así como 5 jg U 15 jg de ARNm m1Y MOG35-55) no puede prevenir el desarrollo de la enfermedad completamente y algunos ratones comienzan a desarrollar la enfermedad similar a los ratones tratados con ARNm 100% inmunogénico (Figura 12). Estos resultados muestran que para un tratamiento eficaz de EAE es necesario ARNm puro no inmunogénico (m1Y).

Se realizó una comparación adicional en términos de activación esplénica de ARNm modificado y no modificado, que se purificó o no mediante HPLC. Como se muestra en la Figura 13, las modificaciones de nucleósidos, como la pseudouridina (pU) sola, no inducen una pérdida de reconocimiento del ARNm por parte del sistema inmunológico, pero el proceso de purificación marca la diferencia. El pU-ARNm no purificado sigue siendo inmunogénico y funciona como el ARNm normal (U-ARNm) en términos de activación esplénica (fuerte sobrerregulación de CD86 en DC, sobrerregulación de CD69 en células B, células T y células NK) y secreción de IFNa. En contraste, pU-ARNm que fue purificado adicionalmente por HPLC para deshacerse del ARNbc (ARNm pU-HPLC) previene la activación de DC, células B, células T y células NK y, en consecuencia, la secreción de IFNa como en ratones de control no tratados. Estos resultados subrayan que exclusivamente la combinación de modificación con uridina y purificación adicional del ARNm de TIV minimiza la inmunogenicidad del ARNm a cero como se observa en ratones sin tratamiento previo, un nivel en el que se puede inducir tolerancia. Por tanto, el ARNm no inmunogénico (modificado con uridina en combinación con la purificación del ARNm) es el ARNm óptimo para el propósito de la inducción de tolerancia.

Ejemplo 8: El tratamiento con ARNm no inmunogénico específico de MOG35-55 no induce de nuevo el cebado de células T CD4+ específicas de antígeno, pero da como resultado la expansión de células T anérgicas en ratones sin tratamiento previo

El mantenimiento e inducción de la tolerancia periférica depende de la presentación de autoantígeno por APC que expresan niveles bajos de moléculas coestimuladoras, como CD86 o CD40, en su superficie. La ausencia de expresión de moléculas coestimuladoras y producción de citocinas por APC tras el tratamiento con ARNm no inmunogénico se mostró en el Ejemplo 2, Figura 1. En consecuencia, tras el tratamiento con ARNm, las APC procesan y presentan el epítopo codificado por el ARNm no inmunogénico en ausencia de estímulos activadores. La participación de TCR en ausencia de señales coestimuladoras no da como resultado la expansión de las células T efectoras, sino más bien la apoptosis o la anergia de las células T (Mueller, D. L., 2010, Nat. Immunol. 11, 21-7). Por el contrario, durante el cebado de las células T efectoras, las DC liberan citocinas específicas, que junto con la presentación de antígenos y la expresión de moléculas coestimuladoras polarizan las respuestas inmunitarias efectoras impulsando la diferenciación de las células T CD4+ en células Th1, Th2 o Th17. De hecho, la generación de células T efectoras tras el tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico no está destinada a una enfermedad autoinmune, ya que más células T efectoras podrían incluso conducir a un curso más severo de la enfermedad en lugar de un tratamiento curativo.

Para investigar la generación de respuestas de células T dirigidas por antígenos, se trataron repetidamente ratones C57BL/6 sin tratamiento previo (día 0, 3, 7 y 10) con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. Después de cuatro inmunizaciones con ARNm, las células T CD4+ se aislaron el día 13 de los bazos y se realizó un ELISpot de IFNy. La Figura 14A muestra que los ratones tratados con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico no desarrollaron células T efectoras CD4+ IFNy+ que respondían al reconocimiento de antígenos tras el tratamiento con ARNm específico de antígeno.

De acuerdo con estos resultados, tampoco la reestimulación de células T CD4+ esplénicas con diferentes concentraciones de péptido MOG35-55 (0, 5, 10, 20 y 100 jg ) durante 48 h no dio como resultado la secreción de otras citocinas inflamatorias tales como como TNFa y GM-CSF, medido en los sobrenadantes mediante ELISA (Figura 14B). Sólo se detectó la secreción de la citoquina antiinflamatoria IL-10 en los ratones tratados con ARNm específico de antígeno no inmunogénico, pero no con ARNm irrelevante no inmunogénico (Figura 14C). Además, solo en este grupo, se pudo detectar la secreción de citocinas Th2 como IL-4 e IL-5 (datos no mostrados). La producción de IL-10 en respuesta a ARNm específico de antígeno no inmunogénico proporciona evidencia de que las células T reguladoras específicas de antígeno (Treg) se activan en respuesta al tratamiento. Las Treg son fundamentales para controlar diversas respuestas inmunes. Se han informado muchos subconjuntos diferentes de Treg inducibles y especialmente las células CD25+Foxp3+ y Tr1 se caracterizan por la producción de altos niveles de IL-10. Estas células T reguladoras regulan el cebado de las células T autorreactivas limitando su expansión y diferenciación.

Para investigar el fenotipo de CD4 después del tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico, se inmunizaron repetidamente ratones C57BL/6 con 20 jg de ARNm de MOG35-55 específico de antígeno no inmunogénico, 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina el día 0, 3, 7 y 10. La expresión de TIGIT, Tim-3, PD-1 y Lag-3 en células CD4+ MOG35-55 tetrámero+ de ratones tratados con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico fue en comparación con las células CD4+ totales de ratones de control no inmunogénicos irrelevantes y no tratados. La inmunización repetitiva con ARNm específico de antígeno no inmunógeno da como resultado una sobrerregulación de TIGIT, Tim-3, PD-1 y Lag-3 en comparación con los ratones tratados con ARNm irrelevante no inmunogénico (Figura 15).

La sobrerregulación de estos marcadores se correlaciona con un fenotipo de células T anérgicas. La anergia es un estado adquirido de falta de respuesta funcional y la consecuencia del acoplamiento del receptor de células T (TCR) sin coestimulación a través de Cd 28 (Jenkins, MK et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5409-13 ; Quill, H. y Schwartz, RH, 1987, J. Immunol. 138, 3704-3712; Jenkins, MK et al., 1990, J. Immunol. 144, 16-22). Además, constituye un medio de imponer tolerancia periférica. Las células T anérgicas son funcionalmente inactivas e incapaces de iniciar una respuesta inmune productiva incluso cuando el antígeno se encuentra en presencia de una coestimulación completa. Las células T CD4+ anérgicas con distintos programas fenotípicos y de expresión génica pueden incluso convertirse en células T reguladoras que, a su vez, pueden promover la anergia de las células T CD4+ patógenas e inhibir la autoinmunidad (Kalekar, LA et al., 2016 , Nat. Immunol. 17, 304-14). Lag-3, Tim-3, ICOS y TIGIT median funciones coinhibidoras en las células T efectoras y una sobreexpresión de estas moléculas se asocia con el agotamiento de las células T (Anderson, AC et al., 2016, Immunity 44, 989-1004). La acumulación de múltiples receptores coinhibidores en la superficie de las células T se asocia incluso con una disfunción aumentada (Blackburn, S.D. et al., 2009, Nat. Immunol. 10, 29-37). El propio TIGIT actúa como una molécula coinhibidora subrregulando directamente la proliferación de células T, pero también previniendo la maduración de las DC, disminuyendo la secreción de IL-12 e induciendo la producción de la citocina inmunosupresora IL-10 (Yu, X. et al., 2009, Nat. Immunol.

10, 48-57; Joller, N. et al., 2011, J. Immunol. 186, 1338-1342). Lag-3 juega un papel en la modulación de la homeostasis de las células T y las respuestas de las células T efectoras (Workman, Cj et al., 2002, J. Immunol.169, 5392-5395; Workman, CJ & Vignali, DAA, 2003, Eur. J. Immunol. 33, 970 - 979; Workman, CJ y Vignali, DAA, 2005, J. Immunol. 174, 688 - 695). Además, las moléculas de puntos de control inmunitarios como el receptor 1 de muerte programada (PD-1) y la proteína 4 asociada a linfocitos T citotóxicos (CTLA-4) son moléculas coinhibidoras implicadas en la subregulación de las respuestas inmunitarias y, en consecuencia, en el mantenimiento de la autotolerancia periférica. Las moléculas coinhibidoras en general se sobrerregulan con la activación de las células T y limitan la respuesta efectora a través de la inhibición por retroalimentación. PD-1 y sus ligandos, PD-L1 y PD-L2, por ejemplo, suministran señales inhibidoras que regulan el equilibrio entre la activación y la tolerancia de las células T (Keir, ME et al., 2008, Annu. Rev. Immunol. 26, 677-704 ). Las respuestas inmunes a los autoantígenos requieren respuestas específicas y equilibradas para mantener la tolerancia, que está mediada por los diferentes receptores coinhibidores y su ligando. Mediante una sobrerregulación del efecto de PD-1, las respuestas de las células T se apagarán y los tejidos, a su vez, estarán protegidos del daño mediado por células inmunitarias.

Todos estos receptores coinhibidores juegan un papel central en la regulación de enfermedades autoinmunes y la deficiencia en algunas de estas moléculas incluso conduce a la autoinmunidad.

Ejemplo 9: Caracterización más detallada de células T CD4+ específicas de MOG35-55 tras el tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico en el modelo de enfermedad EAE

De acuerdo con los resultados mostrados en el Ejemplo 6, Figura 8 y 9, también los experimentos de transferencia celular adoptiva de células T CD4+ específicas de MOG35-55 mostraron los mismos resultados. Se transfirieron células T CD4+ Thy1.1+ específicas de MOG35-55 de ratones transgénicos TCR 2D2 a ratones C57BL/6 Thy1.2+ y 24 h más tarde se indujo EAE en los ratones receptores. Los días 7 y 10 después de la inducción de la enfermedad, los ratones se trataron con 20 |jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, 20 |jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. Seis días después del último tratamiento con ARNm, se aislaron el cerebro y la médula espinal. Las células de estos tejidos se reactivaron in vitro con péptido MOG35-55 durante 6 horas y luego se activaron en células T CD4+ Thy1.1+. Como se muestra en la Figura 16, la administración de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico condujo a una disminución significativa en la frecuencia de células T CD4+ específicas de MOG35-55 en el cerebro y la médula espinal. A nivel funcional, las células T CD4+ secretan significativamente menos IPNy e interleucina 17A (IL-17A) en el cerebro y la médula espinal de los ratones tratados con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico en comparación con los ratones de control (Figura 17). Estos datos nuevamente indican que el tratamiento con ARNm con ARNm de MOG35-55 no inmunogénico puede inactivar las células T efectoras, lo que conduce a una infiltración reducida de estas células en el cerebro y la médula espinal.

Para investigar el fenotipo de células T CD4 específicas de antígeno después de un tratamiento exitoso, se indujo EAE activamente y el día 7 y el día 10 después de la inducción de la enfermedad, los animales se trataron con 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico, 20 jg de ARNm irrelevante no inmunogénico o solución salina. En el pico de la enfermedad (día 16 después de la inducción de la enfermedad), se investigó el fenotipo de células T CD4 en el bazo mediante tinción con MOG35-55 tetrámero. De acuerdo con los experimentos mostrados en los Ejemplos 5 y 8, también en el contexto de la enfermedad de EAE, la tolerancia específica de antígeno inducida por ARNm específico de antígeno no inmunogénico está mediada por la sobrerregulación de moléculas coinhibidoras Lag-3, ICOS, TIGIT y Tim-3 en células T CD4+ específicas de MOG35-55 en el bazo (Figura 18A). Además del mecanismo intrínseco de la célula que media la tolerancia inmune como la anergia y la coestimulación negativa, también los mecanismos extrínsecos de la célula (tolerancia mediada por células Treg) pueden mediar el efecto del tratamiento del ARNm específico de antígeno no inmunogénico. Como ya se discutió, las Treg juegan un papel crucial en la tolerancia específica de antígeno (Sakaguchi, S. et al., 1985, J. Exp. Med. 161, 72-87). El análisis FACS de células T CD4+ específicas de MOG35-55 mostró además una expansión significativa de las poblaciones de Treg (Figura 18B). Además, las Treg en los bazos de ratones tratados con ARNm no inmunogénico específico de antígeno expresan niveles altos de CD69, lo que indica que están altamente activados.

Para determinar si la expresión de moléculas coestimuladoras negativas era necesaria para la inducción y el mantenimiento de la tolerancia, se bloquearon PD-1 o CTLA-4 durante el tratamiento con ARNm de EAE. El tratamiento de EAE el día 7 y el día 10 después de la inducción de la enfermedad con ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico en combinación con anticuerpo anti-PD-1 o anti-CTLA-4 dio lugar a la reversión de la protección frente a la EAE en comparación con los ratones tratados con ARNm que codifica MOG35-55 inmunogénico en combinación con controles de IgG (Figura 19). Esto demuestra que PD-1 y CTLA-4 son cruciales para el mantenimiento a largo plazo de la tolerancia específica de antígeno inducida por ARNm específico de antígeno no inmunogénico, ya que el bloqueo de anticuerpos de PD-1 y CTLA-4 en paralelo al tratamiento de ARNm resultó en una marcada reducción en la eficacia de la inducción de tolerancia mediada por el tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico.

En conjunto, los experimentos representados investigaron el modo de acción de este nuevo enfoque terapéutico de inducción de tolerancia específica de antígeno mediante tratamiento con ARNm no inmunogénico específico de antígeno. Los resultados muestran que el tratamiento con ARNm no inmunogénico específico de antígeno es un método eficaz para alterar las respuestas inmunitarias dañinas en la autoinmunidad para conferir protección. Los experimentos mostrados en ratones no tratados y en ratones afectados por la enfermedad demuestran que el tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico da como resultado la inducción de células T anérgicas y reguladoras que median la tolerancia en la periferia, lo que lleva a un tratamiento exitoso de una enfermedad en curso autoinmune. Se demostró que el efecto terapéutico se basa en mecanismos ya bien descritos para la inducción de tolerancia como se describe en la literatura discutida en cada ejemplo. Estos mecanismos son importantes y fundamentales para la inducción de tolerancia independientemente del tipo de enfermedad autoinmune. El mecanismo de tolerancia mediado por el tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico puede, por tanto, transferirse a cualquier otro tipo de enfermedad autoinmune.

Ejemplo 10: La inducción de tolerancia específica de antígeno por tratamiento con ARNm específico de antígeno no inmunogénico es independiente del modelo de enfermedad de EAE

Todos los experimentos de EAE descritos anteriormente se realizaron en ratones C57BL/6 inducidos con péptido MOG35-55 dando como resultado una progresión monofásica de la enfermedad. Otro modelo de EAE se caracteriza por enfermedad recurrente debido a un epítopo relevante diferente (PLP139-151) que conduce a un curso de enfermedad remitente-recurrente en ratones SJL. Este modelo se empleó para demostrar la inducción de tolerancia en un entorno de enfermedad más relevante desde el punto de vista clínico. La Figura 20A muestra que el tratamiento de ARNm 2 veces por semana a partir del día 7 y el día 10 después de la inducción de EAE con ARNm que codifica PLP139-151 no inmunogénico en el modelo de enfermedad remitente-recidivante tiene un efecto positivo en el desarrollo de EAE ya que estos ratones mostraron un efecto mucho más débil progresión de la enfermedad que los ratones tratados con ARNm de control irrelevante no inmunogénico. Para simular aún mejor la situación en la MS, se utilizó una EAE compleja asociada con múltiples clones de células T autorreactivas patógenas. Dado que tras un diagnóstico definitivo de MS, es probable que la enfermedad ya esté asociada con una autorreactividad anti-mielina compleja, debido a la "diseminación del epítopo" se investigó la eficacia del enfoque de tratamiento con múltiples epítopos. Como se muestra en la Figura 20B, la EAE compleja se trató con éxito mediante una mezcla de cuatro ARNm que codifican el epítopo de enfermedad no inmunogénicos diferentes que codifican MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 y MBP84-104. De cada ARNm que codifica el epítopo de enfermedad no inmunogénico, se usaron 10 |jg, lo que dio como resultado 40 |jg para el tratamiento eficaz. Ninguno de los tratamientos de epítopo único pudo conferir resultados de tratamiento similares, como se muestra para 20 jg de ARNm que codifica MOG35-55 no inmunogénico.

Estos resultados muestran que la inducción de tolerancia específica de antígeno observada en los diferentes experimentos es independiente de un epítopo específico y puede estar mediada por diferentes epítopos relevantes para la enfermedad. Además, los datos subrayan que incluso una enfermedad compleja en curso con un proceso autoinmune patógeno complejo puede tratarse con éxito mediante la administración de múltiples constructos de ARNm específicos de mielina no inmunogénicos.

Ejemplo 11: La coadministración de citocinas inmunomoduladoras mejora el efecto tolerogénico del tratamiento con ARNm-LPX no inmunogénico específico de antígeno

Varias moléculas inmunorreguladoras, tales como IL-10, pueden soportar la función de Treg. Además, se sabe que la citocina antiinflamatoria IL-10 induce DC tolerogénicas (Torres-Aguilar, H. et al., 2010, Autoimmun. Rev.10, 8-17; Torres-Aguilar, H. et al., 2010, J. Immunol.184, 1765-1775; Steinbrink K. et al., 1997, J. Immunol. 159, 4772-4780) y para suprimir la proliferación de células T y las respuestas de citocinas (Gu, Y. et al., 2008, Eur . J. Immunol. 38, 1807 1813; Guo, B., 2016, J. Clin. Cell Immunol. 7, 1-16). Además, la IL-27 es una citocina que se sabe que tiene propiedades antiinflamatorias y en estudios de EAE, se ha demostrado que esta citocina atenúa la gravedad de la enfermedad (Mascanfroni, ID et al., 2013, Nat. Immunol. 14, 1054- 63; Thom, R. et al., 2017, Front. Immunol. 8, 1-14). En un conjunto de experimentos de EAE, se debe investigar la coadministración de ARNm específico de antígeno no inmunogénico con citocinas inmunomoduladoras como IL-10 e IL-27 codificadas por ARNm no inmunogénico para modular la respuesta inmune y mejorar la eficiencia de inducción de tolerancia.

Se evaluó la capacidad de la coadministración de citocinas inmunomoduladoras para mejorar la tolerancia del tratamiento con ARNm-LPX específico de un solo antígeno utilizando un tratamiento "subterapéutico" de ratones con

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para uso en terapia, comprendiendo dicha composición ARN no inmunogénico que codifica un péptido o polipéptido que comprende un autoantígeno, en el que el ARN no inmunogénico se vuelve no inmunogénico mediante la incorporación de 1-metilpseudouridinas y mediante la eliminación de ARNbc.

2. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1, en la que el ARN no inmunogénico cuando se administra no da como resultado la activación de células dendríticas, activación de células T y/o secreción de IFN-alfa.

3. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1 o 2, en la que el ARN no inmunogénico es ARN transcrito in vitro.

4. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el autoantígeno está asociado con una enfermedad autoinmune y en la que el autoantígeno es preferiblemente un antígeno de células T.

5. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el autoantígeno es un antígeno de mielina, en el que el autoantígeno es preferiblemente glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG) o un fragmento de la misma que comprende los aminoácidos 35 a 55 de la glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG).

6. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende además un compuesto inmunoinhibidor o un ARN no inmunogénico que codifica dicho compuesto inmunoinhibidor, en el que dicho compuesto inmunoinhibidor se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interleucina 10 (IL-10), antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1RA), interleucina 4 (IL-4), interleucina 27 (IL-27), interleucina 35 (IL-35), ligando 1 de muerte programada (PD-L1), ligando coestimulador de células T inducible (ICOSL), B7-H4, c D39, CD73, FAS, FAS-IL, indolamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO1), indolamina 2,3-dioxigenasa 2 (IDO2), acetaldehído deshidrogenasa 1 (ALDHl)/retinaldehído deshidrogenasa (RALDH), arginasa 1 (ARG1), arginasa 2 (ARG2), óxido nitroso sintasa (NOS2), galectina-1, galectina-9, semaforina 4A.

7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la terapia comprende tratar o prevenir una enfermedad autoinmune.

8. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 7, en la que la terapia comprende inducir tolerancia a las células T autorreactivas.

9. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 7, en la que la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune mediada por células T.

10. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 7, en la que la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune del SNC.

11. La composición farmacéutica para su uso de la reivindicación 7, en la que la enfermedad autoinmune es la esclerosis múltiple.

12. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, en la que el ARN no inmunogénico cuando se administra no da como resultado la activación de células dendríticas, activación de células T y/o secreción de IFN-alfa.

13. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en la que los nucleótidos modificados suprimen la activación de los receptores inmunes innatos mediada por ARN.

14. La composición farmacéutica para uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 13, en la que la terapia comprende proporcionar al sujeto que es tratado un compuesto inmunoinhibidor, o un ARN no inmunogénico que codifica el compuesto inmunoinhibidor, en la que el compuesto inmunoinhibidor es seleccionado del grupo que consiste en factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), interleucina 10 (IL-10), antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1RA), interleucina 4 (IL-4), interleucina 27 (IL-27), interleucina 35 (IL-35), ligando 1 de muerte programada (PD-L1), ligando coestimulador de células T inducible (ICOSL), B7-H4, CD39, CD73, FAS, FAS-IL, indolamina 2,3-dioxigenasa 1 (IDO1), indolamina 2,3-dioxigenasa 2 (IDO2), acetaldehído deshidrogenasa 1 (ALDHl)/retinaldehído deshidrogenasa (RALDH), arginasa 1 (ARG1), arginasa 2 (ARG2), óxido nitroso sintasa (NOS2), galectina 1, galectina 9, semaforina 4A.