ES2893354T3 - Combinación partícula - agente activo que ayuda a la regeneración ósea - Google Patents

Abstract

Una composición que mineraliza in vivo que comprende una pluralidad de partículas sólidas de fosfato de calcio cargadas con un agente activo y dispersadas en un vehículo de hidrogel que comprende ácido hialurónico, caracterizado porque las partículas tienen un tamaño medio comprendido entre 150 nm y 500 nm.

Description

DESCRIPCIÓN

Combinación partícula - agente activo que ayuda a la regeneración ósea

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones útiles en el campo biomédico, en particular como biomateriales para la regeneración de tejidos, especialmente para tejidos óseos.

Técnica anterior

La alta capacidad de regeneración de los huesos significa que la mayoría de las fracturas sanarán sin necesidad de intervención importante. A pesar de ello, los defectos grandes en huesos, como los que se observan después de resecciones de tumores óseos o fracturas sin unión graves, carecen de la plantilla para una regeneración organizada y necesitan intervenciones quirúrgicas. En la actualidad, el tratamiento estándar de referencia es el uso de un procedimiento denominado autoinjerto, que supone la recogida de hueso del “donante” a partir de un sitio del paciente que no soporte carga (típicamente, un lugar fácilmente accesible como la cresta ilíaca) y el trasplante al sitio defectuoso. El trasplante de hueso autólogo (es decir, hueso del propio paciente) tiene el mejor pronóstico clínico ya que se integra de forma fiable con el hueso hospedador y no se producen las complicaciones relacionadas con la inmunidad y las enfermedades que se producen con hueso alogénico (es decir, hueso de un cadáver humano) o hueso xenogénico (es decir, hueso de una fuente animal). No obstante, su uso está grandemente dificultado por la escasa capacidad de suministro y la considerable morbilidad en el sitio del donante asociadas con su recogida. Además, muchas condiciones, como la osteoporosis, los tumores óseos, la necrosis avascular o las infecciones podrían necesitar un enfoque más invasivo, tal como la implantación de dispositivos de osteosíntesis y endoprótesis. En tales casos, la calidad deficiente del hueso es un problema grave, ya que podría conducir al fallo del implante, principalmente debido a cuestiones relacionadas con el material de hueso que rodea el implante, tales como una baja densidad ósea, una excesiva resorción de hueso o una vascularización insuficiente. En estos casos, es crucial conservar y regenerar el stock de hueso tan rápida y eficientemente como sea posible, para una evolución con éxito para el paciente.

Por lo tanto, la búsqueda de estrategias de regeneración de hueso nuevo es una prioridad clave impulsada por el dolor debilitador asociado con el daño en el hueso, y el reto creciente socioeconómico y médico que supone nuestra población que envejece. La medicina regenerativa se ha dirigido hacia nuevas medidas menos invasivas para curar defectos graves de los huesos con un riesgo de infección y rechazo reducido. Mientras que los materiales destinados en el pasado a la implantación se diseñaban para que fueran “bio-inertes”, los científicos de materiales se han dirigido ahora hacia el diseño de materiales “bioactivos” que se integran con moléculas biológicas o células y regeneran tejidos. Se ha promovido la formación de tejido y hueso añadiendo agentes terapéuticos y biológicos a un sustrato que se puede implantar. Sin embargo, muchos de estos agentes se tienen que incorporar de forma adecuada al sustrato o sobre él, con el fin de que sean clínicamente eficaces. Un problema importante para el uso clínico de estos agentes es un sistema adecuado de distribución de los mismos. Un sistema ideal de distribución es uno que sea capaz de mantener in situ un agente durante suficiente tiempo para que pueda interaccionar con las células objetivo y para que se libere el agente en una concentración eficaz pero segura durante la reparación o curación del tejido. En el caso del hueso, los materiales deberían ser preferiblemente tanto osteoinductores (es decir, capaces de promover y potenciar la diferenciación de las células progenitoras en una estirpe osteoblástica), osteoconductoras (soportar el crecimiento del hueso y favorecer el crecimiento del hueso de alrededor) y capaces de osteointegración (es decir, de integrarse en el hueso de alrededor). Se han evaluado muchos materiales sustitutos del hueso destinados a reemplazar la necesidad de huesos autólogos o alogénicos. En general, consisten en cerámicas bioactivas, vidrios bioactivos, polímeros biológicos o sintéticos y compuestos de los mismos. La premisa básica ideal, si se sigue el paradigma de la ingeniería de tejidos, es que los materiales se reabsorberán y serán reemplazados con el tiempo por el tejido biológico regenerado nuevamente por el propio cuerpo, y en sintonía con él.

Los armazones o andamios inyectables sintéticos pueden proporcionar estabilidad estructural y soporte mecánico a un sitio con defecto. Los armazones se deben degradar a una velocidad suficiente puesto que son solamente estructuras temporales. La tasa de degradación de los armazones es vital puesto que deben mantener su integridad el tiempo suficiente como para que el nuevo tejido sustituya al tejido dañado, proporcionando simultáneamente resistencia mecánica para ayudar a absorber algo de la tensión, pero no toda. Algunas de las ventajas de los polímeros en gel son la capacidad de tomar la forma de defectos de cualquier tamaño y la capacidad de integrar fácilmente numerosos agentes dentro del gel.

Materiales bioactivos inorgánicos

Una amplia gama de materiales inorgánicos bioactivos similares en cuanto a su composición a la fase mineral del hueso son de interés clínico, por ejemplo, fostato de tricalcio, vidrios bioactivos de hidroxiapatita (HA), y sus combinaciones. Los vidrios bioactivos (vidrios de sílice que contienen Ca y posiblemente P), por ejemplo, cuando se sumergen en un fluido biológico, pueden producir rápidamente una capa de apatita hidroxicarbonatada bioactiva que se puede unir al tejido biológico. Además, se pueden adaptar para distribuir iones como el Si a niveles capaces de activar vías de transducción de genes complejas, lo que lleva a una diferenciación de células reforzada y a la osteogénesis. La tasa de resorción de los vidrios y cerámicas bioactivos se puede ajustar con HA cristalina que persiste durante años después de la implantación, mientras que otros fosfatos de calcio tienen una capacidad mayor de ser reabsorbidos, pero tienen menos resistencia para soportar cargas. La naturaleza quebradiza de los materiales inorgánicos bioactivos implica que su resistencia a la fractura no se puede igualar a la del hueso y por si mismos no son buenos materiales para aplicaciones de mucho aguante.

Polímeros

Los polímeros biológicos, como el colágeno y el ácido hialurónico, son candidatos interesantes para la ingeniería de tejidos y proporcionan un acompañamiento informativo biológico innato a las células lo que favorece la unión de las células y fomenta respuestas quimiotácticas. Los polímeros sintéticos como los polifumaratos, el ácido poliláctico (PLA), el ácido poliglicólico (PGA), los copolímeros de PLA y PGA (PLGA) y la policaprolactona ofrecen una alternativa versátil. Se pueden procesar para generar una gama de estructuras de armazón tridimensionales con diferentes porosidades y características superficiales. También están generalizados los hidrogeles (por ejemplo, de polietilenglicol, a base de alginato) ya que con frecuencia se pueden distribuir de manera mínimamente invasiva y se pueden gelificar in situ (por ejemplo, se pueden fotoreticular, o reticular iónicamente) para proporcionar un micro medio ambiente celular tridimensional con un alto contenido de agua. Sus propiedades de material viscoelástico parecen ser particularmente adecuadas para la regeneración de cartílago, aunque se han explorado también muchas aplicaciones en hueso. Los hidrogeles tienen la ventaja de que la biofuncionalización química y la distribución y encapsulación del material son relativamente sencillas.

Hidrogeles de hialuronano

El hialuronano es un glicosaminoglicano natural que se encuentra en todos los tejidos conectivos y en el fluido sinovial de las articulaciones. Su composición natural y abundancia le convierten en sujeto de intensa investigación para aplicación clínica. Las propiedades de biodegradabilidad del hialuronano, su conformación natural, su estabilidad frente a la hidrólisis, sus características de adhesión a las células, migración de células, proliferación de células y diferenciación celular son importantes para su uso potencial como base constructiva en ingeniería de tejidos. Los estudios con hialuronano han mostrado que el material es inmunológicamente inerte y 100 % biodegradable, tanto in vitro como in vivo. De manera similar, in vivo, el hialuronano tiene la capacidad de ayudar en la construcción de una matriz extracelular, que produce un microambiente adecuado y estructuralmente protegido para la diferenciación de las células progenitoras. La capacidad de replicar un medio ambiente natural para las células progenitoras es importante, en particular debido a la facilidad con la que las células diferenciadas pierden sus atributos funcionales. Los hidrogeles permiten que las células sembradas se extiendan por todo el material.

Los hidrogeles inyectables a base de hialuronano se han utilizado como almacén o depósito para medicamentos que son moléculas pequeñas, tales como bifosfonato y plásmidos de ADN. Además, los geles de hialuronano se usaron como vehículos para factores de crecimiento, tal como para la distribución de BMP (proteínas morfogenéticas óseas, por sus siglas en inglés) para favorecer el aumento del hueso.

Materiales compuestos

Los materiales compuestos orgánico-inorgánicos que pretender “imitar” la naturaleza compuesta de los huesos reales combinan la dureza y robustez de una fase polimérica con la resistencia a la compresión de una inorgánica para generar materiales bioactivos con propiedades mecánicas y perfiles de degradación mejorados. Para tales materiales compuestos, la alcalinidad del relleno inorgánico neutraliza la degradación autocatalítica ácida de polímeros tales como el PLA. Cada vez se reconoce más que es probable que un componente inorgánico de tamaño “nano” sea más bioactivo que un componente de tamaño “micro”.

Los biomateriales usados para fabricar implantes dentales incluyen metales, cerámicas, carbones, polímeros y combinaciones de ellos. Los polímeros son más blandos y más flexibles que las otras clases de biomateriales. También presentan baja resistencia mecánica, lo que los hace propensos a fracturas mecánicas durante su funcionamiento cuando se someten a cargas altas. Se ha informado que los materiales poliméricos tienen muy poca aplicación en odontología de implantes y que solo se usan para fabricar componentes que absorban los golpes colocados entre el implante y la superestructura.

El titanio, incluyendo la aleación Ti-6Al-4V (Ti-6 aluminio-4 vanadio), es el primer material moderno usado para implantes dentales y todavía es uno de los más usados en los implantes dentales actuales. El Ti comercialmente puro es un metal ligero, con una excelente biocompatibilidad, una rigidez relativamente alta y una alta resistencia a la corrosión. Sin embargo, cuando se expone al aire, se forma un óxido en la superficie y esta capa de óxido determina la respuesta biológica. Esta capa de óxido es una interfaz dinámica que actúa como plataforma para la deposición y el pegado de la matriz de hueso.

Se han usado otros metales para la oseointegración, incluyendo zirconio, oro y aleaciones Ti-aluminio-vanadio. Estas aleaciones pueden reforzar el implante pero se ha mostrado que tienen un contacto entre el hueso y el implante relativamente pobre.

También se han usado biocerámicas como la hidroxiapatita debido a su baja resistencia, excelente biocompatibilidad y capacidad para integrarse con tejidos duros y hueso vivo. Además de su naturaleza quebradiza, las cerámicas de hidroxiapatita, fosfato tricálcico y óxido de aluminio se usan actualmente como revestimientos pulverizados por plasma sobre un núcleo metálico. Esto da como resultado la unión del implante con el tejido hospedador.

En el pasado se han emprendido muchas tentativas de restaurar defectos de hueso y facilitar una regeneración de tejidos funcional de las lesiones de huesos, con diversas tasas de éxito, aprovechando las características únicas de los biomateriales, y de los materiales compuestos en particular.

El documento WO 2013/165333 describe un material microporoso para la reparación de huesos y para el relleno de los huecos en los huesos. El material comprende gránulos de polímero bioabsorbibles y un disolvente miscible en agua biocompatible, de modo que el disolvente disuelve al menos parcialmente y/o ablanda los gránulos de polímero para formar una masa moldeable que se puede usar para rellenar un defecto de hueso, pero la cual se endurece cuando el material del implante se expone al agua. En presencia de agua o de un medio ambiente acuoso, tal como el existente al situarlo en el cuerpo, se elimina el disolvente y el material del implante se endurece para formar una masa con macroporosidad interconectada.

El documento WO 2012/117260 describe un sustituto de hueso sintético, que comprende una mezcla de partículas osteoconductoras de un primer y un segundo tamaño de partícula promedio, suspendidas en un vehículo de hidrogel de fase inversa soluble en agua, en la que el hidrogel es preferiblemente un poloxámero.

El documento WO 2003/043576 describe una composición fluida para introducir en un defecto de un hueso o cartílago que comprende un agente osteogénico o un agente condrogénico, en la que el agente osteogénico o condrogénico es un inhibidor de la resorción del hueso o un agente anabólico de hueso, y un vehículo biocompatible que es más fluido a temperatura ambiente que a una temperatura elevada.

El documento WO 2007/134465 describe un precursor sólido para la preparación de un material de sustitución de hueso pastoso mediante la mezcla con un líquido, por el cual dicho precursor permanece estable antes d esu uso y en particular mantiene su integridad molecular en un alto grado. Dicho precursor comprende un hidrogel o una sustancia que se puede hinchar para producir un hidrogel y partículas cerámicas que contienen calcio.

El documento US 2006/0257492 describe métodos y composiciones bioactivas para la distribución localizada de agentes terapéuticos utilizando una suspensión de partículas biomiméticas cristalinas, porosa, con al menos un agente terapéutico dispersado dentro y en todas las partículas de apatita. Las partículas de la suspensión son suficientemente pequeñas como para que las partículas y el agente terapéutico se pueden proporcionar al sujeto mediante inyección.

El documento US 8697107 describe un implante médico que puede fluir para su aplicación a un defecto de hueso para favorecer el crecimiento del hueso. El implante biomédico fluido comprende una matriz portadora que incluye un polisacárido biodegradable y partículas cerámicas. Se puede formar de forma integral una membrana impermeable en la superficie de la matriz portadora poniendo en contacto el polisacárido biodegradable que incluye las partículas cerámicas con un agente de reticulación en una cantidad de 0,1 % en peso a aproximadamente 20 % en peso. La membrana resultante forma un elemento de sellado que inhibe el crecimiento de las células de tejido blando en el defecto de hueso lo que puede reducir o evitar el crecimiento de hueso en el defecto de hueso.

Shi et al. Informaron de un estudio sobre la fabricación y el uso in vitro de microesferas de hidroxiapatita (HA) hibridada con ácido láctico-co-glicólico (PLGA) cargadas con el fármaco de tipo bifosfonato aledronato. El sistema de distribución in situ de aledronato inhibe el crecimiento de macrófagos fomentando a la vez la proliferación y adhesión de osteoblastos.

Nejadnik et al. mostraron que el ácido hialurónico funcionalizado con bifosfonato que contiene partículas de fosfato de calcio es estable in vivo y atrae el crecimiento del hueso: En el estudio, no se informó de la liberación de las moléculas de bifosfonato usadas para funcionalizar el vehículo de ácido hialurónico.

Boanini et al. informaron de los resultados de un estudio in vitro realizado sobre cultivos de osteoclastos y crecimiento de osteoblastos sobre nanocristales de hidroxiapatita-aledronato. Los resultados demuestran que el aledronato es capaz de influir a las células del hueso incluso en nanocristales de materiales compuestos.

A pesar de todos estos avances en la tecnología para la mejora de la calidad del hueso en presencia de alteraciones funcionales o estructurales, todavía es necesario un biomaterial alternativo válido que pudiera permitir una restauración robusta y duradera de los defectos del hueso y/o conservar y regenerar el stock de hueso, evitando a la vez los inconvenientes asociados con la terapéutica conocida o los enfoques quirúrgicos.

Resumen de la invención

De acuerdo con ello, es un objeto de la presente invención proporcionar una composición bioactiva que tiene características osteoconductoras y osteointegradoras, la cual puede mineralizarse rápidamente in vivo y la cual podría servir como estructura o armazón in situ para promover la formación de hueso nuevo.

Otro objeto de la invención es proporcionar una composición bioactiva que protege la reserva ósea existente de la resorción y al mismo tiempo inhibe la degradación de la estructura mineralizada que se forma in situ.

Otro objeto de la invención es proporcionar una composición bioactiva que puede obturar huecos y defectos de hueso (por ejemplo, el “cráter” de resorción alrededor de un implante dental tras una infección local) y por lo tanto puede prevenir el crecimiento de tejido fibroso.

Otro objetivo de la invención es proporcionar una composición bioactiva que mejora la estabilidad primaria de los implantes directamente después de una cirugía.

Todos estos objetivos se consiguen mediante las composiciones descritas en este documento y que se definen en las reivindicaciones. El alcance de la invención se define mediante las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamientos se refiere a las composiciones de la presente invención para su uso en un método para tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia. La invención se basa, al menos en parte, en un sorprendente efecto sinérgico proporcionado por la combinación de un agente activo cargado sobre partículas sólidas de fosfato de calcio para promover la reparación de tejido óseo, su curación y regeneración. En particular, la invención describe una composición bioactiva que comprende un vehículo y partículas sólidas cargadas con un agente activo.

En un aspecto, la composición bioactiva de la invención se caracteriza porque las partículas sólidas se escogen en el grupo que consiste en cristales, gránulos, partículas redondeadas, partículas esféricas o cualquier combinación de ellas.

En un aspecto preferido, la composición bioactiva de la invención se caracteriza porque las partículas sólidas son partículas sólidas de fosfato de calcio.

La composición bioactiva de la composición se caracteriza porque el vehículo comprende una matriz polimérica. En un aspecto preferido, la composición bioactiva de la invención se caracteriza porque el agente activo es un agente anti-resorción.

La composición bioactiva de la invención se caracteriza porque las partículas sólidas tienen un tamaño medio de partícula comprendido entre 150 nm y 500 nm.

En un aspecto particular, la composición bioactiva de la invención se caracteriza porque está en forma de hidrogel. En un aspecto particular, la composición bioactiva de la invención se proporciona en una formulación inyectable. Un objeto adicional de la presente invención se basa en una formulación farmacéutica que comprende la composición bioactiva de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa nanopartículas de hidroxiapatita.

La figura 2 representa la preparación del estudio de liberación indirecta utilizando un ensayo con la línea celular de macrófagos RAW 264.7. El hidrogel cargado con fármaco con y sin partículas de HA se incubó en H2O durante 1 hora para investigar si se produce una liberación explosiva del fármaco. Los macrófagos se expusieron más tarde a los sobrenadantes de los hidrogeles que se diluyeron mucho con el medio de cultivo de células.

La figura 3 representa imágenes de microscopio de los macrófagos de ratón RAW 264.7 después de 48 h de cultivo con diversas concentraciones de zoledronato y nanopartículas de HA. Rectángulo de la izquierda: control. Rectángulo central: 2,5 pM de zoledronato - 0,7 pg/ml de nanopartículas de hidroxiapatita. Rectángulo de la derecha: 40 pM de zoledronato - 10,9 pg/ml de nanopartículas de hidroxiapatita.

La figura 4 representa los resultados del ensayo con células RAW 264.7 que investiga la liberación de zoledronato de los hidrogeles durante 1 h de incubación en agua. Las células RAW 264.7 se cultivaron durante 24-72 h.

La figura 5 representa escaneos microCT (microtomografía computerizada) tomados en 6 momentos temporales después de cirugía para el grupo nHA-gel (arriba) y el grupo nHA-zol-gel (abajo). Los escaneos muestran una rápida mineralización del tejido alrededor de los tornillos en ambos grupos que se reabsorbe y se remodela rápidamente en el grupo nHA-gel y persiste en el grupo nHA-zol-gel.

La figura 6 representa la relación volumen mineralizado / volumen de tejido medida en 4 capas alrededor del tornillo. Los asteriscos grises indican las diferencias significativas entre el grupo nHA-gel y el grupo de control, los negros las mismas entre el grupo nHA-zol-gel y el grupo zol-gel y los signos de dólar indican las diferencias significativas entre el grupo nHA-zol-gel y el grupo nHA-gel. Los datos para el grupo zol-gel y para el grupo de control se obtuvieron durante un estudio previo y se muestran solamente por razones comparativas. Línea continua gris: nHA-gel; línea de puntos gris: control; línea continua negra: nHA-zol-gel; línea de puntos negra: zol-gel; *: p < 0,05; **p < 0,01.

La figura 7 representa comparaciones de representaciones de volumen entre siempre 2 escaneos microCT consecutivos tomados a partir de dos muestras representativas de dos grupos experimentales, una del grupo nHA-gel (arriba) y una del grupo zol-gel (abajo).

La figura 8 representa la tasa de mineralización que incluye la formación de hueso y la mineralización de biomaterial medida en 4 capas alrededor del tornillo. Los signos de dólar indican las diferencias significativas entre el grupo nHA-zol-gel y el grupo nHA-gel. Los asteriscos indican las diferencias significativas entre el grupo nHA-gel y el grupo gel; no se encontraron diferencias significativas para el grupo nHA-zol-gel y el grupo zol-gel. Los datos del grupo zol-gel y del grupo de control se obtuvieron durante un estudio previo y se muestran solamente por razones comparativas. Línea continua gris: nHA-gel; línea de puntos gris: control; línea continua negra: nHA-zol-gel; línea de puntos negra: zol-gel; *: p < 0,05; **p < 0,01.

La figura 9 representa la tasa de desmineralización que incluye la resorción del hueso y la degradación del biomaterial medida en 4 capas alrededor del tornillo. Los signos de dólar indican las diferencias significativas entre el grupo nHA-zol-gel y el grupo nHA-gel. Los asteriscos indican las diferencias significativas entre el grupo nHA-gel y el grupo gel; no se encontraron diferencias significativas para el grupo nHA-zol-gel y el grupo zol-gel. Los datos del grupo zol-gel y del grupo de control se obtuvieron durante un estudio previo y se muestran solamente por razones comparativas. Línea continua gris: nHA-gel; línea de puntos gris: control; línea continua negra: nHA-zol-gel; línea de puntos negra: zol-gel; *: p < 0,05; **p < 0,01.

La figura 10 representa secciones histológicas de huesos de animales tratados. Fila superior y central: secciones de base teñidas con azul de toluidina para el grupo nHA-gel (arriba) y el grupo nHA-zol-gel (centro). Los asteriscos indican zonas de hueso inmaduras, no remodeladas; las elipses señalan el hueso viejo que queda. Las mineralizaciones se resaltan con polígonos. Las imágenes dentro de los rectángulos pequeños son imágenes de rayos X de las láminas de histología y muestran la mineralización de cada región. Fila de abajo: detalles de las muestras mostradas arriba teñidas con Giemsa para una mejor diferenciación entre hueso y mineralizaciones. En la imagen de la izquierda del grupo nHA-gel, se indican con flechas pequeñas mineralizaciones con forma de grano. En el lado derecho del grupo nHA-zol-gel, se indica con una línea una extensa región mineralizada; las áreas más pequeñas se resaltan también con flechas.

Descripción detallada de la invención

La presente descripción se puede entender más claramente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada que se presenta en relación con las figuras de los dibujos que acompañan, los cuales forman parte de esta descripción. Debe entenderse que esta descripción no se limita a las condiciones o parámetros específicos que se describen y/o muestran en la misma y que la terminología usada en ella es para describir realizaciones particulares solamente a modo de ejemplo y que no se pretende que limiten la descripción reivindicada.

Tal como se usan en esta descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “uno o una”, “y” y “el o la” incluyen referentes en plural a menos que claramente el contexto explicite otra cosa. De este modo, por ejemplo, la referencia a “una partícula” incluye una pluralidad de tales partículas y la referencia a “un agente” incluye la referencia a uno o más agentes, y así sucesivamente.

Asimismo, el uso de “o” quiere decir “y/o” a menos que se establezca otra cosa. De manera similar, las expresiones “comprende”, “que comprende”, “incluye” y “que incluye” son intercambiables y no se pretende que sean limitadoras. Adicionalmente, debe entenderse que cuando las descripciones de varias realizaciones usan la expresión “que comprende”, las personas expertas en la técnica deberían entender que en algunos casos específicos, una realización se puede describir de manera alternativa usando las expresiones “que consiste esencialmente en” o “que consiste en”.

En el marco de la presente descripción, una “composición bioactiva” es cualquier composición que comprende un agente activo. La expresión “agente activo”, así como las expresiones “compuesto bioactivo” o “agente terapéutico”, se refieren a cualquier agente que es biológicamente activo, es decir, que tiene un efecto sobre un organismo vivo, un tejido, o una célula. La expresión se usa aquí para referirse a un compuesto o entidad que altera, inhibe, activa o afecta de otra manera a los hechos biológicos o químicos.

Las personas conocedoras de la técnica se darán cuenta de que se pueden usar diversos agentes terapéuticos, dependiendo de la condición que se vaya a tratar. Entre los agentes terapéuticos de ejemplo se incluyen, aunque las posibilidades no se limitan a ellos: factores de crecimiento, proteínas, péptidos, enzimas, anticuerpos, secuencias de ácidos nucleicos (es decir, ADN o ARN), hormonas, agentes anti-inflamatorios, agentes antivirales, agentes antibacterianos, citoquinas, oncogenes, supresores de tumores, receptores transmembrana, receptores de proteínas, proteínas séricas, moléculas de adhesión, neurotransmisores, proteínas morfogenéticas, factores de diferenciación, analgésicos, proteínas de matriz, células y combinaciones de ellos. En otras realizaciones, el agente terapéutico puede ser un agente osteoinductor, un agente osteoconductor, un agente anti-resorción, moléculas orgánicas, polisacáridos y cualquier combinación de dichas sustancias.

Un agente anti-resorción según la presente invención es cualquier agente que inhibe la resorción del hueso, tal como los agentes que interfieren con la inflamación o agentes que inhiben la actividad de los osteoclastos (agentes antiosteoclásticos). Los agentes más importantes que pertenecen al grupo de los agentes anti-resorción son los bifosfonatos. Los bifosfonatos son análogos estructurales de los pirofosfatos. Tienen una actividad farmacológica específica para el hueso, debido a la fuerte afinidad química de los bifosfonatos para la hidroxiapatita. En una realización preferida, el agente activo es un bifosfonato tal como alendronato, risedronato, etidronato, ibandronato, pamidronato, zoledronato, o combinaciones suyas.

El agente activo de la composición de la presente invención se carga en partículas sólidas. Se puede unir químicamente a la superficie de las partículas, se puede incorporar en ellas o se puede colocar en las inmediaciones de ella. El término “partícula” se usa aquí para referirse a cualquier cuerpo tridimensional, independientemente de sus dimensiones y forma. El término incluye gránulos, granos, polvos, cristales, partículas esféricas o globalmente redondas, y similares. En un aspecto preferido de la invención, las partículas son partículas redondas. Las partículas tienen un tamaño medio de partícula entre 150 nm y 500 nm, incluso más preferiblemente entre 175 nm y 250 nm. En la realización más preferida, las partículas tienen un tamaño medio de partícula de 200 nm. El tamaño de partícula se refiere a la longitud de la dimensión más larga de las partículas. Se puede considerar la combinación de partículas que tienen diferente tamaño y forma.

Las partículas sólidas son partículas de fosfato de calcio. Una lista no exhaustiva de partículas de fosfato de calcio incluye partículas de apatita, partículas de hidroxiapatita, partículas de hidroxiapatita deficiente en calcio, partículas de apatita carbonatada, partículas de cloruro-apatita, partículas de fosfato de tetracalcio, partículas de oxiapatita, partículas de fostato de calcio amorfo, partículas de monohidrato fosfato monocalcio, partículas anhidras de fosfato de monocalcio, partículas deshidratadas de fosfato de dicalcio, partículas anhidras de dicalcio, partículas de fosfato de octacalcio, partículas de fosfato de tricalcio y cualquier combinación de ellas.

La composición bioactiva de la presente invención comprende un vehículo. Tal como se usa en este documento, un “vehículo” es cualquier sustancia que funciona como medio de dispersión para las partículas sólidas cargadas con el agente activo y que posibilita un medio de distribución adecuado para estas últimas. El vehículo comprende una matriz polimérica, es decir, una red organizada o amorfa compuesta de elementos monoméricos.

El vehículo de la composición de la presente invención es un hidrogel.

Tal como se usa en este documento, el término “gel” se refiere a una red coloidal no fluida o una red polimérica que se expande hasta todo su volumen mediante un fluido. Un gel es una red tridimensional sólida que abarca el volumen de un medio líquido y lo atrapa mediante efectos de tensión superficial. La estructura interna de la red puede ser resultado de enlaces físicos (geles físicos) o de enlaces químicos (geles químicos).

Tal como se usa en este documento, el término “hidrogel” se refiere a un gel en el cual el agente de hinchado es el agua. Un hidrogel es un gel polimérico macromolecular construido a partir de una red de cadenas poliméricas reticuladas. Se sintetiza a partir de monómeros hidrofílicos, algunas veces se encuentra como un gel coloidal en el cual el medio de dispersión es el agua. Los hidrogeles son redes poliméricas sintéticas o naturales altamente absorbentes (pueden contener por encima del 90 % de agua). Como resultado de sus características, los hidrogeles desarrollan propiedades mecánicas que los hacen firmes pero elásticos.

Varias propiedades físicas de los hidrogeles son dependientes de la concentración. El aumento de la concentración de hidrogel puede cambiar el radio de los poros del hidrogel, su morfología, o su permeabilidad a proteínas de diferente peso molecular. Las personas expertas en la técnica se darán cuenta de que el volumen o las dimensiones (longitud, anchura y espesor) del hidrogel de la composición bioactiva se pueden seleccionar en base a la región o entorno en el que se va a implantar el hidrogel. Las propiedades mecánicas del material se pueden personalizar según el sitio de aplicación cambiando el hidrogel (longitud de la cadena molecular, reticulado, contenido de agua) y/o su composición (relación partículas / hidrogel, tamaño de las partículas, forma de las partículas).

El hidrogel comprende o consiste en ácido hialurónico. El ácido hialurónico consiste en ácido glucurónico y acetilglucosamina que crean el disacárido ácido hialurónico. El ácido hialurónico tiene una estructura molecular no ramificada, fibrosa, y, por lo tanto, da como resultado disoluciones líquidas altamente viscosas. Las propiedades del ácido hialurónico se pueden mejorar de forma significativa con la reticulación, produciendo un hidrogel. Esta característica adicional permite conformar una forma deseada, así como distribuir moléculas terapéuticas, en un anfitrión. El ácido hialurónico se puede reticular adjuntándole tioles, metacrilatos, hexadecilamidas o/y tiramina. El hialuronano se puede reticular también directamente con formaldehido o con divinilsulfona. El hidrogel puede comprender también ácido hialurónico en forma de hialuronato de sodio.

La composición bioactiva se puede distribuir o aplicar a una región específica en un sujeto. De este modo, en un aspecto particular, la invención se refiere a la distribución o aplicación localizada de la composición bioactiva de la invención a una región del cuerpo objetivo en un sujeto. El pequeño tamaño y la naturaleza porosa de las partículas de fosfato de calcio en la composición bioactiva conduce a una fuerte adsorción de los agentes terapéuticos con alta afinidad, así como a la posterior liberación lenta del agente terapéutico. La composición bioactiva se caracteriza por su capacidad para interaccionar con y adsorber agentes terapéuticos, lo que la hace un vehículo de distribución ideal de dichos agentes a una región objetivo en un sujeto.

La composición bioactiva libera el agente activo en la región objetivo del sujeto de manera controlada y elimina los efectos adversos que se producen debido a la administración sistémica del agente terapéutico. En particular, el uso de la composición bioactiva de la invención puede evitar la “liberación explosiva” del agente terapéutico y reduce el coste provocado por la administración sistemática de agentes terapéuticos caros. Los métodos y composiciones de la invención proporcionan también una técnica mínimamente invasiva para el tratamiento de situaciones clínicas difíciles, tales como la curación de grandes defectos óseos.

La distribución local de la composición bioactiva, junto con la liberación controlada del agente terapéutico en una región localizada de un sujeto, se puede usar para favorecer el proceso de remodelación del hueso natural en esa región. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser un agente anti-resorción tal como bifosfonatos acoplados a las partículas sólidas, que se pueden incorporar en la composición bioactiva. Los bifosfonatos administrados de forma oral tienen el problema de que se absorben mal gastro-intestinalmente y necesitan ser suministardos en dosis altas. Además, algunos datos indican que en un pequeño porcentaje de pacientes la esofagitis es un efecto secundario potencialmente grave que se produce. De este modo, estos problemas hacen que se presente una limitación en el uso de los bifosfonatos según este modo de terapia y, hasta un cierto grado, cuando se aborda el problema local, hay una clara necesidad de realizar localmente la distribución del fármaco. La distribución localizada del agente activo mediante las composiciones de la invención tiene la ventaja de evitar los efectos adversos de la administración sistemática para proporcionar localmente la concentración deseada del agente en el sitio objetivo. Se mejora además la eficacia del agente terapéutico controlando la absorción y la desorción del agente terapéutico de tal forma que se libera a una tasa controlada. Esto permite que se distribuyan los agentes en el sitio objetivo con una dosis óptima para la curación, regeneración o reparación del hueso.

La composición de la invención puede comprender además al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, estructuras de refuerzo del hueso, compuestos que fomentan o favorecen el crecimiento del hueso y uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar una condición en la cual el uso de la composición bioactiva es beneficioso para mejorar dicha condición. Por ejemplo, cuando la composición bioactiva se usa para apoyar la regeneración reparación y curación del hueso en el caso de una fractura relacionada con osteoporosis (con o sin necesidad de implantación de una endoprótesis), la composición farmacéutica puede incluir además uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar la osteoporosis, o antibióticos que se pueden añadir a la composición cuando, por ejemplo, esta se usa para el tratamiento de cráteres en el hueso alrededor de implantes dentales en presencia de periimplantitis.

La composición bioactiva descrita en este documento es útil en diversas enfermedades, trastornos y defectos en los cuales la formación de hueso nuevo y/o la inhibición de la resorción del hueso son parte esencial de la terapia. La composición bioactiva es útil para grandes defectos en huesos largos como el fémur, la tibia, el peroné y el húmero y también para defectos en el cuerpo vertebral. Asimismo, la composición es particularmente útil en enfermedades periodontales en las que el hueso alveolar necesita el crecimiento de hueso nuevo para soportar implantes dentales. Por lo tanto, la composición bioactiva se puede utilizar para diversos procedimientos quirúrgicos ortopédicos, maxilofaciales y dentales, tal como la reparación de fracturas sencillas o compuestas, no uniones que necesiten fijación externa o interna, reconstrucción de articulaciones y sustitución total de articulaciones, reparaciones de la columna vertebral incluyendo la fusión espinal y la fijación interna, cirugía de tumores, reparación de daños espinales, y deformidades espinales, como la escoliosis, fijación intramedular de fracturas, mentoplastia, sustitución de la articulación temporomandibular, aumento y reconstrucción de la cresta alveolar, implantes de hueso mediante incrustación, revisión y sustitución de implantes y similares.

Las composiciones típicamente preferidas son las que están en forma de hidrogeles inyectables.

Además, la composición puede rellenar cavidades presentes en implantes de hueso no biodegradables o herramientas quirúrgicas o se puede aplicar a la superficie de estos dispositivos. También se puede imaginar una aplicación de la composición según la presente invención mediante implantes que presentan canales o ranuras tal como tornillos canulados. Además, la composición se puede incorporar en implantes biodegradables existentes tales como tornillos o placas reabsorbibles, o se puede añadir a formulaciones existentes como cementos de hueso biodegradables, disoluciones de enjuague o revestimientos para implantes.

En una realización preferida, la composición bioactiva se formula en forma inyectable. Si es necesario, la composición bioactiva se puede mezclar con una cantidad suficiente de agua o de una disolución tampón fisiológicamente compatible para producir la consistencia deseada para que se pueda inyectar. La mayoría de las veces será tan espesa como sea posible siempre y cuando pueda pasar a través de una jeringa de calibre 16-18. También se pueden usar jeringas de otros calibres tal como la jeringa de calibre 12-14, así como estructuras mayores tales como catéteres, cánulas o boquillas de gran dosificación cuando se aplica la composición por ejemplo a defectos de huecos superficiales como cráteres de implantes dentales. Para algunas formulaciones que necesitan inyectarse directamente en tejido sólido (por ejemplo, en hueso esponjoso de un paciente con osteoporosis) se pueden usar consistencias más finas (por ejemplo, 1,5 ml H2O / g de composición bioactiva). En una realización preferida, el modo de administración es mediante inyección in situ (es decir, inyección de la composición directamente en el área del hueso a tratar).

La invención proporciona también composiciones farmacéuticas que comprenden la composición bioactiva de la invención. En otra realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden, opcional y adicionalmente, comprender un vehículo, excipiente y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en este documento, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera de: todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen disoluciones de cloruro de sodio, disoluciones de cloruro de sodio tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite en agua, diversos tipos de agentes humectantes, disoluciones estériles, disolventes orgánicos y así sucesivamente. El vehículo contiene, de manera adecuada, cantidades menores de aditivos tales como sustancias que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química. Tales materiales son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen disoluciones tampón como por ejemplo fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes como el ácido ascórbico; (poli)péptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulina; polímeros hidrofílicos como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azúcar como manitol o sorbitol; contraiones como sodio; y/o tensioactivos no iónicos como polisorbatos, poloxámeros o PEG.

Ejemplos

Habitualmente, en el pasado, los bifosfonatos (a partir de ahora “BPs”) se han absorbido sobre implantes en masa o revestimientos de hidroxiapatita (a partir de ahora de “HA”) utilizando la alta afinidad del fármaco con el mineral. Enlazar los BPs a hidroxiapatita en masa se asocia con una liberación lenta del fármaco ya que se necesita un pH bajo para la liberación espontánea del medicamento de la superficie mineral. Sin embargo, una disponibilidad rápida del BP parece ser importante para un efecto positivo sobre la formación temprana de hueso. Por tanto, los inventores tuvieron la intuición de combinar los BPs con partículas de HA lo suficientemente pequeñas como para que se puedan distribuir fácilmente en el hueso y puedan ser captadas por los osteoclastos. Mediante experimentos in vitro en ensayos con células e in vivo en un modelo de rata osteoporótica, los inventores encontraron, de manera inesperada, efectos sinérgicos en la remodelación del hueso del periimplante utilizando una composición que comprende partículas de tamaño nanométrico de hidroxiapatita osteoconductora cargadas con el bifosfonato zoledronato y un hidrogel de ácido hialurónico. La presente invención se basó, al menos en parte, en investigaciones previas realizadas en el laboratorio de los inventores que mostraron que el zoledronato distribuido localmente a partir de un hidrogel de ácido hialurónico aumenta la tasa de formación temprana de hueso hasta un 100 % inhibiendo a la vez de manera eficiente la resorción del hueso del peri-implante. Sorprendentemente, el principal hallazgo de la presente invención no estaba, sin embargo, directamente relacionado con el bifosfonato anti-resorción zoledronato. El estudio in vivo en un modelo de rata de osteoporosis postmenopaúsica mostró una mineralización inesperadamente rápida del hidrogel cargado con partículas de HA ya entre el día 3 y el día 10 después de la implantación, con y sin la presencia de zoledronato. El fármaco mostró su fuerte efecto más tarde durante el estudio e inhibió de manera eficiente la resorción del hueso presente y formado de nuevas, así como la degradación del biomaterial.

Materiales y métodos

El zoledronato usado para este ensayo se compró a la empresa Enzo Life Sciences (número de artículo ALX-430-153-0000, Enzo Life Sciences, Farmingdale, Estados Unidos de América) y el polvo de hidroxiapatita (nHA) con un tamaño de partícula menor de 200 nm se compró a Sigma (número de artículo 677418, Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, Estados Unidos de América). Esas partículas tienen una estructura redondeada (figura 1). La nHA se esterilizó con calor antes de su uso. El medio de cultivo celular (MCC) para los estudios in vitro se preparó mezclando el medio Eagle modificado Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés, Gibco) con suero bovino fetal al 10 % (Sigma, , San Luis, Missouri, Estados Unidos de América) y 1 % de penicilina / estreptomicina.

Ensayo con células in vitro

Se usaron macrófagos murinos (RAW 264.7, pase 13) para el presente estudio ya que se ha mostrado que tales células reaccionan in vitro a la exposición a bifosfonatos de la misma forma que los osteoclastos y que toleran bien la presencia de las partículas de HA. Se preparó una disolución acuosa de zoledronato con una concentración de 2 mg/ml y se filtró de manera estéril. La disolución del fármaco se diluyó con MCC hasta una concentración final de 80 pM de zoledronato. Una dilución adicional con MCC dio un medio suplementado con zoledronato (zol-MCC) con concentraciones 80 pM, 40 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2,5 pM y 1,25 pM. El procedimiento de dilución se repitió con una dispersión acuosa que contenía 2mg/ml de zoledronato y 20 mg/ml de nHA (nHA-zol-MCC). Se sembraron los macrófagos con una densidad de 2500 células por pocillo en placas de 96 pocillos. (Microtest™ 96, Becton Dickinson Labware, New Jersey, Estados Unidos de América) y se incubaron con 100 pl de MCC en condiciones estándar de incubación (37 °C, 5 % CO2). Tras 24 h de incubación, se añadieron a las células 100 pl de MCC, zol-MCC o nHA-zol-MCC; por lo tanto las concentraciones finales de zoledronato en el MCC eran 40 pM, 20 pM, 10 pM, 5 pM, 2,5 pM, 1,25 pM y 0,625 pM. Se realizó un ensayo de proliferación celular (CellTiter 96® AQueous One Solution, Promega, Winsconsin, Estados Unidos de América) tras 24, 48 y 72 horas de exposición de las células al MCC modificado. Se midió la absorbancia con un lector de placas (Wallac 1420 Victor 2, Perkin Elmer, Waltham, Massachussets, Estados Unidos de América). Se midieron las placas de base con solo el medio modificado en todos los momentos temporales para evitar el sesgo debido a las partículas de nHA en las dispersiones.

Preparación del hidrogel

Se usó un ácido hialurónico reticulado disponible comercialmente (Termira AuxiGel™ Estocolmo, Suecia) como matriz vehículo para el BP. La preparación del hidrogel se realizó en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Se preparó una disolución acuosa de zoledronato con una concentración de 2 mg/ml y se filtró de manera estéril. Se añadió el nHA a la disolución en una relación nHA / zoledronato de 100:1. Se aseguró la dosis exacta de fármaco mezclando cantidades medidas y pesadas con precisión de zoledronato, nHA y agua destilada. Se consiguió el reticulado del hidrogel mezclando un derivado de hialuronano (componente A) con un reticulador PVA (componente B). Se mezclaron 5 partes de la disolución zoledronato / nHA con 3 partes del componente A y 2 partes del componente B para el grupo nHA-zol-gel. Para el grupo nHA-gel la dispersión de zoledronato y nHA se sustituyó por agua bidestilada con nHA. Se dejó que los geles resultantes se asentaran durante 1 hora antes de llenar los pistones capilares de una pipeta de desplazamiento positivo (Microman® Gilson, Middleton, Estados Unidos de América) con 5 pl de gel cada una de ellas. Se sacaron los capilares de la pipeta con el gel dentro y se dejaron estabilizar durante 1 hora. Luego se empaquetaron de forma estéril en tubos de plástico y se congelaron a -20 °C.

Estudio de liberación del fármaco

Se evaluó la liberación de zoledronato a partir del hidrogel que contenía partículas de nHA y de hidrogel puro de manera indirecta con un ensayo celular. Se preparó hidrogel cargado con zoledronato con y sin nHA siguiendo la técnica previamente descrita. Los geles se incubaron durante 1 hora en agua bidestilada a temperatura ambiente (figura 2). La relación de agua a gel fue 3:1 para alcanzar una concentración total de 250 pg por 1 ml de volumen de líquido/gel. Para comparación, se preparó también una disolución acuosa de zoledronato con una concentración de 250 pl/l (figura 2). La disolución de zoledronato se filtró de forma estéril y se diluyó en MCC hasta alcanzar concentraciones finales de 10 pM, 5 pM y 0,625 pM. Se diluyó de forma similar el sobrenadante procedente de la incubación del hidrogel. Se prepararon células RAW 264.7 como se ha descrito previamente. Tras 24 h de incubación en MCC se añadieron 100 pl del medio preparado; por lo tanto, las concentraciones finales de zoledronato fueron 5 pM, 2,5 pM y 0,3125 pM. Se llevó a cabo un ensayo de proliferación celular tras 24, 48 y 72 horas de incubación con zoledronato.

Estudio in vivo

Se llevó a cabo el estudio in vivo en un modelo femoral de rata de osteoporosis postmenopáusica siguiendo un protocolo bien establecido. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el comité local de uso y cuidado animal (licencia número 2508.1, EXPANIM, SCAV, Epalinges, Suiza).

Procedimientos quirúrgicos

Ocho ratas Wistar hembras vírgenes (Janvier Labs, Saint-Berthevin, Francia) se ovariectomizaron bilateralmente con un enfoque dorsal a una edad de 17 semanas y con un peso de 295 ± 18 g para inducir una pérdida de hueso relacionada con la deficiencia de estrógenos. Se alojaron 4 ratas por jaula bajo ciclos de 12 h de luz y 12 h de oscuridad a temperatura ambiente de 22 °C con 55 % de humedad. Se alimentaron con una dieta de roedores estándar (KLIBA NAFAG 3436, Provimi Kiba AG, Suiza) y agua del grifo a voluntad. Después de la ovariectomía (OVX) de las ratas, se limitó la toma de alimento a 50 g por kg de peso corporal por día. Para enriquecer el medio ambiente de la jaula se ofrecieron forraje esterilizado, túneles de papel y barritas de madera. Los animales se alimentaron en grupos; por lo tanto, se aseguró una nutrición igual de todos los animales mediante control y seguimiento cercano y pesaje periódico. Cuando las ratas tenían 22 semanas y un peso de 350 ± 20 g, se implantaron tornillos en miniatura bilateralmente en los cóndilos femorales de las ratas. Los tornillos, con una longitud de rosca de 3 mm y un diámetro de 1,4 mm se fabricaron a medida de polieteretercetona (PEEK) radioopaca (RISystem, Davos, Suiza) y se revistieron con una capa de 100 nm de titanio para imitar la interfaz con un tornillo ortopédico estándar. Antes de la inserción del tornillo, se rellenaron los agujeros del tornillo unicorticales pretaladrados (diámetro 1,2 mm, profundidad 3,5 mm) con 5 |ul del hidrogel preparado que contenía solo nHA (grupo nHA-gel) o nHA y 5 |ug de zoledronato (grupo nHA-zol-gel) con una pipeta de desplazamiento positivo. Se trataron ambas piernas de cada animal con el mismo hidrogel para evitar un efecto indeseado del fármaco en el lado contralateral.

Imágenes de micro Nomografía por ordenador (micro-CT) in vivo y procesado de imágenes

Se realizaron escaneos micro-CT in vivo (Skysscan 1076 Bruker microCT, Kontich, Bélgica) del fémur derecho solamente un día antes de la OVX y un día antes de la implantación del tornillo con el fin de confirmar la pérdida de hueso provocada por la pérdida de estrógenos. Luego, ambos fémures se escanearon en los días 3, 10, 17, 31,45 y 58 después de la implantación del tornillo para la histomorfometría dinámica. Se escogieron los parámetros para la adquisición de datos y la reconstrucción según un protocolo previamente ensayado. Los animales se mantuvieron bajo anestesia de isoflurano durante el tiempo de escaneo para evitar artefactos debidos al movimiento. Se sacrificaron todas las ratas en el momento del último escaneo microCT con pentobarbital (Esconarkon, Strauli Pharma SA, Uznach, Suiza), mientras estaban todavía anestesiadas. Se procesaron y analizaron las imágenes tomadas de la evaluación de la pérdida de hueso y para la histomorfometría dinámica utilizando los programas Amira® (FEI Vizualisation Sciences Group, Burlington, Estados Unidos de América) y CTan (Bruker microCT, Kontich, Bélgica). La histomorfometría dinámica es una técnica de procesamiento de imágenes basada en el registro y comparación de escaneos microCT dinámicos. Se considera que el volumen de tejido mineralizado que está presente solamente en el primer escaneo microCT se está resorbiendo o degradando, mientras que el presente solo en el segundo escaneo se considera tejido recién mineralizado o hueso formado. Para un análisis del efecto espacio-temporal, los parámetros de hueso estático y dinámico se analizaron en 4 capas de 368 |um cada una, alrededor del tornillo. Se ha demostrado previamente que esta partición da una buena idea de la curación del hueso en la zona del periimplante y de la remodelación del hueso normal.

Histología

Se disecaron los fémures de las ratas justo después de su sacrificio y se fijaron, deshidrataron y se insertaron en PMMA. Tras la polimerización, se cortaron las secciones, se pegaron a láminas de PMMA y se pulieron antes de grabar químicamente su superficie con ácido fórmico al 0,7 % (Applichem, Gatersleben, Alemania) y se tiñeron con Giemsa (VWR, Dietikon, Suiza) o azul de toluidina (VWR, Dietikon, Suiza). Se tomaron imágenes al microscopio para su evaluación utilizando un microscopio vertical (DM 5500 Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania). Finalmente, las secciones de base (“ground sections”) se sometieron a rayos X (Skyscan 1076, Bruker microCT, Kontich, Bélgica) para cartografiar la densidad del tejido.

Estadística

Se realizaron pruebas estadísticas con Matlab (Mathworks, Natick, Massachussets, Estados Unidos de América). Los valores que caían fuera del intervalo de 1,5 veces el intervalo cuartílico se identificaron como atípicos y se excluyeron. Los resultados de los escaneos OVX se analizaron mediante una prueba t comparada después de realizar una prueba Lelliefors para probar la distribución normal. En el caso en que no se podía confirmar la distribución normal, se usó la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon. Los parámetros de los tejidos mineralizados estáticos y dinámicos se probaron en cuanto a su significancia mediante un ANOVA Kruskal Wallis no paramétrico seguido de un test HSD Tukey (o test Tukey de “diferencia honradamente significativa”) puesto que no se pudo confirmar en todos los grupos la distribución normal y la igual varianza.

Ejemplo 1

Efecto in vitro sobre los macrófagos

El ensayo de proliferación celular que se realizó con macrófagos murinos RAW 264.7 mostró una disminución de la proliferación dependiente de la dosis para las células que se expusieron a concentraciones de zoledronato de 0,16 a 40 gM (figura 3). Este efecto inhibidor se favoreció de manera significativa mediante la presencia de nanopartículas de hidroxiapatita que se añadieron a la disolución con una proporción nHA / zoledronato de 10:1. Debido a la alta afinidad del zoledronato con la hidroxiapatita, debe asumirse que la mayor parte del fármaco fue absorbido por las partículas y por lo tanto no estaba presente en la disolución. Las imágenes del microscopio óptico mostraron que los macrófagos se incorporaban a las partículas cargadas con zoledronato rodeándolas. Este hallazgo sugiere que las células han captado el fármaco junto con las partículas de nHA. Se ha mostrado que las partículas son incorporadas por los macrófagos via pinocitosis solo para tamaños menores de 500 nm; las partículas más grandes son fagocitadas. Las partículas usadas para este estudio tenían un tamaño menor de 200 nm pero forman aglomeraciones, de tal forma que se tienen que considerar los dos mecanismos. Con el fin de descartar un efecto negativo del propio polvo de nHA sobre los macrófagos, también se cultivaron solos con partículas. Los resultados muestran que las células toleraban bien la presencia de las partículas. Este hallazgo está de acuerdo con la bibliografía ya que otros estudios han mostrado que partículas de HA con diferentes tamaños y formas no impactan de manera considerable la viabilidad de los macrófagos RAW 264.7 hasta una concentración de 500 gg/ml.

Ejemplo 2

Estudio de liberación del fármaco

El estudio de proliferación celular con macrófagos murinos solo permite una estimación aproximada de la liberación pasiva muy temprana del gel de ácido hialurónico. Se estimó la concentración de fármaco en el medio de dos grupos de liberación (zol-gel, nHA-zol-gel) comparando su proliferación celular con el grupo de referencia (zol) en el que se había puesto una cantidad conocida de zoledronato. Cuando se compara el grupo zol-gel con el grupo nHA-zol-gel, se puede ver una clara diferencia entre la proliferación celular de ambos casos (figura 4). Comparando las curvas, se puede estimar que la concentración final de zoledronato en el MCC del grupo zol-gel debe haber sido alrededor del 75 % (50 % - 100 %) de las máximas concentraciones posibles que podrían verse si el fármaco no hubiera sido retenido en absoluto por el hidrogel (grupo zol). Este resultado confirma la hipótesis de que el hidrogel altamente poroso distribuye las pequeñas moléculas de zoledronato mediante una liberación explosiva. Por el contrario, el sobrenadante diluido nHA-zol-gel no mostró una diferencia significativa respecto del control en ningún momento y a ninguna concentración. Este resultado sugiere que no se ha liberado ninguna cantidad significativa de fármaco durante la primera hora de incubación en agua, y que, por lo tanto, hay un cambio en las propiedades de liberación del zoledronato debido a la presencia de las partículas de nHA. Dado que el sobrenadante se filtró antes de añadirlo al MCC, solamente se puede concluir que no había nada de zoledronato en la disolución después de 1 hora de incubación en H2O.

Ejemplo 3

Estudio in vivo

Todas las ratas aceptaron bien ambas cirugías y volvieron a su actividad normal justo después de la cirugía. La toma de comida limitada permitió una ganancia controlada de peso de los animales; su peso final medio era 384±24 g. El análisis de los parámetros del hueso basados en los escaneos microCT realizados antes y después de la ovariectomía confirmó una ovariectomía con éxito, mostrando una pérdida de hueso en todos los animales similar a los resultados encontrados antes en este modelo.

Histomorfometría dínamica basada en microCT (micro tomografía por ordenador)

Se analizaron 87 escaneos microCT en total para la histomorfometría dinámica, ya que 3 tuvieron que excluirse debido a artefactos de movimiento. Una pata de un animal del grupo nHA-zol-gel mostró una formación de hueso excesiva y, por lo tanto, se excluyó también. En cada grupo se dejaron de cinco a ocho muestras después de quitar los resultados atípicos. La rapidez de la aparición y la estructura del tejido mineralizado que se estaba formando que se hacía visible en los escaneos microCT sugerían que no solo puede ser hueso formado (figura 5). La histología confirmó más tarde que el compuesto de hidrogel y nHA calcifica in vivo. Puesto que es imposible distinguir en los escaneos microCT entre el hueso y la hidroxiapatita, los inventores analizaron en su lugar la tasa de mineralización (TM) y la tasa de desmineralización (TD) en vez de la tasa de formación de hueso y la tasa de resorción de hueso y el volumen de tejido mineralizado (CV) en vez del volumen de hueso (BV, por sus siglas en inglés).

Parámetros estáticos

Solamente se analizó un parámetro estático, la fracción de tejido mineralizado (CV/TV), para este estudio, ya que todos los otros parámetros típicos del hueso serían engañosos al examinar la mezcla de hueso y de biomaterial que se mineraliza. Los resultados de este estudio se compararon con el valor de BV/TV que se consiguió con hidrogel cargado con zoledronato puro y en animales de control sin biomaterial en un estudio previo. Esta comparación permite una evaluación de la influencia de la nHA. Los valores de CV/TV se normalizaron respecto del primer escaneo microCT (correspondiente al día 3) para descartar el sesgo provocado por la nHA que era visible en los escaneos microCT ya en el día 3. El análisis del cociente CV/TV en la capa junto a la superficie del tornillo (0-368 pm) no mostró diferencia entre el grupo nHA-zol-gel y el grupo que liberó el fármaco del hidrogel puro (grupo zol-gel) (figura 6). En la segunda capa (368-736 pm) la ganancia en el cociente CV/TV fue de alrededor del 50 % mayor en el grupo nHA-zol-gel que en el grupo zol-gel empezando a partir del día 17. Sin embargo, un valor importante de la desviación estándar impedía considerar que los resultados fueran estadísticamente significativos. Esta diferencia disminuyó hasta aproximadamente 30 % en la tercera capa (736-1104 pm); de nuevo, debido a la alta variabilidad de los resultados no se pudo mostrar que la diferencia fuera significativa. En la cuarta capa (1104-1472 pm); no fue visible ninguna diferencia en absoluto. Para comparación con el grupo nHA-gel, el grupo de control del estudio previo se ha escogido como referencia debido a que se había mostrado que el hidrogel de ácido hialurónico puro no tenía influencia en absoluto sobre la curación y el remodelado del hueso en la zona del periimplante, comparado con el control. Cerca del tornillo (0-368 pm), la nHA en el hidrogel provoca una ganancia en la fracción de tejido mineralizado que era alrededor de 30 % mayor que en el grupo de control durante el período experimental completo. La diferencia, sin embargo, no fue estadísticamente significativa. En la segunda capa, (368-736 pm), la relación CV/TV se dobló entre el día 3 y el día 10, lo que fue comparable a los grupos tratados con zoledronato y significativamente mayor que en el grupo de control que mostró una valor constante de CV/TV. Más tarde, la diferencia entre los dos grupos disminuyó y fue solo mínima al final del período experimental. Un desarrollo similar se podría observar en la tercera capa, en la que la ganancia inicial en el cociente CV/TV fue solo del 50 % y la diferencia entre el grupo nHA-gel y el grupo de control se niveló el día 17. No se pudo encontrar diferencia entre el grupo nHA-gel y el grupo de control en la capa exterior (1104-1472 pm).

Parámetros dinámicos

El análisis de los parámetros dinámicos da información acerca de los procesos de formación y resorción del hueso. En el caso del presente estudio, no está claro que parte de la estructura mineralizada que aparece era hueso nuevo y que parte era biomaterial que se estaba mineralizando; por lo tanto, se midió una tasa de mineralización general en vez de una tasa de formación de hueso. Lo mismo se aplica para la tasa de resorción de hueso que se denominó tasa de desmineralización para este estudio e incluía la resorción del hueso y la degradación del biomaterial. Una representación 3D de un ejemplo para cada grupo de estudio (figura 7) dio una buena visión general de los procesos de mineralización y desmineralización. En ambos grupos se encontró una mineralización significativa alrededor del tornillo entre el día 3 y el día 10, que fue seguida por una pronunciada desmineralización en el grupo nHA-gel. Asimismo, el hueso alrededor del sitio de implantación se reabsorbió gradualmente. El grupo nHA-zol-gel, por el contrario, mostró solo muy poca desmineralización en la región analizada. Estos hallazgos también se representaron en las tasas de mineralización y desmineralización medidas (figuras 8 y 9). No se pudieron encontrar diferencias en la tasa de mineralización entre los dos grupos de este estudio y los dos grupos sin nHA del experimento previo en contacto directo con el tornillo (capa 0-368 pm). En el segundo grupo (368-736 pm), sin embargo, entre el día 3 y el día 10 había una diferencia altamente significativa entre el grupo nHA-gel y el grupo de control y una ligera tendencia a una mayor tasa de mineralización en el grupo nHA-zol-gel respecto del grupo que liberó el fármaco directamente desde el hidrogel (grupo zol-gel). Estas diferencias se nivelaron el día 10. La misma situación se pudo encontrar también en las dos capas exteriores (736-1472 pm). Cuando se mira a la tasa de resorción del hueso, se vio la diferencia típica entre los grupos con zoledronato y sin zoledronato. El pico de resorción / desmineralización del hueso entre los días 10 y 31 que es característico de los grupos libres de fármaco fue completamente inhibido por el zoledronato distribuido localmente. La tasa de desmineralización del grupo nHA-zol-gel no difería en ningún momento y en ninguna zona de la del grupo zol-gel. Cuando se compara el grupo nHA-gel con el grupo de control, hay una tendencia inesperada a una mayor tasa de desmineralización en el grupo nHA en las dos capas exteriores (736-1472 pm).

Ejemplo 4

Histología

Los resultados histológicos confirmaron el hallazgo anterior de que el hidrogel de ácido hialurónico usado se degrada completamente tras 58 días desde la implantación, sin dejar ningún residuo visible (figura 10). Todos los tornillos mostraron una buena osteointegración sin ninguna reacción de inflamación o encapsulación de tejido fibrótico. De manera sorprendente, en ambos grupos nHA-gel y nHA-zol-gel, había regiones de mineralizaciones presentes dentro del hueso. Estas mineralizaciones con forma de gránulo tenían un diámetro de hasta un máximo de 50 pm en el grupo nHA-gel y se extendían a través de amplias áreas en el grupo nHA-gel. Los rayos X tomados de los cortes histológicos indicaron que esas mineralizaciones pueden ser más densas que el hueso. Se puede excluir que esas regiones representen partículas de nHA que quedan ya que esas partículas tienen un diámetro menor de 200 nm y las mineralizaciones observadas son mucho mayores. En el grupo nHA-gel, solo se encontraron pequeñas cantidades de esas mineralizaciones en islas de hueso nuevo localizadas principalmente cerca de la punta del tornillo, la región en la cual se acumula el hidrogel durante la inserción del tornillo. Las mineralizaciones estaban completamente integradas en la matriz de hueso y los constructos resultantes mostraban una estructura trabecular. En la médula del hueso alrededor de estas islas de mineralización del hueso estaban presentes grandes cantidades de células multinucleadas tales como macrófagos y células del cuerpo extrañas gigantes, lo que indicaba una resorción en marcha del biomaterial. No se pudo detectar en este grupo la formación de hueso nuevo aparte de una capa delgada cerca de la superficie del tornillo y del hueso cercano al biomaterial. Casi no quedaba hueso trabecular alrededor del tornillo en los animales del grupo nHA-gel 13 semanas después de la OVX. El grupo nHA-zol-gel mostraba una situación completamente diferente. Pudieron encontrarse mineralizaciones significativamente más grandes cerca de la punta del tornillo, pero también entre los hilos de rosca. El biomaterial que quedaba tenía una estructura porosa y está penetrado parcialmente por el tejido del hueso. En contraste con lo observado en el grupo nHA-gel, los constructos de mineralización del hueso eran más bien compactos y no mostraban una estructura de tipo trabecular. Pudieron detectarse cantidades más pequeñas de macrófagos, pero no células corporales extrañas gigantes en la médula del hueso cerca del biomaterial, lo cual confirma el efecto inhibidor del zoledronato. En general, se podía encontrar un hueso mucho más trabecular cerca y lejos del tornillo en el grupo nHA-zol-gel que en el grupo nHA-gel. Se formó hueso nuevo cerca y lejos de la superficie del tornillo y especialmente también en la interfaz con el biomaterial. También se vio la formación de un callo perióstico significativo en el grupo nHA-zol-gel que no estaba presente en el grupo nHA-gel en esa medida.

El hallazgo más sorprendente de este estudio fue la rápida mineralización in vivo del hidrogel que sucedió independientemente del bifosfonato en ambos grupos. Se sabe que las partículas de fosfato de calcio pueden actuar como sitios de nucleación en matrices de hidrogel que fomentan la precipitación de la HA. Se ha investigado este fenómeno en el pasado principalmente in vitro con fluidos corporales simulados, pero la presente invención mostró por primera vez tal rápida mineralización in vivo. Las mineralizaciones que se encontraron en el presente estudio mostraron principalmente una estructura de tipo granular con un tamaño de partícula de hasta 50 gm formada por la deposición de hidroxiapatita empezando a partir de las partículas de nHA como puntos de nucleación. En el grupo nHA-zol-gel, los gránulos parecían haberse fusionado incluso en regiones mineralizadas más grandes, como se muestra mediante la histología. La integración completa de los gránulos recién formados en la matriz de hueso sin ningún signo de inflamación o reacciones a cuerpos extraños confirmó su excelente biocompatibilidad y osteoconductividad. Cuando se comparó el grupo nHA-gel de este estudio con un grupo de control de un estudio previo que recibió solo tornillos (datos no mostrados) se observó una diferencia significativa en la mineralización temprana en las tres capas exteriores analizadas (736-1472 gm). La diferencia disminuyó con el tiempo y quedó solo como una tendencia en las dos capas interiores. La explicación a este fenómeno es una mineralización rápida inicial del biomaterial seguida por la degradación y la penetración por el tejido del hueso que se producen simultáneamente, como se muestra mediante cambios estructurales en escaneos micro-CT separados temporalmente y en los resultados de histología terminal.Las grandes cantidades de macrófagos y células del cuerpo extrañas gigantes que se pudieron encontrar en el grupo nHA-gel muestran una biodegradación eficiente de la hidroxiapatita. Las mineralizaciones obvias del biomaterial complicaron la evaluación del efecto del fármaco sobre el hueso del periimplante. Las imágenes microCT in vivo no permiten una diferenciación entre el tejido óseo formado de nuevas y el hidrogel mineralizado. Sin embargo, hay una fuerte tendencia a mayor mineralización del tejido en las dos capas centrales de la región analizada (368-736 gm) que aparece antes y permanece durante todo el tiempo del estudio. Los contribuyentes a esta ganancia de tejido mineralizado podrían ser, por una parte, la formación de nuevo tejido óseo y, por otra, la mineralización del biomaterial. En estudios previos de los inventores se mostró que el impulso descubierto en la formación temprana de hueso en el periimplante estaba provocado por un “lavado” de todas las células del hueso con bifosfonato. Con el estudio de liberación que se presenta aquí, se puede ver que este lavado no se produce cuando se incluye la nHA en la matriz de hidrogel ya que el zoledronato es absorbido por las partículas. Se puede suponer que la liberación de las partículas comparativamente enormes de nHA es significativamente más lenta que la liberación de las moléculas pequeñas de fármaco. Ya que es menos probable que los osteoblastos no fagocíticos incorporen partículas cargadas con zoledronato, se puede suponer menos influencia en la formación de hueso del grupo nHA-zol-gel respecto de la situación en la que el zoledronato se distribuye a partir de hidrogel puro. No obstante, también se pueden mostran diferencias pequeñas, pero todavía significativas, para la tasa de mineralización entre el grupo nHA-gel y el grupo nHA-zol-gel. Desde el día 7 al 10 hubo una mayor tasa de mineralización vista en el grupo nHA-gel y desde el día 31 -58 en el grupo nHA-zol-gel. Como conclusión, la combinación zoledronato-nHA debe influir en la formación del hueso y/o en la biomineralización del biomaterial de una forma diferente a la de la nHA pura. Cuando se observa la tasa de desmineralización, el fuerte efecto inhibidor del zoledronato resulta obvio en las altamente significativas diferencias entre el grupo nHA-gel y el grupo nHA-zol-gel. El estudio microCT y la histología revelaron que el fármaco no solamente inhibió la resorción del hueso sino también la degradación del biomaterial como puede verse por la ausencia de macrófagos y células del cuerpo extrañas gigantes y por las cantidades mucho mayores de mineralizaciones que quedan en el grupo nHA-zol-gel. La histología muestra también que el constructo hueso / biomaterial en el grupo nHA-gel ya había sido remodelado a una estructura trabecular mientras que todavía era más bien compacto en el grupo nHA-zol-gel. De manera sorprendente, no hay diferencia en la tasa de desmineralización entre el grupo zol-gel del primer estudio y el grupo nHA-zol-gel del presente estudio incluso a mucha distancia del tornillo (1104-1472 gm) en donde es poco probable que el hueso esté en contacto con el hidrogel. Por lo tanto, debe existir o bien una liberación de las partículas cargadas con fármaco o bien una liberación del fármaco solo puesto que puede ser provocada por la actividad de resorción de los osteoclastos o macrófagos.

Los materiales probados son fáciles de aplicar al hueso debido a su consistencia blanda que los hace perfectos para una aplicación a cavidades de forma irregular como el lecho de un implante o defectos del hueso de difícil acceso. Se ha mostrado también que estos materiales calcifican rápidamente in vivo y que forman una especie de andamio mineral osteoconductor. Este andamio o estructura biodegradable es penetrado luego por células del hueso y se incluye en el hueso formado de nuevas. El hidrogel con nHA y zoledronato sería favorable para la reparación de defectos de hueso que necesitan al mismo tiempo la conservación de la matriz de hueso que los rodea.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que mineraliza in vivo que comprende una pluralidad de partículas sólidas de fosfato de calcio cargadas con un agente activo y dispersadas en un vehículo de hidrogel que comprende ácido hialurónico, caracterizado porque las partículas tienen un tamaño medio comprendido entre 150 nm y 500 nm.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que las partículas sólidas se escogen en el grupo que consiste en cristales, gránulos, partículas redondeadas, partículas esféricas o cualquier combinación de las mismas.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el agente activo es un agente antirresortivo.

4. La composición de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el agente activo consiste en o incluye un bifosfonato.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que el bifosfonato incluye o consiste en zoledronato.

6. La composición de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las partículas sólidas de fosfato de calcio son partículas de hidroxiapatita.

7. La composición de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque está en forma de hidrogel inyectable.

8. Una formulación farmacéutica que comprende la composición de las reivindicaciones 1 a 7.