ES2889914B2 - GLYCOSYLATION PATTERN OF sAPPalpha AND/OR sAPPbeta AS DIAGNOSTIC BIOMARKER OF ALZHEIMER'S DISEASE, METHOD AND KIT BASED ON THE SAME - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓNDESCRIPTION
PATRÓN DE GLICOSILACIÓN DE sAPPa Y/O sAPPp COMO BIOMARCADOR DIAGNÓSTICO DE LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER, MÉTODO Y KIT BASADOS GLYCOSYLATION PATTERN OF sAPPa AND/OR sAPPp AS DIAGNOSTIC BIOMARKER OF ALZHEIMER'S DISEASE, BASED METHOD AND KIT
EN EL MISMOIN THE SAME
SECTOR DE LA TÉCNICATECHNICAL SECTOR
La invención se relaciona con métodos in vitro de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en los que se determina el patrón de glicosilación de proteínas. En particular, la invención se relaciona con un método in vitro en el que se determina el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp, fragmentos generados en el procesamiento proteolítico del precursor de la proteína amiloide (APP).The invention relates to in vitro methods for diagnosing Alzheimer's disease in which the protein glycosylation pattern is determined. In particular, the invention relates to an in vitro method in which the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp, fragments generated in the proteolytic processing of the amyloid protein precursor (APP), is determined.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓNBACKGROUND OF THE INVENTION
La enfermedad de Alzheimer (EA) es la forma más común de demencia senil y se caracteriza por la presencia de depósitos proteináceos cerebrales, a nivel extracelular, como placas amiloides y, a nivel intracelular, como ovillos neurofibrilares. La EA es una tauopatía en la que ovillos neurofibrilares de la proteína citoesquelética tau anormalmente hiperfosforilada (P-tau) llevan al colapso y muerte neuronal. La EA es la única tauopatía que cursa con depósitos fibrilares amiloides, constituidos principalmente por el péptido p-amiloide (Ap).Alzheimer's disease (AD) is the most common form of senile dementia and is characterized by the presence of proteinaceous deposits in the brain, at the extracellular level, as amyloid plaques, and, at the intracellular level, as neurofibrillary tangles. AD is a tauopathy in which neurofibrillary tangles of abnormally hyperphosphorylated cytoskeletal protein tau (P-tau) lead to neuronal collapse and death. AD is the only tauopathy that presents with amyloid fibrillar deposits, consisting mainly of p-amyloid peptide (Ap).
El Ap es un péptido de 40-42 aminoácidos producto del procesamiento proteolítico de la proteína transmembrana conocida como precursor de la proteína amiloide (APP). El procesamiento de APP puede llevarse a cabo por distintas vías que coexisten en condiciones fisiológicas normales, la vía no amiloidogénica y la vía amiloidogénica. En ambas vías se producen largos fragmentos N-terminales (NTF, del inglés N-terminal fragment). Ap is a 40-42 amino acid peptide product of the proteolytic processing of the transmembrane protein known as amyloid precursor protein (APP). APP processing can be carried out by different pathways that coexist under normal physiological conditions, the non-amyloidogenic pathway and the amyloidogenic pathway. Both pathways produce long N-terminal fragments (NTFs ).
En la vía no amiloidogénica, con la acción secuencial de a-secretasa (ADAM10) y y-secretasa, no se produce Ap. Con la acción de la a-secretasa, se producen el fragmento NTF sAPPa y el fragmento C-terminal (CTF, del inglés C-terminal fragment) APP-CTF83. Con la acción de la Y-secretasa, el fragmento APP-CTF83 produce los fragmentos AICD y P3. In the non-amyloidogenic pathway, with the sequential action of a-secretase (ADAM10) and y -secretase, Ap is not produced. With the action of a-secretase, the NTF sAPPa fragment and the C-terminal fragment (CTF , from the English C-terminal fragment) APP-CTF83. With the action of Y-secretase, the APP-CTF83 fragment produces the AICD and P3 fragments.
La vía amiloidogénica, dirigida por la acción secuencial de las enzimas p-secretasa (BACE1) y Y-secretasa, genera el Ap. Con la acción de la p-secretasa, se produce el fragmento NTF sAPPp y el fragmento CTF APP-CTF99. Con la acción de la Y-secretasa, el fragmento APP-CTF99 produce los fragmentos AICD y Ap.The amyloidogenic pathway, directed by the sequential action of the enzymes p-secretase (BACE1) and Y-secretase, generates Ap. With the action of p-secretase, the NTF sAPPp fragment and the CTF APP-CTF99 fragment are produced. With the action of Y-secretase, the APP-CTF99 fragment produces the AICD and Ap fragments.
Hoy en día se acepta que los verdaderos “efectores” patológicos de la EA son los oligómeros de Ap y el P-tau y que un exceso de formas oligoméricas de Ap (especialmente la forma de 42 aminoácidos: Ap42) es el determinante primigenio de la neurotoxicidad en la EA. La determinación de Ap42 en el líquido cefalorraquídeo (LCR) se ha propuesto como marcador diagnóstico (junto a tau y P-tau, buenos marcadores pero que carecen de especificidad frente a otras tauopatías y desórdenes neurológicos).Today it is accepted that the true pathological "effectors" of AD are the Ap oligomers and P-tau and that an excess of oligomeric forms of Ap (especially the 42-amino acid form: Ap42) is the primary determinant of AD. neurotoxicity in AD. The determination of Ap42 in cerebrospinal fluid (CSF) has been proposed as a diagnostic marker (along with tau and P-tau, good markers but lacking specificity against other tauopathies and neurological disorders).
Respecto al Ap como biomarcador, se da la paradoja de que lo que existe es una disminución en sus valores en el LCR de EA. Ello sería el resultado del aumento de la producción de Ap en el cerebro, que a su vez fibrila, forma placas y queda secuestrado en dichas placas amiloides, por lo que llega al LCR en cantidades menores de las determinadas en sujetos sin placas, sin EA. Esta circunstancia hace difícil que el Ap en LCR pueda ser considerado un marcador temprano o de progresión.Regarding Ap as a biomarker, there is the paradox that what exists is a decrease in its values in the CSF of AD. This would be the result of the increased production of Ap in the brain, which in turn fibrillates, forms plaques and is sequestered in said amyloid plaques, for which reason it reaches the CSF in lower amounts than those determined in subjects without plaques, without AD . This circumstance makes it difficult for CSF Ap to be considered an early or progression marker.
Se han propuesto los niveles de los fragmentos NTF de APP, sAPPp y el sAPPa, antes mencionados, como marcadores alternativos al Ap. Pese a las altas expectativas, los resultados no han sido alentadores, por la poca consistencia en los resultados de diversos estudios. Algunos de dichos estudios describieron aumento de sAPPp, pero otros describieron que no había ningún cambio o incluso disminuciones de sAPPp. Algo equivalente ha ocurrido con los niveles de sAPPa; algunos estudios describieron disminución de sAPPa, mientras que otros estudios describieron o bien que no había cambios o aumentos de sAPPa. Los estudios que examinaron ambos, sAPPa y sAPPp, describieron que ambos NTF de APP mostraban la misma tendencia, fuese aumento o disminución en sus niveles en LCR, cuando lo esperable es que muestren tendencias opuestas por desequilibrio de las vías de procesamiento (Perneczky et al., 2014).The levels of the NTF fragments of APP, sAPPp and sAPPa, mentioned above, have been proposed as alternative markers for Ap. Despite high expectations, the results have not been encouraging, due to the lack of consistency in the results of various studies. Some of these studies reported increased sAPPp, but others reported no change or even decreased sAPPp. Something equivalent has occurred with the levels of sAPPa; some studies reported decreased sAPPa, while other studies reported either no change or increased sAPPa. Studies that examined both sAPPa and sAPPp reported that both APP NTFs showed the same trend, either increased or decreased CSF levels, when expected to show opposite trends due to imbalance of processing pathways (Perneczky et al ., 2014).
Además, se ha determinado que la proteína completa de APP (sin procesar proteolíticamente) está también presente en el LCR coexistiendo con sAPPa y sAPPp y que todas las especies forman heterómeros, por lo que los análisis de ELISAs para determinar niveles de sAPPa y sAPPp, aun contando con anticuerpos específicos, no cuantifican las especies separadamente de forma fiable (Cuchillo-Ibañez et al., 2015).In addition, it has been determined that the complete APP protein (without proteolytic processing) is also present in the CSF coexisting with sAPPa and sAPPp and that all species form heteromers, so ELISA analyzes for determining levels of sAPPa and sAPPp, even with specific antibodies, do not reliably quantify the species separately (Cuchillo-Ibañez et al., 2015).
Posteriormente, se realizó un estudio por Western blot, evitando que los heterómeros falsearan la interpretación de los resultados, en el que no se evidenciaron niveles alterados de sAPPa o sAPPp (Lopez-Font et al., 2017).Subsequently, a Western blot study was carried out, preventing the heteromers from distorting the interpretation of the results, in which no altered levels of sAPPa or sAPPp were found (Lopez-Font et al., 2017).
La glicosilación es un proceso de adición de glúcidos a proteínas, que puede darse como una modificación cotraduccional (ocurre paralela a la síntesis de la proteína cuando el ribosoma se encuentra asociado al retículo endoplásmico) o postraduccional (ocurre cuando la proteína ya ha terminado su síntesis). Los glúcidos pueden unirse a las proteínas mediante N-glicosilación, en la que se unen al nitrógeno de las cadenas laterales de los aminoácidos asparagina o arginina o mediante O-glicosilación, en la que se unen al oxígeno del grupo hidroxilo de las cadenas laterales de los aminoácidos serina, treonina o tirosina.Glycosylation is a process of adding carbohydrates to proteins, which can occur as a cotranslational modification (occurs parallel to protein synthesis when the ribosome is associated with the endoplasmic reticulum) or posttranslational (occurs when the protein has already finished its synthesis ). Carbohydrates can be attached to proteins by N-glycosylation, in which they bind to the nitrogen of the amino acid side chains asparagine or arginine, or by O-glycosylation, in which they bind to the oxygen of the hydroxyl group of the side chains of amino acids. the amino acids serine, threonine or tyrosine.
La glicosilación es un proceso específico del tipo celular y del momento del desarrollo celular, y que muestra alteraciones asociadas a algunas patologías. La glicosilación también determina la interacción de las proteínas, su funcionalidad y posterior procesamiento. El patrón de glicosilación de proteínas y/o péptidos como biomarcadores ha sido descrito para el diagnóstico de la EA. Así, US2002022242A1 describe el patrón de glicosilación de la enzima butirilcolinesterasa como un biomarcador para el diagnóstico de la EA. Dicho documento describe la detección del patrón de glicosilación de la butirilcolinesterasa mediante la unión a lectinas. Las lectinas son proteínas que reconocen con muy alta especificidad azúcares terminales expuestos en glicoproteínas.Glycosylation is a specific process of the cell type and the moment of cell development, and that shows alterations associated with some pathologies. Glycosylation also determines the interaction of proteins, their functionality and subsequent processing. The pattern of glycosylation of proteins and/or peptides as biomarkers has been described for the diagnosis of AD. Thus, US2002022242A1 describes the glycosylation pattern of the enzyme butyrylcholinesterase as a biomarker for the diagnosis of AD. Said document describes the detection of the glycosylation pattern of butyrylcholinesterase by binding to lectins. Lectins are proteins that recognize exposed terminal sugars on glycoproteins with very high specificity.
WO2012056008A1 describe la O-glicosilación de un aminoácido del Ap como un biomarcador para el diagnóstico de la EA y describe, entre otras, las siguientes técnicas para detectar el aminoácido O-glicosilado en el Ap: ELISA, espectrometría de masas, tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética, radioinmunoensayos, ensayos de unión a lectinas, inmunohistoquímica, Western blot y citometría de flujo. Sin embargo, no se describe en este documento nada acerca de la utilidad de los patrones de glicosilación de sAPPa o de sAPPp como biomarcadores para el diagnóstico de la EA. WO2012056008A1 describes the O-glycosylation of an amino acid of Ap as a biomarker for the diagnosis of AD and describes, among others, the following techniques to detect the O-glycosylated amino acid in Ap: ELISA, mass spectrometry, emission tomography positron (PET), magnetic resonance imaging, radioimmunoassays, lectin binding assays, immunohistochemistry, Western blot and flow cytometry. However, nothing is described in this document about the utility of sAPPa or sAPPp glycosylation patterns as biomarkers for the diagnosis of AD.
Por otro lado, se han caracterizado la O-glicosilación de residuos específicos de Ap en LCR y las diferencias en los niveles de glicosilación de dichos residuos entre pacientes con EA y sujetos control (Halim et al., 2011). Este documento, centrado en la glicosilación de Ap, no describe, sin embargo, nada acerca de los patrones de glicosilación de sAPPa o de sAPPp, con residuos altamente N-glicosilados, además de la O-glicosilación; ni de su utilidad como biomarcadores para el diagnóstico de la EA.On the other hand, the O-glycosylation of specific Ap residues in CSF and the differences in the levels of glycosylation of said residues between patients with AD and control subjects have been characterized (Halim et al., 2011). This document, focused on Ap glycosylation, however, does not describe anything about the glycosylation patterns of sAPPa or sAPPp, with highly N-glycosylated residues, apart from O-glycosylation; nor of their usefulness as biomarkers for the diagnosis of AD.
A pesar de los avances recientes en el desarrollo de biomarcadores para el diagnóstico de la EA, existe actualmente una necesidad de desarrollar nuevos biomarcadores para el diagnóstico de esta enfermedad.Despite recent advances in the development of biomarkers for the diagnosis of AD, there is currently a need to develop new biomarkers for the diagnosis of this disease.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNDESCRIPTION OF THE INVENTION
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, el término "comprende", "que comprende" y sus variantes no son de naturaleza limitativa y, por lo tanto, no pretenden excluir otras características técnicas. El término "comprende", "que comprende" y sus variantes, a lo largo de la descripción y las reivindicaciones, incluye también, específicamente, el término "consiste en", "que consiste en" y sus variantes.Throughout the description and claims, the term "comprises", "comprising" and its variants are not of a limiting nature and, therefore, are not intended to exclude other technical characteristics. The term "comprise", "comprising" and its variants, throughout the description and claims, also includes, specifically, the term "consists of", "consisting of" and its variants.
Como se usa en esta descripción y en las reivindicaciones, las formas singulares “el”, “la” incluyen referencias a las formas plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más células, y similares.As used in this description and claims, the singular forms "the", "the" include references to the plural forms unless the content clearly indicates otherwise. Thus, for example, reference to "a cell" includes a combination of two or more cells, and the like.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados a lo largo de la descripción y reivindicaciones, tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en el campo de la invención.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used throughout the description and claims have the same meaning as is commonly understood by a person skilled in the field of the invention.
A efectos de la presente invención, el término “sujeto” se refiere a un humano. Más preferentemente, dicho sujeto tiene la enfermedad de Alzheimer o se sospecha que tiene, o está en riesgo de tener, dicha enfermedad. Los sujetos que están afectados por dicha enfermedad pueden ser identificados por los síntomas que acompañan a la enfermedad, que son conocidos en el estado de la técnica. Sin embargo, un sujeto que se sospecha que está afectado por la enfermedad mencionada puede ser también un sujeto aparentemente sano, por ejemplo, investigado mediante un examen clínico de rutina, o puede ser un sujeto que corre el riesgo de desarrollar la enfermedad mencionada.For purposes of the present invention, the term "subject" refers to a human. More preferably, said subject has Alzheimer's disease or is suspected of having, or at risk of having, said disease. Subjects who are affected by said disease can be identified by the symptoms that accompany the disease, which are known in the state of the art. However, a subject suspected of being affected by the aforementioned disease may also be an apparently healthy subject, for example, investigated by clinical examination of routine, or may be a subject at risk of developing the disease mentioned.
A efectos de la presente invención, el término "muestra” se refiere a una muestra de un fluido corporal, a una muestra de células, a una muestra de un tejido o a una muestra de fluido de lavado/enjuague obtenida de una superficie corporal externa o interna. Preferentemente, las muestras son muestras de líquido cefalorraquídeo, orina, sangre, sangre completa, plasma, suero, líquido linfático, saliva, células y tejidos.For purposes of this invention, the term "sample" refers to a body fluid sample, cell sample, tissue sample, or lavage/rinse fluid sample obtained from an external body surface or Preferably, the samples are samples of cerebrospinal fluid, urine, blood, whole blood, plasma, serum, lymphatic fluid, saliva, cells and tissues.
A efectos de la presente invención, "patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp” se refiere, de forma general, al conjunto de glúcidos unidos a sAPPa y/o sAPPp. En la presente invención, se puede utilizar cualquier método de reconocimiento de patrones conocido en el estado de la técnica, de forma que se detecten diferencias entre el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp del sujeto respecto a un patrón de glicosilación de referencia. Ventajosamente, se puede obtener un valor numérico o un rango de valores numéricos que dependan del patrón de glicosilación, permitiendo la comparación entre el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp del sujeto respecto al patrón de glicosilación de de sAPPa y/o sAPPp de referencia. En la presente invención, se pueden utilizar ensayos de unión a lectinas para determinar el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp. En dichos ensayos de unión a lectinas, se puede obtener un porcentaje o fracción de sAPPa y/o sAPPp ligada a una lectina, dicho porcentaje o fracción de sAPPa y/o sAPPp depende del patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp y permite la comparación entre el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en el sujeto respecto al patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp de referencia.For the purposes of the present invention, "glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp" refers, in general, to the set of carbohydrates linked to sAPPa and/or sAPPp. In the present invention, any recognition method can be used. patterns known in the state of the art, so that differences between the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp of the subject with respect to a reference glycosylation pattern are detected Advantageously, a numerical value or a range of values can be obtained binding assays that depend on the glycosylation pattern, allowing comparison between the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp of the subject with respect to the glycosylation pattern of reference sAPPa and/or sAPPp In the present invention, binding assays can be used to lectins to determine the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp In said lectin binding assays, a percentage or fraction of sAPPa and/or sAPPp bound to a lectin can be obtained, said percentage The percentage or fraction of sAPPa and/or sAPPp depends on the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp and allows the comparison between the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in the subject with respect to the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp of reference.
A efectos de la presente invención, el término "comparar” se refiere a contrastar el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en la muestra que se va a analizar con el patrón de glicosilación en una muestra de referencia adecuada, tal como se especifica más adelante en la presente descripción. La comparación se refiere a la de los parámetros o valores correspondientes a dichos patrones de glicosilación, por ejemplo, un porcentaje o fracción de sAPPa y/o sAPPp ligada a lectinas se compara con un porcentaje o fracción de referencia de sAPPa y/o sAPPp ligada a lectinas; una señal de intensidad obtenida del patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp ligada a lectinas en una muestra se compara con el mismo tipo de señal de intensidad de dicho patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp ligada a lectinas en una muestra de referencia. La comparación referida puede ser llevada a cabo manualmente o asistida por ordenador. En el caso de una comparación asistida por ordenador, el valor de la cantidad determinada puede compararse con los valores correspondientes a las referencias adecuadas que se almacenan en una base de datos mediante un programa informático. En consecuencia, el resultado de la identificación a que se hace referencia en el presente documento podrá facilitarse automáticamente en un formato de salida adecuado.For the purposes of the present invention, the term "compare" refers to contrasting the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in the sample to be analyzed with the glycosylation pattern in a suitable reference sample, as specified later in the present description The comparison refers to that of the parameters or values corresponding to said glycosylation patterns, for example, a percentage or fraction of sAPPa and/or sAPPp bound to lectins is compared with a reference percentage or fraction of sAPPa and/or sAPPp bound to lectins; an intensity signal obtained from the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp bound to lectins in a sample is compared with the same type of intensity signal of said glycosylation pattern of sAPPa and/or or lectin-bound sAPPp in a reference sample. Referred comparison can be carried out manually or computer assisted. In the case of a computer-assisted comparison, the value of the determined quantity can be compared with the values corresponding to the appropriate references that are stored in a database by means of a computer program. Consequently, the result of the identification referred to in this document may be provided automatically in a suitable output format.
En la presente patente, el término "patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp de referencia”, se deriva de muestras de sujetos sanos, para los cuales se sabe que no padecen la enfermedad de Alzheimer. Un patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp de referencia adecuado puede determinarse, mediante los métodos de la presente invención, a partir de una muestra de referencia para analizarse juntos, es decir, simultáneamente, o posteriormente, con la muestra de prueba. Preferiblemente, se puede usar un valor de corte como un valor de referencia asociado al patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp de referencia.In the present patent, the term "reference sAPPa and/or sAPPp glycosylation pattern", is derived from samples from healthy subjects, for whom it is known that they do not have Alzheimer's disease. A glycosylation pattern of sAPPa and/or o Suitable reference sAPPp may be determined, by the methods of the present invention, from a reference sample to be analyzed together, i.e. simultaneously, or subsequently, with the test sample Preferably, a cut-off value may be used as a reference value associated with the reference sAPPa and/or sAPPp glycosylation pattern.
A efectos de la presente invención, el término "diferencia en la comparación” puede corresponder a una disminución o a un aumento de un valor numérico o rango de valores dependiente del patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en la muestra que se va a analizar, respecto a un valor numérico o rango de valores dependiente del patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp, en una muestra de referencia adecuada, tal como se especificó anteriormente. Preferiblemente, aunque no necesariamente, dicha diferencia, es estadísticamente significativa, es decir, una disminución estadísticamente significativa, o un aumento estadísticamente significativo. Se puede determinar si una diferencia es estadísticamente significativa, utilizando diversas herramientas de evaluación estadística, bien conocidas en la técnica, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza y determinación del valor p, por ejemplo, a través de pruebas binomiales. Los intervalos de confianza preferidos son al menos 90%, al menos 95%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99%. Los niveles de significación de las pruebas estadísticas son, preferiblemente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 o 0,0001.For the purposes of the present invention, the term "difference in comparison" may correspond to a decrease or an increase in a numerical value or range of values depending on the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in the sample to be analyzed. , with respect to a numerical value or range of values dependent on the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp, in a suitable reference sample, as specified above Preferably, although not necessarily, said difference is statistically significant, that is , a statistically significant decrease, or a statistically significant increase Whether a difference is statistically significant can be determined using various statistical evaluation tools well known in the art, for example, determination of confidence intervals and determination of p-value, for example, through binomial tests Preferred confidence intervals are at least 90%, when least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%. The significance levels of the statistical tests are preferably 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001.
En la presente patente, el término "indicativa” se refiere a que, una diferencia entre el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en la muestra que se va a analizar, respecto al patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en una muestra de referencia adecuada, permite diagnosticar si un sujeto tiene la enfermedad de Alzheimer.In the present patent, the term "indicative" refers to a difference between the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in the sample to be analyzed, with respect to to the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in a suitable reference sample, makes it possible to diagnose whether a subject has Alzheimer's disease.
A efectos de la presente invención, "Western blot”, también denominado "inmunoblot” o "electrotransferencia”, se refiere a una técnica analítica usada en biología celular y molecular para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, tal como la que se presenta en extractos celulares o de tejidos. La técnica utiliza las siguientes tres etapas: separación por tamaño, transferencia a un soporte sólido y, finalmente, visualización mediante unión de proteínas a anticuerpos primarios o secundarios apropiados.For the purposes of the present invention, "Western blot", also called "immunoblot" or "electroblotting", refers to an analytical technique used in cell and molecular biology to identify specific proteins in a complex mixture of proteins, such as the one shown presented in cell or tissue extracts.The technique uses the following three steps: separation by size, transfer to a solid support and, finally, visualization by protein binding to appropriate primary or secondary antibodies.
A efectos de la presente invención, "ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)” se refiere a una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo unido a una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina, etc.) capaz de generar un producto detectable a partir de un sustrato, por medio de un cambio de color o algún otro tipo de cambio, provocado por la acción enzimática sobre dicho sustrato. En dicha técnica puede existir un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario unido a dicha enzima. El antígeno se puede detectar indirectamente en la muestra mediante los cambios de color medidos por espectrofotometría.For purposes of the present invention, "enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)" refers to an immunoassay technique in which an immobilized antigen is detected by an antibody linked to an enzyme (peroxidase, alkaline phosphatase, etc.) capable of of generating a detectable product from a substrate, by means of a color change or some other type of change, caused by the enzymatic action on said substrate.In this technique there may be a primary antibody that recognizes the antigen and that, in turn, Once it is recognized by a secondary antibody bound to said enzyme, the antigen can be detected indirectly in the sample by means of color changes measured by spectrophotometry.
A efectos de la presente invención, "splicing alternativo” se refiere a un procedimiento en el que se obtienen, a partir de un transcrito primario de ARNm o pre-ARNm, distintas isoformas de ARNm y proteínas, las cuales pueden tener funciones diferentes. Este proceso ocurre principalmente en eucariotas.For the purposes of the present invention, "alternative splicing " refers to a procedure in which different isoforms of mRNA and proteins, which may have different functions, are obtained from a primary mRNA or pre-mRNA transcript. process occurs primarily in eukaryotes.
A efectos de la presente invención, la expresión "anticuerpos pan-específicos” se refiere a anticuerpos con especificidad frente a un dominio específico presente únicamente en una diana, por ejemplo, el dominio exclusivo que diferencia varias formas o variantes de una proteína.For purposes of the present invention, the term "pan-specific antibodies" refers to antibodies with specificity against a specific domain uniquely present in a target, eg, the unique domain that differentiates various forms or variants of a protein.
El problema técnico a resolver consiste en el desarrollo de un método de diagnóstico in vitro para el diagnóstico de la EA basado en nuevos biomarcadores. The technical problem to be solved consists of the development of an in vitro diagnostic method for the diagnosis of AD based on new biomarkers.
La presente invención, tal y como se define en las reivindicaciones, proporciona a una solución a dicho problema técnico.The present invention, as defined in the claims, provides a solution to said technical problem.
La presente invención proporciona un método in vitro de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en un sujeto, que comprende:The present invention provides an in vitro method of diagnosing Alzheimer's disease in a subject, comprising:
(a) determinar, en una muestra biológica de dicho sujeto, el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp,(a) determining, in a biological sample of said subject, the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp,
(b) comparar dicho patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp con un patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp de referencia, en el que una diferencia en dicha comparación es indicativa de un diagnóstico positivo de enfermedad de Alzheimer en dicho sujeto.(b) comparing said sAPPa and/or sAPPp glycosylation pattern to a reference sAPPa and/or sAPPp glycosylation pattern, wherein a difference in said comparison is indicative of a positive diagnosis of Alzheimer's disease in said subject.
En una realización del método de la invención, dicho biomarcador es sAPPa.In an embodiment of the method of the invention, said biomarker is sAPPa.
En una realización del método de la invención, la muestra biológica está seleccionada del grupo que consiste en: líquido cefalorraquídeo, orina, sangre, sangre completa, plasma, suero, líquido linfático, saliva, células y tejidos.In an embodiment of the method of the invention, the biological sample is selected from the group consisting of: cerebrospinal fluid, urine, blood, whole blood, plasma, serum, lymphatic fluid, saliva, cells and tissues.
En una realización del método de la invención, se determina dicho patrón de glicosilación por una técnica seleccionada del grupo que consiste en: ELISA, espectrometría de masas, tomografía por emisión de positrones (PET), resonancia magnética nuclear (RMN), radioinmunoensayos, ensayos de unión a lectinas, inmunohistoquímica, Western blot y citometría de flujo.In one embodiment of the method of the invention, said glycosylation pattern is determined by a technique selected from the group consisting of: ELISA, mass spectrometry, positron emission tomography (PET), nuclear magnetic resonance (NMR), radioimmunoassays, assays lectin binding, immunohistochemistry, Western blot and flow cytometry.
En una realización preferente del método de la invención, se determina dicho patrón de glicosilación por ensayos de unión a lectinas.In a preferred embodiment of the method of the invention, said glycosylation pattern is determined by lectin binding assays.
En una realización más preferente del método de la invención, dichas lectinas son Concanavalina A de Canavalia ensiformis (Con A) y/o PHA de Phaseolus vulgaris. In a more preferred embodiment of the method of the invention, said lectins are Concanavalin A from Canavalia ensiformis (Con A) and/or PHA from Phaseolus vulgaris.
En una realización del método de la invención, en dichos ensayos de unión a lectinas se detecta la cantidad o concentración de sAPPa y/o sAPPp discriminando entre ligados o no ligados a lectinas. In one embodiment of the method of the invention, in said lectin binding assays the amount or concentration of sAPPa and/or sAPPp is detected, discriminating between bound or not bound to lectins.
En una realización del método de la invención, la detección de la cantidad o concentración de sAPPa y/o sAPPp se lleva a cabo por ELISA o Western blot.In one embodiment of the method of the invention, the detection of the amount or concentration of sAPPa and/or sAPPp is carried out by ELISA or Western blot.
En una realización del método de la invención, sAPPa y/o sAPPp derivan de cualquiera de las variantes del precursor de la proteína amiloide (APP). Preferentemente, dichas variantes del APP se seleccionan del grupo que consiste en: APP695, APP751 y APP770.In one embodiment of the method of the invention, sAPPa and/or sAPPp are derived from any of the variants of the amyloid precursor protein (APP). Preferably, said APP variants are selected from the group consisting of: APP695, APP751 and APP770.
En una realización del método de la invención, una disminución en un sujeto, respecto a un valor de referencia derivado de muestras de sujetos sanos, de los niveles de sAPPa derivado de APP695 y derivado de la combinación de las variantes APP-KPI, APP751 y APP770, no ligado a las lectinas Con A o PHA, es indicativa de un diagnóstico positivo de enfermedad de Alzheimer en dicho sujeto; una disminución en un sujeto, respecto a un valor de referencia derivado de muestras de sujetos sanos, del nivel de sAPPp derivado de APP695, no ligado a las lectinas Con A o PHA, es indicativa de un diagnóstico positivo de enfermedad de Alzheimer; y en el que un aumento en un sujeto, respecto a un valor de referencia derivado de muestras de sujetos sanos, del nivel de sAPPp derivado de la combinación de las variantes APP-KPI, APP751 y APP770, no ligado a las lectinas Con A o PHA, es indicativo de un diagnóstico positivo de enfermedad de Alzheimer en dicho sujeto.In one embodiment of the method of the invention, a decrease in a subject, with respect to a reference value derived from samples of healthy subjects, of the levels of sAPPa derived from APP695 and derived from the combination of the variants APP-KPI, APP751 and APP770, not bound to Con A or PHA lectins, is indicative of a positive diagnosis of Alzheimer's disease in said subject; a decrease in a subject, relative to a reference value derived from samples of healthy subjects, in the level of sAPPp derived from APP695, not bound to Con A or PHA lectins, is indicative of a positive diagnosis of Alzheimer's disease; and wherein an increase in a subject, relative to a reference value derived from samples from healthy subjects, in the level of sAPPp derived from the combination of the APP-KPI variants, APP751 and APP770, not bound to Con A lectins or PHA, is indicative of a positive diagnosis of Alzheimer's disease in said subject.
Información sobre la secuencia del APP humano y sobre las variantes de procesamiento proteolítico de APP, junto con información sobre aminoácidos con glicosilación potencial, es accesible en la base de datos de proteínas UniProtKB (N° de acceso P05067). Según dicho registro del APP humano en la base de datos de proteínas UniProtKB, los siguientes aminoácidos de APP pueden tener glicosilación potencial (numeración para la variante mayoritaria APP695):Information on the sequence of human APP and on APP proteolytic processing variants, along with information on amino acids with potential glycosylation, is accessible in the UniProtKB protein database (Accession No. P05067). According to this registry of human APP in the UniProtKB protein database, the following amino acids of APP may have potential glycosylation (numbering for the major variant APP695):
N-glicosilación: aminoácidos 542, 571N-glycosylation: amino acids 542, 571
O-glicosilación: aminoácidos 633, 651, 652, 659, 663, 667, 681.O-glycosylation: amino acids 633, 651, 652, 659, 663, 667, 681.
Los aminoácidos 1-17 del APP corresponden al péptido señal. El fragmento sAPPp corresponde a los aminoácidos 18-671 del APP. El fragmento sAPPa corresponde a los aminoácidos 18-687. Esta información está también accesible en la base de datos de proteínas UniProtKB (N° de acceso P05067). Amino acids 1-17 of APP correspond to the signal peptide. The sAPPp fragment corresponds to amino acids 18-671 of APP. The sAPPa fragment corresponds to amino acids 18-687. This information is also accessible in the UniProtKB protein database (Accession No. P05067).
La presente invención también proporciona los biomarcadores sAPPa y/o sAPPp para uso en un método in vitro de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer en el que se determina el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en una muestra biológica.The present invention also provides the sAPPa and/or sAPPp biomarkers for use in an in vitro method for diagnosing Alzheimer's disease in which the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in a biological sample is determined.
En una realización de los biomarcadores para uso de la invención, dicho biomarcador es sAPPa.In an embodiment of the biomarkers for use of the invention, said biomarker is sAPPa.
En una realización de los biomarcadores para uso de la invención, la muestra biológica está seleccionada del grupo que consiste en: líquido cefalorraquídeo, orina, sangre, sangre completa, plasma, suero, líquido linfático, saliva, células y tejidos.In one embodiment of the biomarkers for use of the invention, the biological sample is selected from the group consisting of: cerebrospinal fluid, urine, blood, whole blood, plasma, serum, lymphatic fluid, saliva, cells and tissues.
En una realización de los biomarcadores para uso de la invención, la muestra biológica ha sido obtenida de un sujeto.In one embodiment of the biomarkers for use of the invention, the biological sample has been obtained from a subject.
La presente invención también proporciona un kit de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer, que comprende reactivos para determinar el patrón de glicosilación de sAPPa y/o sAPPp en una muestra biológica.The present invention also provides a diagnostic kit for Alzheimer's disease, comprising reagents for determining the glycosylation pattern of sAPPa and/or sAPPp in a biological sample.
En una realización del kit de la invención, dichos reactivos comprenden la lectina Con A y/o PHA.In one embodiment of the kit of the invention, said reagents comprise the Con A lectin and/or PHA.
En una realización, el kit de la invención además comprende anticuerpos específicos frente a sAPPa y/o sAPPp.In one embodiment, the kit of the invention also comprises specific antibodies against sAPPa and/or sAPPp.
En una realización, el kit de la invención además comprende al menos una disolución tampón.In one embodiment, the kit of the invention further comprises at least one buffer solution.
Ejemplos de tampones son: tampón fosfato, tampón fosfato salino, tampón acetato, tampón borato-cloruro, tampón carbonato, tampón glicina y tampón Tris.Examples of buffers are: phosphate buffer, phosphate buffer saline, acetate buffer, borate-chloride buffer, carbonate buffer, glycine buffer and Tris buffer.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOSBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figura 1. Aumento de la expresión de APP en tejido cerebral de EA. Expresión relativa de ARNm de APP analizada por qRT-PCR en tejido de corteza frontal de sujetos control (C) (n = 7) y sujetos con EA (etapa V-VI en la escala Braak y Braak, n = 7). Los valores se calcularon a partir de curvas estándar relativas, se normalizaron al ARNm de la subunidad ribosomal 18Sa partir del mismo ADNc. Se obtuvo un valor p <0,001 respecto a C. Figure 1 . Increased APP expression in AD brain tissue. Relative expression of APP mRNA analyzed by qRT-PCR in frontal cortex tissue of control subjects (C) (n = 7) and subjects with AD (stage V-VI on the Braak and Braak scale, n = 7). The values were calculated from relative standard curves, normalized to 18Sa ribosomal subunit mRNA from the same cDNA. A p value <0.001 was obtained with respect to C.
Figura 2. Representación esquemática y caracterización bioquímica de fragmentos NTF y CTF de APP. (A) Representación esquemática de los fragmentos proteolíticos sAPPa, sAPPp, CTFa y CTFp generados por la a-secretasa (vía no amiloidogénica) y la psecretasa (vía amiloidogénica) (no dibujado a escala). Se indica la localización del dominio KPI presente en las variantes APP751 y APP770, pero no en APP695. También se muestran los epítopos para los anticuerpos utilizados en este estudio. (B) Para evaluar la identidad de las especies sAPPa y sAPPp de mayor masa molecular derivadas de las variantes de KPI, dos extractos cerebrales se procesaron en paralelo y se probaron por separado mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes con el anticuerpo indicado para identificar las bandas inmunoreactivas al anticuerpo antisAPPa (generado en ratón), al anticuerpo anti-sAPPp (generado en conejo) y al anti-KPI (generado en conejo). Se señala mediante una flecha la banda coincidente con todos los anticuerpos y mediante asterisco la banda no coincidente. Se indican las posiciones correspondientes a una masa molecular de 100 y 130 kDa. (C) Se representan bajo el número 2 los resultados con extractos de corteza frontal, analizados con el anticuerpo anti-sAPPa y el anticuerpo anti-sAPPp, tras tratamiento de deglicosilación mediante incubación con N- y O-glicosidasas específicas, combinadas con Sialidasa A en condiciones desnaturalizantes. Se representan bajo el número 1 los resultados del control (tampón sin las glicosidasas). El Western blot se resolvió incubando simultáneamente con los anticuerpos sAPPa (ratón) y sApPPp (conejo) y anticuerpos secundarios fluorescentes. La fluorescencia de los anticuerpos secundarios (IRDye 800CW cabra anti-conejo y IRDye 680RD cabra anti-ratón) se detectó con un aparato Odyssey CLx para fluorescencia simultánea (en el panel marcado con el término "Unión” se muestran las bandas que co-localizan). Se indican las posiciones correspondientes a una masa molecular de 100 y 130 kDa. (D) Para caracterizar CTFa y CTFp, se analizaron células CHO-PS70 tratadas con el inhibidor de la Y-secretasa, DAPT, o el vehículo solo (DMSO; control: Ctrl) en paralelo para controlar los extractos cerebrales (corteza frontal humana: Cx). Las inmunotransferencias de extractos de CHO-PS70 se detectaron simultáneamente con dos anticuerpos diferentes: el anticuerpo C-terminal generado en conejo y que reconoce un dominio común a CTFa y CTFp; y el anticuerpo generado en rata 2D8 y que reconoce el dominio N-terminal de Ap que, por lo tanto, solo detecta CTFp (se indica mediante flecha la banda que se acumula tras tratamiento con DAPT). Se indican las posiciones correspondientes a una masa molecular de 6,5, 10 y 14 kDa. Figure 2 . Schematic representation and biochemical characterization of NTF and CTF fragments of APP. ( A ) Schematic representation of the proteolytic fragments sAPPa, sAPPp, CTFa and CTFp generated by α-secretase (non-amyloidogenic pathway) and p-secretase (amyloidogenic pathway) (not drawn to scale). The location of the KPI domain present in variants APP751 and APP770, but not in APP695, is indicated. Epitopes for the antibodies used in this study are also shown. ( B ) To assess the identity of higher molecular mass sAPPa and sAPPp species derived from KPI variants, two brain extracts were processed in parallel and tested separately by electrophoresis under denaturing conditions with the indicated antibody to identify immunoreactive bands. anti-sAPPa antibody (generated in mouse), anti-sAPPp antibody (generated in rabbit) and anti-KPI (generated in rabbit). The band that coincides with all the antibodies is indicated by an arrow and the non-coincident band by an asterisk. Positions corresponding to a molecular mass of 100 and 130 kDa are indicated. ( C ) The results with frontal cortex extracts, analyzed with the anti-sAPPa antibody and the anti-sAPPp antibody, after deglycosylation treatment by incubation with specific N- and O-glycosidases, combined with Sialidase A, are represented under number 2. under denaturing conditions. The results of the control (buffer without the glycosidases) are represented under the number 1. The Western blot was resolved by simultaneously incubating with sAPPa (mouse) and sApPPp (rabbit) antibodies and fluorescent secondary antibodies. The fluorescence of the secondary antibodies (IRDye 800CW goat anti-rabbit and IRDye 680RD goat anti-mouse) was detected with an Odyssey CLx apparatus for simultaneous fluorescence (in the panel marked "Binding" the bands that co-localize are shown). Positions corresponding to a molecular mass of 100 and 130 kDa are indicated.( D ) To characterize CTFa and CTFp, CHO-PS70 cells treated with the Y-secretase inhibitor, DAPT, or vehicle alone (DMSO) were analyzed. ; control: Ctrl) in parallel to control brain extracts (human frontal cortex: Cx).Immunoblots of CHO-PS70 extracts were detected simultaneously with two different antibodies: the C-terminal antibody generated in rabbit and recognizing a common domain to CTFa and CTFp; and the antibody generated in rat 2D8 and that recognizes the N-terminal domain of Ap which, therefore, only detects CTFp (the band that accumulates after treatment with DAPT is indicated by an arrow). Positions corresponding to a molecular mass of 6.5, 10 and 14 kDa are indicated.
Figura 3. Las variantes sAPPa y sAPPp permanecen inalteradas en tejido cerebral de EA. (A) Western blot de muestras de corteza frontal humana de sujetos control (n=7) y sujetos con EA (n=7) detectados con anticuerpos contra sAPPa. (B) Cuantificación densitométrica de las bandas de Western blot de sujetos control (n=7) y sujetos con EA (n = 7) detectados con anticuerpos contra sAPPa, de las variantes APP-695 y APP-KPI, con cantidades equivalentes de proteína cargadas en cada carril y utilizando vinculina como control de carga. Los cálculos se realizaron por duplicado. (C) Western blot de muestras de corteza frontal humana de sujetos control (n=7) y sujetos con EA (n=7) detectados con anticuerpos contra sAPPp. (D) Cuantificaciones densitométricas de las bandas de Western blot de sujetos control (n=7) y sujetos con EA (n = 7) detectados con anticuerpos contra sAPPp, de las variantes APP-695 y APP-KPI, con cantidades equivalentes de proteína cargadas en cada carril y utilizando vinculina como control de carga. Los cálculos se realizaron por duplicado. (E) Gráfico de la relación obtenida dividiendo los valores para las especies sAPP (sAPPa o sAPPp) derivadas de la variante APP-KPI por los derivados de APP695 para cada muestra. Ninguna de las comparaciones resultó en diferencias estadísticamente significativas entre las muestras EA y C. Figure 3 . The sAPPa and sAPPp variants remain unchanged in AD brain tissue. ( A ) Western blot of human frontal cortex samples from control subjects (n=7) and AD subjects (n=7) detected with antibodies against sAPPa. ( B ) Densitometric quantification of Western blot bands from control subjects (n=7) and AD subjects (n=7) detected with antibodies against sAPPa, of the APP-695 and APP-KPI variants, with equivalent amounts of protein loaded in each lane and using vinculin as loading control. Calculations were performed in duplicate. ( C ) Western blot of human frontal cortex samples from control subjects (n=7) and AD subjects (n=7) detected with antibodies against sAPPp. ( D ) Densitometric quantifications of Western blot bands from control subjects (n=7) and AD subjects (n=7) detected with antibodies against sAPPp, of the APP-695 and APP-KPI variants, with equivalent amounts of protein loaded in each lane and using vinculin as loading control. Calculations were performed in duplicate. ( E ) Plot of the ratio obtained by dividing the values for the sAPP species (sAPPa or sAPPp) derived from the APP-KPI variant by those derived from APP695 for each sample. None of the comparisons resulted in statistically significant differences between the EA and C samples.
Figura 4. CTFa y CTFp permanecen inalterados en tejido cerebral de EA. (A) Western blot de tejido de la corteza frontal humana de sujetos control (n = 7) y EA (n = 7), detectado con un anticuerpo C-terminal (de la APP de longitud completa). (B) Cuantificación densitométrica de las especies CTFp (B) y CTFa (C), utilizando GAPDH como control de carga para asegurar que se cargaron cantidades equivalentes de proteína en cada carril. Los cálculos se realizaron por duplicado. (D) Gráfico de la relación obtenida para cada muestra dividiendo la inmunorreactividad de CTFp por la de CTFa. No hubo diferencias estadísticamente significativas evidentes. Figure 4 . CTFa and CTFp remain unchanged in AD brain tissue. ( A ) Western blot of human frontal cortex tissue from control (n = 7) and EA (n = 7) subjects, detected with a C-terminal (to full-length APP) antibody. ( B ) Densitometric quantification of CTFp ( B ) and CTFa ( C ) species, using GAPDH as a loading control to ensure equivalent amounts of protein were loaded in each lane. Calculations were performed in duplicate. ( D ) Graph of the ratio obtained for each sample by dividing the immunoreactivity of CTFp by that of CTFa. There were no statistically significant differences evident.
Figura 5. Comparación de la glicosilación APP695 y APP-KPI en tejido cerebral de sujetos control y con EA. Representación gráfica del porcentaje del fragmento sAPPa derivado de las variantes APP695 o APP-KPI de los tejidos cerebrales de 7 sujetos control (C) y 7 sujetos con EA que no se unieron a las lectinas inmovilizadas de PHA (A) o Con A (B). Representación gráfica del porcentaje del fragmento sAPPp derivado de las variantes APP695 o APP-KPI de los tejidos cerebrales de 7 sujetos control (C) y 7 sujetos con EA que no se unieron a las lectinas inmovilizadas de PHA (C) o Con A (D). Los valores de p están indicados en la figura (ns, no significativo). Figure 5 . Comparison of APP695 and APP-KPI glycosylation in brain tissue from control and AD subjects. Graphical representation of the percentage of sAPPa fragment derived from APP695 or APP-KPI variants from brain tissues of 7 control subjects (C) and 7 AD subjects that did not bind to immobilized PHA lectins ( A ) or With A ( B ). Graphical representation of the percentage of sAPPp fragment derived from APP695 or APP-KPI variants from brain tissues of 7 control (C) and 7 AD subjects that did not bind to immobilized PHA ( C ) or ConA ( D ) lectins. ). The p values are indicated in the figure (ns, not significant).
Figura 6. Comparación de la glicosilación de sAPPa y sAPPp en tejido cerebral de sujetos control y sujetos con EA. Representación gráfica del porcentaje del fragmento sAPPa derivado de las variantes APP695 o APP-KPI de los tejidos cerebrales de 7 sujetos control (C) y 7 sujetos con EA que no se unieron a las lectinas inmovilizadas de PHA (A) o Con A (B). Representación gráfica del porcentaje del fragmento sAPPp derivado de las variantes APP695 o APP-KPI de los tejidos cerebrales de 7 sujetos control (C) y 7 sujetos con EA que no se unieron a las lectinas inmovilizadas de PHA (C) o Con A (D). Los valores p están indicados en la figura. Figure 6 . Comparison of sAPPa and sAPPp glycosylation in brain tissue from control and AD subjects. Graphical representation of the percentage of sAPPa fragment derived from APP695 or APP-KPI variants from brain tissues of 7 control (C) and 7 AD subjects that did not bind to immobilized PHA ( A ) or ConA ( B ) lectins. ). Graphical representation of the percentage of sAPPp fragment derived from APP695 or APP-KPI variants from brain tissues of 7 control (C) and 7 AD subjects that did not bind to immobilized PHA ( C ) or ConA ( D ) lectins. ). The p-values are indicated in the figure.
Figura 7. Comparación de la glicosilación cerebral de sAPP entre sujetos control y sujetos con EA. Representación gráfica del porcentaje del fragmento sAPPa derivado de APP695 (A) y APP-KPI (B) en los tejidos cerebrales de 7 sujetos control (C) y 7 sujetos con EA que no se unieron a las lectinas inmovilizadas de PHA y Con A. Representación gráfica del porcentaje del fragmento sAPPp derivado de APP695 (C) y APP-KPI (D) en los tejidos cerebrales de 7 sujetos control (C) y 7 sujetos con EA que no se unieron a las lectinas inmovilizadas de PHA y Con A. Los valores p están indicados en la figura (n.s., no significativo). Figure 7 . Comparison of brain glycosylation of sAPP between control subjects and subjects with AD. Graphical representation of the percentage of sAPPa fragment derived from APP695 ( A ) and APP-KPI ( B ) in the brain tissues of 7 control subjects ( C ) and 7 AD subjects that did not bind to immobilized PHA and Con A lectins. Graphical representation of the percentage of sAPPp fragment derived from APP695 ( C ) and APP-KPI ( D ) in the brain tissues of 7 control subjects (C) and 7 AD subjects that did not bind to immobilized PHA and Con A lectins. p-values are indicated in the figure (ns, not significant).
DESCRIPCIÓN DE MODOS DE REALIZACIÓNDESCRIPTION OF METHODS OF IMPLEMENTATION
Materiales y métodosMaterials and methods
Muestras biológicasBiological samples
El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Miguel Hernández de Elche (Alicante, España), y se llevó a cabo en conformidad con la declaración de Helsinki. Las muestras se recibieron anonimizadas e identificadas sólo en base al código del banco de tejidos.The study was approved by the ethics committee of the Miguel Hernández University of Elche (Alicante, Spain), and was carried out in accordance with the Declaration of Helsinki. The samples were received anonymously and identified only based on the code of the tissue bank.
Las muestras congeladas de corteza cerebral de 7 pacientes con la EA (3 hombres y 4 mujeres, con un rango de edad 81 ± 12 años) y 7 pacientes sanos como controles (3 hombres y 4 mujeres, con un rango de edad de 65 ± 15 años), fueron obtenidas del banco de tejidos neurológicos de la Fundación CIEN-Unidad de Investigación Proyecto Alzheimer (UIPA; Madrid), y del banco de tejidos de la Región de Murcia, ambos coordinados por el neuropatólogo Dr. Alberto Rábano (Fundación CIEN-UIPA).Frozen samples of cerebral cortex from 7 AD patients (3 men and 4 women, age range 81 ± 12 years) and 7 healthy controls (3 men and 4 women, age range 65 ± 12 years). 15 years), were obtained from the neurological tissue bank of the CIEN Foundation-Project Research Unit Alzheimer (UIPA; Madrid), and the tissue bank of the Region of Murcia, both coordinated by the neuropathologist Dr. Alberto Rábano (CIEN-UIPA Foundation).
Todos los pacientes con la EA cumplían criterios clínicos para probable EA (NINCDS-ADRDA). Los pacientes con la EA se correspondían a casos esporádicos que fueron seleccionados en base a su historial clínico y diagnóstico neuropatológico basado en los criterios de diagnóstico CERAD, del inglés Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease. Los casos fueron categorizados como estadios V-VI durante el análisis neuropatológico siguiendo la escala de Braak y Braak (Braak y Braak, 1991). El intervalo postmortem medio del tejido fue entre 1,5 y 6 horas, sin diferencias significativas en ambos grupos. Los sujetos control resultaron negativos en su análisis histopatológico, y no tenían antecedentes de síntomas neurológicos o psiquiátricos ni de alteración en la memoria.All patients with AD met clinical criteria for probable AD (NINCDS-ADRDA). The patients with AD corresponded to sporadic cases that were selected based on their clinical history and neuropathological diagnosis based on the CERAD diagnostic criteria, from the English Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease. The cases were categorized as stages V-VI during the neuropathological analysis following the Braak and Braak scale (Braak and Braak, 1991). The mean postmortem tissue interval was between 1.5 and 6 hours, with no significant differences in both groups. Control subjects were negative on histopathology, and had no history of neurological or psychiatric symptoms or impaired memory.
Procesamiento de las muestras biológicasProcessing of biological samples
Las muestras de tejido cerebral recolectadas en los bancos de tejidos se mantuvieron en todo momento a -80°C. Posteriormente, se descongelaron lentamente en hielo y se homogeneizaron en un tampón de extracción (10% p/v) Tris-HCl 50 mM; pH 7,4; NaCl 500 mM; EDTA 5 mM; 1% (p/v) Nonidet P-40; 0,5% (p/v) Triton X-100, complementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (Sigma P834). El homogeneizado se sonicó utilizando un sonicador Microson ultrasonic cell disruptor Misonix en 3 series de 10 pulsos. Tras sonicar, las muestras se centrifugaron a 70.000*g a 4°C durante 1 hora. Por último, se recolectó el sobrenadante, se alicuotó y se almacenó a -80°C hasta el momento de su utilización. La concentración total de proteína de los distintos extractos se determinó utilizando como estándar albúmina de suero bovino (BSA) de acuerdo con el método del ácido bicinconínico (BCA; Pierce).The brain tissue samples collected in the tissue banks were kept at -80°C at all times. Subsequently, they were slowly thawed on ice and homogenized in an extraction buffer (10% w/v) Tris-HCl 50 mM; pH7.4; 500mM NaCl; 5mM EDTA; 1% (w/v) Nonidet P-40; 0.5% (w/v) Triton X-100, supplemented with a cocktail of protease inhibitors (Sigma P834). The homogenate was sonicated using a Misonix Microson ultrasonic cell disruptor sonicator in 3 sets of 10 pulses. After sonication, the samples were centrifuged at 70,000*g at 4°C for 1 hour. Finally, the supernatant was collected, aliquoted and stored at -80°C until use. The total protein concentration of the different extracts was determined using bovine serum albumin (BSA) as a standard according to the bicinchoninic acid method (BCA; Pierce).
Células que sobre-expresan APPCells that overexpress APP
Las células CHO-PS70 que sobre-expresan de manera estable la APP humana (variante 751) de tipo salvaje y la subunidad catalítica de Y-secretasa, presenilina-1, se cultivaron durante 48 horas en placas de seis pocillos (350000 células/pocillo) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado con GlutaMAX ™ (Gibco® Life Technologies, Paisley, Reino Unido), 5% de suero fetal bovino (FBS; Gibco) y 100 |jg/ml de penicilina/estreptomicina (Gibco). Las células se trataron con el inhibidor de y-secretasa DAPT (5 jM , LY-374973 t-butil éster de (N-[N-(3,5-difluorofenacetilo)-l-alanil]S-fenilglicina; Calbiochem®, Merck KGaA). Las células de control se trataron solo con el mismo volumen de dimetilsulfóxido (DMSO). Después de una exposición de 18 h de las células al inhibidor, las células se lavaron dos veces con tampón fosfato solución salino (PBS) frío y se volvieron a suspender en 100 ^l de tampón de extracción (descrito más arriba) enfriado con hielo complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa (descrito más arriba). Los lisados celulares se sonicaron y centrifugaron durante 1 hora a 70000 x g y 4 °C, y los extractos se congelaron a -80 °C para futuros análisis.CHO-PS70 cells stably over-expressing wild-type human APP (variant 751) and the Y-secretase catalytic subunit, presenilin-1, were cultured for 48 hours in six-well plates (350,000 cells/well). ) in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), supplemented with GlutaMAX™ (Gibco® Life Technologies, Paisley, UK), 5% fetal bovine serum (FBS; Gibco) and 100 µg/ml penicillin/streptomycin (Gibco ). Cells were treated with the y -secretase inhibitor DAPT (5 jM, LY-374973 t-butyl ester of (N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-l-alanyl]S-phenylglycine; Calbiochem®, Merck KGaA). Control cells were treated with only the same volume of dimethyl sulfoxide (DMSO). After an 18-h exposure of cells to inhibitor, cells were washed twice with cold phosphate buffered saline (PBS) and resuspended in 100 μl of ice-cold extraction buffer (described above) supplemented. with a cocktail of protease inhibitors (described above). Cell lysates were sonicated and centrifuged for 1 hour at 70,000 xg and 4°C, and extracts were frozen at -80°C for further analysis.
Aislamiento de ARN y análisis qRT-PCRRNA isolation and qRT-PCR analysis
El ARN total se aisló de las muestras de tejido cerebral usando el reactivo TRIzol y el sistema de purificación de ARN PureLink™ Micro-to-Midi Total RNA Purífication System (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante de dicho kit y se realizó un análisis de moléculas de ARN mensajero (ARNm) por reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcriptasa inversa (qRT-PCR). El ADN complementario (ADNc) de primera cadena se obtuvieron por transcripción inversa del ARN total (1,5 ^g), utilizando el kit de transcripción inversa High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems; Life Technologies Paisley, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante de dicho kit. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó en el sistema de PCR en tiempo real StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems), utilizando los ensayos de expresión génica TaqMan Gene Expression Assays (Hs00169098-m1 para APP y Hs03003631-g1 para 18S; Thermo Fisher) y la mezcla maestra de la PCR TaqMan PCR Master Mix. Los niveles de transcripción se calcularon mediante el método comparativo 2"ACt con respecto al ADNc de la subunidad ribosomal 18S.Total RNA was isolated from brain tissue samples using the TRIzol reagent and the PureLink ™ Micro-to-Midi Total RNA Purification System (Invitrogen), according to the kit manufacturer's instructions, and performed an analysis of messenger RNA (mRNA) molecules by quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR). First-strand complementary DNA (cDNA) was obtained by reverse transcription of total RNA (1.5 ^g), using the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems; Life Technologies Paisley, UK), from according to the kit manufacturer's instructions. Polymerase chain reaction (PCR) was performed on the StepOne™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems), using TaqMan Gene Expression Assays (Hs00169098-m1 for APP and Hs03003631 for APP). -g1 for 18S; Thermo Fisher) and TaqMan PCR Master Mix. Transcription levels were calculated by the 2"ACt comparative method with respect to the 18S ribosomal subunit cDNA.
Western blotwestern blot
Las muestras de tejido cerebral (30 |jg por pocillo) se hirvieron a 95°C durante 5 minutos, se separaron por electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (en inglés, SDS-PAGE) al 7,5% en Tris-Tricina y posteriormente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa de 0,45 ^m (Schleicher & Schuell Bioscience, GmbH, Dassel, Germany). Se cuantificó la señal inmunorreactiva de las bandas APP en las transferencias Western (Western blots). Las especies de APP en las muestras se detectaron usando: un antisuero policlonal anti-APP C-terminal de conejo (1:1000; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.; denominado aquí Sigma-Ct); un anticuerpo monoclonal de rata llamado 2D8 producido contra el dominio N-terminal de Ap, por lo que detecta CTFp pero no CTFa (1:50) (Willem et al., 2015), un antisuero policlonal de conejo anti-sAPPp específico para el C-terminal de sAPPp (1:100; IBL, Hamburgo, Alemania; denominado aquí IBL-p); un anticuerpo monoclonal de ratón anti-sAPPa específico para el C-terminal de sApPPa (1:100; IBL; denominado aquí IBL-a); y un antisuero policlonal de conejo anti-KPI específico para el dominio KPI de APP (1:500; Millipore; denominado aquí como KPI). Vinculina (1:2000, anticuerpo monoclonal de ratón anti-vinculina, sc-73614 Santa Cruz; antisuero de conejo anti-vinculina 1:1000, Sigma V4139) y GAPDH (1:10000 anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH; Proteintech 60004-1) se utilizaron como controles de carga. Las intensidades de las bandas se analizaron utilizando el programa informático Image Studio Lite (LI-COR). Los anticuerpos utilizados tenían una reactividad cruzada entre los fragmentos sAPPa y sAPPp inferior al 1,5%, y ninguno de los anticuerpos reacciona de forma cruzada con la APP de longitud completa. Las transferencias se detectaron utilizando anticuerpos secundarios conjugados apropiados (IRDye 680RD cabra anti-ratón (Número de catálogo 925-68180); IRDye 800CW cabra anti-conejo (Número de catálogo 925 32211); IRDye 680RD cabra anti-conejo (Número de catálogo 925-68071) o IRDye 800CW cabra anti-rata (Número de catálogo 926-32210); todos de LI-COR Biosciences GmbH, Bad Homburg, Alemania) y se analizaron en un sistema de imagen infrarrojo Odyssey Clx (LI-COR).Brain tissue samples (30 µg per well) were boiled at 95°C for 5 minutes, separated by electrophoresis on 7.5% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels (SDS-PAGE) in Tris-Tricine and subsequently transferred to 0.45 μm nitrocellulose membranes (Schleicher & Schuell Bioscience, GmbH, Dassel, Germany). The immunoreactive signal of APP bands in Western blots was quantified. APP species in the samples were detected using: a rabbit C-terminal anti-APP polyclonal antiserum (1:1000; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA; designated here as Sigma-Ct); a rat monoclonal antibody called 2D8 raised against the N-terminal domain of Ap, thus that detects CTFp but not CTFa (1:50) (Willem et al., 2015), a polyclonal rabbit anti-sAPPp antiserum specific for the C-terminus of sAPPp (1:100; IBL, Hamburg, Germany; referred to here as IBL -p); a mouse anti-sAPPa monoclonal antibody specific for the C-terminus of sApPPa (1:100; IBL; referred to herein as IBL-a); and a polyclonal rabbit anti-KPI antiserum specific for the KPI domain of APP (1:500; Millipore; referred to herein as KPI). Vinculin (1:2000, anti-vinculin mouse monoclonal antibody, sc-73614 Santa Cruz; 1:1000 rabbit anti-vinculin antiserum, Sigma V4139) and GAPDH (1:10000 anti-GAPDH mouse monoclonal antibody; Proteintech 60004- 1) were used as loading controls. Band intensities were analyzed using Image Studio Lite (LI-COR) software. The antibodies used had a cross-reactivity between the sAPPa and sAPPp fragments of less than 1.5%, and none of the antibodies cross-reacted with full-length APP. Blots were detected using appropriate conjugated secondary antibodies (IRDye 680RD goat anti-mouse (Catalog Number 925-68180); IRDye 800CW goat anti-rabbit (Catalog Number 925 32211); IRDye 680RD goat anti-rabbit (Catalog Number 925 -68071) or IRDye 800CW goat anti-rat (Catalog Number 926-32210); all from LI-COR Biosciences GmbH, Bad Homburg, Germany) and analyzed on an Odyssey Clx Infrared Imaging System (LI-COR).
De-glicosilación enzimáticaEnzymatic de-glycosylation
Las glicoproteínas solubilizadas de cerebro se trataron con un kit de de-glicosilación enzimática de ProZyme (GK80110), de acuerdo con las instrucciones del fabricante de dicho kit, y luego se sometieron a SDS-PAGE y análisis por Western blot. Los extractos de la corteza frontal se desnaturalizaron y se de-glicosilaron mediante incubación con N-Glicanasa, O-Glicanasa y Sialidasa A. Este tratamiento elimina todos los glicanos unidos a N y los glicanos simples unidos a O (incluidos los polisialilados) de las glicoproteínas.Solubilized brain glycoproteins were treated with a ProZyme enzymatic de-glycosylation kit (GK80110), according to the kit manufacturer's instructions, and then subjected to SDS-PAGE and Western blot analysis. Frontal cortex extracts were denatured and de-glycosylated by incubation with N-Glycanase, O-Glycanase and Sialidase A. This treatment removes all N-linked glycans and single O-linked glycans (including polysialylated) from the glycoproteins.
Unión a lectinaslectin binding
Las muestras de corteza cerebral se incubaron a 4°C durante toda la noche con lectinas específicas de azúcares terminales: la lectina de Canavalia ensiformis Concanavalina A (Con A) (Sigma; Número de catálogo C9017), con alta especificidad por residuos de manosa terminales, o la lectina de Phaseolus vulgaris PHA (Vector; Número de catálogo AL113), con alta especificidad por residuos de galactosa terminales, inmovilizadas en sefarosa (Con A) o agarosa (PHA). La fracción de glicoproteína no ligada a las lectinas se separó por centrifugación y se analizó en Western blot utilizando anticuerpos contra sAPPa y sAPPp. La proporción de APP no unida a lectina se calculó como la relación entre la inmunoreactividad de APP no unida a lectina y la inmunoreactividad total, obtenida de una alícuota mantenida en las mismas condiciones, pero no incubada con una lectina. Todos los análisis se realizaron por duplicado.Cerebral cortex samples were incubated at 4°C overnight with terminal sugar-specific lectins: the Canavalia ensiformis lectin Concanavalin A (Con A) (Sigma; Catalog Number C9017), with high specificity for terminal mannose residues. , or the Phaseolus vulgaris lectin PHA (Vector; Catalog Number AL113), with high specificity for terminal galactose residues, immobilized on sepharose (Con A) or agarose (PHA). The glycoprotein fraction not bound to lectins was separated by centrifugation and analyzed by Western blot using antibodies against sAPPa and sAPPp. The proportion of APP not bound to lectin was calculated as the ratio between the immunoreactivity of APP not bound to lectin and the total immunoreactivity, obtained from an aliquot maintained under the same conditions, but not incubated with a lectin. All analyzes were performed in duplicate.
Análisis estadísticoStatistic analysis
Todos los datos se analizaron en SigmaStat (Versión 2.0; SPSS Inc.), aplicando una prueba t de Student (de dos colas) o una prueba U de Mann-Whitney para comparaciones individuales, y determinando los valores p exactos (los valores p <0.05 fueron considerados significativos). Los resultados se presentan como las medias ± error estándar de la media (SEM) y la correlación entre las variables se evaluó mediante análisis de regresión lineal.All data were analyzed in SigmaStat (Version 2.0; SPSS Inc.), applying a Student's t-test (two-tailed) or Mann-Whitney U-test for individual comparisons, and determining exact p-values (p-values < 0.05 were considered significant). Results are presented as means ± standard error of the mean (SEM) and the correlation between variables was evaluated by linear regression analysis.
Ejemplo 1. Aumento de la expresión de APP en el cerebro de sujetos con EA Se realizaron ensayos de qRT-PCR para determinar la expresión del ARN mensajero (ARNm) de APP en EA, usando cebadores que correspondían a secuencias en los exones 10-11 de APP y que son comunes a las principales variantes cerebrales. Por lo tanto, se determinaron los niveles totales de ARNm de las variantes APP695, APP751 y APP770. En consecuencia, los niveles de transcritos de APP en su conjunto fueron significativamente mayores en el tejido cerebral de sujetos con EA que en el tejido cerebral de sujetos control (C) (p<0,001; Figura 1). Example 1. Increased expression of APP in the brain of AD subjects qRT-PCR assays were performed to determine the expression of APP messenger RNA (mRNA) in AD, using primers corresponding to sequences in exons 10-11 of APP and that are common to the main cerebral variants. Therefore, the total mRNA levels of the APP695, APP751 and APP770 variants were determined. Consequently, the levels of APP transcripts as a whole were significantly higher in the brain tissue of AD subjects than in the brain tissue of control subjects (C) (p<0.001; Figure 1).
Ejemplo 2. Caracterización de sAPPa, sAPPp, CTFa and CTFp en el tejido cerebral de sujetos con EAExample 2. Characterization of sAPPa, sAPPp, CTFa and CTFp in the brain tissue of subjects with AD
Se caracterizaron el sAPPa o sAPPp en Western blot del tejido cerebral de sujetos con EA, un método que permitió discriminar diferentes especies de APP, especialmente aquellas con diferentes masas moleculares. Sin embargo, sAPPa y sAPPp se distinguen entre sí sólo en 16 aminoácidos (lo que representa 1-2 kDa en masa molecular), y se ha predicho que sAPPa o sAPPp son sólo ~5-10 kDa más pequeños que la APP de longitud completa, y por lo tanto, no se distinguen por separación electroforética. Además, pequeñas diferencias en la migración electroforética también pueden atribuirse a diferencias en la glicosilación, o incluso reflejar formas inmaduras de la proteína. En consecuencia, para poder distinguir sAPPa o sAPPp, se abordó la discriminación de estas proteínas por electroforesis SDS-PAGE, utilizando anticuerpos pan-específicos generados contra el dominio exclusivo C-terminal de sAPPa y sAPPp.sAPPa or sAPPp were characterized in Western blots of brain tissue from AD subjects, a method that allowed discriminating different APP species, especially those with different molecular masses. However, sAPPa and sAPPp differ from each other by only 16 amino acids (representing 1-2 kDa in molecular mass), and sAPPa or sAPPp have been predicted to be only ~5-10 kDa smaller than full-length APP. , and therefore are not distinguished by electrophoretic separation. Furthermore, small differences in electrophoretic migration can also be attributed to differences in glycosylation, or even reflect immature forms of the protein. Consequently, in order to be able to distinguish sAPPa or sAPPp, the discrimination of these proteins by SDS-PAGE electrophoresis, using pan-specific antibodies raised against the unique C-terminal domain of sAPPa and sAPPp.
Tanto para sAPPa y el sAPPp, en el cerebro existen 3 variantes de splicing alternativo, la de 695 aminoácidos, APP695, mayoritariamente expresada en neuronas, y las variantes APP751 y APP770, expresadas en células gliales, que presentan el dominio inhibidor de serín proteasa tipo Kunitz KPI (del inglés Kunitz-type serine protease inhibitor). Los NTF de APP sAPPa y el sAPPp se distinguen electroforéticamente y por Western blot con anticuerpos pan-específicos contra el extremo C-terminal exclusivo de sAPPa y sAPPp. En las muestras de tejido cerebral, las diferentes especies de APP y sus fragmentos N-terminales largos se detectaron en varias bandas que migraron en el rango 100-130 kDa. Las diferencias en la masa molecular reflejan variantes alternativas de la especie predominante neuronal, la especie denominada APP695, y las isoformas APP751 y APP770, ambas portadoras del dominio KPI y prácticamente indistinguibles entre ellas por tamaño. Todas las variantes sufren el mismo procesamiento por secretasas y generan los mismos tipos de fragmentos, incluidos el sAPPa y el sAPPp. La Figura 2A muestra una representación esquemática de la longitud completa de APP y de los fragmentos N- y C-terminales determinados en este ejemplo, así como los epítopos reconocidos por los diferentes anticuerpos utilizados. Las especies de APP-NTF de cerebro se caracterizaron en Western blot, utilizando anticuerpos panespecíficos contra los dominios C-terminales específicos de sAPPa o sAPPp (Figura 2B). Cuando se utilizó un anticuerpo anti-KPI, solo las especies de mayor masa molecular mostraron tamaños compatibles con las bandas inmunorreactivas de KPI.For both sAPPa and sAPPp, there are 3 alternative splicing variants in the brain: the 695 amino acid variant, APP695, mainly expressed in neurons, and the variants APP751 and APP770, expressed in glial cells, which have the serine protease inhibitor domain. Kunitz KPI ( Kunitz-type serine protease inhibitor). The APP NTFs sAPPa and sAPPp are distinguished electrophoretically and by Western blot with pan-specific antibodies against the exclusive C-terminus of sAPPa and sAPPp. In the brain tissue samples, the different APP species and their long N-terminal fragments were detected in several bands that migrated in the 100-130 kDa range. The differences in molecular mass reflect alternative variants of the predominant neuronal species, the species designated APP695, and the APP751 and APP770 isoforms, both of which carry the KPI domain and are virtually indistinguishable from each other by size. All variants undergo the same processing by secretases and generate the same types of fragments, including sAPPa and sAPPp. Figure 2A shows a schematic representation of the full length of APP and the N- and C-terminal fragments determined in this example, as well as the epitopes recognized by the different antibodies used. Brain APP-NTF species were characterized on Western blot, using panspecific antibodies against the specific C-terminal domains of sAPPa or sAPPp (Figure 2B). When an anti-KPI antibody was used, only the higher molecular mass species showed sizes compatible with the KPI immunoreactive bands.
Dado que las variantes sAPPa y sAPPp derivadas del APP695 (no KPI) tampoco mostraron co-localización, se exploró si esas diferencias en masa molecular eran atribuibles a glicosilación (si la extensión de la glicosilación entre los distintos NTF variaba). Para ello, se de-glicosiló APP de manera completa, observando que, tras deglicosilación, todas las bandas identificadas con anticuerpos sAPPa y sAPPp sí co localizaban (Fig. 2C).Since the sAPPa and sAPPp variants derived from APP695 (non-KPI) also did not show co-localization, it was explored whether these differences in molecular mass were attributable to glycosylation (if the extent of glycosylation between the different NTFs varied). For this, APP was completely de-glycosylated, observing that, after deglycosylation, all the bands identified with sAPPa and sAPPp antibodies did co-localize (Fig. 2C).
El CTFa y el CTFp no difieren entre las variantes de APP y se caracterizaron usando extractos de células CHO-PS70 que sobre-expresan de manera estable la APP humana de tipo salvaje y la subunidad catalítica de Y-secretasa, presenilina-1. CTFa and CTFp do not differ between APP variants and were characterized using extracts from CHO-PS70 cells that stably overexpress wild-type human APP and the Y-secretase catalytic subunit, presenilin-1.
Los extractos de estas células tratadas con el inhibidor de la Y-secretasa, DAPT, se ensayaron con el anticuerpo C-terminal, proporcionando evidencia de la acumulación de CTFa (también llamado C83 por su longitud de aminoácidos) y CTFp (también llamado C99 por su longitud de aminoácidos) en los extractos celulares, y de bandas coincidentes en homogeneizados cerebrales cargados en paralelo (Figura 2D). Cuando se ensayó con el anticuerpo 2D8 de rata generado contra el dominio N-terminal de Ap, CTFa y CTFp podían discriminarse ya que el epítopo reconocido por este anticuerpo está ausente en CTFa (ver esquema en la Figura 2A).Extracts from these cells treated with the Y-secretase inhibitor, DAPT, were assayed with the C-terminal antibody, providing evidence for the accumulation of CTFa (also called C83 after its amino acid length) and CTFp (also called C99 after amino acid length). their amino acid length) in cell extracts, and from matching bands in parallel-loaded brain homogenates (Figure 2D). When tested with the rat 2D8 antibody raised against the N-terminal domain of Ap, CTFa and CTFp could be discriminated as the epitope recognized by this antibody is absent in CTFa (see scheme in Figure 2A).
Después de esta caracterización bioquímica, se evaluaron las diferentes isoformas de sAPPa y sAPPp en extractos de tejido cerebral. No se detectaron diferencias entre las muestras C y EA en los niveles relativos de sAPPa (Figura 3A y 3B) o sAPPp (Figura 3C y 3D) derivados de APP695 o APP-KPI. A pesar de las grandes diferencias en las proporciones APP695/APP-KPI para las especies sAPPa y sAPPp, no había diferencias evidentes en estas proporciones entre las muestras de C y EA (Figura 3E). La acumulación de bandas inmunorreactivas sAPPa-695 y sAPPa-KPI se correlacionó tanto en extractos de tejido C (r=0.76; p=0,048) como EA (r=0,96; p<0.001), aunque esta correlación no fue significativa para las especies sAPPp (C: r=0,19; p=0,69; EA: r=0,57; p=0,17). No hubo correlaciones significativas entre sAPPa y sAPPp en las isoformas APP695 o APP-KPI en sujetos con C o EA.After this biochemical characterization, the different isoforms of sAPPa and sAPPp in brain tissue extracts were evaluated. No differences were detected between samples C and EA in the relative levels of sAPPa (Figure 3A and 3B) or sAPPp (Figure 3C and 3D) derived from APP695 or APP-KPI. Despite the large differences in the APP695/APP-KPI ratios for the sAPPa and sAPPp species, there were no apparent differences in these ratios between the C and EA samples (Figure 3E). The accumulation of sAPPa-695 and sAPPa-KPI immunoreactive bands was correlated in both C (r=0.76; p=0.048) and EA (r=0.96; p<0.001) tissue extracts, although this correlation was not significant for the sAPPp species (C: r=0.19; p=0.69; EA: r=0.57; p=0.17). There were no significant correlations between sAPPa and sAPPp in the APP695 or APP-KPI isoforms in subjects with C or AD.
Para evaluar si los niveles de APP-CTF se alteraron en extractos cerebrales de pacientes con EA, se utilizó un anticuerpo generado contra el dominio C-terminal original de la APP de longitud completa. La inmunoreactividad para CTFa y CTFp en el tejido cerebral (Figura 4A, Figura 4B y Figura 4C) fue similar entre los sujetos con C y EA. Además, la relación CTFp/CTFa no indicó diferencias entre los grupos EA y C (Figura 4D).To assess whether APP-CTF levels were altered in brain extracts from AD patients, an antibody raised against the original C-terminal domain of full-length APP was used. Immunoreactivity for CTFa and CTFp in brain tissue (Figure 4A, Figure 4B, and Figure 4C) was similar between C and AD subjects. Furthermore, the CTFp/CTFa ratio did not indicate differences between the EA and C groups (Figure 4D).
Ejemplo 3. Unión de sAPPa and sAPPp a lectinasExample 3. Binding of sAPPa and sAPPp to lectins
Para comparar el patrón de glicosilación de sAPPa y sAPPp, se incubaron muestras de extractos de corteza frontal de sujetos C (n= 7) y sujetos con la EA (n= 7) con la lectina Con A, que tiene alta especificidad por residuos de manosa terminales, y la lectina PHA, que tiene alta especificidad por residuos de galactosa terminales, inmovilizadas en sefarosa (Con A) o agarosa (PHA). Se utilizaron anticuerpos pan-específicos para determinar qué porcentaje de sAPPa y sAPPp no era reconocido por cada una de las lectinas (Tabla 1).To compare the glycosylation pattern of sAPPa and sAPPp, samples of frontal cortex extracts from C subjects (n= 7) and AD subjects (n= 7) were incubated with the Con A lectin, which has high specificity for A nucleotide residues. terminal mannose, and the lectin PHA, which has high specificity for terminal galactose residues, immobilized on sepharose (Con A) or agarose (PHA). Pan-specific antibodies were used to determine what percentage of sAPPa and sAPPp was not recognized by each of the lectins (Table 1).
Tabla 1Table 1
Los fragmentos sAPPp derivados tanto de APP695 como de APP-KPI mostraron diferencias en su interacción con ambas lectinas, tanto en el grupo control como en el de pacientes con la EA (Figuras 5A-5D). Esto puede deberse al origen celular diferente para las isoformas derivadas de la especie APP695 (neuronal) y las APP-KPI (mayormente glial), y a que cada tipo celular tiene una maquinaria de glicosilación particular. Sin embargo, los distintos fragmentos sAPPa exhibieron un patrón similar de unión a Con A o PHA en ambos grupos. Lo que resultó más interesante fue constatar que el patrón de unión a lectinas variaba al comparar sAPPa y sAPPp, tanto para las especies derivadas de APP695, como para las derivadas de APP-KPI, y en ambos grupos, control y con la EA (Figuras 6A-6D). Este resultado, junto con las evidencias de una extensión diferente en glicosilación entre sAPPa y sAPPp derivada de la misma variante (Figura 2C), sugiere que diferentes glicoformas de APP se procesan preferencialmente por la vía no amiloidogénica (a-secretasa) o por la amiloidogénica (psecretasa). Además, esta determinación se da tanto en neuronas (APP695) como en células gliales (APP-KPI).The sAPPp fragments derived from both APP695 and APP-KPI showed differences in their interaction with both lectins, both in the control group and in that of patients with AD (Figures 5A-5D). This may be due to the different cellular origin for the isoforms derived from the APP695 species (neuronal) and the APP-KPI species (mostly glial), and to the fact that each cell type has a particular glycosylation machinery. However, the different sAPPa fragments exhibited a similar pattern of binding to Con A or PHA in both groups. What was most interesting was to verify that the lectin binding pattern varied when comparing sAPPa and sAPPp, both for the species derived from APP695 and for those derived from APP-KPI, and in both groups, control and with AD (Figures 6A-6D). This result, together with the evidence of a different extent of glycosylation between sAPPa and sAPPp derived from the same variant (Figure 2C), suggests that different APP glycoforms are preferentially processed by the non-amyloidogenic pathway (α-secretase) or by the amyloidogenic pathway. (psecretase). In addition, this determination occurs both in neurons (APP695) and in glial cells (APP-KPI).
Para estudiar si la glicosilación de APP difiere en extractos cerebrales de sujetos con la EA en comparación con los sujetos control, se confrontó el patrón de glicosilación de sAPPa y sAPPp (Figuras 7A-7D). Se determinaron diferencias significativas entre el grupo control y el grupo con la EA en cuanto a la interacción del sAPPa derivado de la APP695 con Con A y PHA; y también con Con A para el sAPPa derivado de las especies APP-KPI. Existían diferencias en la proporción de sAPPp que no se unió ni a Con A ni a PHA en muestras de pacientes con la EA en comparación con controles en la especie APP695 y en las especies APP-KPI, aunque dichas diferencias no eran estadísticamente significativas con número de sujetos del presente ejemplo y con la precisión alcanzada en el presente ejemplo. No obstante, no es descartable que se puedan detectar diferencias con mayor significación estadística utilizando técnicas más precisas o un mayor número de pacientes. Los resultados de este ejemplo indicaron que la glicosilación de APP en el cerebro con la EA está alterada y afecta principalmente a las glicoformas procesadas por la vía no amiloidogénica.To study whether APP glycosylation differs in brain extracts from AD subjects compared to control subjects, the glycosylation pattern of sAPPa and sAPPp was compared (Figures 7A-7D). Significant differences were determined between the control group and the AD group in terms of the interaction of sAPPa derived from APP695 with Con A and PHA; and also with Con A for sAPPa derived from APP-KPI species. There were differences in the proportion of sAPPp that did not bind to Con A or to PHA in samples from patients with AD compared to controls in the APP695 species and in the APP-KPI species, although these differences were not statistically significant with the number of subjects in the present example and with the precision achieved in the present example. However, it is not ruled out that differences with greater statistical significance can be detected using more precise techniques or a larger number of patients. The results of this example indicated that APP glycosylation in the AD brain is impaired and primarily affects glycoforms processed by the non-amyloidogenic pathway.
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