ES2395063B1

ES2395063B1 - Method to determine Alzheimer's disease by detecting glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope

Info

Publication number: ES2395063B1
Application number: ES201130290A
Authority: ES
Inventors: Javier Saez Valero; Mª Salud GARCIA AYLLON
Original assignee: Universidad Miguel Hernandez de Elche UMH
Current assignee: Universidad Miguel Hernandez de Elche UMH
Priority date: 2011-03-04
Filing date: 2011-03-04
Publication date: 2014-02-07
Anticipated expiration: 2031-03-04
Also published as: WO2012120170A1; ES2395063R1; ES2395063A2

Abstract

Método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de cilicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1.#La presente invención se refiere a un método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1, a un método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer y al uso de un kit para llevar a cabo dichos métodos.Method for determining Alzheimer's disease by detecting HNK-1 glycoepitope carrying cylcoproteins. # The present invention relates to a method for determining Alzheimer's disease by detecting HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins, to a method for determine the progression of Alzheimer's disease and the use of a kit to carry out these methods.

Description

Método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1. Method to determine Alzheimer's disease by detecting glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope.

La presente invención se enmarca dentro del campo de la neurobiología y de la biomedicina. The present invention falls within the field of neurobiology and biomedicine.

5 Específicamente, se refiere a un método para determinar la enfermedad de Alzheimer (EA) mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1, a un método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer y al uso de un kit para llevar a cabo dichos métodos. 5 Specifically, it refers to a method for determining Alzheimer's disease (AD) by detecting glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope, a method for determining the progression of Alzheimer's disease and the use of a kit to carry Perform these methods.

STATE OF THE PREVIOUS TECHNIQUE

La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa de carácter progresivo, de origen Alzheimer's disease is a progressive neurodegenerative disease of origin

10 todavía desconocido. Dicha enfermedad es la causa de invalidez y dependencia más frecuente en la actualidad, entre las personas de edad avanzada. Se estima que 8 millones de europeos están afectados por la enfermedad de Alzheimer y, teniendo en cuenta el envejecimiento de la población, se prevé que el número de enfermos se duplique en 2020 y triplique en 2050. Pese a estos datos, todavía no existen tratamientos capaces de curar la enfermedad y, la no existencia de marcadores bioquímicos capaces de 10 still unknown. This disease is the cause of disability and dependence more frequent today, among the elderly. It is estimated that 8 million Europeans are affected by Alzheimer's disease and, given the aging of the population, the number of patients is expected to double in 2020 and triple in 2050. Despite these data, there are still no treatments capable of curing the disease and, the non-existence of biochemical markers capable of

15 distinguir a la EA de otro tipo de demencias, hace que el diagnóstico de la misma no sea del todo concluyente. 15 distinguishing AD from other types of dementias makes the diagnosis of it not entirely conclusive.

Esta enfermedad está caracterizada por una progresiva pérdida de memoria y de otras capacidades mentales a medida que las neuronas degeneran y diferentes zonas del cerebro se atrofian. A nivel neuropatológico la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la aparición de dos estructuras anormales 20 que se acumulan en el cerebro, los depósitos amiloides (fibras insolubles localizadas extracelularmente formadas por el péptido �-amiloide (�A)) y los ovillos neurofibrilares (conglomerados de la proteína citoesquelética tau hiperfosforilada). Por otro lado, también se ha descrito glicosilación alterada para diversas glicoproteínas tanto en el líquido cefalorraquídeo (LCR) como en el cerebro de pacientes con EA (Sáez-Valero et al., Lancet 1997, 350, 929; Guevara J et al., Exp. Neurol. 1998, 57, 905-914; Fodero LR. This disease is characterized by a progressive loss of memory and other mental abilities as neurons degenerate and different areas of the brain atrophy. At the neuropathological level, Alzheimer's disease is characterized by the appearance of two abnormal structures 20 that accumulate in the brain, the amyloid deposits (insoluble fibers located extracellularly formed by the peptide �-amyloid (�A)) and the neurofibrillary tangles (conglomerates) of the hyperphosphorylated tau cytoskeletal protein). On the other hand, altered glycosylation has also been described for various glycoproteins in both cerebrospinal fluid (CSF) and in the brain of patients with AD (Sáez-Valero et al., Lancet 1997, 350, 929; Guevara J et al., Exp. Neurol. 1998, 57, 905-914; Fodero LR.

25 et al., J. Neurochem. 2001, 79, 1022-1026; Kanninen K et al., Neurosci Lett. 2004, 367, 235-240; Botella-López A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578), por lo que se piensa que las alteraciones patológicas que acontecen en el cerebro de Alzheimer pueden ser consecuencia o determinante de cambios en la pauta de glicosilación. 25 et al., J. Neurochem. 2001, 79, 1022-1026; Kanninen K et al., Neurosci Lett. 2004, 367, 235-240; Botella-López A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578), so it is thought that the pathological alterations that occur in the Alzheimer's brain may be a consequence or determinant of changes in the glycosylation pattern.

Las glicoproteínas consisten en una mezcla de variantes glicosiladas, denominadas glicoformas, en las Glycoproteins consist of a mixture of glycosylated variants, called glycoforms, in the

30 que la misma secuencia peptídica está asociada a la unión de uno o más oligosacáridos al mismo punto de glicosilación. En una misma especie, los restos oligosacarídicos dependen del tipo celular y su equipamiento enzimático, pero también de su estado de desarrollo, nutricional y patológico. Una misma proteína puede presentar incluso en el mismo tipo celular alternativas en su glicosilación que marquen diferentes localizaciones subcelulares (o secreción) y determinen su función y funcionalidad. 30 that the same peptide sequence is associated with the binding of one or more oligosaccharides to the same glycosylation point. In the same species, oligosaccharide residues depend on the cell type and its enzymatic equipment, but also on its state of development, nutritional and pathological. The same protein can present even in the same cell type alternatives in its glycosylation that mark different subcellular locations (or secretion) and determine its function and functionality.

35 Un glicoepítopo (porción glucídica de una glicoproteína) abundante en el sistema nervioso central es el llamado HNK-1, un carbohidrato inusual que contiene el azúcar ácido 3-sulfo-glucurónico en la siguiente secuencia: GlcA(3-sulfato)(�1�3)Gal(�1�4)GlcNAc (Voshol H et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 2295722960). El glicano HNK-1 es un marcador de adhesión celular, presente en glicolípidos (SGGL-1 y SGGL2) y glicoproteínas. 35 A glycoepitope (glycidic portion of a glycoprotein) abundant in the central nervous system is the so-called HNK-1, an unusual carbohydrate containing 3-sulfo-glucuronic acid sugar in the following sequence: GlcA (3-sulfate) (�1 �3) Gal (�1�4) GlcNAc (Voshol H et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 2295722960). HNK-1 glycan is a marker of cell adhesion, present in glycolipids (SGGL-1 and SGGL2) and glycoproteins.

40 La expresión del glicoepítopo HNK-1 está temporalmente y espacialmente regulada durante el desarrollo. Y lo que resulta potencialmente más interesante, el determinante HNK-1 sólo aparece en algunas variantes (glicoformas) de la misma proteína y sólo en determinados tejidos, posiblemente revelando funciones fisiológicas distintas para dichas variantes. Así, podemos suponer que dicho azúcar determina y participa en las funciones y/o localización específica de unas variantes de glicoproteínas frente a otras, 40 HNK-1 glycoepitope expression is temporarily and spatially regulated during development. And what is potentially more interesting, the HNK-1 determinant only appears in some variants (glycoforms) of the same protein and only in certain tissues, possibly revealing different physiological functions for these variants. Thus, we can assume that said sugar determines and participates in the functions and / or specific location of some variants of glycoproteins compared to others,

45 variantes que pueden estar específicamente afectadas en ciertas condiciones patológicas; aunque hasta el momento no es conocido como se regula el glicoepítopo HNK-1 durante la patogénesis neurodegenerativa en general y en la EA en particular. 45 variants that may be specifically affected in certain pathological conditions; although so far it is not known how the HNK-1 glycoepitope is regulated during neurodegenerative pathogenesis in general and in AD in particular.

Por tanto, aunque el hallazgo de patrones específicos de expresión de determinadas glicoproteínas y su identificación en el LCR o plasma, podría ser de gran interés como marcador biológico, aún no se han Therefore, although the finding of specific expression patterns of certain glycoproteins and their identification in the CSF or plasma, could be of great interest as a biological marker, they have not yet been

50 encontrado marcadores bioquímicos que diferencien la EA de otro tipo de demencias, por lo que persiste el problema del diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. 50 found biochemical markers that differentiate AD from other types of dementias, so the problem of the diagnosis of Alzheimer's disease persists.

EXPLANATION OF THE INVENTION

La presente invención se refiere a un método para determinar la enfermedad de Alzheimer mediante la detección de glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1, a un método para determinar la The present invention relates to a method for determining Alzheimer's disease by the detection of glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope, to a method for determining the

55 progresión de la enfermedad de Alzheimer y a un kit para llevar a cabo dichos métodos. 55 progression of Alzheimer's disease and a kit to carry out these methods.

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Es de destacar que la presente invención demuestra que el glicoepítopo HNK-1, asociado a diversas proteínas, presenta manifiesta alteración en la inmunoreactividad (cantidad relativa) de las bandas HNK-1 detectadas en cerebro de Alzheimer al comparar éstos con controles no patológicos, indicando que la patología afecta específicamente a glicoformas asociadas con el epítopo HNK-1 en el cerebro de Alzheimer. It is noteworthy that the present invention demonstrates that the HNK-1 glycoepitope, associated with various proteins, shows manifest alteration in the immunoreactivity (relative amount) of the HNK-1 bands detected in Alzheimer's brain when comparing these with non-pathological controls, indicating that the pathology specifically affects glycoforms associated with the HNK-1 epitope in the Alzheimer's brain.

Debido a que la expresión de proteínas portadoras del epítopo HNK-1 se muestra específicamente afectada en la enfermedad de Alzheimer, el objeto de la presente invención es proporcionar un método para determinar la enfermedad de Alzheimer y más específicamente, para determinar la presencia o ausencia de dicha enfermedad neurodegenerativa basado en la determinación de glicoproteínas asociadas con el epítopo HNK-1. Because the expression of HNK-1 epitope-bearing proteins is specifically affected in Alzheimer's disease, the object of the present invention is to provide a method to determine Alzheimer's disease and more specifically, to determine the presence or absence of said neurodegenerative disease based on the determination of glycoproteins associated with the HNK-1 epitope.

Por tanto, la presente invención resuelve el problema técnico que plantea el diagnóstico de la EA, para la cual actualmente no existe ninguna prueba que pueda diagnosticar dicha enfermedad con precisión recurriéndose a la evaluación sistemática que elimina otras posibles causas. Therefore, the present invention solves the technical problem posed by the diagnosis of AD, for which there is currently no test that can accurately diagnose said disease by resorting to a systematic evaluation that eliminates other possible causes.

La presente invención proporciona un nuevo biomarcador de alta especificidad y sensibilidad, con potencial diagnóstico para la EA donde, a partir de una muestra biológica de un sujeto, se detectan y/o cuantifican glicoformas de glicoproteínas mediante anticuerpos frente al glicoepítopo HNK-1. The present invention provides a new biomarker of high specificity and sensitivity, with diagnostic potential for AD where, from a biological sample of a subject, glycoproteins of glycoproteins are detected and quantified by antibodies against the HNK-1 glycoepitope.

Así, en la presente invención se muestra, que a partir de una muestra cerebral de un sujeto se detectan patrones que permiten diagnosticar dicha enfermedad con una sensibilidad mayor de un 80%, preferentemente entre el 83 y el 100%, y una especificidad mayor de un 65%, preferentemente entre el 67 y el 83%, valores acordes a los señalados como necesarios según el Consensus Report of the Working Group on "Molecular and Biochemical Markers of Alzheimer´s Disease" (1998; estudio esponsorizado por The Reagan Research Institute of the Alzheimer´s Association and The National Institute on Aging). De igual forma, la presente invención provee de un método de diagnóstico altamente eficaz para descartar dicha enfermedad. Thus, it is shown in the present invention, that from a brain sample of a subject patterns are detected that allow diagnosing said disease with a sensitivity greater than 80%, preferably between 83 and 100%, and a specificity greater than 65%, preferably between 67 and 83%, values according to those indicated as necessary according to the Consensus Report of the Working Group on "Molecular and Biochemical Markers of Alzheimer's Disease" (1998; study sponsored by The Reagan Research Institute of the Alzheimer´s Association and The National Institute on Aging). Similarly, the present invention provides a highly effective diagnostic method to rule out said disease.

Así, un primer aspecto de la presente invención se refiere a un método, en adelante primer método de la invención, para determinar la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo, que comprende: Thus, a first aspect of the present invention relates to a method, hereinafter the first method of the invention, for determining Alzheimer's disease in an isolated biological sample of an individual, comprising:

a. to.: detectar y/o cuantificar las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 en dicha muestra biológica aislada, y detecting and / or quantifying the glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope in said isolated biological sample, and

b. b.: comparar los datos obtenidos en el apartado (a) con valores de referencia, para encontrar una desviación significativa. compare the data obtained in section (a) with reference values, to find a significant deviation.

El término “glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1”, tal y como se utiliza en la descripción se refiere a una proteína unida a una o varias moléculas de glicoepítopo HNK-1. The term "HNK-1 glycoepitope carrier glycoprotein", as used in the description refers to a protein bound to one or more HNK-1 glycoepitope molecules.

Son muchas las glicoproteínas cerebrales portadoras de dicho glicoepítopo. Así, pero sin limitarse, se ha descrito HNK-1 en las moléculas de adhesión celular NCAM (neural cell adhesion molecule), telencefalina y tenascina-R [Yoshihara Y et al., Neurosci Res. 1991, 10,83-105], en CD-24 (Lieberoth A et al., J Neurosci. 2009, 29, 6677-6690), en la molécula periférica P0 (Bollensen E et al., Neurosci Lett 1987, 82, 77-82), en la molécula de reconocimiento neural L1 (Hall H et al., J Neurochem. 1997, 68, 544-553), las moléculas TAG-1 (Dodd et al., Neuron 1988, 1, 105-116) y F3/F11 (Rathjen FG et al., J Cell Biol. 1987, 104, 343-353), y en otros muchos glicanos como neuroglicano C (Shuo T et al., Glycoconj J. 2004, 20, 267-278), agrecano (Domowicz MS et al., Dev Dyn 2003, 226, 42-50), distroglicano (Smalheiser NR et al., J Biol Chem. 1995, 270, 15425-15433), MAG (Bartoszewicz ZP et al., J Neurosci Res. 1995, 41, 27-38), somataglicano-S (Williams C et al., Neurochem. 1994, 62, 1615-1630), fosfocano y neurocano (Preobrazhensky AA et al., Neurochem Res. 1997, 22, 133-140) entre otros. There are many brain glycoproteins carrying said glycoepitope. Thus, but not limited to, HNK-1 has been described in the cell adhesion molecules NCAM (neural cell adhesion molecule), telencephalin and tenascin-R [Yoshihara Y et al., Neurosci Res. 1991, 10,83-105], in CD-24 (Lieberoth A et al., J Neurosci. 2009, 29, 6677-6690), in the peripheral molecule P0 (Bollensen E et al., Neurosci Lett 1987, 82, 77-82), in the molecule of Neural recognition L1 (Hall H et al., J Neurochem. 1997, 68, 544-553), TAG-1 molecules (Dodd et al., Neuron 1988, 1, 105-116) and F3 / F11 (Rathjen FG et al., J Cell Biol. 1987, 104, 343-353), and in many other glycans such as neuroglycan C (Shuo T et al., Glycoconj J. 2004, 20, 267-278), aggrecan (Domowicz MS et al. , Dev Dyn 2003, 226, 42-50), distroglycan (Smalheiser NR et al., J Biol Chem. 1995, 270, 15425-15433), MAG (Bartoszewicz ZP et al., J Neurosci Res. 1995, 41, 27 -38), somataglicano-S (Williams C et al., Neurochem. 1994, 62, 1615-1630), phosphocan and neurocano (Preobrazhensky AA et al., Neurochem Res. 1997, 2 2, 133-140) among others.

También se ha descrito la presencia de HNK-1 en las enzimas acetilcolinesterasa (Bon S et al., J Neurochem. 1987, 49, 1720-1731), butirilcolinesterasa (Weikert T et al., Neurosci Lett 1994, 176, 9-12) y 5’-nucleotidasa (Vogel M et al., Eur J Neurosci 1993, 5, 1423-1425), y en otras proteínas neurales como la priónica (Chen S et al., Mol Cell Neurosci 2003, 22, 227-233), la reelina (Botella-López A et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 5573-5578), la subunidad del receptor de glutamato GluR2 (Morita I et al., J Biol Chem 2009, 284, 30209-30217), o el receptor RPTP (Abbott KL et al., J Biol Chem 2008, 283, 3302633035) entre otras. The presence of HNK-1 in acetylcholinesterase enzymes has also been described (Bon S et al., J Neurochem. 1987, 49, 1720-1731), butyrylcholinesterase (Weikert T et al., Neurosci Lett 1994, 176, 9-12 ) and 5'-nucleotidase (Vogel M et al., Eur J Neurosci 1993, 5, 1423-1425), and in other neural proteins such as prion (Chen S et al., Mol Cell Neurosci 2003, 22, 227-233 ), reelin (Botella-López A et al., Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 5573-5578), the GluR2 glutamate receptor subunit (Morita I et al., J Biol Chem 2009, 284, 30209- 30217), or the RPTP receptor (Abbott KL et al., J Biol Chem 2008, 283, 3302633035) among others.

De aquí en adelante, para hacer referencia a las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 descritas en párrafos anteriores, se puede emplear el término “glicoproteínas de la invención”. Hereinafter, to refer to the glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope described in the preceding paragraphs, the term "glycoproteins of the invention" can be used.

El término “muestra biológica aislada”, tal y como se utiliza en la descripción se refiere, pero no se limita, a plasma o a una muestra cerebral, donde la muestra cerebral es preferentemente un fluido biológico, y The term "isolated biological sample", as used in the description refers to, but is not limited to, plasma or a brain sample, where the brain sample is preferably a biological fluid, and

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más preferentemente líquido cefalorraquídeo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a mamíferos, preferentemente humanos o animales. more preferably cerebrospinal fluid, obtained by any method known to a person skilled in the art. The term "individual", as used in the description, refers to mammals, preferably humans or animals.

La expresión “detectar y/o cuantificar” tal y como se emplea en la descripción del método de la invención, hace referencia a la detección de la presencia y/o a la medida de la cantidad o la concentración, preferentemente de manera semicuantitativa o cuantitativa. The term "detect and / or quantify" as used in the description of the method of the invention, refers to the detection of the presence and / or to the measure of the amount or concentration, preferably semi-quantitative or quantitative.

De acuerdo con la presente invención, la detección y/o cuantificación de las glicoproteínas de la invención puede ser llevada a cabo por cualquier método conocido en el estado de la técnica. En una realización preferida la detección y/o cuantificación se lleva a cabo mediante electroforesis, preferentemente mediante electroforesis de dos dimensiones o electroforesis bidimensional. In accordance with the present invention, the detection and / or quantification of the glycoproteins of the invention can be carried out by any method known in the state of the art. In a preferred embodiment the detection and / or quantification is carried out by electrophoresis, preferably by two-dimensional electrophoresis or two-dimensional electrophoresis.

El término “electroforesis”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier técnica analítica, basada en la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico. La separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (por ejemplo pero sin limitarse, electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa. The term "electrophoresis", as used in the present description, refers to any analytical technique, based on the separation of molecules according to their mobility in an electric field. The separation can be carried out on the hydrated surface of a solid support (for example but not limited to electrophoresis in paper or cellulose acetate), or through a porous matrix (gel electrophoresis), or in solution (free electrophoresis ). Depending on the technique used, the separation is due in different measure to the electrical charge of the molecules and their mass.

Ejemplos de electroforesis conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: electroforesis capilar, electroforesis en gel, electroforesis proteica o electroforesis bidimensional. Examples of electrophoresis known in the state of the art are, for example, but not limited to: capillary electrophoresis, gel electrophoresis, protein electrophoresis or two-dimensional electrophoresis.

La electroforesis bidimensional permite la separación de mezclas complejas de las glicoproteínas de la invención. La separación se hace en dos etapas consecutivas. En la primera de ellas (“primera dimensión”) las glicoproteínas son separadas en función de su carga a lo largo de un gel con gradiente de pH. Cada glicoproteína avanza en el campo eléctrico hasta alcanzar un valor de pH igual a su punto isoeléctrico. En una segunda etapa (“segunda dimensión”), estas glicoproteínas son separadas entre sí en función de su masa molecular. La visualización del resultado de estas dos electroforesis muestra el conjunto de las glicoproteínas presentes en la mezcla inicial. Two-dimensional electrophoresis allows the separation of complex mixtures of the glycoproteins of the invention. The separation is done in two consecutive stages. In the first of them ("first dimension") the glycoproteins are separated according to their charge along a gel with a pH gradient. Each glycoprotein advances in the electric field until it reaches a pH value equal to its isoelectric point. In a second stage ("second dimension"), these glycoproteins are separated from each other based on their molecular mass. The visualization of the result of these two electrophoresis shows the group of glycoproteins present in the initial mixture.

En otra realización preferida la detección y/o cuantificación se lleva a cabo mediante inmunoensayo, preferentemente mediante ensayo ELISA. In another preferred embodiment the detection and / or quantification is carried out by immunoassay, preferably by ELISA.

El término “inmunoensayo”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a cualquier técnica analítica, basada en la reacción de conjugación de la secuencia aminoacídica de las glicoproteínas de la invención, de sus variantes o de un fragmento de las mismas con un anticuerpo que las reconoce. The term "immunoassay", as used herein, refers to any analytical technique, based on the conjugation reaction of the amino acid sequence of the glycoproteins of the invention, its variants or a fragment thereof. with an antibody that recognizes them.

Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunoensayo lineal (LIA), radioinmunoensayo (RIA), inmunofluorescencia, inmunohistoquímica o microarrays de proteínas. Examples of immunoassays known in the state of the art are, for example, but not limited to: immunoblot, enzyme-linked immunoadsorbent assay (ELISA), linear immunoassay (LIA), radioimmunoassay (RIA), immunofluorescence, immunohistochemistry or protein microarray.

El inmunoensayo puede ser un ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno de la muestra biológica o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo (la muestra biológica se pega a un soporte sólido y el antígeno se detecta con un anticuerpo reportador), ELISA indirecto (igual que el anterior salvo que se emplean dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario marcado contra el primario, lo que permite amplificar la señal), ELISA sándwich (la variante consiste en que se captura el antígeno mediante un primer anticuerpo, resolviéndose con un segundo anticuerpo contra una región distinta, epítopo, del antígeno) u otras variantes de ELISA. The immunoassay can be an enzyme-linked immunoadsorbent assay or ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). The ELISA is based on the premise that an immunoreactive (biological sample antigen or antibody) can be immobilized on a solid support, then bringing that system into contact with a fluid phase containing the complementary reagent that can bind to a marker compound . There are different types of ELISA: direct ELISA (the biological sample sticks to a solid support and the antigen is detected with a reporter antibody), indirect ELISA (same as the previous one unless two antibodies are used: one primary against the antigen and one secondary marked against the primary, which allows amplifying the signal), sandwich ELISA (the variant is that the antigen is captured by a first antibody, resolving with a second antibody against a different region, epitope, of the antigen) or other variants of ELISA

Preferentemente el ensayo ELISA se lleva a cabo: Preferably the ELISA test is carried out:

• •: mediante la fijación al soporte sólido de anticuerpos anti-HNK-1, para fijar y medir la proteína total HNK-1 (ligada a la placa de medida por una Ig-M que permita amplificar la fijación de anticuerpo), revelando la misma por un método convencional de medida de proteínas como por ejemplo pero sin limitarse, el del ácido bicincónico (accesible comercialmente y de uso rutinario en nuestro laboratorio) o, by fixing to the solid support of anti-HNK-1 antibodies, to fix and measure the total HNK-1 protein (linked to the measuring plate by an Ig-M that allows amplifying the antibody binding), revealing it by a conventional method of measuring proteins such as but not limited to that of bicinconic acid (commercially accessible and routinely used in our laboratory) or,

• •: mediante la fijación al soporte sólido de anticuerpos contra la porción aminoacídica de una glicoproteína dada, para fijar y medir el contenido en sus glicoformas HNK-1, revelando con anticuerpos anti-HNK-1 y anticuerpos secundarios contra los mismos o, by fixing to the solid support of antibodies against the amino acid portion of a given glycoprotein, to fix and measure the content in its HNK-1 glycoforms, revealing with anti-HNK-1 antibodies and secondary antibodies against them or,

• •: mediante el uso de lectinas fijando las lectinas a los pocillos (las lectinas fijan exclusivamente glicoproteínas portadoras de ciertos azúcares selectivos, entre ellas a las glicoproteínas de la through the use of lectins by fixing lectins to the wells (lectins exclusively fix glycoproteins carrying certain selective sugars, including the glycoproteins of the

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invención) y tras incubación con extractos, identificando las glicoformas HNK-1 (glicoproteínas de la invención) con anticuerpos anti-HNK-1 como molécula reportera. Las lectinas PHA, aglutininas de Phaseolus vulgaris presentan un patrón de reconocimiento semejante al propio del HNK-1. Esta última aproximación permite mejorar la sensibilidad del análisis, de forma que el uso de otras lectinas podría servir para refinar la especificidad del método. invention) and after incubation with extracts, identifying the HNK-1 glycoforms (glycoproteins of the invention) with anti-HNK-1 antibodies as reporter molecule. The PHA lectins, agglutinins of Phaseolus vulgaris have a recognition pattern similar to that of HNK-1. This last approach allows to improve the sensitivity of the analysis, so that the use of other lectins could serve to refine the specificity of the method.

Estos métodos pueden requerir de una etapa previa de separación de proteínas de bajo peso molecular (por debajo de 100 KDa) mediante filtros. These methods may require a previous stage of separation of low molecular weight proteins (below 100 KDa) by filters.

El término “compuesto marcador”, tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y/o cuantificación de la cantidad del anticuerpo frente a la secuencia aminoacídica de la glicoproteína de la invención. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoróforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo directamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 33P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa por colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía, respectivamente. The term "marker compound", as used herein, refers to a compound capable of giving rise to a chromogenic, fluorogenic, radioactive and / or chemiluminescent signal that allows the detection and / or quantification of the amount of the antibody against the amino acid sequence of the glycoprotein of the invention. The marker compound is selected from the list comprising radioisotopes, enzymes, fluorophores or any molecule capable of being conjugated with another molecule or detected and / or quantified directly. This marker compound can bind to the antibody directly, or through another compound. Some examples of directly binding marker compounds are, but are not limited to, enzymes such as alkaline phosphatase or peroxidase, radioactive isotopes such as 33P or 35S, fluorochromes such as fluorescein or metal particles, for direct detection by colorimetry, auto-radiography, fluorimetry , or metallography, respectively.

En otra realización preferida, el método de la invención además comprende atribuir la desviación significativa a la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en el individuo. In another preferred embodiment, the method of the invention further comprises attributing the significant deviation to the presence or absence of Alzheimer's disease in the individual.

El término “desviación significativa” tal y como se emplea en la presente invención hace referencia a la diferencia de concentración de las glicoproteínas de la invención en la muestra biológica aislada con respecto a una muestra de un individuo sano, es decir, un individuo que presente dichas glicoproteínas a niveles normales. Así, para encontrar una desviación significativa, se compara la desviación de los resultados obtenidos en el apartado (a) con respecto a unos valores de referencia. Preferentemente los valores de referencia son, pero sin limitarse, valores control, es decir, aquellas muestras que presentan las glicoproteínas de la invención en niveles normales. The term "significant deviation" as used in the present invention refers to the difference in concentration of the glycoproteins of the invention in the isolated biological sample with respect to a sample of a healthy individual, that is, an individual presenting said glycoproteins at normal levels. Thus, to find a significant deviation, the deviation of the results obtained in section (a) is compared with respect to reference values. Preferably the reference values are, but are not limited to, control values, that is, those samples presenting the glycoproteins of the invention at normal levels.

En la presente invención se muestra que los valores patológicos se desvían un 48-64% de los promedios determinados en un individuo sano. Dicha desviación es una desviación significativa de las normas estadísticas establecidas, como por ejemplo, pero sin limitarse, la desviación de la media o mediana con respecto al control. No obstante, la desviación estadísticamente significativa puede determinarse mediante cualquier técnica estadística conocida por el experto en la materia. In the present invention it is shown that the pathological values deviate 48-64% of the averages determined in a healthy individual. This deviation is a significant deviation from the established statistical standards, such as, but not limited to, the deviation from the mean or median with respect to the control. However, the statistically significant deviation can be determined by any statistical technique known to the person skilled in the art.

El epítopo HNK-1 determina y participa en las funciones y/o localización específica de unas variantes de glicoproteínas frente a otras, así, por ejemplo, el HNK-1 se encuentra unido a la reelina o a la acetilcolinesterasa (AChE) sólo en ciertas condiciones (Botella-López A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578 y Johnson G, et al., Int J Dev Neurosci 2001, 19, 439-45, respectivamente). En la presente invención se demuestra que el epítopo HNK-1 puede actuar como un indicador de la EA. The HNK-1 epitope determines and participates in the functions and / or specific location of some glycoprotein variants against others, so, for example, HNK-1 is bound to reelin or acetylcholinesterase (AChE) only under certain conditions (Botella-López A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578 and Johnson G, et al., Int J Dev Neurosci 2001, 19, 439-45, respectively). In the present invention it is demonstrated that the HNK-1 epitope can act as an indicator of AD.

Por tanto, en una realización más preferida del método de la invención se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteínas de la invención) que se seleccionan de la lista que comprende, pero sin limitarse, reelina, acetilcolinesterasa, cualquiera de sus subunidades o isoformas o cualquiera de sus combinaciones. Therefore, in a more preferred embodiment of the method of the invention, the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins (glycoproteins of the invention) that are selected from the list comprising, but not limited to, reelin, acetylcholinesterase are detected and quantified, any of its subunits or isoforms or any of its combinations.

En otra realización más preferida se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteínas de la invención) de un tamaño menor de 200 KDa. Preferentemente de un tamaño menor de 100 KDa y aún más preferentemente de un tamaño menor de 60 KDa. In another more preferred embodiment, the glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoproteins of the invention) of a size smaller than 200 KDa are detected and / or quantified. Preferably of a size smaller than 100 KDa and even more preferably of a size smaller than 60 KDa.

En la presente invención se optimizaron las zonas o áreas inmunoreactivas para HNK-1 agrupando bandas cercanas por su peso molecular e inmunoreactividad, usando distintos tiempos de exposición y contrastes. De este modo, se definieron hasta 6 áreas. La inmunoreactividad de estas áreas se cuantificó y sometió a análisis estadístico mediante el test Mann-Whithey, definiendo las áreas con un tamaño menor de 100 KDa, preferentemente con un tamaño menor de 70 KDa, más preferentemente las áreas con un tamaño de entre 40 y 60 KDa y aún más preferentemente las áreas con un tamaño de entre 40 y 55 KDa como áreas con significancia estadística (ejemplo 2.2). In the present invention, the immunoreactive zones or areas for HNK-1 were optimized by grouping bands close by their molecular weight and immunoreactivity, using different exposure times and contrasts. In this way, up to 6 areas were defined. The immunoreactivity of these areas was quantified and subjected to statistical analysis using the Mann-Whithey test, defining areas with a size smaller than 100 KDa, preferably with a size smaller than 70 KDa, more preferably areas with a size between 40 and 60 KDa and even more preferably areas with a size between 40 and 55 KDa as areas with statistical significance (example 2.2).

Otra realización preferida del primer método de la invención se refiere a un método donde, según el apartado (b), se comparan los datos obtenidos en la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) con los valores de referencia que consisten en datos de detección y/o cuantificación de la proteína total. En una realización más preferida, se lleva a cabo el marcaje simultáneo y distinguible de la proteína total y de la glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención). Another preferred embodiment of the first method of the invention relates to a method where, according to section (b), the data obtained in the detection and / or quantification of a glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) are compared. with the reference values consisting of detection data and / or quantification of the total protein. In a more preferred embodiment, the simultaneous and distinguishable labeling of the total protein and the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) is carried out.

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

Así por ejemplo, para la acetilcolinesterasa (AChE, Figura 5) se compara la cantidad total de proteína y la glicoforma HNK-1 mediante ELISA utilizando como anticuerpo de captura un anticuerpo contra la parte aminoacídica (para la proteína total) y como anticuerpo reportador un anticuerpo anti-HNK-1 (para la glicoforma HNK-1). Thus, for example, for acetylcholinesterase (AChE, Figure 5), the total amount of protein and HNK-1 glycoform is compared by ELISA using an antibody against the amino acid part (for the total protein) as capture antibody and as reporter antibody a anti-HNK-1 antibody (for HNK-1 glycoform).

El uso de ELISA con doble anticuerpo (contra la proteína total X y contra la glicoforma HNK-1 de esa proteína X), permite optimizar la sensibilidad del método, para proteínas que, al igual que la acetilcolinesterasa, en situaciones patológicas de EA disminuye la cantidad total de proteína y disminuye la glicoforma HNK-1. The use of ELISA with double antibody (against the total protein X and against the glycoform HNK-1 of that protein X), allows to optimize the sensitivity of the method, for proteins that, like acetylcholinesterase, in pathological situations of AD decreases the Total amount of protein and decreases glycoform HNK-1.

En una realización aún más preferida dicha comparación se lleva a cabo mediante el cociente entre la concentración de proteína total y la concentración de la glicoforma portadora del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención). In an even more preferred embodiment, said comparison is carried out by means of the ratio between the total protein concentration and the concentration of the glycopene carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention).

Por ejemplo, en la presente invención se ha comprobado que en la reelina (Figura 5), se ve una manifiesta diferencia entre la muestra control y la muestra patológica donde se observa un aumento de la proteína total y una disminución de su glicoforma HNK-1 (glicoproteína de la invención), de forma que el uso de cocientes: “nivel total de proteína X”/ “nivel total de glicoforma HNK-1 de esa proteína X (glicoproteína de la invención)” para al menos una de las glicoproteínas de la invención, permite una mayor discriminación de las muestras patológicas. For example, in the present invention it has been shown that in reelin (Figure 5), there is a manifest difference between the control sample and the pathological sample where an increase in the total protein and a decrease in its glycoform HNK-1 is observed (glycoprotein of the invention), so that the use of quotients: "total level of protein X" / "total level of HNK-1 glycoform of that protein X (glycoprotein of the invention)" for at least one of the glycoproteins of The invention allows greater discrimination of pathological samples.

El uso de este tipo de cocientes entre isoformas o variantes de proteínas se ha demostrado eficaz para discriminar más eficazmente potenciales biomarcadores diagnósticos. En concreto para Alzheimer y otro tipo de demencias, se han reportado cocientes de péptidos A (especies de diferente longitud) (Kanai M et al. Ann Neurol. 1998, 44, 17-26; Schupf N et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105, 14052-14057), cocientes de isoformas de la proteína tau (isoformas con diferente grado de fosforilación) (Buerger K et al. Neurobiol Aging 2006, 27, 10-15.; Borroni B et al. Neurology 2008, 71, 1796-1803), y también para otras proteínas que sufren modificación post-traduccional, incluyendo glicosilación (Sáez-Valero et al. Lancet 1997, 350, 929; Biroccio A et al. Proteomics 2006, 6, 2305-2313; Botella-López A et al.. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 5573-5578). The use of this type of quotients between isoforms or protein variants has been proven effective in discriminating more efficiently diagnostic potential biomarkers. Specifically for Alzheimer's and other types of dementias, ratios of peptides A (species of different length) have been reported (Kanai M et al. Ann Neurol. 1998, 44, 17-26; Schupf N et al. Proc Natl Acad Sci USA 2008, 105, 14052-14057), ratios of isoforms of the tau protein (isoforms with different degrees of phosphorylation) (Buerger K et al. Neurobiol Aging 2006, 27, 10-15; Borroni B et al. Neurology 2008, 71 , 1796-1803), and also for other proteins that undergo post-translational modification, including glycosylation (Sáez-Valero et al. Lancet 1997, 350, 929; Biroccio A et al. Proteomics 2006, 6, 2305-2313; Bottle- López A et al. Proc Natl Acad Sci USA 2006, 103, 5573-5578).

Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un método, en adelante segundo método de la invención, para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un individuo, que comprende: A second aspect of the present invention relates to a method, hereinafter second method of the invention, for determining the progression of Alzheimer's disease in an individual, comprising:

a. to.: obtener datos de una primera comparación de la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) con valores de referencia, en una muestra biológica aislada de un individuo, obtain data from a first comparison of the detection and / or quantification of a glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) with reference values, in an isolated biological sample of an individual,

b. b.: obtener datos de una segunda comparación según se describe en el apartado (a) en una muestra biológica aislada del individuo después de determinar la primera comparación, y obtain data from a second comparison as described in section (a) in an isolated biological sample of the individual after determining the first comparison, and

c. C.: comparar los datos obtenidos según el apartado (b) con los datos obtenidos según el apartado compare the data obtained according to section (b) with the data obtained according to section

(a) para buscar alguna desviación significativa. (a) to look for any significant deviation.

Preferentemente la muestra biológica aislada del individuo es plasma o una muestra cerebral. Más preferentemente la muestra cerebral es un fluido biológico, y aún más preferentemente líquido cefalorraquídeo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. Preferably the isolated biological sample of the individual is plasma or a brain sample. More preferably the brain sample is a biological fluid, and even more preferably cerebrospinal fluid, obtained by any method known to a person skilled in the art.

En una realización preferida del segundo método de la invención, la detección y/o cuantificación se realiza por inmunoensayo, preferentemente ensayo ELISA. Y en otra realización preferida, la detección y/o cuantificación se realiza por electroforesis, preferentemente electroforesis de dos dimensiones. In a preferred embodiment of the second method of the invention, the detection and / or quantification is performed by immunoassay, preferably ELISA. And in another preferred embodiment, the detection and / or quantification is performed by electrophoresis, preferably two-dimensional electrophoresis.

En otra realización preferida del segundo método de la invención se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) que se seleccionan de la lista que comprende, pero sin limitarse: reelina, acetilcolinesterasa, cualquiera de sus subunidades o isoformas o cualquiera de sus combinaciones. In another preferred embodiment of the second method of the invention, the glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) which are selected from the list comprising, but not limited to: reelin, acetylcholinesterase, any of its methods are detected and quantified subunits or isoforms or any of their combinations.

Y en otra realización preferida se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteínas de la invención) de un tamaño menor de 200 KDa. Preferentemente de un tamaño menor de 100 KDa y aún más preferentemente de un tamaño menor de 60 KDa. And in another preferred embodiment, the glycoproteins carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoproteins of the invention) of a size smaller than 200 KDa are detected and / or quantified. Preferably of a size smaller than 100 KDa and even more preferably of a size smaller than 60 KDa.

En una realización más preferida del segundo método de la invención, los datos de los valores de referencia con los que se compara la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) según los apartados (a) y (b), consisten en datos de detección y/o cuantificación de dicha proteína total. In a more preferred embodiment of the second method of the invention, the reference value data with which the detection and / or quantification of a glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) is compared according to sections (a ) and (b), consist of detection and / or quantification data of said total protein.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) como biomarcador para determinar la presencia o ausencia de la Another aspect of the invention relates to the use of a glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) as a biomarker to determine the presence or absence of the

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo. Alzheimer's disease in an isolated biological sample of an individual.

El término "biomarcador" o, de forma alternativa, "marcador molecular", tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a una molécula o al producto de expresión de un gen o fragmentos y variantes del mismo que muestran cambios sustanciales en una enfermedad determinada y que se pueden usar tanto para determinar el riesgo de desarrollar la enfermedad como para determinar dicha enfermedad detectando la aparición de dichos cambios en el biomarcador. The term "biomarker" or, alternatively, "molecular marker", as used herein, refers to a molecule or the expression product of a gene or fragments and variants thereof that show substantial changes in a determined disease and that can be used both to determine the risk of developing the disease and to determine said disease by detecting the appearance of said changes in the biomarker.

Adicionalmente, el biomarcador también puede ser usado para seguir la eficacia de un tratamiento para esa enfermedad detectando cambios en el biomarcador en oposición a aquellos que se dan en la enfermedad o situación clínica. Additionally, the biomarker can also be used to track the efficacy of a treatment for that disease by detecting changes in the biomarker as opposed to those that occur in the disease or clinical situation.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un kit que comprende al menos una molécula indicadora de la presencia o ausencia del glicoepítopo HNK-1 que porta una glicoproteína (glicoproteína de la invención), para determinar la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo o para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un individuo. Another aspect of the invention relates to the use of a kit comprising at least one molecule indicating the presence or absence of the HNK-1 glycoepitope carrying a glycoprotein (glycoprotein of the invention), to determine the presence or absence of the disease of Alzheimer's in an isolated biological sample of an individual or to determine the progression of Alzheimer's disease in an individual.

En una realización preferida la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) se selecciona, pero sin limitarse, de la lista que comprende: reelina, acetilcolinesterasa, cualquiera de sus subunidades o isoformas o cualquiera de sus combinaciones. In a preferred embodiment, the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) is selected, but not limited to, from the list comprising: reelin, acetylcholinesterase, any of its subunits or isoforms or any combination thereof.

En otra realización preferida la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 (glicoproteína de la invención) tiene un tamaño menor de 200 KDa. Preferentemente un tamaño menor de 100 KDa y aún más preferentemente un tamaño menor de 60 KDa. In another preferred embodiment, the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope (glycoprotein of the invention) is smaller than 200 KDa. Preferably a size smaller than 100 KDa and even more preferably a size smaller than 60 KDa.

En otra realización preferida la molécula indicadora es, al menos, un anticuerpo específico de dicho glicoepítopo. In another preferred embodiment, the indicator molecule is at least one specific antibody of said glycoepitope.

El término “anticuerpo” tal como se utiliza en la presente descripción, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) con la glicoproteína de la invención. Hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE). The term "antibody" as used herein, refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions of immunoglobulin molecules, that is, molecules that contain an antigen binding site that specifically binds (immunoreacts) with the glycoprotein of the invention. There are five major isotypes or classes of immunoglobulins: immunoglobulin M (IgM), immunoglobulin D (IgD), immunoglobulin G (IgG), immunoglobulin A (IgA) and immunoglobulin E (IgE).

En otra realización preferida la muestra biológica aislada del individuo es plasma o una muestra cerebral, donde la muestra cerebral es preferentemente un fluido biológico, y más preferentemente líquido cefalorraquídeo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia. In another preferred embodiment the isolated biological sample of the individual is plasma or a brain sample, where the brain sample is preferably a biological fluid, and more preferably cerebrospinal fluid, obtained by any method known to one skilled in the art.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following figures and examples are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS DESCRIPTION OF THE FIGURES

FIG. 1. Shows a sugar recognized by the HNK-1 receptor protein.

El azúcar epitópico (en gris y a la izquierda) es el 3-sulfo-glucurónico. Epitopic sugar (in gray and on the left) is 3-sulfo-glucuronic.

FIG. 2. Muestra valores densitométricos de extractos de cerebro humano con la enfermedad de Alzheimer y de controles no dementes. FIG. 2. Shows densitometric values of human brain extracts with Alzheimer's disease and non-insane controls.

2A. Muestra un Dot blot ilustrativo donde los pocillos con alícuotas de extractos de cerebro humano con la enfermedad de Alzheimer y de controles no dementes se han teñido mediante anticuerpos anti-HNK-1. 2A. It shows an illustrative Dot blot where wells with aliquots of human brain extracts with Alzheimer's disease and non-insane controls have been stained using anti-HNK-1 antibodies.

AD, enfermedad de Alzheimer. NCD, controles no dementes. AD, Alzheimer's disease. NCD, controls not insane.

2B. Muestra la representación en nube de puntos de los valores densitométricos determinados para cada una de estas muestras. 2B. Shows the point cloud representation of the densitometric values determined for each of these samples.

Los parámetros de sensibilidad y especificidad, así como el valor estadístico (p) alcanzado con el test Mann-Whithey son: sensibilidad: 75%; especifidad: 70%; p= 0,016. The sensitivity and specificity parameters, as well as the statistical value (p) reached with the Mann-Whithey test are: sensitivity: 75%; specificity: 70%; p = 0.016.

En el eje de ordenadas se representa la inmunorreactividad frente a HNK-1 (unidades arbitrarias). AD, enfermedad de Alzheimer. NCD, controles no dementes. The ordinate represents the immunoreactivity against HNK-1 (arbitrary units). AD, Alzheimer's disease. NCD, controls not insane.

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

FIG. 3. Muestra un Western blot de bandas inmunoreactivas para HNK-1. FIG. 3. Shows a Western blot of immunoreactive bands for HNK-1.

3A. Western blot representativo de bandas inmunoreactivas para HNK-1 tras separación electroforética por SDS-PAGE de extractos de cerebro humano con la enfermedad de Alzheimer y de controles no dementes. 3A. Western blot representative of immunoreactive bands for HNK-1 after electrophoretic separation by SDS-PAGE of human brain extracts with Alzheimer's disease and non-insane controls.

1, área 1; 2, área 2; 3, área 3; 4, área 4; 5, área 5; 6, área 6. AD, enfermedad de Alzheimer. NCD, controles no dementes. 1, area 1; 2, area 2; 3, area 3; 4, area 4; 5, area 5; 6, area 6. AD, Alzheimer's disease. NCD, controls not insane.

3B. El mismo blot que en 3A pero a exposiciones más largas. 3B. The same blot as in 3A but at longer exposures.

FIG. 4. Muestra una representación en nube de puntos de los valores de inmunorreactividad de las áreas con significancia estadística. FIG. 4. Shows a cloud representation of points of the immunoreactivity values of the areas with statistical significance.

Muestra una representación en nube de puntos de la determinación de las muestras de casos Alzheimer y control. Los valores de inmunoreactividad de las áreas determinadas, reflejados en la Tabla 1, se han dividido por un factor para mostrarlas en números más pequeños y manejables. It shows a point cloud representation of the determination of the Alzheimer and control case samples. The immunoreactivity values of the determined areas, reflected in Table 1, have been divided by a factor to show them in smaller and manageable numbers.

Área 6: sensibilidad: 83%, especifidad: 83%; Área 5: sensibilidad: 100%, especifidad: 75%; Área 4: sensibilidad: 83%, especifidad: 75%; Área 3: sensibilidad: 92%, especifidad: 67%. Area 6: sensitivity: 83%, specificity: 83%; Area 5: sensitivity: 100%, specificity: 75%; Area 4: sensitivity: 83%, specificity: 75%; Area 3: sensitivity: 92%, specificity: 67%.

En el eje de ordenadas se representa la inmunorreactividad frente a HNK-1 (unidades arbitrarias). 6, área 6; 5, área 5; 4, área 4; 3, área 3. AD, enfermedad de Alzheimer. NCD, controles no dementes. The ordinate represents the immunoreactivity against HNK-1 (arbitrary units). 6, area 6; 5, area 5; 4, area 4; 3, area 3. AD, Alzheimer's disease. NCD, controls not insane.

FIG. 5. Muestra un Western blot de extractos de corteza frontal de cerebros no dementes (ND) y Alzheimer (AD) revelados con un anticuerpo anti-HNK-1, un anticuerpo anti-Reelina y un anticuerpo anti-acetilcolinesterasa. FIG. 5. It shows a Western blot of frontal cortex extracts of non-insane brains (ND) and Alzheimer's (AD) revealed with an anti-HNK-1 antibody, an anti-Reelin antibody and an anti-acetylcholinesterase antibody.

Tras resolver la membrana con un anticuerpo anti-HNK-1 (parte izquierda de la figura; en la parte de abajo se muestra la imagen con mayor contraste) se realizó stripping a la membrana y se re-incubó con un anticuerpo anti-reelina (parte superior derecha de la figura) o con un anticuerpo anti-acetilcolinesterasa (parte inferior derecha de la figura). Las diferentes bandas observadas para reelina se corresponden con la proteína total (~400 kDa) y con los fragmentos N-terminales de ~300 y 180 kDa, donde se ha identificado el epítopo HNK-1 (Botella-López A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578). Los niveles totales de Reelina son más elevados en las muestras AD. Las diferentes bandas observadas para acetilcolinesterasa (AChE) se corresponden a variantes o isoformas de la glicoproteína presentes en todo tipo de tejidos (al menos 3 bandas entre 55 y 77 kDa). Los niveles de acetilcolinesterasa son menores en las muestras AD. After resolving the membrane with an anti-HNK-1 antibody (left part of the figure; the image with greater contrast is shown below), the membrane was stripped and re-incubated with an anti-reelin antibody ( upper right part of the figure) or with an anti-acetylcholinesterase antibody (lower right part of the figure). The different bands observed for reelin correspond to the total protein (~ 400 kDa) and to the N-terminal fragments of ~ 300 and 180 kDa, where the HNK-1 epitope (Bottle-Lopez A et al., Proc) has been identified Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578). Total Reelina levels are higher in AD samples. The different bands observed for acetylcholinesterase (AChE) correspond to variants or isoforms of the glycoprotein present in all types of tissues (at least 3 bands between 55 and 77 kDa). Acetylcholinesterase levels are lower in AD samples.

AChE, acetilcolinesterasa; AD, enfermedad de Alzheimer; NCD, controles no dementes. AChE, acetylcholinesterase; AD, Alzheimer's disease; NCD, controls not insane.

EXAMPLES

A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la especificidad y sensibilidad del método de diagnóstico de la EA basado en la detección, en muestras de tejido cerebral de los pacientes, de anticuerpos frente al glicoepítopo HNK-1. The invention will now be illustrated by tests carried out by the inventors, which shows the specificity and sensitivity of the diagnosis method of AD based on the detection, in samples of patients' brain tissue, of antibodies against the HNK-glycoepitope. one.

EJEMPLO 1. Muestras de tejido cerebral de pacientes y extracción de proteínas de las muestras. EXAMPLE 1. Samples of brain tissue from patients and protein extraction from samples.

1.1 Muestras de cerebro humano. 1.1 Human brain samples.

Para los experimentos recogidos en esta memoria se obtuvieron muestras de cerebro del Banco de Tejidos del Hospital Clínico de Barcelona, pequeños fragmentos de alrededor de 0,1-0,2 g de un área especialmente afectada por la patología, el córtex prefrontal y en concreto la pars opercularis del giro inferior frontal (12 casos; 76 ±3 años (media ±SEM)). Las muestras de casos esporádicos de EA correspondieron a la categoría VI de Braak and Braak (clasificación de los estadios de la enfermedad de Alzheimer). Los casos control no patológicos no tenían historial clínico de demencia ni mostraron evidencia de patología cerebral en el examen histopatológico (12 casos; 68 ±4 años (media ±SEM)). Las muestras tanto de EA como control se mantuvieron congeladas a – 70º C hasta su uso. For the experiments collected here, brain samples were obtained from the Tissue Bank of the Clinical Hospital of Barcelona, small fragments of about 0.1-0.2 g of an area especially affected by the pathology, the prefrontal cortex and specifically pars opercularis of the inferior frontal gyrus (12 cases; 76 ± 3 years (mean ± SEM)). The samples of sporadic cases of AD corresponded to category VI of Braak and Braak (classification of stages of Alzheimer's disease). Non-pathological control cases had no clinical history of dementia nor showed evidence of brain pathology on the histopathological examination (12 cases; 68 ± 4 years (mean ± SEM)). Samples of both EA and control were kept frozen at -70 ° C until use.

1.2 Extracción de proteínas del tejido cerebral. 1.2 Protein extraction from brain tissue.

Para la solubilización del tejido, las muestras fueron descongeladas gradualmente hasta los 4ºC, temperatura a la que se mantuvieron durante todo el proceso. Se homogeneizó (10% peso/volumen) en un tampón frío conteniendo 50 mM Tris-HCl, pH 7.4/ 150 mM NaCl/ 0.5% (p/v) Triton X-100/ 0.5% Nonidet P-40 (p/v) y For tissue solubilization, the samples were gradually thawed to 4 ° C, at which temperature they were maintained throughout the process. Homogenized (10% weight / volume) in a cold buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 / 150 mM NaCl / 0.5% (w / v) Triton X-100 / 0.5% Nonidet P-40 (w / v) Y

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

suplementado con una mezcla de inhibidores de proteinasas (Botella-López A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578). Los tejidos se procesaron mediante sonicación y se incubaron unos 30 minutos, tras los cuales se centrifugó a 20.000×g durante 20 minutos. Tras la centrifugación se recogieron los sobrendantes, se alicuotaron y conservaron a –70ºC hasta su ulterior uso. Una alícuota se uso para la determinación del contenido total de proteínas, que se realizó por el método del ácido bicinconínico, según el protocolo del fabricante (Pierce). supplemented with a mixture of proteinase inhibitors (Bottle-Lopez A et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103, 5573-5578). The tissues were processed by sonication and incubated for about 30 minutes, after which it was centrifuged at 20,000 × g for 20 minutes. After centrifugation, the supernatants were collected, aliquoted and stored at -70 until further use. An aliquot was used to determine the total protein content, which was performed by the bicinconinic acid method, according to the manufacturer's protocol (Pierce).

EJEMPLO 2. Detección y cuantificación de glicoproteínas HNK-1 en las muestras. EXAMPLE 2. Detection and quantification of HNK-1 glycoproteins in the samples.

2.1 Detección de glicoproteínas HNK-1. 2.1 Detection of HNK-1 glycoproteins.

Para esclarecer si la expresión de HNK-1 aparecía alterada en la EA, se analizó mediante Dot blot extractos de cerebro humano (corteza frontal) de Alzheimer y controles no patológicos. Esta técnica es más elemental que la de Western blot, ya que tiñe las proteínas portadoras del epítopo HNK-1 sin separar y sin necesidad de desnaturalizar las mismas durante su preparación. En base a esta técnica se comprobaron diferencias significativas entre extractos de corteza EA y controles (Figura 2A). To clarify whether the expression of HNK-1 appeared altered in AD, extracts of human brain (frontal cortex) of Alzheimer's and non-pathological controls were analyzed by Dot blot. This technique is more elementary than that of Western blot, since it stains the carrier proteins of the HNK-1 epitope without separating and without denaturing them during their preparation. Based on this technique, significant differences were found between extracts of EA bark and controls (Figure 2A).

Para la determinación de glicoproteínas HNK-1, en el mercado existen gran variedad de anticuerpos monoclonales comerciales; para este estudio se utilizó el denominado CD57 de Sigma-Aldrich Co. a una dilución 1:2000. For the determination of HNK-1 glycoproteins, there are a wide variety of commercial monoclonal antibodies on the market; For this study, the so-called CD57 from Sigma-Aldrich Co. was used at a 1: 2000 dilution.

En primer lugar los extractos cerebrales se sometieron a análisis por Dot blot sin que la muestra se desnaturalizara mediante el aparato de microfiltración Bio-Dot SF de BioRad, mediante siembra en una membrana de nitrocelulosa, resolviéndose la inmunoreactividad tras incubación con el anticuerpo anti-HNK-1 tal cual se detalla a continuación para el Western blot. First, the brain extracts were subjected to Dot blot analysis without the sample being denatured by the BioRad Bio-Dot SF microfiltration apparatus, by seeding in a nitrocellulose membrane, resolving the immunoreactivity after incubation with the anti-HNK antibody -1 as detailed below for the Western blot.

En base a estos resultados se inició un estudio mediante separación electroforética de las diversas proteínas en base a su tamaño (peso molecular), SDS-PAGE y posterior análisis por Western blot con anticuerpos anti-HNKBased on these results, a study was initiated by electrophoretic separation of the various proteins based on their size (molecular weight), SDS-PAGE and subsequent Western blot analysis with anti-HNK antibodies

1. Mediante esta aproximación, se identificaron en extractos de corteza frontal más de una decena de bandas de entre 30 y 180 kDa (Figura 3). 1. By this approach, more than a dozen bands between 30 and 180 kDa were identified in frontal cortex extracts (Figure 3).

Para el análisis electroforético por SDS-PAGE y resolución por Western blot, las muestras fueron desnaturalizadas y cargadas en geles de acrilamida-bisacrilamida del 7,5%. Tras transferir las proteínas a membranas de nitrocelulosa y bloqueo en 5% de leche desnatada las membranas se incubaron con el citado anticuerpo CD57 y posteriormente con un anticuerpo secundario reportador conjugado a HRP. Como control de carga se usó un anticuerpo anti-a-tubulina (1:1000; Sigma-Aldrich Co.). Las bandas inmunoreactivas para HNK-1 se detectaron mediante el kit ECL-Plus (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) en un Analizador de Imagen Luminescente (LAS-1000 Plus (FUJIFILM)). Para el análisis semicuantitativo la intensidad de las bandas inmunoreactivas se determinó mediante un Science Lab Image Gauge v4.0 con software de FUJIFILM. For electrophoretic analysis by SDS-PAGE and resolution by Western blot, the samples were denatured and charged in 7.5% acrylamide-bisacrylamide gels. After transferring the proteins to nitrocellulose membranes and blocking in 5% skim milk, the membranes were incubated with said CD57 antibody and subsequently with a secondary reporter antibody conjugated to HRP. An anti-a-tubulin antibody (1: 1000; Sigma-Aldrich Co.) was used as load control. Immunoreactive bands for HNK-1 were detected by the ECL-Plus kit (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) on a Luminescent Image Analyzer (LAS-1000 Plus (FUJIFILM)). For the semi-quantitative analysis the intensity of the immunoreactive bands was determined using a Science Lab Image Gauge v4.0 with FUJIFILM software.

Se optimizó la cuantificación de las bandas más o menos inmunoreactivas para HNK-1 usando distintos tiempos de exposición y contrastes (para poder cuantificar las bandas más tenues). Así, se cuantificó un Western blot a exposiciones más largas (Figura 3B) porque aunque se pierde resolución en las bandas más inmunoreactivas, que resultan sobre-expuestas, se definieron más bandas inmunoreactivas para HNK-1 para más proteínas, agrupadas en principio en la zona baja del gel (menor peso molecular). Con el grado de resolución (separación) de proteínas alcanzado se definieron zonas o áreas inmunoreactivas, de este modo, se definieron hasta 6 áreas agrupando bandas cercanas por su peso molecular e inmunoreactividad HNK-1 (Figuras 3A y 3B). The quantification of the more or less immunoreactive bands for HNK-1 was optimized using different exposure times and contrasts (to quantify the fainter bands). Thus, a Western blot was quantified at longer exposures (Figure 3B) because although resolution is lost in the more immunoreactive bands, which are overexposed, more immunoreactive bands for HNK-1 were defined for more proteins, grouped in principle in the low gel zone (lower molecular weight). With the degree of resolution (separation) of proteins reached, immunoreactive areas or areas were defined, thus, up to 6 areas were defined by grouping bands close by their molecular weight and HNK-1 immunoreactivity (Figures 3A and 3B).

2.2 Análisis estadístico. 2.2 Statistical analysis.

Sobre estas áreas se estimó cuantitativamente la inmunoreactividad positiva para HNK-1 por determinación densitométrica. Las cuantificaciones de cada área se realizaron optimizando los tiempos de exposición por separado. La inmunoreactividad de estas áreas se cuantificó y sometió a análisis estadístico. El tratamiento estadístico de los datos se realizó mediante el programa SigmaStat 2.03. Dado que la distribución de los datos no se ajustaba a la normalidad, para la comparación entre el grupo control y el EA, se usó el test Mann-Whitney U (Tabla 1). On these areas, positive immunoreactivity for HNK-1 was estimated quantitatively by densitometric determination. The quantifications of each area were made by optimizing the exposure times separately. The immunoreactivity of these areas was quantified and subjected to statistical analysis. The statistical treatment of the data was carried out using the SigmaStat 2.03 program. Since the distribution of the data did not conform to normal, for the comparison between the control group and the EA, the Mann-Whitney U test was used (Table 1).

Tabla 1. Análisis estadístico de de las áreas de inmunorreactividad. Table 1. Statistical analysis of the areas of immunoreactivity.

ÁREA~205KDa AREA ~ 205KDa: 1 ÁREA~100KDa 2 ÁREA~66KDa 3 ÁREA~60KDa 4 ÁREA~55KDa 5 ÁREA 6 ~40KDa one AREA ~ 100KDa 2 AREA ~ 66KDa 3 AREA ~ 60KDa 4 AREA ~ 55KDa 5 AREA 6 ~ 40KDa

n NCD n NCD: 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12

NCD Media NCD Media: 793561 1162122 121322 128786 119269 125311 793561 1162122 121322 128786 119269 125311

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

NCD Error NCD Error: 92438 137768 14907 18934 22644 27517 92438 137768 14907 18934 22644 27517

n AD n AD: 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12

AD Media AD Media: 900715 828512 62846 61179 52887 45154 900715 828512 62846 61179 52887 45154

AD Error AD Error: 81510 94010 4787 4879 2407 3704 81510 94010 4787 4879 2407 3704

p p: 0,394 0,058 0,010 0,007 0,01 0,006 0.394 0.058 0.010 0.007 0.01 0.006

% AD/NCD % AD / NCD: 114 71 52 48 44 36 114 71 52 48 44 36

Mann W Mann w
Mann W Mann w
Mann W Mann w
Mann W Mann w

AD, enfermedad de Alzheimer. NCD, controles no dementes. p, probabilidad. Mann W, test Mann-Whithey. AD, Alzheimer's disease. NCD, controls not insane. p, probability. Mann W, Mann-Whithey test.

En la Tabla 1 se muestra que las áreas 3, 4, 5 y 6 mostraron diferencias estadísticas, mientras que el área 2 se mostró cercana a la significancia estadística, y el área 1 no mostró tendencia alguna. Table 1 shows that areas 3, 4, 5 and 6 showed statistical differences, while area 2 was close to statistical significance, and area 1 showed no trend.

En las áreas con significancia estadística (áreas 3-6 Tabla 1) se estimó la sensibilidad (probabilidad de que para un sujeto enfermo se obtenga en la prueba un resultado positivo; también por ello conocida como “fracción de verdaderos positivos”) y especificidad (probabilidad de que para un sujeto sano se obtenga un resultado negativo; o “fracción de verdaderos negativos”) para definir los grupos EA y controles en base a los marcadores utilizados. In areas with statistical significance (areas 3-6 Table 1) sensitivity was estimated (probability that a positive result will be obtained for a sick subject, also known as the "true positive fraction") and specificity ( probability that a negative result is obtained for a healthy subject, or "fraction of true negatives") to define the EA groups and controls based on the markers used.

Para balancear los puntos de corte que optimizan la discriminación entre la fracción de verdaderos positivos (sensibilidad) y la fracción verdaderos negativos (especificidad), dado el número de muestras analizadas, éstos se pudieron realizar por una estimación sencilla y arbitraria. Para el análisis de un número mayor de muestras se requiere el apoyo del “análisis ROC” o curva ROC (acrónimo de Receiver Operating Characteristic, o Característica Operativa del Receptor), que permite optimizar el umbral de discriminación (valor a partir del cual decidimos que un caso es un positivo). To balance the cut-off points that optimize the discrimination between the true positive fraction (sensitivity) and the true negative fraction (specificity), given the number of samples analyzed, these could be performed by a simple and arbitrary estimate. For the analysis of a larger number of samples, the support of the “ROC analysis” or ROC curve (acronym for Receiver Operating Characteristic, or Receiver Operating Characteristic) is required, which allows to optimize the discrimination threshold (value from which we decide that one case is a positive).

Los valores concretos de los puntos de corte están formulados en unidades arbitrarias. El análisis de las variables por métodos ELISA permite estimar el contenido en glicoproteína en términos objetivos de ng/mL o pg/mL, y subsecuentemente el de los puntos de corte en dichas unidades. The specific values of the cut-off points are formulated in arbitrary units. The analysis of the variables by ELISA methods allows estimating the glycoprotein content in objective terms of ng / mL or pg / mL, and subsequently that of the cut-off points in said units.

Debido a que el actual diagnóstico clínico muestra valores de sensibilidad entorno al 80% y de especificidad entorno al 70%, valores que se superan en la mayoría de las bandas HNK-1 agrupadas en áreas (Figura 4), la estimación de la sensibilidad y especificidad resultaron prometedoras para su aplicabilidad diagnóstica. Because the current clinical diagnosis shows sensitivity values around 80% and specificity around 70%, values that are exceeded in most of the HNK-1 bands grouped into areas (Figure 4), the sensitivity estimation and specificity proved promising for its diagnostic applicability.

Cabe señalar que esta agrupación en áreas es funcional para su análisis, pero se optimiza mediante separación por electroforesis bidimensional, donde las proteínas se separan no sólo en base a su tamaño, sino también a su carga. Ello permite resolver proteínas individuales en spots, aunque cuenta con el inconveniente de que no permite resolver proteínas de gran tamaño molecular (por encima de 100 kDa). It should be noted that this grouping into areas is functional for analysis, but is optimized by two-dimensional electrophoresis separation, where proteins are separated not only based on their size, but also on their charge. This allows to solve individual proteins in spots, although it has the disadvantage that it does not allow to solve proteins of great molecular size (above 100 kDa).

En resumen, los resultados obtenidos indican manifiesta alteración en la inmunoreactividad (cantidad relativa) de gran parte de las bandas HNK-1 detectadas en cerebro de Alzheimer, al comparar con controles no patológicos, lo que es indicativo de que la patología afecta específicamente a glicoformas portadoras del HNK-1 (glicoproteínas de la invención) en el cerebro de Alzheimer, presunción coherente en una patología que se caracteriza por pérdida sináptica en mayor medida que celular y por la directa implicación de las moléculas de adhesión en la formación y mantenimiento de la memoria. In summary, the results obtained indicate manifest alteration in the immunoreactivity (relative quantity) of a large part of the HNK-1 bands detected in Alzheimer's brain, when compared with non-pathological controls, which is indicative that the pathology specifically affects glycoforms carriers of HNK-1 (glycoproteins of the invention) in the Alzheimer's brain, consistent presumption in a pathology characterized by synaptic loss to a greater extent than cellular and by the direct involvement of adhesion molecules in the formation and maintenance of memory.

EJEMPLO 3. Comparación de los niveles totales de proteínas cerebrales y de la inmunoreactividad HNK-1 atribuible a sus glicoformas portadoras del epítopo (glicoproteínas de la invención). EXAMPLE 3. Comparison of total levels of brain proteins and HNK-1 immunoreactivity attributable to their epitope-bearing glycoforms (glycoproteins of the invention).

Para esta comparación se hace un análisis por Western blot de manera simultanea de los niveles totales de proteínas específicas portadoras del epítopo HNK-1 (con anticuerpos específicos contra un dominio aminoacídico de la proteína; detección de los niveles totales de proteína) y de los niveles de las glicoformas HNK-1 (glicoproteínas de la invención) de cada una de las mismas (con anticuerpos dirigidos contra el azúcar, anticuerpos anti-HNK-1; detección de los niveles de las glicoformas HNK-1 en cuestión, es decir, de las glicoproteínas de la invención). For this comparison, a Western blot analysis is performed simultaneously of the total levels of specific proteins carrying the HNK-1 epitope (with specific antibodies against an amino acid domain of the protein; detection of total protein levels) and levels of the HNK-1 glycoforms (glycoproteins of the invention) of each of them (with antibodies directed against sugar, anti-HNK-1 antibodies; detection of the levels of the HNK-1 glycoforms in question, that is, of the glycoproteins of the invention).

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

En la presente invención se realizaron análisis de la proteína reelina y la proteína acetilcoliesterasa por técnicas de revelado clásico, primero con un anticuerpo anti-HNK-1, y tras stripping y lavado, re-incubando con anticuerpos contra la proteína reelina o contra la proteína acetilcolinesterasa respectivamente (Figura 5). In the present invention, analyzes of the reelin protein and the acetylcholinesterase protein were performed by conventional developing techniques, first with an anti-HNK-1 antibody, and after stripping and washing, re-incubating with antibodies against the reelin protein or against the protein acetylcholinesterase respectively (Figure 5).

Para proteínas, como la reelina, que aumenta la cantidad total de proteína y disminuye la glicoforma HNK-1 se For proteins, such as reelin, which increases the total amount of protein and decreases the glycoform HNK-1 is

5 resuelve simultáneamente por electroforesis y de forma óptima con distintos anticuerpos secundarios fluorescentes (para la proteína total (IgG) y para las glicoformas HNK-1 (glicoproteína de la invención, IgM)) y se revela sobre el mismo blot ambos, resolviendo por separado, usando un escáner de fluorescencia que además permite co-localizar las bandas. 5 Solves simultaneously by electrophoresis and optimally with different fluorescent secondary antibodies (for the total protein (IgG) and for the HNK-1 glycoforms (glycoprotein of the invention, IgM)) and both are revealed on the same blot, resolving separately , using a fluorescence scanner that also allows co-locating the bands.

El uso de cocientes del tipo “nivel total de proteína X”/ “nivel total de glicoforma HNK-1 de esa proteína X The use of ratios of the type "total level of protein X" / "total level of glycoform HNK-1 of that protein X

10 (glicoproteína de la invención)”, permite una mayor discriminación de las muestras patológicas, es especial como se observa en la figura para la reelina (Figura 5), en los casos en que para muestras patológicas haya un aumento de la proteína en cuestión y disminución de su glicoforma HNK-1 (glicoproteína de la invención). 10 (glycoprotein of the invention) ”, allows greater discrimination of the pathological samples, it is special as seen in the figure for reelin (Figure 5), in cases where for pathological samples there is an increase in the protein in question and decrease in its glycoform HNK-1 (glycoprotein of the invention).

Para proteínas, como la acetilcolinesterasa, que disminuye la cantidad total de proteína y disminuye la glicoforma HNK-1 se resuelve por ELISA utilizando como anticuerpo de captura un anticuerpo contra la parte aminoacídica For proteins, such as acetylcholinesterase, which decreases the total amount of protein and decreases the HNK-1 glycoform is resolved by ELISA using as antibody to capture an antibody against the amino acid part

15 (para la proteína total) y como anticuerpo reportador un anticuerpo anti-HNK-1 (para la glicoforma HNK-1). 15 (for the total protein) and as a reporter antibody an anti-HNK-1 antibody (for the HNK-1 glycoform).

El uso de ELISA con doble anticuerpo (contra la proteína total X y contra la glicoforma HNK-1 de esa proteína X), permite optimizar la sensibilidad del método. The use of ELISA with double antibody (against the total protein X and against the glycoform HNK-1 of that protein X), allows to optimize the sensitivity of the method.

ES 2 395 063 A2 ES 2 395 063 A2

Claims

1. Method for determining Alzheimer's disease in an isolated biological sample of an individual, comprising:

2. 2.: Método según la reivindicación 1, que además comprende atribuir la desviación significativa a la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en el individuo. Method according to claim 1, further comprising attributing the significant deviation to the presence or absence of Alzheimer's disease in the individual.

3. 3.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 200 KDa. Method according to any one of claims 1 or 2, wherein the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins of a size smaller than 200 KDa are detected and / or quantified.

4. Four.: Método según la reivindicación 3, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 100 KDa. Method according to claim 3, wherein the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins of a size smaller than 100 KDa are detected and / or quantified.

5. 5.: Método según la reivindicación 4, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 60 KDa. Method according to claim 4, wherein the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins of a size less than 60 KDa are detected and / or quantified.

6. 6.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las glicoproteínas del paso (a) son detectadas y/o cuantificadas por electroforesis. Method according to any one of claims 1 to 5, wherein the glycoproteins of step (a) are detected and / or quantified by electrophoresis.

7. 7.: Método según la reivindicación 6, donde la electroforesis se lleva a cabo mediante electroforesis de dos dimensiones. Method according to claim 6, wherein the electrophoresis is carried out by two-dimensional electrophoresis.

8. 8.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde las glicoproteínas del paso (a) son detectadas y/o cuantificadas por inmunoensayo. Method according to any one of claims 1 to 5, wherein the glycoproteins of step (a) are detected and / or quantified by immunoassay.

9. 9.: Método según la reivindicación 8, donde el inmunoensayo se lleva a cabo mediante ensayo ELISA. Method according to claim 8, wherein the immunoassay is carried out by ELISA.

10. 10.: Método según la reivindicación 9, donde el ensayo ELISA se lleva a cabo mediante la fijación al soporte sólido de anticuerpos anti-HNK-1, anticuerpos contra la porción aminoacídica de la glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1, o de lectinas. Method according to claim 9, wherein the ELISA assay is carried out by binding to the solid support of anti-HNK-1 antibodies, antibodies against the amino acid portion of the HNK-1 glycoepitope carrying glycoprotein, or lectins.

11. eleven.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde se comparan los datos obtenidos en la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 con los valores de referencia que consisten en datos de detección y/o cuantificación de la proteína total. Method according to any of claims 1 to 10, wherein the data obtained in the detection and / or quantification of a glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope are compared with the reference values consisting of protein detection and / or quantification data total.

12. 12.: Método según la reivindicación 11, donde se lleva a cabo el marcaje simultáneo y distinguible de proteína total y de dicha glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1. Method according to claim 11, wherein the simultaneous and distinguishable labeling of total protein and said carrier glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope is carried out.

Method according to any of claims 11 or 12, wherein said comparison is carried out by the ratio between the total protein concentration and the concentration of the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope.

13. 13.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la muestra biológica del paso (a) es una muestra cerebral. Method according to any one of claims 1 to 13, wherein the biological sample from step (a) is a brain sample.

14. 14.: Método según la reivindicación 14, donde la muestra cerebral es un fluido biológico. Method according to claim 14, wherein the brain sample is a biological fluid.

15. fifteen.: Método según la reivindicación 15, donde el fluido biológico es líquido cefalorraquídeo. Method according to claim 15, wherein the biological fluid is cerebrospinal fluid.

16. 16.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, donde la muestra biológica del paso (a) es plasma. Method according to any one of claims 1 to 13, wherein the biological sample from step (a) is plasma.

17. 17.: Método para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un individuo, que comprende: Method for determining the progression of Alzheimer's disease in an individual, comprising:

a. to.: obtener datos de una primera comparación de la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 con valores de referencia, en una muestra biológica aislada de un individuo, obtain data from a first comparison of the detection and / or quantification of a glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope with reference values, in an isolated biological sample of an individual,

c. C.: comparar los datos obtenidos según el apartado (b) con los datos obtenidos según el apartado (a) para buscar alguna desviación significativa. compare the data obtained according to section (b) with the data obtained according to section (a) to find a significant deviation.

18. 18.: Método según la reivindicación 18, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 200 KDa. Method according to claim 18, wherein the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins of a size smaller than 200 KDa are detected and / or quantified.

19. 19.: Método según la reivindicación 19, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 100 KDa. Method according to claim 19, wherein the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins of a size smaller than 100 KDa are detected and / or quantified.

20. twenty.: Método según la reivindicación 20, donde se detectan y/o cuantifican las glicoproteínas portadoras del glicoepítopo HNK-1 de un tamaño menor de 60 KDa. Method according to claim 20, wherein the HNK-1 glycoepitope carrying glycoproteins of a size less than 60 KDa are detected and / or quantified.

21. twenty-one.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde las glicoproteínas son detectadas y/o cuantificadas por electroforesis. Method according to any of claims 18 to 21, wherein the glycoproteins are detected and / or quantified by electrophoresis.

22. 22: Método según la reivindicación 22 donde la electroforesis se lleva a cabo mediante electroforesis de dos dimensiones. Method according to claim 22 wherein the electrophoresis is carried out by two-dimensional electrophoresis.

23. 2. 3.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde las glicoproteínas son detectadas y/o cuantificadas por inmunoensayo. Method according to any of claims 18 to 21, wherein the glycoproteins are detected and / or quantified by immunoassay.

24. 24.: Método según la reivindicación 24, donde el inmunoensayo se lleva a cabo mediante ensayo ELISA. Method according to claim 24, wherein the immunoassay is carried out by ELISA.

25. 25.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, donde los datos de los valores de referencia con los que se compara la detección y/o cuantificación de una glicoproteína portadora del glicoepítopo HNK-1 consisten en datos de detección y/o cuantificación de la proteína total. Method according to any of claims 18 to 25, wherein the reference value data with which the detection and / or quantification of an HNK-1 glycoepitope carrying glycoprotein is compared consists of protein detection and / or quantification data. total.

26. 26.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, donde la muestra biológica aislada del individuo es una muestra cerebral. Method according to any of claims 18 to 26, wherein the isolated biological sample of the individual is a brain sample.

27. 27.: Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, donde la muestra biológica aislada del individuo es plasma. Method according to any of claims 18 to 26, wherein the isolated biological sample of the individual is plasma.

28. 28.: Uso del glicoepítopo HNK-1 como biomarcador para determinar la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo. Use of the HNK-1 glycoepitope as a biomarker to determine the presence or absence of Alzheimer's disease in an isolated biological sample of an individual.

29. 29.: Uso de un kit que comprende al menos una molécula indicadora de la presencia o ausencia del glicoepítopo HNK-1 que porta una glicoproteína, para determinar la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer en una muestra biológica aislada de un individuo o para determinar la progresión de la enfermedad de Alzheimer en un individuo. Use of a kit comprising at least one molecule indicating the presence or absence of the HNK-1 glycoepitope carrying a glycoprotein, to determine the presence or absence of Alzheimer's disease in an isolated biological sample of an individual or to determine the progression of Alzheimer's disease in an individual.

30. 30: Uso de un kit según la reivindicación 30, donde la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 tiene un tamaño menor de 200 KDa. Use of a kit according to claim 30, wherein the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope is smaller than 200 KDa.

31. 31.: Uso de un kit según la reivindicación 31, donde la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 tiene un tamaño menor de 100 KDa. Use of a kit according to claim 31, wherein the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope is smaller than 100 KDa.

32. 32: Uso de un kit según la reivindicación 32, donde la glicoproteína que porta el glicoepítopo HNK-1 tiene un tamaño menor de 60 KDa. Use of a kit according to claim 32, wherein the glycoprotein carrying the HNK-1 glycoepitope is smaller than 60 KDa.

33. 33.: Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, donde la molécula indicadora es, al menos, un anticuerpo específico de dicho glicoepítopo. Use of a kit according to any one of claims 30 to 33, wherein the indicator molecule is at least one specific antibody of said glycoepitope.

34. 3. 4.: Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, donde la muestra biológica aislada del individuo es una muestra cerebral. Use of a kit according to any of claims 30 to 34, wherein the isolated biological sample of the individual is a brain sample.

35. 35: Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 34, donde la muestra biológica aislada del individuo es plasma. Use of a kit according to any of claims 30 to 34, wherein the isolated biological sample of the individual is plasma.

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FIG. one

FIG. 2

TO.

B.

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FIG. 3

TO.

B.

ES 2 395 063 A2

FIG. 4

FIG. 5