ES2887832B2 - Electrodos nanoestructurados para la estimulacion electrica de celulas en cultivo, dispositivos, sistemas y procedimientos asociados - Google Patents
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Description
DESCRIPCIÓN
ELECTRODOS NANOESTRUCTURADOS PARA LA ESTIMULACIÓN ELÉCTRICA DE CÉLULAS EN CULTIVO, DISPOSITIVOS, SISTEMAS Y PROCEDIMIENTOS ASOCIADOS
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de las técnicas de estimulación eléctrica de células en cultivo. Más concretamente, la invención se refiere a una nueva tecnología de electrodos nanoestructurados para llevar a cabo dicha estimulación, así como a diversos dispositivos, sistemas y procedimientos que comprenden los citados electrodos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las técnicas de estimulación eléctrica (en inglés, "electrical stimulation”, o ES) se utilizan en la actualidad para diversos fines, entre los que se encuentra la curación de tejidos dañados, tales como los huesos, la piel, los músculos y los nervios, en aplicaciones clínicas y preclínicas in vivo. Además, es conocido que la estimulación eléctrica puede inducir respuestas regenerativas in vitro en células en cultivo como, por ejemplo, un aumento en la expresión de factores de crecimiento pro-regenerativos, así como de marcadores genéticos y de proteínas.
La estimulación eléctrica es una técnica que resulta atractiva para la investigación básica, clínica y traslacional, ya que proporciona una herramienta física controlable y escalable para mejorar las respuestas regenerativas y curativas en diversos tejidos y tipos de células que no pueden curarse de forma natural. El resultado potencial de este campo de investigación apunta al desarrollo de dispositivos de estimulación eléctrica terapéuticos e implantables, configurados para administrar una dosis optimizada de señales eléctricas, que proporcione la mejora y aceleración de la curación de los tejidos dañados. Esta posibilidad resulta de gran interés, por ejemplo, en el caso de las enfermedades traumáticas o degenerativas. Las aplicaciones futuras de esta tecnología comprenden, asimismo, el estudio de usos de la estimulación eléctrica para el mantenimiento del sistema muscular y nervioso en gravedad reducida, o para propiciar la mejora de las capacidades cognitivas, entre otros.
Sin embargo, para alcanzar el posible potencial de las terapias basadas en estimulación eléctrica se necesita aún el desarrollo de técnicas específicas, adaptadas a cada tipo de tejido. Ello se debe, principalmente, a que cada tejido tiene complejidades biológicas únicas y una biofísica característica, y lo mismo sucede con sus mecanismos moleculares subyacentes. En este ámbito, en los últimos años se han desarrollado diversos dispositivos de estimulación eléctrica, configurados para influir sobre las funciones celulares asociadas con la proliferación, diferenciación, migración y secreción de factores de crecimiento. Dichos dispositivos (ver, por ejemplo, Leppik L., Zhihua H., Mobini S., et al., “Combining electrical stimulation and tissue engineering to treat large bone defects in a rat model”, Sci. Rep. 2018, 8(1) y las referencias ahí citadas) comprenden el uso de pares de electrodos de platino, con los que se aplica un campo eléctrico a una placa de cultivo celular de múltiples pocillos. Aunque este tipo de dispositivos son de uso generalizado en la actualidad, sus prestaciones presentan aún deficiencias técnicas que no han sido resueltas, y que se pueden resumir en tres limitaciones principales que se describen a continuación.
En primer lugar, uno de los desafíos clave de los dispositivos de estimulación eléctrica es la definición precisa de los parámetros eléctricos de sus electrodos. Dichos parámetros están relacionados con la amplitud y la forma de la señal de voltaje aplicado y con la geometría de las cámaras o alojamientos de cultivo celular, así como con las propiedades eléctricas de los materiales que configuran los electrodos. Por tanto, para obtener una definición adecuada de los parámetros de estimulación eléctrica y, con ello, un control preciso del campo eléctrico experimentado por las células en cultivo, es necesario que los electrodos se puedan fabricar de forma reproducible, proporcionando propiedades eléctricas estables y óptimas. De ese modo, los parámetros reales (valor local del campo eléctrico, voltaje, corriente) de la estimulación eléctrica real aplicada a nivel celular pueden predecirse con fiabilidad para cada experimento. Asimismo, los electrodos deben ser esterilizables y duraderos, ya que sus propiedades superficiales y eléctricas afectan, por lo general, a su impedancia y, en consecuencia, esto puede afectar considerablemente a la señal eléctrica que se suministra a las células. Por ejemplo, los electrodos monolíticos más habituales, normalmente realizados con materiales metálicos o de carbono, poseen superficies con estructura variable y no reproducible y que, junto con sus propiedades eléctricas, se alteran con el tiempo. Por lo tanto, reemplazar estos electrodos por otros nuevos, o cambiar de un tipo a otro, altera de forma no controlable el resultado de los experimentos realizados. Los electrodos de carbono presentan, además, una alta absorción de proteínas, lo que influye considerablemente en sus prestaciones, incluso
después de un único experimento, haciendo que sea casi imposible reproducir las mismas condiciones y resultados cada vez.
En segundo lugar, otra de las limitaciones de los dispositivos de estimulación eléctrica se deriva de los sistemas de cultivo celular en los que se integran, y que comprenden habitualmente placas de cultivo celular de tamaño estándar con múltiples pocillos. Aunque este diseño tiene sus propias ventajas y satisface razonablemente las condiciones de algunos experimentos que requieren más volumen, no es adecuada para aquellos experimentos que deben realizarse en volúmenes más pequeños, debido a las limitaciones en el uso de reactivos costosos y/o escasos (por ejemplo, factores de crecimiento y medios de cultivo específicos que se utilizan en experimentos de neurociencia), o en el número de células iniciales disponibles.
En tercer lugar, los dispositivos de estimulación eléctrica conocidos se basan principalmente en el uso de placas de cultivo de pocillos múltiples hechas de plástico, como por ejemplo poliestireno, que no resultan adecuadas para la observación de las células cultivadas mediante técnicas de microscopía con alta calidad, a diferencia de los cubreobjetos de vidrio tradicionales, que sí permiten la obtención de imágenes en vivo de alta calidad.
La presente invención está destinada a resolver los problemas mencionados anteriormente, mediante una novedosa tecnología de electrodos nanoestructurados, aptos para su utilización preferente en configuraciones de cultivo celular consistentes en minipocillos (cuyas dimensiones de anchura, altura o profundidad son, típicamente, del orden de una decena de mm) sobre portaobjetos de microscopía (de tamaño estándar, 75 mm de largo y 25 mm de ancho). Dichos electrodos y las mini-cámaras de cultivo celular se integran, ventajosamente, en un "electro-biorreactor miniaturizado". El conjunto de electrodos nanoestructurados metálicos, bien caracterizados gracias a su fabricación bajo condiciones precisas, es capaz de proporcionar una estimulación eléctrica con parámetros ajustables y reproducibles.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN
Con el objetivo de resolver las limitaciones y problemas anteriores, un primer objeto de la invención se refiere a un electrodo adaptado para su inserción en una placa miniaturizada de cultivo celular (tamaño correspondiente a un portaobjetos de microscopio) y, más concretamente, para su inserción en uno o más mini-pocillos de cultivo celular de dicha
placa. Para ello, el electrodo de la invención se fabrica, preferentemente, a partir de un material que se dispone como sustrato, sobre el cual se deposita un material eléctricamente conductor, formando una nanoestructura compleja que actúa como superficie eficaz de intercambio eléctrico de dicho electrodo.
Ventajosamente en la invención, el material eléctricamente conductor del electrodo está formado por nanopilares (también denominados nanocolumnas) metálicos, que se depositan sobre el sustrato a través de una técnica de deposición con ángulo de incidencia (en inglés, “Glancing Angle Deposition” o GLAD). Dicha técnica de deposición consiste en la inclinación relativa del sustrato respecto a una fuente de evaporación de partículas o átomos metálicos, lo que genera una superficie nanoestructurada sobre dicho sustrato en forma de columnas o pilares a lo largo del proceso de deposición. La citada inclinación del sustrato con respecto a la fuente se denomina ángulo GLAD (también se conoce como ángulo a en la literatura). Éste ha de ser igual o superior a, sustancialmente, 70° para que se formen columnas por efecto de sombra.
Es conocido que las técnicas de GLAD pueden llevarse a cabo con diferentes procedimientos de deposición física de vapor conocidas, tales como por ejemplo evaporación térmica, bombardeo con haz de electrones o pulverización catódica por magnetrón. Sin embargo, la presente invención se refiere únicamente al uso de esta última técnica, pulverización catódica por magnetrón (“magnetron sputtering’’ en inglés) para la fabricación de los electrodos, dada su mayor eficiencia en costes de producción, así como su menor impacto medioambiental comparada con otras técnicas de deposición física en fase vapor.
Por su parte, el ángulo que forman las columnas/pilares con respecto a la normal al sustrato (que en la literatura se suele denominar como P), siempre será inferior al ángulo GLAD o a, relacionándose ambos tradicionalmente mediante la “regla de la tangente”: tan(P)=0.5*tan(a). No obstante, hoy día se sabe que dicha regla sobreestima el valor de P, y que su predicción es compleja, pues depende de múltiples factores, tales como los materiales utilizados, el grado de régimen balístico en el que se trabaje, si se está en condiciones de plasma fuerte o débil, etc. Dichos factores se regulan, generalmente, mediante la presión del gas y con la potencia de trabajo, además de con validación experimental y/o modelización. Además, en los casos en los que el sustrato está rotando en torno a un eje perpendicular a su superficie, las estructuras producidas no estarán inclinadas, sino que crecerán siempre verticales, es decir, perpendiculares al sustrato (P
=0° para cualquier a). Obviamente, la rotación del sustrato es económicamente más costosa, pues requiere un motor adicional en el equipo.
En el ámbito de la invención, las condiciones preferentes de trabajo comprenden, por tanto, el uso de los siguientes parámetros: ángulo de inclinación del sustrato a >70° y presión de gas durante la deposición P < 5 Pa, lo que permite obtener una inclinación p de las nanocolumnas desde 0° hasta 70° medida con respecto a la normal al sustrato.
De este modo, mediante GLAD es posible proporcionar tanto nanopilares rectos sobre el sustrato como estructuras más complejas, en caso de que el sustrato se mueva durante la deposición de las partículas metálicas, lo que puede dar lugar a estructuras en zig-zag, en V, etc. Las técnicas de GLAD son conocidas, con carácter general, en el estado del arte de las técnicas de deposición de materiales. No obstante, la invención aquí descrita reivindica el uso de dichas técnicas para la fabricación de electrodos de estimulación eléctrica de células en cultivo, así como los electrodos obtenidos mediante dicha fabricación y sus procesos de fabricación.
La obtención de electrodos de estimulación eléctrica celular, mediante GLAD con pulverización catódica por magnetrón, es idónea para la fabricación de dichos electrodos a gran escala, de forma escalable industrialmente y respetuosa con el medio ambiente. Además, como se verá más adelante en el presente documento, los electrodos obtenidos mediante esta técnica poseen propiedades eléctricas muy estables, tanto en los campos eléctricos generados como en la reproducibilidad de sus propiedades cuando estos se fabrican en serie.
Gracias a las nanoestructuras propuestas, los electrodos de la invención proporcionan una superficie efectiva considerablemente mayor que los electrodos utilizados hasta la fecha, lo que reduce la impedancia del sistema de estimulación eléctrica y aumenta la parte capacitiva de dicha impedancia. Esto da lugar a dos características ventajosas de gran importancia para la estimulación eléctrica tanto in vivo como in vitro: por un lado, la amplitud de la señal de voltaje necesaria para obtener el voltaje o valor de campo eléctrico deseado en el interior de la mini-cámara de cultivo es inferior, y por otro, la carga eléctrica inyectada en el sistema es mayor sin necesidad de subir el voltaje por encima del valor descomposición de las moléculas de agua, que son moléculas esenciales de los sistemas biológicos.
En una realización preferente de la invención, las partículas metálicas que conforman los nanopilares de los electrodos comprenden metales biocompatibles, tales como el titanio, el oro o el platino, aisladamente o en combinación. Por su parte, el sustrato de los electrodos comprende preferentemente silicio, cuarzo, vidrio o vidrio/cuarzo recubierto de una película delgada de un óxido conductor transparente (TCO), tal como óxido de estaño dopado con flúor (FTO) u óxido de indio y estaño (ITO).
Con relación a las características de los nanopilares, éstos se encuentran preferentemente dispuestos sobre el sustrato con un ángulo de inclinación relativo (P) de, como máximo, 70°. Dicho ángulo de inclinación P de las nanocolumnas con respecto a la normal al sustrato, comprendido entre 0° y 70°, se considera ventajoso respecto a otras inclinaciones, ya que favorece las propiedades eléctricas de los electrodos.
Por otra parte, con relación a las propiedades de forma y tamaño de los nanopilares, las longitudes de los mismos dependen principalmente de los tiempos de deposición de los átomos o las partículas metálicas. Los rangos típicos de longitudes alcanzables mediante GLAD se encuentran comprendidos entre 10 y 4000 nm. Preferentemente, la longitud considerada como más apta para las aplicaciones de electrodos de estimulación eléctrica aquí descritos está comprendida entre 10 y 300 nm. Asimismo, los diámetros y la separación de los nanopilares dependen de diversos factores, tales como las propiedades del sustrato (por ejemplo, su rugosidad), la masa de los átomos depositados, la energía de deposición (típicamente de decenas de eV) o la difusión atómica. Dichos factores pueden ser controlados dentro de ciertos límites durante el proceso de formación de los nanopilares, haciendo que los citados diámetros y su separación, para las aplicaciones de la invención, estén comprendidos entre 20 y 120 nm para el oro, entre 30 y 160 nm para el Ti, y entre 10 y 100 nm para el Pt. Preferentemente, el rango considerado como más adecuado con carácter general para los nanopilares de la invención se encuentra comprendido entre 30 y 100 nm.
Un segundo objeto de la presente invención se refiere a un dispositivo para la estimulación eléctrica de células en cultivo, que comprende una disposición de los electrodos según cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, donde dichos electrodos están adaptados para su inserción en placas o pocillos de cultivo celular (bien de tamaño estándar o bien miniaturizadas cuyo tamaño corresponde a un portaobjetos de microscopio).
En una realización preferente del dispositivo de la invención, los electrodos están dispuestos en pares, y adaptados para la inserción de cada uno de dichos pares en un mini-pocillo (cuyo tamaño sería de unos 10 mm x 10 mm) de una placa miniaturizada de cultivo celular cuyo tamaño lateral corresponde a un portaobjetos de microscopio (75 mm x 25 mm). En esta configuración, el campo eléctrico y la densidad de corriente en el interior del mini-pocillo de cultivo celular presentan una gran estabilidad espacial, lo que permite que dichos parámetros puedan ser calculados fácilmente a nivel local (relevante para conocer los parámetros reales experimentados por las células) mediante modelado computacional y comprobación experimental.
En otra realización preferente del dispositivo de la invención, los electrodos están unidos a una placa de circuito impreso (PCB) que comprende una conexión a un generador de funciones y/o a una fuente de alimentación de corriente eléctrica.
En otra realización preferente del dispositivo de la invención, los electrodos se adhieren a la PCB por medio de un adhesivo epoxi conductor.
En otra realización preferente del dispositivo de la invención, éste comprende además una tapa transparente superior, que sostiene la PCB y los electrodos.
En otra realización preferente del dispositivo de la invención, la PCB comprende conexiones independientes entre, al menos, dos electrodos y el generador de funciones/fuente de suministro de corriente.
En otra realización preferente del dispositivo de la invención, la PCB comprende un conjunto de orificios alineados con los mini-pocillos de la placa de cultivo celular.
Un tercer objeto de la presente invención se refiere a un sistema para la estimulación eléctrica de células in vitro, que comprende un dispositivo según cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, en combinación con una disposición de una o más placas miniaturizadas (en general del tamaño correspondiente a un portaobjetos de microscopía óptica o compatible) de cultivo celular.
En una realización preferente del sistema de la invención, los mini-pocillos de cultivo celular están integrados en una pieza monolítica, y divididos por paredes o tabiques formados en dicha pieza.
En otra realización preferente del sistema de la invención, las micro-placas de cultivo celular poseen forma de prisma o de cubo y los electrodos están dispuestos en pares, donde cada uno de los electrodos que componen dichos pares está dispuesto en lados opuestos de una placa o de un mini-pocillo de cultivo celular correspondiente.
En otra realización preferente del sistema de la invención, las placas miniaturizadas y/o los mini-pocillos de cultivo celular comprenden una superficie inferior transparente, adecuada para su uso con un microscopio para la monitorización de un cultivo alojado en cualquiera de las placas/pocillos de cultivo celular. Más preferentemente, dicha superficie inferior transparente es desmontable respecto a la disposición de las placas/pocillos de cultivo celular. Dicha superficie inferior puede consistir en un portaobjeto estándar de microscopía óptica o bien, para acceder a la máxima calidad de imagen que ofrecen los objetivos de inmersión, esa superficie de vidrio debe poseer un grosor de, típicamente, 0.17 mm (cubreobjetos n° 1.5).
Gracias a estas características, el sistema de estimulación eléctrica descrito proporciona una herramienta adecuada para obtener imágenes de alta calidad de las células cultivadas, bien postprocesadas o bien en tiempo real, mientras dichas células se someten a estimulación eléctrica.
Como se ha mencionado, la necesidad de este tipo de dispositivos y sistemas en el mercado es actualmente muy alta. En este contexto, la presente invención propone una tecnología que no sólo mejora el control de los parámetros de estimulación eléctrica aplicados sino que además resulta muy fácil de usar (en un planteamiento listo para usarse, o "plug-and-play"), lo que permite al usuario aplicar simultáneamente condiciones eléctricas bien caracterizadas y totalmente reproducibles, en múltiples mini-pocillos de cultivo celular. Puesto que el sistema de la invención está adaptado para su uso en combinación con las ya mencionadas placas miniaturizadas de cultivo celular (tamaño lateral correspondiente a un portaobjetos de microscopio, 75 mm x 25 mm), ahorra un importante espacio, ya que puede apilarse en una incubadora. Además, reduce el consumo de materiales biológicos, debido a su diseño miniaturizado (lo que se consigue gracias a las reducidas dimensiones de sus electrodos y los mini-pocillos), pero es a la vez lo suficientemente grande como para mantener los cultivos en condiciones óptimas durante varios días.
Un cuarto objeto de la invención se refiere al uso de GLAD con pulverización catódica por magnetrón para la fabricación de electrodos de estimulación celular según cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento.
Un quinto objeto de la invención se refiere a un método de fabricación de electrodos de estimulación celular, que comprende disponer un primer material como sustrato y depositar un segundo material eléctricamente conductor sobre dicho sustrato, mediante GLAD con pulverización catódica por magnetrón, formando una disposición de nanopilares sobre el mismo.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 muestra el sistema de estimulación eléctrica celular de la invención, según una realización preferente de dicho sistema.
La Figura 2 muestra imágenes tomadas por microscopía electrónica que ilustran la nanoestructura de los electrodos de la invención, según una realización preferente de los mismos.
La Figura 3 muestra una comparación de condiciones operativas para tres tipos de electrodos metálicos de titanio, donde uno de ellos está formado por la estructura de nanopilares reivindicada (Figura 3a, imagen izquierda) y las otras corresponden a láminas de titanio de diferentes grosores (sin nanoestructura), donde una de dichas láminas presenta una baja rugosidad (Figura 3a, imagen central) y la otra presenta una alta rugosidad (Figura 3a, imagen derecha). En la Figura 3b se representa la impedancia de los tres tipos de electrodos, en función de la frecuencia de la señal eléctrica aplicada a los mismos. En la Figura 3c se representa la capacidad de inyección de carga de los tres tipos de electrodos utilizados.
La Figura 4 muestra un modelo computacional de la distribución de la densidad de corriente dentro del área de cultivo celular, para una configuración de un par de electrodos según la invención, aplicados a un pocillo de cultivo celular con forma cúbica.
La Figura 5 muestra los resultados de un modelo numérico del comportamiento transitorio de un sistema de electrodos de nanopilares de Ti según la invención, aplicados a un electrolito (Figura 5a). Dichos resultados se comparan con resultados análogos obtenidos para electrodos formados por películas delgadas de Ti (Figura 5b).
La Figura 6 muestra los resultados de un modelo numérico del comportamiento transitorio de un sistema de electrodos de nanopilares de Au según la invención, aplicados a un
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electrolito (Figura 6a). Dichos resultados se comparan con resultados análogos obtenidos para electrodos formados por películas delgadas de Au (Figura 6b).
Referencias numéricas de los dibujos:
(1) Electrodos.
(2) Placa de cultivo celular.
(3) Pocillos de cultivo celular.
(4) Sustrato.
(5) Nanopilares o nanocolumnas.
(6) Tapa superior.
(7) PCB.
(8) Conexión eléctrica.
(9) Agujeros.
(10) Paredes divisorias.
(11) Placa inferior de vidrio.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Según lo descrito en los apartados precedentes, así como en los ejemplos mostrados en las Figuras 1-6 del presente documento, un primer objeto de la invención se refiere a un electrodo (1) adaptado para su inserción en una placa miniaturizada (2) de cultivo celular y, más concretamente, para su inserción en uno o más mini-pocillos (3) de cultivo celular de dicha placa (2) (ver Figura 1). Para ello, el electrodo (1) de la invención se fabrica, preferentemente, a partir de un material que se dispone como sustrato (4), sobre el cual que se deposita un material eléctricamente conductor, formado preferentemente por nanopilares (5) metálicos (Figura 2), y adoptando una nanoestructura que actúa como superficie eficaz de intercambio eléctrico de dicho electrodo (1). Ventajosamente, los nanopilares (5) metálicos del electrodo (1) se depositan sobre el sustrato (4) a través de GLAD con pulverización catódica por magnetrón, lo que favorece la reproducibilidad de las propiedades de los electrodos para su fabricación a gran escala.
La obtención de electrodos de estimulación eléctrica celular mediante GLAD es una característica única que proporciona una impedancia más baja pero con una componente capacitiva más alta respecto a otros electrodos, lo que resulta una gran ventaja tanto para los sistemas de estimulación eléctrica tanto in vitro como in vivo. Ventajosamente, esta característica permite que la amplitud de la señal de voltaje necesaria para obtener el
voltaje o valor de campo eléctrico deseado en el interior de la mini-cámara de cultivo sea inferior así como entregar una carga más alta al sistema sin descomponer las moléculas de agua, que son moléculas esenciales de los sistemas biológicos.
En una realización preferente de la invención, las partículas metálicas que conforman los nanopilares (5) de los electrodos (1) comprenden metales biocompatibles, tales como el titanio, el oro o el platino, aisladamente o en combinación. Por su parte, el sustrato (4) de los electrodos (1) comprende preferentemente silicio, cuarzo, vidrio, vidrio o cuarzo recubierto de una película delgada de un óxido conductor transparente (TCO), tal como óxido de estaño dopado con flúor (FTO) u óxido de indio y estaño (ITO).
En la Figura 1 del presente documento se representa una vista despiezada del sistema de estimulación eléctrica de cultivos celulares de la invención. En dicha figura se representan, además de los electrodos (1), la placa (2) y los pocillos (3), otros de sus elementos principales. Entre dichos elementos se encuentra, por ejemplo, una tapa (6) superior, preferentemente de poliéster transparente, que permite que la luz pase para obtener imágenes en tiempo real cuando se está realizando la estimulación. Dicha tapa (6) superior está preferentemente adaptada para alojar también una PCB (7) a la que se conectan eléctricamente los electrodos (1). De este modo, el conjunto formado por la tapa (6), la PCB (7) y los electrodos (1) conforma un dispositivo de estimulación eléctrica intercambiable con una tapa plana convencional, cuando no se requiere la estimulación de los cultivos, y evitando a la vez que los mismos se contaminen.
Preferentemente, la PCB (7) comprende una conexión (8) del dispositivo de estimulación a un generador de funciones o a una fuente de corriente. Asimismo, el circuito de la PCB (7) está preferentemente configurado para conectar los electrodos (1) a dicho generador/fuente de forma independiente. De ese modo, los pocillos (3) de la placa (2) pueden ser estimulados con las mismas o diferentes señales, según se requiera. Asimismo, la PCB (7) está configurada para sostener eficazmente los electrodos (1), por ejemplo a través de medios adhesivos tales como resinas epoxi conductoras. En otras realizaciones, es posible también perforar orificios (9) en regiones adecuadas de la PCB (7) para permitir el paso de luz durante la toma de imágenes de los cultivos celulares alojados en los pocillos (3) y que, según lo descrito, se encuentran preferentemente separados por paredes (10) divisorias. Adicionalmente, la parte inferior (11), correspondiente al suelo de la placa (2) de cultivo celular, que es donde las células se cultivan, será de material transparente (por ejemplo vidrio) de calidad óptica adecuada para permitir la realización de imagen óptica. Además, dicha placa inferior (11) del sistema de la invención puede estar adherida de forma
permanente a los pocilios (3) de cultivo o puede ser extraíble. La parte inferior (11), cuando es extraíble, podría consistir en un portaobjetos estándar de microscopía óptica o en un cubreobjetos (vidrio de espesor 0.17 mm) si se requiere microscopía de alta calidad. No obstante, en diferentes realizaciones de la invención, la parte inferior (11) de la placa (2) puede poseer una superficie mayor que la que ocupa el conjunto de pocillos de la parte (2). En todo caso, una prolongación de la base de la parte (2) para obtener la completa correspondencia entre las superficies de la parte inferior (11) y del resto de la placa (2) resultará en una configuración por lo general más robusta, reduciendo en consecuencia el riesgo de rotura del portaobjetos/cubreobjetos.
Los electrodos (1) de la invención se pueden caracterizar en términos de sus propiedades eléctricas en condiciones operativas (es decir, en situación de funcionamiento cuando se encuentran aplicadas a los cultivos alojados en los pocillos (3) del sistema). Así, por ejemplo, la Figura 3 del presente documento muestra una comparación de dichas propiedades para tres tipos de electrodos metálicos de titanio, donde uno de ellos está formado por la estructura de nanopilares (5) reivindicada (Figura 3a, imagen izquierda), y las otras corresponden a láminas de titanio de diferentes grosores (sin nanoestructura), donde una de dichas láminas presenta una baja rugosidad (Figura 3a, imagen central) y la otra presenta una alta rugosidad (Figura 3a, imagen derecha). Como se aprecia en la Figura 3b, los electrodos (1) de la invención muestran una disminución significativa en la impedancia del sistema, especialmente para frecuencias bajas de la señal eléctrica. Asimismo, los electrodos (1) presentan también un aumento significativo en la capacidad de inyección de carga (Figura 3c), como consecuencia del aumento de su área efectiva en comparación con los otros dos tipos de estructuras laminares.
La rugosidad superficial de los tres electrodos de Ti, medida por microscopía de fuerzas atómicas, para los nanopilares (5) posee un valor Rq = 26 nm, mientras que para la película delgada posee un valor Rq = 1.2 nm y para la lámina más gruesa posee un valor de Rq = 66 nm. La impedancia eléctrica del Ti se ha medido en líquido cefalorraquídeo artificial utilizando espectroscopía de impedancia electroquímica y la capacidad de inyección de carga se ha medido mediante voltamperometría cíclica a una velocidad de barrido de 100 mV/s, y un rango de voltaje de 2V. Los ensayos de las propiedades anteriores en otros metales, como el Au y el Pt, confirman resultados análogos a los obtenidos para Ti.
Para ilustrar las propiedades de estabilidad eléctrica de los electrodos (1) de la invención, la Figura 4 muestra una simulación computacional realizada mediante el software de modelización COMSOL Multiphysics®, aplicado a un par de electrodos con forma de placas
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cuadradas y planas, dispuestos en un pocilio (3) de cultivo con forma cúbica. Dicha figura muestra que la configuración de los electrodos (1) representada proporciona un campo eléctrico y una densidad de corriente homogéneos y estables (la simulación se ha realización para una corriente de electrodo de 0.001 A, aplicada a electrodos de Ti y con un electrolito de tampón fosfato salino, o PBS). Esta propiedad resulta significativa ya que, en general, los diseños de electrodos tradicionales basados en el uso de varillas y alambres, no son capaces de proporcionar un campo uniforme en el volumen de cultivo. Por tanto, la estabilidad de las propiedades eléctricas de los electrodos de la invención permite diseñar los protocolos de estimulación eléctrica con mucha mayor precisión que mediante los electrodos conocidos. En este sentido, al aplicar estimulación eléctrica a través de métodos controlados por voltaje, es de especial importancia poder comprender cómo la interfaz metal/electrolito filtra la señal aplicada, para predecir la cantidad y la naturaleza temporal del campo eléctrico realmente experimentado por el medio. Ello se debe a que el voltaje resultante que experimenta el medio (Vmedio) puede no ser el mismo que la forma de onda del voltaje aplicado (Vfuente), después de ser filtrado por la capacitancia de la doble capa eléctrica que se forma en la interfaz metal/electrolito (V dl ). Para el caso de los voltajes aplicados por pulsos, la naturaleza transitoria del voltaje a través del medio depende de la constante de tiempo, t, del sistema, que resulta de la combinación de sus elementos resistivos y capacitivos, y depende de la geometría de los electrodos (1) y de los pocillos (3). En la Figura 5 se muestra la respuesta que se obtiene para electrodos (1) de nanopilares (5) de Ti (Figura 5a) y para sistemas de película delgada (Figura 5b) al aplicar un voltaje con una forma de onda cuadrada de 1 V de amplitud en trenes de pulsos de 200 ^s de duración y 3 ms de periodo. Dicha respuesta se ha calculado considerando los electrodos como circuitos equivalentes que consisten en una resistencia en serie con un elemento de fase constante que representa la capacitancia de la doble capa eléctrica en la interfaz metal/electrolito. Los valores asignados a los elementos del circuito equivalente se han obtenido de medidas experimentales de espectroscopía de impedancia electroquímica realizadas en ambos tipos de electrodos. Como consecuencia de que la capacitancia de la doble capa del sistema de nanopilares (5) de Ti es un orden de magnitud mayor que la del sistema de película delgada de Ti, los electrodos (1) basados en nanopilares (5) filtran menos la señal fuente (Vfuente) que en el sistema de película delgada, produciendo una caída de voltaje en el medio (Vmedio) que está mucho más cerca de la señal fuente. Estos resultados muestran, por tanto, que con los electrodos (1) de nanopilares (5) texturizados, resulta más fácil proporcionar campos eléctricos alternos o secuencias de pulsos con forma y amplitud bien definidas en el medio de cultivo a nivel celular, puesto que se minimizan los efectos de doble capa de la interfaz metal/electrolito.
La Figura 6 muestra resultados análogos a los representados en la Figura 5, generados para electrodos (1) de nanopilares (5) de Au (Figura 6a) y para sistemas de película delgada (Figura 6b) de Au.
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Claims (21)
1. - Dispositivo para la estimulación eléctrica de células, que comprende:
- una placa (2) de pocillos (3) de cultivo celular; y
- un electrodo (1) adaptado para la estimulación eléctrica de un cultivo celular alojado en uno o más pocillos (3) de la placa (2), donde el electrodo (1) comprende al menos un material dispuesto como sustrato (4) y un material eléctricamente conductor dispuesto sobre dicho sustrato (4);
caracterizado por que el material eléctricamente conductor está formado por nanopilares (5) metálicos, depositados sobre el sustrato (4) a través de GLAD con pulverización catódica por magnetrón.
2. 
- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde los nanopilares (5) metálicos comprenden titanio, oro y/o platino.
3. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sustrato
(4) comprende silicio, cuarzo, vidrio, vidrio o cuarzo recubierto de una película delgada de un óxido conductor transparente (TCO), tal como óxido de estaño dopado con flúor (FTO) u óxido de indio y estaño (ITO).
4. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la disposición de los nanopilares (5) sobre el sustrato (4) presenta un ángulo de inclinación comprendido entre 0°-70° respecto a la normal de dicho sustrato (4), lo que corresponde a un ángulo de inclinación de deposición a > 70° y una presión de gas durante dicha deposición P < 5 Pa.
5. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la longitud de los nanopilares (5) está comprendida entre10 y 4000 nm.
6. - Dispositivo según la reivindicación anterior, donde la longitud de los nanopilares (5) está comprendida entre 10 y 300 nm.
7. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el diámetro y/o la separación media de los nanopilares (5) están comprendidos entre 30 y 100 nm.
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8. - Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una pluralidad de electrodos (1) adaptados para su inserción en una disposición correspondiente de placas (2) de pocillos (3) de cultivo celular.
9. 
- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde los electrodos (1) están dispuestos en pares y adaptados para la inserción de cada par de electrodos (1) en una placa (2) o un pocillo (3) de cultivo celular correspondiente.
10. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, donde los electrodos (1) están fijados a una PCB (7) que comprende una conexión (8) a un generador de funciones y/o a una fuente de alimentación de corriente eléctrica.
11. 
- Dispositivo según la reivindicación anterior, donde los electrodos (1) están fijados a la PCB (7) por medio de un adhesivo epoxi conductor.
12. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10-11, que comprende además una tapa (6) transparente superior, que aloja la PCB (7) y los electrodos (1).
13. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10-12, donde la PCB (7) comprende conexiones (8) independientes entre al menos dos electrodos (1) y el generador de funciones/fuente de alimentación de corriente.
14. 
- Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 10-13, donde la PCB (7) comprende un conjunto de orificios (9) alineados con aberturas correspondientes de la placa (2) o con los pocillos (3) de cultivo celular.
15. 
Sistema para estimulación eléctrica de células, que comprende un dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 8-14, en combinación con una disposición de placas (2) o de mini-pocillos (3) de cultivo celular.
16. 
- Sistema según la reivindicación anterior, donde la placa (2) y los pocillos (3) de cultivo celular están integrados en una pieza monolítica y divididos por paredes (10) formadas en dicha pieza.
17. 
Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, donde las placas (2) y/o los pocillos (3) de cultivo celular poseen forma de prisma o cúbica, y los electrodos (1)
están dispuestos en pares, donde cada uno de los electrodos (1) del par está dispuesto en
lados opuestos correspondientes de las placas (2) o de los pocilios (3) de cultivo celular.
18. 
- Sistema según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde las placas (2) y/o los pocillos (3) de cultivo celular comprenden una superficie (11) inferior transparente, adecuada para su uso con un microscopio óptico, para la monitorización de un cultivo contenido en las placas (2) o los pocillos (3) de cultivo celular.
19. 
- Sistema según la reivindicación anterior, donde la superficie (11) inferio transparente es desmontable respecto a la placa (2) o los pocillos (3) de cultivo celular.
20. 
- Uso de GLAD con pulverización catódica por magnetrón para la fabricación de electrodos (1) de estimulación celular.
21.- Método de fabricación de electrodos (1) de estimulación celular, que comprende:
- disponer un primer material como sustrato (4) y depositar un segundo material eléctricamente conductor sobre dicho sustrato (4), mediante GLAD con pulverización
catódica por magnetrón, formando una disposición de nanopilares (5) sobre el mismo; y
- adaptar dichos electrodos (1) para su inserción en una placa (2) de pocillos (3) de
cultivo celular.
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Legal Events
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| BA2A | Patent application published |
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