ES2884352T3

ES2884352T3 - Nuevas herramientas de diagnóstico para la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth

Info

Publication number: ES2884352T3
Application number: ES16733462T
Authority: ES
Inventors: Daniel Cohen; Ilya Chumakov; Serguei Nabirochkin
Original assignee: Pharnext SA
Current assignee: Pharnext SA
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2016-06-28
Publication date: 2021-12-10
Anticipated expiration: 2036-06-28
Also published as: WO2017001360A3; WO2017001360A2; EP3317673A2; EP3317673B1

Abstract

Un método in vitro para valorar la evolución de la enfermedad de CMT (Charcot-Marie-Tooth) en un individuo que tiene CMT y está siendo sometido a tratamiento para CMT, método que comprende: i) determinar los niveles de alanina y triptófano en una muestra biológica de dicho individuo, y ii) comparar los niveles de alanina y triptófano obtenidos en i) con los niveles de alanina y triptófano, determinados previamente en el mismo individuo antes de comenzar el tratamiento, o en un estadio más temprano de dicho tratamiento, en donde el intervalo de tiempo entre las dos mediciones de los niveles de alanina y triptófano de las etapas i) y ii) es de al menos 2 meses, y en donde un incremento relativo en los niveles de alanina y triptófano es indicativo de una mejoría o estabilización de la enfermedad de CMT en dicho individuo.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas herramientas de diagnóstico para la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth

La presente invención se refiere generalmente al campo de la medicina. La presente invención se refiere en particular a métodos para detectar la predisposición a o el diagnóstico y/o pronóstico de Charcot-Marie-Tooth (CMT) y trastornos relacionados. Más específicamente, la invención se refiere al desarrollo, validación y aplicación de nuevos biomarcadores, que pueden usarse para detectar la presencia o riesgo de la enfermedad de CMT y trastornos relacionados. En particular, la presente invención se refiere a biomarcadores de metabolitos, lípidos, carbohidratos y proteináceos que pueden medirse en fluidos biológicos corporales y extractos de biopsias fácilmente disponibles, que pueden usarse para ayudar en la detección, predicción del tratamiento farmacológico y seguimiento de este tratamiento de trastornos neurodegenerativos, incluyendo la enfermedad de CMT. La presente invención también se refiere a métodos para la identificación de los subtipos de la enfermedad de CMT, valoración de la capacidad de respuesta a los tratamientos y la eficacia de los tratamientos en sujetos que tienen CMT o un trastorno relacionado.

La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth ("CMT") es una polineuropatía periférica genética huérfana. Afectando a aproximadamente 1 de 2.500 individuos, esta enfermedad es el trastorno del sistema nervioso periférico hereditario más común. Su inicio ocurre típicamente durante la primera o segunda década de vida, aunque puede detectarse en la infancia. El curso de la enfermedad es crónico con una degeneración neuromuscular gradual. La enfermedad es invalidante con casos de dolor neurológico acompañante y discapacidad muscular extrema. La CMT es una de las patologías genéticas mejor estudiadas con aproximadamente 30.000 casos en Francia. Aunque una mayoría de los pacientes con CMT portan una duplicación de un fragmento del cromosoma 17 que contiene un gen de mielina: PMP22 (forma CMT1A), más de dos docenas de genes se han implicado en diferentes formas de CMT. Por consiguiente, aunque tiene un origen monogénico, esta patología manifiesta una heterogeneidad clínica debido a posibles genes moduladores. Los genes mutados en los pacientes con CMT están agrupados alrededor de rutas moleculares conectadas firmemente que afectan a la diferenciación de las células de Schwann o neuronas o cambian la interacción de estas células en los nervios periféricos.

Actualmente, el diagnóstico de la enfermedad de CMT se basa en criterios clínicos y datos de electrofisiología que distinguen solo unos pocos subtipos de esta enfermedad. Una clasificación más precisa se basa en el análisis de mutaciones en los genes relevantes, si se conocen.

Las múltiples mutaciones que dan lugar a la enfermedad de CMT ocurren en más de 25 genes diferentes. No están identificadas para todos los casos de la enfermedad de CMT y no pueden clasificarse exhaustivamente por tipado genético (Suter y Scherer, 2003; Berger et al., 2006; Niemann et al., 2006; Nave et al., 2007). Además, se produce una heterogeneidad clínica y es importante no solo para la caracterización clínica, sino que proporciona una implicación adicional de la gestión/tratamiento específico para formas funcionalmente diferentes (Sereda et al., 2003; Passage et al., 2004; Sahenk et al., 2005; Young et al., 2008).

Por el momento, no existe un tratamiento farmacológico para esta enfermedad, pero se han descrito algunos procedimientos de gestión clínica (Grandis y Shy, 2005; Kapur et al., 2007; Weiner et al., 2008) y están en marcha ensayos clínicos con ácido ascórbico para el tratamiento de la forma CMT1A de esta enfermedad (Burns et al., 2009).

Una herramienta específica para medir el estadio de la enfermedad es la Puntuación de Neuropatía de CMT (CMTNS, Shy et al. 2005). La CMTNS se usa para medir la discapacidad del paciente en los pacientes con CMT y como una medida de resultado en los ensayos de tratamiento. Es una puntuación compuesta que agrupa los resultados de síntomas, signos, y ensayos neurofisiológicos. Los pacientes se clasifican como leves (CMTNS < 10), moderados (CMTNS 11 - 20=, o graves (CMTNS > 20) dependiendo de sus rendimientos valorados en nueve ensayos.

La Escala de Limitaciones de Neuropatía Global (ONLS), aunque no está diseñada específicamente para CMT, se usa para registrar cambios seriados en las limitaciones en un entorno clínico y como una medida de resultado en los ensayos clínicos para pacientes que padecen de neuropatías. Mide las limitaciones en las actividades diarias de las extremidades superiores e inferiores (Graham y Hughes, 2006).

La progresión de esta enfermedad medida por CMTNS u ONLS es bastante lenta y necesita ensayos clínicos largos con cientos de pacientes.

Los niveles de proteína y ARN de PMP22 se han propuesto recientemente como marcadores biológicos para el seguimiento farmacodinámico de dichos ensayos como un sustituto del punto final de CMTNS en un caso de CMT 1A (Li et al., 2005; Meyer zu Horste et al., 2007). Aún así, dicho análisis es tedioso y requiere un procedimiento invasivo. Además, la expresión de PMP22 en dichas biopsias no se correlaciona con la gravedad de la enfermedad (Katona et al., 2009).

Patrocolo et al., 2009 reporta niveles elevados de colesterol total y de triglicéridos en un paciente con Neuropatía Sensorial Motora Hereditaria Autosómica Dominante con Implicación Dominante Proximal (HMSN-P).

Yao et al., 1978 estudia la distribución de fracciones específicas de ésteres de colesterilo en pacientes que tienen neuropatías hereditarias. Este documento no proporciona información respecto a los niveles de colesterol libre o colesterol LDL.

Swartz et al., 1988 se refiere a la inmunogenicidad del colesterol y a la producción de anticuerpos fijadores de complemento IgM monoclonales frente a colesterol.

Niebroj-Dobosz et al., 1976 se refiere a patrones de diferentes fracciones lipídicas en pacientes neuropáticos (tales como lípidos totales, fosfolípidos totales, ácidos grasos libres o ésteres de colesterol). Los autores concluyen que no hay ninguna correlación entre el tipo de cambios en el patrón lipídico y el síndrome clínico.

WO2011/061304 se refiere a un método para detectar la predisposición a o el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) y muestra la cuantificación de varios biomarcadores, tales como alanina o triptófano en un modelo de rata transgénica de CMT1A y en ratas WT. Chumakov et al., 2014 se refiere al uso de una combinación de baclofeno, naltrexona y sorbitol para regular a la baja la sobreexpresión de Pmp22 en pacientes que padecen de la enfermedad de CMT1A.

La disponibilidad de marcadores biológicos fácilmente detectables permitiría un diagnóstico rápido de las formas de CMT funcionalmente relevantes y enfermedades relacionadas, el ensayo clínico de la eficacia de nuevas medicaciones y la monitorización de la respuesta individual de pacientes al tratamiento farmacológico y la gestión de la enfermedad.

Resumen de la invención

El propósito de la presente invención es proporcionar métodos novedosos para detectar la predisposición a, o el diagnóstico y/o pronóstico de, la enfermedad de CMT y trastornos relacionados, así como para valorar la capacidad de respuesta a los tratamientos y/o la eficacia de los tratamientos en sujetos que tienen CMT o un trastorno relacionado.

El objeto de esta invención se refiere a un método como se define en las reivindicaciones.

En la presente memoria también se describe un método para el diagnóstico de CMT y enfermedades relacionadas con CMT. En la presente memoria también se describen métodos para ayudar en el diagnóstico y subclasificación de trastornos neurológicos, o en la etapa de estratificación de pacientes en ensayos clínicos, incluyendo CMT y enfermedades relacionadas con CMT, mediante la cuantificación de la cantidad de lípidos, aminoácidos, hormonas esteroideas, carbohidratos, metales, metabolitos del ácido araquidónico, aminas biogénicas, nucleósidos, nucleótidos, péptidos pequeños y proteínas en una muestra de fluido biológico del sujeto, tal como un fluido cefalorraquídeo, suero, saliva, orina, etc. y la comparación de la cantidad medida con un valor de referencia para el biomarcador. Estos métodos también pueden aplicarse a la cuantificación de biomarcadores en extractos de biopsias incluyendo biopsia de la piel. La información así obtenida puede usarse para ayudar en el diagnóstico, para diagnosticar la enfermedad, o para predecir la respuesta potencial al fármaco en el individuo. Los biomarcadores están presentes de manera diferencial en los sujetos que tienen una enfermedad neurológica, incluyendo CMT y enfermedades relacionadas con CMT, frente a los sujetos que no tienen la enfermedad.

En la presente memoria también se describe un método para diagnosticar o valorar la probabilidad de que un paciente padezca de una enfermedad neurológica, incluyendo CMT, preferiblemente CMT1A, y enfermedades relacionadas con CMT, método que comprende medir un nivel de una combinación compleja de biomarcadores de la presente invención.

En la presente memoria se describe un método in vitro para detectar la presencia o riesgo de la enfermedad de CMT en un mamífero, o para ayudar en el diagnóstico, pronóstico o subclasificación de la enfermedad de CMT, o en la etapa de estratificación de pacientes en los ensayos clínicos, método que comprende determinar la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteración de un biomarcador diana en una muestra de fluido biológico del sujeto, en donde dicha cantidad o alteración es indicativa de la presencia, riesgo, progresión o gravedad de dicha enfermedad, y en donde dicho biomarcador se selecciona de lípidos, aminoácidos, hormonas esteroideas, metales, metabolitos del ácido araquidónico, aminas biogénicas, carbohidratos, péptidos, nucleósidos y nucleótidos.

En la presente memoria también se describe un método in vitro para valorar la eficacia de un tratamiento frente a CMT en un mamífero, método que comprende determinar en una muestra de fluido biológico del sujeto, durante el tratamiento, la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteración de un biomarcador diana seleccionado de lípidos, aminoácidos, hormonas esteroideas, metales, metabolitos del ácido araquidónico, aminas biogénicas, carbohidratos, péptidos, nucleósidos y nucleótidos, y comparar dicha cantidad o alteración con un nivel de dicho biomarcador determinado antes del tratamiento o en un estadio más temprano del tratamiento en dicho mamífero, en donde una desviación es indicativa de la eficacia del tratamiento.

Los métodos descritos en la presente memoria pueden usar uno o más biomarcadores diana. En una realización preferida, dicho o dichos biomarcadores diana se seleccionan de colesterol, alanina, ácido a-aminobutírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano, tirosina, hormona tiroidea T4, testosterona, hierro, LTB4, adrenalina, dopamina y serotonina, o combinaciones de los mismos.

En otra realización, dichos uno o más biomarcadores se usan en conjunción con al menos un ensayo o marcador de diagnóstico adicional para CMT, seleccionado preferiblemente de ensayo o marcador de ácidos nucleicos, proteináceo, fisiológico, neurofisiológico, genético, comportamental, electrofisiológico, clínico y fenotípico.

En la presente memoria también se describe un uso de uno o más biomarcadores descritos en la presente memoria en un método para detectar la predisposición a o el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de CMT en un sujeto mamífero.

Una descripción adicional de la invención es proporcionar un método in vitro para predecir la capacidad de respuesta a un tratamiento de la enfermedad de CMT de un individuo que padece de CMT, método que comprende:

i) determinar el nivel de colesterol libre en una muestra biológica de dicho individuo, y

ii) predecir la capacidad de respuesta de dicho individuo a dicho tratamiento comparando el nivel de colesterol libre obtenido en i) con un valor de referencia de un grupo respondedor o no respondedor.

En la presente memoria también se describe un método in vitro para determinar la progresión de la enfermedad de CMT en un individuo que tiene CMT, método que comprende:

i) determinar el nivel de alanina o triptófano, o ambos, en una muestra biológica de dicho individuo, y

ii) comparar el nivel de alanina o triptófano, o ambos, obtenido en i) con el o los niveles de alanina y/o triptófano, respectivamente, determinados previamente en el mismo individuo,

en donde un cambio en el nivel de alanina y/o triptófano es indicativo de la progresión de la enfermedad de CMT en dicho individuo.

En la presente memoria también se describe un método para dividir un grupo de pacientes que padecen de la enfermedad de CMT que comprende determinar los niveles de alanina o triptófano, o ambos, en una muestra biológica de dichos pacientes, en donde dicho o dichos niveles se usan para dividir dicho grupo de pacientes como una función de la gravedad de la enfermedad.

Descripción breve de la figura

Figura 1: niveles de colesterol libre en pacientes con CMT1A en la línea base. Antes de empezar el tratamiento con una mezcla de baclofeno, naltrexona y sorbitol, se encontró que los niveles de colesterol libre eran significativamente menores en pacientes que se comprobó que respondían al tratamiento, es decir, cuya afección se estabilizó o mejoró (respondedores, caja blanca) en comparación con aquellos que se comprobó que no respondían al tratamiento, es decir, cuya afección empeoró después de un año de tratamiento (no respondedores, caja gris). (p<0,034, ensayo de la t de Welch, niveles de colesterol libre de los respondedores significativamente diferentes de los no respondedores).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevos métodos y herramientas de diagnóstico para CMT y trastornos relacionados.

En el contexto de esta invención, CMT incluye CMT 1 A, CMT 1B, CMT 1C, CMT 1D, CMT 1X, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E CMT2F, CMT2I, CMT2J, CMT2-P0, CMT2K, CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4C, CMT4D, CMT4F, CMT4, AR-CMT2A, CMT4J u otras formas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth. En la realización más preferida, CMT es CMT1A.

En el contexto de la presente invención, el término "trastorno relacionado con CMT" designa otras enfermedades asociadas con síntomas neurológicos. El término "trastorno relacionado con CMT" incluye más particularmente la enfermedad de Alzheimer (AD), demencia senil de tipo AD (SDAT), enfermedad de Parkinson, demencia con cuerpos de Lewis, demencia vascular, autismo, deterioro cognitivo leve (MCI), deterioro de la memoria asociado con la edad (AAMI) y problemas asociados con el envejecimiento, Parkinsonismo post encefalítico, esquizofrenia, depresión, enfermedad bipolar y otros trastornos del humor, enfermedad de Huntington, enfermedades de neuronas motoras incluyendo esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple, neuropatías idiopáticas, neuropatía diabética, neuropatías tóxicas incluyendo neuropatía inducida por tratamientos farmacológicos, neuropatías provocadas por VIH, radiación, metales pesados y estados de deficiencia de vitaminas, neurodegeneración basada en priones, incluyendo la enfermedad de Creutzfeld-Jakob (CJD), encefalopatía espongiforme bovina (BSE), GSS, FFI, Kuru y síndrome de Alper.

El propósito de la presente invención es proporcionar nuevos biomarcadores de fluidos corporales para diagnosticar o monitorizar CMT y trastornos relacionados, y para valorar la capacidad de respuesta de sujetos o la eficacia de tratamientos terapéuticos en sujetos que tienen CMT o un trastorno relacionado. Por tanto, según una realización preferida, el método de la invención comprende la detección de la presencia o ausencia o cantidad (relativa) de metabolitos en fluidos corporales.

En la presente memoria se describe la detección (in vitro o ex vivo) de la presencia de o riesgo de desarrollar CMT o un trastorno relacionado en un mamífero, que comprende la determinación de la presencia, en una muestra biológica del mamífero, de una alteración en uno o más biomarcadores de fluidos corporales seleccionados.

un método para detectar (in vitro o ex vivo) de la presencia de o riesgo de desarrollar CMT o un trastorno relacionado en un mamífero, que comprende la determinación de la presencia, en una muestra biológica del mamífero, de una alteración del nivel de uno o más marcadores, siendo indicativa la presencia de dicha alteración de la presencia de o riesgo de desarrollar CMT en dicho mamífero.

En la presente memoria también se describe un método in vitro para detectar la presencia o riesgo de la enfermedad de CMT en un mamífero, o para ayudar en el diagnóstico, pronóstico o subclasificación de la enfermedad de CMT, o ayudar en la etapa de estratificación de pacientes en ensayos clínicos, método que comprende determinar la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteración de un biomarcador diana en una muestra de fluido biológico del sujeto, en donde dicha cantidad o alteración es indicativa de la presencia, riesgo, progresión o gravedad de dicha enfermedad, y en donde dicho biomarcador se selecciona de lípidos, aminoácidos, hormonas esteroideas, metales, metabolitos del ácido araquidónico, aminas biogénicas, carbohidratos, péptidos, nucleósidos y nucleótidos.

En el contexto de la presente invención, el término "alteración" de un biomarcador diana puede designar un incremento o una disminución de la cantidad del biomarcador diana en una muestra de fluido biológico del sujeto, en comparación con una muestra control o valor de referencia. Típicamente, el término "disminución" en relación con el nivel de un biomarcador, designa una reducción de la concentración o nivel del biomarcador en una muestra biológica del sujeto de al menos un 5 % o 10 % o 15 % en comparación con una muestra control o valor de referencia o medio. Las disminuciones pueden ser más sustanciales, tal como una reducción de al menos un 20 % o 30 % o 40 % o incluso más. De forma similar, el término "incremento" en relación con el nivel de un biomarcador, designa un aumento de la concentración o nivel del biomarcador en una muestra biológica del sujeto de al menos un 5 % o 10 % o 15 % en comparación con una muestra control o valor referencia o medio. Los incrementos pueden ser más sustanciales, tal como incrementos de al menos un 20 % o 30 % o 40 %, o incluso más.

Los tipos preferidos de alteraciones se describen más adelante para cada biomarcador en la Tabla A. Esta tabla indica, para cada biomarcador, si un incremento o una disminución es indicativo de CMT en sujetos humanos. También se proporciona una distinción entre pacientes masculinos y femeninos.

Tabla A: Incremento (+) o disminución (-) de la concentración de un biomarcador en pacientes con CMT

Los ejemplos específicos de alteraciones de cada biomarcador o biomarcadores diana se muestran en las Tablas 1-4 de la parte experimental.

En la presente memoria también se describe la cualificación y subclasificación de una enfermedad de CMT, por ejemplo, CMT1A, CMT1B, CMT1C, CMT1D, CMT1X, CMT2A, CMT2B, CMT2D, CMT2E CMT2F, CMT2I, CMT2J, CMT2-P0, CMT2K, CMT4A, CMT4B1, CMT4B2, CMT4C, CMT4D, CMT4F, CMT4, AR-CMT2A, CMT4J u otras formas de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth o trastornos relacionados con CMT en un sujeto, que comprende medir conjuntos de biomarcadores complejos de la presente invención.

Los métodos descritos en la presente memoria comprenden además la etapa de gestionar el tratamiento individual. Por ejemplo, si la medición del conjunto de biomarcadores se correlaciona con la presencia de enfermedad de CMT de subtipo clínico, entonces el tratamiento de gestión comprende administrar un fármaco concordante o combinación de fármacos para ralentizar o revertir la progresión de la enfermedad. Las mediciones adicionales pueden compararse con las mediciones previas, o el estándar para monitorizar la progresión de la enfermedad.

En otro aspecto de la invención, el método comprende además medir el biomarcador después de que haya empezado el tratamiento, para monitorizar la progresión de la enfermedad.

En otra realización, el método de la presente invención comprende monitorizar la progresión de una CMT, preferiblemente CMT1A, y medir un nivel de conjuntos de biomarcadores de la presente invención.

En la presente memoria también se describe un método para evaluar o seguir la respuesta a un tratamiento para CMT en un sujeto, método que comprende una etapa de medir el nivel de uno o más marcadores, la presencia de dicha alteración antes y/o durante el tratamiento, y una comparación del nivel así medido con el medido en un estadio anterior del tratamiento o antes del tratamiento.

En la presente memoria también se describe un método para evaluar o seguir la respuesta a un tratamiento para CMT en un sujeto, método que comprende una etapa de medir la cantidad de uno o más biomarcadores de fluidos corporales seleccionados antes y/o durante el tratamiento, y una comparación de la cantidad así medida con la medida en un estadio anterior del tratamiento o antes del tratamiento.

El nivel del o de los biomarcadores, medido como se describe en la presente memoria, se correlaciona con enfermedad neurológica, preferiblemente enfermedad de CMT. En realizaciones preferidas, esto puede conseguirse comparando la cantidad medida con un valor de referencia para el o los biomarcadores. El valor de referencia puede obtenerse midiendo una cantidad del o de los biomarcadores en sujetos control con edades concordantes que no están afectados por la enfermedad, o que carecen de la enfermedad.

En la presente memoria también se describe la monitorización de la eficacia de un método de tratamiento de una CMT, que comprende medir un nivel de un conjunto complejo de biomarcadores de la presente invención. La eficacia del tratamiento se mide monitorizando los niveles del biomarcador en el sujeto comparados con una referencia, y/o comparados con otros ensayos previos del sujeto o con un estadio más temprano del tratamiento/enfermedad en el sujeto.

En la presente memoria también se describe una mejoría en los métodos para tratar CMT o trastornos relacionados, consistiendo la mejoría en la medición del nivel de expresión de uno o, preferiblemente, varios biomarcadores antes y/o durante el tratamiento. La medición del nivel de la expresión de biomarcadores, hace que sea posible adaptar el tratamiento según la evolución de la patología y/o eficacia del tratamiento.

En una descripción preferida, el diagnóstico o monitorización de CMT y trastornos relacionados, comprende la determinación de la cantidad (o de la presencia o de la ausencia), en una muestra biológica del mamífero, de dicho o dichos biomarcadores de fluidos corporales seleccionados de lípidos, aminoácidos, hormonas esteroideas, carbohidratos, metales, metabolitos del ácido araquidónico, aminas biogénicas, nucleósidos y nucleótidos, péptidos pequeños y proteínas.

En una descripción preferida adicional, el método de la invención comprende la determinación de la cantidad (o de la presencia o de la ausencia), en una muestra de fluido biológico del mamífero, de uno o más biomarcadores de fluidos corporales, en donde dichos biomarcadores de fluidos corporales se seleccionan de:

- lípidos, preferiblemente colesterol y sus metabolitos, incluyendo deshidroepiandrosterona (DHEA), e incluyendo más preferiblemente colesterol libre o colesterol LDL, o su cantidad respecto al colesterol total,

- aminoácidos o sus derivados, preferiblemente incluyendo alanina, ácido a amino butírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano y tirosina, y/o arginina, asparaginas, ácido aspártico, ácido glutámico, glicina, histidina, 1 -metil histidina, isoleucina, leucina, ornitina, fenilalanina, serina, taurina y valina, - hormonas esteroideas y sus precursores o derivados, preferiblemente incluyendo las hormonas tiroideas T3 y T4, testosterona, 5a-dihidroprogesterona, alopregnanolona y corticosterona,

- metales, preferiblemente hierro y cinc,

- metabolitos del ácido araquidónico, preferiblemente incluyendo leucotrienos (p. ej., LTB4/5), y prostaglandinas PGE2, prostaciclinas PGI2 y tromboxanos TXA2 y TXB2,

- aminas biogénicas, preferiblemente incluyendo adrenalina, dopamina y serotonina,

- carbohidratos, preferiblemente sorbitol,

- nucleótidos, preferiblemente monofosfato de adenosina 3'-5'-cíclico (AMPc), y

- cualquier combinación de los mismos.

Más preferiblemente, dichos biomarcadores de fluidos corporales se seleccionan de:

- lípidos, preferiblemente colesterol y sus metabolitos, incluyendo colesterol libre o colesterol LDL, o su cantidad respecto al colesterol total,

- aminoácidos o sus derivados, preferiblemente incluyendo alanina, ácido a amino butírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano y tirosina,

- hormonas esteroideas, preferiblemente incluyendo la hormona tiroidea T4 y testosterona,

- metales, preferiblemente hierro,

- metabolitos del ácido araquidónico, preferiblemente incluyendo leucotrienos (p. ej., LTB4/5),

- aminas biogénicas, preferiblemente incluyendo adrenalina, dopamina y serotonina, y

- cualquier combinación de los mismos.

El método descrito en la presente memoria comprende la determinación de la cantidad (o de la presencia o de la ausencia), en una muestra de fluido biológico del mamífero, de uno o más biomarcadores de fluidos corporales, en donde dichos biomarcadores de fluidos corporales se seleccionan de:

- metabolitos del colesterol, preferiblemente incluyendo un éster de colesterol, 27-hidroxicolesterol, pregnenolona, sulfato de pregnenolona, y sulfato de deshidroepiandrosterona (DHEAS),

- hormonas esteroideas y sus precursores o derivados, preferiblemente incluyendo cortisol, cortisona, aldosterona, androstanodiol, androstenodiona, estradiol y estrona,

- metabolitos del ácido araquidónico, preferiblemente incluyendo prostaglandinas PGD2 y PGF2a, ácido 12-Hidroxieicosatetraenoico (12-HETE) y lipoxinas (LXA4 y LXB4),

- inositol y sus derivados, preferiblemente incluyendo monofosfatos de inositol, fosfatidilinositol 3-fosfato [PI3P] y fosfatidilinositol (3,5)-bi-fosfato [PI(4,5)P2],

- esfingolípidos o fosfolípidos o sus derivados, preferiblemente incluyendo ácido lisofosfatídico, ácido fosfatídico y esfingosina-1-fosfato (S1P),

- endocanabinoides, preferiblemente incluyendo araquidonoiletanolamina, 2-araquidonoil glicerol, éter de 2-araquidonil glicerilo, N-araquidonoil-dopamina y virodamina, y

- cualesquiera combinaciones de los mismos.

En la presente memoria también se describe un método de la invención que comprende determinar en una muestra de fluido biológico del sujeto la cantidad (relativa) o la presencia, ausencia o alteración, de un biomarcador diana seleccionado de colesterol, alanina, ácido a-aminobutírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano, tirosina, hormona tiroidea T4, testosterona, hierro, LTB4, adrenalina, dopamina y serotonina, así como cualesquiera combinaciones de los mismos.

El biomarcador descrito en la presente memoria es o comprende al menos colesterol, más preferiblemente colesterol libre, y/o colesterol LDL y/o su cantidad respecto al colesterol total. El término "colesterol LDL" designa todas las formas de colesterol contenidas en LDL, incluyendo colesterol no esterificado.

Como se muestra en la parte experimental, los inventores han descubierto sorprendentemente que el nivel de colesterol libre o el nivel de colesterol LDL disminuye en los animales enfermos.

Por tanto, el método descrito en la presente memoria comprende determinar una disminución de colesterol libre y/o colesterol LDL y/o su cantidad respecto al colesterol total, en una muestra de fluido biológico del sujeto, en donde dicha disminución de colesterol libre y/o colesterol LDL y/o su cantidad respecto al colesterol total, es indicativa de la presencia, riesgo, progresión o gravedad de la enfermedad.

El método descrito en la presente memoria comprende determinar en una muestra de fluido biológico del sujeto, una disminución de la relación de colesterol libre a colesterol total.

En otra descripción particular, el método de la invención comprende determinar una disminución de la relación de colesterol LDL a colesterol total.

Como se indica, el método puede comprender la determinación de varios biomarcadores, p. ej., 2, 3, 4, 5 o incluso más. Estos pueden determinarse simultáneamente o secuencialmente en una muestra de fluido biológico.

En una variante particular, la presencia o la ausencia o la cantidad (relativa) de al menos tres biomarcadores se determina simultáneamente o secuencialmente en una muestra de fluido biológico del sujeto mamífero.

El método descrito en la presente memoria comprende la determinación de la presencia o la ausencia o la cantidad (relativa), en una muestra biológica del mamífero, de al menos cuatro biomarcadores distintos.

Los conjuntos de biomarcadores usados en los métodos descritos en la presente memoria se seleccionan de la Tabla 5. En una descripción preferida, los conjuntos de biomarcadores comprenden:

- colesterol libre y alanina;

- colesterol libre y T4 y triptófano e hidroxiprolina;

- colesterol libre e hidroxiprolina;

- colesterol libre y T4 y triptófano;

- colesterol libre y T4 y serotonina;

- colesterol libre y T4 e hidroxiprolina;

- colesterol libre y T4; o

- colesterol libre y serotonina.

Como se ilustra en los ejemplos, dichos conjuntos de biomarcadores son particularmente eficientes para predecir la presencia de la enfermedad de CMT. En particular, los resultados representados en los ejemplos muestran rendimientos del 100 % en los ensayos de entrenamiento y entre un 78 % y 100 % en los ensayos de validación para estos conjuntos de biomarcadores.

El nivel de dicho o dichos biomarcadores puede determinarse por cualquiera de los métodos conocidos per se en la técnica, tales como, sin limitación, métodos inmunológicos, métodos bioquímicos, métodos cromatográficos, métodos enzimáticos, ensayos basados en células, ensayos in vitro, etc. Los ejemplos de métodos adecuados se describen en la sección experimental. El nivel del o de los biomarcadores determinado puede compararse con un valor de referencia, un control, o un valor medio, en donde una desviación de dicho valor es indicativa de la presencia, riesgo, progresión o gravedad de CMT. La desviación debería ser típicamente superior al 5 %, más preferiblemente al 10 %, incluso más preferiblemente el 15 %.

En la presente memoria también se describe un uso de uno o más biomarcadores seleccionados de colesterol, alanina, ácido a-aminobutírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano, tirosina, hormona tiroidea T4, testosterona, hierro, LTB4, adrenalina, dopamina y serotonina en un método para detectar la predisposición a o diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de CMT en un sujeto mamífero.

También, como se ilustra en la parte experimental, los inventores han encontrado que en una población enferma que padece de CMT, los niveles de colesterol libre también son predictivos de la capacidad de respuesta de un paciente a un tratamiento para CMT. Más particularmente, la invención muestra que, en una población de pacientes con CMT que responde a un tratamiento con baclofeno, naltrexona y sorbitol, los niveles de colesterol libre son significativamente menores que en una población que no responde a dicho tratamiento.

Por tanto, en la presente memoria también se describe un método in vitro que comprende identificar a un paciente con mayor probabilidad de responder a un tratamiento de CMT midiendo el nivel de colesterol libre en dicho paciente. Preferiblemente, el método comprende comparar dicho nivel de colesterol libre determinado en un paciente con un valor de referencia de un grupo no respondedor o respondedor, en donde dicha comparación permite la determinación de la probabilidad de que el paciente sea un respondedor o no respondedor. El método descrito en la presente memoria comprende comparar dicho nivel de colesterol libre determinado en un paciente con un valor de referencia de un grupo no respondedor, en donde un nivel de colesterol libre significativamente menor cuando se compara con dicho valor de referencia es indicativo de que el paciente responderá al tratamiento.

Como se muestra en la parte experimental, el valor de referencia de colesterol libre (en plasma) en un grupo respondedor está comprendido típicamente entre 446 y 520 pg/ml, más particularmente entre 446 y 483 pg/ml, incluso más particularmente es menor de 483 pg/ml.

En la presente memoria también se describe un método in vitro que comprende determinar el nivel de colesterol libre de dicho individuo de una muestra de plasma obtenida del individuo, en donde un nivel de colesterol libre en dicho paciente comprendido entre 446 y 520 pg/ml, más preferiblemente entre 446 y 483 pg/ml, incluso más preferiblemente menor de 483 pg/ml, es indicativo de que el paciente responderá a dicho tratamiento. En una realización adicional, el método in vitro comprende comparar el nivel de colesterol libre en plasma de dicho paciente con un valor de referencia de un grupo respondedor con edad, sexo, afección, y/o cualquier tratamiento en curso (p. ej., tratamiento con estatina) similares.

Como se muestra en la parte experimental, el valor de referencia de colesterol libre (colesterol libre en plasma) en un grupo no respondedor es típicamente superior a 520 pg/ml, incluso más particularmente superior a 578 pg/ml.

el método in vitro descrito comprende determinar el nivel de colesterol libre en plasma de dicho paciente, en donde un nivel de colesterol libre superior a 520 pg/ml, incluso más preferiblemente superior a 578 pg/ml, es indicativo de que el paciente no responderá a dicho tratamiento.

En una realización particular, el método permite la determinación de la capacidad de respuesta a un tratamiento de CMT que comprende coadministrar baclofeno, naltrexona y sorbitol, o sales de los mismos, a dicho paciente.

En una realización particular, el término "significativamente menor" designa un nivel que es al menos un 5 % menor, más preferiblemente al menos un 10 % menor, incluso más preferiblemente al menos un 15 % o más menor que el valor de referencia.

En una realización particular, la muestra de fluido biológico es una muestra de sangre del sujeto, preferiblemente una fracción plasmática de dicho sujeto.

En una realización particular, los biomarcadores anteriores se usan en un método para detectar la predisposición a, el diagnóstico y/o pronóstico de, la enfermedad de CMT, o para ayudar en la etapa de estratificación de pacientes en ensayos clínicos, en conjunción con al menos un ensayo o marcador de diagnóstico adicional para CMT, seleccionado preferiblemente de un ensayo o marcador proteináceo, fisiológico, neurofisiológico, genético, comportamental, electrofisiológico, clínico y fenotípico.

En otra realización particular, el nivel de dicho o dichos biomarcadores usados en un método para detectar la predisposición a o el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de CMT, o para ayudar en la etapa de estratificación de pacientes en ensayos clínicos, se compara con un valor de referencia, en donde la desviación de dicho valor es indicativa de la presencia, riesgo, progresión o gravedad de CMT.

Dichos biomarcadores usados en un método descrito en la presente memoria para ayudar en la etapa de estratificación de pacientes en ensayos clínicos o para evaluar la progresión o gravedad de CMT, comprenden al menos triptófano (trp) y/o alanina (ala).

Como se muestra en la parte experimental, los inventores han descubierto sorprendentemente que la variación del o de los niveles de trp y/o alanina en pacientes con CMT se correlaciona con la gravedad de la enfermedad como se determina por ensayos electrofisiológicos, clínicos o mediciones funcionales.

Por consiguiente, en la presente memoria se describe un método in vitro para determinar la progresión de la enfermedad de CMT en un individuo que tiene CMT, método que comprende:

En una realización preferida, la invención se basa en un método in vitro para valorar la evolución de la enfermedad de CMT en un individuo que tiene CMT y que está siendo sometido a un tratamiento para CMT, método que comprende: i) determinar los niveles de alanina y triptófano en una muestra biológica de dicho individuo, y

ii) comparar los niveles de alanina y triptófano obtenidos en i) con los niveles de alanina y triptófano, determinados previamente en el mismo individuo antes de comenzar el tratamiento, o en un estadio más temprano de dicho tratamiento,

en donde el intervalo de tiempo entre las dos mediciones de los niveles de alanina y triptófano de las etapas i) y ii) es de al menos 2 meses, preferiblemente 3 o 4 meses, y en donde un incremento relativo en los niveles de alanina y triptófano es indicativo de una mejoría o estabilización de la enfermedad de CMT en dicho individuo.

El método de la invención comprende determinar un incremento del o de los niveles de trp y/o ala en una muestra de fluido biológico del sujeto en relación con el o los niveles determinados previamente en dicho paciente, en donde dicho incremento del o de los niveles de trp y/o ala es indicativo de una mejoría de la enfermedad de CMT.

La determinación de un nivel de trp y/o niveles de ala en una muestra de fluido biológico del sujeto se hace en conjunción con al menos un ensayo o marcador de diagnóstico adicional para CMT, seleccionado preferiblemente de un ensayo proteináceo, fisiológico, neurofisiológico, genético, comportamental, electrofisiológico, clínico y fenotípico.

La determinación del nivel de trp y/o nivel o niveles de ala en una muestra de fluido biológico del sujeto se hace en conjunción con la determinación de CMTNS y/u ONLS que son conocidos por el experto en la técnica.

La determinación del nivel de trp y/o nivel o niveles de ala en una muestra de fluido biológico del sujeto se hace en conjunción con una o más de las valoraciones que componen CMTNS y/u ONLS que son muy conocidas por el experto en la técnica.

el método descrito en la presente memoria comprende determinar el nivel o niveles de trp y/o ala en muestras de fluidos biológicos de un grupo de pacientes, en donde dicho o dichos niveles se usan para dividir a dicho grupo de pacientes como una función de la gravedad de la enfermedad.

En una realización particular, la muestra de fluido biológico es una muestra de sangre del sujeto, preferiblemente plasma o una fracción de plasma de dicho sujeto.

Como se muestra en la sección experimental, se encuentra sorprendentemente que el o los niveles de trp y/o ala varían como una función de la presencia de un tratamiento de la enfermedad que se ha encontrado que es efectivo para tratar CMT. De hecho, en el curso de un ensayo clínico para evaluar una mezcla de baclofeno, naltrexona y sorbitol como un tratamiento para la enfermedad de CMT, los inventores encontraron que el o los niveles de trp y/o ala eran significativamente mayores en la población de pacientes tratada cuando se compara con los pacientes a los que se administró placebo, y esto ocurrió tan pronto como 3 meses después del comienzo del tratamiento, mientras que una evolución de la enfermedad en un periodo de tiempo tan corto no puede determinarse usando CMTNS ni ONLS.

En la presente memoria se describe un método para valorar la respuesta o la capacidad de respuesta a un tratamiento de CMT, método que comprende medir un incremento del o de los niveles de trp y/o ala en una muestra de fluido biológico de un sujeto que está siendo sometido a un tratamiento para CMT en relación con los niveles determinados previamente en dicho sujeto antes del comienzo de, o en un estadio más temprano de, dicho tratamiento, en donde dicho incremento es indicativo de una respuesta a dicho tratamiento.

En una realización particular, el intervalo de tiempo entre las dos mediciones es de 2 meses o más, preferiblemente 2, 3, o 4 meses.

El método para valorar la respuesta a un tratamiento de CMT comprende medir un incremento del o de los niveles de trp y/o ala en una muestra de fluido biológico de un sujeto que está siendo sometido a un tratamiento para CMT durante 3 meses, en relación con los niveles determinados previamente antes del comienzo de dicho tratamiento.

Típicamente, un incremento en el o los niveles de trp y/o ala superior al 5 %, más preferiblemente al 10 %, incluso más preferiblemente al 15 %, es indicativo de una respuesta a un tratamiento.

En una realización aún más preferida, el método anterior se usa para valorar la respuesta a un tratamiento de combinación para CMT que comprende la administración de baclofeno, naltrexona y sorbitol.

En una realización particular, puede usarse cualquiera de los biomarcadores de fluidos corporales mencionados anteriormente, o sus combinaciones, en conjunción con al menos un ensayo o marcador de diagnóstico adicional para CMT, seleccionado preferiblemente de un ensayo o marcador de ácidos nucleicos, proteináceo, fisiológico, neurofisiológico, genético, comportamental, electrofisiológico, clínico y fenotípico.

Dichos biomarcadores proteináceos, detectables en fluidos corporales, que pueden usarse para el diagnóstico de CMT o para monitorizar la progresión de CMT, o para monitorizar la eficacia de los fármacos relevantes para CMT, incluyen neurofilamento NEFH, receptor del factor de crecimiento nervioso p75/LNGFR, receptor NTRK3, factor de transcripción SCIP, ciclina D1, proteína de membrana asociada a lisosomas LAMP1, homólogo 7 relacionado con autofagia ATG7, subunidades de activador de proteasoma PSME1/2, subunidad de proteasoma PSMA1, integrinas ITGB1/4, factor de crecimiento semejante a insulina 1 (IGF1), proteínas de unión al factor de crecimiento semejante a insulina 1/2/5 (IGFBP1/2/5), vitronectina (VTN), tenascinas (TNC/R/XB), canal de sodio regulado por voltaje SCN10A, canal de potasio regulado por voltaje KCNC1, aldosa reductasas incluyendo AKR1B1, sorbitol deshidrogenasa (SORD), inositol(mio)-1 (o 4)-monofosfatasas IMPA1/2, factor de ADP-ribosilación 6 (ARF6), calnexina (CANX), factores de crecimiento FGF2, PDGFA/B/C, VEGFA/B/C y TGFB1/2, neuregulinas incluyendo n Rg 1, metalopeptidasa de matriz 2/9, activadores de plasminógeno tisular y uroquinasa PLAT y PLAU, proteína 1 qumioatrayente de monocitos (CCL2), factor inhibidor de leucemia (LIF), interleuquina 6, transferrina, y opioides endógenos POMC, PENK y PDYN, así como péptidos más pequeños y otros derivados producidos por el metabolismo de las moléculas mencionadas anteriormente.

Los biomarcadores proteicos adicionales, útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT) o para monitorizar la progresión de CMT, o para monitorizar la eficacia de los fármacos relevantes para CMT, pueden seleccionarse de proteína de mielina periférica 22 PMP22, de factor neurotrófico ciliar CNTF, ácido graso elongasa ELOV16, glipicano GPC3, miosinas MYO1B/1G, fosfoproteína enriquecida en astrocitos PEA15, proteínas de unión a calcio S100A3/4, troponinas TNNT1/3 y ferritina FTH1, así como péptidos más pequeños y otros derivados producidos por su metabolismo.

Los biomarcadores proteicos adicionales, detectables en fluidos corporales y útiles para el diagnóstico de la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth o para monitorizar la progresión de CMT, o para monitorizar la eficacia de los fármacos relevantes para CMT, pueden seleccionarse de proteínas o péptidos más pequeños y sus derivados codificados por los genes ATP1A1, FGL2, ACAT2, ACTN2, AK1, ANK3, ANXA1, APOD, CD151, CD24A, CD9, CD99, CETN2, CHN1, CLIC4, COL1A1/2, COL2A1, COL3A1, COL4A1, CRYAB, CTSC, CYB5B, CYB561, DEAF1, EMID1, EPB4.1L2, EZR, FASN, FBLN2, FDFT1, FHL1, FOS, GAPD, GATM, HBA1, HBB, IGF2, ITIH5, KIT, LGALS1, LPL, LXN, MAPK3, MFGE8, MGLL, MMP12, MRAS, MSLN, MTAP1B, NECL1, NPR3, ODF2, OGN, OLFM1, PCOLCE, PMM1, PROS1, PYGM, RAB2, RAP1GDS1, SERPINA2, SH3GL3, SIRT2, SPP1, TPM1/2, TUBA2 y UCHL1.

Los grupos de genes anteriores (o las proteínas o ligandos correspondientes) representan biomarcadores valiosos que pueden usarse, solos o en diversas combinaciones, para diagnosticar CMT o trastornos relacionados.

En la presente memoria también se describe un kit que comprende un soporte sólido que comprende al menos un agente de captura unido al mismo, en donde el agente de captura se une a o reacciona con uno o más componentes del complejo de proteínas biomarcadoras de la presente invención.

El kit descrito en la presente memoria comprende un soporte sólido que comprende al menos un agente de captura unido al mismo, en donde el agente de captura se une a o reacciona con al menos un biomarcador seleccionado de colesterol, alanina, ácido a-aminobutírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano, tirosina, hormona tiroidea T4, testosterona, hierro, LTB4, adrenalina, dopamina y serotonina. El kit descrito en la presente memoria comprende al menos un compuesto que se une a o reacciona con al menos un biomarcador seleccionado de colesterol, alanina, ácido a-aminobutírico, citrulina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, lisina, metionina, prolina, treonina, triptófano, tirosina, hormona tiroidea T4, testosterona, hierro, LTB4, adrenalina, dopamina y serotonina para el diagnóstico, pronóstico y/o para valorar la eficacia de un tratamiento o seguir la evolución de la enfermedad de CMT1A.

El método de la invención es aplicable a cualquier muestra biológica del mamífero que se va a ensayar, en particular a cualquier muestra que comprende metabolitos. Los ejemplos de dichas muestras incluyen sangre, plasma, suero, saliva, orina, heces, biopsia de tejido, etc. La muestra puede obtenerse por cualquier técnica conocida per se en la técnica, por ejemplo, por la recogida usando, p. ej., técnicas no invasivas, o de colecciones o bancos de muestras, etc. La muestra puede además pretratarse para facilitar la accesibilidad de las moléculas diana, por ejemplo, por lisis (mecánica, química, enzimática, etc), purificación, centrifugación, separación, etc.

La invención es aplicable a cualquier mamífero, preferiblemente a un ser humano.

Los aspectos y ventajas adicionales de esta invención se describirán en la siguiente sección experimental, que debe considerarse solo como ilustrativa.

Ejemplos

I. Identificación de nuevos marcadores y cuantificación de biomarcadores

La invención describe biomarcadores de fluidos corporales útiles para el diagnóstico, pronóstico y/o para valorar la eficacia de un tratamiento o seguir la evolución de la enfermedad de CMT.

I.1 Modelo de rata transgénica CMT1A y recogida de muestras de suero

El modelo de rata transgénica CMT es una rata transgénica hemicigota PMP22 que porta tres copias adicionales del gen PMP22 de ratón muestra signos de desmielinación en los nervios periféricos y craneales (Sereda et al., 1996; Grandis et al., 2004). Este modelo de rata CMT es una buena aproximación a la enfermedad CMT1A humana desde un punto de vista clínico. Además, las ratas CMT ya han servido como modelo para una terapia experimental para CMT1A (Meyer zu Horste et al., 2007).

Los inventores han buscado moléculas pequeñas que muestran niveles diferenciales en las ratas de tipo salvaje y transgénicas constituyendo por tanto biomarcadores relevantes para la enfermedad de CMT.

Excepto cuando se especifique otra cosa, las ratas del modelo CMT1A, de cuatro meses de edad, se anestesian con Ketamina (Imalgene) 100 mg/kg, ip. La sangre se recoge por punción cardiaca en dos tubos diferentes:

- en un tubo de recogida de sangre esterilizado para la coagulación; el suero se recoge y almacena a -80 °C.

- en un tubo sin ARNasa con EDTA; después de la centrifugación (+4 °C.; 1.260 g; 10 min), el plasma se almacena a -80 °C.

I.2 Métodos de cuantificación

• Colesterol libre

El colesterol se extrajo en primer lugar de muestras con heptanos. El colesterol libre se analizó adicionalmente usando un método adaptado de Dong et al. (2007): la colest-4-en-3,6-diona formada a partir de la oxidación del colesterol no esterificado por la oxidación de Jones se midió por análisis de HPLC/UV. El estigmasterol se usó como un estándar interno.

• Sorbitol

Las proteínas se precipitaron en primer lugar con etanol. El sorbitol se analiza principalmente según la nota técnica Dionex N° 20, usando cromatografía de intercambio aniónico acoplada con un detector electroquímico.

• Metales

La cuantificación de hierro y cinc se realizó por ICP/MS después de la mineralización de las muestras de suero. • Metabolitos del ácido araquidónico

Se usaron kits de inmunoensayos enzimáticos (EIA) de Cayman chemical para analizar:

Prostaglandina E²(ref. 514010)

Leucotrieno B⁴(ref. 520111)

Tromboxano B²(ref. 519031)

6-ceto Prostaglandina F¹a (ref. 515211)

• Monofosfato de adenosina cíclico

Después de la precipitación de las proteínas del plasma con etanol, se analizó el AMPc con un kit de EIA de Cayman chemical (ref 581001) según las instrucciones del fabricante.

• Catecolaminas

Se realizó una extracción en fase sólida (SPE) para concentrar y purificar las muestras. Se analizaron adicionalmente la adrenalina, dopamina, y serotoninserotonina por cromatografía de pares iónicos.

• Aminoácidos

Las proteínas del plasma se precipitaron con ácido sulfosalicílico antes de los análisis. La cuantificación de los aminoácidos derivatizados se realizó con un espectrofotómetro después de un proceso automatizado de cromatografía de intercambio catiónico.

• Hormonas tiroideas

Antes de la precipitación de las proteínas del plasma con metanol, se añadió un estándar interno a las muestras. Después, se cuantificaron la triyodotironina (T3) y tiroxina (T4) por un HPLC acoplado a LC-MS/MS principalmente según Soukhova et al (2004).

• Neuroesteroides

Las ratas del modelo CMT1A, de cuatro meses de edad, se decapitaron y se recogió la sangre en dos tubos diferentes: - en un tubo de recogida de sangre esterilizado para la coagulación; el suero se recogió y almacenó a -80 °C;

- en un tubo sin ARNasa con EDTA; después de la centrifugación (+4 °C.; 1.260 g; 10 min), el plasma se almacenó a Antes del análisis, las proteínas del plasma se precipitaron y los neuroesteroides se purificaron y se concentraron entonces por SPE. Los neuroesteroides se derivatizaron químicamente adicionalmente bien con 2-hidrozino-1-metilpiridina (para disminuir el umbral de detección (Higashi et al., 2005) o ácido picolínico (Yamashita et al., 2007). Según el método de derivatización, el estándar interno es 2H testosterona o 2H 3a-androstanodiol. El análisis por HPLC de los neuroesteroides se acopló a un espectrómetro de masa. Los neuroesteroides y los derivados buscados fueron aldosterona, sulfato de pregnelonona, alopregnanolona, progesterona, 5a-dihidroprogesterona (DHP), 3aandrostanodiol, testosterona, 5a dihidrotestosterona, DHEA y corticosterona.

• Estrógenos

La sangre se recoge como anteriormente. Como para los neuroesteroides, la estrona y el estradiol se extraen de la muestra con acetato de etilo antes de la derivatización con purificación de ácido picolínico y una etapa de concentración y purificación por SPE. Se usan la 2H-estrona y el 2H-17p-estradiol como estándares internos.

1.3 Resultados

Se analizaron muestras en duplicado para cada biomarcador. Se realizaron análisis estadísticos (ensayo de student, bilateral, tipo 3) que compararon las ratas WT frente a las ratas CMT1A (transgénicas). Los resultados se resumen en las tres tablas a continuación. Estas tablas reportan el nivel medio de biomarcadores que presentan una diferencia notable (P<0,2) entre las ratas WT y CMT1A en machos y hembras (tabla 1), solo en machos (tabla 2) y solo en hembras (tabla 3).

El análisis de los biomarcadores ha revelado que el nivel de colesterol libre plasmático está disminuido significativamente en las ratas CMT1A macho (P=0,05) y hembra (P=0,06) en comparación con las ratas WT. En las hembras, nuestros resultados presentaron una disminución significativa de los niveles plasmáticos de ácido alfaaminobutírico (P=0,019), glutamina (P=0,025) y tirosina (P=0,03) frente a los controles.

Nuestros resultados también muestran una disminución significativa de los siguientes biomarcadores: alanina, cistina, glutamina, hidroxiprolina, treonina, hormona tiroidea T4, citrulina, LTB4, adrenalina, y lisina; y un incremento significativo de los siguientes biomarcadores: triptófano, testosterona, dopamina, serotonina, hierro, metionina, y prolina (Tabla 1,2 y 3).

1.4 Recogida de muestras de fluido biológico y métodos de cuantificación

Los biomarcadores de la invención pueden cuantificarse fácilmente de otros fluidos biológicos. Como un ejemplo de la cuantificación de una muestra de saliva se describen por Karjalainen et al. (2007) para colesterol, por Syrjanen et al. (1990) para glutamina y tirosina. Asimismo, estas moléculas pequeñas pueden cuantificarse en orina como se describe en otro lugar para el colesterol (Cenedella et al., 1981) y para aminoácidos (Venta et al., 2001).

TABLA 1 WT TG

TABLA 2

TABLA 3

II. Identificación y cuantificación de otros biomarcadores relacionados con el colesterol

11.1 Modelo de rata transgénica CMT1A y recogida de muestras de suero

El modelo de rata transgénica CMT y la recogida de muestras son las mismas que las descritas anteriormente (véase la sección I.1).

11.2 Métodos de cuantificación del colesterol

• Colesterol total

El colesterol total se ha determinado por un ensayo enzimático con el kit CP de Colesterol ABX Pentra (Horiba). El colesterol se consume por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa en una reacción que forma color donde el color producido es proporcional a la cantidad del colesterol total presente en la muestra.

• Colesterol LDL

El colesterol LDL se ha determinado por un ensayo enzimático con el kit CP Directo de LDL ABX Pentra (Horiba). El método está en un formato de dos reactivos y depende de las propiedades de los detergentes usados. El primer detergente solubiliza todas las partículas de lipoproteína que no son LDL. El colesterol liberado se consume por la colesterol esterasa y la colesterol oxidasa en una reacción que no forma color. el segundo detergente solubiliza el resto de las partículas LDL y un acoplador cromogénico permite la formación de color. La reacción enzimática en la presencia del acoplador produce color que es específicamente proporcional a la cantidad de colesterol LDL presente en la muestra.

II.3 Resultados

Los resultados presentados en la tabla 4 a continuación se extrajeron de ensayos independientes y se analizaron con un ensayo de la t de Student bilateral comparando 20 ratas WT frente a 19 ratas CMT1A (transgénicas).

Nuestros resultados muestran que el nivel de colesterol LDL está disminuido significativamente (P=0,039) en las ratas CMT1A (TG) en comparación con las ratas WT, mientras el nivel de colesterol total no está modificado significativamente. El nivel de colesterol LDL se cuantifica muy fácilmente con kits de detección usados comúnmente.

Correlación de la concentración de biomarcadores con los resultados de ensayos comportamentales, histología, expresión génica y electrofisiología

Se compararon el rendimiento motor y la fuerza muscular, los Potenciales de Acción Nerviosa Sensorial (SNAP), la distribución del diámetro axonal y la vaina de mielina de nervio ciático fijado, el contenido de fibra en músculos fijados y la expresión del ARNm de pmp22 con la cantidad de biomarcadores medida en fluidos biológicos. El ensayo usado es un ensayo de asociación lineal entre muestras emparejadas usando la correlación del producto-momento de Pearson. Es un ensayo unilateral y se aplica un umbral de significancia de 0,05 en los valores p.

Dicho análisis demuestra que los niveles de los biomarcadores de la invención se correlacionan con algunos de los ensayos comportamentales, histología, expresión del gen PMP22 y electrofisiología mencionados anteriormente confirmando de esta manera la significancia de estos biomarcadores en la fisiología de CMT1A y la pertinencia del uso de estos biomarcadores en el diagnóstico y seguimiento de CMT1A.

III. Identificación de predictores de la enfermedad a partir de los biomarcadores de la invención

El análisis estadístico del nivel de biomarcadores de la invención obtenido en los experimentos anteriores muestra que dichos biomarcadores también pueden usarse en diferentes conjuntos de biomarcadores agrupados para predecir la presencia de enfermedad con una buena puntuación. Se muestran las puntaciones de predecibilidad para algunos posibles conjuntos que comprenden varias de las moléculas identificadas en la presente memoria como biomarcadores para la enfermedad de CMT (tabla 5).

Brevemente, el diagnóstico de la enfermedad se realizó aplicando un Análisis Discriminatorio Lineal (LDA), usado comúnmente en estadística, reconocimiento de patrones y aprendizaje automático para encontrar una combinación lineal de características que caracterizan o separan a dos o más clases de objetos. El LDA se implementó en R (http ://www.r-project.org/).

El algoritmo del LDA se aplicó en varios conjuntos de biomarcadores seleccionados sobre la base de su correlación con el rasgo de interés (aquí, transgénico frente a tipo salvaje). Con el fin de valorar apropiadamente los rendimientos de cada conjunto de biomarcadores, se dividieron grupos de ratas en "conjunto de entrenamiento" independiente (75 % de las ratas) en el que se entrenó el LDA, y un "conjunto de validación" (25 % de las ratas), en el que se validó el algoritmo entrenado. Para ser homogéneos, los conjuntos de entrenamiento y validación estaban compuestos por proporciones iguales de ratas transgénicas/de tipo salvaje y machos/hembras. Como el nivel de biomarcadores difiere entre los machos y las hembras, para un conjunto dado de biomarcadores, el LDA se entrenó y validó separadamente en machos y hembras. Finalmente, el LDA entrenado se usó para clasificar a cada rata de los conjuntos de entrenamiento y validación en "de tipo salvaje" y "transgénica", y la proporción de ratas que se clasificó bien permitió la valoración de los rendimientos del algoritmo. Este procedimiento se volvió a aplicar de manera iterativa con el fin de promediar los rendimientos sobre todos los posibles muestreos.

TABLA 5

*Total de 20 biomarcadores: Colesterol libre, T4, Triptófano, Hidroxiprolina, Serotonina, Alanina, Ácido alfa-AminoButírico, Citrulina, Cistina, Glutamina, Lisina, Metionina, Prolina, Treonina, Tirosina, Testosterona, Hierro, LTB4, Adrenalina, Dopamina.

IV. Análisis de biomarcadores en pacientes con CMT1A

Se realzó un análisis de biomarcadores en sangre como un objetivo secundario de un estudio de Fase 2 doble ciego, aleatorizado, controlado con placebo (ClinicalT rials.gov Identificador: NCT01401257) cuyo objetivo primario es valorar la seguridad clínica y de laboratorio y la tolerabilidad de tres dosis de una mezcla de baclofeno, naltrexona y sorbitol (MEZCLA), un tratamiento candidato administrado oralmente durante 12 meses a pacientes con CMT1A frente a placebo.

Se incluyeron pacientes con edades de 18-65 años con diagnóstico de CMT1A sobre la base del examen clínico y confirmación por genotipado (duplicación en 17p11.2), debilidad en al menos dorsiflexión del pie, y una Puntuación de Neuropatía de Charcot-Marie-Tooth (CMTNS) < 20, es decir, una gravedad de leve a moderada. Los pacientes elegibles se asignaron aleatoriamente en una relación 1:1:1:1 para recibir diariamente durante un año Placebo, Dosis baja (LD = 0,6 mg de baclofeno, 0,07 mg de naltrexona y 21 mg de sorbitol), Dosis intermedia (ID = 1,2 mg de baclofeno, 0,14 mg de naltrexona y 42 mg de sorbitol) o Dosis alta (HD = 6 mg de baclofeno, 0,7 mg de naltrexona y 210 mg de sorbitol) de la mezcla.

Los resultados respecto a la eficacia del tratamiento de este estudio de Fase 2 se ha publicado (Attarian et al., 2014). Los pacientes tratados con la dosis más alta muestran una evidencia consistente de mejoría más allá de la estabilización de la enfermedad, después de un año de tratamiento.

IV.1 Recogida de biomarcadores

Se tomaron muestras de sangre tanto en la aleatorización como después de 3 meses de tratamiento con la mezcla (3 dosis ensayadas) o placebo. Después de la recogida de muestras en litio-heparina, los tubos se centrifugaron durante 10 min a 1.300 g a temperatura ambiente, y las muestras de plasma se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Las concentraciones en plasma se determinaron usando HPLC acoplado con detección por Espectrometría de Masa (LC-MS/MS) después de la precipitación de las proteínas para L-alanina y L-triptófano y extracción Líquido/Líquido para el Colesterol libre.

Los Límites Inferiores de Cuantificación (LLOQ) fueron 20 gg/ml, 10 gg/ml, 5 gg/ml para colesterol libre, L-alanina, L-triptófano, respectivamente. Los resultados se expresan como gg/ml para L-alanina, colesterol libre y L-triptófano. IV.2 Puntos finales de eficacia

Los puntos finales clínicos considerados en el ensayo se enumeran en la tabla 6:

Tabla 6

El potencial de acción muscular compuesto (CMAP) es una investigación de electromiografía que representa la suma de un grupo de potenciales de acción casi simultáneos de varias fibras musculares en la misma área que se inducen por la estimulación del nervio motor. Los pacientes con nervios periféricos alterados muestran un CMAP disminuido. La velocidad de conducción motora (MCV) es la velocidad a la que una estimulación eléctrica de un nervio se propaga hacia abajo a un músculo con suministro de este nervio. Los pacientes que padecen de neuropatías motoras presentan velocidades reducidas.

IV.3 Análisis estadístico

Todos los análisis se realizaron en el Conjunto de Análisis Completo (todos los pacientes aleatorizados) usando R versión 3.1.2 (http://cran.r-project.org). Considerando la naturaleza exploratoria del estudio, los ensayos estadísticos se llevaron a cabo a un nivel del 5 % bilateral. Las correlaciones se valoraron usando un ensayo de rango de Spearman. Cuando se especifica, las correlaciones se valoraron sobre la base de los datos ajustados en Sexo, Edad y Centro con un modelo lineal. Las comparaciones de dos grupos se realizaron usando un ensayo de la t de Welch; las comparaciones de más de dos grupos se realizaron usando un Análisis de la Varianza (ANOVA).

Análisis del efecto del tratamiento

Las diferencias a 3 meses entre los pacientes tratados con la mezcla de baclofeno, naltrexona y sorbitol y los pacientes con placebo se valoraron por Análisis de la Covarianza (ANCOVA) ajustado en los valores de la línea base e incluyendo también sexo, edad y centro clínico como covariables fijadas. La significancia del efecto del tratamiento en la combinación de dos biomarcadores se valoró a través del ensayo OLS de O'Brien.

Identificación de respondedores

Se han comparado los niveles de biomarcadores en la línea base entre los pacientes no deteriorados (p. ej., que presentan síntomas mejorados o estabilizados) y deteriorados (que presentan una afección empeorada) a los 12 meses después del enfoque de Attarian et al. (2014) sobre los puntos finales de eficacia.

IV.4 Resultados

Correlación entre el estado o evolución de la enfermedad y los biomarcadores

Se ha realizado un análisis de correlación en la línea base entre los puntos finales de eficacia y los biomarcadores mediante el ajuste por sexo, edad y centro clínico con el fin de tener en cuenta cualquier variación no relacionada con el estado de la enfermedad.

Se encuentra que el nivel de triptófano se correlaciona significativamente con todos los puntos finales de eficacia (tabla 7). Esta correlación es positiva con los puntos finales para los que un incremento significa mejoría y negativa con los puntos finales para los que una disminución significa mejoría. Consecuentemente, se encuentra que los niveles mayores de triptófano están asociados con perfiles menos graves de la enfermedad.

La alanina también muestra correlación con algunos de los puntos finales (tabla 7).

De forma destacable, se observa una correlación significativa y positiva entre los dos biomarcadores (R = 0,44, p = 7e-05), lo que confirma la correlación con los puntos finales de eficacia observada tanto para triptófano como alanina. Tabla 7

De forma destacable, los puntos finales de eficacia se correlacionan bien y significativamente entre sí y de una manera coherente con respecto a la gravedad de la enfermedad. Entonces, incluso si es moderado, debido a la naturaleza multidimensional de la enfermedad, los puntos finales de eficacia y también la variación de triptófano y Alanina mantienen una relación predecible con la gravedad global de la enfermedad.

Por tanto, el o los niveles de triptófano y/o alanina pueden usarse para valorar la evolución y la gravedad de CMT1A en la población de pacientes.

Niveles de biomarcadores como marcadores tempranos de la eficacia de un tratamiento.

Se valoró el efecto de un tratamiento de 3 meses con baclofeno, naltrexona y sorbitol en los niveles de biomarcadores (tabla 8). Se encuentra un incremento significativo en triptófano (p = 0,018) y alanina (p = 0,04) en los pacientes tratados durante 3 meses con la mezcla (1,56 ± 2,98 pg/ml y 3,05 ± 8,16 pg/ml, respectivamente) en comparación con el placebo (0,43 ± 1,45 pg/ml y 0,75 ± 6,75 pg/ml, respectivamente). Cuando estos dos marcadores se consideran conjuntamente, la significancia del efecto al tratamiento fue incluso mayor (p = 0,0086). De forma destacable, después de 3 meses de tratamiento, no se evidencia ningún cambio sintomático en la población tratada, debido a la naturaleza lenta y progresiva de la enfermedad. Los biomarcadores de la invención proporcionan por tanto herramientas eficientes para determinar la respuesta a un tratamiento.

Tabla 8

Mezcla: mezcla de baclofeno, naltrexona y sorbitol; HD: Dosis Alta de la Mezcla (6 mg de baclofeno, 0,7 mg de naltrexona y 210 mg de sorbitol).

*los datos son los cambios medios desde la línea base (s.d.); Estimación: diferencia del cambio desde la línea base ajustado en Sexo, Edad y Centro, media de mínimos cuadrados (intervalo de confianza del 95 %). (ANCOVA, *p < 0,05).

Niveles de colesterol libre para discriminar a los respondedores de los no respondedores a tratamientos de CMT

Entre los pacientes tratados con baclofeno, naltrexona y sorbitol, se encontró que aquellos para los que se observó un empeoramiento de su afección (no respondedores) después de un año de tratamiento tenían una concentración en plasma de colesterol libre significativamente mayor que los respondedores (p = 0,034) al comienzo del estudio (Fig 1). Por tanto, los biomarcadores de la invención pueden usarse como un predictor de la respuesta o capacidad de respuesta al tratamiento de combinación de baclofeno, naltrexona y sorbitol.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para valorar la evolución de la enfermedad de CMT (Charcot-Marie-Tooth) en un individuo que tiene CMT y está siendo sometido a tratamiento para CMT, método que comprende:

i) determinar los niveles de alanina y triptófano en una muestra biológica de dicho individuo, y

ii) comparar los niveles de alanina y triptófano obtenidos en i) con los niveles de alanina y triptófano, determinados previamente en el mismo individuo antes de comenzar el tratamiento, o en un estadio más temprano de dicho tratamiento, en donde el intervalo de tiempo entre las dos mediciones de los niveles de alanina y triptófano de las etapas i) y ii) es de al menos 2 meses, y en donde un incremento relativo en los niveles de alanina y triptófano es indicativo de una mejoría o estabilización de la enfermedad de CMT en dicho individuo.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el intervalo de tiempo entre las dos mediciones de los niveles de alanina y triptófano de las etapas i) y ii) es de al menos 3 o 4 meses.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el tratamiento se continúa en un individuo en el que se determina un incremento de los niveles de alanina y triptófano.

4. El método de la reivindicación 1, en donde dicho tratamiento comprende administrar baclofeno, naltrexona y sorbitol, o sales de los mismos, a dicho individuo.

5. El método de la reivindicación 1, en donde dicha enfermedad de CMT es CMT 1 A.

6. El método de la reivindicación 1, en donde dicha muestra biológica es una muestra biológica de fluido, preferiblemente sangre o plasma.