ES2880761T3

ES2880761T3 - Procedimiento in vitro para el diagnóstico de cáncer de pulmón

Info

Publication number: ES2880761T3
Application number: ES18703784T
Authority: ES
Inventors: Arrazubi Jackeline Agorreta; Martinez-Polo Daniel Ajona; Badia Luis Montuenga; Villandiego María Josefa Pajares; Oses Rubén Pio
Original assignee: Fundacion para la Investigacion Medica Aplicada; Advanced Marker Discovery SL AMADIX
Current assignee: Fundacion para la Investigacion Medica Aplicada; Advanced Marker Discovery SL AMADIX
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2021-11-25
Anticipated expiration: 2038-02-08
Also published as: CA3052529A1; AU2018217372A1; US20200025765A1; CN110770584A; DK3580567T3; AU2018217372B2; EP3580567B1; EP3361256A1; HUE054864T2; CN110770584B; WO2018146232A1; EP3580567A1; PT3580567T; PL3580567T3

Abstract

Procedimiento in vitro para el diagnóstico o detección del cáncer de pulmón en un sujeto, que comprende: a. Determinar el nivel de al menos el fragmento C4c en una muestra de plasma aislada del sujeto; y b. Comparar el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa (a) con un nivel de control de referencia de dicho fragmento C4c, y c. En el que si el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa (a) es más alto que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el sujeto padece cáncer de pulmón.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento in vitro para el diagnóstico de cáncer de pulmón

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está generalmente relacionada con ensayos de diagnóstico. En particular, la presente invención se refiere al uso de al menos un fragmento C4c como marcador de diagnóstico de cáncer de pulmón. El fragmento C4c también puede ser útil para estimar el riesgo de cáncer de pulmón.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. El cáncer de pulmón comprende dos subtipos histológicos principales: cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Este último representa el 80-85% de todos los casos e incluye los dos tipos de cáncer de pulmón más frecuentes: adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas. Independientemente de la histología, la mayoría de los pacientes con cáncer de pulmón se diagnostican en etapas avanzadas, cuando la enfermedad es casi incurable.

Varias observaciones experimentales sugieren que el complemento, como parte del sistema de vigilancia inmunitaria, se activa en pacientes con enfermedades neoplásicas, incluido el cáncer de pulmón. El sistema del complemento es una parte central de la respuesta inmunitaria innata que se ha desarrollado como una primera defensa contra patógenos o elementos no deseados del huésped. Este sistema consta de más de 30 proteínas solubles, factores reguladores de superficie y receptores que trabajan juntos para lograr una variedad de actividades que van desde la citotoxicidad celular hasta la regulación de la inmunidad adaptativa y la homeostasis tisular. El complemento se puede activar a través de tres rutas principales, la clásica, la alternativa y la lectina, que convergen en la escisión de C3 en C3b. La deposición de C3b conduce a la formación de convertasas C3 que amplifican la respuesta del complemento y, finalmente, promueven la formación de la convertasa C5 y el ensamblaje del complejo de ataque a membrana (MAC). Las tres rutas de activación del complemento se diferencian entre sí en el mecanismo de reconocimiento e iniciación de la diana. La ruta clásica del complemento normalmente se inicia mediante la unión de C1q a regiones Fc de inmunoglobulinas unidas a antígenos (IgG o IgM). C1q junto con C1r y C1s, dos proenzimas de serina proteasa, constituyen el complejo C1, el primer componente de la ruta clásica. El complejo C1 escinde C4 y C2 para producir la ruta clásica C3 convertasa (C4b2a), que es capaz de activar C3. La ruta alternativa se inicia mediante la activación de bajo nivel de C3 a C3b por el C3 hidrolizado espontáneamente y el factor B activado. C3b se puede unir a la membrana de la célula diana y unir al factor B que es escindido por el factor D para formar la ruta alternativa C3 convertasa (C3bBb). La ruta de lectina se activa tras el reconocimiento y la unión de lectina de unión a manosa (MBL) a patrones repetitivos de carbohidratos que contienen residuos de manosa y N-acetilglucosamina en superficies de patógenos. MBL forma un complejo similar a C1 con serina proteasas asociadas a MBL (MASP). Los cambios de conformación en MBL conducen a la escisión y activación de los componentes del complemento C4 y C2, que continúan activando como en la ruta clásica. En las tres rutas, la escisión y activación de C3 da como resultado el depósito de C3b en la superficie de la célula diana, lo que lleva a la activación de los componentes C5-C9 y la formación del complejo de ataque de membrana (MAC) citolítico que se une a las membranas de la célula, altera la integridad de la membrana y facilita la lisis celular. Finalmente, a lo largo de la cascada del complemento, se liberan C4a, C3a y C5a. Estos péptidos, conocidos como anafilatoxinas, se generan mediante la proteólisis de los componentes del complemento C4, C3 y C5 y ejercen diversas funciones biológicas importantes para el inicio y mantenimiento de respuestas inflamatorias.

En el caso de los tumores de pulmón, los análisis inmunohistoquímicos revelaron el depósito de C3b en los tumores primarios, con una aparente falta de activación del MAC lítico. Además, se encontraron niveles elevados de complemento que se correlacionan con el tamaño del tumor en pacientes con cáncer de pulmón y los componentes del complemento C3c y C4 estaban significativamente elevados en pacientes con cáncer de pulmón en comparación con un grupo de control. Muchos estudios proteómicos también han reportado una elevación de los componentes del complemento en el plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Utilizando análisis funcionales, hemos propuesto previamente que las células de NSCLC activan el complemento de manera más eficiente que sus contrapartes no malignas. Estos análisis demuestran que C1q se une directamente a las células de cáncer de pulmón y activa la ruta clásica de forma independiente de los anticuerpos. De acuerdo con esta observación, C4d, un producto de la división del complemento derivado de la activación de la ruta clásica, se encuentra depositado en tumores primarios de pulmón (Ajona D, Pajares MJ, Corrales L, Perez-Gracia JL, Agorreta J, Lozano MD, Torre W, Massion PP, de-Torres JP, Jantus-Lewintre E, Camps C, Zulueta JJ, Montuenga LM, Pio R. Investigation of complement activation product c4d as a diagnostic and prognostic biomarker for lung cancer [Investigación del producto de activación del complemento c4d como biomarcador de diagnóstico y pronóstico del cáncer de pulmón[. J Natl Cancer Inst 2013; 105: 1385-1393). La forma madura de C4 contiene tres cadenas (a, p y y) (Figura 1). Después de la activación del complemento, C1s escinde un enlace peptídico único en la cadena alfa y genera C4b. Esta escisión implica un cambio conformacional que conduce a la exposición de un grupo tioéster. Este grupo activado se puede unir covalentemente a las superficies de las células diana mediante enlaces amida o éster. C4b unido a la superficie se combina con C2a para formar el complejo C4b2a, la C3-convertasa de la ruta clásica. Para proteger a las células huésped normales de la destrucción de la activación inespecífica, la activación de la cascada del complemento está muy controlada por varias proteínas reguladoras. Por consiguiente, C4b es escindido por el factor proteico regulador I en iC4b, y finalmente en C4c y C4d. C4c se libera al medio extracelular después de la fragmentación de C4, mientras que la mayor parte del C4d permanece unido covalentemente a la membrana plasmática. Los niveles de fragmentos que contienen C4d pueden elevarse significativamente en muestras de pacientes con una variedad de enfermedades autoinmunes (artritis reumatoide, angioedema hereditario, lupus eritematoso sistémico, etc.), en los que se sabe que ocurre la activación de la ruta clásica del complemento. La detección de C4d también es un marcador establecido para el rechazo mediado por anticuerpos en el rechazo de aloinjertos.

Con base en la observación de que las células de cáncer de pulmón son capaces de activar la ruta clásica y, por consiguiente, de inducir la proteólisis de C4, se propuso una nueva estrategia para evaluar la posibilidad de utilizar elementos específicos de esta ruta como biomarcadores de cáncer de pulmón, siempre que estos elementos puedan detectarse en fluidos biológicos. Esta estrategia se basó en la determinación de fragmentos de C4 activado que contienen C4d (un término que comprende las moléculas C4b, iC4b y C4d).

Los marcadores de cáncer pueden proporcionar orientación para el tratamiento clínico de los pacientes. Pueden ser útiles para predecir el riesgo de un individuo de desarrollar cáncer, diagnóstico temprano, evaluación diagnóstica de un paciente con sospecha de cáncer, predicción de la agresividad del tumor (valor pronóstico), orientación sobre la selección de la terapia más adecuada (valor predictivo) y monitorización de la respuesta del paciente a un tratamiento específico y de la posible recaída de la enfermedad tras el tratamiento. Se debe encontrar un biomarcador exitoso en muestras obtenidas de procedimientos relativamente no invasivos y estar asociado con una alta sensibilidad y especificidad. Una de las muestras más adecuadas para evaluar biomarcadores es la sangre (plasma o suero), un tipo de muestra que se puede recolectar de manera fácil y económica mediante procedimientos mínimamente invasivos. Aunque se han producido avances significativos en la comprensión de las alteraciones moleculares y genéticas en el cáncer de pulmón, en la actualidad no existen marcadores moleculares disponibles que puedan utilizarse de forma rutinaria para la evaluación de riesgos, la detección temprana, el diagnóstico, el pronóstico o el seguimiento de la respuesta al tratamiento en el cáncer de pulmón.

La falta de técnicas o biomarcadores adecuados para la detección temprana es una de las principales razones detrás de las pésimas estadísticas relacionadas con los resultados clínicos del cáncer de pulmón. En la actualidad, solo el 20% de los pacientes son diagnosticados en etapas tempranas (I y II), cuando es posible la intervención quirúrgica. Este escenario puede cambiar en el futuro, ya que se dedican grandes esfuerzos a aumentar significativamente el porcentaje de estos casos detectados temprano. En este sentido, los estudios de detección de cáncer de pulmón basados en tomografía circular (CT) de dosis baja han reportado altas tasas de detección de cánceres pequeños en etapas tempranas. El National Lung Screening Trial (NLST), que incluyó a más de 50.000 participantes, concluyó que la detección con el uso de CT espiral detecta tumores pulmonares en etapas tempranas (principalmente en etapa I) y reduce la mortalidad por cáncer de pulmón. El Grupo de Trabajo de Servicios Preventivos de EE. UU. recomienda la detección anual del cáncer de pulmón con CT de dosis baja en adultos, de 55 a 80 años, que tienen antecedentes de tabaquismo de 30 paquetes-año y que actualmente fuman o han dejado de fumar en los últimos 15 años. Otras muchas instituciones, como la American Lung Association, la National Comprehensive Cancer Network y la American Cancer Society, también hacen recomendaciones similares. Desde febrero de 2015, los beneficiarios de Medicare que cumplen con los criterios de inclusión están cubiertos para la detección del cáncer de pulmón.

Un aspecto crítico en los programas de detección por CT es el tratamiento de nódulos pulmonares indeterminados. La tasa promedio de detección de nódulos pulmonares en los ensayos clínicos aleatorizados de detección con CT de dosis baja es de alrededor del 25%, y la gran mayoría de ellos (alrededor del 96%) son benignos. Por lo tanto, una predicción adecuada de neoplasias malignas una vez que se detecta un nódulo pulmonar en sujetos sometidos a detección reduciría el número de rondas de detección por CT, los procedimientos de seguimiento de diagnóstico innecesarios (y el riesgo asociado de morbilidad) y el coste para los sistemas sanitarios.

Se han propuesto varios modelos predictivos que permiten la cuantificación del riesgo de neoplasias malignas para un nódulo dado. Estos modelos tienen en cuenta factores clínicos y demográficos, así como análisis cuantitativos y cualitativos de imágenes de nódulos obtenidas de escaneos por CT y tomografías por emisión de positrones. Sin embargo, las herramientas predictivas actuales para diferenciar los nódulos benignos de los malignos no son óptimas y el desarrollo de biomarcadores moleculares complementarios puede ser muy útil.

El documento de patente WO2013/143940 puede ser considerado como la técnica anterior más cercana dado que está dirigido a un propósito similar al de la invención (diagnóstico de cáncer de pulmón). A modo de breve resumen, WO2013/143940 divulga un procedimiento para el diagnóstico de cáncer de pulmón utilizando el nivel de fragmentos de activación de C4, específicamente el nivel de C4d. La presente invención se diferencia de WO2013/143940 en que está dirigida a un procedimiento para el diagnóstico de cáncer de pulmón utilizando precisamente el nivel de C4c. El uso de C4c conduce a la invención a la inesperada propiedad de lograr un procedimiento para el diagnóstico de cáncer de pulmón que ofrece un mayor rendimiento (básicamente niveles más altos de sensibilidad y especificidad) en comparación con otros procedimientos divulgados en la técnica anterior. Como se puede apreciar en el Ejemplo 1 de la presente invención, C4c tiene un mejor desempeño que C4d en el diagnóstico de cáncer de pulmón. Específicamente, la Tabla 4 de la presente invención muestra que C4c ofrece mayores valores de sensibilidad y especificidad en comparación con C4d. Como se cita en el Ejemplo 3 de la presente invención: "Este análisis evidencia que las muestras de plasma tomadas de pacientes con cáncer de pulmón en etapas tempranas (I y II) contienen niveles más altos de C4c que las muestras de plasma tomadas de individuos de control. Además, la determinación de este biomarcador tiene un rendimiento diagnóstico significativamente superior a la determinación de C4d, otro fragmento proteolítico derivado de la activación del complemento propuesto previamente como marcador diagnóstico para el cáncer de pulmón". No hay ninguna sugerencia en WO2013/143940 de que C4d pueda ser reemplazado por C4c con el propósito de mejorar el rendimiento del procedimiento divulgado por WO2013/143940. Por consiguiente, no existe el menor incentivo para que el experto en la técnica elija C4c con una expectativa razonable de lograr un procedimiento para el diagnóstico de cáncer de pulmón que ofrezca un mayor rendimiento en comparación con la técnica anterior. De hecho, WO2013/143940 no da ninguna indicación de que la selección de C4c tenga un impacto en la mejora del rendimiento de dicho procedimiento.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

El uso de biomarcadores en el contexto de los programas de detección de cáncer de pulmón tiene un potencial enorme. En particular, discriminar si los nódulos pulmonares incidentales o detectados por cribado son malignos o benignos representa uno de los problemas clínicos más urgentes en la detección temprana del cáncer de pulmón. Desafortunadamente, las herramientas de predicción actuales para diferenciar los nódulos benignos de los malignos no son óptimas y la investigación sobre el cáncer aún no ha logrado el objetivo de producir un marcador que pueda ser utilizado de forma rutinaria en la clínica.

Algunos estudios habían determinado previamente la presencia de componentes del complemento en fluidos biológicos de pacientes con cáncer de pulmón. Se obtuvieron resultados prometedores mediante la determinación de fragmentos de C4 activado que contienen C4d que, como se muestra en la Figura 1, comprende las moléculas C4b, iC4b y C4d. La cuantificación de estos marcadores en fluidos biológicos de pacientes con cáncer de pulmón podría ser de utilidad clínica para la evaluación de riesgos, el diagnóstico y el seguimiento de la respuesta.

La presente invención evidencia sorprendentemente que la determinación del fragmento C4c (aquí también abreviado como C4c), otro elemento producido a partir de C4 después de la activación del complemento, proporciona una ventaja sustancial sobre la determinación de otros fragmentos de la proteólisis C4 en el diagnóstico de cáncer de pulmón. En particular, el fragmento C4c se puede determinar en una muestra de plasma de una manera significativa para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un sujeto (véase el Ejemplo 1, en particular la Tabla 4, la Figura 8 y la Tabla 11). Además, un modelo definido por la combinación de C4c con otros marcadores proteicos, a saber, CYFRA 21-1 y/o proteína C reactiva (CRP) y/o prolactina, produce un mejor rendimiento diagnóstico que la determinación de C4c sola. La presente invención también evidencia que la cuantificación de C4c, y su combinación con los marcadores mencionados anteriormente, puede proporcionar información sobre si un nódulo pulmonar indeterminado sospechoso es maligno o no. Además, esta información se puede combinar con datos epidemiológicos y clínicos para generar un modelo de diagnóstico para la predicción de neoplasias malignas. La presente invención puede mejorar las eficacias de diagnóstico y cribado, en particular al discriminar cuál de los nódulos, encontrado de forma incidental o detectado por cribado, puede necesitar un seguimiento más activo. La aplicación de la presente invención se puede utilizar para mejorar el manejo clínico de los nódulos pulmonares, reduciendo el número de procedimientos invasivos potencialmente dañinos que se llevan a cabo para diagnosticar la enfermedad.

Por consiguiente, la primera realización de la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para el diagnóstico o detección de cáncer de pulmón en un sujeto que comprende: a) determinar el nivel de al menos el fragmento C4c en una muestra obtenida del sujeto; comparar el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa (a) con un nivel de control de referencia de dicho fragmento C4c, y en el que si el nivel del fragmento C4c determinado en la etapa (a) es mayor que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el sujeto sufre de cáncer de pulmón y/o que los nódulos pulmonares presentes en el sujeto se consideran malignos. En una realización preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un sujeto que comprende: a) determinar los niveles de fragmento C4c y prolactina, fragmento C4c y CYFRA 21-1, fragmento C4c y CRP, fragmento C4c y prolactina y CYFRA 21-1, fragmento C4c y prolactina y CRP, o fragmento C4c y CYFRA 21-1 y CRP, o fragmento C4c y CYFRA 21-1 y CRP y prolactina, en una muestra obtenida del sujeto; y comparar los niveles determinados en la etapa (a) con los niveles de control de referencia de dichos biomarcadores, y en el que si los niveles determinados en la etapa (a) son más altos que los niveles de control de referencia, es indicativo de que el sujeto padece cáncer de pulmón y/o que los nódulos pulmonares presentes en el sujeto se consideran malignos. En una realización preferente de la invención, el cáncer de pulmón se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de pulmón de células pequeñas. En una realización preferente de la invención, la muestra se selecciona de: sangre, plasma, suero, líquido de lavado broncoalveolar, esputo, biopsia y muestras quirúrgicas. Se prefiere particularmente una muestra de plasma.

En una realización preferente de la invención, el sujeto a cribar es un individuo con alto riesgo de cáncer de pulmón, tal como se define en la presente invención y se apoya en el Ejemplo 4 y en la Figura 11. En otras palabras, en una realización preferente, la presente invención se refiere a un procedimiento para el cribado de individuos asintomáticos mayores de 40 años con antecedentes de tabaquismo.

La segunda realización de la invención se refiere al uso de al menos el fragmento C4c en el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón o para la determinación in vitro de si se trata de un nódulo pulmonar indeterminado, identificado por ejemplo mediante el uso de una técnica de imagen (como la tomografía computarizada), es o no maligno. En una realización preferente, la presente invención se refiere al uso de una combinación de biomarcadores que comprende fragmento C4c y prolactina, fragmento C4c y CYFRA 21-1, fragmento C4c y CRP, fragmento C4c y prolactina y CYFRA 21-1, fragmento C4c y prolactina y CRP, o fragmento C4c y CYFRA 21-1 y CRP, o fragmento C4c y CYFRA 21-1 y CRP y prolactina, en un procedimiento para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón o para la determinación in vitro de si un nódulo pulmonar indeterminado, identificado mediante el uso de técnicas de imagen (como la tomografía computarizada), es o no maligno. En una realización preferente de la invención, el cáncer de pulmón se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de pulmón de células pequeñas. En una realización preferente de la invención, la muestra se selecciona de: sangre, plasma, suero, líquido de lavado broncoalveolar, esputo, biopsia y muestras quirúrgicas. Se prefiere particularmente una muestra de plasma.

Como se explicó anteriormente, es importante señalar que las técnicas de imagen (como la tomografía computarizada) se utilizan comúnmente en la actualidad para el diagnóstico de cáncer de pulmón y que dichas técnicas de imagen están asociadas con un alto porcentaje de falsos positivos, particularmente en el caso de detección de nódulos indeterminados. Desafortunadamente, las herramientas actuales para diferenciar los nódulos benignos de los malignos no son óptimas, y la investigación del cáncer aún no ha logrado el objetivo de producir un marcador que pueda usarse de forma rutinaria en la clínica. Por consiguiente, un alto porcentaje de pacientes son diagnosticados erróneamente de cáncer de pulmón y son sometidos a procedimientos invasivos innecesarios que aumentan el costo del Sistema de Salud Gubernamental.

Por consiguiente, un ejemplo preferente de la presente divulgación se dirige a técnicas de imagenología complementadas con la información de diagnóstico/pronóstico obtenida de los biomarcadores, tal como se divulga en las realizaciones de la presente invención. Se enfatiza que esta realización requiere la obtención de imágenes de un paciente y la información obtenida de dicha técnica de imagen se complementa con la información proporcionada por los biomarcadores como se divulga en las realizaciones uno a cinco de la presente invención, tal combinación de características equivale significativamente a más de un fenómeno natural o idea abstracta. Dado que la medición del nivel de dichos biomarcadores que comprenden el fragmento C4c ofrece una mayor sensibilidad y especificidad que las técnicas de imagen comúnmente utilizadas, se reduce el porcentaje de falsos positivos. Por consiguiente, también se reduce el número de técnicas invasivas que se suelen realizar una vez que se obtiene un resultado positivo de las técnicas de imagen. De este modo, la presente invención ofrece significativamente más en comparación con el estándar actual para el diagnóstico de cáncer de pulmón, ya que la combinación de la técnica de imagen con el nivel de dichos biomarcadores que comprenden C4c mejora el diagnóstico de un paciente en riesgo de padecer cáncer de pulmón que ha sido mal diagnosticado con técnicas de imagen previas o de un paciente que se sabe que tiene un nódulo pulmonar indeterminado.

Por consiguiente, un ejemplo adicional de la presente divulgación se dirige a un procedimiento in vitro para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un sujeto que comprende: obtener imágenes del sujeto para detectar cáncer de pulmón; y a) determinar el nivel de al menos el fragmento C4c en una muestra de sangre (plasma o suero) del sujeto poniendo en contacto la muestra de prueba con un reactivo que se une selectivamente al fragmento C4c; y b) comparar el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa a) con un nivel de control de referencia de dicho fragmento C4c, y c) en el que la obtención de imágenes y la etapa de determinación (a) se pueden realizar en cualquier orden y en el que si el nivel del fragmento C4c determinado en la etapa (a) es superior al nivel de control de referencia, es indicativo de que el sujeto padece cáncer de pulmón y/o que los nódulos pulmonares presentes en el sujeto se consideran malignos.

Para el propósito de la presente invención se proporcionan las siguientes definiciones:

• El término "que comprende" significa que incluye, pero no se limita a, todo lo que sigue a la palabra "comprende". Por lo tanto, el uso del término "que comprende" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, pero que otros elementos son opcionales y pueden estar presentes o no.

• Por "que consiste en" se entiende que incluye, y se limita a, todo lo que sigue a la frase "que consiste en".

De este modo, la frase "que consiste en" indica que los elementos enumerados son requeridos u obligatorios, y que no pueden estar presentes otros elementos.

• El término "referencia" o "nivel de control", cuando se refiere al nivel del fragmento C4c descrito en la presente invención, se refiere al nivel observado en pacientes que no padecen cáncer de pulmón. Es probable que el paciente padezca cáncer de pulmón con una sensibilidad y especificidad determinadas si los niveles de C4c en el paciente están por encima de dicha "referencia" o dicho "nivel de control".

• Para el propósito de la presente invención, el término "individuo/sujeto/paciente con alto riesgo de cáncer de pulmón" se define de acuerdo con los criterios de inclusión del National Lung Screening Trial (NLST) con sede en EE. UU. y/o de conformidad con el protocolo de selección del International Early Lung Cancer Action Program (I-ELCAP); en el primer caso comprende individuos asintomáticos de 55 a 74 años con un mínimo de 30 paquetes-año de tabaquismo y no más de 15 años desde que dejaron de fumar. Esta propuesta ha sido respaldada por varias sociedades destacadas como la American Cancer Society, el American College of Chest Physicians, la American Society of Clinical Oncology, la National Comprehensive Cancer Network, la Asociación Internacional para el Estudio del Cáncer de Pulmón y la US Preventive Services Task Force (USPSTF). La USPSTF recomienda la detección anual de cáncer de pulmón con LDCT en adultos de 55 a 80 años que tienen antecedentes de tabaquismo de 30 paquetes-año y que actualmente fuman o han dejado de fumar en los últimos 15 años. En el segundo caso, el consorcio internacional I-ELCAP comprende sujetos asintomáticos, pero otros parámetros pueden variar entre las instituciones participantes de I-ELCA^p, especialmente en cuanto a la edad y los antecedentes de tabaquismo. En este caso particular, la edad es mayor de 40 años y deben tener antecedentes de tabaquismo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Estructura del componente del complemento C4 y sus fragmentos proteolíticos.

Figura 2. Cuantificación de C4d (A) y C4c (B) en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana e individuos de control.

Figura 3. Correlación entre los niveles plasmáticos de C4d y C4c tanto en individuos de control como en pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana (A), solo individuos de control (B) o solo pacientes con cáncer de pulmón (C).

Figura 4. Curvas ROC obtenidas de la cuantificación de C4d (A) y C4c (B) en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón temprano e individuos de control.

Figura 5. Cuantificación de 24 biomarcadores relacionados con el cáncer en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana e individuos de control medidos con tecnología Luminex.

Figura 6. Cuantificación de IL6 (A), prolactina (B), CYFRA 21-1 (C) y CRP en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana e individuos de control que utilizan tecnología Cobas, y correlación de los niveles de IL6 (A) , prolactina (B) y CYFRA 21-1 (C) medidos con tecnologías Luminex y Cobas. Cabe destacar que no se muestra ninguna correlación para CRP porque este marcador no fue determinado por la tecnología Luminex.

Figura 7. Curva ROC obtenida del modelo de diagnóstico basado en la cuantificación de C4c, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón temprano e individuos de control.

Figura 8. Curvas ROC de la cuantificación de C4c (A) y C4c/CYFRA 21-1/CRP (B) en muestras de plasma de pacientes con nódulos pulmonares malignos y no malignos.

Figura 9. Curvas ROC para la discriminación entre nódulos pulmonares benignos y malignos obtenidas mediante un modelo de diagnóstico basado en la cuantificación de C4c en muestras de plasma y las características clínicas de edad, tabaquismo, antecedentes de tabaquismo y tamaño del nódulo (A), o en función de la cuantificación de C4c, CYFRA 21-1 y CRP en muestras de plasma y las mismas características clínicas (B).

Figura 10. Curvas ROC para la discriminación entre nódulos pulmonares benignos y malignos obtenidas mediante el modelo de diagnóstico de Gould (A), un modelo basado en el modelo de Gould y la cuantificación de C4c en plasma (B), o un modelo basado en el modelo de Gould y la cuantificación de C4c, CYFRA 21-1 y CRP en plasma (C).

Figura 11. Curvas ROC obtenidas del modelo de diagnóstico basado en la cuantificación de C4c (A), C4c/CYFRA (B) y C4c/CYFRA/CRP (C) en muestras de plasma del cribado de individuos con alto riesgo de cáncer de pulmón.

Descripción detallada de la invención

Ejemplo 1. C4c tiene un mejor rendimiento que C4d en el diagnóstico de cáncer de pulmón.

Descripción del experimento

Se determinaron fragmentos que contenían C4c y C4d (en lo sucesivo denominados C4d) en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana e individuos de control.

Materiales y procedimientos

En la Clínica Universidad de Navarra, se obtuvieron muestras de plasma de 39 pacientes con cáncer de pulmón resecable quirúrgicamente en etapas tempranas (I y II) y de 39 personas sanas (emparejadas por sexo, edad e historial de tabaquismo). En la Tabla 1 se muestra un resumen de las características de estos pacientes y controles. Los tumores de pulmón fueron clasificados de conformidad con la clasificación de la Organización Mundial de la Salud de 2004.

Tabla 1. Características epidemiológicas y clínicas de casos y controles.

Características ^{Individuos de}Pacientes con

_Controlcáncer de pulmón

Sexo

Masculino 34 34

Femenino 5 5

Edad

< 70 años 30 31

>70 años 9 8

Estado de tabaquismo

Ex-fumador* 27 26

Fumador actual 12 13

Histología

Adenocarcinoma 19

Carcinoma de células escamosas 20

Tamaño del nodulo

<3 cm 22

>3 cm 17

Etapa

*También incluye uno que nunca ha fumado

Se centrifugaron muestras de plasma a 300 g durante 10 min y se recogieron los sobrenadantes. Las muestras se almacenaron a -80 °C hasta su análisis. C4d se determinó usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) disponible comercialmente (A008, Quidel). El ensayo reconoce todos los fragmentos de C4 activado que contienen C4d (incluyendo C4b, iC4b y/o C4d). Los fragmentos de C4 activado que contienen C4d se denominan en este documento C4d. Los niveles de C4c se determinaron como se describió anteriormente y se expresaron como unidades arbitrarias [Pilely K, Skjoedt MO, Nielsen C, Andersen TE, Louise Aabom A, Vitved L, Koch C, Skj0dt K, Palarasah Y. A specific assay for quantification of human C4c by use of an anti-C4c monoclonal antibody {Un ensayo específico para la cuantificación de C4c humana mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-C4c}. J Immunol Methods 2014; 405: 87-96].

Se generaron curvas de característica operativa del receptor (ROC) para evaluar el rendimiento diagnóstico de los biomarcadores. También se evaluaron otros parámetros como sensibilidad, especificidad, valor predictivo positivo, valor predictivo negativo, índice de probabilidad positiva y índice de probabilidad negativa. Los análisis estadísticos se realizaron con STATA/IC 12.1.

Resultados

Los niveles de C4d en muestras de plasma de individuos de control y pacientes con cáncer de pulmón fueron de 0,79 ± 0,28 |jg/ml frente a 1,00 ± 0,46 jg/ml, respectivamente (Figura 2A). En el caso de C4c, los niveles plasmáticos fueron de 88 ± 30 AU en individuos de control y de 164 ± 60 AU en pacientes con cáncer de pulmón (Figura 2B). Las asociaciones entre los niveles de estos dos marcadores moleculares y el sexo, la edad, el tabaquismo, la histología, el tamaño del nódulo y la etapa se muestran en la Tabla 2 y la Tabla 3.

Tabla 2. Asociación entre los niveles plasmáticos de C4d y las características clínico-patológicas de los casos de cáncer de pulmón y controles.

Controles Casos

Características C4d (Mg/ml) Valor P1 C4d (Mg/ml) Valor p1 Sexo

Masculino 0,78±0,30 0,737 1,03±0,47 0,172 Femenino 0,77±0,09 0,79±0,11

Edad (años)

<70 0,75±0,28 0,257 1,02±0,48 0,767

>70 0,89±0,30 0,91 ±0,24

Estado de tabaquismo

Ex-fumador 0,73±0,24 0,361 1,04±0,50 0,290 Fumador actual 0,88±0,35 0,91 ±0,32

Histología

Adenocarcinoma 0,88±0,20 0,221 Carcinoma de células escamosas 1,11 ±0,57

Tamaño del nódulo

< 3 cm 0,90±0,29 0,130 >3 cm 1,13±0,58

Etapa

0,93±0,34 0,044 1,28±0,69

eba U de Mann-Whitney

Tabla 3. Asociación entre los niveles plasmáticos de C4c y las características clínico-patológicas de los casos de cáncer de pulmón y controles.

Controles Casos Características C4c (AU)1 Valor P2 C4c (AU)1 Valor p2 Sexo

Masculino 89±31 0,801 166±63 0,614 Femenino 83±21 154±34

Edad (años)

<70 84±28 0,243 162±61 0,835

>70 100±32 170±58

Estado de tabaquismo

Ex-fumador 87±30 0,831 162±65 0,882 Fumador actual 91 ±30 167±52

Histología

Adenocarcinoma 157±54 0,431 Carcinoma de células escamosas 171±66

Tamaño del nódulo

<3 cm 155±65 0,223

>3 cm 176±53

Etapa

I 159±58 0,251

II 184±66

1AU: Unidades arbitrarias. 2Prueba U de Mann-Whitney

Los estudios de correlación mostraron que la cuantificación de C4d y la cuantificación de C4c no eran equivalentes. Por lo tanto, solo se observó una asociación débil entre ambos marcadores cuando todas las muestras se analizaron conjuntamente (Figura 3A). Además, esta asociación desapareció cuando los controles y los casos se analizaron por separado (Figura 3B-C).

Para evaluar la capacidad de los marcadores para discriminar entre casos y controles, se generaron curvas ROC (Figura 4). Las áreas bajo la curva ROC fueron 0,69 (IC del 95% = 0,57-0,81) para C4d y 0,86 (IC del 95% = 0,77-0,95) para C4c. El área bajo la curva de C4c fue significativamente mejor que la de C4d (p = 0,001). Asimismo, el rendimiento de C4c fue superior al de C4d en todas las demás características diagnósticas analizadas (Tabla 4).

Tabla 4. Rendimiento diagnóstico de la determinación de los niveles de C4d y C4c en muestras de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana.

C4d C4c

Sensibilidad 51% 78% Especificidad 67% 95% Valor predictivo positivo 61% 93%

Valor predictivo negativo 58% 77%

Índice de probabilidad positiva 1,54 14,00

Índice de probabilidad negativa 0,73 0,30

Clasificado correctamente 59% 83%

Conclusión

Este análisis evidencia que las muestras de plasma tomadas de pacientes con cáncer de pulmón en etapas tempranas (I y II) contienen niveles más altos de C4c que las muestras de plasma tomadas de individuos de control. Además, la determinación de este biomarcador tiene un rendimiento diagnóstico significativamente superior a la determinación de C4d, otro fragmento proteolítico derivado de la activación del complemento propuesto previamente como marcador diagnóstico del cáncer de pulmón.

Ejemplo 2. La combinación de C4c con otros marcadores de cáncer aumenta su potencial diagnóstico.

Descripción del experimento

Se evaluó el rendimiento diagnóstico de varios marcadores de cáncer en el conjunto de pacientes descritos en el Ejemplo 1. La información diagnóstica proporcionada por la cuantificación de algunos de estos marcadores se utilizó para mejorar la precisión diagnóstica de C4c.

Materiales y procedimientos

Las características epidemiológicas y clínicas de los pacientes con cáncer de pulmón en etapa temprana se describen en el Ejemplo 1. La evaluación analítica de los marcadores de cáncer se realizó en muestras de plasma usando el Panel de Perlas Magnéticas de Biomarcadores de Cáncer Circulante Humano 1 (HCCBP1MAG-58K, Millipore) con tecnología Luminex. Los marcadores analizados fueron: AFP, PSA Total, CA15-3, CA19-9, MIF, TRAIL, leptina, IL-6, sFasL, CEA, CA125, IL-8, HGF, sFas, TNFa, prolactina, SCF, CYFRA 21-1, OPN, FGF2, p-HCG, HE4, TGFa, VEGF. También se utilizó un analizador Cobas (Roche) para la determinación de IL6, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP. Se utilizó regresión logística para generar los modelos de diagnóstico.

Resultados

Los resultados de la evaluación de los 24 marcadores de diagnóstico potenciales con tecnología Luminex se muestran en la Tabla 5 y la Figura 5. Se encontraron diferencias significativas entre los controles y los casos en los niveles plasmáticos de IL6, prolactina y CYFRA 21-1.

Tabla 5. Niveles de marcadores (media ± SD) en muestras de plasma de individuos de control y pacientes con cáncer de pulmón en etapas tempranas, según lo determinado por la tecnología Luminex.

Marcador Controles Casos Valor p1 AFP (pg/ml) 5509±23409 1696±951 0,893

PSA Total (pg/ml) 956±1174 714±888 0,475 CA15-3 (U/ml) 13,3±11,7 11,2±6,5 0,549 CA19-9 (U/ml) 21,0±9,8 20,5±9,8 0,877

MIF (pg/ml) 1526±1002 1550±2314 0,124 TRAIL (pg/ml) 183±102 168±63 0,916 Leptina (pg/ml) 25304±22950 24553±16283 0,586

IL6 (pg/ml) 11,8±27,4 6,9±4,1 0,022 sFASL (pg/ml) 56,3±146 21,3±14,5 0,455

CEA (pg/ml) 1326±986 3382±9251 0,738 CA125 (U/ml) 11,1 ±25,0 6,2±3,5 0,319

IL8 (pg/ml) 5,8±5,6 8,4±11,3 0,254

HGF (pg/ml) 300±365 228±53 0,340 sFAS (pg/ml) 2273±1018 2054±855 0,463 TNFa (pg/ml) 10,4±9,1 9,1±2,4 0,996 Prolactina (pg/ml) 8759±5885 16442±18237 0,032

SCF (pg/ml) 59,8±52,4 54,0±19,1 0,569 CYFRA 21-1 (pg/ml) 1294±537 3797±5529 <0,001

OPN (pg/ml) 50181 ±25313 59616±31881 0,310 FGF2 (pg/ml) 162±140 138±48,9 0,798 bHCG (mU/ml) 0,32±1,2 0,09±0,26 0,864

HE4 (pg/ml) 7148±11785 5036±2303 0,860 TGFa (pg/ml) 106±597 1,5±4,2 0,890 VEGF (pg/ml) 74,9±231 40±106 0,847 1Prueba U de Mann-Whitney

A continuación, se validaron los resultados obtenidos para IL6, prolactina y CYFRA 21-1 utilizando tecnología Cobas. Cabe destacar que CYFRA 21-1 no se pudo determinar en una muestra de control. También se evaluaron las correlaciones entre las tecnologías Luminex y Cobas para cada uno de estos marcadores. Además, se analizaron los niveles de CRP, un biomarcador que no estaba presente en el panel de Millipore. Los resultados de estos análisis se muestran en la Tabla 6 y la Figura 6. Todos los marcadores mostraron diferencias significativas entre casos y controles.

Tabla 6. Niveles de marcadores (media ± SD) en muestras de plasma de individuos de control y pacientes con cáncer de pulmón en etapas tempranas, según lo determinado por la tecnología Cobas.

Marcador Controles Casos Valor p1

IL6 (pg/ml) 6,7±10,4 9,5±8,3 0,015

Prolactina (pg/ml) 8330±5970 15389±18385 0,003

CYFRA 21-1 (pg/ml) 1294±537 3797±5529 <0,001

CRP (pg/ml) 2803±3844 14692±24412 0,004

''Prueba U de Mann-Whitney

El siguiente objetivo fue desarrollar modelos de diagnóstico usando combinaciones de los niveles de C4c y estos cuatro marcadores (IL6, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP). Para ello, en primer lugar, se realizó un análisis univariado de cada uno de los marcadores para determinar su capacidad predictiva individual. Como se muestra en la Tabla 7, IL6 no predijo neoplasias malignas y, por lo tanto, no se incluyó en el análisis multivariado.

Tabla 7. Regresión logística simple para la evaluación de C4c, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP como posibles marcadores de diagnóstico en cáncer de pulmón.

Marcador LR chi2 Valor p

C4c 39,18 <0,001

IL6 1,80 0,180

Prolactina 7,40 0,006

CYFRA 21-1 24,38 <0,001

CRP 14,52 <0,001

LR chi2: prueba de chi-cuadrado de índice de probabilidad

Se desarrolló un modelo multivariado usando los niveles plasmáticos de C4c, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP. Cabe destacar que el individuo en el que no se pudo determinar CYFRA 21-1 fue retirado del análisis multivariado. El análisis de regresión logística multivariante generó un modelo con un valor de 52,09 para la prueba de chi-cuadrado de índice de probabilidad (p < 0,001). Las probabilidades predichas del modelo se compararon con los diagnósticos finales y se construyó una curva ROC. El área bajo la curva ROC fue 0,91 (IC del 95% = 0,83-0,98) (Figura 7). Otras características diagnósticas del modelo se muestran en la Tabla 7. Este modelo de diagnóstico multivariado que incluye los cuatro marcadores fue capaz de clasificar correctamente un porcentaje mayor de sujetos que el C4c solo (87% vs 83%).

Tabla 7. Rendimiento del modelo de diagnóstico de cáncer de pulmón basado en los niveles plasmáticos de C4c, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP.

C4c/Prolactina/CYFRA 21-1/CRP

Sensibilidad 82%

Especificidad 92%

Valor predictivo positivo 91%

Valor predictivo negativo 83%

Índice de probabilidad positiva 10,39

Índice de probabilidad negativa 0,19

Clasificado correctamente 87%

Las asociaciones entre las probabilidades predictivas de neoplasias malignas derivadas del modelo y las características clínico-patológicas de los pacientes y controles se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8. Asociación entre las probabilidades obtenidas del modelo multivariado, en función de los niveles plasmáticos de C4c/Prolactina/CYFRA 21-1/CRP, y las características de los pacientes y controles con cáncer de pulmón.

Controles Casos Características

Puntaje Valor p1 Puntaje Valor p1 Sexo

Masculino 0,23±0,19 0,915 0,78±0,32 0,166 Femenino 0,22±0,16 0,76±0,17

Edad (años)

< 65 0,18±0,19 0,015 0,74±0,32 0,237

>65 0,28±0,17 0,82±0,28

Estado de tabaquismo

Ex-fumador 0,23±0,19 0,730 0,79±0,30 0,766 Fumador actual 0,22±0,19 0,77±0,31

Histología

Adenocarcinoma 0,69±0,31 0,012 Carcinoma de células escamosas 0,86±0,26

Tamaño del nódulo

<3 cm 0,70±0,33 0,019

>3 cm 0,89±0,22

Etapa

0,186

1 Prueba U de Mann-Whitney

También se generaron modelos multivariados basados en C4c y diferentes combinaciones de los otros tres marcadores. La Tabla 9 muestra las áreas bajo las curvas ROC y los porcentajes de eventos correctamente clasificados de estas combinaciones. En la mayoría de los casos, los modelos combinados mejoraron las características de diagnóstico de C4c sola.

Tabla 9. Modelos de diagnóstico basados en C4c generados por regresión logística utilizando diferentes combinaciones de C4c y prolactina, CYFRA 21-1 y/o CRP.

Marcadores en el modelo Área bajo la curva Eventos clasificados correctamente C4c 0,87 (IC del 95%=0,77-0,95) 83% C4c/Prolactina 0,87 (IC del 95%=0,79-0,95) 82%

C4c/ CYFRA 21-1 0,91 (IC del 95%=0,84-0,98) 87%

C4c/CRP 0,87 (IC del 95%=0,78-0,95) 85% C4c/Prolactina/CYFRA 21 -1 0,90 (IC del 95%=0,83-0,98) 87% C4c/Prolactina/CRP 0,87 (IC del 95%=0,79-0,95) 85%

C4c/CYFRA 21-1/CRP 0,91 (IC del 95%=0,83-0,98) 87%

Conclusión

Estos análisis evidencian la capacidad para diagnosticar cáncer de pulmón de modelos basados en la combinación de niveles plasmáticos de C4c con prolactina y/o CYFRA 21-1 y/o CRP.

Ejemplo 3. La determinación de C4c en combinación con otros marcadores proteicos puede usarse para discriminar nódulos pulmonares indeterminados benignos de malignos.

Descripción del experimento

Se evaluó la capacidad de los modelos basados en C4c para discriminar entre pacientes con y sin cáncer de pulmón en un conjunto de muestras de plasma de pacientes que presentaban nódulos pulmonares benignos o malignos descubiertos por CT de tórax.

Materiales y procedimientos

En el estudio se utilizó un conjunto de muestras de plasma del Centro Médico de la Universidad de Vanderbilt. Esta cohorte incluyó muestras de plasma de 138 pacientes que presentaban nódulos pulmonares indeterminados descubiertos por CT de tórax. Los nódulos pulmonares se definieron como opacidades redondeadas completamente rodeadas por parénquima pulmonar. Setenta y seis nódulos pulmonares indeterminados fueron diagnosticados como cánceres de pulmón por examen patológico, mientras que los 62 restantes fueron diagnosticados como no malignos. Las características clínicas de los nódulos malignos y no malignos se muestran en la Tabla 10. El diagnóstico de los nódulos no malignos incluyó lesiones pulmonares como enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfisema, enfermedad inflamatoria, lesiones granulomatosas y hamartomas.

Tabla 10. Características clínicas y epidemiológicas en el conjunto de pacientes con nódulos pulmonares indeterminados.

Características ^{Nódulos pulmonares no}Nódulos pulmonares _malignosmalignos

Sexo

Masculino 36 50

Femenino 26 26

Edad

< 65 46 33

>65 16 43

Estado de tabaquismo

Nunca 16 2

Ex-fumador 24 42

Actual 22 32

Paquetes-año

<50 45 35

>50 17 41

Tamaño del nódulo

<3 cm 46 30

>3 cm 12 46

No disponible 4

FEV1% predicho

< 80 29 50

>80 17 12

No disponible 16

Histología1

ADC 26

SCC 16

LCC 6

SCLC 15

NSCLC NOS 13

Etapa

No disponible 20

Estatus

Vivo 23

Muerto 53

1ADC: Adenocarcinoma; SCC: Carcinoma de células escamosas; LCC: carcinoma de células grandes; SCLC: carcinoma de células pequeñas; NSCLC NOS: cáncer de pulmón de células no pequeñas no especificado de otra manera.

Se analizaron los niveles plasmáticos de prolactina, CYFRA 21-1 y CRP utilizando tecnología Cobas (Roche). Se evaluó C4d como se indica en el Ejemplo 1. Se evaluó C4c usando un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con 200 ng de anticuerpo de captura (anticuerpo anti-C4c; ref. CAM072-18, BioPorto Diagnostics). Las placas se lavaron con tampón de lavado (PBS, Tween-20 al 0,05%, pH = 7,4) y se bloquearon con el mismo tampón. Las muestras se diluyeron 1:8 en tampón de ensayo (tampón de lavado que contenía EDTA 20 mM). Una muestra de plasma de un individuo sano, diluida 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16, se utilizó como referencia para la cuantificación. Después de 1 hora a temperatura ambiente, se lavaron las placas y se añadió un anticuerpo de detección (1:50.000; anticuerpo antiC4b biotinilado; ref. HYB162-02B, BioPorto Diagnostics). Las placas se lavaron y revelaron con estreptavidina (1:200) y paquete de reactivo de sustrato (ref. DY999; R&D Systems). Los resultados se calcularon como valores relativos a los encontrados en la muestra de referencia y se expresaron como unidades arbitrarias (AU). Se utilizó regresión logística para generar los modelos de diagnóstico.

Resultados

Los niveles plasmáticos de C4c fueron significativamente más altos en pacientes con cáncer de pulmón que en sus homólogos sin cáncer de pulmón (9,89 ± 3,95 frente a 7,17 ± 5,16 AU; p = 0,002). El área bajo la curva ROC fue 0,66 (IC del 95% = 0,56 a 0,75) (Figura 8A). En el caso de C4d, no hubo diferencias estadísticas en los niveles plasmáticos de este marcador entre individuos con nódulos benignos y malignos (4,60 ± 2,06 pg/ml vs 5,09 ± 2,10 pg/ml; p = 0,212), sugiriendo que la determinación de fragmentos de C4 activado que contienen C4d es ineficaz en este contexto clínico. El rendimiento diagnóstico de C4c se resume en la Tabla 11.

Tabla 11. Rendimiento de la determinación de los niveles de C4c en muestras de plasma como posible marcador diagnóstico para la discriminación entre nódulos pulmonares benignos y malignos.

C4c

Sensibilidad 88%

Especificidad 44%

Valor predictivo positivo 6%

Valor predictivo negativo 98,9%

Índice de probabilidad positiva 1,56

Índice de probabilidad negativa 0,27

Clasificado correctamente 68%

1Se calcularon valores predictivos positivos y negativos con una prevalencia estimada de nódulos malignos en este entorno clínico del 4%.

Las asociaciones entre los niveles de C4c y las características epidemiológicas y clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 12.

Tabla 12. Asociación entre niveles plasmáticos de C4c y características clínicas en el conjunto de pacientes con nódulos pulmonares indeterminados.

Benigno Maligno Características C4c (AU)1 Valor p2 C4c (AU)1 Valor p2 Sexo

Masculino 6,72±4,12 0,663 9,50±3,17 0,206 Femenino 7,78±6,36 10,68±5,11

Edad (años)

< 65 8,11 ±5,46 0,398 10,70±4,79 0,753

>65 6,76±4,02 9,45±3,37

Estado de tabaquismo

Nunca fumador 9,13±6,80 0,212 11,57±1,04 0,364 Ex-fumador/fumador actual 6,48±4,34 9,85±3,99

Paquetes-año

<50 7,08±5,59 0,795 9,38±3,40 0,823

>50 7,39±3,64 10,34±4,36

Tamaño del nódulo

<3 cm 7,76±5,21 0,219 9,71±3,37 0,807 >3 cm 6,02±4,93 10,01 ±4,32

FEV1% predicho

<80 5,96±4,13 0,700 10,08±4,28 0,430

>80 6,44±7,29 10,43±3,96

Histología3

ADC 11,55±4,25 <0,001

SCC 7,51 ±2,87

LCC 12,52±4,74

SCLC 8,04±2,70

NSCLC NOS 10,45±3,18

Etapa

0,964

Estatus

Vivo 10,96±4,19 0,442 Muerto 9,43±3,79

''Unidades arbitrarias, 2Prueba U de Mann-Whitney o prueba de Kruskal Wallis, 3ADC: Adenocarcinoma; SCC: Carcinoma de células escamosas; LCC: Carcinoma de células grandes; SCLC: carcinoma de células pequeñas; NSCLC NOS: cáncer de pulmón de células no pequeñas no especificado de otra manera,

El siguiente objetivo fue desarrollar modelos de diagnóstico utilizando la información combinada proporcionada por C4c y los tres marcadores proteicos encontrados expresados diferencialmente entre casos y controles en el Ejemplo 2 (prolactina, CYFRA 21-1 y CRP). En la Tabla 13 se muestra un análisis de regresión logística realizado para cada uno de los marcadores individualmente.

Tabla 13. Regresión logística univariante para la evaluación de C4c, prolactina, CYFRA 21-1 y CRP como posibles marcadores de diagnóstico para la discriminación entre nódulos pulmonares benignos y malignos.

Marcador LR chi2 Valor p

C4c 12,11 <0,001

Prolactina 2,54 0,111

CYFRA 21-1 45,12 <0,001

CRP 19,87 <0,001

Con base en los análisis univariados, C4c, CYFRA 21-1 y CRP fueron predictores de neoplasias malignas y se incluyeron en el análisis de regresión logística multivariante. Este estudio generó un modelo con un valor de 64,04 para la prueba de chi-cuadrado de índice de probabilidad (p < 0,001). Las probabilidades predichas del modelo se compararon con los diagnósticos finales y se construyó una curva ROC. El área bajo la curva fue 0,86 (IC del 95% = 0,80-0,92) (Figura 8B). Otras características diagnósticas del modelo se muestran en la Tabla 14.

Tabla 14. Rendimiento del modelo de diagnóstico para la discriminación entre nódulos pulmonares benignos y malignos en función de los niveles plasmáticos de C4c, CYFRA 21-1 y CRP.

C4c/ CYFRA 21-1/CRP

Sensibilidad 75%

Especificidad 85%

Valor predictivo positivo1 18%

Valor predictivo negativo1 98,8%

Índice de probabilidad positiva 5,17

Índice de probabilidad negativa 0,29

Clasificado correctamente 80%

Las asociaciones entre la capacidad predictiva del modelo y las características de los pacientes se muestran en la Tabla 15. Curiosamente, las probabilidades predictivas de neoplasias malignas se asociaron significativamente con el tamaño del nódulo y el estado vital en el grupo maligno.

Tabla 15. Asociación entre los puntajes obtenidos del modelo multivariado, en función de los niveles plasmáticos de C4c/CYFRA 21-1/CRP, y las características de los pacientes con nódulos pulmonares malignos y controles con nódulos benignos.

Benigno Maligno

Características ^{Puntaje diagnóstico}

_(AU)1Valor P2 Puntaje diagnóstico

_(AU)1Valor p2 Sexo

Masculino 0,33±0,19 0,887 0,74±0,27 0,466 Femenino 0,34±0,21 0,70±0,28

Edad (años)

<65 0,33±0,20 0,987 0,74±0,28 0,509

>65 0,34±0,21 0,71±0,26

Estado de tabaquismo

Nunca fumador 0,40±0,21 0,111 0,65±0,04 0,436 Ex-fumador/fumador actual 0,31 ±0,19 0,73±0,27

Paquetes-año

<50 0,33±0,19 0,994 0,70±0,25 0,265

>50 0,34±0,22 0,75±0,28

FEV1% predicho

<80 0,32±0,18 0,309 0,72±0,28 0,178

>80 0,27±0,20 0,64±0,20

Tamaño del nódulo

<3 cm 0,34±0,20 0,863 0,58±0,29 <0,001 > 3 cm 0,32±0,17 0,83±0,21

Histología

ADC 0,72±0,25 0,706

SCC 0,75±0,31

LCC 0,66±0,32

SCLC 0,65±0,30

NSCLC NOS 0,85±0,15

Etapa

0,258

Estatus

Vivo 0,70±0,26 0,005 Muerto 0,84±0,22

1Unidades arbitrarias, 2Prueba U de Mann-Whitney o prueba de Kruskal Wallis,

El siguiente objetivo fue generar modelos de diagnóstico basados tanto en marcadores moleculares como en características clínicas. Primero, se realizaron análisis de regresión logística univariante para estas últimas características (Tabla 16).

Tabla 16. Regresión logística univariante para la evaluación de variables clínicas como marcadores de discriminación de nódulos pulmonares.

Marcador LR chi2 Valor p

Sexo 0,87 0,352

Edad 14,98 <0,001

Estado de tabaquismo 17,57 <0,001

Paquetes-año 11,12 <0,001

FEV1% Predicho 2,42 0,120

Tamaño del nódulo 27,18 <0,001

Con base en los resultados obtenidos de estos análisis univariados, las variables clínicas seleccionadas para ser incluidas en el modelo fueron la edad, el tabaquismo, los paquetes-año y el tamaño del nódulo. Se generaron dos modelos combinados, uno que incluye las variables clínicas y C4c, y otro que incluye las variables clínicas y los tres marcadores moleculares. En el primer caso (C4c combinado con variables clínicas), la LR chi2 del modelo fue 69,81 (p < 0,001). El área bajo la curva ROC fue 0,88 (IC del 95% = 0,83-0,94) (Figura 9A). La LR chi2 del modelo basado en los tres marcadores moleculares y las variables clínicas fue 86,82 (p < 0,001). El área bajo la curva ROC fue 0,92 (IC del 95% = 0,87-0,96) (Figura 9B). Otras características de diagnóstico de los dos modelos se muestran en la Tabla 17.

Tabla 17. Rendimiento de los modelos de diagnóstico de cáncer de pulmón basados en los niveles plasmáticos de marcadores moleculares (C4c solo o junto con CYFRA 21-1 y ^cR^p) y variables clínicas (edad, tabaquismo, paquetes-año y tamaño del nódulo).

Variables clínicas C4c ^{Variables clínicas C4c/CYFRA} _21-1/CRP Sensibilidad 87% 91%

Especificidad 76% 76%

Valor predictivo positivo1 13% 14%

Valor predictivo negativo1 99,3% 99,5%

Índice de probabilidad positiva 3,60 3,76

Índice de probabilidad negativa 0,17 0,12

Clasificado correctamente 82% 84%

Se han descrito modelos de diagnóstico no invasivos para cáncer de pulmón basados en características clínicas y de imagen. Gould et al. desarrollaron y validaron un modelo clínico para diferenciar el cáncer de pulmón de los nódulos pulmonares benignos utilizando la edad, el historial de tabaquismo, el diámetro del nódulo y el tiempo transcurrido desde el momento en que se dejó de fumar. Este modelo se ha utilizado previamente para evaluar el valor diagnóstico agregado por las firmas moleculares a los datos clínicos y de la CT de tórax para el diagnóstico no invasivo de pacientes que presentan nódulos pulmonares indeterminados. Asimismo, se evaluó la capacidad de C4c, sola o en combinación con CYFRA 21-1 y CRP, para complementar este modelo clínico validado para la detección de cáncer de pulmón en pacientes con nódulos pulmonares indeterminados.

En primer lugar, se evaluó el rendimiento diagnóstico del modelo clínico de Gould en nuestro grupo de pacientes. Debido a la limitada información clínica disponible de algunos pacientes, el modelo solo se pudo aplicar a 134 pacientes. Un análisis de regresión logística arrojó una LR chi2 de 58,19 (p < 0,001). El área bajo la curva ROC fue 0,86 (IC del 95% = 0,80-0,92) (Figura 10A). Otras características diagnósticas del modelo se muestran en la Tabla 18.

Tabla 18. Rendimiento del modelo de Gould en función de las variables clínicas de edad, antecedentes de tabaquismo, diámetro del nódulo y tiempo desde el abandono del tabaquismo.

Modelo de Gould

Sensibilidad 86%

Especificidad 73%

Valor predictivo positivo1 12%

Valor predictivo negativo1 99,2%

Índice de probabilidad positiva 3,15

Índice de probabilidad negativa 0,20

Clasificado correctamente 80%

La precisión del modelo clínico aumentó cuando se añadió C4c o C4c/CYFRA 21-1/CRP al modelo. En el primer caso (modelo de Gould y C4c), la LR chi2 fue 63,96 (p < 0,001). El área bajo la curva ROC fue 0,87 (IC del 95% = 0,81-0,93) (Figura 10B). En el segundo caso (modelo de Gould y C4c/cYf RA/CRP), la LR chi2 fue 86,91 (p < 0,001). El área bajo la curva ROC fue 0,92 (iC del 95% = 0,87-0,96) (Figura 10C). Otras características de diagnóstico de los dos modelos se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Rendimiento de los modelos de diagnóstico de cáncer de pulmón basados en los niveles plasmáticos de marcadores moleculares (C4c sola o junto con CYFRA 21-1 y CRP) y variables del modelo de Gould clínicamente validado (edad, antecedentes de tabaquismo, diámetro del nódulo y tiempo desde que se dejó de fumar).

Modelo de Gould C4c ^{Modelo de Gould C4c/CYFRA} _21-1/CRP Sensibilidad 92% 92% Especificidad 66% 72%

Valor predictivo positivo1 10% 12%

Valor predictivo negativo1 99,5% 99,6%

Índice de probabilidad positiva 2,67 3,34

Índice de probabilidad negativa 0,12 0,11

81% 84%

Clasificado correctamente

Ejemplo 4. Cribado de individuos con alto riesgo de cáncer de pulmón.

Materiales y procedimientos

Se inscribieron 128 fumadores asintomáticos mayores de 40 años en el programa de cribado por CT I-ELCAP de la Clínica Universidad de Navarra (CUN). Treinta y dos fumadores fueron diagnosticados con cáncer de pulmón en el contexto del programa, y los 96 restantes no tenían evidencia de cáncer de pulmón después del programa de cribado por CT. Ambos grupos fueron emparejados por sexo, edad e historial de tabaquismo. Los niveles plasmáticos de C4c, C4c/CYFRA y C4c/CYFRA/c Rp se midieron en aquellos pacientes de alto riesgo finalmente diagnosticados con cáncer de pulmón y se compararon con pacientes de alto riesgo sin evidencia de cáncer de pulmón.

Resultados

Los niveles plasmáticos de C4c, C4c/CYFRA y C4c/CYFRA/CRP fueron significativamente más altos en individuos con alto riesgo de cáncer de pulmón que finalmente fueron diagnosticados con cáncer de pulmón. La Figura 11 muestra las curvas ROC obtenidas del modelo de diagnóstico basado en la cuantificación de C4c (A), C4c/CYFRA (B) y C4c/CYFRA/CRP (C) en muestras de plasma del cribado de individuos con alto riesgo de cáncer de pulmón.

Conclusión

Estos análisis evidencian la capacidad diagnóstica de la cuantificación de C4c en muestras de plasma (individualmente o en combinación con otros marcadores moleculares y características epidemiológicas y clínicas) para discriminar qué nódulos pulmonares son malignos. La aplicación de este enfoque multimodal predice el cáncer de pulmón con mayor precisión y puede usarse para la identificación de los sujetos que necesitan un seguimiento más activo, lo que mejoraría el manejo clínico de los nódulos pulmonares al reducir el número de procedimientos innecesarios.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento in vitro para el diagnóstico o detección del cáncer de pulmón en un sujeto, que comprende:

a. Determinar el nivel de al menos el fragmento C4c en una muestra de plasma aislada del sujeto; y b. Comparar el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa (a) con un nivel de control de referencia de dicho fragmento C4c, y

c. En el que si el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa (a) es más alto que el nivel de control de referencia, es indicativo de que el sujeto padece cáncer de pulmón.

2. Procedimiento in vitro, de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se han identificado previamente nódulos pulmonares indeterminados en el sujeto a diagnosticar y en el que si el nivel de fragmento C4c determinado en la etapa (a) es superior al nivel de control de referencia, es indicativo de que los nódulos pulmonares indeterminados identificados en el sujeto son malignos.

3. Procedimiento in vitro, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa a) comprende medir el nivel de fragmento C4c y prolactina, fragmento C4c y CYFRA 21-1, fragmento C4c y proteína C reactiva (CRP), fragmento C4c y prolactina y CYFRA 21-1, fragmento C4c y prolactina y CRP, fragmento C4c y CYFRA 21-1 y CRP, o fragmento C4c y CYFRA 21-1 y CRP y prolactina.

4. Procedimiento in vitro, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el cáncer de pulmón se selecciona del grupo que consiste en cáncer de pulmón de células no pequeñas y carcinoma de pulmón de células pequeñas.

5. Procedimiento in vitro, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sujeto a diagnosticar o cribar es un individuo con alto riesgo de cáncer de pulmón.

6. Procedimiento in vitro, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es un inmunoensayo.

7. Uso de al menos el fragmento C4c en el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón.

8. Uso, de acuerdo con la reivindicación 7, de al menos el fragmento C4c para el diagnóstico in vitro de cáncer de pulmón, en el que se determina si los nódulos pulmonares indeterminados identificados previamente son malignos.

9. Uso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que se miden las siguientes combinaciones de biomarcadores: C4c y prolactina, C4c y CYFRA 21-1, C4c y CRP, C4c y prolactina y CYFRA 21-1, C4c y prolactina y CRP, C4c y CYFRA 21-1 y CRP, o C4c y CYFRA 21-1 y CRP y prolactina.

10. Uso, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que el sujeto a diagnosticar o cribar es un individuo con alto riesgo de cáncer de pulmón.