ES2878185T3 - Ensayos para identificar elementos genéticos que afectan al fenotipo - Google Patents

Abstract

Método para identificar un elemento genético que afecta a un fenotipo de una célula, donde dicho fenotipo se manifiesta intracelularmente, donde el método comprende los pasos de: (a) Someter un grupo de células a un tratamiento de mutagénesis; (b) Fijar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de fijación y, opcionalmente, con un agente de reticulación; y permeabilizar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de permeabilización; (c) Tratar el conjunto de células con una o más sondas detectables, preferiblemente un anticuerpo o una sonda de ARN, para detectar el fenotipo afectado; (d) Clasificar las células basándose en la detección de al menos una de las una o más sondas detectables para obtener una o más poblaciones de células; (e) Opcionalmente, desreticular las células en cada una de las poblaciones de células obtenidas; y (f) Secuenciar al menos parte de las células de al menos parte de las poblaciones de células obtenidas para identificar un elemento genético que afecte al fenotipo de la célula.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayos para identificar elementos genéticos que afectan al fenotipo

Estado de la técnica

[0001] La genética basada en la mutagénesis se ha utilizado para estudiar numerosos fenotipos diferentes. Este poderoso enfoque ha identificado genes necesarios para la división celular (mediante la búsqueda de cepas de levadura mutantes sensibles a la temperatura), el desarrollo embrionario temprano (mediante la detección de embriogénesis aberrante en moscas) y la muerte celular programada (mediante el estudio de la muerte celular durante el desarrollo en C. elegans). Por lo general, se mutageniza un organismo de elección y se examina la descendencia resultante (a veces después de los cruces) en busca de fenotipos de interés.

[0002] Zdenek et al (2013) describen un método para identificar reguladores que influyen en la relación p21/PUMA tras la activación de p53. El fenotipo que se investiga es intracelular, es decir, la proporción de las proteínas p21/PUMA, las cuales son genes del ciclo celular. Las células (células de cáncer colorrectal) se tratan con una biblioteca de ARNhc y luego las células se activan para expresar p53. Las células se trataron con anticuerpos para p21 y PUMA, para detectar el fenotipo. Las células se clasifican con FAC basándose en las relaciones de señales de fluorescencia, lo que da como resultado varias poblaciones, y los locus codificantes de ARNhc se amplificaron y secuenciaron por PCR. Los locus identificados son moduladores putativos de p21 y PUMA. En estos casos, es fundamental tener acceso a organismos mutantes viables para vincular la mutación de interés con el fenotipo observado. En algunos casos, el fenotipo es letal o disminuye la forma física (por ejemplo, defectos del desarrollo temprano en Drosophila o fenotipos de división celular en levaduras). Para tales fenotipos, las mutaciones causales se pueden mapear en los progenitores de la descendencia afectada o se pueden utilizar alelos sensibles a la temperatura.

[0003] En general, un problema importante de los cribados genéticos es la presencia de altos niveles de "ruido" que dificultan significativamente la identificación de candidatos/genes relevantes relacionados con el fenotipo que se estudia. Entre los ejemplos de dicho ruido se incluyen la presencia de un gran número de resultados potenciales que resultan no ser relevantes, no reproducibles o similares. Por lo tanto, los cribados genéticos no solo requieren una experimentación laboriosa y estudios de seguimiento para encontrar, entre los muchos resultados potenciales identificados, los relevantes, sino que también significa que solo es probable que se capten señales muy fuertes. Se pierden las señales/resultados que son menos fuertes en el cribado pero que son relevantes en relación con el fenotipo que se estudia.

[0004] A la luz de esto, los métodos para enfoques de alto rendimiento, que permiten cribados genéticos fiables, por ejemplo en sistemas eucariotas, basados en rasgos fenotípicos que se manifiestan intracelularmente (es decir, que están presentes en una célula o en una célula de un organismo), o que solo se pueden detectar intracelularmente (que requieren acceso al interior de la célula), son muy deseables, pero aún no están disponibles para la genética basada en mutagénesis u otras pruebas genéticas realizadas en grandes poblaciones (grupos, grupos complejos) de células modificadas (poblaciones heterogéneas con respecto a la presencia de mutaciones).

[0005] En particular, existe una clara necesidad en la técnica de métodos fiables, eficientes y reproducibles que permitan la identificación directa de elementos genéticos desconocidos (genes, exones, intrones, SNP, etc.) que afectan al fenotipo de una célula u organismo (es decir, que están implicados en cambiar o proporcionar un determinado rasgo de un carácter dado), incluidos los elementos genéticos que serían difíciles de identificar en los cribados genéticos de la técnica anterior debido al alto nivel de ruido. Esto es particularmente relevante para aquellos fenotipos que se manifiestan intracelularmente (o que solo pueden detectarse intracelularmente). Disponer de tales métodos permitiría al mismo tiempo la identificación de los elementos celulares relacionados con estos elementos genéticos (incluidas, entre otras, las proteínas expresadas o moduladas por dichos elementos genéticos, la actividad de dichos elementos celulares y/o biomoléculas relacionadas (por ejemplo, lípidos, otras proteínas o enzimas, metabolitos) modulados o creados por estos elementos celulares).

[0006] Por consiguiente, el problema técnico subyacente a la presente invención puede verse en la provisión de tal método para cumplir con cualquiera de las necesidades mencionadas anteriormente. El problema técnico se resuelve mediante las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones y en el presente documento a continuación.

[0007] Un objeto de la presente invención es proporcionar un método, o un método mejorado, que permita la identificación de un elemento genético, en particular un elemento genético endógeno, que afecta a un fenotipo, preferiblemente un fenotipo que se manifiesta (al menos en parte) intracelularmente y/o que se detecta o se ha de detectar intracelularmente.

[0008] Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método que permita la identificación de elementos celulares relacionados con el elemento genético que afecta al fenotipo.

[0009] Un objeto de la presente invención es proporcionar un método que permita la identificación de un o más de un elemento genético (y/o elementos celulares relacionados con el mismo) de una gran población de células que se han sometido a un tratamiento de mutagénesis, en el que cada elemento genético, solo o en combinación, afecta a un fenotipo que se manifiesta intracelularmente y/o que se detecta intracelularmente.

[0010] Un objeto de la presente invención es proporcionar un cribado genético directo que permita la identificación de un elemento genético (y/o elementos celulares relacionados con el mismo), en particular un elemento genético endógeno que afecta a un fenotipo que se manifiesta intracelularmente y/o que se detecta intracelularmente.

[0011] Un objeto de la presente invención es proporcionar tales cribados genéticos directos que no se vean obstaculizados, o que se vean obstaculizados en menor medida, por un ruido relativamente alto frente a la proporción de resultados relevantes, en otras palabras, que muestren bajos niveles de ruido, es decir, de resultados irrelevantes. Por lo tanto, esto permite una identificación sencilla de los elementos genéticos relevantes y puede prevenir o reducir los laboriosos estudios de confirmación adicionales.

[0012] Un objeto de la presente invención es lograr lo anterior en células eucariotas, por ejemplo, pero sin limitarse a células humanas, incluyendo células que llevan mutaciones que causan enfermedades, por ejemplo células cancerosas humanas.

[0013] Un objeto de la presente invención también es proporcionar un método para identificar un modulador, por ejemplo un fármaco, de un producto génico, en particular, un producto génico endógeno, codificado por un gen candidato que afecta a un fenotipo de una célula.

[0014] Un objeto de la presente invención es proporcionar un método para establecer o analizar vías biológicas, para identificar genes involucrados en enfermedades, por ejemplo, pero sin limitarse al cáncer, para estudiar la interacción fármaco-diana, para estudiar la interacción fármaco-fármaco, o para analizar la supresión o modulación de un fenotipo, preferiblemente un fenotipo asociado con una enfermedad, incluido el cáncer.

[0015] Estos y otros objetos se resuelven con los métodos de la invención descritos en este documento.

Descripción de la invención

Descripción de los dibujos

[0016]

Figura 1. Un cribado genético en una población de células mutagenizadas que se ha fijado con paraformaldehído.

Figura 2. Separación fenotípica de un grupo de células mutagenizadas e identificación de sitios de inserción de trampa génica mediante secuenciación.

Figura 3. Cribado de mutagénesis en todo el genoma para identificar reguladores de la fosforilación de AKT. Figura 4. KCTD5 afecta a la fosforilación de AKT.

Figura 5. El método de cribado es adecuado para cualquier fenotipo intracelular que pueda visualizarse y usarse para separar poblaciones celulares en función de la intensidad de la señal.

Figura 6. Un cribado de las concentraciones de proteína IRF1 (expresión de proteína).

Figura 7. Un cribado de la expresión de IkBa (degradación de proteínas).

Figura 8. Un cribado de la fosforilación de p38.

Figura 9. Un cribado para detectar daños en el ADN de células irradiadas.

Figura 10. Un cribado para la modificación de una cola de histonas.

Figura 11. KCTD5 modula la señalización de GPCR.

Figura 12. Un cribado basado en CRISPR/Cas9 identifica a KCTD5 como un regulador negativo para fosfo-AKT (pAKT).

Figura 13. Comparación de fenotipos asociados a genes en un panel de fenotipos.

Figura 14. Análisis comparativo de genes necesarios para dos modificaciones postraduccionales (MPT) similares en el mismo aminoácido en una proteína histona.

Figura 15. Cribado de la abundancia de la proteína lisosomal LAMP1.

Figura 16. Los cribados genéticos haploides identifican genes que, tras la mutación, alteran los niveles de un marcador de una enfermedad.

Definiciones

[0017] En la siguiente descripción y ejemplos se utilizan varios términos. Con el fin de proporcionar una comprensión clara y coherente de la especificación y las reivindicaciones, incluido el alcance que se les dará a dichos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina lo contrario en el presente documento, todos los términos técnicos y científicos usados tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan al presente documento en su totalidad por referencia.

[0018] Como se usa en este documento, el término "términos científicos comunes", a menos que se defina de otro modo, se refiere a términos técnicos y científicos usados en este documento que tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Un experto en la técnica reconocerá muchos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento que podrían usarse en la práctica de la presente invención. De hecho, la presente invención no se limita de ninguna manera a los métodos y materiales descritos y la práctica de técnicas convencionales de biología molecular, bioquímica, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante, bioinformática, genómica, secuenciación y campos relacionados es ampliamente conocida por los expertos en la técnica.

[0019] Como se usa en este documento, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, un método para aislar "una" molécula de ADN incluye aislar una pluralidad de moléculas (por ejemplo, decenas, centenas, miles, decenas de miles, centenas de miles, millones o más moléculas).

[0020] Como se usa en este documento, y a menos que se indique específicamente o sea obvio por el contexto, el término "aproximadamente" se entiende dentro de un rango de tolerancia normal en la técnica, por ejemplo, dentro de 2 desviaciones estándar de la media. Aproximadamente se puede entender como dentro del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,05 % o 0,01 % del valor establecido.

[0021] Como se usa en este documento, el término "y/o" indica que puede darse uno o más de los casos indicados, solo o en combinación con al menos uno de los casos indicados, incluso con todos los casos indicados.

[0022] Como se usa en este documento, “al menos" un valor concreto significa ese valor concreto o más. Por ejemplo, se entiende que "al menos 2" es lo mismo que "2 o más", es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, ..., etc.

[0023] Como se usa en el presente documento, los términos "amplificación" y "amplificar” se refieren a una reacción de amplificación de polinucleótidos, a saber, una población de polinucleótidos que se replican a partir de una o más secuencias de partida. La amplificación puede referirse a una variedad de reacciones de amplificación, que incluyen, entre otras, reacción en cadena de la polimerasa, reacción lineal de la polimerasa, amplificación basada en secuencias de ácido nucleico, amplificación por círculo rodante y reacciones similares. Normalmente, para la amplificación se utilizan cebadores de amplificación, siendo el resultado de la reacción de amplificación un amplicón.

[0024] Como se usa en este documento, los términos "que comprende" y "comprender”, y sus conjugaciones, se refieren a una situación en la que dichos términos se usan en su sentido no limitativo para significar que los elementos que siguen a la palabra están incluidos, pero los elementos no mencionados específicamente no se excluyen. También abarca el verbo más limitante "consistir en".

[0025] Como se usa en el presente documento, el término "reticulación" se refiere a la acción de hacer reaccionar un agente con ADN en dos posiciones diferentes, de manera que estas dos posiciones diferentes puedan estar conectadas. Pueden producirse reticulaciones entre cadenas de ADN de la misma molécula de ADN (de doble cadena) y/o entre ^a Dⁿ y proteína. Un reticulante que se puede utilizar ventajosamente según la invención es el (para-)formaldehído. El formaldehído induce enlaces cruzados proteína-proteína y ADN-proteína. Por lo tanto, el formaldehído puede reticular diferentes cadenas de ADN entre sí a través de sus proteínas asociadas. Las reticulaciones se pueden invertir mediante una etapa de calentamiento, por ejemplo mediante incubación a 60 °C. La reticulación da como resultado la formación de enlaces cruzados entre proteínas y/o ADN, y permite que el estado tridimensional del ADN permanezca prácticamente inalterado.

[0026] Como se usa en el presente documento, el término "nivel de expresión" de un gen se refiere a la cantidad de transcrito de ARN que es transcrito por un gen y/o la cantidad de proteína que puede traducirse a partir de un transcrito de ARN, por ejemplo ARNm. Por ejemplo, para los genes que codifican un miARN, el nivel de expresión se puede determinar cuantificando la cantidad de transcrito de ARN que se expresa, por ejemplo, utilizando métodos estándar como la PCR cuantitativa de un miARN maduro, micromatriz o transferencia Northern. Alternativamente, el nivel de expresión también se puede determinar midiendo el efecto de un miARN en un ARNm diana.

[0027] Como se usa en este documento, el término "expresión de un gen" se refiere al proceso en el que una región de ADN, que está operativamente unida a regiones reguladoras apropiadas, particularmente un promotor, se transcribe en un ARN, que es biológicamente activo, es decir, que es capaz de ser traducido en una proteína o péptido biológicamente activo (o fragmento de péptido activo) o que es activo en sí mismo (por ejemplo, en el silenciamiento de genes postranscripcional o ARNi).

[0028] Como se usa en el presente documento, el término gen se refiere a una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita), que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo, un ARNm) en una célula, operativamente unida a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). Por lo tanto, un gen puede comprender varias secuencias unidas operativamente, tales como un promotor, una secuencia líder 5' que comprende, por ejemplo, secuencias implicadas en el inicio de la traducción, una región codificante (proteína) (ADNc o ADN genómico) y una secuencia 3' no traducida que comprende, por ejemplo, sitios de terminación de la transcripción.

[0029] Como se usa en este documento, el término elemento genético se refiere a un elemento de una molécula de ^a Dⁿ o ARN, es decir, una parte básica de una molécula de ADN o ARN, o una parte considerada como tal por un experto. El elemento genético puede consistir en un nucleótido o puede comprender más de un nucleótido. En caso de que un elemento genético comprenda más de un nucleótido, estos nucleótidos son nucleótidos adyacentes. Por lo tanto, un elemento genético puede consistir, por ejemplo, en cualquier número de ácidos nucleicos adyacentes (por ejemplo, al menos/como máximo 1, 5, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 ácidos nucleicos de longitud) o puede constar de diferentes grupos de tales ácidos nucleicos adyacentes (por ejemplo, los exones separados espacialmente). En el contexto de la presente invención, el elemento genético es una parte de una molécula de ADN o ARN que, con el método según la invención, se reconoce que afecta al fenotipo que se estudia. El elemento genético puede ser una (parte de una) molécula de ADN o una molécula de ARN y, por ejemplo, puede estar presente en un cromosoma o episoma. En eucariotas, el elemento genético puede estar presente, por ejemplo, en el núcleo, en el citosol o en cualquier otro orgánulo, incluidas las mitocondrias. El elemento genético puede estar presente de forma natural en las células sometidas al método de la invención o puede ser un elemento genético que se ha introducido en estas células a propósito. Sin embargo, preferiblemente el elemento genético es un elemento genético que es endógeno a las células utilizadas en el método de la invención (es decir, que se origina dentro del organismo del cual se obtienen las células y/o persiste en la línea germinal del organismo/célula). Por ejemplo, el elemento genético puede ser un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) identificado con un gen, en el que el método según la invención identificó la presencia del SNP como asociado con el fenotipo que se estudia. Sin embargo, preferiblemente el elemento genético es un elemento genético funcional como lo reconoce generalmente el experto, que incluye y prefiere, pero no se limita a, un promotor, un gen, un intrón, un exón, un potenciador, una molécula de ARN no codificante, un elemento represor y similares. También se contemplan los polimorfismos de nucleótido simple (SNP), por ejemplo, un SNP sin un gen asociado. Un "elemento celular" como se usa en este documento se refiere a cualquier otro elemento, en particular biomolécula, de una célula que no es una molécula de ADN o ARN. El término elemento celular en este contexto se refiere a cualquier otro elemento de la célula que no sea un elemento genético e incluye pero no se limita a las proteínas, lípidos, azúcares y carbohidratos presentes en la célula, sino que también incluye otros metabolitos y biomoléculas presentes en la célula, orgánulo o membranas de la célula. Como entenderá el experto en la materia, la identificación del elemento genético con el método según la invención también puede permitir la identificación del elemento celular relacionado. Por ejemplo, en caso de que el elemento genético sea (parte de) un gen que codifica una proteína, la proteína codificada por el gen es un elemento celular correspondiente. Por ejemplo, en caso de que el elemento genético sea (parte) de un gen que codifica una proteína que se sabe que se une a un lípido específico, el lípido también puede ser un elemento celular correspondiente. Por ejemplo, en caso de que el elemento genético sea un ARN no codificante, por ejemplo implicado en la interferencia del ARN, un ARN que comprende el complemento de dicho ARN no codificante y la proteína codificada son elementos celulares correspondientes.

[0030] Como se usa en este documento, el término "producto génico" se refiere a moléculas que consisten en una cadena de nucleótidos o aminoácidos, sin referencia a un modo de acción, tamaño, estructura tridimensional u origen específicos, que son los productos de la transcripción y traducción de un determinado gen.

[0031] Como se usa en este documento, los términos "secuenciación de alto rendimiento" y "secuenciación de nueva generación" y "secuenciación profunda" se refieren a tecnologías de secuenciación que son capaces de generar una gran cantidad de lecturas, típicamente del orden de muchos miles (es decir, decenas o cientos de miles) o millones de lecturas de secuencia en lugar de unos pocos cientos a la vez. La secuenciación de alto rendimiento se distingue de la secuenciación capilar o Sanger convencional.

[0032] Como se usa en el presente documento, “menos de" o "hasta" y similares significa el rango desde cero hasta el valor proporcionado, incluyendo este último. Por ejemplo, "menos de 10" o "hasta 10" se entiende como 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10.

[0033] Como se usa en este documento, el término "fenotipo" se refiere a al menos una característica o rasgo observable de un organismo o célula de un organismo tal como su morfología, desarrollo, propiedades bioquímicas o fisiológicas, fenología, comportamiento y productos del comportamiento. Los fenotipos resultan de la expresión de los genes, así como de la influencia de factores ambientales y las interacciones entre los dos. Aunque un fenotipo es el conjunto de características observables mostradas por un organismo, la palabra fenoma a veces se usa para referirse a una colección de rasgos y su estudio simultáneo se conoce como fenómica. Como se usa en el presente documento, "un elemento genético que afecta a un fenotipo" se refiere, por lo tanto, a un elemento genético como se define en el presente documento que influye en la manifestación de dicho fenotipo, es decir, que es un modulador de/modula/influye en dicho fenotipo. El elemento genético puede, por ejemplo, estar implicado en causar o promover un primer rasgo del fenotipo (o primer rasgo de un carácter), o puede estar implicado en reprimir otro rasgo del mismo fenotipo. La inducción de cambios en dicho elemento genético, por ejemplo, como consecuencia del tratamiento de mutagénesis como se describe en el presente documento, puede provocar la modificación de dicho fenotipo (el rasgo puede cambiar). Por lo tanto, el método de la invención permite la identificación de dichos elementos genéticos basándose en la detección del fenotipo afectado (cambiado, modificado, alterado) (es decir, la manifestación de un rasgo fenotípico, una variante distinta de una característica fenotípica o carácter de un organismo o célula).

[0034] Como se usa en este documento, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, ubicado en dirección hacia el extremo 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio de inicio de la transcripción del gen, y está estructuralmente identificado por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y cualquier otra secuencia de ADN, incluidos, entre otros, los sitios de unión al factor de transcripción, los sitios de unión a la proteína represora y activadora y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida por un experto en la técnica que actúe directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción del promotor.

[0035] Como se usa en el presente documento, el término "secuenciación" se refiere a determinar el orden de los nucleótidos (secuencias de bases) de una muestra de ácido nucleico, por ejemplo, ADN o ARN.

[0036] Como se usa en este documento, el término "rasgo", en el contexto de la biología, se refiere a un rasgo relacionado con cualquier carácter distintivo fenotípico de un miembro individual de un organismo, o de una célula individual, en comparación con (cualquier) otro miembro individual del mismo organismo, o de (cualquier) otra célula individual. Por ejemplo, en la presente invención se comparan rasgos (preferiblemente del mismo carácter) de células (del mismo organismo). En el contexto de la presente invención, el rasgo puede heredarse, es decir, transmitirse a las siguientes generaciones del organismo mediante la información genética del organismo. Como se usa en este documento, los términos "rasgo del mismo carácter" y "rasgo de dicho carácter" se refieren a cualquiera de un grupo de al menos dos rasgos que existen (o se han manifestado) para un carácter. Por ejemplo, en el caso del carácter "color de la flor", las manifestaciones fenotípicas (rasgos) pueden incluir azul, rojo, blanco, etc. En el ejemplo anterior, el azul, el rojo y el blanco son rasgos diferentes del mismo carácter.

Descripción detallada de la invención

[0037] Los objetivos y objetos de la invención se resuelven con los métodos de la invención caracterizados en las reivindicaciones, cláusulas, descripción, dibujos y ejemplos de este documento.

[0038] El método de la invención es un enfoque de alto rendimiento que proporciona un cribado genético fiable, por ejemplo en sistemas eucariotas, basado en rasgos fenotípicos que, preferiblemente, se manifiestan intracelularmente, o que solo pueden detectarse intracelularmente. El método se refiere a la genética basada en mutagénesis llevada a cabo en/con grandes poblaciones de células, es decir, conjuntos o conjuntos complejos de células. Preferiblemente, el conjunto de células consiste en células isogénicas o son células del mismo tipo (por ejemplo, derivadas de la misma línea celular). Las células del conjunto pueden someterse a un tratamiento de mutagénesis. Estos tratamientos pueden ser tales que se obtengan poblaciones heterogéneas de células con respecto a las mutaciones introducidas en las células. En otras palabras, después del tratamiento, diferentes células dentro del grupo pueden comprender varias mutaciones, en varias posiciones y en varios números. Por ejemplo, una primera célula de la población puede comprender 5 mutaciones después de dicho tratamiento de mutagénesis, por ejemplo, una mutación en un gen A, un gen B, un exón C, un intrón D y un gen E, mientras que otra célula puede comprender el mismo de un número diferente de mutaciones y en diferentes posiciones en el genoma. Se puede prever una situación correspondiente en el caso de un tratamiento que modifique la expresión génica y como se detalla en el presente documento. A continuación, las células de los conjuntos tratados se clasifican (preferiblemente después de la fijación y permeabilización de las células) basándose en el fenotipo que se estudia; por ejemplo, en una primera población que no tiene el rasgo definido (o deseado o predeterminado) de un carácter dado y una segunda población que tiene el rasgo. Según la clasificación, se puede identificar el elemento genético subyacente, involucrado en el fenotipo (carácter, rasgo).

[0039] En particular, el método proporciona un método fiable, eficaz y reproducible que permite la identificación de elementos genéticos desconocidos que afectan al fenotipo de una célula u organismo, en particular con respecto a aquellos fenotipos que se manifiestan intracelularmente/que solo pueden detectarse intracelularmente.

[0040] En un primer aspecto se proporciona un método para identificar un elemento genético que afecta a un fenotipo de una célula, preferiblemente en el que el fenotipo se manifiesta intracelularmente (es decir, puede o debe detectarse en la célula, por ejemplo usando una sonda que detecta el fenotipo intracelularmente). El método para identificar un elemento genético que afecta a un fenotipo de una célula comprende varios pasos, como se describe a continuación en el presente documento. Los pasos de la invención comprenden:

(a) Someter un grupo de células a un tratamiento de mutagénesis;

(b) Fijar el grupo de células, preferiblemente con un reactivo de fijación, y opcionalmente un agente de reticulación, y permeabilizar el grupo de células, preferiblemente con un reactivo de permeabilización (es decir, someter al menos parte de las células del grupo de células tratado a fijación y permeabilización, y opcionalmente a reticulación);

(c) Tratar el conjunto de células con una o más sondas detectables, preferiblemente un anticuerpo o una sonda de ARN, que detecta específicamente el fenotipo afectado (o manifestado);

(d) Clasificar las células basándose en la detección de al menos una de una o más sondas detectables para obtener una o más poblaciones de células;

(e) Opcionalmente, desreticular las células en cada una de las poblaciones de células obtenidas; y (f) Secuenciar al menos parte de las células de al menos parte de las poblaciones de células obtenidas para identificar un elemento genético que afecte al fenotipo de la célula.

[0041] Aunque los pasos sucesivos del método según la invención se pueden realizar consecutivamente (es decir, sin que se realicen otros pasos entre los pasos descritos en este documento), la invención no se limita a los mismos; se pueden realizar pasos adicionales antes o después de cualquiera de los pasos del método inventivo descrito en este documento o entre dos pasos sucesivos del método de la invención.

[0042] El método según la invención se realiza preferiblemente in vitro, aunque en principio ciertos pasos del método se pueden realizar, por ejemplo, in vivo, por ejemplo en una planta o en un animal no humano. En particular, en las formas de realización en las que el método incluye exponer las células vivas a condiciones ambientales (por ejemplo, agresiones, condiciones de crecimiento, fármacos y metabolitos, metabolitos producidos por otras células y similares), puede ser deseable realizar al menos parte del método in vivo.

[0043] El método de la invención solo requiere un grupo de células, pero se puede usar más de un grupo de células secuencialmente o en paralelo, es decir, someterse a los diversos pasos del método después del primer grupo de células, o al mismo tiempo (en un experimento paralelo).

[0044] En el contexto de la presente invención, el término in vitro se utiliza para indicar un método (paso) realizado con células y que se realiza fuera del contexto biológico normal de estas células, por ejemplo en un tejido o (sistema de) cultivo celular utilizando un medio de cultivo artificial. En el contexto de la presente invención, el término también abarca ex vivo (es decir, experimentos realizados en o sobre tejido de un organismo en un entorno externo (fuera del cuerpo del animal). Los estudios in vivo son aquellos realizados en animales o plantas. El experto comprenderá que el método según la invención también se puede utilizar para organismos unicelulares y/o organismos que consisten en una cantidad limitada de células (por ejemplo, bacterias y hongos) Preferiblemente, el método según la invención se realiza utilizando células eucariotas.

[0045] El método de la invención permite la identificación de un elemento genético. La identificación, en el contexto de la presente invención, se refiere a establecer, reconocer y/o asociar un determinado elemento genético en relación con el fenotipo afectado. El método permite la identificación de los elementos genéticos que están involucrados en el fenotipo o que lo causan o lo modifican, por ejemplo, provoca la manifestación de un rasgo del carácter. Como se ejemplifica en los Ejemplos de este documento que aparecen más adelante, el método según la invención permite establecer, reconocer o asociar elementos genéticos en relación con un fenotipo dado. El elemento genético puede ser un elemento genético conocido, o incluso un elemento genético conocido en relación con el fenotipo dado, pero el método en particular permite la identificación de elementos genéticos que son desconocidos o que no se sabe que estén relacionados o involucrados en el fenotipo dado.

[0046] El elemento genético que se identifica puede ser cualquier elemento genético que esté presente en la célula. El elemento genético puede ser un elemento genético de ADN o un elemento genético de ARN y puede, por ejemplo, estar presente en un cromosoma o episoma. En eucariotas, el elemento genético puede estar presente, por ejemplo, en el núcleo, en el citosol o en cualquier otro orgánulo, incluidas las mitocondrias. El elemento genético puede estar presente de forma natural en las células sometidas al método de la invención o puede ser un elemento genético que se ha introducido en estas células a propósito. Sin embargo, preferiblemente el elemento genético es un elemento genético que es endógeno a las células utilizadas en el método de la invención (es decir, que se origina dentro del organismo del cual se obtienen las células y/o persiste en la línea germinal del organismo/célula). Por ejemplo, puede estar presente en/o en los cromosomas de la célula.

[0047] El elemento genético puede consistir en cualquier número de ácidos nucleicos adyacentes (por ejemplo, al menos/como máximo 1, 5, 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 ácidos nucleicos de longitud) siempre que se identifique en contexto con el fenotipo.

[0048] Por ejemplo, el elemento genético puede ser un polimorfismo de nucleótido simple (SNP) identificado con un gen, en el que el método según la invención ha identificado la presencia del ^s N^p como asociado con el fenotipo que se estudia. Sin embargo, preferiblemente el elemento genético es un elemento genético funcional como lo reconoce generalmente el experto, que incluye y prefiere, pero no se limita a, un promotor, un gen, un intrón, un exón, un potenciador, una molécula de ARN no codificante, un elemento represor y similares. También se contemplan los polimorfismos de nucleótido simple (SNP), por ejemplo, un SNP sin un gen asociado.

[0049] Como entenderá el experto en la materia, la identificación del elemento genético se puede utilizar posteriormente para identificar elementos celulares adicionales. Por ejemplo, una vez que se identifica un gen con el método según la invención, también se identifica la proteína codificada por dicho gen mediante el método según la invención. Además, cuando, por ejemplo, la proteína codificada por el gen identificado es una enzima que produce un metabolito, el metabolito puede identificarse con el método según la invención. Otro ejemplo es cuando la proteína está, por ejemplo, implicada en la modificación posterior a la traducción de otra proteína y/o lípidos (por ejemplo, una cinasa) o está implicada en modificaciones epigenéticas; el sitio donde actúa dicha proteína también puede identificarse con el método según la invención. Otro ejemplo es cuando el gen codifica una transcripción no traducida, como un microARN que afecta a la expresión de otro gen, también puede identificarse dónde se produce dicha transcripción con el método según la invención. Tal identificación de elementos celulares, en particular proteínas y enzimas, que incluyen, por ejemplo, enzimas metilantes (de ADN y ARN), se contempla específicamente como perteneciente a la invención descrita en el presente documento.

[0050] El método descrito en este documento permite la identificación de un elemento genético (y los elementos celulares correspondientes (por ejemplo, proteína o metabolito)) que afectan a un fenotipo en una célula. El método según la invención implica someter las células a un tratamiento de mutagénesis, por ejemplo, usando mutagénesis química, una trampa génica o usando una biblioteca CRISPR de secuencias de ARN guía (que se describen en detalle a continuación). En una forma de realización preferida, el tratamiento permite, por ejemplo, la introducción de numerosas mutaciones diferentes y de todo el genoma en el conjunto de células sometidas al tratamiento. En otras palabras, en el conjunto de células (es decir, en la misma muestra), las células llevarán muchas mutaciones diferentes (por ejemplo, aleatorias) como consecuencia del tratamiento de las células, y donde diferentes células llevan diferentes mutaciones.

[0051] A continuación, las células se clasifican basándose en al menos un fenotipo dado para identificar el elemento genético que causa el fenotipo dado o está asociado con este, es decir, que afecta al fenotipo. En otras palabras, el elemento genético identificado con el método según la invención está involucrado en causar el fenotipo y/o rasgos del carácter considerados o está asociado a estos. Por ejemplo, el elemento genético identificado puede ser un gen que, como consecuencia de, por ejemplo, el tratamiento de mutagénesis, ha mutado, provocando, por ejemplo, la no expresión de la proteína correspondiente, lo que a su vez provoca un determinado rasgo de un carácter dado, un fenotipo. El elemento genético, en este caso el gen, interviene entonces en el establecimiento de los diversos rasgos del carácter (un rasgo es la consecuencia de la no expresión del elemento genético, en este caso el gen, mientras que, en consecuencia, otro rasgo está relacionado con la expresión del elemento genético) y, por lo tanto, afecta al fenotipo dentro del contexto de la presente invención.

[0052] Dentro del contexto de la presente invención, un fenotipo es un rasgo (una variante distinta de una característica fenotípica) de cierto carácter manifestado por el organismo o la célula. El rasgo puede observarse directa o indirectamente, en el último caso el rasgo es detectable usando medios adicionales (por ejemplo, usando un anticuerpo o cualquier otro medio o ensayo funcional). Por ejemplo, el carácter puede ser "respuesta a un fármaco”, siendo posibles rasgos "resistentes" o "sensibles". Otro carácter puede ser la abundancia de una proteína, siendo posibles rasgos "bajo", "normal" o "alto". Un tercer ejemplo es el rasgo "actividad cinasa celular de una proteína", siendo los rasgos posibles "sin actividad", "baja actividad" o "alta actividad". Un último ejemplo es el "estado de fosforilación de una proteína", de nuevo, siendo posibles rasgos, por ejemplo, "no fosforilado" o "fosforilado". De lo anterior, el experto comprenderá que un rasgo (o fenotipo) puede considerarse de manera cualitativa (por ejemplo, sin expresión frente a expresión de una proteína) o de manera cuantitativa (sin expresión, baja expresión, expresión normal, expresión superior a lo normal, alta expresión (o abundancia)).

[0053] Los ejemplos de otros caracteres preferidos (y el fenotipo/rasgos correspondientes) incluyen, entre otros: actividad de una proteína, abundancia de una proteína, abundancia de ARN, abundancia de un metabolito, potencial de membrana mitocondrial, modificación postraduccional de una proteína, número de lisosomas, forma de un orgánulo (por ejemplo, utilizando un citómetro de flujo como IMAGESTREAM proporcionado por Amnis), especies reactivas de oxígeno (ROS), número de peroxisomas u otros orgánulos, flujo de Ca u otros cationes, conformación de proteínas (utilizando cribados de anticuerpos (por ejemplo, detección de proteínas mal plegadas)), actividad cinasa, actividad fosfatasa, etc., son otras actividades proteicas comunes que pueden enumerarse.

[0054] Para el método según la invención, el fenotipo (carácter/rasgo) puede manifestarse o ser detectable en cualquier lugar de la célula (por ejemplo, en la superficie celular, en la membrana celular (capa interna y/o externa), en el citosol, en la membrana o lumen de un orgánulo, y similares). El fenotipo puede detectarse directa o indirectamente. Sin embargo, y a diferencia de los métodos conocidos en la técnica, el método según la invención es particularmente adecuado para un fenotipo (carácter/rasgo) que se manifiesta o detecta intracelularmente (es decir, en cualquier lugar excepto en la superficie celular). Con el método según la invención es posible detectar dicho fenotipo intracelular en una célula individual de un grupo de células (matando (permeabilizando y fijando) las células del grupo de células), clasificar las células del grupo de células (basándose en el fenotipo para el que se busca el elemento genético) y, utilizando tecnología de secuenciación, identificar los elementos genéticos que están involucrados o relacionados con el fenotipo. En una forma de realización preferida, el fenotipo es un fenotipo que se manifiesta intracelularmente, en particular que puede detectarse intracelularmente, por ejemplo después de fijar y permeabilizar el conjunto de células (lo cual se describe en más detalle en el presente documento a continuación). En una forma de realización preferida adicional, el fenotipo es un fenotipo que sólo puede detectarse intracelularmente y, por lo tanto, requiere la provisión de células que han sido sometidas a fijación y permeabilización y que, como consecuencia de dicho tratamiento, no son viables. Preferiblemente, el fenotipo que se puede detectar intracelularmente es un fenotipo que solo puede detectarse indirectamente (es decir, no es visible para el ojo, pero requiere medios adicionales, tales como sondas, para detectar el fenotipo). En una forma de realización preferida particular, el método según la invención es un método para identificar un elemento genético (por ejemplo, un promotor, gen, intrón, exón, ARN no codificante) que afecta a un fenotipo de una célula, donde el fenotipo es un fenotipo que se detecta (o se ha de detectar) intracelularmente. En otras palabras, el método según la invención es particularmente adecuado, pero no se limita a, aquellos fenotipos que pueden detectarse después de tratar las células de manera que el fenotipo pueda detectarse intracelularmente, por ejemplo, permeabilizando la membrana celular, permitiendo la entrada de sondas de detección en la célula. Dicho tratamiento hace que las células se vuelvan inviables (es decir, que las células ya no puedan multiplicarse en número). En una forma de realización preferida adicional, el método es para rasgos (fenotipos; caracteres) que solo pueden detectarse intracelularmente, es decir, que requieren la permeabilización de la membrana celular antes de que se pueda detectar el rasgo (fenotipo, carácter), aunque la invención no está limitada a esto. En tal forma de realización, los rasgos (fenotipo, carácter) no pueden detectarse desde el exterior de la célula (es decir, el rasgo (fenotipo, carácter) solo es detectable intracelularmente).

[0055] En una etapa inicial del método descrito en el presente documento, un grupo de células se somete a un tratamiento de mutagénesis (por ejemplo, como se detalla en el presente documento). Aunque no se limita a ello, el conjunto de células puede ser preferiblemente células obtenidas de un mismo organismo individual, aunque también se puede utilizar un conjunto de células que comprendan células de diferente origen. El conjunto de células pueden ser células primarias pero, por razones prácticas, se usa preferiblemente una línea celular. La línea celular puede ser una línea celular establecida (por ejemplo, una línea celular disponible comercialmente). El número de células del grupo no es crucial para el método descrito en este documento, pero el grupo puede comprender típicamente de 1 millón a varios cientos de millones de células, dependiendo de, por ejemplo, las células o el método de tratamiento utilizado en este paso inicial.

[0056] El término tratamiento de mutagénesis es ampliamente conocido en la técnica y se refiere a un tratamiento que introduce cambios en la información genética original (ADN) presente en la célula, por ejemplo mediante inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos. La mutación puede comprender el cambio de un solo nucleótido o puede comprender muchos nucleótidos adyacentes (por ejemplo, mediante deleción o inserción de nucleótidos adicionales). Dentro del contexto de la presente invención, el tratamiento de mutagénesis preferiblemente causa deleciones, inserciones o sustituciones en todo el genoma, es decir, puede causar mutaciones en diferentes posiciones en todo el genoma presente en la célula sometida al tratamiento. El tratamiento de mutación introduce preferiblemente mutaciones de manera aleatoria o semialeatoria, es decir, si el tratamiento no es un tratamiento dirigido específicamente a, por ejemplo, un elemento genético predeterminado. También se contempla el uso de bibliotecas que comprenden medios en donde cada medio introduce una mutación específica en una ubicación específica, y en donde los medios de la biblioteca juntos introducen mutaciones en todo el genoma (es decir, en diferentes posiciones por todo el genoma).

[0057] El tratamiento de mutagénesis usado en este paso inicial es preferiblemente, pero sin limitarse a este, un tratamiento que introduce muchas mutaciones diferentes en todo el genoma. En otras palabras, el tratamiento de mutagénesis según el método de la invención es, preferiblemente, un tratamiento que introduce muchas mutaciones diferentes y en muchas localizaciones diferentes en todo el material genético presente en la célula que se somete al tratamiento. Como consecuencia, se obtiene un conjunto de células en el que una célula puede tener diferentes mutaciones en comparación con otra célula del mismo conjunto de células, y donde una célula puede tener más de una mutación y en diferentes posiciones en el material genético presente en la célula. En otras palabras, el tratamiento de mutagénesis es un tratamiento que introduce mutaciones en más de una posición, es decir, que proporciona células portadoras de mutaciones diferentes cuando se comparan entre sí. Por ejemplo, el tratamiento de mutagénesis puede ser un tratamiento que introduce mutaciones de forma aleatoria o semi-aleatoria y, en consecuencia, puede afectar a diferentes elementos genéticos presentes en la célula. Alternativamente, la mutagénesis puede realizarse usando un (gran) número de mutágenos, cada uno de los cuales actúa sobre un sitio específico (por ejemplo, usando tecnología CRISPR). Al tratar con una biblioteca de este tipo, también se obtendrán células, cada una de las cuales lleva mutaciones diferentes (en lugar y en número). Con el tratamiento de mutagénesis, el conjunto de células se convierte así en un conjunto heterogéneo de células con respecto a la presencia de mutaciones en las células individuales y en comparación con el conjunto de células no tratadas; es decir, un conjunto de células mutagenizadas de manera heterogénea.

[0058] De hecho, un objetivo es proporcionar un método de la invención que permita identificar (nuevos) elementos genéticos que están implicados en un fenotipo dado. En ese sentido, se debe considerar que el método se relaciona con un cribado genético directo, es decir, la determinación de una base genética responsable de, involucrada o asociada con un fenotipo dado (predeterminado). Por lo tanto, el método según la invención también puede considerarse un método para determinar un elemento genético que es responsable de un fenotipo, está implicado o asociado con él, por ejemplo, un fenotipo predeterminado. El método primero detecta o determina un fenotipo y luego identifica el elemento genético que afecta al fenotipo (enfoque genético directo). La genética directa es diferente de la genética inversa, que determina la función de un gen mediante el análisis de los efectos fenotípicos de las secuencias de ADN alteradas (por ejemplo, mediante la introducción intencionada y selectiva de una mutación en un elemento genético predeterminado)./pct

[0059] El experto en la materia conoce las condiciones y circunstancias en las que el conjunto de células necesita someterse al tratamiento de mutagénesis y/o a un tratamiento que modifique la expresión génica. Dichos métodos se han descrito ampliamente en varios manuales y están disponibles para los expertos. Por ejemplo, se pueden usar métodos como los descritos en los ejemplos de este documento.

[0060] En un paso siguiente del método según la invención, se fija y permeabiliza el conjunto de células que se ha sometido al tratamiento de mutagénesis. Esto se puede hacer en un paso (usando una composición para fijar y permeabilizar las células) o se puede hacer en pasos separados usando composiciones separadas. El experto en la materia conoce bien los medios y maneras para fijar las células. La fijación puede incluir reticulación, pero también se puede hacer con agentes no reticulantes. Así en una forma de realización, y opcionalmente, la fijación incluye reticulación. En otra forma de realización las células se fijan, se reticulan y se permeabilizan. En otra forma de realización las células se fijan y se permeabilizan. Esto puede realizarse en un mismo tratamiento o en tratamientos separados. Mediante la fijación de las células se evita la autólisis y/o la putrefacción, conservando así los componentes celulares. En particular, la fijación de las células permite la posterior extracción y la posterior secuenciación del ADN y/o ARN (celular).

[0061] En la técnica, están disponibles muchos métodos o protocolos diferentes para la fijación de células, incluyendo los conjuntos de células que se utilizan en el método de la presente invención. Por ejemplo, la fijación puede realizarse usando protocolos basados en el uso de fijadores reticulantes como aldehídos (los fijadores reticulantes actúan creando enlaces químicos covalentes entre proteínas en la célula) o la fijación puede realizarse usando un protocolo basado en el uso de fijadores precipitantes como alcoholes (por ejemplo, como describen Smith y col. en Anal Biochem. 1987; 160 (1): 135-8; los fijadores precipitantes actúan reduciendo la solubilidad de las moléculas de proteínas y (a menudo) interrumpiendo las interacciones hidrófobas que dan a muchas proteínas su estructura terciaria). Sin embargo, también se pueden utilizar otros métodos para la fijación de las células (incluidos los métodos basados en agentes oxidantes y el fijador HOPE (efecto protector de disolventes orgánicos mediado por tampón de ácido glutámico-Hepes) (por ejemplo, http: //www.dcsdiagnostics.de/)) que se sepa que proporcionan una buena conservación de antígenos proteicos y buenos rendimientos de ARN y ADN y ausencia de proteínas de reticulación.

[0062] Además de la fijación de las células, las células se permeabilizan. La fijación y la permeabilización se pueden realizar en el mismo paso y/o se puede utilizar el mismo reactivo. De nuevo, el experto en la materia conoce bien los medios y métodos para permeabilizar las células. Puede ser necesaria la permeabilización para detectar compuestos intracelulares e intraorganulares (es decir, elementos celulares) tales como antígenos o lípidos y similares. Para ello, el conjunto de células debe permeabilizarse primero, por ejemplo, después de la fijación (pero la fijación y la permeabilización también pueden ocurrir al mismo tiempo).

[0063] Aunque en principio se puede usar cualquier tipo de reactivo para permeabilizar las células del conjunto, comúnmente se usan dos tipos generales de reactivos: disolventes orgánicos (que también pueden usarse para la fijación), como metanol, etanol y acetona, y detergentes como como saponina, Triton X-100 y Tween-20. Los disolventes orgánicos disuelven los lípidos de las membranas celulares, haciéndolas permeables. Debido a que los disolventes orgánicos también coagulan proteínas, pueden usarse para fijar y permeabilizar células al mismo tiempo. La saponina interactúa con el colesterol de la membrana, eliminándolo selectivamente y dejando agujeros en la membrana. Los detergentes como Triton X-100 y Tween-20 son de naturaleza no selectiva (analizados en detalle por Jamur Methods Mol Biol. 2010; 588: 63-6.).

[0064] Como entenderá el experto en la materia, al fijar y permeabilizar las células en el conjunto, estas células pierden la capacidad de dividirse y crecer, ya que las células no son viables después del tratamiento de fijación y permeabilización de las células. Por lo tanto, el método de la invención es particularmente útil, pero no se limita a ello, para identificar elementos genéticos que afectan a un fenotipo, en el que la detección del fenotipo requiere la fijación y/o permeabilización de las células.

[0065] En un paso siguiente del método descrito en este documento, el conjunto de células fijas y permeabilizadas se trata con una o más sondas que se pueden detectar y que se pueden usar para detectar (específicamente) el fenotipo afectado (o manifestado) (es decir, el rasgo de un carácter) para el que se va a identificar el elemento genético. Como ya se ha mencionado en este documento anteriormente, el rasgo puede ser un rasgo cualitativo y/o un rasgo cuantitativo. En caso de que el rasgo sea un rasgo cualitativo, la sonda puede usarse para detectar la presencia o ausencia del fenotipo (rasgo). En el caso de un rasgo cuantitativo, la sonda utilizada puede conducir inicialmente a una señal detectable tanto en las células que tienen el fenotipo dado como en las células que no lo tienen pero, según el nivel de la señal, las células serán calificadas o descalificadas por manifestar una fenotipo dado que se estudia. Por ejemplo, en caso de que se utilice un anticuerpo como sonda para detectar la abundancia de una proteína, la sonda detectará tanto las células que tengan niveles altos de la proteína como las células que tengan niveles bajos de la proteína. En función del nivel de abundancia (por ejemplo, bajo versus alto), las células que muestren una baja abundancia de la proteína se considerarán (y se clasificarán) como que no tienen el fenotipo si el fenotipo se define como alta abundancia de la proteína. La alta abundancia puede, por ejemplo, definirse como un 5, 10, 20 o 20 % de células que proporcionan la señal más alta del conjunto total de células.

[0066] En el método de la invención se pueden usar una o más sondas detectables. Las sondas pueden estar dirigidas al mismo fenotipo, pero también pueden estar dirigidas a detectar diferentes fenotipos en el mismo experimento. Por lo tanto, también se proporciona un método para identificar uno o más de un elemento genético para más de un fenotipo, en el mismo experimento (multiplex).

[0067] El método según la invención se puede utilizar en particular para fenotipos que consisten en más de un elemento. Por ejemplo, el fenotipo/rasgo puede definirse como que tiene alta expresión de una primera proteína y baja expresión de una segunda proteína. En tal forma de realización, el fenotipo puede ser detectado por una primera sonda que detecta el primer elemento del fenotipo y una segunda sonda que detecta el segundo elemento del fenotipo. La clasificación posterior basada en, en este ejemplo, ambas sondas permiten obtener las células (del conjunto de células) que manifiestan el fenotipo deseado, definido y/o dado. Por lo tanto, el fenotipo dentro del contexto de la presente invención puede ser un fenotipo que comprende solo un elemento, pero también puede ser de naturaleza más compleja y comprender diferentes elementos que, juntos, definen el fenotipo.

[0068] Las sondas utilizadas en este paso del método pueden ser cualquier sonda que pueda utilizarse de forma adecuada para detectar (un elemento de) el fenotipo dado. En una forma de realización preferida, la sonda detectable es un anticuerpo, una sonda de ARN o una sonda de ADN. Como sabe el experto en la materia, las sondas de ARN son secuencias de longitud variable que se utilizan para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos complementarias en una muestra. Las sondas de ARN pueden marcarse con nucleótidos modificados que pueden detectarse, por ejemplo, mediante fluorescencia o quimioluminiscencia. Por ejemplo, se puede hacer uso de técnicas que incluyen la hibridación in situ de fluorescencia de ARN (FISH de ARN). Por ejemplo, se podrían usar sondas de a Rn en telómeros para cuantificar la abundancia de ADN telomérico (por ejemplo, como el fenotipo afectado). Alternativamente, se pueden utilizar balizas moleculares o balizas de ARN (las balizas moleculares incluyen oligonucleótidos con estructura de bucle en horquilla equipados con un atenuador de fluorescencia en un extremo y un tinte fluorescente (también llamado indicador o fluoróforo) en el extremo opuesto. Esta estructura permite que la baliza, en ausencia de su secuencia diana complementaria, no emita fluorescencia. Al unirse a sus dianas, las balizas emiten fluorescencia, debido a la separación espacial del atenuador y el reportero.) Las balizas moleculares se pueden utilizar como sondas detectables en el método según la invención (véase también Journal of Nucleic Acids Volume 2011 (2011), ID de artículo 741723), y puede obtenerse en diferentes empresas, como Eurogentec. En general, estas sondas de ARN se utilizan para cuantificar moléculas de ARN, como moléculas de ARNm. Encuentran sus dianas a través de la hibridación y pueden equiparse con un fluoróforo u otros (véase, por ejemplo, Klemm y col. Nat. Methods 2014 mayo; 11 (5): 549-51.doi: 10.1038/nmeth.2910).

[0069] Los anticuerpos adecuados incluyen, entre otros, anticuerpos que detectan una determinada proteína, anticuerpos que detectan específicamente la presencia o ausencia de una modificación postraduccional específica (por ejemplo, un anticuerpo fosfoespecífico) o anticuerpos que detectan específicamente una estructura terciaria de proteína. Otras sondas preferidas incluyen, entre otros, miméticos de anticuerpos (tales como avímeros, moléculas Affibody y similares), sondas basadas en biotina/estreptavidina, agentes de captura de proteínas de tipo anticuerpo, nanocuerpos, aptámeros, etc.

[0070] A continuación, las células del conjunto se clasifican basándose en la detección de al menos una de las una o más sondas detectables. La comparación de una población negativa y positiva (es decir, una que tiene el rasgo y otra que no tiene el rasgo) conduce a la identificación de reguladores. La clasificación de células es una técnica ampliamente conocida por el experto en la materia, y se puede utilizar cualquier método conocido en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen la citometría de flujo, incluida la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). La citometría de flujo y la clasificación de células son tecnologías muy establecidas en el diagnóstico clínico y la investigación biomédica. En general, en la FACS se ponen mezclas heterogéneas de células en suspensión y se hacen pasar a través de uno o más puntos de interrogación láser. Las señales emitidas por las partículas se recopilan y correlacionan con un fenotipo determinado, como la morfología celular, la expresión de proteínas de superficie e intracelular, la expresión de genes y la fisiología celular. Según los parámetros definidos por el usuario, las células individuales pueden luego desviarse de la corriente de fluido y recogerse en fracciones homogéneas a velocidades excepcionalmente altas y con una pureza que se aproxima al 100 % (véase Ibrahim SF Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007; 106: 19-39). Como entenderá el experto en la materia, las células clasificadas en el método según la invención ya no son viables como consecuencia del paso de fijación y permeabilización.

[0071] Otras técnicas adecuadas incluyen la clasificación celular activada magnéticamente (MACS), técnicas de unión por afinidad y métodos basados en microfluidos (revisados por Autebert J. Methods. 201257 (3): 297-307). La clasificación puede realizarse en un paso, o puede consistir en más de un paso (a saber, en donde en un paso siguiente se clasifica adicionalmente un primer conjunto de células clasificadas). La clasificación da como resultado una o más poblaciones de células que se basan en el fenotipo que se estudia. Por ejemplo, la clasificación puede dar como resultado una primera población de células que tienen el rasgo detectado por la sonda y una segunda población de células que no tienen el rasgo. La célula también puede clasificarse en varias poblaciones diferentes, por ejemplo, células que, según la detección por la sonda, no comprenden una determinada proteína o ARN, células que comprenden un nivel bajo (definido por el usuario) de determinada proteína o a Rn , células que comprenden el nivel normal (definido por el usuario) de determinada proteína o ARN, y células que comprenden un nivel alto (definido por el usuario) de determinada proteína o ARN. La clasificación también puede dar como resultado una sola población, en la que, por ejemplo, todas las células manifiestan el fenotipo dado (en función de la sonda utilizada para la detección) o ninguna de las células manifiesta el fenotipo dado. La población puede compararse, por ejemplo, con información previa obtenida de una población de células que no tiene el fenotipo/rasgo, o por comparación con (parte de) la población completa de células antes de la clasificación (es decir, la población no clasificada).

[0072] Después de clasificar la célula, opcionalmente pero preferiblemente después de la fijación basada en reticulación, las células pueden desreticularse con el fin de hacer que el ADN y/o ARN estén disponibles para el paso de secuenciación del método según la invención. Además, por ejemplo, cuando se usa un alcohol para la fijación y permeabilización de las células, las células pueden tratarse adicionalmente con una proteasa para purificar el ADN/ARN de las células clasificadas. En los métodos que no incluyen la reticulación, el ADN/ARN se puede aislar fácilmente usando métodos conocidos por el experto, sin la necesidad de eliminar la reticulación. Las células que fijadas y permeabilizadas con otros reactivos como formaldehído (y, por ejemplo, un detergente) se pueden desvincular antes del aislamiento del ADN. El experto dispone de métodos para eliminar la reticulación de las células y, en parte, estos dependen del método de fijación y permeabilización utilizado. Por ejemplo, para facilitar la eliminación de la reticulación de los gránulos de células clasificadas, las células se pueden resuspender en un tampón e incubarse durante varias horas con agitación y después de la adición de proteinasa K y tampón de lisis (véanse los ejemplos a continuación). Otros protocolos de eliminación de la reticulación incluyen la incubación a 65 grados Celsius durante 5 horas, sin proteinasa K, después de lo cual se agrega proteinasa K y se incuba durante varias horas a 42 grados Celsius.

[0073] Así, en una forma de realización preferida de la invención, la fijación del conjunto de células es una fijación que es reversible, es decir, el método comprende un paso de fijación reversible con un agente de fijación (véase, por ejemplo, Eltoum I Advanced concepts in fixation: 1. Effects of fixation on immunohistochemistry, reversibility of fixation and recovery of proteins, nucleic acids, and other molecules from fixed and processed tissues. 2. Developmental methods of fixation. J Histotechnol 2001;24;201-210), y/o es un método que no afecta al material genético para el procesamiento de seguimiento. Tales métodos son generalmente conocidos en la técnica y un ejemplo no limitante es la fijación reversible con formaldehído, un ejemplo de la cual se muestra en los Ejemplos de este documento. Alternativamente, como ya se ha mencionado en el presente documento, la fijación y la permeabilización se pueden realizar sin reticulación, por ejemplo usando alcoholes. En tales métodos, no se requiere la eliminación de la reticulación y el ADN/ARN se puede obtener fácilmente.

[0074] En un siguiente paso, al menos parte de las células de al menos parte de las poblaciones obtenidas se secuencia para identificar uno o más elementos genéticos (ARN o ADN) que afectan al fenotipo de las células. Para la presente invención, el método de secuenciación no es crucial; sin embargo, preferiblemente la secuenciación comprende métodos de secuenciación de alto rendimiento y/o tecnologías de secuenciación de nueva generación, por ejemplo pirosecuenciación 454, secuenciación de Illumina (Solexa) (véase el ejemplo a continuación), secuenciación SOLiD, secuenciación de nanobolas de ADN, secuenciación de ARN o cualquier otra técnica. Preferiblemente, la secuenciación implica una secuenciación profunda (es decir, una secuencia en la que el número total de lecturas es muchas veces mayor que la longitud de la secuencia en estudio; es decir, una profundidad/cobertura de al menos 2, 710 o incluso 50 o 100 o más).

[0075] Antes de la secuenciación del material genético, el material genético puede someterse a pasos adicionales de preparación o procesamiento, como la amplificación de (parte de) el material genético utilizando, por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Por ejemplo, cuando el conjunto de células se trata con un protocolo de mutagénesis usando vectores de trampa génica, introduciendo mutaciones de inserción en el genoma de mamífero, los sitios de inserción pueden, antes de la secuenciación, amplificarse usando PCR, por ejemplo, y preferiblemente usando una reacción en cadena de la polimerasa con amplificación lineal (LAM-pCr ) utilizando el ADN genómico total. El experto en la materia conoce bien dichos métodos, incluidas las variaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Ranzani y col. (2013) Protocol Exchange (2013) doi:10.1038/protex.2013.009 o Schmidt y col. (2007) Nature methods 4, 1051-7).

[0076] En una forma de realización se secuencia el ADN o ARN total; en otra forma de realización solo se secuencia una parte del ADN del ARN.

[0077] En función de los resultados de la secuenciación, se pueden identificar uno o más elementos genéticos que afectan al fenotipo, por ejemplo, mediante la comparación de los resultados de una primera población que se había clasificado como que manifestaba el fenotipo dado y una segunda población (o más) que se había clasificado como que no manifestaba el fenotipo dado (o en menor medida). Las diferencias en las secuencias de ADN obtenidas son indicativas de elementos genéticos que están o no implicados en el fenotipo dado. Por ejemplo, si se encuentra insertado un vector de trampa génica en un gen dado en la población de células que muestran el fenotipo y no en la población de células que no muestran el fenotipo, dicho gen se considera un elemento genético que afecta el fenotipo (ya que el vector de trampa génica inactiva el gen).

[0078] Por ejemplo, se pueden utilizar diversos métodos para identificar genes/elementos genéticos en los que se ha insertado un vector de trampa génica. Por ejemplo, se puede usar PCR inversa para identificar secuencias genómicas que flanquean la inserción. Alternativamente, se utiliza PCR con molécula adaptadora splinkerette (Horn, C y col., Nat. Genet., 39: 807-8, 2007) o 5'-RACE (amplificación rápida de extremos de a Dnc) para amplificar secuencias celulares contenidas en una transcripción de fusión de trampa génica (véase, por ejemplo, Nature Methods, 2(8), 2005). Como entenderá el experto en la materia, cuanto más frecuentemente se encuentre/identifique específicamente un determinado elemento genético en la población de células que manifiestan el fenotipo dado (y no se encuentre, o menos, en una población que no muestra el fenotipo dado) o las derivaciones de un determinado fenotipo o se identifiquen elementos genéticos (por ejemplo, colección de diferentes mutaciones que afectan al mismo gen), es más probable que el elemento genético candidato afecte al fenotipo. Por ejemplo, cuando se usa mutagénesis por inserción en el paso (a) del método, la proporción de inserciones en el genoma entre las poblaciones clasificadas puede determinarse para varias posiciones en el genoma. Si un elemento genético es un regulador positivo de un determinado fenotipo/rasgo, mostrará relativamente menos inserciones en el elemento genético en comparación con elementos genéticos no relevantes en una población celular que sea positiva para el rasgo. Un regulador negativo de un determinado fenotipo/rasgo mostrará relativamente más inserciones en una población celular que sea positiva para el rasgo. Los métodos para comparar las poblaciones son ampliamente conocidos por los expertos (véase, por ejemplo, van Opijnen y col. Nature Methods 6, 767 - 772 (2009).) o Sun y col. Cell Reports 7, 86-93, 2014 (http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2014.02.045.) Otros posibles métodos de ese tipo se describen en los Ejemplos.

[0079] Obviamente, los resultados obtenidos de la secuenciación de las células que manifiestan el fenotipo (o, independientemente, que no manifiestan el fenotipo) pueden compararse con los resultados de análisis anteriores en lugar de compararlos con una segunda población obtenida.

[0080] En una forma de realización de la invención, los resultados obtenidos de las células que no manifiestan el fenotipo dado pueden usarse para excluir que los elementos genéticos candidatos afecten a un fenotipo dado.

[0081] Se prefiere que en el paso (d) se obtengan al menos dos poblaciones de células con la clasificación de las células en función de la detección de al menos una de las una o más sondas detectables y que en el paso (f) al menos se secuencien y comparen dos poblaciones de células para identificar elementos genéticos que afecten el fenotipo de la célula.

[0082] La invención no se limita a una o dos poblaciones en el paso (d) del método según la invención; dependiendo del fenotipo, el método según la invención también puede comprender el uso de tres, cuatro, cinco o incluso más poblaciones. Por ejemplo, al comparar más poblaciones, el método puede, por ejemplo, permitir la identificación de elementos genéticos que desempeñan diferentes roles en diferentes poblaciones. Por ejemplo, al comparar cuatro poblaciones de células que tienen diferente abundancia de un ARNm dado (ninguna, baja, normal, alta), se puede observar que en la segunda población está involucrado un cierto elemento genético A, que en la tercera población, junto a elemento genético A, también está implicado un determinado elemento genético B, mientras que en la cuarta población sólo está implicado el elemento genético C. Así, en una forma de realización preferida del método de la invención, en el paso (d) se obtienen al menos tres, cuatro, cinco, seis o más poblaciones, y preferiblemente en el paso (f) al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o más poblaciones se someten a secuenciación.

[0083] Como se ha mencionado anteriormente, el elemento genético puede ser cualquier tipo de elemento presente en la célula. Sin embargo, preferiblemente, el elemento genético es una unidad funcional en el material genético, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en un gen, un intrón, un exón, un promotor y un ARN no codificante. Otros incluyen operones, operadores, un sitio de inicio de la transcripción, potenciadores, silenciadores, aislantes y similares. De la manera más preferible, el elemento genético que se identifica es un gen.

[0084] El método descrito en el presente documento puede emplearse usando cualquier tipo de célula que pueda someterse a los diferentes tratamientos en las etapas de la invención (fijación por mutagénesis, etc.), por ejemplo, células procariotas y eucariotas. Sin embargo, en una forma de realización preferida, las células del conjunto de células se seleccionan del grupo que consiste en una célula eucariota, una célula animal, una célula vegetal, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula humana o una célula madre. La célula puede ser, por ejemplo, una célula madre pluripotente o una célula madre pluripotente inducida. La célula puede obtenerse de un embrión no humano. El embrión en el que esto conduce a la destrucción de la célula no se obtiene de un embrión humano. El método no se utiliza para modificar la identidad de la línea germinal de los seres humanos. Las células pueden ser células primarias o pueden ser líneas celulares. Las líneas celulares pueden estar modificadas genéticamente o no.

[0085] Las células pueden tener la ploidía (el número de conjuntos de cromosomas en una célula) que es normal para el organismo del que se obtuvieron originalmente las células (por ejemplo, diploide para humanos y la mayoría de los animales). Las células pueden ser células diploides o, por ejemplo, en el caso de materia vegetal, pueden ser células poliploides, por ejemplo triploides, tetraploides, pentaploides, etc. En una forma de realización preferida, las células son células casi haploides o células completamente haploides, preferiblemente células de mamífero casi haploides o completamente haploides, más preferiblemente células casi haploides o células humanas completamente haploides.

[0086] En casi todos los mamíferos, incluidos los humanos, la mayoría de las células somáticas normalmente son diploides, es decir, contienen dos copias homólogas de cada cromosoma (distintas de los dos cromosomas sexuales, que pueden ser homólogos o no homólogos según el sexo y la especie en particular). Los miembros de un par homólogo son cromosomas no idénticos que contienen los mismos genes en los mismos locus pero posiblemente tienen diferentes alelos (es decir, diferentes variantes genéticas) de esos genes.

[0087] Por el contrario, una célula haploide contiene solo una copia de cada cromosoma. Una célula de mamífero casi haploide, como se usa en la técnica, se refiere a una célula de mamífero en la que no están presentes más de 5 cromosomas en dos o más copias. En algunas formas de realización, una célula de mamífero casi haploide no tiene más de 1, 2, 3 o 4 cromosomas presentes en dos o más copias. Cuando ninguno de los cromosomas está presente en dos o más copias, las células se consideran células haploides.

[0088] En algunas formas de realización de la invención, la célula de mamífero casi haploide es una célula humana. En algunas formas de realización de la invención, la célula de mamífero casi haploide es una célula de mamífero no humana, por ejemplo, una célula de primate no humano o una célula de roedor, por ejemplo, una célula de ratón, rata o conejo. En algunas formas de realización de la invención, la célula de mamífero casi haploide es una célula de linaje hematopoyético, por ejemplo, una célula linfoide o mieloide. En algunas formas de realización de la invención, la célula de mamífero casi haploide es una célula tumoral, por ejemplo, un descendiente de una célula procedente de un tumor. Por ejemplo, la célula de mamífero casi haploide es una célula de la línea celular KBM7, o un subclon de la misma. En otras formas de realización de la invención, la célula de mamífero casi haploide es una célula de leiomiosarcoma (Dal Sin, por ejemplo, y col., J Pathol., 185 (1): 112-5, 1988). Las células casi haploides se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente EP2451982.

[0089] Se pueden usar varios métodos de mutagénesis en el método según la invención. Dado que el propósito del método de la invención es identificar elementos genéticos que afectan a un fenotipo dado (genética directa), preferiblemente el método utilizado para la mutagénesis introduce modificaciones en todo el genoma presente en el conjunto de células. En una forma de realización preferida, las mutaciones se introducen de forma aleatoria o semialeatoria. En el contexto de la presente invención, la mutagénesis aleatoria y semialeatoria se refiere a métodos de mutagénesis que introducen mutaciones de forma aleatoria o semialeatoria (por ejemplo, dirigidas a determinadas regiones presentes en todo el genoma y basadas en la homología). Se considera que mutágenos químicos como etil metanosulfonato (EMS), ácido nitroso, mitomicina C,N-metil-N-nitrosourea (MNU), diepoxibutano (DEB), 1,2,7,8-diepoxioctano (DEO), metil metanosulfonato (MMS) , N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), 4-nitroquinolina 1-óxido (4-NQO), 2-metiloxi-6-cloro-9 (3-[etil-2-cloroetil]-aminopropilamino)-acridinodihidrocloruro (ICR-170), 2-amino purina (2AP) e hidroxilamina (HA) causan mutaciones aleatorias en el genoma. También el uso de radiación, por ejemplo, la radiación ultravioleta y/o la radiación radiactiva introducen mutaciones aleatorias. Alternativamente, se puede usar mutagénesis de inserción (por ejemplo, usando retrovirus o transposones), mutagénesis de marcado de firmas, trampa génica y otros procesos no(específicos) genéticos dirigidos.

[0090] Como alternativa, se puede usar un método de mutagénesis que utilice una biblioteca de mutágenos dirigidos a muchos sitios diferentes en el material genético de las células del conjunto, pero en el que cada miembro de la biblioteca es específico para solo uno o unos pocos sitios en el material genético. Por ejemplo, dicha biblioteca puede consistir en una biblioteca CRISPR de secuencias de ARN guía, en donde cada a Rn guía se dirige a una cantidad limitada de secuencias/posiciones en el genoma de la célula del conjunto, pero donde la biblioteca consiste en diferentes ARN guía, cada uno dirigido a una secuencia específica de las células (donde dicha secuencia, sin embargo, puede estar presente más de una vez en la célula).

[0091] La mutagénesis también puede comprender el uso de tecnologías de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR), o meganucleasas que incluyen nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), nucleasas de dedos de zinc y similares. Todas estas técnicas para introducir mutaciones son ampliamente conocidas por los expertos en la materia.

[0092] El tratamiento de mutagénesis puede ser, por ejemplo, un método que, de media, introduce solo unas pocas mutaciones por célula (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, ... 10 mutaciones por célula de media) o más.

[0093] En una forma de realización preferida, el tratamiento de mutagénesis es un tratamiento de mutagénesis aleatoria.

[0094] En una forma de realización preferida, la mutagénesis implica el uso de radiación, radiación ultravioleta e ionizante, productos químicos mutagénicos, preferiblemente metanosulfonato de etilo, ácido nitroso o etilnitrosourea, mutagénesis de inserción, preferiblemente mutagénesis de inserción basada en transposones o mutagénesis de inserción aleatoria basada en retrovirus, una biblioteca de CRISPR de secuencias de ARN guía (destinadas a generar mutaciones en muchos o todos los genes humanos, promotores, potenciadores o ARN no codificantes y similares), meganucleasa y/o mediante métodos que reprimen la reparación del ADN (acumulando así mutaciones).

[0095] En una forma de realización preferida, las células se exponen a una condición de agresión particular o condición de crecimiento de interés y/o las células se tratan con un compuesto, preferiblemente un fármaco, antes de que las células se fijen y permeabilicen en el paso (b), preferiblemente entre la realización del paso (a) y el paso (b).

[0096] En esta forma de realización, las células presentes en el conjunto pueden exponerse a una condición de agresión o condición de crecimiento o tratarse con un compuesto, preferiblemente un fármaco, antes de que las células se fijen y permeabilicen. La exposición o el tratamiento puede ser antes del tratamiento en el paso (a), durante el tratamiento en el paso (a) y/o después del tratamiento en el paso (a); pero antes de la fijación y permeabilización en el paso (b). La condición de agresión de las condiciones de crecimiento puede ser una condición de crecimiento que requiere que la célula adapte un fenotipo dado o que induzca tal fenotipo. Alternativamente, dicha condición puede usarse, en combinación con el tratamiento del paso (a), para seleccionar aquellas células que han adoptado un fenotipo (debido al tratamiento en el paso (a)) que permitió que las células sobrevivieran mejor al estrés de la condición de crecimiento, y, utilizando el método de la invención, para identificar los elementos genéticos que afectan este fenotipo. Por ejemplo, la condición de agresión puede ser un aumento de la temperatura o de la concentración de sal o la presencia de material tóxico en el medio de crecimiento. Otros ejemplos incluyen estrés metabólico, hipoxia y exposición a patógenos.

[0097] Cabe señalar que, en el método según la invención, el conjunto de células también puede ser un conjunto de células que han sido modificadas para llevar ya una mutación que se sabe que causa un fenotipo particular, por ejemplo, una enfermedad (hereditaria) (humana). Cuando tales células se utilizan como conjunto de células en el método según la invención, y se someten a los diversos pasos (a) -(f), se pueden identificar elementos genéticos que, por ejemplo, en el trasfondo genético dado, afectan a tal fenotipo y pueden ser un objetivo interesante para la intervención (véase la figura 16). Por lo tanto, en una forma de realización preferida, el conjunto de células que se usará en el método de la invención comprende células que comprenden al menos una mutación que causa (en el animal/humano/planta, preferiblemente humano) una afección, por ejemplo, afecciones hereditarias. Por ejemplo, la afección puede incluir enfermedades, incluido el cáncer, o, por ejemplo, resistencia a ciertos medicamentos.

[0098] Diferentes grupos de células tratados de manera diferente, por ejemplo, sometidos a diferentes formas de estrés o compuestos (antes, después o al mismo tiempo que se realiza la mutagénesis del tratamiento modificador de la expresión génica), también pueden usarse y compararse en el método según la invención.

[0099] El método según la invención también se puede utilizar para estudiar la respuesta de las células a un fármaco, y qué elementos genéticos están implicados en un fenotipo dado en relación con la respuesta a un fármaco (por ejemplo, fármacos que inducen vías de estrés o inducen fosforilación de proteínas). Por ejemplo, se puede saber que un fármaco determinado provoca la inhibición de la fosforilación de una determinada proteína. Al exponer las células al fármaco y realizar el método según la invención, se pueden identificar elementos genéticos que, por ejemplo, están implicados en la superación de la inhibición de la fosforilación de dicha proteína, o que están implicados en la inhibición.

[0100] Con el método según la invención, en algunas formas de realización, el mismo grupo de células se somete a un tratamiento de mutagénesis. El tratamiento de mutagénesis es un tratamiento que causa muchas mutaciones diferentes (aleatorias o dirigidas) en un mismo grupo de células. En otras palabras, se obtiene un conjunto de células en el que las células individuales comprenden diferentes mutaciones, no solo en número, sino también con respecto a la ubicación de la mutación. El método según la invención permite identificar, a partir de estos conjuntos heterogéneos de células, estas células que manifiestan el fenotipo de interés y, a su vez, el elemento o elementos genéticos responsables de afectar (o provocar) el rasgo (o fenotipo).

[0101] En una forma de realización preferida de la invención, el reactivo de fijación para fijar las células se selecciona del grupo que consiste en reactivos reticulantes, preferiblemente formaldehído, paraformaldehído, formalina y glutaraldehído o reactivos no reticulantes, preferiblemente fijadores a base de cloruro mercúrico, etanol, metanol o acetona.

[0102] El reactivo de fijación utilizado en el método según la invención puede ser cualquier tipo de reactivo de fijación adecuado siempre que permita que el ADN/ARN genómico pueda solubilizarse posteriormente y usarse para el análisis de secuencias (lo que puede implicar o no un paso adicional de amplificación del ADN). Sin embargo, los materiales preferidos incluyen reactivos reticulantes, preferiblemente formaldehído, paraformaldehído, formalina y glutaraldehído o reactivos no reticulantes, preferiblemente fijadores de cloruro mercúrico, etanol, metanol o acetona.

[0103] Preferiblemente, el reactivo de permeabilización se selecciona del grupo que consiste en disolventes, preferiblemente metanol y acetona, o detergentes, preferiblemente saponina, digitonina, Triton X-100 y Tween-20. Dentro del contexto de la presente invención, el experto en la materia conoce bien los métodos adecuados para fijar y permeabilizar el conjunto de células.

[0104] La sonda detectable puede ser cualquier tipo de sonda que pueda usarse para detectar el fenotipo o un elemento del mismo. Preferiblemente, la sonda detectable se une a una proteína, una proteína modificada después de la traducción, un lípido, ADN, ARN, o se une o detecta un metabolito o elemento celular. En otras palabras, cualquier sonda que pueda ser detectada y que pueda usarse para detectar ARN, proteínas, modificaciones de proteínas (por ejemplo, modificadas por ubiquitina, grupos metilo, lípidos, etc.), modificaciones de ARN, modificaciones de ADN o cualquier metabolito puede ser adecuada para su uso en el método de la invención.

[0105] Por ejemplo, y en una forma de realización preferida, la sonda es un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo marcado, preferiblemente con un marcador fluorescente, o un anticuerpo que puede detectarse con un anticuerpo adicional que comprende dicho marcador. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo fosfoespecífico (por ejemplo, un anticuerpo que solo se une a una versión fosforilada de la proteína). La sonda detectable también puede ser un receptor para un ligando o un ligando para un receptor. La sonda detectable también puede ser un ácido nucleico que se hibridará específicamente basándose en la complementariedad de la secuencia con una diana (ADN o ARN) en la célula. También se pueden emplear otras sondas útiles, que incluyen miméticos de anticuerpos, como se ha descrito anteriormente.

[0106] El término elemento celular en este contexto se refiere a cualquier otro elemento de la célula que no sea un elemento genético e incluye pero no se limita a las proteínas, lípidos y azúcares y carbohidratos presentes en la célula, pero también incluye metabolitos y biomoléculas presentes en la célula, orgánulos o membranas.

[0107] Se puede utilizar cualquier método adecuado para clasificar las células en el método de la invención, siempre que se pueda utilizar para detectar una sonda utilizada en el método de la invención. En una forma de realización preferida, la clasificación implica citometría de flujo, análisis por FACS, citometría de masas y/o clasificación magnética.

[0108] Preferiblemente, la sonda utilizada en el método de la invención comprende un resto detectable, preferiblemente seleccionado de entre un resto fluorescente, un resto radiactivo, un resto magnético o un marcador que se puede medir usando espectrometría de masas. Tales etiquetas y el uso de las mismas son ampliamente conocidos por los expertos.

[0109] En una forma de realización preferida del método según la invención, el método se utiliza para un fenotipo que se manifiesta en el citosol, dentro de un orgánulo, en la membrana de un orgánulo o en la membrana celular, preferiblemente en la capa interna de la membrana celular.

[0110] Preferiblemente, el fenotipo es un fenotipo que requiere la permeabilización de las células para permitir la detección del fenotipo con la sonda.

[0111] El método de la invención puede usarse para cualquier tipo de fenotipo. Preferiblemente, el fenotipo es o implica un aumento de la abundancia de proteínas, una disminución de la abundancia de proteínas, un aumento de la actividad de las proteínas, una disminución de la actividad de las proteínas, un aumento de la modificación postraduccional de una proteína, una disminución de la expresión postraduccional de una proteína, un aumento de la abundancia de ARNm o una disminución de la abundancia de ARNm.

[0112] En otro aspecto, se proporciona un método para identificar un modulador, por ejemplo un inhibidor o activador, de un producto génico (endógeno) codificado por un gen candidato que afecta a un fenotipo de una célula, preferiblemente en el que dicho fenotipo se manifiesta (o detecta y presente) intracelularmente, donde el método comprende los pasos de:

(a) Someter un grupo de células a un tratamiento de mutagénesis;

(b) Fijar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de fijación, y opcionalmente un agente de reticulación, y permeabilizar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de permeabilización; (c) Tratar el conjunto de células con una o más sondas detectables, preferiblemente un anticuerpo o una sonda de ARN (fluorescente), para detectar el fenotipo afectado (o manifestado);

(d) Clasificar las células en función de la detección de al menos una de las una o más sondas detectables para obtener una o más poblaciones de células,

(e) Opcionalmente, desreticular las células de cada una de las poblaciones de células obtenidas;

(f) Secuenciar al menos parte de las células de al menos parte de las poblaciones de células obtenidas para identificar un elemento genético que afecta al fenotipo de la célula, en el que el elemento genético es un gen candidato.

(g) Identificar un modulador que afecta a la expresión o actividad de un producto de expresión de dicho gen candidato identificado que afecta al fenotipo de la célula.

[0113] Con el método según la invención se pueden identificar elementos genéticos que afectan a un fenotipo dado. En función del elemento genético, se puede reconocer un elemento celular correspondiente, por ejemplo, una proteína cuya actividad, expresión o abundancia está modulada por el elemento genético identificado (por ejemplo, el elemento genético es el gen que codifica la proteína). A su vez, puede identificarse un modulador de la actividad del producto génico (por ejemplo, proteína) del gen candidato identificado usando ensayos de cribado. El modulador puede, por ejemplo, influir directamente en la expresión del producto génico o puede modular la actividad de la proteína o puede modular la degradación o el procesamiento postraduccional de la proteína.

[0114] Los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para diversos fines. Preferiblemente, los métodos se usan para establecer o analizar vías biológicas, para identificar genes involucrados en enfermedades, preferiblemente en cáncer, para estudiar interacciones fármaco-diana, para estudiar interacciones fármaco-fármaco, o para analizar la supresión o modulación de un fenotipo, preferiblemente donde el fenotipo es un fenotipo asociado con una enfermedad. En vista de la divulgación en el presente documento, el experto en la materia comprenderá cómo se puede usar el método según la invención para los propósitos dados anteriormente.

[0115] El modulador puede ser cualquier tipo de compuesto, incluidos compuestos orgánicos o inorgánicos, fármacos candidatos y similares.

[0116] Para el experto en la materia está claro que el método según la invención no solo permite la identificación de un elemento genético, sino que, en consecuencia, el método también permite la identificación de elementos celulares que están relacionados o corresponden al elemento genético. Por ejemplo, basándose en el elemento genético identificado, se puede identificar la proteína o enzima correspondiente, o el elemento genético relacionado (por ejemplo, promotor y gen) o incluso una vía que comprende más de una proteína.

[0117] El método de la invención posee muchas ventajas con respecto a los de la técnica y permite la identificación de elementos genéticos que no podrían ser identificados por los métodos de la técnica anterior, como se ejemplifica en el presente documento, incluida, por ejemplo, la identificación de dianas para la supresión de enfermedades (véase la figura 16). Una de las ventajas de este enfoque es que el método acopla directamente fenotipos (o mediciones cuantitativas de biomoléculas) a mutaciones reales en el genoma y permite hacerlo utilizando millones de células que tienen millones de genotipos diferentes. El método permite hacerlo en células que están fijadas y que ya no se pueden cultivar para aumentar el número de genomas mutantes, permitiendo así el análisis de fenotipos que están, por ejemplo, presentes intracelularmente. En una forma de realización, esto se logra usando, por ejemplo, trampas génicas o enfoques basados en mutagénesis de inserción comparables. Cuando, por ejemplo, se utiliza una trampa génica, se producen integraciones en todo el genoma y no se pueden diseñar 2 secuencias cebadoras específicas para recuperar las secuencias de ADN flanqueante afectadas. Sin embargo, esto se puede lograr con el método que se ha desarrollado, en el que se ha desarrollado un protocolo LAM-PCR optimizado que permite la recuperación de sitios de inserción de trampa génica de muy pocas células e incluso de células individuales que habían sido fijadas y permeabilizadas. Los pasos para hacer que la recuperación sea lo suficientemente sensible son, por ejemplo, el uso de un cebador de captura doble biotinilado, polimerasa Accurprime, una ARN ligasa recombinante que también puede ligar ADN monocatenario y el uso de una porción conectora preadenilada de secuencia optimizada. Este enfoque funciona muy bien con tales trampas génicas y un método de mutagénesis de inserción comparable. Por ejemplo, este enfoque también funciona haciendo uso de una biblioteca de CRISPR combinada para mutagénesis, pero se prefiere el uso de trampas génicas. El acoplamiento directo de mutaciones en el genoma a fenotipos aumenta la precisión (véase más adelante), así como la intensidad de la señal.

[0118] Una ventaja adicional del método de la invención es que para muchos genes se pueden medir varios cientos o miles de mutaciones por gen individual. Debido a esto, se puede contar la frecuencia de las mutaciones en genes individuales. Gracias a que se puede usar el recuento, no es necesario medir la abundancia de cada mutación (o agente que perturba los genes, como ARNhc o CRISPR). Medir la abundancia de cada componente de una biblioteca compleja es un desafío en una cantidad limitada de material biológico debido a las variaciones que se introducen mediante la amplificación por PCR. En el método desarrollado, se ignora la frecuencia con la que se recupera una mutación, pero se cuenta y se compara el número de mutaciones en genes individuales. Cuando ahora se comparan diferentes estados fenotípicos (por ejemplo, células con una gran cantidad de proteína LAMP1 versus células con una baja cantidad de proteína lAm P1), esto da como resultado de nuevo la identificación de genes que afectan a los fenotipos con resultados muy bajos de falsos positivos.

[0119] La naturaleza cuantitativa de este espectro de mutación y el hecho de que la mayoría de los resultadoss no son causados por ruido permiten comparar los espectros de mutación con la intensidad de un fenotipo (biomolécula alta/baja), en diferentes fenotipos (por ejemplo, genes requeridos para la biogeneración de un residuo de lisina acetilado o trimetilado) o genotipos (supresores o potenciadores específicos de genotipo de un fenotipo). Por último, al comparar muchas lecturas de fenotipos diferentes, los genes se pueden agrupar en función de su resultado fenotípico. Por lo tanto, el análisis comparativo de espectros de mutación facilita nuevas formas de estudiar y comparar fenotipos biológicos. Es importante destacar que esto no sería práctico cuando se utiliza un enfoque que da como resultado una cantidad significativa de ruido o que requiere un seguimiento experimental significativo para separar los resultados reales del ruido.

[0120] Finalmente, debido a que los espectros de mutación se pueden comparar directamente, un cribado comparativo en células de tipo salvaje y mutantes puede señalar potenciadores o supresores de fenotipo específicos para un genotipo. Es importante destacar que, cuando el genotipo de interés está relacionado con una enfermedad humana (por ejemplo, una enfermedad hereditaria o una enfermedad causada por mutaciones somáticas del ADN), esto puede señalar dianas para la supresión de la enfermedad. Esto se puede utilizar para identificar productos genéticos que, cuando se inhiben, protegen contra enfermedades. Los fármacos desarrollados para actuar sobre tales dianas podrían usarse para suprimir la enfermedad (véase la figura 16). Habiendo descrito completamente esta invención en el presente documento, los expertos en la técnica apreciarán que la misma se puede realizar dentro de una amplia gama de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin experimentación indebida.

[0121] Si bien esta invención se ha descrito en relación con formas de realización específicas de la misma, se entenderá que es susceptible de modificaciones adicionales. Esta solicitud está destinada a cubrir cualquier variación, uso o adaptación de las invenciones siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo las desviaciones de la presente divulgación que se encuentren dentro de la práctica conocida o habitual dentro de la técnica a la que pertenece la invención y tal como se puedan aplicar a las características esenciales anteriormente expuestas como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

[0122] La referencia a pasos de método conocidos, pasos de método convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales no es de ninguna manera una admisión de que cualquier aspecto, descripción o forma de realización de la presente invención se divulgue, enseñe o sugiera en la técnica relevante.

[0123] La descripción anterior de las formas de realización específicas revelará tan completamente la naturaleza general de la invención que otros pueden, aplicando conocimientos dentro de la habilidad de la técnica (incluido el contenido de las referencias citadas en este documento), modificar y/o adaptar fácilmente a diversas aplicaciones tales formas de realización específicas, sin experimentación innecesaria.

[0124] Debe entenderse que la fraseología o terminología de este documento tiene el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente especificación debe ser interpretada por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y la guía aquí presentada en combinación con el conocimiento de un experto en la técnica.

Métodos

[0125] Se produjeron retrovirus de trampa génica necesarios para la mutagénesis de las células HAP1 (por ejemplo, como se describe en Carette y col. (2011). Nature, 477 (7364), 340-3. doi: 10.1038/nature10348; disponible en www.horizon-genomics.com/hap1-wildtype.html) en células HEK293T utilizando el vector de trampa génica descrito anteriormente (Jae y col., Science 2013340 (6131): 479-83) y se utilizó un retrovirus de trampa génica similar en el que se intercambió proteína fluorescente verde (GFP) con proteína fluorescente azul (BFP).

[0126] Las células se sembraron en 12 matraces T175 al 40 % de confluencia. Al día siguiente, el medio se reemplazó con DMEM suplementado con suero fetal de ternero (FCS) al 30 % antes de la transfección con 6,6 microgramos de plásmido de trampa génica por matraz T175, en combinación con los plásmidos de empaquetamiento Gag-pol, VSVg y pAdv (Carette y col., Science 2009326 (5957): 1231-1235). El medio se recogió 48 horas después de la transfección y posteriormente se concentró mediante ultracentrifugación a 21000 rpm durante 2 horas a 4 °C. El sobrenadante se descartó y los sedimentos se resuspendieron en 200 microlitros de solución salina con pH regulado con fosfato (PBS, Life Technologies) durante la noche a 4 °C. Se recogió medio que contenía retrovirus y se concentró dos veces cada día durante tres días.

[0127] Para generar una población de células HAP1 mutagenizadas, se sembraron 40 millones de células HAP1 y se transdujeron con retrovirus de trampa génica de dos cosechas combinadas en tres días consecutivos en presencia de 8 microgramos/ml de sulfato de protamina (Sigma). La biblioteca mutante se expandió posteriormente durante un período máximo de 10 días antes del análisis de un fenotipo intracelular mediante tinción con FAC.

[0128] Para los cribados genéticas, las bibliotecas de HAP1 mutagenizadas se expandieron a 3x109 células, se disociaron con tripsina-EDTA (Life Technologies) y posteriormente se fijaron con tampón de fijación BD I (BD Biosciences) durante 10 minutos a 37 °C. Después de un lavado con PBS que contenía FCS al 1 %, las células se permeabilizaron mediante suspensión en tampón de permeabilización BD (BD biosciences) frío (-20°C) mientras se agitaban y se incubaron en hielo durante 30 minutos.

[0129] Después de dos lavados en PBS/FCS al 1 %, las células se filtraron a través de un colador de 40 micrómetros (BD FalconTM). La tinción se realizó en 100 microlitros por 107 células con anticuerpos primarios específicos (1:200 - 1:400) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron en tampón de lavado (PBS/FCS al 1 %) dos veces y se tiñeron con el anticuerpo secundario (anticuerpo ALEXA488, -568 o -647, Life Technologies) durante una hora en la oscuridad.

[0130] Además, para minimizar los posibles efectos de confusión de las células diploides que son heterocigotas para los alelos que llevan integraciones de trampa génica, el contenido de ácido desoxirribonucleico (ADN) se tiñó usando o bien 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) 3 microM o bien una solución de yoduro de propidio (Life Technologies) a 10 microgramos/ml. En el último caso, las células también se trataron con ARNasa A (Qiagen) a 100 microgramos/ml a temperatura ambiente durante 1 hora.

[0131] Para la tinción de anticuerpos en el compartimento nuclear (por ejemplo, modificaciones de histonas), las células se fijaron en la oscuridad con tampón de fijación/permabilización (eBioscience) durante una hora a temperatura ambiente. Después de dos lavados en tampón de permeabilización que contenía FCS al 5 %, las células se resuspendieron en HCl 2 M y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente para agregar células y desnaturalizar el ADN. De ese modo, se mezcló suavemente la suspensión celular. Para la neutralización, las células se lavaron con Na2B4O70,1 M (pH = 8,5) y se tiñeron con el anticuerpo primario (100 microlitros por 107 células; 1:200 - 1:400) en tampón de permeabilización que contenía FCS al 5 % (eBioscience). Después de una hora a temperatura ambiente, las células se lavaron y se tiñeron con anticuerpo secundario durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad (en tampón de permeabilización que contenía FCS al 5 % (eBioscience)). Los últimos pasos de lavado se realizaron en PBS/FCS al 1 %.

[0132] Después de la tinción, las células se clasificaron en un clasificador de células Biorad S3 (combinación: trampa génica BFP, anticuerpo secundario Alexa488, PI para medir el contenido de ADN) o un Astrios Moflo (combinación: trampa génica GFP, Alexa488, anticuerpo -568 o -647, DAPI para medir el contenido de ADN) según la señal de interés (aproximadamente del 1 al 5 % de las poblaciones de tinción más alta y más baja para el anticuerpo de consulta) y el contenido de ADN (1n).

[0133] Las células clasificadas se sedimentaron mediante centrifugación (2500 rpm durante 10 minutos) y el ADN genómico se aisló usando el mini kit de ADN de Qiagen. Para facilitar la desreticulación, los sedimentos se resuspendieron en PBS (200 microlitros/10 millones de células) y, después de la adición de proteinasa K (Qiagen) y tampón de lisis (tampón AL, Qiagen), se incubaron durante la noche a 56 °C con agitación. Al día siguiente, se aisló el ADN de acuerdo con las especificaciones del fabricante y se midió con el espectrofotómetro Nanodrop2000 (Thermo Fisher).

[0134] Los sitios de inserción se amplificaron usando una reacción en cadena de la polimerasa de amplificación lineal (LAM-PCR) usando el ADN genómico total (0,5-2 microgramos/reacción), con cada reacción de 50 microlitros (rxn) que contenía MgSO4 1 mM, cebador doble biotinilado 0,75 pmol (5' -/doble biotina/ggtctccaaatctcggtggaac-3') (SEQ ID NO: 1), Accuprime Taq HiFi (0,4 microlitros/rxn) y el tampón II suministrado (Life Technologies). La reacción se realizó en 120 ciclos con una temperatura de hibridación de 58 °C durante 30 segundos y una temperatura de extensión de 68 °C durante 60 segundos. Para capturar productos de ADN monocatenario (ADNmc) biotinilado, las reacciones de PCR se combinaron con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina M270 (Life Technologies) en tampón de unión 2x (LiCI 6 M, Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,5) durante 2 horas a temperatura ambiente y posteriormente se capturaron con un imán. Antes de la unión, las perlas se lavaron una vez en albúmina de suero bovino (ASB) que contenía PBS al 0,1 % en tubos antiadherentes de 1,5 ml (Life Technologies). Después de la precipitación magnética, las perlas se lavaron tres veces con PBS que contenía Triton X-100 (Sigma) al 0,05 % antes de la ligación de la porción conectora.

[0135] Se ligó una porción conectora de ADNmc (5'/fosfo/atcgtatgccgtcttctgcttgactcagtagttgtgcgatggattgatg/didesoxicitidina/3') (SEQ ID NO: 2) al extremo 3' de los productos biotinilados en reacciones N x 10ul que contenían 2,5 mM de MnCh, 1 M de betaína, 12,5 mol de porción conectora, 1 microlitro y 0,5 microlitros de tampón Circligase II (Illumina) y enzima, respectivamente, donde N = número de reacciones LAM-PCR. Alternativamente, una porción conectora pre-adenilada (5'/Adenil/atcgtatgccgtcttctgcttgactcagtagttgtgcgatggattgatg/didesoxicitidina/3') (SEQ ID NO: 3) se ligó al producto de ADN monocatenario amplificado utilizando la ARN ligasa 1 termoestable TS2126 purificada con E. coli del bacteriófago Thermus scotoductus (Blondal y col., Nucleic Acid Research 2005, 33 (1) 135-142, patente WO 2010/094040 A1) en reacciones de N x 10 microlitros que contenían 12,5 pmol de porción conectora adenilada, PEG6000 al 18,75 %, 2,5 microgramos de ASB, MnCh 2,5 mM, tampón de 1 microlitro (MOPS 500 mM, KCI 100 mM, MgCl250 mM, ditiotreitol (DTT) 10 mM) y 2 microgramos de ARN ligasa. Todas las reacciones de ligadura se produjeron a 60 °C durante 2 horas en tubos antiadherentes de 1,5 ml (Life Technologies) y fueron seguidas de tres lavados con PBS con Triton X-100 al 0,05 % (Sigma) después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente. Posteriormente, se realizó una reacción de PCR que introdujo las secuencias de adaptadores necesarias para la secuenciación de Illumina (P5 y P7) en reacciones de N x 50 microlitros que contenían 25 pmol de cada cebador, 5 microlitros de tampón II y 0,6 microlitros de Accuprime Taq HiFi (Life Technologies) (con N = 0,5 X N.° de reacciones LAM-PCR).

[0136] Esta amplificación final se llevó a cabo utilizando 18 ciclos y una temperatura de hibridación de 55 °C durante 30 s seguido de una extensión (a 68 °C) durante 105 s utilizando los cebadores: 5'-aatgatacggcgaccaccgagatctgatggttctctagcttgcc-3' (SEQ ID NO: 4) y 5' -caagcagaagacggcatacga-3' (SEQ ID NO: 5).

[0137] Los productos se purificaron (kit de purificación de PCR, Qiagen) y se secuenciaron como lecturas únicas de 51 pb (concentración de carga 18 picomolar) en un Illumina HiSeq2000 (Illumina) o HiSeq2500 (Illumina) usando el cebador de secuenciación 5'-ctagcttgccaaacctacaggtggggtctttca-3' (SEQ ID NO: 6).

[0138] Después de la secuenciación profunda, los sitios de inserción de trampa génica se identificaron como lecturas que se alinean de manera única con el genoma humano (hg19) sin o con un solo desajuste usando Bowtie (Langmead y col., Genome Biol 2009, 10: R25) para las poblaciones de fenotipo intracelular clasificadas como altas y bajas. Las lecturas alineadas se cruzaron con las coordenadas del gen hg19 para establecer sitios de inserción intragénicos y su orientación respectiva al gen usando intersectBED (Quinlan y Hall, Bioinformática 2010, 26 (6): 841-842). A efectos de este análisis, los sitios de inserción integrados en sentido dentro de un gen se consideraron disruptivos. Para genes superpuestos con cadenas codificantes opuestas, solo se consideraron las regiones únicas. Además, para los genes superpuestos que utilizan la misma cadena codificante, se concatenaron los nombres de los genes. Para identificar genes que están enriquecidos para integraciones disruptivas de trampa génica en cualquier población de consulta, se comparó el número de sitios de inserción disruptiva en cada gen y en total de una población (por ejemplo, señal alta) con esos valores en la otra población (por ejemplo, señal baja) utilizando una prueba exacta de Fisher unilateral y viceversa. Los valores de P resultantes se ajustaron para pruebas múltiples utilizando la corrección de la FDR de Benjamini y Hochberg. Se crearon diagramas MA plot calculando la razón del número de integraciones disruptivas por gen en ambas poblaciones normalizadas por el número de integraciones totales en las dos poblaciones (representadas en el eje y) y la suma de integraciones disruptivas identificadas tanto en poblaciones altas como en bajas (representadas en el eje x).

[0139] Para los cribados genéticos basados en CRISPR/Cas9, las bibliotecas lentivirales GeCKO (versión 1 y versión 2) se obtuvieron de Zhang lab a través de Addgene (Shalem y col., 2014 Science, 343 (6166), 84-87. doi: 10.1126/science.1247005; www.addgene.org/crispr/libraries/geckov2/). Las bibliotecas se amplificaron en E. Coli y el ADN se purificó de acuerdo con las instrucciones del fabricante (QIAgen). La complejidad de la biblioteca se confirmó mediante secuenciación profunda (tasa de recuperación> 98 %). El lentivirus se produjo en células HEK293T utilizando los plásmidos de empaquetamiento apropiados. El virus se recogió en varios días y se sedimentó en un rotor Beckmann SW28 (21000 rpm durante 2 horas a 4 °C). El virus se resuspendió en medio completo suplementado con HEPES 50 mM y se congeló en alícuotas a -80 °C. Después de la valoración del virus, se transdujeron 100 millones de células HAP1 con las bibliotecas lentivirales y se seleccionaron con 0,75 microgramos/ml de puromicina 2 días después de la infección. Las células resistentes se expandieron durante 6­ 8 días, después de lo cual las células se congelaron en alícuotas de 50 millones de células por vial. Para un solo cribado, se descongelaron varias alícuotas y se sembraron en múltiples matraces T175. Las células se fijaron y permeabilizaron después de 7 días de cultivo (con el objetivo de ± 1.109 células) y se procesaron para la tinción y clasificación de anticuerpos como se ha descrito anteriormente. La secuenciación profunda de las poblaciones de células clasificadas y el análisis de datos se llevó a cabo como describen Shalem y col. 2014, con modificaciones menores. Cebadores utilizados para la PCR inicial para amplificar la biblioteca del ADN genómico aislado: 5'-AATGGACT AT CAT ATGCTT ACCGT AACTT GAAAGTATTT CG-3' (SEQ ID NO: 7) y 5'-CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTCC-3' (SEQ ID NO: 7). Para la segunda, PCR2 anidada en el producto de la PCR1: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACGACGCTCTTCCGATCT NNNNNNtcttgtggaaaggacgaaacaccg-3' (SEQ ID NO: 9). y 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC

Ttctactattctttcccctgcactgt-3' (SEQ ID NO: 10).

Generación de células knockout KCTD5

[0140] Hapl: Se diseñaron CRISPR dirigidos a KCTD5 (KCTD5#1 5'-caccGAGGTGCCGACGTTGAGT-3' (SEQ ID NO: 11) y KCTD5#2 5'-caccGGACGTTGAGTCGACCCACT-3') (SEQ ID NO: 12) y se clonaron en px330 (Cong et al. Science. 2013, PMID: 23287718). Las células HAP1 se transfectaron con uno de los vectores px330 además de un vector que contenía un ARN guía del gen TIA del pez cebra (5'-ggtatgcgggaacctcc-3') (SEQ ID NO: 13) y un casete de una secuencia 2A seguido de un gen de resistencia a la blasticidina, flanqueado por dos sitios diana de TIA. La cotransfección con px330 da lugar a la escisión del casete del plásmido y a la posterior incorporación esporádica en el lugar del locus genómico diana mediante la unión de extremos no homólogos (similar a la descrita en Maresca et al, Genome Res. 2013 Mar;23(3):539-46.). La integración exitosa del casete en el gen diana interrumpe el alelo, hace que las células sean resistentes a la blasticidina y proporciona una etiqueta en la ubicación de la mutación. Cuatro días después de la transfección, el medio de cultivo se complementó con blasticidina (10 microgramos/ml). Las colonias supervivientes se expandieron por clonación. HEK 293T: Se diseñó un CRISPR adicional dirigido a KCTD5 (KCTD5#35'-caccGAGGATTTCGGTCCCGGCAC-3') (SEQ ID NO: 14) y se clonó en px330. Las células fueron transfectadas con CRISPR KCTD5#3 y CRISPR kCTd5#1 o CRISPR KCTD5#3 y cRiSPR KCTD5#2, cotransfectadas con pMX-ires-Blast. La cotransfección de dos CRISPR dará lugar a roturas de doble cadena en dos posiciones del gen, dando lugar a una deleción de la región genómica. La selección de la transfección se realizó con blasticidina (80 microgramos/ml) durante 2 días. Las colonias que sobrevivieron se expandieron mediante clonación y se les asignó un genotipo.

Resultados y discusión

[0141] Los resultados de varios experimentos realizados se muestran en las figuras.

[0142] La figura 1 muestra los resultados de un cribado genético en una población mutagénica de células HAP1 fijada con paraformaldehído. Anteriormente (Jae et al, Science, 2013) se había utilizado un anticuerpo que reconoce el distroglicano glicosilado en la superficie celular para enriquecer los mutantes que carecían del antígeno respectivo en la superficie celular. Las células vivas se clasificaron, se expandieron en cultivo y se sometieron a la secuenciación profunda de los sitios de inserción de la trampa génica (Figura 1A). En la Figura 1B (publicada en Jae et al, 2013), se muestra un gráfico que muestra los genes enriquecidos para las mutaciones en la población celular viable seleccionada. Se identificaron los genes necesarios para la glicosilación del alfa-distroglicano. La Figura 1C y la Figura 1D muestran los resultados con el método según la invención. Se realizó la misma tinción con anticuerpos descrita anteriormente, pero ahora sobre células fijadas con paraformaldehído. En este caso, las células muertas se sometieron directamente a la desreticulación (por calor) y al aislamiento del ADN genómico sin ninguna amplificación previa de los genomas dentro de las células vivas. La recuperación de los sitios de integración de las trampas génicas de las células fijadas no expandidas produce una mancha típica de ADN amplificado por LAM-PCR. Las mutaciones de la trampa génica se identificaron mediante secuenciación profunda y se analizaron los genes para el enriquecimiento de las mutaciones disruptivas. Estos resultados muestran que las células fijas no expandidas también son una fuente adecuada para la identificación de los genes necesarios para la glicosilación del alfa-distroglicano. Este experimento demuestra que un cribado realizado previamente en células vivas puede recapitularse en una población celular fijada y no viable en el momento del examen fenotípico. Demuestra además que las células mutantes individuales fijadas pueden utilizarse como fuente para recuperar y secuenciar mutaciones genómicas (inserciones de trampas génicas).

[0143] La figura 2 muestra la separación fenotípica de un conjunto de células mutagenizadas y la secuenciación de los sitios de inserción de la trampa génica. En la Figura 2A se muestra cómo una población de células haploides o casi haploides que ha sido mutagenizada utilizando una trampa génica retroviral es fijada, permeabilizada y posteriormente marcada con fluorescencia utilizando anticuerpos dirigidos contra la fosfo-AKT (serina473). La figura 2B muestra cómo las células fijadas, permeabilizadas y teñidas para fosfo-AKT se separaron mediante citometría de flujo para enriquecer los grupos que mostraban una fosforilación de AKT alta o baja (el 1-5% más alto/bajo de la población total). Posteriormente, se aisló el ADN genómico de ambas poblaciones celulares y se utilizó para mapear los sitios de inserción de las trampas génicas. La Figura 2C muestra un gráfico que indica la frecuencia de inserciones de trampas génicas disruptivas detectadas en un regulador negativo conocido (INPP4A) de AKT en la población celular izquierda (baja fosfo-AKT) y derecha (alta fosfo-AKT). El gráfico muestra que los mutantes para INPP4A se enriquecieron en la población de células con una señal de fosfo-AKT "alta". Este experimento demuestra que, utilizando el método según la invención, las poblaciones celulares mutagenizadas que han sido seleccionadas para la fosforilación diferencial de AKT se enriquecen o agotan para las mutaciones en un regulador conocido del fenotipo intracelular interrogado.

[0144] La figura 3 muestra un cribado de mutagénesis en todo el genoma para identificar reguladores de la fosforilación de AKT. La Figura 3A muestra un esquema de la vía que conduce a la fosforilación de AKT y que implica la señalización de PIP3 y el complejo II de mTOR (mTORCII). La Figura 3B muestra un diagrama con el número relativo de mutaciones de trampas génicas por gen en la población "alta" en fosfo-AKT en comparación con la población "baja". Los genes que no afectan a la fosforilación de AKT se encuentran mutados con una frecuencia comparable en las poblaciones "alta" y "baja" (el 1-5% más alto/bajo de la población). Los genes que afectan a la fosforilación de AKT cuando están mutados muestran un cambio significativo en su frecuencia de mutación en la población alta frente a la población baja. Se identifican reguladores conocidos de la vía (por ejemplo, PTEN, LST8, SIN1) (tanto reguladores negativos como positivos). Este experimento muestra que las frecuencias de mutación en las poblaciones celulares separadas pueden examinarse en todo el genoma, lo que lleva a la identificación de reguladores positivos y negativos conocidos de la vía de la AKT. Es importante destacar que numerosos factores nuevos muestran un sesgo significativo en sus frecuencias de mutación (puntos grises oscuros) y, por tanto, están vinculados a la fosforilación de AKT.

[0145] La Figura 4 muestra que KCTD5 afecta a la fosforilación de AKT. La Figura 4 A muestra que el cribado de todo el genoma para los reguladores de AKT con el método según la invención identificó KCTD5 como un valor atípico significativo. La Figura 4B muestra que una mutación que provoca la pérdida de la función de KCTD5 en células HAP1 utilizando CRISPR conduce a un aumento de la fosforilación de AKT. La Figura 4C muestra que las células knockout generadas por CRISPR para KCTD5 muestran un aumento de la tinción para fosfo-AKT cuando se examinan por citometría de flujo. La Figura 4C muestra que la restauración de la expresión de KCTD5 en las células knockout generadas por CRISPR normalizó la fosforilación de AKT. Estos experimentos demuestran que se pueden identificar y verificar nuevos reguladores de la fosforilación de AKT mediante la inactivación de genes generada por CRISPR y el análisis de Western-Blot. Esto demuestra que la E3-ligasa de repetición de WD40 KCTD5 es un nuevo regulador de la fosforilación de AKT.

[0146] La figura 5 muestra que el método de cribado según la invención es adecuado para cualquier fenotipo intracelular que pueda visualizarse y utilizarse para separar poblaciones celulares en función de la intensidad de la señal. Este método de cribado, por ejemplo, utilizando células haploides mutagenizadas, puede utilizarse en principio para cualquier rasgo intracelular que pueda cuantificarse mediante métodos de separación como FACS (por ejemplo, utilizando anticuerpos de proteínas totales, anticuerpos postraduccionales o sondas marcadas para cuantificar la expresión o abundancia de moléculas de ARN endógeno). La figura enumera diferentes lecturas de fenotipos intracelulares que podrían aplicarse al enfoque de cribado.

[0147] La figura 6 muestra los resultados de un cribado de los niveles de la proteína IRF1 (expresión de la proteína). Las células haploides mutagenizadas se trataron con Interferón gamma (IFN-y) para inducir la expresión de IRF-1. Después de 24 horas, las células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron para detectar la IRF-1. Las células se clasificaron para enriquecer las poblaciones que mostraban niveles "altos" o "bajos" de IRF1 y se sometieron a una secuenciación profunda de los sitios de inserción de trampas génicas para identificar los mutantes enriquecidos en cualquiera de las poblaciones celulares. También se muestra un esquema que muestra la vía de señalización del IFN-y que conduce a la transcripción del IRF-1. Varios genes etiquetados indicados (JAK1, JAK2, IRF1 y STAT1) se identificaron en el cribado, empleando el método según la invención. El uso de este método permite identificar componentes de la vía de señalización del IFN-y.

[0148] La Figura 7 muestra un cribado para la expresión de IkappaBalpha (degradación de proteínas). Las células haploides HAP1 se mutagenizaron y se trataron con TNF-a durante 30 minutos. Tras la tinción con anticuerpos específicos contra IkappaBalpha, las células se clasificaron para enriquecer las poblaciones con alta y baja intensidad de IkappaBalpha. Para identificar los mutantes enriquecidos en cualquiera de las dos poblaciones celulares, se secuenciaron los sitios de inserción de trampas génicas. También se muestra un esquema que muestra los componentes de señalización del NFKB que se identificaron en el cribado. Este experimento demuestra la aplicación de un cribado fenotípico de células fijas en la vía de señalización del NFKB. Se pudieron identificar modificadores conocidos y desconocidos de la señalización del NFKB.

[0149] La Figura 8 muestra un cribado de la fosforilación de p38. Las células haploides mutagenizadas se trataron con anisomicina para inducir la fosforilación de p38a. Después de 4 horas, las células se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpos específicos de fosfo-p38a. Las células se clasificaron para enriquecer las poblaciones que mostraban niveles "altos" o "bajos" de fosfo-p38. Se aisló el ADN genómico de ambas poblaciones celulares y se utilizó para mapear los sitios de inserción de las trampas génicas. También se muestra un esquema que muestra la vía de señalización de la MAPK con los genes que se identificaron en el cribado. Este experimento demuestra la aplicación de un cribado fenotípico de células fijas según la invención en la vía de señalización de la MAPK. Se identifican componentes conocidos pero también genes implicados en el metabolismo/empalme de ARN como PRPF39.

[0150] La Figura 9 muestra un cribado para el daño al ADN en células irradiadas. Las células haploides mutagénicas se expusieron a radiación ionizante, se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron para la fosforilación de H2AX. Como se ilustra en el esquema, la proteína histona H2AX se fosforila cuando se daña el ADN. Las células se clasificaron para enriquecer las poblaciones que mostraban niveles "altos" o "bajos" de fosforilación de H2AX y se sometieron a una secuenciación profunda de los sitios de inserción de trampas génicas para identificar los mutantes enriquecidos en cualquiera de las dos poblaciones celulares. Este experimento demuestra la aplicación de un cribado de mutagénesis en células permeabilizadas no viables para estudiar la señalización del daño en el ADN. Los mutantes con más fosforilación de H2AX (indicativo de daño en el ADN) afectan a la matriz nuclear, al poro nuclear y a la vía de polycomb, lo que sugiere un papel clave para la organización nuclear en el daño en el ADN.

[0151] La Figura 10 muestra un cribado de una modificación de la cola de la histona. Las células haploides mutagénicas se fijaron, permeabilizaron y tiñeron para la trimetilación de H3K27 que está asociada con la represión transcripcional. Las células se clasificaron para enriquecer las poblaciones que mostraban niveles "altos" o "bajos" de trimetilación H3K27, se aisló el ADN genómico de ambas poblaciones celulares y se utilizó para mapear la inserción de la trampa génica. Estos experimentos demuestran que el método según la invención permite conocer los complejos que regulan la trimetilación de H3K27. Se sabe que el complejo represivo polycomb 2 es necesario para la generación de esta modificación y está compuesto por EZH2, SUZ12 y EED. Todos estos componentes se identificaron en el cribado.

[0152] La Figura 11 muestra cómo KCTD5 modula la señalización de GPCR. Las figuras A y B muestran una comparación de dos cribados de todo el genoma para reguladores de AKT (cribado en células HAP1 wt y células KCTD5 KO) y revelan la vía que activa la fosforilación de AKT en las células deficientes en KCTD5. La Figura 11C muestra un esquema de la señalización por GPCR. Se destacan los componentes identificados (GNB1, GNB2, GNG5, GNG7, PDLC). La Figura 11D muestra que la E3-ligasa KCTD5 conduce a una disminución de los niveles de proteína GNB1 (subunidad beta-1 de la proteína de unión a nucleótidos de guanina), una subunidad de las proteínas G heterotriméricas que están implicadas en la señalización de GPCR. Las células KCTD5 KO muestran una mayor expresión de la proteína GNB1 en comparación con las células 293 de tipo salvaje. El método según la invención puede identificar modificadores específicos del genotipo de los rasgos intracelulares y puede dilucidar los mecanismos responsables de los fenotipos asociados a los mutantes, así como los potenciadores o represores de dichos fenotipos.

[0153] La Figura 12 muestra un cribado basado en CRISPR/Cas9 que identifica a KCTD5 como regulador negativo de la fosfo AKT (pAKT). La biblioteca lentiviral GeCKOv2 (Sanjana et al. Nat. Methods 2014; que contiene ±123000 secuencias de ARN guía) se introdujo en células HAP1 y se aislaron poblaciones con niveles altos y bajos de pAKT. La abundancia de cada ARN guía (dirigido a su respectivo gen) en ambas poblaciones celulares se identificó mediante amplificación por PCR y secuenciación profunda. En el caso de KCTD5, 5/6 secuencias de ARN guía (indicadas con KCTD5) estaban claramente enriquecidas en la población celular con altos niveles de pAKT. Esto demuestra que también la mutagénesis mediante bibliotecas basadas en

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Método para identificar un elemento genético que afecta a un fenotipo de una célula, donde dicho fenotipo se manifiesta intracelularmente, donde el método comprende los pasos de:

(a) Someter un grupo de células a un tratamiento de mutagénesis;

(b) Fijar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de fijación y, opcionalmente, con un agente de reticulación; y permeabilizar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de permeabilización; (c) Tratar el conjunto de células con una o más sondas detectables, preferiblemente un anticuerpo o una sonda de ARN, para detectar el fenotipo afectado;

(d) Clasificar las células basándose en la detección de al menos una de las una o más sondas detectables para obtener una o más poblaciones de células;

(e) Opcionalmente, desreticular las células en cada una de las poblaciones de células obtenidas; y (f) Secuenciar al menos parte de las células de al menos parte de las poblaciones de células obtenidas para identificar un elemento genético que afecte al fenotipo de la célula.

2. Método de la reivindicación 1, en el que en el paso (d) se obtienen al menos dos poblaciones de células con la clasificación de las células basándose en la detección de al menos una de las una o más sondas detectables y en el que en el paso (f) se secuencian al menos dos poblaciones de células, preferiblemente en donde la secuenciación implica secuenciación de alto rendimiento, y se comparan para identificar un elemento genético que afecta al fenotipo de la célula.

3. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el elemento genético se selecciona del grupo que consiste en un gen, un intrón, un exón, un promotor y un ARN no codificante.

4. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en una célula eucariota, una célula animal, una célula vegetal, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula humana o una célula madre.

5. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula es una célula casi haploide o una célula completamente haploide, preferiblemente una célula casi haploide o una célula de mamífero completamente haploide, más preferiblemente una célula casi haploide o una célula humana completamente haploide.

6. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la mutagénesis implica el uso de radiación, sustancias químicas mutagenizadas, preferiblemente metanosulfonato de etilo, ácido nitroso o etilnitrosourea, mutagénesis de inserción, preferiblemente mutagénesis de inserción basada en transposones o mutagénesis de inserción basada en retrovirus (aleatoria), una biblioteca CRISPR de secuencias de a Rn guía.

7. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las células se exponen a una condición de estrés o condición de crecimiento y/o en el que las células se tratan con un compuesto, preferiblemente un fármaco, antes de que las células se fijen y permeabilicen en el paso (b), preferiblemente entre la realización del paso (a) y el paso (b).

8. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el reactivo de fijación para fijar las células se selecciona del grupo que consiste en reactivos de reticulación, preferiblemente formaldehído, paraformaldehído, formalina y gluteraldehído o reactivos no reticulantes, preferiblemente fijadores a base de cloruro de mercurio, etanol, metanol o acetona y/o en el que el reactivo de permeabilización se selecciona del grupo que consiste en disolventes, preferiblemente metanol y acetona, o detergentes, preferiblemente saponina, digitonina, Triton X-100, NP-40, Leucoperm y Tween-20.

9. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sonda detectable se une a una proteína, una proteína modificada después de la traducción, un lípido, ADN, ARN, o se une a o detecta un metabolito o elemento celular, preferiblemente en el que la sonda comprende un resto detectable, preferiblemente seleccionado de un resto fluorescente, un resto radiactivo, un resto magnético o un marcador que se puede medir usando espectrometría de masas.

10. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la clasificación implica citometría de flujo, análisis mediante FACS, citometría de masas y/o clasificación magnética.

11. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fenotipo se manifiesta en el citosol, dentro de un orgánulo, en la membrana de un orgánulo o en la membrana celular.

12. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el fenotipo es un aumento de la abundancia de proteínas, una disminución de la abundancia de proteínas, un aumento de la actividad de las proteínas, una disminución de la actividad de las proteínas, un aumento de la modificación postraduccional de una proteína, una disminución de la expresión postraduccional de una proteína, un aumento de la abundancia de ARNm o una disminución de la abundancia de ARNm.

13. Método para identificar un modulador de un producto génico codificado por un gen candidato que afecta a un fenotipo de una célula, donde dicho fenotipo se manifiesta intracelularmente, donde el método comprende los pasos de:

(a) Someter un grupo de células a un tratamiento de mutagénesis;

(b) Fijar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de fijación, y opcionalmente con un agente de reticulación, y permeabilizar el conjunto de células, preferiblemente con un reactivo de permeabilización; (c) Tratar el conjunto de células con una o más sondas detectables, preferiblemente un anticuerpo o una sonda de ARN, para detectar el fenotipo afectado;

(d) Clasificar las células basándose en la detección de al menos una de las una o más sondas detectables para obtener una o más poblaciones de células,

(e) Opcionalmente, desreticular las células en cada una de las poblaciones de células obtenidas;

(f) Secuenciar al menos parte de las células de al menos parte de las poblaciones de células obtenidas para identificar un elemento genético que afecta al fenotipo de la célula, en el que el elemento genético es un gen candidato; e

(g) Identificar un modulador que afecta a la expresión o actividad de un producto de expresión de dicho gen candidato identificado que afecta al fenotipo de la célula.

14. Método de la reivindicación 13, en el que en el paso (d) se obtienen al menos dos poblaciones de células con la clasificación de las células en función de la detección de al menos una de una o más sondas susceptibles de datos y en el que en el paso (f) se secuencian al menos dos poblaciones de células, preferiblemente en donde la secuenciación implica secuenciación de alto rendimiento, y se comparan para identificar elementos genéticos que afectan al fenotipo de la célula.

15. Método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el método se utiliza para establecer o analizar vías biológicas, para identificar genes implicados en enfermedades, preferiblemente en cáncer, para estudiar la interacción fármaco-diana, para estudiar la interacción fármaco-fármaco o para analizar la supresión o modulación de un fenotipo, preferiblemente en el que el fenotipo es un fenotipo asociado con una enfermedad.