ES2877351T3 - Instrumento de detección portátil basado en micro-raman y método de detección - Google Patents

Abstract

Un instrumento (10) espectroscópico Raman portátil para la detección de patógenos, que comprende: una carcasa (12) que tiene una porción de manija, una porción (48) de cabezal y un efector (14) de extremo; una sonda espectroscópica Raman encajada en la carcasa e incluye: un láser (22) dispuesto en la porción de la manija y operable para emitir un haz de luz coherente; un filtro (24) de línea láser operable para transmitir el haz de luz a lo largo de una trayectoria óptica y suprimir la luz ambiental; un divisor (26) de haz dispuesto en la porción de cabezal y operable para reflejar el haz de luz desde el filtro de línea láser a través de una abertura formada en el efector de extremo hacia una muestra para producir una señal de muestra desplazada Raman; un colector (36) para recoger la señal de muestra y transmitir la señal de muestra a través del divisor de haz; un expansor (32) de haz para colimar la señal de muestra del divisor de haz y generar una señal de muestra de diámetro expandido; un filtro (34) graduado espacialmente de rango estrecho de resolución ultra-alta para filtrar la señal de muestra de diámetro expandido en al menos una banda espectral estrecha basada en un conjunto predeterminado de bandas espectrales discretas para un patógeno diana, en la que el filtro es un filtro de espacio de banda que comprende una aleación de nitruro de aluminio indio graduada; y un formador (30) de imágenes para convertir la señal de muestra de diámetro expandido en datos de imagen representativos de la señal de muestra desplazada Raman; y un conjunto de electrónica que incluye: un microcontrolador (50) encajado dentro de la carcasa para controlar la sonda espectroscópica Raman, leer los datos de la imagen del formador de imágenes, y analizar los datos de la imagen en las bandas espectrales discretas para detectar la presencia del patógeno diana, comparando los datos de la imagen con un espectro Raman de referencia y comunicar un resultado de prueba basado en el análisis y la comparación; y una fuente (52) de energía acoplada operativamente al microcontrolador y la sonda espectroscópica Raman.

Description

DESCRIPCIÓN

Instrumento de detección portátil basado en micro-raman y método de detección

Referencia cruzada a aplicaciones relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos No. 61/893,095, presentada el 7 de agosto de 2013.

Campo

La presente divulgación se refiere a un método y aparato para detectar e identificar rápidamente compuestos basados en proteínas que incluyen bacterias, virus, fármacos o anomalías tisulares, y más particularmente un espectroscopio portátil basado en espectroscopía Raman que es adaptable para examinar superficies mucosas (fosas nasales, oral, oído), interrogando el sitio de una herida y/o inspección de un objeto o superficie potencialmente contaminada en busca de compuestos a base de proteínas, incluido MRSA u otros patógenos. El dispositivo se puede adaptar para interrogar muestras de tejido, heces, orina, suero o secreciones.

Antecedentes

Esta sección proporciona información de antecedentes relacionada con la presente divulgación que no es necesariamente una técnica anterior.

La resistencia a la meticilina de Staphylococcus aureus (MRSA) está determinada por el gen mecA que es portado por un elemento genético móvil, denominado casete estafilocócico cromosómico mec (SCCmec). MecA codifica una proteína de unión a penicilina resistente a betalactámicos llamada PBP2a (o PBP2'). Los antibióticos beta-lactámicos normalmente se unen a las PBP en la pared celular interrumpiendo la síntesis de la capa de peptidoglicano, lo que da como resultado la muerte de la bacteria. Sin embargo, dado que los antibióticos betalactámicos no pueden unirse a PBP2a, continúa la síntesis de la capa de peptidoglicano y la pared celular. Si bien el mecanismo responsable de la transferencia de mecA aún es oscuro, la evidencia apoya la transferencia horizontal del gen mecA entre diferentes especies de estafilococos. Normalmente, el MRSA se diagnostica mediante métodos basados en cultivos.

El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) recomienda la prueba de difusión en disco de cefoxitina complementada con la prueba de aglutinación de látex para PBP2a. La expresión fenotípica de la resistencia puede variar dependiendo de las condiciones de crecimiento, así como de la presencia de subpoblaciones de estafilococos que pueden coexistir (susceptibles y resistentes) dentro de un cultivo, lo que hace que las pruebas de susceptibilidad mediante métodos microbiológicos estándar sean potencialmente problemáticas. Además, el cultivo lleva tiempo, generalmente de 1 a 5 días. Se han desarrollado técnicas más rápidas de detección de MRSA por métodos moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para probar el gen mecA que confiere resistencia a la meticilina, oxacilina, nafcilina y dicloxacilina y otros antibióticos similares. Tales técnicas, aunque más rápidas, aún toman horas y se envían a los laboratorios. Además, los enfoques moleculares disponibles comercialmente (utilizados para el cribado) no pueden detectar variantes de mecA de MRSA.

La espectroscopia Raman es una técnica no destructiva sin reactivos que puede proporcionar la huella digital espectral única de una sustancia química y/o molécula que permite la identificación del objetivo sin preparación de la muestra. Con esta técnica, se irradia una muestra con una longitud de onda de luz específica mediante la cual un pequeño componente, aproximadamente 1 de cada 107 fotones, se dispersa de forma no elástica (a longitudes de onda desplazadas de la radiación incidente). La dispersión inelástica de fotones, debido a las vibraciones moleculares que cambian la polarización de la molécula, proporciona información química y estructural característica única de la sustancia objetivo. La espectroscopía Raman puede ser extremadamente útil para caracterizar completamente la composición de un material y permite una identificación relativamente rápida de materiales desconocidos con el uso de una base de datos espectral Raman. Además, dado que la espectroscopia Raman es una técnica sin contacto y no destructiva, es muy adecuada para análisis in-situ, in-vitro e in-vivo.

La espectroscopia Raman tiene un alto potencial para el cribado de bacterias, virus, fármacos y anomalías tisulares ya que: 1) es práctica para un gran número de especies moleculares; 2) puede proporcionar una identificación rápida; y 3) se puede utilizar tanto para análisis cualitativos como cuantitativos. Unos instrumentos de detección portátiles o portátil basados en micro Raman serían útiles para evaluar de manera confiable y rápida las cepas de Staphylococcus aureus en heridas o conductos nasales. La evaluación y tipificación rápidas permitirían rastrear la propagación de tales patógenos y podría disminuir significativamente el número de infecciones adquiridas en el hospital y los costos asociados en el tratamiento de las mismas. El documento US2006/268266 divulga un instrumento espectroscópico Raman portátil para la detección de patógenos. XP055385094 (UTE NEUGEBAUER ET AL: “Towards a Detailed Understanding of Bacterial Metabolism - Spectroscopic Characterization of Staphylococcus Epidermidis”, CHEMPHYSCHEM - A EUROPEAN JOURNAL OF CHEMICAL PHYSICS & PHYSICAL CHEMISTRY., vol. 8, No. 1, 8 enero 2007) y XP055385857 (U. NEUGEBAUER ET AL: “The Influence of Fluoroquinolone Drugs on the Bacterial Growth of S. epidermidis Utilizing the Unique Potential of Vibrational Spectroscopy”, JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY. A, MOLECULES, SPECTROSCOPY, KINETICS, ENVIRONMENT AND GENERAL THEORY, vol. 111, No. 15, 1 abril 2007) se refieren a la caracterización espectroscópica de la composición química del material bacteriano mediante espectroscopía Raman.

Resumen

Esta sección proporciona un resumen general de la divulgación y no es una divulgación completa de su alcance completo o de todas sus características.

Un sistema de dispositivo portátil basado en espectroscopía Raman para examen de mucosas (narinas, oral, oído) y examen de heridas proporciona un método para la detección rápida y rentable de bacterias, virus, fármacos y anomalías tisulares. El dispositivo es un sistema de detección de punto de atención casi en tiempo real automatizado no intrusivo que puede permitir a los proveedores de atención médica brindar una mejor gestión de los pacientes y optimizar los resultados clínicos. El dispositivo incluye un elemento de punta desechable que tiene dimensiones que son lo suficientemente pequeñas para caber en una cavidad corporal pequeña, como la fosa nasal. Se pueden empleartres tipos de elementos de punta con este sistema: uno para examen nasal directo, uno con aspiración al vacío y filtro, y otro con óptica de proximidad para examen de heridas. El elemento de la punta y el dispositivo incluyen un conjunto de componentes ópticos que permiten la medición espectral Raman que puede proporcionar la huella digital espectral única de una sustancia química y/o molécula que permite la identificación del objetivo sin preparación de la muestra.

El dispositivo incorpora algoritmos de procesamiento e identificación de señales para el acondicionamiento de señales y la detección de objetivos. Las combinaciones de microfiltros de resolución ultra-alta en regiones discretas (por ejemplo, cuadrantes) de un área en la matriz de detectores de imágenes proporcionan un análisis específico de los picos espectrales objetivo. Cada región o cuadrante permite la detección de banda espectral discreta y cada microfiltro proporciona una detección de número de onda específica para el análisis espectral. Las bandas espectrales Raman discretas que distinguen una sustancia objetivo de la interferencia de fondo se utilizan para desarrollar algoritmos de aprendizaje que sirven como base para la detección y la identificación del objetivo. Al obtener datos en regiones espectrales discretas en lugar de en todo el intervalo espectral, el tiempo de adquisición y las contribuciones espectrales de la interferencia de fondo confusa se reducirán o eliminarán, lo que permitirá una evaluación casi en tiempo real.

Los métodos para la identificación de patógenos en muestras fluídicas usando espectroscopía Raman también forman parte de la presente divulgación. Estos métodos muestran el uso de un número limitado de picos de espectros discretos para muestrear identificadores moleculares clave de una amplia gama de objetivos potenciales para la detección de patógenos específicos. Como resultado, el aparato y los métodos descritos en este documento pueden personalizarse para una gran cantidad de materiales de destino e implementarse en un factor de forma portátil relativamente pequeño. En esencia, se proporciona un sistema adaptado, que puede modificarse fácilmente para cambiar las necesidades objetivo por medio de un algoritmo de aprendizaje incorporado. Se desarrolló un algoritmo de aprendizaje ejemplar en el marco de un programa del Departamento de Defensa de los Estados Unidos para la detección de patógenos en tiempo real en el agua, así como para la identificación en tiempo real de células cancerosas a partir de muestras de tejido y puede adaptarse a un protocolo de detección. Una vez finalizado el preprocesamiento, se utiliza un análisis de función discriminante (DFA) para clasificar las muestras. DFA predice la pertenencia a un grupo. Las variables independientes son los predictores y las variables dependientes son los grupos, basados en un supuesto de normalidad multivariante. Estos datos resultantes se utilizan para modificar el análisis espectral basado en Raman ejecutado en el dispositivo portátil.

Otras áreas de aplicabilidad resultarán evidentes a partir de la descripción proporcionada en este documento. La descripción y los ejemplos específicos de este resumen están destinados únicamente a fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.

Dibujos

Los dibujos descritos en este documento son solo para fines ilustrativos de realizaciones seleccionadas y no de todas las implementaciones posibles, y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación.

La Fig. 1 ilustra los espectros medios para diversas bacterias en términos de intensidad relativa en función de la longitud de onda;

La Fig. 2 ilustra los números de onda o bandas espectrales comprobados con DFA que distinguen las bacterias probadas;

La Fig. 3 ilustra un análisis de grupos de espectros Raman de bacterias;

La Fig. 4 ilustra una comparación de espectros medios para muestras de hisopos nasales inoculadas (claro) y MRSA 1R (oscuro);

La Fig. 5 ilustra los espectros medios de Staphylococcus con una vista ampliada de regiones espectrales mínimamente obstruidas 600-740 (cirr1);

La Fig. 6 ilustra los espectros medios de Staphylococcus con una vista ampliada de regiones espectrales mínimamente obstruidas 1200-1300 (cm-1);

La Fig. 7 ilustra una muestra de los espectros Raman recogidos para tres virus de la influenza;

La Fig. 8 ilustra picos espectrales para los tres virus de la influenza en desplazamientos Raman entre 2850 y 2950 cirr1; La Fig. 9 ilustra picos espectrales para los tres virus de la influenza en desplazamientos Raman entre 700 y 1700 cirr1; La Fig. 10 ilustra los espectros de influenza inmovilizada utilizando técnicas de sustracción de fondo;

La Fig. 11 ilustra los espectros de un virus de la gripe que se ha desactivado utilizando diferentes procedimientos de desactivación que incluyen tratamiento UV, térmico y químico;

La Fig. 12 ilustra un factor de forma ejemplar de una realización del instrumento de detección portátil basado en micro-Raman;

La Fig. 13 ilustra las características funcionales del espectroscopio mostrado en la Fig. 12;

La Fig. 14 ilustra los componentes del dispositivo mostrado en la Fig. 12;

La Fig. 15 un efector de extremo desechable del dispositivo para examen nasal y/o de heridas;

La Fig. 16 ilustra un efector de extremo desechable del dispositivo con función de filtrado para la aplicación de succión al vacío;

La Fig. 17 es una vista de extremo del efector de extremo mostrado en la Fig. 16;

La Fig. 18Ay 18B ilustran ejemplos sencillos del expansorde haz mostrado en la Fig. 14;

La Fig. 19 ilustra el elemento de filtro mostrado en la Fig. 14;

La Fig. 20 ilustra un ejemplo que no entra dentro del alcance de la invención de una sonda Raman y un sistema de detección;

La Fig. 21A-C ilustra los componentes ópticos de la sonda Raman mostrada en la Fig. 20;

La Fig. 22A-C ilustra aspectos detallados de los componentes ópticos mostrados en la Fig. 20;

La Fig. 23A-D ilustra un filtro de línea láser, un sistema de espejo parabólico fuera del eje y una lente cónica hexagonal para la sonda Raman mostrada en la Fig. 22;

La Fig. 24 ilustra un factor de forma portátil del dispositivo mostrado en la Fig. 20; y

La Fig. 25 es un diagrama de flujo que ilustra los procedimientos operativos llevados a cabo durante un procedimiento de detección de patógenos utilizando el instrumento de detección portátil basado en micro-Raman.

Los números de referencia correspondientes indican las partes correspondientes en las diversas vistas de los dibujos. Descripción detallada

Mediante estudios preliminares explicados con más detalle a continuación, se demuestra la viabilidad de la espectroscopia Raman para evaluar varios compuestos basados en proteínas, incluidos numerosos patógenos, utilizando un espectrómetro Raman de laboratorio. Para estos estudios se evaluaron los siguientes patógenos en ausencia de interferencia de fondo:

• MSSA-1S: Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 6538™);

• MSSA-2S: Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® BAA1721™);

• MRSA-1R: Staphylococcus aureus (ATCC® BAA1683™);

• MRSA-2R: Staphylococcus aureus subsp. aureus (ATCC® 700787™);

• Corynebacterium sp. (ATCC® 6931™);

• Staphylococcus epidermidis (ATCC® 12228™);

• Influenza APR8/34 (H1N1);

• Influenza A/WSN/32 (H1N1); y

• Influenza A/Udorn/72 (H2N3).

Estudios preliminares sobre patógenos adicionales (como Bacillus subtilis, E. coli K99, E. coli O111, E. coli O157, Enterobacter amnigenus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Rahnella aquatilis, Salmonella Schottmueller, Salmonella Typhimurium, Streptococcus pneumonia, Vibrio fluvialis, y Staphylococcus epidermidus-ATCC#35984) demuestran la viabilidad de identificación por espectroscopía Raman como se describe adicionalmente en el presente documento. Estos resultados proporcionan una indicación positiva de que se podría desarrollar una base de datos espectral Raman para una amplia variedad de compuestos basados en proteínas con protocolos de análisis que permitan la identificación y clasificación del objetivo. Como tal, el sistema y método descritos en este documento no se limitan al examen, detección e identificación de MRSA y/o influenza, sino que tiene un rango más amplio de aplicación al examen, detección e identificación de varios patógenos, toxinas y otros compuestos basados en proteínas.

La cepa MRSA-2R de Staphylococcus aureus tiene una susceptibilidad reducida a la vancomicina y se aisló de sangre humana de un paciente con bacteriemia mortal. La cepa MSSA-2S de Staphylococcus aureus es una cepa sensible a la meticilina adquirida en la comunidad hipervirulenta aislada en el Reino Unido. Es una cepa secuenciada del genoma completo. La cepa MRSA 1R de Staphylococcus aureus es resistente a la meticilina y se aisló de un absceso humano. Se ha confirmado que porta el gen mec A con SCCmec, o mec de cromosoma de casete de estafilococo tipo IV y PFGE tipo USA 400. La cepa MSSA-1S de Staphylococcus aureus es sensible a la meticilina y se aisló de una lesión humana [ATCC].

Staphylococcus epidermidis y Corynebacterium son flora normal que se encuentra en la nariz. Staphylococcus epidermidis con Corynebacteria coloniza predominantemente el tracto respiratorio superior, especialmente las fosas nasales. S. epidermidis representa el 90 % - 100 % de los estafilococos que se encuentran en la cavidad nasal cuando no está presente S. aureus. Sin embargo, cuando S. aureus está presente, la cantidad de S. epidermidis disminuye drásticamente. Sin embargo, la mayoría de las especies de Corynebacterium no causan enfermedades en humanos; Corynebacterium diptheriae NCTC 13129 es una cepa muy infecciosa.

Se prepararon muestras a partir de bacterias sembradas en placas de agar tríptico de soja. Se recogió una sola colonia y se añadió a 5 ml de caldo de soja tríptico en un tubo de cultivo de 10 ml. El tubo de cultivo se colocó en un agitador en una incubadora a 37 °C y se incubó durante la noche. Al día siguiente se tomó una densidad óptica (DO) para verificar la consistencia de las condiciones de crecimiento y proporcionar una DO de referencia. El cultivo de una noche se centrifugó a temperatura ambiente durante 5 min a 3000 rpm. Después de centrifugar, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el sedimento de bacterias con 5 ml de agua potable filtrada. Las bacterias se centrifugaron como se indica y el proceso de lavado se repitió 2 veces más. En el lavado final se midió la DO de la solución y si la DO era mayor de 1.05, se añadió agua hasta que se obtuvo una DO de 1 0.05. Luego se colocaron 150 ul de la suspensión de bacterias sobre un sustrato de cuarzo u V (tecnologías Craic) para espectroscopía Raman.

Los espectros Raman se registraron con un microscopio Raman de entrada (Renishaw®) equipado con una rejilla de 1800 l/mm, un láser de 50 mW 514.5 nm como fuente de excitación al 100 % de potencia del láser. La luz láser se enfocó sobre la muestra a través de un objetivo de inmersión de 63X (Leica HCX PL APO 1.2NA Corr/0.17 CS). Los espectros se adquirieron en un rango espectral de 400-3200 cirr1 con 40 acumulaciones en un tiempo de integración de 10 s.

Antes del análisis, los espectros se preprocesaron usando: (1) suavizado derivado con una ventana deslizante de 5; (2) exclusión de rango en la región de 735-874 cirr1 y 1013-1116 cirr1 para eliminar regiones espectrales dominadas por el cuarzo; (3) sustracción de fondo mediante un ajuste polinomial robusto para eliminar las contribuciones espectrales debidas a la fluorescencia; y (4) normalización de vectores para reducir los efectos de la concentración de bacterias. Los espectros Raman medios se muestran en la Figura 1.

Una clave para desarrollar el dispositivo de detección basado en espectroscopía Raman es el desarrollo de una base de datos espectral Raman con protocolos de análisis que permiten la identificación y clasificación de objetivos. Como parte del protocolo de análisis, se identifican las bandas espectrales Raman que pueden distinguir una sustancia objetivo de la interferencia de fondo. Estas bandas discretas se utilizan para desarrollar algoritmos de aprendizaje que sirven como base para la detección e identificación. Al obtener datos en regiones espectrales discretas en lugar de en todo el rango espectral (600-1800 cirr1), se puede reducir el tiempo de adquisición, así como las contribuciones espectrales de la interferencia de fondo confusa. El sistema espectroscópico con identificación de banda espectral discreta para el desarrollo de algoritmos se detalla en realizaciones del dispositivo.

Para identificar bandas espectrales discretas de significación estadística, se analizaron los espectros puros de bacterias en agua usando análisis de función discriminante, DFA (IBM SPSS Statistics 21). DFA crea un modelo predictivo para la pertenencia a grupos. El modelo está compuesto por funciones discriminantes que se basan en combinaciones lineales de variables predictoras. Se utilizaron datos espectrales, es decir, número de onda con intensidad Raman asociada, correspondientes a los siguientes picos Raman: 600, 621, 643, 670, 725, 896, 935, 960, 1003, 1126, 1158, 1173, 1209, 1249, 1297, 1320, 1338, 1362, 1375, 1397, 1420, 1449, 1480, 1578, 1584, 1606, 1620, 1640, 1657 cm-1. El análisis de función discriminante por etapas se utiliza para reducir el número de variables (números de onda) a un subconjunto de entrada en el análisis discriminante simultáneo para la clasificación. Una vez finalizado el modelo, la validación cruzada se realiza de acuerdo con el principio de “dejar uno fuera” en el que se elimina un individuo de la matriz original y luego se realiza el análisis discriminante de las observaciones restantes y se utiliza para clasificar al individuo omitido.

Se puede usar un procedimiento y análisis similar para otros patógenos tales como el virus de la influenza descrito en este documento, así como para otros numerosos compuestos basados en proteínas.

El análisis para identificar las cepas de bacterias MRSA se realiza basándose en un esquema de clasificación de 2 grupos. Primero se lleva a cabo una investigación de la capacidad de la espectroscopia Raman para distinguir el género Staphylococcus de otros géneros de bacterias. El grupo de Staphylococcus consistió en MRSA 1R, MRSA2R, MSSA 1S, MSSA 2S y S. epidermidis, mientras que el grupo sin estafilococos consistió en Bacillus subtilis y Corynebacterium sp. Los resultados de la clasificación muestran que el 100 % de los casos agrupados con validación cruzada se clasificaron correctamente con el 100 % del grupo de Staphylococcus y el 100 % del grupo de no Staphylococcus clasificando correctamente. Se utilizaron cinco números de onda en el modelo discriminante; 725 cm-1, 1158 cm-1, 1209 cm-1, 1420 cm-1 y 1450 cm-1, correspondientes a vibraciones de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos. Las asignaciones de bandas vibratorias Raman se dan en la Tabla 1 que se muestra a continuación.

Tabla 1

A continuación, se determina la viabilidad de la espectroscopia Raman para distinguir MRSA de otras especies y cepas de Staphylococcus. El análisis continúa hasta la identificación de las manchas. Los resultados de la clasificación DFA se proporcionan en la Tabla 2 que se muestra a continuación.

Tabla 2

La primera columna de la Tabla 2 enumera los miembros de cada grupo. La segunda columna enumera los resultados de la clasificación con validación cruzada. La tercera columna enumera los números de onda específicos utilizados en los modelos de función discriminante que se muestran acumulativamente en la Fig. 4. Los resultados de este análisis indican que MRSA se puede separar de otras bacterias hasta el nivel de la cepa utilizando un número mínimo de bandas espectrales Raman. Además, también se pueden distinguir e identificar cepas de bacterias sensibles a la metacilina.

A continuación, se considera la detección de un patógeno diana con antecedentes de confusión. Para el análisis nasal, se evalúa la interferencia de fondo de posibles factores de confusión. S. aureus coloniza con mayor frecuencia las fosas nasales anteriores, aunque el tracto respiratorio, las heridas abiertas, los catéteres intravenosos y el tracto urinario también son sitios potenciales de infección. Dado que hay otras bacterias y material en las fosas nasales exteriores, es importante investigar la capacidad de separar MRSA de otras especies de bacterias y factores de confusión. La flora nasal prominente incluye Staphylococcus aureus, células de Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium sp. y Propionibacterium sp. Las secreciones nasales también pueden incluir mucina, células epiteliales y glóbulos rojos.

Para este trabajo, se toman muestras de frotis nasales y se inoculan con MRSA 1R, MRSA2R, MSSA1S o S. epidermidis. Para determinar si MRSA se puede distinguir en presencia de secreciones nasales, se realiza un análisis de grupos. Se analizan los espectros puros de Corynebacterium sp., Staphylococcus epidermidis, MSSA 2S y MRSA 2R en agua, así como los espectros de muestras de frotis nasales inoculadas con MRSA 2R. La Fig. 5 muestran los resultados de un análisis de conglomerados. Los resultados muestran que las muestras de frotis nasal inoculadas con MRSA2R se agrupan con muestras puras de MRSA 2R, lo que indica que la espectroscopia Raman se puede utilizar para distinguir bacterias en presencia de factores de confusión.

Para determinar las regiones de los espectros Raman que no están dominadas por la interferencia de fondo, se superpusieron los espectros puros de MRSA 1R (en ausencia de factores de fondo) sobre los espectros de muestras de hisopos nasales inoculados. La figura 6 indica que las regiones alrededor de 640-740, 1200-1265, 1520-1560 y 1620­ 1700 cirr1 tienen una contribución de fondo mínima.

Los espectros mostrados en la Fig. 6 están preprocesados ligeramente diferentes a los mostrados en las figuras anteriores. Debido a los grandes picos intensos de los componentes de fondo, los espectros se preprocesaron con (1) suavizado derivado usando una ventana deslizante de 5; (2) sustracción de fondo mediante un ajuste polinomial robusto para eliminar las contribuciones espectrales debidas a la fluorescencia; y (3) normalización usando el pico de 1657 cirr1 en oposición a la normalización del vector.

Los espectros puros, de bacterias en agua, se volvieron a analizar con DFA utilizando datos solo en las regiones 640­ 740, 1200-1265 cm'1. La capacidad de la espectroscopia Raman para distinguir el género Staphylococcus de otros géneros de bacterias se muestra a continuación. Se utilizan cinco números de onda en el modelo discriminante; 640 cirr 1, 672 cm_1, 725 cm_1, 1209 cm_1 y 1225 cirr1, correspondientes a vibraciones de ácidos nucleicos y proteínas.

Los resultados de la clasificación muestran que el 94.5 % de los casos agrupados con validación cruzada se clasificaron correctamente con el 95.8 % del grupo de Staphylococcus y el 91.3 % del grupo sin Staphylococcus (Cory y Bacillus) se clasificaron correctamente. Estos resultados indican que las regiones de 640-740 cirr1, 1200-1265 cirr1 tienen potencial para la identificación de bacterias. Para probar más el modelo, se introdujeron en el análisis muestras de hisopos nasales inoculadas con MRSA 1R, MRSA 2R, MSSA 1S o S. epidermidis como incógnitas. 100 % de los casos correctamente clasificados como estafilococos. Además, los espectros medios de las especies y cepas de Staphylococcus muestran una clara distinción en estas regiones, como se ve mejor en las Figs. 8 y 9.

Los estudios preliminares detallados anteriormente han mostrado un alto nivel de confianza de que el estafilococo en general se puede identificar con 5 o menos regiones espectrales Raman. En una realización de la invención, el sistema está diseñado para adquirir medidas Raman en presencia de factores de confusión. Las mediciones se realizarán directamente en el vestíbulo nasal. Las regiones espectrales de 640-740 cirr1, 1200-1265 cirr1, 1640-1740 cm’1 tienen componentes espectrales mínimos debido a factores de confusión y muestran utilidad para esta aplicación. En otra realización, el otoscopio contiene un aspirador nasal que permite aspirar la muestra al efector de extremo del otoscopio a través de un filtro interno. Este filtro en procedimiento reducirá la señal de la interferencia de fondo. Las bandas espectrales para esta configuración se muestran en la Fig. 4.

Se realiza un análisis para identificar el virus de la influenza usando un esquema de clasificación similar. Se han obtenido espectros Raman para varios virus de influenza purificados en solución tampón de fosfato usando un micro espectrómetro Raman portátil a una longitud de onda de excitación de 514.5 nm equipado con una sonda fluídica como se describe adicionalmente en el presente documento. Una longitud de onda de excitación de 514.5 nm dio como resultado una señal de fluorescencia significativa de las muestras. Sin embargo, los picos Raman asociados con los virus diana eran lo suficientemente fuertes como para ser detectables a partir de la señal fluorescente de fondo. En la Fig. 7 se muestra una muestra de los espectros Raman recogidos para tres virus de la gripe examinados. Las tres cepas de influenza para las que se muestran los resultados preliminares son las siguientes: A/PR/8 y A/WSN/33, ambas del serotipo H1N1 y A/Udorn/72 del serotipo H3N2.

Los resultados confirman que se pueden obtener espectros Raman para el virus de la influenza. Además de confirmar la utilidad de Raman para la investigación de los virus de la influenza, los datos recopilados confirman que existen varios picos de Raman para fines de identificación. Una comparación de los espectros Raman para A/PR/8 y A/WSN/33 muestra una diferencia suficiente en los espectros, lo que proporciona características distintivas entre virus con el mismo serotipo. Los espectros Raman de los tres virus de la Fig. 8 muestran un triplete claro de picos en el desplazamiento Raman entre 2850 y 2950 cm-1. Estos picos están claramente presentes en todos los virus de la influenza que hemos examinado hasta la fecha.

Estos datos de muestra proporcionan claramente la detección de virus en general en comparación con el espectro de otras entidades biológicas. En desplazamientos Raman de aproximadamente 700 a 1700 cm-1, como se muestra en la Fig. 9, se observa un gran número de picos distintos para todas las muestras de virus. Si bien muchos de estos picos son comunes a todos los virus probados, un examen detallado muestra que las alturas relativas de los picos específicos, así como los desplazamientos en la posición de algunos picos, difieren con cada cepa de virus. Son estas relaciones máximas y desplazamientos los que se utilizan para distinguir las distintas cepas entre sí. Para aumentar la sensibilidad y las características de los datos de la influenza, la Fig. 10 muestra los espectros de influenza inmovilizada utilizando técnicas de sustracción de fondo. Las bandas espectrales identifican claramente el grupo amida I de la estructura de lámina plisada distintiva, así como los ácidos nucleicos carbono-carbono distintos y otros grupos amida. Estos resultados indican claramente las capacidades de distinción de la influenza para la identificación por espectroscopía Raman. Las mejoras en la sensibilidad y un aumento en la resolución en el sistema descrito ayudarán a identificar y distinguir las diferencias en esta región.

La presente divulgación permite además un análisis para distinguir un virus vivo (activo) de un virus muerto (inactivado). Por ejemplo, los resultados del muestreo de muestras secas inactivadas de influenza de serotipo A/PR/8 (H1N1) corridas a una longitud de onda de excitación de 785 nm revelaron una diferencia en los espectros Raman del virus de acuerdo con el método de inactivación utilizado. La presente divulgación se ha centrado hasta ahora en muestras de patógenos activos; sin embargo, los resultados preliminares de las pruebas del aparato y los métodos descritos en este documento mostraron que los datos espectrales Raman podrían usarse para desactivar los efectos del virus. Para determinar los efectos de desactivación del virus, se desactivó una muestra de A/PR/8 mediante tres métodos distintos: UV, calor y desactivación química. Cuando estas muestras fueron examinados a una longitud de onda de excitación de 785 nm, se observó una clara diferencia en los espectros Raman de la muestra que se desactivó químicamente, como puede verse en la Fig. 11. Esta diferencia es más obvia en el desplazamiento del pico de 1080 a 1040 cm-1, pero también se puede ver en el desplazamiento menor del pico ubicado cerca de 1340 cm-1. También existe una pequeña diferencia entre las muestras de influenza desactivadas por UV y por calor, pero indica la sensibilidad al cambio en el análisis. Esta información es útil para identificar cambios o mutaciones en el virus objetivo. Por ejemplo, la Fig. 7 muestra una parte significativa de los espectros Raman medios de APR8/34 (H1N1), A/WSN/32 (H1N1) y A/Udorn/72 (H3N2) después del preprocesamiento. Se promediaron aproximadamente 12 espectros promediados de cada patógeno y los resultados de la clasificación se reproducen en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4

Las realizaciones de ejemplo de un instrumento de detección portátil basado en micro Raman se describirán ahora más completamente con referencia a las Figs. 12-24 de los dibujos adjuntos. Se proporcionan ejemplos de realizaciones para que esta descripción sea completa y transmita completamente el alcance de esta descripción a los expertos en la técnica. Pueden establecerse detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones de la presente divulgación. Resultará evidente para los expertos en la técnica que no es necesario emplear detalles específicos, que las realizaciones de ejemplo se pueden realizar de muchas formas diferentes y que ninguna debe interpretarse como una limitación del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones de ejemplo, los procesos bien conocidos, las estructuras bien conocidas y las tecnologías bien conocidas no se describen en detalle.

La terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir realizaciones de ejemplo particulares solamente y no pretende ser limitante. Como se usa en este documento, las formas singulares “un”, “una” y “el” pueden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Los términos “comprende”, “que comprende”, “que incluye” y “que tiene” son inclusivos y, por lo tanto, especifican la presencia de la (s) estructura (s) o etapa (s) enumeradas; por ejemplo, las características, números enteros, etapas, operaciones, elementos de grupos y/o componentes indicados, pero no excluyen la presencia o adición de estructuras o etapas adicionales de las mismas. Los métodos, etapas, procesos y operaciones descritos en este documento no deben interpretarse como que requieran necesariamente una ejecución en el orden indicado o en cualquier orden particular discutido o ilustrado, a menos que se identifique específicamente como un orden de ejecución. También debe entenderse que se pueden emplear etapas adicionales, alternativos o equivalentes.

Cuando se hace referencia a la estructura como “activada”, “acoplada a”, “conectada a” o “acoplada” a otra estructura, puede estar directa o indirectamente (es decir, a través de una estructura interviniente) activada, acoplada, conectada o acoplado a la otra estructura. Por el contrario, cuando se hace referencia a la estructura como “directamente sobre”, “directamente acoplada a”, “directamente conectada a” o “directamente acoplada a” la otra estructura, puede que no haya una estructura intermedia presente. Otras palabras utilizadas para describir la relación entre elementos deben interpretarse de manera similar (por ejemplo, “entre” frente a “directamente entre”, “adyacente” frente a “directamente adyacente”). Como se usa en este documento, el término “y/o” incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos de referencia asociados.

Los términos de grado (por ejemplo, primero, segundo, tercero) que se usan en este documento para describir varias estructuras o etapas no pretenden ser limitantes. Estos términos se utilizan para distinguir una estructura o etapa de otra estructura o etapas, y no implican una secuencia u orden a menos que se indique claramente por el contexto de su uso. Por tanto, una primera estructura o etapa puede denominarse de manera similar una segunda estructura o etapa sin apartarse de las enseñanzas de los ejemplos de realización. Del mismo modo, términos espacialmente relativos (por ejemplo, “ interior”, “exterior”, “debajo”, “abajo”, “ inferior”, “arriba”, “superior”) que se utilizan aquí para describir la relación especial relativa de una estructura o etapa a otra estructura o etapa (s) puede abarcar orientaciones del dispositivo o su funcionamiento que son diferentes a las representadas en las figuras. Por ejemplo, si se voltea una figura, la estructura descrita como “debajo” o “debajo” de otra estructura estaría entonces orientada “encima” de la otra estructura sin afectar materialmente su relación u operación especial. La estructura puede estar orientada de otra manera (por ejemplo, rotada 90 grados o en otras orientaciones) y los descriptores espacialmente relativos usados en este documento pueden interpretarse en consecuencia.

Con referencia ahora a la Fig. 12, se muestra un factor de forma ejemplar (por ejemplo, Otoscopio inalámbrico Tele-View® de Advanced Monitors Corp.) para el sistema 10 portátil basado en espectroscopía Raman y que incluye un paquete láser en miniatura y una óptica. El sistema portátil puede configurarse como un otoscopio para pruebas en oídos, nariz y garganta, como un oftalmoscopio para pruebas en los ojos o, más generalmente, como un espectroscopio portátil para probar sitios de heridas, alimentos o superficies inanimadas. Los componentes funcionales de los componentes del sistema incluyen una carcasa 12 de factor de forma portátil y una punta de interrogación desechable o un efector de extremo 14 que se utiliza para examen nasal. El sistema se puede utilizar con tres tipos de efectores finales: uno para examen nasal directo, uno con aspiración al vacío y filtro, y otro con óptica de proximidad para examen de heridas. Otros componentes no mostrados en la Fig. 12 pero que se ilustran y describen a continuación incluyen un cabezal de muestreo óptico que tiene un microespejo híbrido, un micro CCD integrado o un formador de imágenes CMOS con un filtro graduado espacialmente de rango estrecho de resolución ultra-alta (reemplaza un espectrómetro delicado grande), procesamiento de señales y algoritmos de identificación para acondicionamiento de señales y detección de objetivos.

Una clave para desarrollar un dispositivo portátil basado en espectroscopía Raman es el desarrollo de protocolos de análisis que permiten la identificación y clasificación de objetivos. Los análisis espectrales de bandas Raman discretas que distinguen una sustancia objetivo de la interferencia de fondo forman la base de este desarrollo. Estas bandas discretas se utilizan para desarrollar algoritmos de aprendizaje que sirven como base para la detección e identificación. Un diagrama de la funcionalidad del dispositivo portátil se ilustra esquemáticamente en la Fig. 13 para incluir un extremo 16 frontal de la sonda, un conjunto de filtros 18 micro graduados y un generador 20 de imágenes. El conjunto de filtros micro graduados está diseñado para filtrar en la banda discreta, por ejemplo, filtros 18A-18D. Como se prefiere actualmente, el filtro 18A es un filtro micro graduado que cubre la banda espectral 640-740 cirr1 (banda ~ 3 nm), el filtro 18B es un filtro micro graduado que cubre la banda espectral 1200-1260 cirr1 (banda ~ 2 nm), el filtro 18C es un filtro micro graduado que cubre la banda espectral 1520-1560 cirr1 (banda de 1.3 nm), y el filtro 18D es un filtro micro graduado que cubre la banda espectral 1620-1750 cirr1 (banda de 4.4 nm). Cabe destacar un haz de excitación a 532 nm, el filtro 18A filtra una banda en el rango de 550.57-553.80 nm, el filtro 18B filtra una banda en el rango de 568.28-570.22 nm, el filtro 18C filtra una banda en el rango de 578.80 -580.18 nm, y el filtro 18D filtra una banda en el rango de 582.17-586.61 nm. El generador 20 de imágenes puede ser un CCD, un CMOS u otros dispositivos de formación de imágenes digitales similares.

Esta tecnología de diagnóstico en el punto de atención (POC) tiene un coste relativamente bajo y demuestra la viabilidad de su uso en entornos con recursos limitados y entornos de triaje para servicios no clínicos. El dispositivo permite la recolección de muestras (con el efector terminal nasal desechable en el dispositivo), el procesamiento y la lectura de resultados en la misma área, sin la necesidad de enviar muestras a un punto de recolección central para su procesamiento o prueba. No requiere manipulación de muestras y proporciona una contención segura de material biopeligroso con la eliminación rutinaria de la punta desechable. La salida se proporciona en un formato visual, sin ambigüedad, e incluye un proceso completo de control negativo y positivo interno. Las lecturas están disponibles como entradas en los protocolos de gestión médica. El sistema también puede incluir un sistema de código de barras integrado como una forma de conectar una muestra tomada quizás horas antes con la persona que proporcionó esa muestra.

Como se señaló anteriormente, el dispositivo está diseñado para funcionar en condiciones no ideales, que se esperan para un instrumento desplegable en el campo o en el punto de atención. Esto incluye la capacidad de operar bajo temperaturas extremas entre 0 y 45 grados Celsius. Si el diseño es tal que se podría producir una versión capaz de operar de -25 a 50 grados Celsius, pero es posible que se requieran calentadores para evitar la congelación que podría afectar la vida útil de la batería. El dispositivo también está diseñado para ser resistente al agua y la suciedad para permitir que los dispositivos funcionen en condiciones no ideales. Solo el efector de extremo desechable está expuesto al paciente, por lo que no se requerirá esterilización o limpieza del dispositivo entre usos. Las superficies expuestas del dispositivo pueden fabricarse con material antimicrobiano o resistente a bacterias.

El dispositivo, como una opción, también puede utilizar brazaletes de códigos de barras existentes si ya están asignados en la instalación o sitio del punto de atención. El dispositivo incluye un pequeño procesador de bajo consumo para operar el dispositivo, recopilar y analizar datos y almacenar resultados. El dispositivo incluye un controlador USB para permitir la descarga de datos desde el almacenamiento interno del dispositivo POC hasata dispositivos externos, así como la visualización en tiempo real. El dispositivo en un monitor auxiliar también puede incluir tarjetas inalámbricas/celulares estándar si se desea. El dispositivo utiliza un paquete de batería recargable, fácilmente intercambiable y accesible desde el exterior para obtener energía.

En la Figura 14 se muestra una representación esquemática de los componentes del dispositivo 10 portátil basado en espectroscopía Raman. En este ejemplo, la radiación del láser 22 se dirige a través de un filtro 24 de línea láser, que transmite luz láser mientras suprime la luz ambiental, a un divisor 26 de haz de 45 °. El divisor 26 de haz refleja la luz láser a través del efector 14 de extremo desechable a muestras donde interactúa con la muestra que produce una señal desplazada Raman. La luz se recoge de la muestra en una geometría de 180 grados y se transmite a través del divisor 26 de haz y el filtro 28 de bloqueo del láser. El filtro de bloqueo del láser evita además que la luz láser no deseada llegue al detector 30.

La señal desplazada Raman luego incide sobre un expansor 32 de haz (por ejemplo, un expansor 32A, 32B de haz simple como se muestra en las Figs. 18Ay 18B, respectivamente) que aumenta el diámetro de un haz de entrada colimado a un haz de salida colimado más grande. La configuración y la forma particulares de la óptica del expansor de haz se pueden cambiar, como la reflexión parabólica fuera del eje, para hacer que el expansor de haz sea más eficiente y se pueda empaquetar fácilmente dentro del dispositivo. Las señales ópticas del haz de salida se convierten en señales eléctricas mediante un formador 30 de imágenes con un filtro 34 graduado espacialmente de rango estrecho de resolución ultra-alta para su procesamiento. El filtro 34 incluye preferiblemente un conjunto de filtros 34A-34D micro graduados como se describe en referencia a la Fig. 13.

El efector 14 de extremo desechable ilustrado esquemáticamente en la Fig. 15 es un accesorio que interactúa con el paciente ya sea insertado en el conducto nasal o cerca de una herida o sitio de infección. Para el examen directo de la nariz o de la herida, se integra una lente 36 en la punta del efector de extremo para permitir que la luz láser se enfoque sobre las muestras y que se recoja la luz dispersa Raman. Como se muestra en la Fig. 16, se usa un efector 14' de extremo modificado cuando se requiere la filtración de la muestra. El efector 14' de extremo se conectará a una fuente 38 de vacío lo que permite que la muestra se introduzca en el cuerpo del efector de extremo a través de un filtro 40 interno. En una realización, el dispositivo puede estar equipado con una pequeña bomba de vacío que funciona cuando la fuente 38 de vacío elimina las moléculas de gas (aire) de un volumen sellado, indicado por la línea discontinua en la Fig. 14, para dejar un vacío parcial. El vacío llevará la muestra al efector 14' de extremo. La medición Raman tiene lugar en una ventana 42 óptica fabricada con un material ópticamente transparente como el cuarzo. La ventana 42 óptica está ubicada de forma concéntrica dentro de una malla 44 y un sello 46 formado en un extremo del efector 14' de extremo opuesto al filtro 40. El filtrado de la muestra reducirá la señal de la interferencia de fondo atrapando desechos grandes permitiendo que las bacterias o los virus pasen para su medición.

El sistema está configurado para entregar y recolectar luz de la muestra usando una trayectoria de haz abierta. Los tubos 24, 38 de lente se utilizan para aislar la trayectoria óptica y reducir la luz parásita.

Los efectores 14, 14' finales mostrados son espéculos desechables que se conectan de forma desmontable al cabezal 48 del dispositivo 10 con, por ejemplo, una conexión de bloqueo giratorio para permitir una alineación óptica precisa y facilitar la extracción del efector de extremo (punta). Los conectores efectores finales pueden estar equipados con o sin una lente de enfoque. Para la aplicación de succión al vacío, el conector albergará una lente 36 para permitir que la luz láser se enfoque sobre la muestra y que se recoja la luz dispersa Raman. Para la herida y el examen nasal directo, la lente estará ausente. El espéculo está diseñado como un componente de un solo uso que se separa del cabezal 48 del dispositivo y se desecha de acuerdo con los procedimientos de eliminación de desechos médicos.

Para este sistema, el haz incidente y la luz de señal recogida comparten un camino común de modo que se usa un divisor de haz de 45 ° 26 para reflejar la luz láser a través de la óptica a la muestra mientras se transmite eficazmente la luz de señal de retorno con desplazamiento Raman. Se usa un filtro 24 de bloqueo de láser con incidencia normal delante del elemento 26 de dispersión para bloquear completamente la luz láser no deseada. El diámetro de un haz de entrada colimado se incrementa con un expansor 32 de haz a un haz de salida colimado más grande. Con referencia a las Figs.

13, 19A y 19B, un conjunto de cuadrantes de microfiltro de resolución ultra-alta 34A-34D están dispuestos delante del detector 30 de imágenes y proporcionan un número de onda específico o un filtrado de banda espectral mediante el análisis de banda de ondas discretas. Cada cuadrante 34A-34D permite la detección de banda espectral discreta y cada microfiltro proporciona una detección de número de onda específica para el análisis espectral. Los cuadrantes 34A-34D pueden disponerse simétricamente alrededor de los ejes x e y como se muestra en la Fig. 19A, o dispuestos en bandas verticales como se muestra en la Fig. 19B. El sensor de imagen 30 convierte las señales ópticas en señales eléctricas. El sensor 30 de imágenes puede ser un CCD o CMOS integrado o similar.

Los filtros microópticos únicos proporcionan un rango estrecho de filtro graduado espacialmente, que abarca la región espectral estrecha que cubre un pico espectral Raman específico o una región estrecha de picos muy próximos. Los filtros graduados comerciales no tienen una resolución suficiente para lograr una resolución espacial de 1 cm-1. La longitud de onda espectral se transforma en una lectura de posición/intensidad de la matriz de imágenes que proporciona una reconstrucción de los picos espectrales de interés. El método de fabricación es una aleación de nitruro de aluminio indio graduado (InAIN) que puede proporcionar filtrado espectral mediante ingeniería de espacio de banda en cualquier región entre el espacio 1 eV y 6 eV de banda o 1240 nm a 206 nm. Se utiliza una deposición de plasma de baja energía basada en cátodos huecos para depositar la aleación de nitruro. La deposición se controla mediante una ventana de sustrato deslizante coordinada con un cambio en la tasa de deposición de indio que crea el recubrimiento óptico graduado.

Se usa un láser 22 de ancho de línea estrecho empaquetado en un módulo con electrónica de accionamiento integral para la excitación Raman. La longitud de onda y la potencia del láser se eligen de acuerdo con la aplicación. El láser puede utilizarse como fuente de haz abierto o acoplarse a una guía de ondas óptica.

El subsistema del espectrómetro incluye un subsistema electrónico, así como un paquete 52 de batería de iones de litio interna para proporcionar energía al sistema y permitir su uso portátil en el campo. El sistema 10 se alimenta de su paquete de batería interno o mediante un cargador/adaptador de corriente externo. El dispositivo 10 puede tener una provisión para monitorear la vida útil de la batería y el estado de carga. El dispositivo 10 puede diseñarse con un controlador USB (no mostrado) para permitir la descarga de datos desde el almacenamiento interno del dispositivo de punto de atención (POC) a dispositivos externos, así como una pantalla en tiempo real (no mostrada). En forma de panel LCD compacto. El dispositivo también puede construirse para adaptarse a la comunicación inalámbrica/celular estándar si se desea. El subsistema 50 electrónico del espectrómetro utiliza un microcontrolador dedicado para leer el espectro medido con el sensor 30 de imágenes, realiza el procesamiento básico de los datos de la imagen y transmite esa información a una pantalla, PC u otra interfaz similar. Como se señaló anteriormente, el dispositivo 10 puede estar equipado con un pequeño vacío 38 para que la bomba funcione junto con el efector 14' terminal desechable con filtro para la aplicación de succión por vacío.

En otro ejemplo, un dispositivo 110 está diseñado como una sonda Raman con conexión óptica a un sistema 112 de detección portátil como se muestra en las Figs. 20 y 24. El dispositivo 110 está diseñado para enviar luz láser a la muestra y recoger la dispersión Raman. Para lograr esto, el dispositivo 110 está configurado con guías de ondas, lentes y filtros que funcionan para transmitir la dispersión Raman de la muestra al sistema de detección para el análisis espectral de una manera similar a la descrita con respecto al dispositivo 10.

El sistema 112 de detección es una unidad portátil de aproximadamente 24 cm x 10 cm x 3 cm de tamaño (6“ x 4” x 1“). Los componentes clave incluyen un láser 114 acoplado ópticamente al dispositivo 110 para la excitación Raman y una subunidad 114 de espectrógrafo ópticamente acoplada al dispositivo 110 para la medición de la intensidad de la radiación Raman en función de la longitud de onda. Una subunidad 116 del espectrógrafo indicada por el cuadro discontinuo en la figura 20 puede configurarse como, pero no se limita a: un espectrómetro de rejilla, un espectrómetro de prisma, o un interferómetro. El sistema 112 de detección también incorporará un microcontrolador 118 para el procesamiento de señales y los algoritmos de identificación para el acondicionamiento de señales y la detección de objetivos, así como una pantalla gráfica fácil de usar que actúa como la interfaz hombre-máquina. Una pantalla LCD en color tendrá una resolución suficiente para mostrar las instrucciones de uso, así como los resultados de las pruebas en la salida de texto para la clasificación pasa/no pasa, y para mostrar gráficamente un espectro. Una estructura de menú simple con los íconos de botones grandes hace que el funcionamiento del dispositivo sea sencillo y fácil de usar.

Como se muestra en las FIGS. 20 y 24, la subunidad 116 del espectroscopio está configurada como un espectrómetro Czerny-Turner. La radiación del láser 114 se dirige a través de una guía de ondas óptica flexible (fibra) 120 al dispositivo 110 y se transmite a través de un filtro 122 de línea láser y un efector 124 final desechable a las muestras. La luz interactúa con la muestra produciendo una señal de desplazamiento Raman que se recoge en una geometría de 180 grados. La luz recogida se transmite a través de un filtro 122 de bloqueo de láser y se acopla a una guía de ondas óptica flexible (fibra) 126. El filtro 122 de bloqueo de láser evita que la luz láser no deseada llegue al detector. La señal desplazada Raman se dirige a través de la guía de ondas óptica (fibras) 126 a la subunidad 116 espectroscópica del sistema 112 de detección. La luz que entra en la subunidad 116 se refleja en el espejo 128 colimador y se dirige a la rejilla 130 de difracción que separa la policromática incidente luz en componentes constituyentes de longitud de onda. La luz difractada se dirige a un espejo 132 de enfoque sobre un detector 134 que convierte señales ópticas en eléctricas para su procesamiento.

Como se prefiere actualmente, el efector 124 de extremo desechable es un espéculo desechable que interactúa con el paciente, ya sea insertado en el conducto nasal o cerca de una herida o vista de infección. El diseño del efector de extremo es similar al descrito en las Figs. 15-17.

En las Figs. 21-23D se ilustran más detalles del tren óptico para el dispositivo 110. La luz del láser 114 se acopla a las fibras de excitación 120e de la sonda como se muestra en la Fig. 19. Como se ve mejor en la Fig. 22A, las fibras de excitación 120e forman parte del haz de fibras 120 que están dispuestas concéntricamente alrededor de la fibra 120c de recogida. En una realización preferida, la fibra 120c de recogida tiene un diámetro aproximadamente cuatro veces mayor que el diámetro de la fibra 120e de excitación. Se utiliza un filtro 122A de alto rechazo (filtro de línea láser) en la salida de estas fibras para eliminar las bandas Raman que surgen del núcleo de sílice, permitiendo así que solo la luz láser se transmita a la muestra. Las fibras de cristal fotónico de núcleo hueco se utilizan como fibras de excitación para reducir/eliminar la necesidad de filtrado.

Los espejos 136 parabólicos fuera del eje, situados debajo de las fibras 120 de excitación, coliman y dirigen los rayos a una lente 138 cónica de 45 grados. La Fig. 22C ilustra un haz de excitación transmitido desde las fibras 120e de excitación e incidiendo en la cara 138 de la lente cónica. Como se prefiere actualmente, la altura de la lente 138 cónica es aproximadamente el doble del diámetro de la fibra 120e de excitación, como se ve mejor en la Fig. 22B. Esta lente 138 tiene caras recubiertas de dieléctrico que permiten que se refleje la luz láser y se transmita la dispersión Raman. En particular, la superficie exterior de la lente 138 está recubierta con un dieléctrico para reflejar la luz láser y dejar pasar la luz dispersada de Stokes. La luz láser reflejada se dirige hacia la superficie de la muestra y se enfoca con una lente convexa. Cuando la lente está ausente, la sonda emite luz colimada. La luz dispersada de una muestra se recolecta 180 grados con respecto a la dirección del rayo láser. Se dirige a través de la lente 138 cónica que permite que solo la luz dispersada Raman se acople a la fibra 126 colectora.

Dos elementos clave de este diseño son el sistema 136 de espejo parabólico fuera del eje y la lente 138 cónica de 45 grados. Como se ve mejor en la Fig. 23B, el espejo parabólico fuera del eje es una óptica anular o en forma de rosquilla que tiene ocho depresiones cónicas u hoyuelos 140 en su superficie. Cada uno de los ocho hoyuelos 140 forma un espejo parabólico de 90 grados con su punto focal en una fibra 120e de excitación designada. Como se muestra en las Figs. 21, 22B, 22C, 23C y 23D, la lente 138 cónica es un elemento óptico hexagonal hueco cuyas caras están en un ángulo de 45 grados. La lente 138 tiene un revestimiento dieléctrico que le permite actuar como un filtro de paso largo (que refleja la luz láser y transmite la dispersión Raman).

La incorporación de otras características en el sistema incluye: una funda 142 de alivio de tensión que proporciona alivio de tensión a los cables de fibra y exhibe un alto grado de flexibilidad. Un primer conector 144 asegura la fibra de excitación (guía de ondas) del dispositivo 110 al láser 114. Un segundo conector 146 asegura la fibra de recolección Raman (guía de ondas) del dispositivo 110 hasta la subunidad 116 del espectrógrafo. Se empaqueta un láser 114 de ancho de línea estrecha en un módulo con electrónica de accionamiento integral para excitación Raman. La longitud de onda y la potencia del láser se seleccionan en función de la aplicación y la identificación del objetivo. El láser se acopla a una fibra óptica o guía de ondas con el uso de un tercer conector.

El segundo conector de fibra 146 asegura la fibra 126 de entrada (o guía de ondas) a la subunidad 116 del espectrógrafo. La luz de la fibra de entrada (o guía de ondas) ingresa al sistema de detección a través de este conector. Detrás del conector, se puede utilizar una hendidura (no mostrada) que tiene una pieza oscura de material que contiene una abertura rectangular. El espejo 128 de colimación enfoca la luz que entra en la porción del espectrómetro del sistema de detección hacia la rejilla 130. La rejilla 130 de difracción difracta la luz del espejo 128 de colimación y dirige la luz difractada hacia el espejo 132 de enfoque. El elemento 130 dispersivo separa la luz policromática incidente en componentes de longitud de onda constituyentes y puede ser una rejilla o prisma o similar. El espejo 132 de enfoque recibe la luz reflejada desde la rejilla 130 y enfoca la luz sobre el detector 134 CCD. El detector 134 CCD recoge la luz recibida del espejo 132 de enfoque y convierte la señal óptica en una señal digital. Cada píxel del detector CCD corresponde a la longitud de onda de la luz que lo incide, creando una señal de respuesta digital.

Como se señaló anteriormente, el sistema 112 de detección incluye un paquete de batería de iones de litio interno (no mostrado) para proporcionar energía al sistema y permitir su uso portátil en el campo. El sistema se puede ejecutar desde su paquete de baterías interno o mediante un cargador/adaptador de corriente externo. El dispositivo 112 tendrá una provisión para monitorear la vida de la batería y el estado de carga. El sistema 112 de detección puede incluir un subsistema electrónico que incluye un procesador 148 basado en PC, espectrómetro 116, bomba de vacío y controlador de válvula (no mostrados), sensores de presión (no mostrados) y enclavamientos. El procesador basado en PC se usa para realizar todos los cálculos y se acopla a una pantalla LCD 150 con una pantalla táctil y/o botones 152 de función perimetral para manejar la selección del menú. El subsistema 112 del espectrómetro utiliza un microcontrolador 118 dedicado para leer la matriz CCD, realizar el procesamiento básico de los datos de la imagen y luego transmitir esa información al PC usando un USB u otra interfaz similar.

Con referencia ahora a la Fig. 25, se proporciona un diagrama 210 de flujo que ilustra el proceso de detección. En particular, un dispositivo espectroscópico Raman portátil como se describió anteriormente se opera para transmitir un haz de luz coherente desde el láser de excitación a una muestra. El sensor de formación de imágenes detecta la radiación de la señal de muestra filtrada con desplazamiento Raman (bloque 212) y genera datos de imagen representativos de la misma (bloque 214). A continuación, se analizan los datos de la imagen (bloque 216) y la característica espectral en las bandas espectrales discretas se examinan para detectar la presencia de un patógeno diana (bloque 218). Si no se encuentran características patógenas objetivo, el dispositivo muestra y/o informa un resultado negativo para la presencia del patógeno diana (bloque 220).

Si se encuentran características patógenas diana, estas características se comparan con los espectros Raman de línea base (bloque 222). Los algoritmos y los coeficientes de clasificación se calculan sobre la base de los espectros de la línea de base (bloque 224). La tipificación de las características patógenas objetivo se realiza en un enfoque jerárquico y la clasificación se asigna a medida que la comparación desciende en la jerarquía (bloque 226). Si se identifica una coincidencia positiva en la base de datos, el dispositivo muestra y/o informa un resultado positivo para detectar la presencia del patógeno diana (bloque 228). Si no se identifica una coincidencia positiva en la base de datos, la probabilidad de la identidad o pertenencia del patógeno diana dentro de un grupo de interés particular puede calcularse y presentarse o notificarse (bloque 230).

Un sistema robusto y portátil basado en espectroscopía Raman como se detalla anteriormente tiene muchos beneficios anticipados. La técnica no invasiva y no destructiva para el examen nasal y el examen de heridas proporciona una detección rápida y rentable de una amplia gama de compuestos a base de proteínas que incluyen bacterias, virus, fármacos y anomalías tisulares. El método requiere poca o ninguna preparación de la muestra, lo que reduce la necesidad de almacenar consumibles. Además, la facilidad de uso y el muestreo sin contacto hacen del dispositivo una herramienta valiosa para las investigaciones en el punto de atención.

El dispositivo es un sistema de detección de punto de atención casi en tiempo real automatizado sin reactivos que puede permitir a los proveedores de atención médica brindar una mejor gestión de los pacientes y optimizar los resultados clínicos. Dado que el sensor se puede desarrollar para analizar bacterias, virus, fármacos y tejidos, se puede promover a una variedad de segmentos de mercado que incluyen: médicos de atención primaria y farmacias.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un instrumento (10) espectroscópico Raman portátil para la detección de patógenos, que comprende:

una carcasa (12) que tiene una porción de manija, una porción (48) de cabezal y un efector (14) de extremo;

una sonda espectroscópica Raman encajada en la carcasa e incluye:

un láser (22) dispuesto en la porción de la manija y operable para emitir un haz de luz coherente;

un filtro (24) de línea láser operable para transmitir el haz de luz a lo largo de una trayectoria óptica y suprimir la luz ambiental;

un divisor (26) de haz dispuesto en la porción de cabezal y operable para reflejar el haz de luz desde el filtro de línea láser a través de una abertura formada en el efector de extremo hacia una muestra para producir una señal de muestra desplazada Raman;

un colector (36) para recoger la señal de muestra y transmitir la señal de muestra a través del divisor de haz;

un expansor (32) de haz para colimar la señal de muestra del divisor de haz y generar una señal de muestra de diámetro expandido;

un filtro (34) graduado espacialmente de rango estrecho de resolución ultra-alta para filtrar la señal de muestra de diámetro expandido en al menos una banda espectral estrecha basada en un conjunto predeterminado de bandas espectrales discretas para un patógeno diana, en la que el filtro es un filtro de espacio de banda que comprende una aleación de nitruro de aluminio indio graduada; y

un formador (30) de imágenes para convertir la señal de muestra de diámetro expandido en datos de imagen representativos de la señal de muestra desplazada Raman; y

un conjunto de electrónica que incluye:

un microcontrolador (50) encajado dentro de la carcasa para controlar la sonda espectroscópica Raman, leer los datos de la imagen del formador de imágenes, y analizar los datos de la imagen en las bandas espectrales discretas para detectar la presencia del patógeno diana, comparando los datos de la imagen con un espectro Raman de referencia y comunicar un resultado de prueba basado en el análisis y la comparación; y

una fuente (52) de energía acoplada operativamente al microcontrolador y la sonda espectroscópica Raman.

2. El instrumento (10) espectroscópico Raman portátil de la reivindicación 1, en el que el filtro filtra la señal de muestra de diámetro expandido en al menos una banda espectral estrecha seleccionada del grupo que consiste en: 640-740 cm-1, 1200-1260 cm-1, 1520-1560 cm-1, y 1640-1740 cm-1.

3. El instrumento (10) espectroscópico Raman portátil de la reivindicación 1, en el que el filtro filtra la señal de muestra de diámetro expandido en una pluralidad de bandas espectrales estrechas; y en el que, preferiblemente, el filtro filtra la señal de muestra de diámetro expandido en:

i) una pluralidad de bandas espectrales estrechas seleccionadas del grupo que consiste en: 640-740 cirr1, 1200-1260 cirr 1, 1520-1560 cm-1, y 1640-1740 cm’1 o

ii) cada una de las bandas espectrales a 640-740 cm-1, 1200-1260 cm-1, 1520-1560 cm-1, y 1640-1740 cm-1.

4. El instrumento (10) espectroscópico Raman portátil de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el filtro está dividido en regiones discretas, cada una de dichas regiones proporciona filtrado en una de las bandas espectrales.

5. El instrumento (10) espectroscópico Raman portátil de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la sonda espectroscópica Raman comprende además un elemento (120) de retrodispersión de 180 grados interpuesto entre un detector (134) y la abertura del efector de extremo, el elemento de retrodispersión tiene:

una fibra (120c) de recogida ubicada en el centro para transmitir la señal de muestra desplazada Raman al detector (134); una pluralidad de fibras (120e) de excitación dispuestas radialmente con respecto a la fibra de recogida para transmitir el haz de luz coherente; y

espejos (136) parabólicos fuera de eje para reflejar el haz de luz coherente emitido desde la pluralidad de fibras de excitación; y

en el que, preferiblemente, la sonda espectroscópica Raman comprende además un filtro (122) de bloqueo de láser entre los espejos (136) parabólicos fuera del eje y el detector (134).

6. El instrumento (10) espectroscópico Raman portátil de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el efector de extremo comprende además un espéculo (14) desechable que tiene una base fijada de forma desmontable a la porción (45) del cabezal de la carcasa, el espéculo se estrecha desde la porción de base hasta una punta que tiene una abertura formada a través de la misma; y

en el que, preferiblemente, el espéculo desechable comprende, además:

i) una lente (36) dispuesta en la punta de la abertura para enfocar el haz de luz y recoger la señal de muestra; o ii) un filtro (40) dispuesto en la punta de la abertura, una ventana (42) óptica ubicada cerca de la base y una fuente (38) de vacío acoplada al efector de extremo para extraer una muestra a través del filtro y hacia la ventana óptica.

7. Un método para detectar un patógeno diana mediante análisis espectroscópico basado en Raman que comprende: transmitir un haz de luz coherente sobre una muestra para generar una señal de muestra con desplazamiento Raman; filtrar, utilizando un filtro (34) graduado espacialmente de rango estrecho de resolución ultra-alta, la señal de muestra con desplazamiento Raman en al menos una banda espectral estrecha basada en un conjunto predeterminado de bandas espectrales discretas para que un patógeno diana genere una señal de muestra filtrada con desplazamiento Raman, en la que el filtro es un filtro espacio de banda que comprende una aleación de nitruro de aluminio indio graduada; generar datos de imagen representativos de la señal de muestra filtrada con desplazamiento Raman;

analizar los datos de la imagen en las bandas espectrales discretas para detectar la presencia del patógeno diana; comparar los datos de la imagen con un espectro Raman de referencia;

mostrar un resultado positivo cuando la comparación de los datos de la imagen con el espectro Raman de línea de base indica una coincidencia.

8. El método para detectar un patógeno diana de la reivindicación 7, en el que la señal con desplazamiento Raman se filtra en al menos una banda espectral estrecha seleccionada del grupo que consta de: 640-740 cirr1, 1200-1260 cirr1, 1520-1560 cm-1, y 1640-1740 cm-1

9. El método para detectar un patógeno diana de la reivindicación 7, en el que la señal con desplazamiento de Raman se filtra en múltiples bandas espectrales estrechas seleccionadas del grupo que consiste en: 640-740 cirr1, 1200-1260 cm’1, 1520-1560 cm-1, y 1640-1740 cm-1 y

en el que, preferiblemente, la señal con desplazamiento Raman se filtra en cada una de las bandas espectrales a 640­ 740 cm-1, 1200-1260 cm-1, 1520-1560 cm-1, y 1640-1740 cm-1.

10. El método para detectar un patógena diana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que comprende además proyectar el haz de luz coherente a través de una lente y sobre la muestra.

11. El método para detectar un patógeno diana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende además extraer la muestra a través de un filtro y depositar la muestra filtrada en una ventana óptica, en el que el haz de luz coherente se transmite a través de la ventana óptica sobre la muestra.

12. El método para detectar un patógeno diana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-11, que comprende además transmitir el haz de luz coherente desde un láser en una carcasa de espectroscopio a lo largo de una trayectoria óptica a través de una abertura formada en un efector de extremo y sobre la muestra.

13. El método para detectar un patógeno diana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-12, que comprende además proyectar la señal de muestra filtrada con desplazamiento Raman sobre un formador de imágenes en la carcasa del espectroscopio para generar los datos de imagen representativos de la señal de muestra filtrada con desplazamiento Raman.