ES2873080T3 - Métodos de diagnosticar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) usando novedosos biomarcadores moleculares - Google Patents

Métodos de diagnosticar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) usando novedosos biomarcadores moleculares Download PDF

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Abstract

Un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde el sujeto ha sido diagnosticado como que padece EPOC estable o se sospecha que padece EPOC estable, el método comprende: - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de diagnosticar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) usando novedosos biomarcadores moleculares
La presente invención se refiere a métodos in vitro para el diagnóstico de enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), en donde se determina la expresión del gen marcador DMBT1 y KIAA1199, como se define adicionalmente en las reivindicaciones.
En particular, la invención se refiere a un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde el sujeto ha sido diagnosticado como que padece EPOC estable o se sospecha que padece EPOC estable, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes marcadores DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y
- determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
La invención también se refiere a un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) estable a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes marcadores DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto que padece EPOC estable, en donde dicho sujeto control que padece EPOC estable es un sujeto que padece una fase inicial de EPOC con limitación de flujo de aire leve caracterizado por una proporción VEFi /Cv F de < 70% y un VEF1 de > 80% (fase I de EPOC según los criterios GOLD); y - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde una disminución en el nivel de expresión de DMBTl y un aumento en el nivel de expresión KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
La invención también se refiere a un método in vitro de diagnosticar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) estable en un sujeto, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto;
- comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y
- determinar si el sujeto padece o no EPOC estable, en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y una disminución en el nivel de expresión de KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KlAA1199 es indicativo de EPOC estable,
en donde dicha EPOC estable se refiere a fase iniciales de EPOC con limitación de flujo de aire leve caracterizado por una proporción VEF1/CVF de < 70% y un VEF1 de > 80% (fase I de EPOC según los criterios GOLD).
La EPOC representa una de las patologías principales de la población anciana del mundo. Desencadenada por la exposición prolongada a productos de combustión, condiciones climáticas e infecciones repetidas, la EPOC se ha convertido en la cuarta causa principal de mortalidad en individuos ancianos. Durante las últimas décadas, la prevalencia mundial de la EPOC ha subido en más del 10%, en particular en fumadores activos más allá de la edad de 55 (Murray et al., 1997). Dado el número creciente de personas ancianas en la población mundial y el aumento en el mundo de riesgos inhalantes, tanto ocupacionales como personales, la EPOC se debe considerar como una de las amenazas más desafiantes a los sistemas de salud mundiales (Halbert et al., 2006; US Burden of Disease Collaborators, 2013). Sin embargo, aunque el impacto de la EPOC en las condiciones de salud se entiende cada vez más, los mecanismos que producen y mantienen la evolución de la enfermedad son en gran parte desconocidos. Basado en la experiencia clínica y los resultados de estudios controlados, la EPOC se considera como una enfermedad en gran medida inflamatoria. Sin embargo, mientras que el tratamiento antiinflamatorio a largo plazo puede mejorar el desenlace en EPOC, su impacto en la patología global de la enfermedad es menos claro. El estudio TORCH (TOwards a Revolution en COPD Health; Hacia una revolución en la salud de EPOC) ha mostrado claramente que esta visión unilateral en la patofisiología de EPOC no es completamente correcta ya que pacientes en tratamiento continuo con corticosteroides inhalados no tuvieron un mejor desenlace que esos sin. En línea con esto, varios ensayos clínicos bien definidos han intentado estratificar pacientes según fenotipos clínicos relevantes, el estudio ECLIPSE (Evaluation of COPD Longitudinally to Identify Predictive Surrogate Endpoints, Evaluación de EPOC longitudinalmente para identificar puntos finales sustitos predictivos) es el último y más importante intento hasta ahora (Vestbo et al., 2011).
Mientras que estos intentos han demostrado la notable heterogeneidad de las manifestaciones clínicas de EPOC, desafortunadamente fracasaron para mejorar el entendimiento de las fuerzas centrales que dirigen la enfermedad, sus mediadores, y su jerarquía en provocar los fenotipos clínicos de EPOC.
El documento WO 2013/177060 divulga un método de clasificar el estado de la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) de un sujeto.
Hasta recientemente, la EPOC se ha definido en gran medida por la limitación del volumen máximo de aire exhalado en un segundo durante la espiración forzada (VEF1), así como la cantidad total de aire exhalado (capacidad vital [espiratoria] forzada, CVF), y sus respectivas relaciones (Wedzicha JA, 2000). Sin embargo, la variabilidad de la presentación clínica de EPOC independientemente de cualquier grado individual de limitación de flujo de aire sugería que la enfermedad comprende diferentes mecanismos relacionados con patologías bronquiales y peribronquiales (Hurst et al., 2010; Han et al., 2010). Como consecuencia, se han añadido medidas clínicas adicionales al proceso diagnóstico en EPOC, tal como la intensidad de la inflamación bronquial, la frecuencia de exacerbaciones de la enfermedad o la presencia de comorbilidades (Vestbo et al., 2013).
No sorprendentemente, VEF1 no se correlaciona bien con el desarrollo de síntomas. Sin embargo, muchos estudios han demostrado claramente que VEF1 es un predictor fuerte de mortalidad y morbilidad en EPOC, lo que sugiere una correlación relevante entre la obstrucción (morfológicamente fijada) de las vías respiratorias periféricas y la patofisiología de la enfermedad. Dada la probabilidad de que la morfología de las vías respiratorias pequeñas vaya a reflejar el resultado neto patológico de todos los sucesos metabólicos en este compartimento pulmonar, incluyendo actividades inflamatorias crónicas y regeneradoras, esto es más que plausible. Basado en estos hechos, todavía parece apropiado aplicar los síntomas de las manifestaciones clínicas más establecidas de EPOC, es decir, obstrucción bronquial fijada e intensidad de bronquitis como los indicadores clínicos principales para un primer intento para delinear mecanismos y mediadores capaces de dirigir la patología de EPOC. En vista de los antecedentes prolongados bien documentados de EPOC que con frecuencia cubren periodos de más de dos décadas, cualquier intento de delinear la patología de la enfermedad debería a) cubrir la fase más temprana de desarrollo patológico, el establecimiento de bronquitis crónica (EPOC “en riesgo” según los criterios GOLD (Global Initiative on Obstructive Lung Disease, Iniciativa global en enfermedad pulmonar obstructiva)) que probablemente preceda a la primera manifestación de obstrucción bronquial “irreversible”, b) incluir tanto desarrollo a largo plazo de la enfermedad que precede a la fase controlada de evaluación clínica y c) abarcar un periodo suficientemente largo para permitir la identificación de efectos de corto alcance importantes en la patología EPOC. Por último, como la patología EPOC se enfoca en las vías respiratorias pequeñas (Hogg, JC, et al., 2004 (a)), la evaluación biológica inicial se debería realizar en este compartimento, independientemente del hecho que algunos síntomas característicos, tal como la producción de flema como un signo de bronquitis intensificada, también reflejarán la actividad metabólica de las vías respiratorias más centrales.
La EPOC progresivamente debilita pacientes, produciendo una discapacidad creciente y empeorando el impacto de exacerbaciones. En particular, el desarrollo de daño irreversible a los pulmones comienza y después gradualmente empeora cuando un paciente que padece EPOC avanza de la fase de enfermedad temprana estable a una fase progresiva de la EPOC. Desafortunadamente, muchos pacientes con EPOC permanecen sin diagnosticar y potencialmente desconocidos para los profesionales sanitarios hasta las fases más avanzadas de la enfermedad. En tales casos, el diagnostico retrasado de EPOC produce pacientes que padecen síntomas y limitaciones que de otra manera se podrían aliviar por tratamiento (Price et al., 2011). Por tanto, sería muy deseable ser capaz de diagnosticar EPOC en una fase de enfermedad temprana y, en particular, identificar pacientes que están en riesgo de desarrollar EPOC progresiva con el fin de poder prevenir que estos pacientes padezcan daño irreversible significativo.
Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar métodos novedosos y/o mejorados que permitan diagnosticar EPOC en una fase de enfermedad temprana o evaluar el riesgo o susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC. Es además un objeto de la invención proporcionar métodos novedosos y/o mejorados que permitan evaluar la susceptibilidad de un sujeto de desarrollar EPOC progresiva.
La presente invención se basa en el inesperado hallazgo de el gen DMBT1, así como los genes KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL se expresan diferencialmente en muestras de sujetos que padecen EPOC progresiva o sujetos en riesgo/propensos a desarrollar EPOC progresiva por una parte, y en muestras control de sujetos sanos, por otra parte. En particular, y como también se describe en el ejemplo 1, se ha encontrado que la expresión de los genes DMBT1, KIAA1199, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, FGG, CEACAM5, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, NTRK2 y COMP está aumentada en muestras de pacientes que padecen EPOC progresiva o en riesgo de desarrollar EPOC progresiva, mientras que la expresión de los genes TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, PLA1A, HYAL2, CST6, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL está disminuida en muestras de pacientes que padecen EPOC progresiva o en riesgo de desarrollar EPOC progresiva, en comparación con la expresión de los genes correspondientes en muestras control de pacientes sanos. Por tanto, según la presente invención, estos novedosos biomarcadores moleculares se pueden usar ventajosamente para evaluar la susceptibilidad/propensión de un sujeto a desarrollar EPOC progresiva. Se ha encontrado además sorprendentemente que los genes DMBT1, KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL se expresan diferencialmente en muestras de sujetos que padecen EPOC estable o sujetos en riesgo/propensos a desarrollar EPOC estable por una parte, y en muestras control de sujetos sanos por otra parte. En relación a esto, se ha encontrado particularmente que la expresión de los genes KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, PLA1A, HYAL2, CST6, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL está disminuida en muestras de pacientes que tienen EPOC estable o en riesgo de desarrollar EPOC estable, mientras que la expresión de los genes DMBT1, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, FGG, CEACAM5, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, NTRK2 y COMP está aumentada en muestras de pacientes que tienen EPOC estable o en riesgo de desarrollar EPOC estable, en comparación con la expresión de los correspondientes genes en muestras control de pacientes sanos. Según la presente invención, estos novedosos biomarcadores moleculares se pueden usar, por tanto, para diagnosticar EPOC estable y/o evaluar la susceptibilidad/propensión de un sujeto para desarrollar EPOC estable. Además, los biomarcadores proporcionados en el presente documento tienen excelente sensibilidad y/o especificidad.
Según esto, en un primer aspecto la presente divulgación proporcionar un método in vitro para el diagnóstico de EPOC, el método comprende determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida de un sujeto.
Según este primer aspecto, la divulgación también se refiere al uso de DMBT1 como un marcador para el diagnóstico in vitro de EPOC.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde el sujeto ha sido diagnosticado como que padece EPOC estable o se sospecha que padece EPOC estable, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida de un sujeto;
- comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y
- determinar si el sujeto o no es propenso o desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde el aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
Se prefiere que en este segundo aspecto el método además comprenda:
- determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A, y opcionalmente al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2, RASGRF2, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, DPP6, SLC51B y NUDT11 en la muestra obtenida del sujeto;
- comparar el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A, y opcionalmente al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2, RASGRF2, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, DPP6, SLC51B y NUDT11 con un nivel de expresión control de los genes correspondientes en un sujeto sano; y
- determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible,
en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, FGG, CEACAM5, CYP1A1 y/o NTRK2 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva, y
en donde una disminución en el nivel de expresión de TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11 y/o CTHRC1 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un método in vitro de diagnosticar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) estable en un sujeto, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida de un sujeto;
- comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y
- determinar si el sujeto padece o no EPOC estable, en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y una disminución en el nivel de expresión de KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de EPOC estable, en donde dicha EPOC estable se refiere a fase iniciales de EPOC con limitación de flujo de aire leve caracterizado por una proporción VEF1/CVF de < 70% y un VEF1 de > 80% (fase I de EPOC según los criterios GOLD).
El método según este tercer aspecto preferiblemente además comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A con un nivel de expresión control de los genes correspondientes en un sujeto sano; y
- determinar si el sujeto padece o no EPOC estable,
en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 en la muestra del sujeto en comparación al nivel de expresión control del gen correspondiente es indicativo de EPOC estable, y
en donde una disminución en el nivel de expresión de KIAA1199 y TMSB15A en la muestra del sujeto en comparación al nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de EPOC estable.
En un cuarto aspecto, la invención se refiere a un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto;
- comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto que padece EPOC estable, en donde dicho sujeto control que parece EPOC estable es un sujeto que padece una fase inicial de EPOC con limitación de flujo de aire leve caracterizado por una proporción VEFi /Cv F de < 70% y un VEF1 de > 80% (fase I de EPOC según los criterios GOLD); y - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde una disminución en el nivel de expresión de DMBTl y un aumento en el nivel de expresión de KIA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión para desarrollar EPOC progresiva.
En un quinto aspecto, la divulgación se refiere al uso de (i) un par de cebadores para un transcrito del gen DMBT1, (ii) una sonda de ácido nucleico para un transcrito del gen DMBT1, (iii) una micromatriz que comprende una sonda de ácido nucleico para el transcrito del gen DMBT1 y opcionalmente comprende sondas de ácido nucleico para los transcritos de uno o más genes adicionales seleccionados de KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL, o (iv) un anticuerpo contra la proteína DMBT1, en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible.
En un sexto aspecto, la invención se refiere a un fármaco contra EPOC para uso en tratar EPOC en un sujeto que se ha identificado en un método según el segundo aspecto de la invención como que es propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible.
En un séptimo aspecto, la divulgación se refiere al uso de (i) un par de cebadores para un transcrito del gen DMBT1, (ii) una sonda de ácido nucleico para un transcrito del gen DMBT1, (iii) una micromatriz que comprende una sonda de ácido nucleico para el transcrito del gen DMBT1 y opcionalmente comprende sondas de ácido nucleico para los transcritos de uno o más genes adicionales seleccionados de KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL, o (iv) un anticuerpo contra la proteína DMBT1, en un método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable.
En un octavo aspecto, la invención se refiere a un fármaco contra EPOC para uso en tratar o prevenir EPOC en un sujeto que se ha identificado en un método según el tercer aspecto de la invención como que padece EPOC estable.
En un noveno aspecto, la divulgación se refiere al uso de (i) un par de cebadores para un transcrito del gen DMBT1, (ii) una sonda de ácido nucleico para un transcrito del gen DMBT1, (iii) una micromatriz que comprende una sonda de ácido nucleico para el transcrito del gen DMBT1 y opcionalmente comprende sondas de ácido nucleico a los transcritos de uno o más genes adicionales seleccionados de KIAA1199, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, BEX1, y GHRL, o (iv) un anticuerpo contra la proteína DMBT1, en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible.
En un décimo aspecto, la invención se refiere a un fármaco contra EPOC para uso en tratar EPOC en un sujeto que padece EPOC estable, en donde el sujeto se ha identificado en un método según el cuarto aspecto de la invención como que es propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible.
En un undécimo aspecto, la presente divulgación proporciona un método in vitro de seguir la evolución de EPOC en un sujeto, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados de NTRK2 y RASGRF2 en una primera muestra obtenida del sujeto;
- determinar el nivel de expresión del uno o más genes en una segunda muestra obtenida del sujeto en un punto de tiempo posterior que la primera muestra;
- comparar el nivel de expresión del uno o más genes en la segunda muestra respecto al nivel de expresión del/los gen(es) correspondiente(s) en la primera muestra; y
- evaluar la evolución de EPOC en el sujeto,
en donde una disminución en el nivel de expresión de NTRK2 y/o RASGRF2 en la segunda muestra en comparación con el nivel de expresión del/los gen(es) correspondiente(s) en la primera muestra es indicativo de una mejora de EPOC en el sujeto, y
en donde un aumento en el nivel de expresión de NTRK2 y/o RASGRF2 en la segunda muestra en comparación con el nivel de expresión del/los gen(es) correspondiente(s) en la primera muestra es indicativo de un empeoramiento de EPOC en el sujeto.
La siguiente descripción de características y formas de realización generales y preferidas se refiere a cada uno de los métodos, usos y fármacos contra EPOC proporcionados en la presente especificación, incluyendo en particular esos según los anteriormente descritos primer, segundo, tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo y undécimo aspectos, a menos que explícitamente se indique otra cosa.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar caracterizada por la limitación de flujo de aire persistente que habitualmente es progresiva y se asocia con una respuesta inflamatoria crónica aumentada en las vías respiratorias y el pulmón a partículas nocivas o gases. La EPOC se clasifica típicamente en cuatro fases diferentes basado en la extensión de la obstrucción pulmonar no reversible que se va a determinar por espirometría, como se especifica en la Iniciativa Global para Enfermedad Pulmonar Obstructiva (GOLD) (véase, por ejemplo, Vestbo et al., 2013; y Pauwels et al., 2001). La EPOC de fase I (“EPOC leve”) se caracteriza por una proporción VEF1/CVF de < 70% y un VEF1 de > 80%. En la fase I, el paciente puede no ser consciente de que su función pulmonar es anómala. La EPOC de fase II (“EPOC moderada”) se caracteriza por una proporción VEFi/CVF de < 70% y un VEFi de > 50% y < 80%. Esta es la fase en la que los pacientes típicamente buscan atención médica debido a los síntomas respiratorios crónicos o una exacerbación de su enfermedad. La EPOC de fase III (“EPOC grave”) se caracteriza por una proporción VEFi/CVF de < 70% y un VEFi de > 30% y < 50%. La EPOC de fase IV (“EPOC muy grave”) se caracteriza por una proporción VEFi/CVF de < 70% y un VEFi de < 30%, o insuficiencia respiratoria crónica y un VEFi de < 50%. El desarrollo patológico de EPOC puede estar precedido por síntomas respiratorios crónicos (en particular bronquitis crónica) sin obstrucción de las vías respiratorias (proporción VEFi/CVF de > 70%), que también se denomina “fase 0” o “en riesgo para EPOC”. Los términos “fase I”, “fase II”, “fase III”, “fase IV”, y “fase 0” como se usan en la presente especificación se refieren a las correspondientes fases GOLD, es decir, las correspondientes fases de EPOC según los criterios GOLD descritos anteriormente.
Como se usa en el presente documento, el término “EPOC estable” (usado de forma sinónima con “EPOC de fase temprana estable”) se refiere a las fases iniciales de EPOC que preceden al desarrollo de daño pulmonar irreversible. En particular, “EPOC estable” se refiere a las fases iniciales de EPOC desde los signos más tempranos para el inicio de la enfermedad hasta la limitación del flujo de aire leve caracterizado por una proporción VEFi/CVF de < 70% y un VEFi de > 80%. Por tanto, “EPOC estable” preferiblemente se refiere a fase 0 de EPOC (es decir, la fase de EPOC “en riesgo”) y fase I de EPOC (según los criterios GOLD), y más preferiblemente se refiere a fase I de EPOC.
Los términos “EPOC progresiva” y “EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible” se usan en el presente documento de forma sinónima/intercambiable, y se refieren a la fase de enfermedad de EPOC en la se produce daño irreversible a los pulmones y empeora progresivamente. En particular, “EPOC progresiva” se refiere a la fase de enfermedad EPOC caracterizada por limitación de flujo de aire moderada, es decir, una proporción VEFi/CVF de < 70% y un VEFi de > 50% y < 80%. Según esto, es particularmente preferido que “EPOC progresiva” se refiera a fase II de EPOC (según los criterios GOLD).
Como se usa en el presente documento, los términos "K IAAii99", "DMBTi", "TMSBi5A", "DPP6", "SLC5iB", "N U D Tii", "ITGAi0", "CST6", "TALi", "FIBIN", "BEX5", "BEXi", "ESMi", "GHRL", "NTRK2", "SFN", "G PR ii0", "FGG", "CEACAM5", "AZGPi", "COMP", "PRRXi", "AHRR", "C YPiA i", "CYPiA2", "C YPiB i", "GDFi5", "ELF5", "AQP3", "RASGRF2", "PLAiA", "HYAL2", "CTHRCi", "RNDi" y "CXCL3" se refieren cada uno al respectivo gen humano, el correspondiente ARNm (incluyendo todos los posibles transcritos/variantes de ayuste), y la correspondiente proteína (incluyendo todas las posibles isoformas). Estos términos también se refieren a homólogos y/u ortólogos de los correspondientes genes humanos que se encuentran en otras especies (no humanas), en particular otras especies de mamíferos, así como sus correspondientes ARNm y sus correspondientes proteínas. Se debe entender que, si el sujeto que se va a ensayar en los métodos de la presente invención es un animal no humano (en particular, un mamífero no humano), entonces el uno o más genes marcadores (cuyo nivel de expresión se va a determinar) serán los homólogos/ortólogos de los genes humanos indicados que se encuentran en el animal no humano que se va a ensayar. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano y, según esto, los términos anteriormente mencionados preferiblemente se refieren a los respectivos genes humanos y los correspondientes ARNm y proteínas. Los nombres completos de las formas humanas de los genes marcadores anteriormente mencionados, su ID de Entrez Gene, y las secuencias de referencia de NCBI de sus ARNm y proteínas se enumeran en la siguiente tabla 1:
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Tabla 1: Resumen de los genes marcadores proporcionados en el presente documento (formas humanas), incluyendo si nombres enteros, sus ID de Entrez Gene, y las secuencias de referencia de NCBI de sus ARNm y proteínas (donde sea aplicable, se indican diferentes transcritos de ARNm/variantes de ayuste y las correspondientes isoformas de proteína; posibles variantes de ARNm e isoformas de proteína adicionales de los genes indicados también se pueden usar para determinar los niveles correspondientes de la expresión de genes marcadores según la invención).
En los métodos según la presente invención, es decir, los métodos según el segundo, tercero y cuarto aspecto de la invención, el nivel de expresión de uno o más genes se determina en una muestra obtenida del sujeto que se va a ensayar.
El nivel de expresión se puede determinar, por ejemplo, determinando el nivel de transcripción o el nivel de traducción del/los correspondiente(s) gen(es) marcador(es). Por tanto, se puede medir la cantidad de ARNm de estos gen(es) en la muestra o se puede medir la cantidad de la(s) correspondiente(s) proteína(s) con el fin de determinar el nivel de expresión de los genes respectivos. Esto se puede lograr usando métodos conocidos en la técnica, como se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012. El nivel de transcripción de este/os gen(es) se puede, por ejemplo, determinar usando una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (en tiempo real) (“qRT-PCR”) o usando una micromatriz (véase, por ejemplo, Ding et al., 2004). El uso de una micromatriz puede ser ventajoso, por ejemplo, si se va a determinar el nivel de transcripción de un número de diferentes genes marcadores. Usar una micromatriz también puede ser ventajoso si se van a ensayar o diagnosticar simultáneamente varias enfermedades/trastornos o la susceptibilidad a varias enfermedades/trastornos. Si se va a determinar el nivel de transcripción, puede además ser ventajoso incluir uno o más inhibidores de RNasa en la muestra del sujeto. El nivel de traducción del/los correspondiente(s) gen(es) marcador(es) se puede, por ejemplo, determinar usando ensayos basados en anticuerpos, tal como un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), en donde se emplean anticuerpos dirigidos contra la(s) proteína(s) que se va(n) a cuantificar, o espectrometría de masas, un ensayo basado en gel o basado en transferencia, o citometría de flujo (por ejemplo, FACS). Si el nivel de traducción se va a determinar, puede ser ventajoso incluir uno o más inhibidores de proteasas en la muestra del sujeto. Puesto que el ARNm se puede aislar y cuantificar más fácilmente y de una manera más económica que las proteínas, se prefiere en los métodos de la presente invención que el nivel de expresión del uno o más genes se determine determinando el nivel de transcripción del/los correspondiente(s) gen(es). El nivel de transcripción preferiblemente se determina usando qRT-PCR a una micromatriz.
El sujeto que se va a ensayar según la presente invención puede ser un animal y es preferiblemente un mamífero. El mamífero que se va a ensayar según la presente invención puede ser, por ejemplo, un roedor (tal como, por ejemplo, una cobaya, un hámster, una rata o un ratón), un murino (tal como, por ejemplo, un ratón), un canino (tal como, por ejemplo, un perro), un felino (tal como, por ejemplo, un gato), un porcino (tal como, por ejemplo, un cerdo), un equino (tal como, por ejemplo, un caballo), un primate, un simio (tal como, por ejemplo, un mono o un simio), un mono (tal como, por ejemplo, un tití o un babuino), un simio (tal como, por ejemplo, un gorila, un chimpancé, un orangután o un gibón), o un ser humano. Se prevé particularmente que se ensayen mamíferos no humanos, que sean económica, agronómica o científicamente importantes. Los mamíferos científicamente importantes incluyen, por ejemplo, ratones, ratas y conejos. Los ejemplos no limitantes de mamíferos agronómicamente importantes son oveja, ganado y cerdos. Los mamíferos económicamente importantes incluyen, por ejemplo, gatos y perros. Lo más preferiblemente, el sujeto que se va a ensayar según la presente invención es un ser humano.
En el segundo y cuarto aspecto de la invención, el sujeto que se va a ensayar es un sujeto (preferiblemente un ser humano) que ha sido diagnosticado como que padece EPOC estable o se sospecha que padece EPOC estable.
Según el tercer aspecto de la invención, se prefiere que el sujeto que se va a ensayar sea un sujeto (preferiblemente un ser humano) que se sospecha padece EPOC estable o un sujeto (preferiblemente un ser humano) con sospecha de ser propenso a padecer EPOC estable.
La muestra obtenida del sujeto que se va a ensayar puede, en principio, ser cualquier muestra de tejido o suero del sujeto. Preferiblemente, la muestra es una muestra de tejido pulmonar. Más preferiblemente, la muestra es una muestra de biopsia pulmonar transbronquial o una muestra de lavado broncoalveolar (LBA).
En los métodos según el segundo y el tercer aspecto de la invención, el nivel de expresión de uno o más genes específicos se compara a un nivel de expresión control del/los gen(es) correspondiente(s) en un sujeto sano. Tales niveles de expresión control se pueden establecer como parte de los respectivos métodos de la invención, que pueden, por tanto, incluir una etapa adicional de determinar el nivel de expresión del/los gen(es) correspondiente(s) en una muestra obtenida de un sujeto sano (es decir, un sujeto que no padece EPOC y no tiene un riesgo aumentado de desarrollar EPOC) o en una mezcla de muestras de varios sujetos sanos (por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100, o aproximadamente 500 sujetos sanos). Se debe entender que el/los sujeto(s) sano(s) será(n) de la misma especie que el sujeto que se va a ensayar y deben preferiblemente tener la misma edad, sexo y etnia que el sujeto que se va a ensayar. Alternativamente, estos niveles de expresión control también se pueden derivar de la bibliografía médica o de experimentos realizados antes de llevar a cabo los métodos de la invención. Se entenderá que las condiciones en las que los niveles de expresión control se obtienen u obtuvieron (independientemente de si derivan de la bibliografía o experimentos anteriores o si se determinan en el curso de llevar a cabo los métodos de la invención), incluyendo también el tipo/origen de la muestra (o mezcla de muestras) del sujeto sano, deben ser idénticas o al menos similares/comparables a las condiciones usadas para determinar el nivel de expresión del uno o más genes en la muestra obtenida del sujeto que se va a ensayar.
En el método según el cuarto aspecto, el nivel de expresión de uno o más genes específicos se compara a un nivel de expresión control del/los gen(es) correspondiente(s) en un sujeto que padece EPOC estable. Tales niveles de expresión control se pueden establecer como parte del método según el cuarto aspecto de la invención, que puede, por tanto, incluir una etapa adicional de determinar el nivel de expresión del/los gen(es) correspondiente(s) en una muestra obtenida de un sujeto que padece EPOC estable (en particular, un sujeto que ha sido diagnosticado como que padece EPOC estable) o en una mezcla de muestras de varios sujetos (por ejemplo, aproximadamente 10, aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100, o aproximadamente 500 sujetos) que padecen EPOC estable. Se debe entender que estos sujetos control será(n) de la misma especie que el sujeto que se va a ensayar y debe preferiblemente tener la misma edad, sexo y etnia que el sujeto que se va a ensayar. Alternativamente, los correspondientes niveles de expresión control se pueden derivar de experimentos realizados antes de llevar a cabo el método del cuarto aspecto de la invención. Se entenderá que las condiciones en las que los niveles de expresión control se obtienen u obtuvieron (independientemente de si derivan de experimentos anteriores o si se determinan en el curso de llevar a cabo el método del cuarto aspecto de la invención), incluyendo también el tipo/origen de la muestra (o mezcla de las muestras) del sujeto control, deben ser idénticas o al menos similares/comparables a las condiciones usadas para determinar el nivel de expresión del uno o más genes en la muestra obtenida del sujeto que se va a ensayar. El sujeto control que padece EPOC estable según el cuarto aspecto de la invención es un sujeto que padece EPOC de fase I (en particular un sujeto que ha sido diagnosticado como que padece EPOC de fase I).
En los métodos según el segundo, tercer y cuarto aspecto de la presente invención, se determina el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y, opcionalmente, de uno o más genes marcadores adicionales. Preferiblemente, se determina el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y al menos uno de los correspondientes genes marcadores adicionales, y más preferiblemente, se determina el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y al menos dos de estos genes marcadores adicionales, mediante lo cual la fiabilidad del diagnóstico o evaluación se puede mejorar más. En general, cuanto mayor sea el número de genes marcadores cuya expresión está alterada (como se define en el correspondiente aspecto de la invención), y también cuando más pronunciado sea el aumento o disminución de la expresión de cada uno de estos genes marcadores, será más probable que el sujeto ensayado sea propenso a desarrollar EPOC progresiva (en los métodos del segundo y el cuarto aspecto) o de que el sujeto ensayado padezca EPOC estable (en el método del tercer aspecto de la invención).
Por tanto, tanto (i) el número de generes marcadores ensayados que muestran un nivel de expresión alterada como se ha descrito anteriormente como (ii) el grado de la alteración del nivel de expresión de cada uno de los genes marcadores ensayados, se pueden considerar cuando se determina si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva (según el segundo o el cuarto aspecto de la invención) o si el sujeto padece o no EPOC estable (según el tercer aspecto de la invención). Factores, signos y síntomas adicionales indicativos de EPOC, tal como, por ejemplo, limitación del flujo de aire (determinado, por ejemplo, por espirometría), tos, sibilancias espiratorias, síntomas respiratorios adicionales, los antecedentes de fumar del sujeto, inflamación bronquial y/o biomarcadores adicionales (incluyendo biomarcadores moleculares), se pueden además considerar con el fin de mejorar más la precisión de la determinación de si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva (según el segundo o el cuarto aspecto de la invención) o si el sujeto padece o no EPOC estable (según el tercer aspecto de la invención).
En una forma de realización adicional del método según el segundo aspecto de la invención, se prefiere que se determine el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y al menos un gen adicional seleccionado de TMSB15A, DPP6, SLC51B y NUDT11 en la muestra obtenida del sujeto. En esta forma de realización, es además preferido que se determine el nivel de expresión de al menos dos de los genes adicionales anteriormente mencionados. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y TMSB15A, o se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y DPP6, o se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y SLC51B, o se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y NUDT11. Además de ello, también se puede determinar el nivel de expresión de al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2 y RASGRF2 y/o el nivel de expresión de la menos un gen más seleccionado de ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2 y RND1.
En el método según el segundo aspecto de la invención, es particularmente preferido que se determine el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y el gen adicional TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto. Según esto, se determina el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en los métodos de la invención. Lo más preferiblemente, se determina el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199, TMSB15A y al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2, RASGRF2, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, DPP6, SLC51B y NUDT11.
En una forma de realización adicional del método según el tercer aspecto de la invención, se prefiere que se determine el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y al menos un gen adicional seleccionado de t Ms B15A, DPP6, SLC51B y NUDT11 en la muestra obtenida del sujeto. En esta forma de realización, es además preferido que se determine el nivel de expresión de al menos dos de los genes adicionales anteriormente mencionados. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y TMSB15A, o se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y Dp P6, o se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y SLC51B, o se puede determinar el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y NUDT11. Además de ello, también se puede determinar el nivel de expresión de al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2 y RASGRF2 y/o el nivel de expresión de al menos un gen más seleccionado de ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2 y RND1.
En el método según el tercer aspecto de la invención, es particularmente preferido que se determine el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y el gen adicional TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto. Según esto, se determina el nivel de expresión de KIAA1199 y DMBT1. Lo más preferiblemente, se determina el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1y TMSB15Aen la muestra obtenida del sujeto.
En el método según el cuarto aspecto de la invención, es particularmente preferido que se determine el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 y el gen adicional TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto. Según esto, se determina el nivel de expresión de KIAA1199 y DMBT1. Lo más preferiblemente, se determina el nivel de expresión de KIAA1199, DMBT1 y TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto.
La disminución o aumento en el nivel de expresión del/los gen(es) marcador(es) ensayado(s) que se requiere para determinar que el sujeto es propenso a desarrollar EPOC progresiva según el segundo aspecto es preferiblemente al menos una disminución o aumento de 1,5 veces, más preferiblemente, una disminución o aumento de 2 veces, incluso más preferiblemente, una disminución o aumento de 3 veces, incluso más preferiblemente, una disminución o aumento de 5 veces, y aún más preferiblemente, una disminución o aumento de 10 veces.
En el método según el segundo aspecto de la invención, se determina el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199, puesto que la fase de enfermedad de EPOC está particularmente bien reflejada por los patrones de expresión de estos genes marcadores. Mientras que se observa una disminución inicial en la expresión de KIAA1199 y un aumento simultáneo en la expresión de DMBT1 cuando un sujeto desarrolla EPOC estable, la proporción entre los niveles de expresión de KIAA1199 y DMBT1 cambia tras entrar la fase progresiva de EPOC, es decir, la expresión de KIAA1199 aumenta mientras que la expresión de DMBT1 disminuye. Por tanto, en una forma de realización particularmente preferida del método según el segundo aspecto, si la diferencia entre los niveles de expresión de DMBT1 y KIAA1199 (es decir, el nivel de expresión de DMBT1 menos el nivel de expresión de KIAA1199) en la muestra del sujeto aumenta en comparación con la diferencia entre los niveles de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 (es decir, en comparación con el valor obtenido cuando se resta el nivel de expresión control de KIAA1199 del nivel de expresión control de DMBT1) en un factor de más de 2363 (es decir, en un factor de más de 12,38; preferiblemente en un factor de más de 238, es decir, en un factor de más de 13,93; y más preferiblemente en un factor de más de 24, es decir, más de 16), entonces se determina que el sujeto es propenso a desarrollar EPOC progresiva. Este procedimiento permite distinguir de forma particularmente segura entre EPOC progresiva y EPOC estable (véase también la figura 6E) y, por tanto, mejora más la precisión del método de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva según el segundo aspecto de la invención.
La disminución o el aumento en el nivel de expresión del/los gen(es) marcador(es) ensayado(s) que se requiere para determinar que el sujeto padece EPOC estable según el tercer aspecto es preferiblemente al menos una disminución o aumento de 1,5 veces, más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 2 veces, incluso más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 3 veces, incluso más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 5 veces, y aún más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 10 veces.
La disminución o aumento en el nivel de expresión del/los gen(es) marcador(es) ensayado(s) que se requiere para determinar que el sujeto es propenso a desarrollar EPOC progresiva según el cuarto aspecto es preferiblemente al menos una disminución o aumento de 1,5 veces, más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 2 veces, incluso más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 3 veces, incluso más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 5 veces, y aún más preferiblemente, al menos una disminución o aumento de 10 veces.
La presente divulgación se refiere además al uso del gen DMBT1 como un marcador en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva. En particular, según el quinto aspecto, la divulgación se refiere al uso de un par de cebadores para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva. Los ejemplos no limitantes de tal método in vitro son los métodos según el segundo aspecto de la presente invención. El transcrito es preferiblemente un ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior). Los cebadores se pueden diseñar usando métodos conocidos en la técnica (como también se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012) de modo que permita la amplificación/cuantificación específica del transcrito del gen DMBT1. Además, los cebadores son preferiblemente cebadores de ADN. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva, en el que se va a usar un par de cebadores, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el segundo aspecto de la presente invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar un par de cebadores.
Según el quinto aspecto, la presente divulgación también se refiere al uso de una sonda de ácido nucleico para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva. Los ejemplos no limitantes de tal método in vitro son los métodos según el segundo aspecto de la presente invención. El transcrito es preferiblemente un ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior). La sonda de ácido nucleico comprende o consiste en un ácido nucleico capaz de hibridar con el transcrito anteriormente mencionado. La sonda de ácido nucleico es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, más preferiblemente una sonda de ADN monocatenario. Se prefiere además que la sonda de ácido nucleico (que puede ser, por ejemplo, una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, y es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario) sea una sonda oligonucleotídica que tiene, por ejemplo, de 10 a 80 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 35 nucleótidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos. Tales sondas de ácido nucleico se pueden diseñar usando métodos conocidos en la técnica (como también se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012) de modo que permitan la detección específica y cuantificación del transcrito del gen correspondiente. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva, en el que se va a usar la sonda de ácido nucleico, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el segundo aspecto de la presente invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar una sonda de ácido nucleico.
En el quinto aspecto, la divulgación se refiere además al uso de una micromatriz que comprende una sonda de ácido nucleico para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 y opcionalmente comprende sondas de ácido nucleico para los transcritos de uno o más genes adicionales seleccionados de KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva. La micromatriz preferiblemente comprende sondas de ácido nucleico para el transcrito de DMBT1 y para los transcritos de al menos uno, más preferiblemente al menos dos, incluso más preferiblemente al menos tres de los genes adicionales anteriormente mencionados. Cada uno de los transcritos es preferiblemente un ARNm del gen correspondiente (incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los correspondientes ARNm específicos enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen (incluyendo, por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los correspondientes ARNm específicos enumerados en la tabla 1 anterior). Cada una de las sondas de ácido nucleico es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, más preferiblemente una sonda de ADN monocatenario. Se prefiere además que las sondas de ácido nucleico (que pueden ser, por ejemplo, ADN monocatenario o ARN monocatenario, preferiblemente ADN monocatenario) sean sondas oligonucleotídicas que tienen, por ejemplo, de 10 a 80 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 35 nucleótidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva, en el que se va a usar la micromatriz, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 y opcionalmente de uno o más genes adicionales en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el segundo aspecto de la invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar la micromatriz.
Según el quinto aspecto, la divulgación también se dirige al uso de un anticuerpo contra (es decir, unión a) la proteína DMBT1 en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva. El anticuerpo se une específicamente a la proteína DMBT1 y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser además una molécula de inmunoglobulina entera/intacta o un fragmento/parte de la misma (tal como, por ejemplo, una cadena ligera o pesada separada, un fragmento Fab, un fragmento Fab/c, un fragmento Fv, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2), siempre que el fragmento/parte retenga sustancialmente la especificidad de unión de la correspondiente molécula de inmunoglobulina entera. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo modificado y/o alterado, tal como un anticuerpo quimérico o humanizado, un anticuerpo bifuncional o trifuncional, o una construcción de anticuerpo (tal como un fragmento variable monocatenario (scFv) o un anticuerpo-proteína de fusión). El anticuerpo se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica, como también se describe, por ejemplo, en Harlow et al., 1998. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales por métodos tal como la técnica del hibridoma (véase, por ejemplo, Kohler et al., 1975), la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (véase, por ejemplo, Kozbor et al., 1983) o la técnica de EBV-hibridoma (véase, por ejemplo, Cole et al., 1985). La proteína DMBT1 puede ser, por ejemplo, la proteína DMBT1 específica enumerada en la tabla 1 anterior. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva, en el que se va a usar el anticuerpo, preferiblemente comprende una etapa de determinar la cantidad de la proteína DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el segundo aspecto de la invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar la cantidad de una proteína específica en una muestra (como se discute en relación con la determinación de niveles de traducción), las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar el anticuerpo.
Además, según el séptimo aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un par de cebadores para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 en un método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable. Los ejemplos no limitantes de tal método in vitro son los métodos según el tercer aspecto de la presente invención. El transcrito es preferiblemente un ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior). Los cebadores se pueden diseñar usando métodos conocidos en la técnica (como también se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012) de modo que permita la amplificación específica/cuantificación del transcrito del gen DMBT1. Además, los cebadores son preferiblemente cebadores de ADN. El método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable, en el que se va a usar un par de cebadores, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el tercer aspecto de la presente invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar un par de cebadores.
Según el séptimo aspecto, la presente divulgación también se refiere al uso de una sonda de ácido nucleico para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 en un método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable. Los ejemplos no limitantes de tal método in vitro son los métodos según el tercer aspecto de la presente invención. El transcrito es preferiblemente un ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior). La sonda de ácido nucleico comprende o consiste en un ácido nucleico capaz de hibridar con el transcrito anteriormente mencionado. La sonda de ácido nucleico es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, más preferiblemente una sonda de ADN monocatenario. Se prefiere además que la sonde de ácido nucleico (que puede ser, por ejemplo, una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, y es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario) sea una sonda oligonucleotídica que tiene, por ejemplo, de 10 a 80 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 35 nucleótidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos. Tales sondas de ácido nucleico se pueden diseñar usando métodos conocidos en la técnica (como también se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012) de modo que permitan la detección específica y cuantificación del transcrito del gen correspondiente. El método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable, en el que se va a usar la sonda de ácido nucleico, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el tercer aspecto de la presente invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar una sonda de ácido nucleico.
En el séptimo aspecto, la divulgación se refiere además al uso de una micromatriz que comprende una sonda de ácido nucleico para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 y opcionalmente comprende sondas de ácido nucleico para los transcritos de uno o más genes adicionales seleccionados de KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL en un método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable. La micromatriz preferiblemente comprende sondas de ácido nucleico para el transcrito de DMBT1 y para los transcritos de al menos uno, más preferiblemente al menos dos, incluso más preferiblemente al menos tres de los genes adicionales anteriormente mencionados. Cada uno de los transcritos es preferiblemente un ARNm del gen correspondiente (incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los correspondientes ARNm específicos enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen (incluyendo, por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los correspondientes ARNm específicos enumerados en la tabla 1 anterior). Cada una de las sondas de ácido nucleico es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, más preferiblemente una sonda de ADN monocatenario. Se prefiere además que las sondas de ácido nucleico (que pueden ser, por ejemplo, ADN monocatenario o ARN monocatenario, preferiblemente ADN monocatenario) sean sondas oligonucleotídicas que tienen, por ejemplo, de 10 a 80 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 35 nucleótidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos. El método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable, en el que se va a usar la micromatriz, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 y opcionalmente del uno o más genes adicionales en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el tercer aspecto de la invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar la micromatriz.
Según el séptimo aspecto, la divulgación también se dirige al uso de un anticuerpo contra (es decir, unión a) la proteína DMBT1 en un método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable. El anticuerpo se une específicamente a la proteína DMBT1 y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser además una molécula de inmunoglobulina entera/intacta o un fragmento/parte de la misma (tal como, por ejemplo, una cadena ligera o pesada separada, un fragmento Fab, un fragmento Fab/c, un fragmento Fv, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2), siempre que el fragmento/parte retenga sustancialmente la especificidad de unión de la correspondiente molécula de inmunoglobulina entera. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo modificado y/o alterado, tal como un anticuerpo quimérico o humanizado, un anticuerpo bifuncional o trifuncional, o una construcción de anticuerpo (tal como un fragmento variable monocatenario (scFv) o un anticuerpo-proteína de fusión). El anticuerpo se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica, como también se describe, por ejemplo, en Harlow et al., 1998. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales por métodos tal como la técnica del hibridoma (véase, por ejemplo, Kohler et al., 1975), la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (véase, por ejemplo, Kozbor et al., 1983) o la técnica de EBV-hibridoma (véase, por ejemplo, Cole et al., 1985). La proteína DMBT1 puede ser, por ejemplo, la proteína DMBT1 específica enumerada en la tabla 1 anterior. El método in vitro de diagnosticar EPOC estable en un sujeto o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable, en el que se va a usar el anticuerpo, preferiblemente comprende una etapa de determinar la cantidad de la proteína DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el tercer aspecto de la invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar la cantidad de una proteína específica en una muestra (como se discute en relación con la determinación de niveles de traducción), las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar el anticuerpo.
Además, según el noveno aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un par de cebadores para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible. Los ejemplos no limitantes de tal método in vitro son los métodos según el cuarto aspecto de la presente invención. El transcrito es preferiblemente un ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior). Los cebadores se pueden diseñar usando métodos conocidos en la técnica (como también se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012) de modo que permita la amplificación específica/cuantificación del transcrito del gen DMBT1. Además, los cebadores son preferiblemente cebadores de ADN. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en el que se va a usar un par de cebadores, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el cuarto aspecto de la presente invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar un par de cebadores.
Según el noveno aspecto, la presente divulgación también se refiere al uso de una sonda de ácido nucleico para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible. Los ejemplos no limitantes de tal método in vitro son los métodos según el cuarto aspecto de la presente invención. El transcrito es preferiblemente un ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen DMBT1 (por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los ARNm específicos de DMBT1 enumerados en la tabla 1 anterior). La sonda de ácido nucleico comprende o consiste en un ácido nucleico capaz de hibridar con el transcrito anteriormente mencionado. La sonda de ácido nucleico es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, más preferiblemente una sonda de ADN monocatenario. Se prefiere además que la sonde de ácido nucleico (que puede ser, por ejemplo, una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, y es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario) sea una sonda oligonucleotídica que tiene, por ejemplo, de 10 a 80 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 35 nucleótidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos. Tales sondas de ácido nucleico se pueden diseñar usando métodos conocidos en la técnica (como también se describe, por ejemplo, en Green et al., 2012) de modo que permitan la detección específica y cuantificación del transcrito del gen correspondiente. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en el que se va a usar la sonda de ácido nucleico, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el cuarto aspecto de la presente invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar una sonda de ácido nucleico.
En el noveno aspecto, la divulgación se refiere además al uso de una micromatriz que comprende una sonda de ácido nucleico para (es decir, unión a) un transcrito del gen DMBT1 y opcionalmente comprende sondas de ácido nucleico para los transcritos de uno o más genes adicionales seleccionados de KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, PLA1A, FGG, CEACAM5, HYAL2, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, CST6, NTRK2, COMP, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible. La micromatriz preferiblemente comprende sondas de ácido nucleico para el transcrito de DMBT1 y para los transcritos de al menos uno, más preferiblemente al menos dos, incluso más preferiblemente al menos tres de los genes adicionales anteriormente mencionados. Cada uno de los transcritos es preferiblemente un ARNm del gen correspondiente (incluyendo, por ejemplo, cualquiera de los correspondientes ARNm específicos enumerados en la tabla 1 anterior) o un ADNc sintetizado a partir del ARNm del gen (incluyendo, por ejemplo, un ADNc sintetizado a partir de cualquiera de los correspondientes ARNm específicos enumerados en la tabla 1 anterior). Cada una de las sondas de ácido nucleico es preferiblemente una sonda de ADN monocatenario o una sonda de ARN monocatenario, más preferiblemente una sonda de ADN monocatenario. Se prefiere además que las sondas de ácido nucleico (que pueden ser, por ejemplo, ADN monocatenario o ARN monocatenario, preferiblemente ADN monocatenario) sean sondas oligonucleotídicas que tienen, por ejemplo, de 10 a 80 nucleótidos, preferiblemente de 15 a 60 nucleótidos, más preferiblemente de 20 a 35 nucleótidos, e incluso más preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en el que se va a usar la micromatriz, preferiblemente comprende una etapa de determinar el nivel de expresión del gen DMBT1 y opcionalmente del uno o más genes adicionales en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el cuarto aspecto de la invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar los niveles de expresión, las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar la micromatriz.
Según el noveno aspecto, la divulgación también se dirige al uso de un anticuerpo contra (es decir, unión a) la proteína DMBT1 en un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible. El anticuerpo se une específicamente a la proteína DMBT1 y puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal. Preferiblemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El anticuerpo puede ser además una molécula de inmunoglobulina entera/intacta o un fragmento/parte de la misma (tal como, por ejemplo, una cadena ligera o pesada separada, un fragmento Fab, un fragmento Fab/c, un fragmento Fv, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2), siempre que el fragmento/parte retenga sustancialmente la especificidad de unión de la correspondiente molécula de inmunoglobulina entera. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo modificado y/o alterado, tal como un anticuerpo quimérico o humanizado, un anticuerpo bifuncional o trifuncional, o una construcción de anticuerpo (tal como un fragmento variable monocatenario (scFv) o un anticuerpo-proteína de fusión). El anticuerpo se puede preparar usando métodos conocidos en la técnica, como también se describe, por ejemplo, en Harlow et al., 1998. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos monoclonales por métodos tal como la técnica del hibridoma (véase, por ejemplo, Kohler et al., 1975), la técnica del trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (véase, por ejemplo, Kozbor et al., 1983) o la técnica de EBV-hibridoma (véase, por ejemplo, Cole et al., 1985). La proteína DMBT1 puede ser, por ejemplo, la proteína DMBT1 específica enumerada en la tabla 1 anterior. El método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece EPOC estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en el que se va a usar el anticuerpo, preferiblemente comprende una etapa de determinar la cantidad de la proteína DMBT1 en una muestra obtenida del sujeto. Las características/formas de realización preferidas del método según el cuarto aspecto de la invención como se describe en el presente documento, incluyendo en particular las formas de realización preferidas de determinar la cantidad de una proteína específica en una muestra (como se discute en relación con la determinación de niveles de traducción), las formas de realización preferidas de la muestra, y las formas de realización preferidas del sujeto, también aplican al método en el que se va a usar el anticuerpo.
Según el sexto aspecto, la presente invención proporciona un fármaco contra EPOC para uso en tratar EPOC en un sujeto que se ha identificado en un método según el segundo aspecto como que es propenso a desarrollar EPOC progresiva. El sujeto a que se hace referencia anteriormente es como se ha definido en los métodos según el segundo aspecto de la invención y, según esto, es preferiblemente un ser humano.
Además, según el octavo aspecto, la presente invención proporciona un fármaco contra EPOC para uso en tratar o prevenir EPOC en un sujeto que se ha identificado en un método según el tercer aspecto como que padece EPOC estable. Se entenderá que el sujeto que se ha identificado como que padece EPOC estable se puede tratar administrando un fármaco contra EPOC. El sujeto a que se hace referencia anteriormente es como se ha definido en los métodos según el tercer aspecto de la invención y, según esto, es preferiblemente un ser humano.
Según el décimo aspecto, la presente invención proporciona un fármaco contra EPOC para uso en tratar EPOC en un sujeto que padece EPOC estable, en donde el sujeto se ha identificado en un método según el cuarto aspecto como que es propenso a desarrollar EPOC progresiva. El sujeto a que se hace referencia anteriormente es como se ha definido en los métodos según el cuarto aspecto de la invención y, según esto, es preferiblemente un ser humano.
El fármaco contra EPOC que se va a administrar a un sujeto según el sexto, octavo o décimo aspecto de la invención no está particularmente limitado y puede ser, por ejemplo, un agonista p2 (tal como, por ejemplo, bitolterol, carbuterol, fenoterol, pirbuterol, procaterol, reproterol, rimiterol, salbutamol, levosalbutamol, terbutalina, tulobuterol, arformoterol, bambuterol, clembuterol, formoterol, olodaterol, salmeterol, indacaterol, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), un glucocorticoide (tal como, por ejemplo, beclometasona, betametasona, budesonida, ciclesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), un anticolinérgico o un antagonista muscarínico (tal como, por ejemplo, bromuro de aclidinio, bromuro de glucopirronio, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), un estabilizador de células cebadas (tal como, por ejemplo, cromoglicato, nedocromil, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), un derivado de xantina (tal como, por ejemplo, acefilina, ambufilina, bamifilina, doxofilina, enprofilina, etamipfilina, proxifilina, teobromina, teofilina, aminofilina, teofilinato de colina, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), un antagonista de leucotrieno (tal como, por ejemplo, montelukast, pranlukast, zafirlukast, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), un inhibidor de lipoxigenasa (tal como, por ejemplo, zileuton o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), un antagonista de receptor de tromboxano (tal como, por ejemplo ramatroban, seratrodast, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados) un inhibidor de PDE4 no xantina (tal como, por ejemplo, ibudilast, roflumilast, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), o cualquier otro fármaco contra EPOC (tal como, por ejemplo, amlexanox, eprozinol, fenspirida, omalizumab, epinefrina, hexoprenalina, isoprenalina, isoproterenol, orciprenalina, metaproterenol, atropina, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados), o cualquier combinación de los mismos. Un fármaco contra EPOC particularmente preferido es roflumilast.
En el undécimo aspecto, la presente divulgación proporciona un método in vitro de seguir la evolución de EPOC en un sujeto, el método comprende:
- determinar el nivel de expresión de uno o más genes seleccionados de NTRK2 y RASGRF2 en una primera muestra obtenida del sujeto;
- determinar el nivel de expresión del uno o más genes en una segunda muestra obtenida del sujeto en un punto posterior en el tiempo que la primera muestra;
- comparar el nivel de expresión del uno o más genes en la segunda muestra respecto al nivel de expresión del/los correspondiente(s) gen(es) en la primera muestra; y
- evaluar (o determinar) la evolución de EPOC en el sujeto,
en donde una disminución en el nivel de expresión de NTRK2 y/o RASGRF2 en la segunda muestra en comparación con el nivel de expresión del/los correspondiente(s) gen(es) en la primera muestra es indicativa de una mejoría (es decir, mejora) e EPOC en el sujeto, y
en donde un aumento en el nivel de expresión de NTRK2 y/o RASGRF2 en la segunda muestra en comparación con el nivel de expresión del/los correspondiente(s) gen(es) en la primera muestra es indicativo de un empeoramiento de EPOC en el sujeto.
Como se demuestra en el ejemplo 1 y se muestra en las figuras 4A y 8A, una disminución en el nivel de expresión de NTRK2 y/o RASGRF2 es indicativo de una mejoría/mejora de EPOC mientras que un aumento en el nivel de expresión de estos genes es indicativo de un empeoramiento de EPOC. El seguimiento de la evolución de EPOC en un sujeto que padece esta enfermedad puede ser útil, por ejemplo, para evaluar los prospectos de éxito de un tratamiento, de una nueva medicación, o de una nueva pauta posológica.
En el undécimo aspecto, se prefiere que se determine el nivel de expresión del gen NTRK2 y opcionalmente del gen RASGRF2. Más preferiblemente, se determina el nivel de expresión de los genes NTRK2 y RASGRF2.
El nivel de expresión de los genes marcadores anteriormente mencionados en la primera muestra y en la segunda muestra según el undécimo aspecto de la divulgación se puede determinar como se describe en relación con los métodos del segundo al cuarto aspectos de la invención. Por ejemplo, se puede determinar el nivel de transcripción o el nivel de traducción del/los gen(es) marcador(es) NTRK2 y/o RASGRF2. Se prefiere que el nivel de expresión del uno o más genes seleccionados de NTRK2 y RASGRF2 en la primera muestra y en la segunda muestra se determine determinando el nivel de transcripción del/los correspondiente(s) gen(es). El nivel de transcripción se determina preferiblemente usando qRT-PCR o una micromatriz.
El sujeto que se va a ensayar en el método según el undécimo aspecto de la divulgación es como se ha definido en relación con los métodos del segundo al cuarto aspectos de la invención, y preferiblemente es un ser humano o un mamífero no humano, más preferiblemente un ser humano. Se prefiere además que el sujeto que se va a ensayar/seguir según el undécimo aspecto sea un sujeto (preferiblemente un ser humano) que ha sido diagnosticado como que padece EPOC (por ejemplo, en el punto en el tiempo cuando se obtuvo la primera muestra).
Mientras que la primera muestra y la segunda muestra obtenidas del sujeto pueden, en principio, ser cualquier muestra de tejido o suero del sujeto, deben originarse ambas del mismo tipo de tejido del sujeto (o deben ser ambas muestras de suero). Preferiblemente, la primera muestra y la segunda muestra son muestras de tejido pulmonar. Más preferiblemente, la primera muestra y la segunda muestra son muestras de biopsia pulmonar transbronquial o son muestra de lavado broncoalveolar (LBA).
La segunda muestra se ha obtenido del sujeto en un punto posterior en el tiempo que la primera muestra. Por ejemplo, la segunda muestra se puede haber obtenido del sujeto aproximadamente 2 meses hasta aproximadamente 12 meses, preferiblemente de aproximadamente 3 meses hasta aproximadamente 9 meses (por ejemplo, aproximadamente 3 meses, o aproximadamente 4 meses, o aproximadamente 5 meses, o aproximadamente 6 meses, o aproximadamente 7 meses, o aproximadamente 8 meses, o aproximadamente 9 meses), y más preferiblemente de aproximadamente 3 meses hasta aproximadamente 6 meses después de obtener la primera muestra del sujeto.
Como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ±10% del valor numérico indicado, y en particular a ±5% del valor numérico indicado. Siempre que se usa el término “aproximadamente”, también está incluida una referencia específica al valor numérico exacto indicado. Si el término “aproximadamente” se usa en relación con un parámetro que se cuantifica en número enteros, tal como el número de nucleótidos en un ácido nucleico determinado, los números correspondientes a ±10% o ±5% del valor numérico indicado se deben redondear al número entero más cercano. Por ejemplo, la expresión “aproximadamente 25 nucleótidos” se refiere al intervalo de 23 a 28 nucleótidos, en particular el intervalo de 24 a 26 nucleótidos, y preferiblemente se refiere al valor específico de 25 nucleótidos.
Se debe entender que la presente invención específicamente se refiere a cada una y todas las combinaciones de características y formas de realización descritas en el presente documento, incluyendo cualquier combinación de características/formas de realización generales y/o preferidas. En particular, la invención específicamente se refiere a todas las combinaciones de características preferidas (incluyendo todos los grados de preferencia) de los métodos y usos proporcionados en el presente documento.
La invención, así como las formas de realización de referencia divulgadas en el presente documento también se describen mediante las siguientes figuras ilustrativas. Las figuras adjuntas muestran:
Figura 1: Diseño de estudio del estudio EPOC-AUVA realizado en la Universidad Médica de Viena (véase el ejemplo 1).
Figura 2: Resumen de los números de sujetos de diferentes estados de enfermedad que se sometieron al estudio EPOC-AUVA.
Figura 3: Resumen de los sujetos sanos (A ) y de los sujetos con bronquitis crónica, pero sin signos de obstrucción pulmonar (EPOC “en riesgo”; “GOLD 0”) en la visita 1 (B) o con EPOC manifiesta en la visita 1 (C), así como el desarrollo de EPOC (gravedad según los criterios GOLD), bronquitis y hábitos de fumar en estos sujetos durante el periodo desde la visita 1 (día 0) hasta la visita 2 (12 meses) hasta la visita 3 (36 meses). El término “paquetes años” se refiere al consumo de cigarrillos de una persona calculado como los paquetes de cigarrillos (cada paquete contiene 20 cigarrillos) fumados al día, multiplicado por la duración del consumo de cigarrillos en años. (D) Características clínicas de los participantes en el estudio EPOC-AUVA y cambios entre el basal y la visita 3 (véase el ejemplo 1).
Figura 4 : Patología EPOC módulo 1: Desarrollo de bronquitis crónica: Inhibición progresiva de la motilidad adaptativa de las células de la mucosa causada por la inhibición de movimientos del citoesqueleto de actina coordinados. La bronquitis crónica empieza con la disminución significativa de genes que controlan el ensamblaje, polimerización, motilidad, estabilización y suministro de energía de movimientos del citoesqueleto mediados por actina F (supresión de timosina beta 15A (TMSB15A), dipeptidil-peptidasa 6 (DPP6), nudix (fracción X ligada a nucleósido difosfato)-motivo tipo 11 (NUDT11) e integrina alfa 10 (ITGA10)). Al mismo tiempo, la expresión del gen RASGRF2 que se sabe que inhibe la polimerización de actina mediada por Cdc42 durante los movimientos celulares aumenta progresivamente durante el avance de la EPOC (Figuras 4A y 4D) lo que indica que la inhibición de la motilidad celular no solo es un mecanismo principal en las fases tempranas del desarrollo de EPOC, sino también parte de la progresiva destrucción de la membrana en fases posteriores de EPOC.
Importante, la expresión reducida de estos genes también está relacionada con la intensidad creciente de la inflamación bronquial. Este patrón de expresión característico incluye el gen SLC51B (Figura 4D) que hasta ahora es en gran parte conocido por su capacidad para transportar moléculas precursoras de esteroides en las células intestinales.
La activación compensatoria de la GTPasa RND1 (GTPasa 1 de la familia Rho) mejor conocida por su capacidad para controlar la organización del citoesqueleto de actina en respuesta a estimulación con factores de crecimiento se aumenta solo hasta la EPOC de fase II GOLD, lo que indica no solo un fracaso completo de la organización del citoesqueleto celular dependiente de actina en fases posteriores de EPOC, sino también la pérdida de capacidad regeneradora, como también se demuestra en el módulo 3 (véase las figuras 6A-6E). Esto a su vez coincide bastante bien con la disminución progresiva del gen de cistatina M/E (CST6) anotada tanto con diferenciación funcional de células epiteliales como mantenimiento de la integridad de superficie.
Como la acción coordinada de estas moléculas se requiere para los movimientos controlados de las células epiteliales durante procesos cruciales, tales como crecimiento, intercalación y extrusión de células en una sistema de capas celulares cohesivas, la pérdida de estas funciones produce una alteración profunda de la integridad de la membrana que permite el desarrollo de inflamación bronquial no específica que básicamente refleja todos los constituyentes de aire ventilado incluyendo productos de combustión, tal como humo de cigarrillos o gases de soldadura.
Figura 5: Patología EPOC módulo 2: Activación bifásica de la inmunidad de la mucosa.
Dirigido por esta pérdida de cohesión celular, el bronquio desarrolla una respuesta inmunitaria de mucosa diversa que combina mecanismos de inflamación aguda, tal como la expresión de fibrinógeno (Figuras 5A y 5D), el aumento de molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5) (Figuras 5A y 5D), y señalización del receptor de aril hidrocarburo (AHR), la última caracterizada por la expresión aumentada de citocromo P450, familia 1, subfamilia A, polipéptido 1 (CYP1A1) y citocromo P450, familia 1, subfamilia B, polipéptido 1 (CYP1B1) (Figuras 5A y 5E, 5F). La intensidad de la señalización de AHR es significativa, a pesar de la expresión compensatoria aumentada del gen del represor del receptor de aril hidrocarburo (AHRR), lo que refleja lo más probablemente el impacto continuo del humo. Como se ha mostrado recientemente que las CEACAM actúan como receptores de superficie para bacterias gram negativas tal como Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis que se encuentran frecuentemente en bronquitis progresiva, este mecanismo es propenso a contribuir a episodios de inflamación bronquial intensificada.
No obstante, ni la expresión de FGG ni de CEACAM5 produce empeoramiento a corto plazo de obstrucción pulmonar no reversible (Figura 5D, panel medio), aunque la activación de ambos genes contribuye significativamente a la intensidad de la inflamación bronquial (Figura 4D, panel derecho). Esto se diferencia de la expresión de CYP1A2, KIAA1199 y fosfolipasa A1 miembro A (PLA1A) (Fig. 4b y e) que se correlacionan todas con un deterioro significativo de la función pulmonar. Mientras que la expresión de CYP1A2 como parte de una respuesta de señalización de AHR inducida por humo se ajusta bien a la percepción actual del desarrollo de EPOC, la fuerte correlación de la expresión de KIAA1199 y PLA1A con el deterioro de la función pulmonar según los criterios GOLD señala hacia otra dirección, el fracaso completo del sistema del compartimento bronquial.
Se ha demostrado recientemente que KIAA1199 activa las hialuronidasas de matriz mientras que se sabe que la fosfolipasa A1 miembro A (PLA1A) activa células T en respuesta a estimulación inflamatoria no específica. Se ha encontrado ahora que el aumento significativo de KIAA1199 es característico para la segunda fase de inflamación bronquial aumentada en las fases GOLD III y IV (Figura 5B) que sigue una fase de inflamación bronquial no progresiva que caracteriza la fase I GOLD (Figura 5A). Notablemente, durante esta fase de estabilización tanto la expresión de KIAA1199 como de PLA1A también se reduce (Figura 5B). Dado el fuerte impacto proinflamatorio de la degradación de hialuronano de alta masa molecular, estas observaciones indican que el aumento final de actividad inflamatoria en EPOC de fase III y IV GOLD es el resultado combinado de integridad epitelial permanentemente alterada y una destrucción secundaria de la matriz de hialuronano en la pared bronquial por la activación de hialuronidasas de matriz. Esta visión está apoyada por el patrón de expresión de la hialuronidasa de matriz 2 (HYAL2) misma que representa la enzima degradante de hialuronano principal en seres humanos (Figura 5C).
Figura 6: Patología EPOC módulo 3: El impacto de la reparación regenerativa intensificada: suspensión temporal de inflamación bronquial progresiva.
Mantener la integridad estructural de la mucosa, así como sostener componentes esenciales de la pared bronquial es parte de la cicatrización eficaz y como tal una medida indispensable para prevenir la intrusión de antígenos, alergenos y agentes infecciosos en los compartimentos submucosa. Por tanto, no es sorprendente que varios genes que guían las funciones de reparación epitelial estén aumentados en respuesta a inflamación incrementada, como se demuestra en la figura 6A. Sin embargo, solo un pequeño grupo de estos genes contribuye significativamente a la suspensión temporal de la inflamación bronquial progresiva en la fase I GOLD, genes que se sabe participan en la regeneración y diferenciación epitelial, defensa bacteriana y transporte de agua transepitelial (Figuras 6A-6C): a) delecionado en tumores cerebrales malignos 1 (DMTB1), b) alfa-2-glucoproteína 1, de unión a zinc (AZGP1), y c) acuaporina 3 (AQP3). Sin embargo, este impulso regenerativo no dura mucho ya que la expresión de estos genes disminuye de nuevo una vez que la evolución de la inflamación se reanuda reforzando el impacto de la expresión de KIAA1199 y degradación de matriz en la inflamación bronquial. Aunque más genes muy relacionados con la reparación epitelial, tal como estratifina (SFN), el receptor huérfano acoplado a proteína G 110 (GPR110), el factor de diferenciación de crecimiento inducible por humo 15 (GDF15), y el factor 5 similar a E74 (ELF5), se expresan a lo largo de un periodo más largo de desarrollo de EPOC (Figura 6A), la eficacia de este enfoque de cicatrización evidentemente no es suficiente para mantener la integridad bronquial y para equilibrar la inflamación bronquial en presencia de desintegración epitelial y rotura progresiva de hialuronano.
Como resultado, la medida simultanea de la expresión génica de DMTB1 y KIAA1199 es capaz de discernir EPOC estable de progresiva (según los criterios GOLD), si la diferencia entre la expresión de DMTB1 y KIAA1199 supera un valor de 3,63 (Figura 6E). La importancia de expresión intensificada de KIAA1199 para inflamación epitelial progresiva se subraya más por el hecho de que en cicatrización inflamatoria crónica de piel diabética, la expresión de KIAA1199 está significativamente aumentada, mientras que, en reparación de piel normal, la expresión de KIAA1199 está reducida (véase la figura 8). También se debe indicar que la expresión de KIAA1199 en piel envejecida es en general significativamente mayor que en la piel de individuos más jóvenes (p < 0,01).
Figura 7: Expresión de KIAA1199 en cicatrización de piel.
Figura 8: Patología EPOC módulo 4: Formación de cicatriz por reparación mesenquimatosa predominante como resultado del fracaso regenerativo en presencia de deficiencia estructural predominante.
Como en cualquier situación de reparación no resuelta predominante que no es potencialmente mortal, la activación de reparación mesenquimatosa “secundaria” servirá como la estrategia de salida para eliminar la deficiencia estructural y terminar la cicatrización. Durante la evolución de EPOC, la activación génica coordinada a este respecto se puede dividir en dos categorías: a) apoyo permanente de reparación mesenquimatosa (expresión de los genes NTRK2 y SOS1) (Figuras 8A y 8B), b) apoyo de reparación mesenquimatosa durante tanto la reparación “primaria” funcional como la cicatrización “secundaria” no funcional (expresión de los genes COMP, PRRX1 y CTHRC1) (Figuras 8A-8C). Como en cualquier forma de reparación predominantemente mesenquimatosa, la expresión de genes que controlan el crecimiento y la diferenciación vascular disminuye progresivamente. La figura 8D proporciona un resumen del patrón de expresión y anotaciones relevantes para todos los genes relacionados con el sobrecrecimiento y reparación vascular que están significativamente regulados durante la evolución de EPOC.
La invención se describirá ahora mediante referencia a los siguientes ejemplos que son meramente ilustrativos y no se deben interpretar como una limitación del ámbito de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayo piloto prospectivo controlado dirigido a identificar marcadores metabólicos moleculares basado en síntomas para EPOC progresiva (Estudio EPOC-AUVA Viena)
Introducción
En el contexto de la presente invención, se realizó un ensayo piloto prospectivo controlado dirigido a la identificación de marcadores metabólicos moleculares basado en síntomas para EPOc progresiva en la Universidad Médica de Viena entre 2007 y 2012. El estudio EPOC-AUVA de Viena combinaba la evaluación de medidas clínicas validadas para EPOC siguiendo en parte la estrategia global del ensayo ECLIPSE (Vestbo et al., 2011), el estudio mayor y más elaborado que aborda la evolución y variabilidad de EPOC.
Para la estratificación de los pacientes, un análisis de tres años (día 0, 12 meses y 36 meses) de puntuación de síntomas (cuestionario respiratorio de St. George, puntuación de actividad y síntomas), evaluación de la función pulmonar, ensayo de ejercicio cardiopulmonar y evaluación radiológica por tomografía computarizada (modo de alta resolución) se combinaron con análisis de transcripción del genoma entero más evaluación por RT-PCR cuantitativa y proteómica por espectrometría de masas. Como se muestra en la figura 1, los pacientes se agruparon en tres estratos, dos de los cuales presentaron al inicio del estudio función pulmonar regular, o bien sin ningún signo de enfermedad cardiopulmonar (voluntarios sanos) o con síntomas de bronquitis crónica (EPOC “en riesgo”), y un grupo de voluntarios que tenía síntomas de bronquitis crónica junto con función pulmonar deteriorada (EPOC en fases I-IV GOLD).
Las visitas de estudio se realizaron al inicio y después de 12 y 36 meses, respectivamente. Cada visita se realizó en una base ambulatoria e incluyó antecedentes médicos, examen físico, pruebas de función pulmonar (PFT), pruebas de ejercicio cardiopulmonar (CPET), evaluación radiológica por tomografía computarizada (TAC) y una broncoscopia. En cada visita, se tomaron antecedentes tanto personales como ocupacionales, así como los antecedentes de fumar que comprendía el inicio y duración de síntomas relacionados con EPOC, producción de flema (frecuencia, cantidad y color), intensidad de síntomas medidos por el cuestionario respiratorio de St. George (SGRQ; actividad e índice de puntuación de síntomas) y evaluación de la calidad debida usando el cuestionario SF-36. La tasa de exacerbaciones (frecuencia, número de hospitalizaciones, uso de antibióticos, corticosteroides o tratamiento combinado) y la medicación individual también se registraron.
Se tomaron pruebas de función pulmonar (PFT) en cada visita e incluían extracciones de sangre, pletismografía corporal, espirometría y medida cuantitativa del intercambio de gases pulmonar en reposo y durante ensayo de ejercicios cardiopulmonares limitados por síntomas (CPET). Se realizó PFT con un Autobox DL 6200 (Sensor Medics, Viena, Austria), y CPET en una cinta usando el Sensormedics 2900 Metabolic Measurement Cart. Las fórmulas para el cálculo de los valores de referencia se tomaron de Harnoncourt et al., 1982. Los valores predichos se derivaron de los valores de referencia de la Sociedad Austriaca de Neumología según las recomendaciones de la Sociedad Europea Respiratoria (Rabe et al., 2007).
Las muestras de suero se analizaron para recuento de células sanguíneas completo, electrolitos, glucosa, proteína C reactiva, fibrinógeno y parámetros de coagulación.
Antes de la broncoscopia, se realizaron escáneres TAC que abarcan tomografía computarizada de alta resolución (HRCT). Después de consentimiento informado adicional en cada visita, se realizó la broncoscopia. Durante la broncoscopia, se tomaron tanto muestras de lavado broncoalveolar (LBA) como muestras de biopsia transbronquial (cinco por segmento en cada lóbulo medio).
Se realizó el análisis biológico en biopsias pulmonares transbronquiales durante la broncoscopia de dos localizaciones pulmonares (5 cada) del lóbulo medio después de la evaluación radiológica por tomografía computarizada (TAC) incluyendo escáner de alta resolución. Los escáneres TAC se usaron para la evaluación de formación de enfisema, así como para la exclusión de desarrollo de tumor e infección. Durante el periodo observacional controlado, la evaluación combinada de desarrollo clínico y molecular fue finalmente posible en 120 voluntarios. Se identificaron biomarcadores en cada caso por medio de cambios individuales de la función pulmonar y síntomas clínicos característicos para la evolución de EPOC. Como resultado, este enfoque hace uso de la variabilidad bien conocida de fenotipos clínicos en EPOC y su curso variable de evolución mientras que al mismo tiempo identifica el mismo conjunto de biomoléculas responsables para este tipo de evolución de enfermedad.
Análisis clínico
El protocolo del estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad Médica de Viena (ClinicalTrial.gov Identificador: NCT00618137). Después del consentimiento informado durante el cribado, los individuos se estratificaron en la visita 1 (día 0) si cumplían los siguientes criterios:
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Tabla 2 : Estratificación de sujetos en la visita 1 (día 0).
Se cribaron 396 individuos, 185 de los cuales cumplían los criterios del estudio. 136 participantes terminaron la visita 2 después de 12 meses, y 120 completaron la visita final después de 36 meses de observación controlada. A lo largo del estudio, todos los participantes residían y estaban ocupados en la gran área de Viena con el fin de asegurar condiciones medioambientales comparables. El grupo control consistía en 16 voluntarios sanos que nunca fumaron (7 mujeres y 9 hombre; edad media 36 ± 12,2 años), como también se muestra en la tabla 2 anteriormente. Ninguno de los participantes sanos desarrolló ningún síntoma de enfermedad pulmonar durante el periodo del estudio. Al inicio del estudio, 104 participantes presentaban síntomas clínicos de bronquitis crónica según la definición de la OMS, 55 de los cuales no tenían signos de obstrucción bronquial no reversible (GOLD “en riesgo”), mientras que los otros 49 participantes mostraron obstrucción bronquial que variaba de GOLD fase I a fase IV determinado por PFT (véase la figura 3D). Todos los participantes en los grupos de EPOC y EPOC “en riesgo” eran fumadores activos de cigarrillos con antecedentes de fumar de más de 10 paquetes años, excepto un soldador que además de una expectoración diaria de flema informó sobre frecuentes episodios de infección bronquial (>2 al año) sin signos radiológicos de bronquiectasia. 64 participantes trabajaban como taxistas o conductores de autobús (53%) y 40 soldadores activos (33%) con una exposición previa a humos de soldadura de más de 10 años.
En la visita 1, la mayoría de los participantes con EPOC manifiesta tenía obstrucción bronquial GOLD fase II y III (n = 38), mientras que los restantes sujetos estaban en EPOC GOLD fase I (n = 9) y IV (n = 2) (véase la figura 3D). La edad media en GOLD fases I y II era 50 ± 9,5 y 56 ± 10,4 años, respectivamente, comparado con 52 ± 9,0 años en GOLD fase III y 63 ± 11 años en GOLD fase IV. El 29% de los participantes en el grupo GOLD “en riego” ya presentaban una expectoración diaria continua de esputo, y el esputo estaba con frecuencia descolorido (amarillo, verde, marrón) en el 27%.
Durante la observación controlada (36 meses), 14 participantes (12%) tuvieron una evolución de la enfermedad según GOLD, 7 (13%) en el grupo GOLD “en riesgo”, 1 (11%) en GOLD I, 3 (12%) en GOLD II, y 3 (25%) en GOLD III. La mejora de la obstrucción bronquial según GOLD se observó en 13 individuos (5 participantes en GOLD tanto fase I como II, y 3 casos en GOLD fase III y IV), en gran parte relacionado con dejar de fumar.
Como parte del diseño observacional del estudio, no se animó específicamente a los participantes a que dejaran de fumar. Según esto, los hábitos de fumar cambiaron solo ligeramente: solo 5 participantes del grupo “EPOC en riesgo” (9%) y 2 participantes en el grupo “EPOC manifiesta” (4%) dejaron de fumar durante el periodo de observación, mientras que el 31% redujo el consumo de cigarrillos (datos no mostrados). Estos no alteraron significativamente tanto la aparición como la intensidad de síntomas de bronquitis crónica, ya que 27 participantes (23%) demostraron mejora y deterioro de tos y producción de esputo.
Análisis biológico/molecular (transcripción génica en tejido pulmonar)
Se usó RNAlater (Ambion, lifetechnologies) para aseveración de tejido. El material de biopsia pulmonar se rompió usando bolas cerámicas Lysing Matrix D en un sistema Fastprep 24 (MP Biomedical, Eschwege). Se usó un tampón de lisis caotrópico (RLT, kit RNeasy, Qiagen, Hilden), seguido por una extracción en fenol/cloroformo y posterior limpieza usando el enfoque de columna de centrifugación del kit RNeasy Mini (Qiagen, Hilden) según el manual del fabricante, incluyendo una digestión con DNasa I en la matriz de cromatografía. La cuantificación de ARN se hizo espectrofotométricamente usando un dispositivo NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y el control de calidad se realizó en el bionalizador Agilent 2100. Se eligió un límite para la cantidad de 1 microgramo y un número de integridad del ARN de 7,0.
Las muestras de ARN total se hibridaron a la matriz de genoma humana U133plus 2.0 (Affymetrix, St. Clara, CA), preguntando 47.000 transcritos con más de 54.000 conjuntos de sondas.
La hibridación de la matriz se realizó según las instrucciones del suministrador usando "GeneChip® Expression 3' Amplification One-Cycle Target Labeling and Control reagents" (Affymetrix, St. Clara, CA). La hibridación se llevó a cabo durante la noche (16 h) a 45°C en el horno de hibridación GeneChip® 640 (Affymetrix, St. Clara, CA). Los posteriores protocolos de lavado y tinción se realizaron en Affymetrix Fluidics Station 450. Para la mejora de señal, se llevó a cabo la amplificación de anticuerpo usando un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Vector Laboratories, R.U.), que estaba entrecruzado por una IgG de cabra (Sigma, Alemania) seguido por una segunda tinción con un conjugado estreptavidina-ficoeritrina (Molecular Probes, Invitrogen). El escaneo de la micromatriz se hizo con GeneChip® Scanner 3000 (Affymetrix, St. Clara, CA) a resolución de 1,56 micrómetros.
El análisis de los datos se realizó con análisis de nivel de sonda MAS 5.0 (algoritmo estadístico Microarray Suite, Affymetrix) usando software de operación de GeneChip (GCOS 1.4) y la extracción de datos final se hizo con DataMining Tool 3.1 (Affymetrix, St. Clara, CA).
Se importaron y procesaron ficheros CELL en R/Bioconductor (Gentleman et al., 2004). Brevemente, los datos se procesaron usando normalización de cuantiles (Gentleman et al., 2004) y combate (Johnson et al., 2007), se calcularon modelos lineales usando limma (Smyth GK, 2005) y genes con un valor p de la estadística f < 5e-3 se denominaron significativos. Esos genes se agruparon en 20 grupos de genes corregulados. El procedimiento de modelado y agrupamiento se repitió para GOLD o flema como covariantes.
Para el posterior análisis de ontología génica (GO) fue necesario separar los efectos de GOLD y flema sobre expresión génica. Para este fin, las clasificaciones GOLD se agruparon en “sin EPOC” (sanos y GOLD 0) y “EPOC” (GOLD grados I-IV). De forma similar, flema se reclasificó en un grupo “flema” (productiva o grave) y un grupo “sin flema” (sano o sin/seca). Basado en estas reclasificaciones, la expresión génica se modeló usando un diseño factorial 2x2, que produce cinco listas diferentes de genes: (1) genes que están regulados con flema en presencia de EPOC, (2) genes que están regulados con flema en ausencia de EPOc , (3) genes que están regulados con EPOC en presencia de EPOC, (4) genes que están regulados con EPOC en ausencia de EPOC y, por último (5) genes que están regulados diferentemente con EPOC, dependiendo de si hay flema o no.
Estas listas se anotaron con respecto a sus funciones biológicas como se cataloga en las bases de datos de ontología génica (GO) usando el complemento ClueGO para el entorno Cytoscape.
Resultados de análisis clínico y molecular combinado
Activación de mecanismos de reparación epitelial
El análisis sistemático de los cambios significativos de expresión génica durante el desarrollo de EPOC revela una imagen diferenciada: Como se muestra en las figuras 6A a 6D, los mecanismos de regeneración y reparación comienzan tan pronto como el proceso inflamatorio crónico en el árbol bronquial periférico está establecido. Este ya es el caso en bronquitis persistente o que se manifiesta repetidamente (EPOC “en riesgo”). Las funciones asociadas con el tipo de anomalía del equilibrio normal, en términos ontológicos todavía solo EPOC potencial, incluyen mediadores implicado en la regulación de crecimiento epidérmico y pulmonar embrionario, tal como ELF5 (factor 5 similar a E74; factor de transcripción de dominio ETS) que confiere sobrecrecimiento espacialmente controlado de estructuras epiteliales (Metzger et al., 2008; Yaniw et al., 2005), así como inmunidad de la mucosa del pulmón (Lei et al., 2007). De forma no sorprendente, la expresión de ELF5 está acompañada por un aumento significativo de estratifina (SFN) que confiere regeneración y diferenciación epidérmica aumentada (Medina et al., 2007), aunque también deposito reducido de proteínas de matriz incluyendo colágeno I (Chavez-Muñoz et al., 2012) y funciones reducidas de inmunidad de superficie no específica (Butt et al., 2012). Esta fase regenerativa de reparación implica no solo el receptor huérfano acoplado a proteína G GPR110 y el factor de diferenciación del crecimiento inducible por humo 15 (GD15) (Wu et al., 2012), un miembro de la superfamilia de la proteína morfogénica ósea-factor de crecimiento transformante beta, sino también mediadores que dirigen la reparación epitelial diferenciada, tal como alfa-2-glucoproteína 1 de unión a zinc (AZGP1), y el gen DMBT1 (delecionado en tumores cerebrales malignos 1) que está fuertemente aumentado durante inflamación bacteriana aguda pero que se resuelve en epitelio entérico durante apendicitis (Kaemmerer et al., 2012), lo que sugiere una relevancia funcional para la defensa de la mucosa (Diegelmann et al., 2012). El perfil de expresión casi idéntico de DMBT1 y AZGP1, un mediador capaz de inducir una fuerte transdiferenciación epitelial en células tumorales (Kong et al., 2010), sugiere un efecto combinatorio aún no definido de ambos mediadores en la diferenciación celular durante la regeneración epitelial. Notablemente, la expresión de estos genes está fuertemente aumentada en individuos con EPOC GOLD I y disminuye significativamente con la evolución de EPOC, como también se muestra en la figura 6A. En línea con esta observación, se encontró que todos los mediadores que transmiten regeneración y diferenciación epitelial estaban significativamente disminuidos durante la transición de EPOC fase III a EPOC fase IV.
La activación de los mediadores de reparación regenerativa también se encontró en individuos que demuestran síntomas significativos de inflamación bronquial, como se demuestra por un aumento uniforme de la expresión génica de SFN, GPR110 (véase también la figura 6D), y acuaporina 3 (AQP3) (véase la figura 6A) que es un mediador adicional que se sabe guía la proliferación y diferenciación de células epiteliales (Nakahigashi et al., 2011; Kim et al., 2010). Sin embargo, la expresión de estos factores no aumentó más con un aumento de gravedad de la inflamación bronquial, muy al contrario a los mediadores capaces de intensificar la inflamación en superficies epiteliales, tal como la molécula de adhesión celular relacionada con el antígeno carcinoembrionario 5 (CEACAM5) (véase las figuras 5A y 5D), o factores que son parte de la respuesta de cicatrización preferentemente mesenquimatosa durante la reparación inflamatoria (Agarwal et al., 2012; Agarwal et al., 2013), tal como la proteína de matriz oligomérica de cartílago (COMP) (véase las figuras 8A y 8C). El diseño del estudio permitió también la medida de cambios de expresión génica que se producen a lo largo del periodo del estudio de 3 años, posiblemente indicando cambios significativos de reparación durante la evolución a corto plazo de EPOC. Aquí, se encontró una disminución significativa de los genes GPR110 y DMBT1 que se correlaciona con función pulmonar deteriorada según GOLD, como también se muestra en las figuras 6B y 6D. Esta disminución de actividad génica regenerativa empezó ya en GOLD fase II, donde estaba acompañada por un aumento notable de funciones de reparación relacionadas con la cicatrización mesenquimatosa (véase también la figura 8).
Activación progresiva de reparación mesenquimatosa
Durante fases posteriores de EPOC, la expresión de mediadores que favorecen la reparación mesenquimatosa se volvió crecientemente prominente. Esto no solo se relacionaba con la expresión aumentada del gen COMP (véase las figuras 8A y 8C), sino también a la expresión de activadores potentes de células madre mesenquimatosas, tal como el gen del homólogo de son de sevenless 1 (SOS1), un factor de intercambio de nucleótidos de guanina para proteínas RAS que actúa como el receptor afín para el factor de crecimiento de hepatocitos, y para el gen relacionado con homeobox 1 apareado (PRRX1), un coactivador transcripcional de factores de transcripción de RAS que pertenece a la familia HOX de factores de diferenciación temprana capaces de inducir sobrecrecimiento mesenquimatoso en cirrosis hepática (Jiang et al., 2008), así como transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) durante el desarrollo de cáncer (Ocaña et al., 2012). Mientras que su patrón de expresión indica que tanto los genes COMP como PRRX1 también toman parte en la fase regenerativa de la cicatrización que caracteriza GOLD fase I y II, su aumento posterior durante la transición de GOLD fase III a IV sugiere una implicación adicional en la cicatrización progresiva de las vías respiratorias. La expresión aumentada de factores profibróticos se demuestra adicionalmente por el aumento notable de expresión del receptor tirosina quinasa neurotrófico de tipo 2 (o receptor B del receptor quinasa de tropomiosina; TrkB) (NTRK2). NTRK2/TrkB, que hasta ahora se sabe que actúa como receptor de alta afinidad para varios factores de crecimiento neurotróficos durante el desarrollo nervioso, también es capaz de fomentar resistencia de células mesenquimatosas hacia apoptosis y anoikis (Frisch et al., 2013). El aumento combinado de mediadores profibróticos incluye también la expresión del gen que contiene la repetición de triple hélice de colágeno 1 (CTHRC1) capaz de conferir distrofia orgánica fibrótica (Spector et al., 2013). Notablemente, mientras que la expresión aumentada de CTHRC1 empieza solo en GOLD fase II, la activación acumulada de NTRK2/TrkB es un distintivo a lo largo de la evolución de EPOC en general, lo que sugiere una contribución permanente de la señalización de NTRK2/TrkB a la respuesta de reparación anómala en las vías respiratorias periféricas durante el desarrollo de EPOC. Esta visión está además apoyada por la observación de que un eje de TrkB alterado puede contribuir a fibrosis pulmonar experimental (Avcouglu et al., 2011).
Con la excepción de la expresión de COMP, donde el deterioro clínico se correlaciona con empeoramiento de obstrucción bronquial según GOLD (véase también la figura 8C), ni la expresión aumentada a largo plazo de NTRK2 (véase también la figura 8B), ni de los genes PRRX1 (véase también la figura 8B) o CTHRC1 (véase también la figura 8C) demuestran un impacto de corto plazo comparable en obstrucción bronquial durante el periodo de estudio observacional de 3 años controlado. Se obtuvieron resultados correspondientes cuando se evaluó la correlación de expresión génica con inflamación bronquial progresiva: mientras que la expresión de todos los genes que favorecen la reparación mesenquimatosa aumenta como resultado de bronquitis intensificada, solo se encontraron cambios significativos para los genes PRRX1 y CTHRC1 (véase también las figuras 8B y 8C).
Pérdida de integridad estructural de superficies epiteliales
Inesperadamente, el presente análisis reveló una disminución muy significativa de la expresión de un grupo de genes que guía el movimiento, distribución y activación del citoesqueleto celular y que, como resultado, es probable que influyan profundamente en la integridad estructural y función barrera de la superficie mucosa. La disminución de estos genes tiene lugar ya durante el establecimiento de bronquitis crónica, mucho antes del establecimiento de la obstrucción bronquial según GOLD, como también se muestra en la figura 4A. Los genes estrechamente relacionados con este desarrollo son timosina beta 15 A (TMB15A), dipeptil-peptidasa 6 (DPP6) nudix (fracción X ligada a nucleósido difosfato)-motivo de tipo 11 (NUDT11), integrina alfa 10 (ITGA10), cistatina E/M (CST6) y PRICKLE2 (datos no mostrados). Notablemente, los dos genes más significativamente disminuidos durante la evolución de EPOC, TMB15A y DPP6, también están significativamente disminuidos en correlación con síntomas de inflamación bronquial aumentada (véase también la figura 4B). Las beta timosinas son controladores tanto de composición como de secuestro del citoesqueleto de actina (Hannapel, 2007; Huff et al., 2001; Malinda et al., 1999), mediante ello influyen la estructura de la membrana, la estabilidad de superficie y el fenotipo celular (Husson et al., 2010). Uno de los desenlaces de niveles elevados de beta timosinas durante la cicatrización parece ser una protección de anomalías fibróticas de reparación (De Santis et al., 2011), en parte al prevenir la expresión de fibras de estrés de músculo liso a previniéndolas de una transdiferenciación a miofibroblastos más característicos para desarrollo de tejido fibrótico. Actualmente, se sabe poco sobre la función de DPP6 en la cicatrización regenerativa. Sin embargo, DPP6, un miembro de la familia S9B de serina proteasas unidas a membrana que carece de cualquier actividad proteasa detectable, se ha demostrado recientemente que confiere estabilidad de membrana y sobrecrecimiento controlado de células durante el desarrollo nervioso incluyendo control estrecho de unión y motilidad celular (Lin et al., 2013). Además, dada su asociación demostrada con y control de expresión y activación de canales iónicos unidos a membrana (Jerng et al., 2012), en particular canales de potasio activados por voltaje, la expresión de DPP6 también es capaz de controlar el potencial de membrana en reposo (Nadin et al., 2013), controlando de esta manera tanto la actividad como la distribución intracelular del citoesqueleto de actina (Mazzochi et al., 2006; Chifflet et al., 2003).
Combinado con la notable reducción de la expresión génica de TMSB15A, la disminución significativa de la expresión DPP6 sugiere una grave alteración de movimiento regular y distribución del esqueleto de actina celular, reduciendo la integridad fisicoquímica de las bicapas lipídicas epiteliales. Como esto ya se produce muy pronto en el desarrollo de EPOC, este hallazgo podría indicar un mecanismo iniciador y posiblemente de predisposición que produce inflamación de superficie no específica.
La cistatina E/M (CST6), por otra parte, es un inhibidor de proteasa específico de epitelio que pertenece a la familia cistatina de inhibidores de cisteína proteasas secretados indispensables para la regulación fisiológica de la actividad proteasa durante el crecimiento y diferenciación de estructuras epiteliales. CST6 se expresa tanto en epitelio dérmico como bronquial donde caracteriza el estado de diferenciación funcional (Zeeuwen et al., 2009). La disminución significativa de CST6 ya se ha mostrado que produce una marcada alteración tanto de la integridad de superficie como del estado de diferenciación en la dermis de ratón (Zeeuwen et al., 2010). La disminución progresiva de CST6 como se observa durante el avance de EPOC es, por tanto, probable que desestabilice el equilibrio intrincado entre proteasas e inhibidores de proteasas, contribuyendo mediante ello a una pérdida de estabilidad de superficie, así como adhesión y diferenciación celular en el epitelio bronquial en regeneración. En este contexto, la disminución significativa de otros dos genes estrechamente implicados en la regulación de la adhesión y motilidad celular también se ha observado, es decir, de integrina a10 (ITGA10) que es parte de estructuras mesenquimatosas diferenciadas, y nudix (fracción X ligada a nucleósido difosfato)-motivo de tipo 11 (NUDT11), capaz de hidrolizar difosfoinositol polifosfatos derivados de estructuras de bicapas lipídicas celulares, y diadenosina polifosfatos, en gran parte basados en adenosina trifosfato (ATP).
La consecuencia de estos cambios en la expresión génica se espera que sea una desintegración de la función barrera epitelial, probablemente empezando a nivel celular (tensión cortante continua en la bicapa lipídica celular debido a acumulación descoordinada y movimientos del citoesqueleto de actina unido a ella), y agravada por la desintegración de la composición de matriz extracelular misma. Esto está apoyado por el aumento significativo de expresión génica del gen KIAA1199 durante la evolución de EPOC de GOLD fase I a GOLD fase IV (véase la figura 5B). La expresión aumentada de KIAA1199, además de mediar unión celular e inhibición por contacto (Tian et al., 2013), se ha demostrado solo recientemente que produce la pérdida de contenidos del retículo endoplásmico (ER) al citosol en células cancerosas (Evensen et al., 2013). Además, la expresión aumentada de KIAA1199 es capaz de activar hialuronidasas (HAasa), enzimas capaces de degradar ácido hialurónico de alta masa molecular (HMM-HA), uno de los constituyentes principales de la matriz extracelular (Toole et al., 2004). Las respuestas biológicas desencadenadas por ácido hialurónico (HA) dependen de la longitud del polímero de HA. HMM-HA tiene propiedades antiinflamatorias fuertes (Kothapalli et al., 2007), mientras que el HA de baja masa molecular fomenta la inflamación y proliferación celular concomitante (Puré et al., 2009). En apoyo de esta visión, se ha mostrado que HA desencadena inflamación de la piel por la generación de fragmentos de bajo peso molecular de HA (Yoshida et al., 2013).
En línea con esto, la expresión de HA sintasas (HAS1-3) no cambia durante la evolución de EPOC (véase la figura 5G), mientras que el gen de hialuronidasa 2 (HYAL2) aumenta entre las fases GOLD I y III (véase también la figura 5C). En efecto, el patrón de expresión tanto de HYAL1 como HYAL2 sigue el patrón de expresión de KIAA1199, mostrando una disminución durante la fase regenerativa más intensa de reparación en evolución de EPOC (bronquitis crónica y EPOC GOLD I). El aumento de KIAA1199 a su vez es sincrónica a la del gen PLA1A (véase la figura 5B) que es una fosfolipasa específica de fosfatidilserina expresada en macrófagos estimulados por mecanismos típicos de inmunidad de superficie, tal como señalización del receptor de tipo toll 4 (TLR4) (Wakahara et al., 2007). Se encontró que la expresión intensificada tanto de KIAA1199 como PLA1A estaban relacionadas con empeoramiento a corto plazo de la función pulmonar según los criterios GOLD (véase también la figura 5B).
Disminución de mediadores proangiogénicos durante la evolución de EPOC
La reparación de órgano eficaz implica mecanismos que dirigen concomitantemente sobrecrecimiento epitelial, mesenquimatoso y endotelial espacialmente controlado. Sin embargo, al contrario que funciones génicas que contribuyen a la reparación epitelial y mesenquimatosa, se encontró que la expresión génica que fomenta angiogénesis y diferenciación vascular disminuía tan pronto como la bronquitis crónica estaba presente. Durante el desarrollo de EPOC (GOLD fase I y II), este patrón de expresión génica seguía significativamente, como también se muestra en la figura 8D. Incluso el aumento de la expresión génica de Bex1 y ghrelina (GHRL) que se produce en la GOLD fase I es bastante pequeño e insignificante comparado a funciones génicas dirigidas a la regeneración de sobrecrecimiento epitelial, tal como DMBT1 y AZGP1. Algunas de las funciones, tal como FIBIN (homólogo del factor de inicio del brote de la aleta), ESM1 (molécula específica de célula endotelial 1) y ghrelina (GHRL) se sabe que actúan, en parte, como mediadores en las fases tempranas de desarrollo de órganos. Por ejemplo, FIBIN toma parte en el desarrollo de la placa latera mesodérmica (Wakahara et al., 2007) que es crucial para la vasculogénesis temprana (Paffett-Lugassy et al., 2013), ESM1 media la señalización dependiente de VEGF-A (Zhang et al., 2012) y se expresa típicamente en tejido vascular en crecimiento que incluye angiogénesis tumoral (Zhang et al., 2012; Roudnicky et al., 2013; Chen et al., 2010) y cicatrización regenerativa (Béchard et al., 2001).
La ghrelina, por otra parte, es un marcador típico de desarrollo microvascular (Li et al., 2007; Wang et al., 2012; Rezaeian et al., 2012) que es vital para el suministro continuo de oxígeno y energía que previene la apoptosis excesiva característica para el desarrollo de enfisema (Mimae et al., 2013). BEX1 y BEX5 (expresada en cerebro, ligada a X 1 y 5) son genes que codifican moléculas adaptadoras que interfieren con los sucesos de señalización de p75NTR. p75NTR es uno de los dos receptores centrales para la señalización del factor de crecimiento nervioso (NGF). Mientras que se sabe que BEX1 induce proliferación celular sostenida en condiciones de detención de crecimiento en respuesta a NGF, se sabe mucho menos sobre su posible implicación en angiogénesis y formación de vasos, aunque se sabe bien que la señalización de NGF misma fomenta la angiogénesis (Cantarella et al., 2002). Una posible interacción podría ser que expresión génica de BEX1 reducida aumentaría la eficacia de señalización de p75NTR produciendo apoptosis endotelial aumentada, ya que el bloqueo de la señalización de p75NTR disminuye significativamente la apoptosis endotelial (Han et al., 2008; Caporali et al., 2008). El promotor de BEX5. a su vez, contiene sitios de unión reguladores para TAL1 (leucemia linfocítica aguda de células T 1), un activador transcripcional directo de angiopoyetina 2, que está significativamente aumentada durante angiogénesis (Deleuze et al., 2012). Sin embargo, TAL1 también disminuye durante la evolución de EPOC, como también se muestra en la figura 8D.
Activación dependiente de fase de la respuesta inmunitaria
Basado en los cambios significativos de expresión génica medidos durante la evolución de EPOC, se distinguieron cuatro fases progresivas de expresión génica: la fase 1 se caracteriza por un rápido aumento de genes implicados en respuesta inmunitaria aguda, tal como fibrinógeno (FGG) (Duvoix et al., 2013; Cockayne et al., 2012), y productos de señalización del receptor de aril hidrocarburo (AHR), tal como expresión de CYP1A1 (citocromo P450, familia 1, subfamilia A, polipéptido 1) y CYP1B1 (citocromo P450, familia 1, subfamilia B, polipéptido 1), como también se muestra en las figuras 5A a 5E. Esto incluye también una expresión aumentada de moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEA) (CEACAM), particularmente el gen CEACAM5 (véase las figuras 5A y 5D). En esta fase temprana, que aun representa bronquitis crónica sin cambios significativos de la función pulmonar (EPOC “en riesgo”), la expresión de genes que median funciones de inmunidad adaptativa principalmente, tal como RASGRF2 (factor liberador de nucleótidos de guanina específico de la proteína Ras 2), KIAA1199 o CXCL3 no cambió significativamente (véase también las figuras 5H y 5F). En la fase 2 (que representa la fase GOLD I), la expresión de estos genes permaneció estable o incluso disminuyó en algún grado (véase figuras 4A y 5A), probablemente reflejando el desenlace estabilizador de los esfuerzos de reparación regenerativa que era más intensa en la fase GOLD I (véase también la figura 6A). Sin embargo, la fase 3 que incluye las fases GOLD II y III se caracterizaba por un aumento significativo de la expresión de todos los genes relacionados con inmunidad incluyendo genes que indican señalización de AHR aumentada, tal como CYP1A1, CYP1A2 y CYP1B1 (véase también las figuras 5A, 5E y 5F). Los últimos lo más probablemente reflejan el impacto de fumar cigarrillos, todavía más ya que tres cuartos de los participantes todavía eran fumadores activos en esta fase (véase la figura 3C). La expresión génica aumentada que refleja señalización de AHR intensificada se podría demostrar a pesar de los niveles elevados del gen del represor del receptor de aril hidrocarburo (AHRR) que se sabe que inhibe los sucesos de señalización de AHR, en particular durante las fases GOLD II y III.
No obstante, el análisis a corto plazo de la expresión génica que aborda un desarrollo de EPOC durante un periodo de 3 años (véase también las figuras 5A y 5D, medio) indica que el impacto global de la señalización de AHR en el deterioro de la función pulmonar es más importante que la expresión adicional de CEACAM5 que, comparable a la expresión de FGG (véase también la figura 5d ), parece reflejar la intensidad de la bronquitis mucho mejor. La fase 4 que representa la fase GOLD IV muestra una notable disminución de la mayoría de las funciones relacionadas con inmunidad aumentadas durante fases anteriores del desarrollo de EPOC, comparable a la regulación de genes que controlan la regeneración y diferenciación celular. Sin embargo, de forma interesante, esto no aplica a la expresión de los genes KIAA1199 y RASGRF2 que están ambos aumentados incluso en la fase GOLD IV, el último es capaz de nuevo de influir los movimientos celulares por inhibición del citoesqueleto de actina (Calvo et al., 2011): RASGRF2 pertenece a un grupo de activadores de la GTPasa RAS implicada también en la activación de células T y requerida para la inducción de NF-AT, IL-2 y TNF-a (Ruiz et al., 2007).
En este contexto, el lento, aunque constante y muy significativo aumento del factor de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) homólogo de son of sevenless 1 (SOS1) (véase la figura 8A), capaz de activar continuamente RAS, podría contribuir significativamente al proceso inflamatorio crónico de la cicatrización de la pared bronquial característico para la etapa tardía de EPOC.
Los miembros de la familia de moléculas de adhesión celular relacionadas con el antígeno carcinoembrionario (CEACAM) sirven como receptores celulares para bacterias gram negativas típicas que colonizan con frecuencia la superficie de las vías respiratorias humanas, tal como Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis que expresan proteínas opacidad (Opa) (Muenzner et al., 2010; Bookwalter et al., 2008; Muenzner et al., 2005). Se ha sugerido recientemente que Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis no tipables son capaces de aumentar la expresión de sus respectivos receptores en células huésped (Klaile et al., 2013). Sin embargo, no se encontró correlación entre la expresión de miembros de la familia CEACAM y EPOC en las condiciones empleadas en ese estudio. En el presente estudio, solo la expresión del gen CEACAM5 estaba significativamente aumentada hasta la fase GOLD III, en que después de la reacción inflamatoria en general, mientras que disminuía significativamente después de ello en la fase GOLD IV. Sin embargo, eso no excluye el agravamiento de la inflamación de la mucosa como resultado de un aumento persistente de CEACAM5, más todavía ya que se encontró que la expresión de CEACAM5 estaba aumentada en combinación con una intensidad creciente de inflamación bronquial (véase la figura 5D).
Conclusiones
Entre 2007 y 2012, se realizó un ensayo piloto prospectivo controlado en finalmente 120 voluntarios con el fin de identificar marcadores metabólicos indicativos de evolución de EPOC. Al adoptar partes del diseño de ensayo ECLIPSE (Vestbo et al., 2011), el mayor y más elaborado estudio realizado hasta ahora para identificar marcadores clínicos que describen tanto evolución como variabilidad de EPOC, el estudio EPOC Viena combinaba evaluación controlada de medidas clínicas validadas con evaluación no supervisada de transcripción génica en todo el genoma en tejido pulmonar que representa el foco de la patología de EPOC (Hogg JC, 2004 (b)). La correlación de expresión génica con desarrollo clínico se basó a) en el grado de obstrucción pulmonar no reversible en la visita 1 (según la Iniciativa Global para Enfermedad Pulmonar Obstructiva; GOLD), b) en el empeoramiento de obstrucción no reversible según GOLD entre la vista 1 y 3 (que cubre un periodo de tres años), y c) en síntomas indicativos de una intensidad creciente de bronquitis que se registran durante los antecedentes clínicos estructurados en las visitas 1 y 3.
Este análisis reveló cambios de expresión génica indicativos de seis desviaciones principales del mantenimiento reguilar de la estructura y defensa pulmonar: (1) Pérdida progresiva de funciones epitelial guía y (2) regeneración vascular combinado con (3) activación persistente y creciente de mecanismo de reparación fibroproliferativa, que juntos indica una transición de reparación regenerativa a fibrótica durante la evolución de EPOC; (4) inflamación bronquial creciente que se antagoniza en la fase GOLD I cuando la actividad reparadora regenerativa es más alta, y culmina después de ello en la fase GOLD IV relacionada a una inmunidad que finalmente falla, ambos sugerentes de la formación de tejido cicatricial; y, por último, una disminución rápida y persistente de funciones que controlan la distribución intracelular, agregación y secuestro de polímeros de actina que forman el citoesqueleto (6). El último hallazgo es de interés particular ya que los cambios en la transcripción de los correspondientes genes, en particular la disminución de TMSB15A, Dp P6, NUDT11 y PRICKLE2, ya se observaron en la fase GOLD 0 (EPOC “en riesgo”), mucho antes de que cualquier cambio en la función pulmonar fuera cuantificable. Esta pérdida notable se produce junto con un aumento significativo de funciones que determinan la inflamación bronquial lo que sugiere que estos cambios podrían ser los primeros para predisponer a los bronquios a inflamación persistente. El desenlace de tal disminución temprana y simultanea de los genes TMSB15A, DPP6, NUDT11 y PRICKLE2 se discutirá a continuación.
Timosina beta 15A (TMSB15A) pertenece al grupo de proteínas de unión al dominio WH2 (homólogo de WASP 2) que son necesarias para la despolimerización de filamentos de actina durante los movimientos celulares (Husson et al., 2010; Hertzog et al., 2004). La formación y rápido movimiento de filamentos de actina a su vez son indispensables para procesos tales como la división celular, intercalación y extrusión celular. Esto aplica también a la regulación de la polaridad celular apicobasal (Nishimura et al., 2012), e incluso más importante, a la formación y mantenimiento de uniones estrechas y adherentes (Shen et al., 2005; Calautti et al., 2002). Estas dinámicas de membrana complejas no son solo una respuesta a estrés interno y externo, sino también parte del crecimiento de tejido regular y como tal, dependientes de energía. El ensamblaje del esqueleto de actina es muy dinámico y crea una capa de células epidérmicas que actúan como una protección de tipo impenetrable a líquidos compuesta del límite lipídico en constante movimiento de las células (Guillot et al., 2013). Por tanto, una disminución persistente de TMSB15A es probable que prevenga cualquier reorganización adaptativa rápida de las capas lipídicas superficiales durante los movimientos celulares causando perturbaciones repetidas de la función barrera epitelial.
DPP6, por otra parte, se sabe que estabiliza el potencial de membrana al actuar sobre canales de potasio unidos a membrana, y también tiene un impacto profundo en la organización del citoesqueleto de actina (Chifflet et al., 2003), apoyando la percepción de una función barrera fallida. Los mismo aplica a la disminución de la expresión génica de NUDT11. El gen de la fracción X ligada de nucleósido difosfato (nudix)-motivo de tipo 11 (NUDT11) codifica una difosfoinositol polifosfato fosfohidrolasa de tipo 3 que genera fosfatos ricos en energía esenciales para el tráfico de vesículas, mantenimiento de la integridad de la pared celular en Saccharomyces y para la mediación de respuestas celulares a estrés por sales medioambientales (Dubois et al., 2002). Como el ensamblaje adaptativo de fibras de actina F y G en el citoesqueleto se produce en segundos, es fácilmente concebible que los difosfoinositol polifosfatos ricos en energía que son constituyentes integrales de cualquier membrana celular se utilizarán como fuente de energía rápidamente accesible.
Estos hallazgos señalan hacia una disregulación sincronizada de genes necesarios para mantener la barrera epitelial. Además, también se mostró que la disminución del gen PRICKLE2 era vital para la formación de capas epiteliales polarizadas durante la embriogénesis de ratón (Tao et al., 2012). La expresión disminuida de los cuatro genes (es decir, TMSB15A, DPP6, NUDT11 y PRICKLE2), sin embargo, estaba asociada con inflamación bronquial significativamente aumentada, lo que sugiere una correlación funcional entre la disminución de genes que guían características funcionalmente interrelacionadas del ensamblaje del citoesqueleto con la activación de bronquitis. Esto derrama una nueva luz sobre la evolución de inflamación bronquial ya que indica una relación directa entre la pérdida de un escudo epitelial protector y el agravamiento de bronquitis crónica. Basado en la naturaleza fisicoquímica de tal efecto, la penetración de las membranas epiteliales por cualquier potencial antígeno o alergeno es probable que esté aumentada, en particular durante la reparación intensificada debido al daño inducido por humo repetido o después de infecciones víricas. Esto podría no solo explicar la notable heterogeneidad de estados inflamatorios característicos para EPOC, sino también la observación de que la capacidad de lograr regeneración celular intensa a pesar de la inflamación en marcha podría ser útil en suprimir expresión de genes proinflamatorios.
Esta visión está apoyada además por la disminución significativa del inhibidor de proteasa cistatina M/E (CST6) durante la evolución de EPOC (véase también la figura 4A). Se sabe que CST6 controla la homeostasis de la capa córnea, su deficiencia en ratones causa ictiosis grave y letalidad neonatal (Zeeuwen et al., 2009). La pérdida progresiva de un inhibidor de proteasa en fases posteriores de EPOC que se sabe que conserva la integridad de las estructuras epiteliales contribuirá lo más probablemente al fracaso de la función barrera protectora, no solo por una disgregación de la capa epitelial sino también al facilitar la rotura de la matriz misma.
En este contexto, el fuerte aumento del gen KIAA1199 que se ha demostrado que aumenta significativamente la actividad de hialuronidasas de matriz, es probablemente igualmente importante, ya que este aumento se asocia directamente con un empeoramiento significativo de la función pulmonar, incluso en el periodo observacional relativamente corto del presente estudio (véase también la figura 5B). Se ha mostrado recientemente que estructuras de matriz que contienen grandes cantidades de hialuronano de alta masa molecular, así como la inhibición de la actividad hialuronidasa protegen tanto contra inflamación como evolución del cáncer (Tian et al., 2013). En resumen, estos hallazgos proporcionan la primera evidencia conclusiva para un corte progresivo de la integridad de la superficie bronquial durante el curso del desarrollo de EPOC lo que produce inflamación bronquial no específica creciente que varía con frecuencia e intensidad de los asaltos fisicoquímicos que atacan las superficies bronquiales.
Según los resultados descritos en el presente documento, la respuesta a estos asaltos es un proceso de cicatrización progresiva lenta en los bronquios periféricos, mediante lo cual el aumento combinado de los genes CTHRC1, SOS1 y NTRK2 (véase también la figura 8A) es probable que indique mecanismos de cicatrización preferentemente mesenquimatosa mientras que la expresión dependiente de fase de los genes PRRX1 y COMP sugiere su participación en reparación de órgano regular, así como demuestra la ambigüedad entre soporte de matriz regular durante la reparación regenerativa y formación de cicatriz como resultado de un fracaso progresivo de la capacidad de reparación regenerativa del órgano.
Esto se ajusta bien a la disminución progresiva de genes que controlan principalmente funciones de crecimiento regenerativo del árbol vascular como se demuestra por la disminución concomitante de la expresión de los genes FIBIN, TAL1, BEX1/5 y ghrelina (GHRL) (véase también la figura 8D). Aquí de nuevo, la capacidad creciente del pulmón periférico para emplear mecanismos de reparación preferentemente regenerativa durante la fase GOLD I se hace evidente ya que BEX1 y GHRL aumentan en esta fase mientras que disminuyen progresivamente durante la evolución adicional de EPOC.
Por tanto, en estudio EPOC AUVA, la evolución clínica de EPOC se ha correlacionado con éxito con el análisis biológico de expresión génica en tejido pulmonar. En particular, se ha demostrado que la expresión de los genes KIAA1199, DMBT1, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1 FGG, CEACAM5, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, NTRK2 y COMP está aumentada en muestras de tejido pulmonar de sujetos propensos a desarrollar EPOC progresiva, mientras que la expresión de los genes TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, PLA1A, HYAL2, CST6, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL está disminuida en muestras de tejido pulmonar de sujetos propensos a desarrollar EPOC progresiva, en comparación con la expresión de los correspondientes genes en muestras de tejido pulmonar de sujetos sanos. Estos biomarcadores moleculares se pueden por tanto usar para evaluar la susceptibilidad/propensión de un sujeto para desarrollar EPOC progresiva según la presente invención, en particular en el método del segundo aspecto de la invención. Además, también se ha demostrado que la expresión de los genes DMBT1, ELF5, AZGP1, PRRX1 , AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1 FGG, CEACAM5, AHRR, CXCL3, CYP1A1, CYP1B1, CYP1A2, NTRK2 y COMP está aumentada en muestras de tejido pulmonar de sujetos que padecen o propensos a desarrollar EPOC estable, mientras que la expresión de los genes KIAA1199, TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11, PLA1A, HYAL2, CST6, ITGA10, CTHRC1, TAL1, FIBIN, BEX5, BEX1, ESM1 y GHRL está disminuida en muestras de tejido pulmonar de sujetos que padecen o propensos a desarrollar EPOC estable, en comparación con la expresión de los correspondientes genes en muestras de tejido pulmonar de sujetos sanos, lo que indica que estos biomarcadores son adecuados para diagnosticar EPOC estable o evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar EPOC estable según la invención, en particular en el método del tercer aspecto de la invención.
Referencias
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Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto para desarrollar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde el sujeto ha sido diagnosticado como que padece EPOc estable o se sospecha que padece EPOC estable, el método comprende:
    - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y
    - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
    El método de la reivindicación 1, que comprende:
    - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto;
    - comparar el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A con un nivel de expresión control de los genes correspondientes en un sujeto sano; y
    - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible,
    en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva, y
    en donde una disminución en el nivel de expresión de TMSB15A en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control del gen correspondiente es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
    El método de la reivindicación 2, que comprende:
    - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A y opcionalmente al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2, RASGRF2, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, DPP6, SLC51B y NUDT11 en la muestra obtenida del sujeto;
    - comparar el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A y opcionalmente al menos un gen más seleccionado de FGG, CYP1A1, CEACAM5, CTHRC1, NTRK2, RASGRF2, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, DPP6, SLC51B y NUDT11 con un nivel de expresión control de los genes correspondientes en un sujeto sano; y
    - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible,
    en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199, ELF5, AZGP1, PRRX1, AQP3, SFN, GPR110, GDF15, RASGRF2, RND1, FGG, CEACAM5, CYP1A1 y/o NTRK2 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva, y
    en donde una disminución en el nivel de expresión de TMSB15A, DPP6, SLC51B, NUDT11 y/o CTHRC1 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
    Un método in vitro de diagnosticar enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) estable en un sujeto, el método comprende:
    - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto sano; y
    - determinar si el sujeto padece o no EPOC estable, en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 y una disminución en el nivel de expresión de KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de EPOC estable,
    en donde dicha EPOC estable se refiere a fases iniciales de EPOC con limitación del flujo de aire leve caracterizada por una proporción VEF1/CVF de <70% y un VEF1 de > 80% (EPOC de fase I según los criterios GOLD).
    5. El método de la reivindicación 4, que comprende:
    - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A en la muestra obtenida del sujeto;
    - comparar el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y TMSB15A con un nivel de expresión control de los genes correspondientes en un sujeto sano; y
    - determinar si el sujeto padece o no EPOC estable,
    en donde un aumento en el nivel de expresión de DMBT1 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control del gen correspondiente es indicativo de EPOC estable, y
    en donde una disminución en el nivel de expresión de KIAA1199 y TMSB15A en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de los genes correspondientes es indicativo de EPOC estable.
    6. Un método diagnóstico in vitro de evaluar la susceptibilidad de un sujeto que padece enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) estable para desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, el método comprende:
    - determinar el nivel de expresión de los genes DMBT1 y KIAA1199 en una muestra obtenida del sujeto; - comparar el nivel de expresión de DMBT1 y KIAA1199 en la muestra del sujeto con un nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 en un sujeto que padece EPOC estable, en donde dicho sujeto que padece EPOC estable es un sujeto que padece una fase inicial de EPOC con limitación del flujo de aire leve caracterizada por una proporción VEF1/CVF de <70% y un VEF1 de > 80% (EPOC de fase I según los criterios GOLD); y
    - determinar si el sujeto es o no propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible, en donde una disminución en el nivel de expresión de DMBT1 y un aumento en el nivel de expresión KIAA1199 en la muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión control de DMBT1 y KIAA1199 es indicativo de una propensión a desarrollar EPOC progresiva.
    7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano.
    8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la muestra obtenida del sujeto es una muestra de tejido pulmonar, o la muestra obtenida del sujeto es una muestra de biopsia pulmonar transbronquial o una muestra de lavado broncoalveolar.
    9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el nivel de expresión de DMBT1, KIAA1199 y, si es aplicable, el uno o más genes adicionales en la muestra del sujeto se determina determinando el nivel de transcripción de los genes correspondientes, en donde el nivel de transcripción preferiblemente se determina usando una reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa o una micromatriz.
    10. Un fármaco contra enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) para uso en tratar EPOC en un sujeto que se ha identificado en un método como se ha definido en la reivindicación 1 o cualquiera de sus reivindicaciones dependientes 2 a 3 o 7 a 9 como que es propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible,
    en donde el fármaco contra EPOC es preferiblemente bitolterol, carbuterol, fenoterol, pirbuterol, procaterol, reproterol, rimiterol, salbutamol, levosalbutamol, terbutalina, tulobuterol, arformoterol, bambuterol, clembuterol, formoterol, olodaterol, salmeterol, indacaterol, beclometasona, betametasona, budesónida, ciclesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, bromuro de aclidinio, bromuro de glucopirronio, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, acefilina, ambufilina, bamifilina, doxofilina, enprofilina, etamifilina, proxifilina, teobromina, teofilina, aminofilina, teofilinato de colina, ibudilast, roflumilast, eprozinol, fenspirida, epinefrina, hexoprenalina, isoprenalina, isoproterenol, orciprenalina, metaproterenol, o atropina, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados, o cualquier combinación de los mismos,
    y en donde el fármaco contra EPOC es más preferiblemente roflumilast.
    11. Un fármaco contra enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) para uso en tratar EPOC en un sujeto que se ha identificado en un método como se ha definido en la reivindicación 4 o cualquiera de sus reivindicaciones dependientes 5 o 7 a 9 como que padece EPOC estable,
    en donde el fármaco contra EPOC es preferiblemente bitolterol, carbuterol, fenoterol, pirbuterol, procaterol, reproterol, rimiterol, salbutamol, levosalbutamol, terbutalina, tulobuterol, arformoterol, bambuterol, clembuterol, formoterol, olodaterol, salmeterol, indacaterol, beclometasona, betametasona, budesónida, ciclesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, bromuro de aclidinio, bromuro de glucopirronio, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, acefilina, ambufilina, bamifilina, doxofilina, enprofilina, etamifilina, proxifilina, teobromina, teofilina, aminofilina, teofilinato de colina, ibudilast, roflumilast, eprozinol, fenspirida, epinefrina, hexoprenalina, isoprenalina, isoproterenol, orciprenalina, metaproterenol, o atropina, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados, o cualquier combinación de los mismos,
    y en donde el fármaco contra EPOC es más preferiblemente roflumilast.
    12. Un fármaco contra enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) para uso en tratar EPOC en un sujeto que padece EPOC estable, en donde el sujeto se ha identificado en un método como se define en la reivindicación 6 o en cualquiera de sus reivindicaciones dependientes 7 a 9 como que es propenso a desarrollar EPOC progresiva que implica la aparición de daño pulmonar irreversible,
    en donde el fármaco contra EPOC es preferiblemente bitolterol, carbuterol, fenoterol, pirbuterol, procaterol, reproterol, rimiterol, salbutamol, levosalbutamol, terbutalina, tulobuterol, arformoterol, bambuterol, clembuterol, formoterol, olodaterol, salmeterol, indacaterol, beclometasona, betametasona, budesónida, ciclesonida, flunisolida, fluticasona, mometasona, triamcinolona, bromuro de aclidinio, bromuro de glucopirronio, bromuro de ipratropio, bromuro de oxitropio, bromuro de tiotropio, acefilina, ambufilina, bamifilina, doxofilina, enprofilina, etamifilina, proxifilina, teobromina, teofilina, aminofilina, teofilinato de colina, ibudilast, roflumilast, eprozinol, fenspirida, epinefrina, hexoprenalina, isoprenalina, isoproterenol, orciprenalina, metaproterenol, o atropina, o una sal farmacéuticamente aceptable de cualquiera de los agentes anteriormente mencionados, o cualquier combinación de los mismos,
    y en donde el fármaco contra EPOC es más preferiblemente roflumilast.
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