ES2844432T3 - Método de predicción de la mortalidad debido al tratamiento con agentes estimulantes de la eritropoyesis - Google Patents

Abstract

Un metodo in vitro para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con un agente estimulante de la eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un resultado fatal o adverso tras el tratamiento continuado con ESA, el metodo comprende las etapas de: (a) Proporcionar las muestras de pacientes del paciente de al menos dos momentos, (b) Determinar a partir de dichas muestras la tasa de degradacion individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] para dicho paciente, (c) Determinar a partir de dicha tasa de degradacion de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] el numero de sitios de union de ESA [EpoR] para dicho paciente, (d) Determinar a partir de (i) la tasa de degradacion individual de la Hb, (ii) el numero de sitios de union de ESA y (iii) la ultima dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA planeada/calculada para la administracion, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF] determinado de acuerdo con la siguiente formula (1): (1) [aRF]=Bo+B1*[EpoR]+B2*[Hb degr]+B3*[ESA] (e) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF], en donde el paciente tiene un alto riesgo si el [aRF] es 0,1 o superior.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de predicción de la mortalidad debido al tratamiento con agentes estimulantes de la eritropoyesis Campo de la invención

La presente invención se refiere al diagnóstico de un alto riesgo de mortalidad u otros eventos adversos en un paciente que padece anemia, por ejemplo, anemia causada por la quimioterapia, el cáncer o la inflamación crónica tal como la enfermedad renal crónica (CKD). La invención proporciona los medios para diagnosticar a un paciente que recibe Agentes Estimulantes de la Eritropoyesis (ESA) y sufre un evento adverso si se continúa el tratamiento con ESA. Sobre la base de los métodos descritos en la presente descripción, el médico podrá diagnosticar la prevalencia de un evento fatal y ajustar el tratamiento de la anemia en el paciente en consecuencia.

Descripción

Muchas citocinas actúan sistémicamente, se unen a receptores de la superficie celular en células diana específicas y desencadenan su supervivencia, proliferación y diferenciación. De esta manera se producen células altamente especializadas que cumplen funciones esenciales en un organismo. Por tanto, las alteraciones en las respuestas celulares pueden tener importantes consecuencias a escala corporal. A la inversa, múltiples citocinas o sus derivados se explotan como agentes terapéuticos y se aplican sistémicamente para provocar respuestas celulares y aliviar estados patológicos. Varias reacciones no lineales contribuyen a este intrincado circuito y determinan el resultado. Por lo tanto, se requiere un enfoque racional para el diseño de un tratamiento optimizado, que requiere conocimientos detallados de los mecanismos moleculares y el desarrollo de un concepto de modelado matemático que abarque desde la escala celular hasta la corporal.

Una citoquina terapéuticamente relevante es la hormona eritropoyetina (Epo). Las interacciones dinámicas de la Epo con su receptor afín, el receptor de la eritropoyetina (EpoR), determinan la proliferación de células progenitoras eritroides en el estadio de unidad formadora de colonias eritroides (CFU-E) y su diferenciación a eritrocitos maduros de corta vida que contienen hemoglobina (Hb) y asegurar el suministro de oxígeno en el cuerpo. Los niveles bajos de eritrocitos que corresponden a valores reducidos de Hb son característicos de la anemia en todas las edades. Por ejemplo, la anemia se observa con frecuencia en pacientes con cáncer de pulmón y CKD, llegando hasta el 90 % en los estadios avanzados de la enfermedad. La anemia reduce la calidad de vida, aumenta el riesgo de mortalidad y disminuye, por ejemplo, los efectos quimioterapéuticos. Para el tratamiento de la anemia, se usan ampliamente agentes estimulantes de la eritropoyesis (ESA) tales como Epo o derivados de la Epo producidos de forma recombinante.

Sin embargo, en el contexto de la anemia asociada al cáncer, el tratamiento con ESA se discute de manera controvertida porque los ensayos clínicos se terminaron debido a efectos adversos y se informó que el EpoR estaba presente en las células tumorales. Aparentemente, los niveles de EpoR en las líneas celulares de carcinoma son mucho más bajos en comparación con la expresión en hCFU-E y su detección precisa sigue siendo un desafío. Debido a la disminución de la funcionalidad del riñón que produce Epo, el tratamiento con ESA se vuelve inevitable en pacientes con CKD. Sin embargo, la progresión de la enfermedad es muy dinámica y, por lo tanto, pueden producirse fluctuaciones importantes en los niveles de Hb que afectan gravemente el bienestar de los pacientes y se correlacionan en gran medida con un mayor riesgo de eventos adversos y mortalidad (Regidor 2006, Yang 2007, Singh 2006).

El 30-50 % de los pacientes con cáncer de pulmón no responden al tratamiento con ESA. Se han desarrollado modelos de regresión lineal o logística para predecir las respuestas de los pacientes a partir de marcadores clínicos. Sin embargo, ninguno de los parámetros de referencia evaluados o su combinación mostró suficiente sensibilidad para la predicción individualizada de la respuesta. Se realizaron intentos similares para identificar parámetros con valores predictivos para la evaluación del riesgo de eventos tromboembólicos y mortalidad. Los estudios realizados en cáncer y CKD describieron una correlación general de la hiporreactividad al tratamiento con ESA con dosis altas de ESA y la mortalidad. Sin embargo, debido a la falta de parámetros específicos del paciente que faciliten la predicción individualizada de las respuestas a ESA, hasta el momento no ha sido posible realizar la estratificación del riesgo de los pacientes.

Con base en los datos de los ensayos clínicos, se desarrollaron modelos matemáticos que describieron las respuestas farmacocinéticas (PK) y farmacodinámicas (PD) medias al tratamiento con ESA a escala corporal. Sin embargo, ninguno de estos modelos matemáticos contenía reacciones bioquímicas a escala celular. Los inventores han informado recientemente de un modelo de vía dinámica cuantitativa, que describe la interacción dinámica de la Epo con el EpoR murino (mEpoR) y, por lo tanto, descubrieron que la rápida renovación del receptor permite que el sistema responda a una amplia gama de dosis de ligando. La unión del ligando al receptor provoca la activación de vías de señalización, incluida la cascada de señalización JAK2-STAT⁵. Mediante el modelado de vías dinámicas, los inventores demostraron que el grado de fosforilación de STAT⁵ inducida por la Epo se relaciona linealmente con la supervivencia celular de las células CFU-E y que la estimulación con la Epo mejora la supervivencia de la línea celular H838 de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) tras el tratamiento con el agente quimioterapéutico cisplatino. Los modelos matemáticos a escala celular proporcionan conocimientos mecánicos y facilitan las predicciones cuantitativas y, por lo tanto, podrían proporcionar módulos esenciales para el desarrollo de modelos predictivos multiescala para la estratificación de los pacientes, la predicción de riesgos y la optimización de la terapia.

El carcinoma de pulmón es la causa más frecuente de muerte por cáncer con 1,59 millones de muertes en 2012, de las cuales el 80 % se diagnosticó como carcinoma de Pulmón de Células no Pequeñas (NSCLC). La mayoría de los pacientes se diagnostican en un estadio IIIB o IV y se tratan con una combinación de compuestos de platino y taxanos, gemcitabina o vinorelbina como primera línea de tratamiento. En el carcinoma de pulmón existe una alta prevalencia de anemia ([Hb] <11 g/dl), que va del 50 al 70 %, aunque en estadios avanzados puede llegar hasta el 90 %. El grado de anemia depende de la terapia, el estadio del tumor y la duración de la enfermedad. La anemia relacionada con el cáncer reduce la calidad de vida (Cella y otros, 2004) y se considera un factor de riesgo de mortalidad en pacientes con cáncer (Caro 2001). Además, se ha informado que la anemia afecta el resultado de la terapia contra el cáncer, disminuyendo la respuesta a la quimioterapia en los pacientes con NSCLC (Albain 1991, MacRae 2002 y Robnett 2002).

La etiología de la anemia en el cáncer es compleja por causas multifactoriales tales como las deficiencias de vitamina B12 y ácido fólico, el sangrado, la hemólisis, las citocinas inflamatorias secretadas en el contexto tumoral y la reducción de la captación de hierro (Weiss y Goodnough N. Engl. J Med 2005) son algunos de los orígenes causales de la anemia relacionada con el cáncer. Además, la quimioterapia a base de platino inhibe la producción renal de Epo y ejerce mielosupresión, lo que aumenta la anemia (Groopman1999, Kosmidis 2005, Ludwig2004). Se estima que entre el 8-16 % de la población en todo el mundo sufre en algún grado de CKD (Jha 2013). La anemia es muy prevalente en los estadios avanzados de los pacientes con CKD. La transfusión de sangre no es una opción para tratamientos a largo plazo como se requiere en el contexto de la CKD, ya que sensibilizaría el sistema inmunológico y reduciría las posibilidades de que los pacientes reciban un trasplante de riñón. Más bien, los pacientes con CKD deben ser tratados con ESA. Para garantizar el bienestar de estos pacientes, es importante mantener constantes los niveles de Hb. Desafortunadamente, la dinámica de múltiples factores de la enfermedad, tales como los cambios en el estado de la inflamación o la disponibilidad de hierro, aumentan la heterogeneidad de la respuesta a ESA entre los pacientes con CKD.

El documento WO 2015/193462 describe modelos matemáticos para la predicción de concentraciones de ESA para el uso en el tratamiento de la anemia. La presente invención es un desarrollo adicional con base en la enseñanza técnica del documento WO 2015/193462.

En vista de los problemas existentes del tratamiento con ESA de la anemia causada por cáncer, quimioterapia, CKD, inflamación crónica u otros trastornos primarios, fue un objeto de la presente invención proporcionar un enfoque de diagnóstico para identificar a los pacientes que tienen un mayor riesgo de mortalidad u otros eventos adversos (tales como eventos cardiovasculares) tras el tratamiento con ESA.

La invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

En un aspecto, el problema anterior se resuelve mediante un método para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con agentes estimulantes de la eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un resultado fatal y/o adverso tras el tratamiento continuado con ESA, el método comprende las etapas de:

(a) Proporcionar muestras de pacientes del paciente de al menos dos momentos durante el tratamiento inicial de la anemia con ESA en dicho paciente,

(b) Determinar a partir de dichas muestras la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] y el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente,

(c) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación individual de la Hb, (ii) el número de sitios de unión de ESA y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA planeada/calculada para la administración, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF], y

(d) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF].

En un aspecto adicional, el problema anterior se resuelve mediante un método para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con Agentes Estimulantes de la Eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un resultado adverso o fatal tras el tratamiento continuado con ESA, el método comprende las etapas de:

(a) Proporcionar las muestras de pacientes del paciente de al menos dos momentos,

(b) Determinar a partir de dichas muestras la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] para dicho paciente,

(b') Determinar a partir de dicha tasa de degradación de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente,

(c) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación individual de la Hb, (ii) el número de sitios de unión de ESA y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA planeada/calculada para la administración, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF], y

(d) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF].

En modalidades preferidas, el evento adverso se selecciona de un resultado fatal tal como la muerte del paciente, preferentemente la muerte del paciente causada por el tratamiento con ESA. En otras modalidades, el evento adverso se selecciona de eventos trombovasculares.

El método se realiza preferentemente in vitro.

El [aRF] se determina mediante una combinación lineal de (i) la tasa de degradación individual de Hb, (ii) el número de sitios de unión de ESA y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA planeada/calculada para administrar. Preferentemente, de acuerdo con la siguiente ecuación A:

Ecuación A: [aRF]=Bo+B1*[EpoR]+B2*[Hb degr]+B3*[ESA].

En aspectos preferidos, los factores de la ecuación A anterior son B0=2,3518, B1=-2,5840, B2=-0,3957 y B³=-0,1374. Preferentemente, los factores pueden variar según la situación, pero no más del /- 20 %, 1 %, 10 % y preferentemente no más del 5 % del valor indicado anteriormente. Estos son particularmente útiles en el caso de que el paciente sea tratado con CERA u otros ESA y padezca NSCLC.

En algunas modalidades, los factores de la ecuación A anterior son Bo=-2,1927, B1=0,5392, B2=-0,82877, B³=0,0046426. Preferentemente, los factores pueden variar según la situación, pero no más del /- 20 %, 1 %, 10 % y preferentemente no más del 5 % del valor indicado anteriormente. Estos son particularmente útiles en el caso de que el paciente sea tratado con ESA y padezca CKD.

En modalidades preferidas de la invención, un paciente tiene un alto riesgo de experimentar un evento adverso si [aRF] es 0,1 o mayor, preferentemente 0,15 o mayor, o 0,17 o mayor, y lo más preferentemente en donde [aRF] es > aproximadamente 0,18.

En otras modalidades preferidas de la invención, un paciente tiene un alto riesgo de experimentar un evento adverso si [aRF] es 0,1 o mayor, preferentemente 0,2 o mayor, o 0,3 o mayor, y con mayor preferencia en donde [aRF] es > aproximadamente de 0,37. Este es el caso de los pacientes con c Kd .

En el contexto de la presente invención, el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para el paciente se determina mediante la evaluación del aclaramiento del ESA administrado en el suero de dicho paciente a lo largo del tiempo, y mediante el cálculo a partir del aclaramiento de dicho ESA mediante el uso de un modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R la cantidad de sitios de unión de ESA en dicho paciente [EpoR]. Los modelos se describen en la presente descripción más abajo.

Se prefieren los métodos en donde la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] se determina mediante el cálculo a partir de la concentración de hemoglobina del paciente desde al menos dos momentos separados la tasa de degradación individual de la hemoglobina del paciente (degradación de la hemoglobina por tiempo).

En modalidades preferidas, dicho modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R se basa en un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE) como se describe en la presente descripción más abajo. En el contexto de la invención descrita en la presente descripción, la concentración de hemoglobina del paciente (o sujeto, los términos que se usan en la presente descripción como sinónimos) se determina preferentemente a través de muestras de sangre tomadas del paciente. Los métodos para calcular las concentraciones de hemoglobina son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, dado que la mayoría de los pacientes con anemia tienen un historial de tratamiento donde se determinaron las concentraciones de hemoglobina en múltiples momentos, la tasa de degradación de la hemoglobina del paciente puede calcularse a partir de estos valores tomados del expediente médico del paciente individual.

La tasa de degradación de la hemoglobina puede determinarse midiendo las concentraciones de hemoglobina en el paciente en varios momentos, por ejemplo, en un paciente que no ha recibido ESA o que recibe ESA, o mediante el uso del historial de tratamiento previo del paciente. De acuerdo con el modelo matemático descrito en la presente descripción, las características específicas de ESA que se usará en terapia, por ejemplo, CERA, Epo alfa, Epo beta, NESP, pero también se incluyen biosimilares en la invención, se usan para determinar la dosis de ESA.

Basado en los experimentos iniciales in vitro (experimentos de agotamiento de ESA) como se describe en la sección de ejemplos, el modelo matemático que se detalla describe las propiedades de unión de cada ESA: la tasa de asociación "k^asociación" y la tasa de disociación "k^disociadón" (la constante de disociación "K^d " se define como kdisociación/kasociación). Basado en las propiedades de unión de cada ESA, el modelo descrito en la presente descripción puede calcular la ocupación integral del EpoR en CFU-E humana durante 60 minutos. La EC⁵⁰ (concentración de ESA requerida para obtener la mitad de la ocupación máxima de EpoR) se calcula para cada ESA y esto se correlaciona con la actividad de ESA en hCFU-E. En el modelo integrador farmacocinético dinámico no lineal de la hemoglobina (Hb) de la vía ESA-EPO-R, la ocupación integral del ESA-EpoR está relacionada con la producción de Hb. La cantidad de ESA-EpoR es, entre todos los demás parámetros, en función de la tasa de k^asociación y k^disociación del ESA específico. Basado en los experimentos de agotamiento de ESA, el modelo matemático calcula k^asociación y k^disociación para cada ESA. Estos datos pueden usarse (i) para calcular los valores de EC⁵⁰ para cada ESA y (ii) calcular los valores de Hb basados en inyecciones de ESA. Por lo tanto, mediante el uso del modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la hemoglobina (Hb) de la vía ESA-EPO-R de la invención, puede ser calculada la dosis de ESA para lograr una producción de hemoglobina en el paciente con anemia que sea suficiente para aliviar la anemia.

El término "anemia" en el contexto de la invención descrita en la presente descripción se referirá a una afección en donde se reducen los glóbulos rojos. La anemia generalmente se diagnostica mediante un hemograma completo. Además de informar el número de glóbulos rojos y el nivel de hemoglobina, los contadores automáticos también miden el tamaño de los glóbulos rojos mediante citometría de flujo, que es una herramienta importante para distinguir entre las causas de la anemia. El examen de un frotis de sangre teñido con un microscopio también puede ser útil y, a veces, es una necesidad en regiones del mundo donde el análisis automatizado es menos accesible. En los contadores modernos, se miden cuatro parámetros (recuento de glóbulos rojos, concentración de hemoglobina, MCV y RDW), lo que permite calcular otros (hematocrito, MCH y MCHC) y compararlos con valores ajustados por edad y sexo. Algunos contadores estiman el hematocrito a partir de mediciones directas. En el contexto de la presente invención, la anemia está presente si un individuo tiene una concentración de hemoglobina (Hb) de menos de 14 g/dl, con mayor preferencia de menos de 12 g/dl, con la máxima preferencia de menos de 11 g/dl.

En determinadas modalidades de la invención, la anemia que va a tratarse de acuerdo con los métodos descritos es una anemia que se ha desarrollado de acuerdo con cualquier posible causa o enfermedad. Esto incluye todos los tipos de cáncer, toda la anemia asociada a la inflamación (enfermedad infecciosa crónica, trastornos autoinmunitarios o reumatológicos y cualquier otra enfermedad o tratamiento que produzca anemia basada en la reducción de la producción de Epo endógena, eritropoyesis ineficiente o mayor destrucción de glóbulos rojos). Además, y particularmente preferido, es que la anemia es causada por quimioterapia, enfermedad renal crónica (CKD), síndrome mielodisplásico (MDS), o es anemia asociada a mielofibrosis, anemia en el contexto de HIV, anemias aplásicas, anemia en bebés prematuros, anemia aplásica no severa, anemia en la beta talasemia, anemia en la anemia de células falciformes y estimulación de la eritropoyesis por ESA después de un trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas.

Los inventores de la presente invención descubrieron previamente que un modelo matemático que describe la vía de señalización de EPO-EPO-R en una célula puede adaptarse para predecir el comportamiento no solo de los ESA en una célula, sino también de la dinámica de los ESA administrados a un paciente, preferentemente un paciente con anemia asociada a una enfermedad crónica. Inicialmente el modelo es capaz de describir a nivel celular la actividad de los diferentes ESA en función de la afinidad de cada ESA (tiempo de ocupación del EpoR). Esta actividad corresponde a la activación de EPO-R por unión de ESA al receptor de EPO. Esta activación del EPO-R inducirá la proliferación y maduración de los eritroprogenitores, la principal población celular del cuerpo que expresa EpoR en los eritrocitos. Para la presente invención se amplió el modelo de núcleo inicial que describe la activación de EpoR a nivel celular por ESA para su uso en una situación fisiológica en un organismo, en particular un paciente humano. El aclaramiento del ESA administrado en el compartimento sanguíneo, el transporte del ESA administrado por vía subcutánea al compartimento sanguíneo y el aclaramiento saturable del ESA en el compartimento intersticial se añadieron al modelo inicial. Esta versión extendida del modelo inicial ESA-EPO-R fue sorprendentemente capaz de describir los datos experimentales de farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) publicados de cada ESA como se muestra en los ejemplos. Los inventores pudieron caracterizar la anemia inducida por cáncer y la quimioterapia, así como también CKD, en pacientes individuales en la unidad formadora de colonias de eritroides (CFU-E), los progenitores de los eritroides. Se observó que los pacientes en el mismo tipo de cáncer y estadio de la enfermedad (figura 5c) muestran diferentes números de CFU-E. Esto explica los diferentes resultados del tratamiento con ESA observados en los pacientes: el 40 % de los pacientes con NSCLC no responden al tratamiento con ESA en la posología aprobada actualmente (protocolo para el tratamiento de pacientes anémicos con cáncer). En el caso de CKD el modelo podría describir la heterogeneidad entre los pacientes (figura 10), explicando también la variabilidad en la respuesta a los tratamientos con ESA (figura 11). Los niveles más bajos de CFU-E significan niveles más bajos de la respuesta a los tratamientos con ESA y se correlacionó con los resultados individuales en los niveles de hemoglobina (Hb). Ahora, en el contexto de la presente invención, fue sorprendente que el uso del número de sitios de unión de EPO y la tasa de degradación de la hemoglobina de un paciente en combinación con una dosis de tratamiento de ESA planificada permite predecir adecuadamente si el paciente sufrirá un evento fatal debido al tratamiento ESA. El uso de los métodos de la invención permite al médico decidir si continuar o no un tratamiento con ESA en un paciente anémico, o si es mejor recurrir a transfusiones de sangre. Los cálculos básicos del factor de riesgo acumulado se proporcionan en la presente descripción más abajo.

En el contexto de la invención que se describe a continuación, los modelos matemáticos se basan todos en los hallazgos básicos publicados y accesibles al público en la publicación Becker V y otros, Science. 2010 Jun 11;328(5984):1404-8 y la publicación WO 2015/193462. Los modelos usados en el contexto de la presente invención se ajustaron para responder a las preguntas respectivas de la invención descrita en la presente descripción. A este respecto, el término "modelo dinámico no lineal de la vía EPO-EPO-R" se referirá al modelo publicado por Becker V y otros. Referencia 2010. El término "modelo dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R" se referirá a la versión del modelo dinámico no lineal de la vía EPO-EPO-R en el documento WO 2015/193462, que describe la dinámica de unión/disociación de los ESA a la EPO-R a nivel celular. El término "modelo farmacocinético dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R" se referirá al modelo farmacocinético dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R en el documento WO 2015/193462 que se ajusta a la situación en un organismo, en particular un paciente ser humano. Los fundamentos básicos de los modelos descritos en la presente descripción se proporcionan en la sección de Materiales y Métodos de la presente solicitud.

Por lo tanto, es una modalidad preferida que el modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R considere el aclaramiento del ESA administrado en el compartimento sanguíneo, el transporte del ESA administrado desde el compartimento intersticial al compartimento sanguíneo y el aclaramiento del ESA en el compartimento intersticial.

La aplicación básica de los métodos matemáticos requerida por los métodos inventivos descritos en la presente descripción es estándar para la persona experta en el campo de la biología de sistemas. Mediante el uso de la información proporcionada por la presente solicitud de patente, la persona experta en vista también de la publicación de 2010 de Becker V y otros, puede realizar las etapas necesarias para trabajar la invención.

Para la presente descripción se usan las siguientes variables, constantes y siglas:

Tabla 1: Siglas

Tabla 2: Variables

Tabla: Constantes cinéticas

Los modelos descritos en la presente solicitud se basan en las siguientes ecuaciones diferenciales ordinarias con referencia a la figura 6. Este modelo describe el siguiente esquema de reacción que se basa en conocimientos biológicos previos. ESA se une reversiblemente (k^asociación respectivamente k^disociación) al receptor Epo (EPO-R) que está expuesto en la superficie celular. De ese modo, el complejo del receptor ESA se activa y puede inducir la fosforilación de moléculas de señalización aguas abajo como STAT⁵. A continuación, el complejo ESA-receptor se internaliza (k^e) en grupos de receptores intracelulares donde el ESA se exporta (k^ex) o se degrada (k^de y k^di) y el receptor puede translocarse de nuevo a la membrana (k^ex). Además, una renovación (k^t) del EpoR independiente del ligando asegura que la célula sea sensible a una amplia gama de concentraciones de ligando. En las ecuaciones [] denotan concentraciones de los componentes respectivos. Estos son, EpoR o EPO-R es el receptor de EPO, ESAEpoR es el complejo de ESA unido al EPO-R. ESAEpoRi es el complejo internalizado. dESA se degrada a ESA, ya sea internamente en la célula (dESAi) o extracelularmente (dESAe). Las ecuaciones son:

(1.3) d [ESAEpoRi _ kasocj ac¡¿ n . [esa] . [EpoR] ^disociación ■ [ESAEpoR] íce * [ESAEpoR] dr

d [ESAEpoRi:

(1.4) dt = íce ■ [ESAEpoR] — kex- [ESAEpoRi] — ícdi - [ESAEpoRi] ícde - [ESAEpoRi]

(1.5) dldESAi:

_df = ícdi ■ [ESAEpoRi]

(1.6) d[d^ Ag~ = fede • [ESAEpoRi]

Para el modelo que simula la situación del paciente in vivo, este modelo se amplía dando como resultado un sistema de siete ecuaciones diferenciales ordinarias acopladas (EDO). El modelo ampliado en la figura (6b) describe la situación, incluidos los compartimentos sanguíneo e intersticial. El ESA intravenoso se aclara en el compartimento sanguíneo (k^aciaram) o se une al EPO-R (k^asociación, k^disociación). ESA aplicado por vía subcutánea (ESA^{s c} ) se transporta al compartimento sanguíneo (k^sc_fuera) o se aclara de forma saturada en el compartimento intersticial (k^{sc_aciaram_sat}). El modelo farmacocinético dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R:

^{d [ESASC:} [ESASC;

(2.1.) = —ksc aclaram _dr iksc_aclaram _sat [ESASC; i — ksc fuera - [ESASC]

ícaclaram • [ESA] — ^asociación • [ESA] • [EpoR] ícdisodación •

]

d[EpoRl

(2.3.) _dr = — ícasociación ■ [ESA] ■ [EpoR] ícdisodación ■ [ESAEpoR] kt ■ Srnáx — k t ■ [EpoR] ices [ESAEpoRi]

(2-4) d[ESA_dE_fpoR- = ícasociación ■ [ESA] • [EpoR] - ícdisodación • [ESAEpoR] - íce • [ESAEpoR]

fedi . [ESAEpoRi] - ícde ■ [ESAEpoRi]

(26 ) diESAi.

= ícdi ■ [ESAEpoRi]

dr

dLESAel

(2.7.) = ícde ■ [ESAEpoRi]

dr

Dado que la cantidad de hemoglobina (Hb) en el suero de un paciente está directamente correlacionada con la actividad del sistema ESA-EPO-R, la invención puede, en lugar de determinar la concentración de ESA después de la administración inicial de ESA en función del tiempo, determinar la concentración de Hb, que es un parámetro estándar observado durante el tratamiento de la anemia. En esta modalidad, el modelo anterior comprende las reacciones adicionales de producción de Hb por el ESA-EPO-R activado (kHb_pro) y la degradación específica del paciente de Hb (kHb_deg).

En este caso, el modelo incluye la EDO adicional:

dlHbl

(2.8.) = W b pro ■ [ESAEpoR] - kHbgrDáDS ■ [Hb]

Para ambos modelos, la constante de disociación Kd se define como

(3.1) R d — ^disociación/^ asociación

En estos modelos, Bmáx es el número inicial de sitios de unión para ESA.

En la sección de ejemplos y en la figura 6 se proporciona una explicación más detallada de las ecuaciones.

Los valores para las concentraciones respectivas de los elementos y todas las constantes usadas en las ecuaciones anteriores pueden determinarse experimentalmente mediante el uso, por ejemplo, de un método conocido por el experto o los métodos proporcionados en la presente descripción más abajo en la sección de ejemplos.

De acuerdo con la presente invención, una dosis clínicamente segura de un ESA es una dosis aprobada por las autoridades para el tratamiento de la anemia.

En los métodos descritos en la presente descripción se determina la tasa de aclaramiento de ESA en el suero de un paciente. Preferentemente, y esto es cierto para todos los aspectos y modalidades como se describe en la presente descripción, la tasa de aclaramiento (o cambio de concentración) de dicho ESA se determina basándose en la dosis inicial de ESA administrada a un paciente. Después de la administración inicial de ESA, las muestras obtenidas de un paciente pueden analizarse para determinar la concentración restante de ESA durante al menos un momento posterior al tratamiento inicial de ESA. Idealmente, la concentración de ESA se observa en varios momentos, por ejemplo, de 1 a 6 semanas, preferentemente de 1 a 3 semanas, e incluye al menos 2, preferentemente 5, más preferentemente de 7 a 10 mediciones independientes de la concentración de ESA en diferentes puntos de tiempo. Un ejemplo de plan de observación sería la administración de ESA el día 0 y la posterior medición de la concentración de ESA en el paciente los días 1, 2, 3, 5, 7, 10 y 14. Esto puede ajustarse en dependencia del escenario clínico. Para la modalidad alternativa de la invención con respecto al cálculo de los sitios de unión de ESA iniciales basado en la observación del cambio de concentración de Hb en un paciente, se aplica el mismo principio. En una determinada modalidad de la invención, ESA es cualquier ESA conocido por el experto, que incluye en particular biosimilares de la EPO, pero se selecciona preferentemente del grupo de Epoyetina alfa, Epoyetina beta, Nueva proteína estimulante de la eritropoyesis (NESP) y Activador continuo del receptor de la eritropoyetina (CERA). Se prefiere CERA para la invención descrita en la presente descripción.

Preferentemente, el cálculo se basa además en la dosis inicial de ESA y la concentración inicial de Hb en el paciente en el momento en que se administró el ESA.

En el contexto de la invención descrita en la presente descripción, un paciente es preferentemente un paciente que padece anemia en el contexto de CKD, enfermedad cancerosa o quimioterapia, siendo la enfermedad cancerosa preferentemente un cáncer de pulmón tal como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

En modalidades preferidas, el modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R se basa en un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE) como se describió anteriormente. En este contexto, la invención busca obtener el número inicial de sitios de unión de ESA, que es Bmáx. Por tanto, Bmáx es predictivo o una aproximación de las unidades formadoras de colonias eritroides (CFU-E).

El problema de la invención se resuelve adicionalmente mediante un método implementado por ordenador, preferentemente realizado in silico, para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con Agentes Estimulantes de la Eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, el método comprende las etapas de: (a) Obtener la dosis inicial de ESA administrada de dicho paciente y la tasa de degradación de la hemoglobina [Hb degr] de dicho paciente (véase más arriba cómo obtener la tasa de degradación de la Hb de un paciente), (b) Obtener la concentración de dicho ESA en una muestra de suero de dicho paciente al menos un segundo momento después de la administración inicial de dicho ESA a dicho paciente.

(c) Determinar la tasa de concentración de dicho ESA en función del tiempo en dicho paciente

(d) Calcular en base a un modelo farmacocinético no lineal (PK) ESA-EPO-R como se describe en la presente descripción anteriormente y la tasa de concentración de dicho ESA en dicho paciente el número inicial de sitios de unión de ESA [EpoR] en dicho paciente,

(e) Calcular a partir de (i) la tasa de degradación de la Hb del paciente, (ii) el número de sitios de unión de ESA, y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA que se planea administrar, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF], y

(f) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF].

El [aRF] se determina mediante una combinación lineal de (i) la tasa de degradación individual de Hb, (ii) el número de sitios de unión de ESA y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA planeada/calculada para administrar. Preferentemente, de acuerdo con la ecuación A como se describe en la presente descripción:

En aspectos preferidos, por ejemplo, preferentemente para el cáncer, los factores de la ecuación anterior A son Bo=2,3518, B1=-2,5840, B2=-0,3957, y B³=-0,1374. Preferentemente, los factores pueden variar según la situación, pero no más del /- 20 %, 1 %, 10 % y preferentemente no más del 5 % del valor indicado anteriormente. Estos son particularmente útiles en el caso de que el paciente sea tratado con CERA, o también en algunas otras modalidades con Epo alfa, Epo beta, NESP y padezca NSCLC.

En modalidades preferidas de la invención, un paciente tiene un alto riesgo de experimentar un evento adverso si [aRF] es 0,1 o mayor, preferentemente 0,15 o mayor, o 0,17 o mayor, y lo más preferentemente en donde [aRF] es > aproximadamente 0,18. Este es en particular el caso de un paciente con cáncer.

En el caso de CKD, los factores de la ecuación A anterior son Bo=-2,1927, B1=0,5392, B2=-0,82877, and B3=-0,0046426. Estos son particularmente útiles en caso de que el paciente sea tratado con CERA, Epo alfa, Epo beta, NESP y padezca CKD.

En modalidades preferidas de la invención, un paciente con CKD tiene un alto riesgo de experimentar un evento adverso si [aRF] es > aproximadamente 0,37.

Otro aspecto más de la descripción proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene almacenadas instrucciones ejecutables por ordenador que, cuando se ejecutan, hacen que un ordenador lleve a cabo un método implementado por ordenador de acuerdo con la presente invención.

Sin embargo, se prefiere el método anterior en donde dicho organismo es un paciente, preferentemente un paciente humano, o en donde dicha célula es una célula que expresa de forma endógena el receptor de EPO-R, tal como una célula precursora de glóbulos rojos o una célula tumoral.

Otro aspecto más de la invención de la descripción proporciona un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene almacenadas instrucciones ejecutables por ordenador que, cuando se ejecutan, hacen que un ordenador lleve a cabo un método implementado por ordenador de acuerdo con la presente invención.

En modalidades preferidas de todos los aspectos de la invención, la Kd de ESA es aproximadamente 16 pM para Epoetina alfa, aproximadamente 17 pM para Epoetina beta, aproximadamente 789 pM para NESP y aproximadamente 982 pM para CERA.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x ± 20 %, x ± 15 %, x ± 10 %, x ± 5 %, o con la máxima preferencia x ± 2 %. Preferentemente, todos los valores numéricos de la presente descripción permiten una variación de x ± 5 %, donde x es el valor numérico.

En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un agente estimulante de la eritropoyesis (ESA) para el uso en el tratamiento de la anemia, el tratamiento comprende las etapas de

(a) Determinar si un paciente que padece anemia tiene un alto riesgo o bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento con ESA mediante el uso de un método de acuerdo con la invención descrito en la presente descripción, y

(b) Si el paciente tiene un bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento con ESA, administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un ESA.

En una modalidad preferida, el evento adverso es un resultado fatal, tal como la muerte del paciente. En otras modalidades, se selecciona un evento adverso de cualquier evento no deseado durante el tratamiento que reduzca la calidad de vida o incluso constituya un evento potencialmente mortal como edema pulmonar, hipertensión, infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca, arritmia, hipotensión y embolia pulmonar que podría conducir a un resultado fatal tal como la muerte del paciente.

El modelo dinámico no lineal de la vía de la Hb ESA-EPO-R usado en este aspecto tiene en cuenta las reacciones adicionales de la producción de Hb basadas en el complejo ESA-EPO-R activo y la degradación individual de la Hb del paciente.

También se proporciona en el contexto de la invención un ESA para el uso en el tratamiento de la anemia en un paciente, en donde el paciente tiene un bajo riesgo de un acontecimiento adverso tras el tratamiento continuado con ESA. El riesgo se determina de acuerdo con un método de diagnóstico de estratificación como se describe en la presente descripción en otra parte. El tratamiento de la anemia de acuerdo con la invención en algunas modalidades comprende la obtención de muestras de sangre de dicho paciente en las primeras 1 a 5 semanas del tratamiento con ESA, y calcular a partir de ellas el riesgo individual del paciente de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, como de describe en la presente descripción en otro lugar.

En algunas otras modalidades, la invención puede aplicarse sin un tratamiento previo con ESA mediante el cálculo del número de sitios de unión de ESA con la tasa de degradación de la hemoglobina.

En otro aspecto, también se proporciona un método para tratar a un paciente que padece anemia asociada con una enfermedad cancerosa, anemia inducida por quimioterapia o anemia asociada con inflamación crónica, el método comprende las etapas de

(a) Administrar al paciente una dosis baja de ESA durante las primeras 1 a 5 semanas, preferentemente 3 semanas,

(b) Obtener al menos dos muestras del paciente durante las primeras 1 a 5 semanas, preferentemente 3 semanas,

(c) Determinar a partir de dichas al menos dos muestras el riesgo del paciente de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA,

(d) Administrar al paciente ESA después de las primeras 1 a 5 semanas si el paciente tiene un bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, o

(e) Administrar al paciente una transfusión de sangre después de las primeras 1 a 5 semanas si el paciente tiene un alto riesgo de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA.

En otros aspectos de la invención, el método también puede combinar transfusiones de sangre con un régimen de ESA de bajo riesgo. Con este enfoque, las transfusiones de sangre se mantienen al mínimo, ahorrando unidades de sangre y reduciendo los eventos adversos inducidos por un gran número de unidades de sangre transfundidas en un paciente.

En modalidades preferidas, en la etapa (c), el riesgo del paciente de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA se determina mediante un método de estratificación como se describe anteriormente en la presente descripción.

El término "tratamiento", como se usa en la presente descripción, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad o afección (por ejemplo, anemia) en un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye: (i) prevenir que la enfermedad o afección ocurra en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero aún no se ha diagnosticado que la tenga; (ii) inhibir la enfermedad o afección, es decir, detener su desarrollo; o (iii) aliviar la enfermedad o afección, es decir, provocar su regresión o la mejora de sus síntomas.

Como se usa en la presente descripción, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de una proteína sintética modificada con polímero estimulante de la eritropoyesis que, cuando se administra a un mamífero que lo necesita, es suficiente para efectuar el tratamiento (como se define anteriormente), por ejemplo, como inductor de la producción de glóbulos rojos, un agente antianemia, etc. La cantidad que constituye una "cantidad terapéuticamente efectiva" variará en dependencia del ESA, la afección o enfermedad y su gravedad, y el paciente a tratar, su peso, edad, género, etc., pero puede ser determinado de forma rutinaria por un experto en la técnica con respecto al conocimiento contemporáneo y a esta descripción.

La administración del ESA de la invención puede realizarse a través de cualquier vía sistémica o local aceptada conocida para el ESA respectivo, por ejemplo, vía parenteral, oral (particularmente para formulaciones infantiles), intravenosa, nasal, inhalación bronquial (es decir, formulación en aerosol), vías transdérmicas o tópicas, en forma de sólido, semisólido o líquido o formas de dosificación de aerosol, tales como, por ejemplo, tabletas, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, soluciones, emulsiones, inyectables, suspensiones, supositorios, aerosoles o similares. Los agentes estimulantes de la eritropoyesis de la invención también pueden administrarse en formas de dosificación de liberación sostenida o controlada, que incluyen inyecciones de depósito, bombas osmóticas, píldoras, parches transdérmicos (que incluyen electrotransporte) y similares, para la administración prolongada del polipéptido a una tasa predeterminada, preferentemente en formas de dosificación unitarias adecuadas para la administración única de dosis precisas. Las composiciones incluirán un portador o excipiente farmacéutico convencional y un antagonista o agonista de proteínas de la invención y, además, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, etc. Los portadores pueden seleccionarse de varios aceites, incluidos aquellos de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. El agua, la solución salina, la dextrosa acuosa y los glicoles son portadores líquidos preferidos, particularmente para soluciones inyectables. Los portadores farmacéuticos adecuados incluyen almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, creta, gel de sílice, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, cloruro de sodio, leche desnatada en polvo, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y similares. Otros portadores farmacéuticos adecuados y sus formulaciones se describen en "Remington's Pharmaceutical Sciences" de EW Martin.

Otro aspecto de la invención es además un Agente Estimulante de la Eritropoyesis (ESA) para el uso en el tratamiento de la anemia en un sujeto, el tratamiento comprende las etapas de

(a) Determinar o proporcionar concentraciones de hemoglobina en el sujeto a partir de al menos dos momentos separados y calcular a partir de ellos una tasa de degradación de la hemoglobina específica del sujeto,

(b) Determinar la concentración actual de hemoglobina en el sujeto,

(c) Calcular a partir de la tasa de degradación de la hemoglobina específica del sujeto y la concentración de hemoglobina en el sujeto, el número de sitios de unión de ESA en el paciente y la dosis de un ESA suficiente para tratar la anemia en el sujeto mediante el uso de un modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R de la hemoglobina (Hb),

(d) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación de la Hb del paciente, (ii) el número de sitios de unión de ESA del paciente y (iii) la dosis calculada de ESA suficiente para tratar la anemia en el paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF],

(e) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con la ESA de acuerdo con el [aRF],

(f) Administrar al sujeto la dosis calculada de ESA según se determina en (c) si el paciente está en un grupo de bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA,

(g) Opcionalmente, monitorear la concentración de hemoglobina en el sujeto después de la administración de ESA y ajustar la siguiente dosis de ESA mediante la repetición de las etapas (b) a (d).

En algunas modalidades, el método anterior comprende las etapas alternativas:

(d') no administración al sujeto de un ESA y, opcionalmente, administración al sujeto de una transfusión de sangre, o

(d") combinación de transfusiones de sangre con un régimen de ESA de bajo riesgo.

Con el enfoque de (d'') las transfusiones de sangre se mantienen al mínimo, ahorrando unidades de sangre y reduciendo los eventos adversos inducidos por un elevado número de unidades de sangre transfundidas en un paciente.

La presente invención se refiere además a los siguientes elementos preferidos:

Elemento 1: Método para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con Agentes Estimulantes de la Eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, el método comprende las etapas de: (a) Proporcionar muestras de pacientes del paciente de al menos dos momentos durante el tratamiento inicial de la anemia con ESA en dicho paciente,

(b) Determinar a partir de dichas muestras la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] y el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente,

(c) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación individual de la Hb, (ii) el número de sitios de unión de ESA y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA que se planea administrar, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF], y

(d) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF].

Elemento 2: El método de acuerdo con el elemento 1, en donde el [aRF] se determina de acuerdo con la siguiente ecuación (1):

(1) [aRF]=Bo+B1*[EpoR]+B2*[Hb degr]+B3*[ESA].

Elemento 3: El método de acuerdo con el elemento 1 o 2, en donde el ESA se selecciona del Activador continuo del receptor de la eritropoyetina (CERA), EPO alfa, EPO beta y proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (NESP), y preferentemente es CERA.

Elemento 4: El método de acuerdo con el elemento 2, en donde Bo=2,3518, B1=-2,5840, B2=-0,3957, and B3=-0,1374, y preferentemente en donde el paciente se estratifica en un grupo alto de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA si el [aRF] es mayor que aproximadamente 0,18.

Elemento 5: El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 4, en donde el número de los sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente está determinado por

(a) evaluar el aclaramiento del ESA administrado en el suero de dicho paciente a lo largo del tiempo, y (b) Calcular a partir del aclaramiento de dicho ESA mediante el uso del modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R de la cantidad de sitios de unión de ESA en dicho paciente [EpoR]. Elemento 6: El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 5, en donde la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] se determina mediante el cálculo a partir de la concentración de hemoglobina del paciente a partir de al menos dos momentos separados, tasa de degradación individual de la hemoglobina del paciente (degradación de la hemoglobina por tiempo).

Elemento 7: El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 6, en donde las muestras de pacientes son muestras de sangre.

Elemento 8: El método de acuerdo con el ítem 5, en donde dicho modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R se basa en un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE):

(24) —BS&gpflÜ = Jasodac^iB * [ESñ] -[E poR ]—¿disociación ■ [ESAEpoR] — íce ■ [ESAEpo R]

df

d [ESAEpoRi:

(2.5.) _dt = íce • [ESAEpoR] — ícex • [ESAEpoRi] — ícdi • [ESAEpoRi] — ícde • [ESAEpoRi]

dLESAil

(2.6.) = fcdi ■ [ESAEpoRi]

dt

diESAel

(2.7.) = fcde ■ [ESAEpoRi]

dt

y

en donde Bmáx es el número de sitios de unión de ESA.

Elemento 9: El método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 8, en donde la anemia es una anemia asociada con una enfermedad cancerosa, anemia inducida por quimioterapia o anemia asociada con inflamación crónica.

Elemento 10: Un ESA para el uso en el tratamiento de la anemia en un paciente, en donde el paciente tiene un bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA según se determina con un método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 9.

Elemento 11: El ESA para el uso de acuerdo con el elemento 10, en donde el ESA se selecciona de Activador continuo del receptor de la eritropoyetina (CERA), EPO alfa, EPO beta y proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (NESP), y preferentemente es CERA.

Elemento 12: El ESA para el uso de acuerdo con el elemento 10 u 11, en donde el paciente padece anemia asociada con una enfermedad cancerosa, anemia inducida por quimioterapia o anemia asociada con inflamación crónica.

Elemento 13: El ESA para el uso de acuerdo con cualquiera de los elementos 10 a 12, en donde el tratamiento comprende obtener muestras de sangre de dicho paciente en las primeras 1 a 5 semanas del tratamiento con ESA y calcular a partir de ellas el riesgo individual del paciente de sufrir un efecto adverso eventual tras continuar el tratamiento con ESA mediante un método de acuerdo con cualquiera de los elementos 1 a 9.

Elemento 14: El ESA para el uso de acuerdo con cualquiera de los elementos 10 a 13, en donde el paciente padece anemia como patología secundaria inducida por otro trastorno tal como inflamación crónica, síndrome mielodisplásico o cáncer, preferentemente cáncer de pulmón.

Elemento 15: El ESA para el uso de acuerdo con cualquiera de los elementos 10 a 13, en donde el tratamiento comprende las etapas de

(a) Administrar al paciente una dosis baja de ESA durante las primeras 1 a 5 semanas, preferentemente 3 semanas,

(b) Obtener al menos dos muestras del paciente durante las primeras 1 a 5 semanas, preferentemente 3 semanas,

(c) Determinar a partir de dichas al menos dos muestras el riesgo del paciente de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA,

(d) Administrar al paciente ESA después de las primeras 1 a 5 semanas si el paciente tiene un bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, o

(e) Administrar al paciente una transfusión de sangre después de las primeras 1 a 5 semanas si el paciente tiene un alto riesgo de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA.

La presente invención se describirá ahora aún más en los siguientes ejemplos con referencia a las figuras y secuencias adjuntas, sin embargo, sin limitarse a las mismas. Para En las Figuras:

Figura 1: Caracterización de las propiedades de unión de ESA en base a la determinación del agotamiento del ligando y el modelo matemático ESA-EpoR. Las células parentales BaF,³ (BAF³) y BAF³ que expresan de forma estable el EpoR murino (BaF³-mEpoR) se incubaron con 100 pM de Epo alfa o 100 pM de Epo beta. En los momentos indicados, se eliminó el sobrenadante y se cuantificó la concentración de Epo mediante un ensayo ELISA. Con base en estos datos, la tasa de asociación k^asociación, la tasa de disociación k^disociación y el número de lados de unión de ESA en la superficie celular (B^máx) se estimaron mediante el modelo matemático ESA-EpoR y se calculó la constante de disociación específica de ESA K^d (k^disociación/k^asociación). (a) Se incubaron células BaF³ y BaF³ que expresaban de forma estable el EpoR humano (BaF³-hEpoR) con Epo alfa, Epo beta, NES^p y C^e R^a . En los momentos indicados, se eliminó el sobrenadante y se cuantificó la concentración de Epo mediante un ensayo ELISA. Con base en estos datos, la tasa de asociación k^asociación, la tasa de disociación k^disociación y el número de lados de unión de ESA en la superficie celular (B^máx) se estimaron mediante el modelo matemático ESA-EpoR y se calculó la constante de disociación específica de ESA K^d (k^disociación/k^asociación) se calculó. (b) Predicho por el modelo matemático ESA-EpoR para cada ESA, la tasa de asociación k^asociación se representó gráficamente frente a la tasa de disociación k^disociación. La constante de disociación específica de ESA calculada K^d para el hEpoR se indica mediante símbolos. Las áreas sombreadas alrededor de los símbolos indican el intervalo de confianza de la K^d (k^disociación/k^asociación). El mapa de calor muestra los valores de K^D.

Figura 2: Presencia de un EpoR funcional en líneas celulares de cáncer de pulmón humano. (a) Se extrajo el ARNm total de las líneas celulares de NSCLC H838, H1299, A549 y H1944 y se determinó la expresión del ARNm de EpoR mediante qRT-PCR. La expresión de ARNm de EpoR en células H838 se usó como referencia. (b) Se estimularon las células BaF³ y BaF³-hEpoR, así como también las líneas celulares de NSCLC indicadas con 10 U/ml de Epo beta durante 10 min o se dejaron sin tratar y se lisaron. La abundancia de EpoR fosforilado (pEpoR) y EpoR total se determinó mediante inmunoprecipitación (IP) e inmunotransferencia cuantitativa (IB). El experimento se realizó por triplicado biológico y se muestra una inmunotransferencia representativa. (c) Las líneas celulares de NSCLC H838, H1299, A549 y H1944 se estimularon con 4 pM de Epo beta y se determinó la cinética de agotamiento de la Epo mediante un ensayo ELISA hasta un tiempo de incubación de 8000 min. Se empleó el modelo matemático ESA-EpoR para describir la cinética de agotamiento en todas las líneas celulares de NSCLC analizadas y para determinar el número de sitios de unión de ESA / célula (B^máx).

Figura 3: Las células H838-EpoR pueden servir como modelo para las células CFU-E humanas con respecto a los niveles del EpoR (a) Las células madre hematopoyéticas humanas (hHSC) de la sangre del cordón se aislaron y diferenciaron a CFU-E humanas (hCFU-E) como se describió. Las células hCFU-E y hHSC que sirvieron como control negativo (a), así como también la línea celular de NSCLC H838 transducida de manera estable con hEpoR (H838-EpoR) (b) se estimularon con 4 pM de Epo beta y el análisis de la resolución temporal de la cinética de agotamiento se controló mediante un ensayo ELISA durante un período de tiempo de 200 min (datos experimentales - puntos). El modelo podría describir la cinética de agotamiento (modelo - línea continua) y estimar los valores de KD y Bmáx. (c) Inmunotransferencia cuantitativa que demuestra el nivel de sobreexpresión de EpoR humano en células H838-hEpoR en comparación con H838 parental. La funcionalidad de EpoR se muestra mediante la fosforilación del receptor y JAK2 inducida por Epo.

Figura 4: CERA activa preferentemente células con alta expresión de EpoR (a) Predicción basada en modelos de la respuesta a la dosis diferencial para la activación de EpoR en H838-hEpoR mediante diferentes ESAS (panel izquierdo). Las líneas azul y roja corresponden a Epo beta y CERA respectivamente. Las líneas discontinuas indicaban la EC⁵⁰ de cada ESA en la activación de los eritroprogenitores, 141 pM y 1048 pM para Epo beta y CERA respectivamente. El panel derecho representa la validación de la predicción del modelo. Epo beta y CERA activan EpoR en un intervalo de concentraciones muy diferente. Las células H838-hEpoR se estimularon durante 10 minutos con concentraciones crecientes de cada ESA. Las células se lisaron, se inmunoprecipitaron con EpoR y se transfirieron contra la forma total y fosforilada. Los círculos azules representan los datos experimentales tras la estimulación con Epo beta. Los círculos rojos representan los datos experimentales correspondientes a la estimulación con CERA. Las líneas continuas son las trayectorias de activación predichas por el modelo. (B) El panel de la izquierda representa la predicción basada en el modelo de la activación integral de EpoR por cada EC⁵⁰ durante 60 minutos. El área bajo la curva no muestra una diferencia significativa entre la activación de Epo beta y CERA en H838-EpoR. El panel derecho muestra la predicción basada en el modelo de la activación de EpoR integral por cada EC50 durante 60 minutos en H838. En este caso, el área bajo la curva indica una probable activación más baja de EpoR por CERA en comparación con Epo beta.

Figura 5: Comportamiento farmacocinético diferencial de CERA entre sujetos sanos y con NSCLC, (a)

Comportamiento farmacocinético de concentraciones crecientes de CERA en voluntarios sanos. Los círculos de colores son los valores medios de las concentraciones de CERA en suero, determinados por ensayo ELISA. Las líneas continuas representan las trayectorias previstas del aclaramiento de CERA para las concentraciones dadas y los datos experimentales. (B) Comportamiento farmacocinético del aumento de las concentraciones de CERA en pacientes con NSCLC en estadio III o IV. Los círculos de colores son los valores medios de las concentraciones de CERA en suero, determinados por ensayo ELISA. Las líneas continuas representan las trayectorias previstas del aclaramiento de CERA para las concentraciones dadas y los datos experimentales. Las diferentes trayectorias informadas por el modelo describen los datos experimentales y mostraron una reducción del 72 % ± 16 % en la capacidad de aclaramiento de CERA de los pacientes con NSCLC. (c) Caracterización y comparación relativa de la capacidad de aclaramiento de CERA (% de CFU-E) de pacientes con NSCLC y sujetos sanos. La línea punteada es la capacidad de aclaramiento del 100 % de CERA, que representa la capacidad normal de eliminación de CERA en sujetos sanos. Las barras rosa representan el número de pacientes con NSCLC con un % definido de capacidad de aclaramiento de Ce Ra en comparación con sujetos sanos (datos de PK individuales extraídos del ensayo clínico de Hirsch y otros, 2007). El gráfico representa una reducción general de la población de CFU-E (% de la capacidad de aclaramiento de CERA) en pacientes con NSCLC en comparación con el valor medio en sujetos sanos representado como 100 %. También pueden notarse diferentes grados de reducción en la población de CFU-E de pacientes con NSCLC.

Figura 6: Representación gráfica del modelo matemático básico y farmacocinético/farmacodinámico. (a) las reacciones 1 a 6 son 1: Unión/No unión de ESA al receptor de Epo (EpoR). Las constantes de velocidad kasociación/kdisociación de la reacción de unión/desunión son específicas de ESA y pueden caracterizarse completamente mediante el uso del modelo de tráfico y los datos de agotamiento respectivos. 2: Internalización del complejo ESA-EpoR. 3: Reciclaje a la membrana celular y disociación del complejo ESA-EpoR internalizado. 4: Producción/degradación de EpoR en la membrana celular. Las reacciones de producción/degradación están en equilibrio definiendo una cierta cantidad específica de receptores de tipo celular (a) / paciente (b) en la superficie celular caracterizada por el parámetro Bmáx. 5: Degradación del complejo ESA-EpoR internalizado. 6: Degradación y liberación de complejo ESA-EpoR internalizado; (b) las reacciones adicionales 7 a 9 son 7: Aclaramiento en el compartimento sanguíneo, 8: Transporte al compartimento sanguíneo, 9: Aclaramiento saturable en el compartimento intersticial. (c) El cálculo de Bmáx en base a los niveles de Hb incluye además las reacciones 10: producción de Hb desencadenada por el complejo activado por el receptor, y 11: agotamiento de Hb en la sangre de un individuo.

Figura 7: Vinculación del modelo matemático ESA-EpoR con la predicción de riesgos. a, Diagrama de flujo que muestra la predicción del riesgo específico del paciente mediante el modelo ESA-EpoR-PK/PD en base a los datos de PK/PD o PD. b, El panel izquierdo representa la correlación por regresión logística de los parámetros específicos del paciente inferidos por el modelo (sitio de unión a ESA y tasa de degradación de la Hb) y el tratamiento con ESA o la combinación de los mismos con resultado fatal en pacientes con NSCLC. El panel derecho muestra la curva ROC correspondiente a la combinación de los tres parámetros como predictores de riesgo de resultado fatal. c, el panel de la izquierda corresponde a los pacientes agrupados en base a su probabilidad predicha de resultado fatal. El verde y el naranja indican la fracción de los pacientes sobrevivientes y fallecidos. La línea discontinua indica el umbral de riesgo de acuerdo con los criterios establecidos en (b). El panel derecho muestra la supervivencia general de los pacientes en un gráfico de Kaplan-Meier, los colores azul y rojo corresponden al riesgo bajo y alto previsto de resultado fatal para cada grupo de pacientes. Se usó la razón de riesgo proporcional de Cox para calcular un aumento de 4 veces en el riesgo (p<0,01). La calibración del modelo para la estratificación del riesgo se realizó en los conjuntos de datos de PK/PD (N=205) en los ensayos clínicos de NSCLC (NCT00072059 y NCT00327535).

Figura 8: Optimización de la respuesta en base al modelo y la predicción de riesgos. a, la estratificación de pacientes en base a las estimaciones individuales de los sitios de unión de ESA y la tasa de degradación de la Hb en ambos ensayos clínicos de NSCLC (NCT00072059 y NCT00327535)40'41 Los pacientes que murieron durante el ensayo se representan como triángulos y los supervivientes como cuadrados. En el panel de la izquierda, el código de color indica la dosis de ESA administrada en las primeras tres semanas. En el panel derecho, los colores rojo y azul indican la clasificación de los pacientes en alto riesgo y bajo riesgo de resultado fatal. b, Representación de un conjunto de datos independiente del ensayo clínico NCT0007205940 para el que solo estaban disponibles los valores de PD. El panel de la izquierda corresponde a los grupos de pacientes en función de su probabilidad predicha de resultado fatal. El verde y el naranja indican la fracción de pacientes que sobrevivieron o murieron. La línea discontinua indica el umbral de riesgo de acuerdo con los criterios establecidos en la Figura 38 complementaria. La supervivencia general se muestra como un gráfico de Kaplan-Meier (panel derecho), los colores azul y rojo corresponden al grupo de riesgo bajo y alto previsto. Se usó el modelo de riesgo proporcional de Cox para determinar un aumento del riesgo de 2,9 veces (P<0,05).

Figura 9: Gráfico del riesgo relativo de un evento adverso frente al factor de riesgo acumulado aRF; a.

conjunto de datos de calibración b. conjunto de datos de validación.

Figura 10: Descripción específica del paciente mediante el modelo matemático de la farmacodinámica y farmacocinética de ESA en una cohorte de pacientes con CKD. Se muestran tres gráficos diferentes por paciente: el régimen de ESA dado (inyecciones, panel superior), la farmacocinética predicha por el modelo matemático (ESA unido a EpoR, panel central) y la descripción farmacodinámica por el modelo (niveles de hemoglobina, panel inferior). Las flechas indican las inyecciones de Epo alfa (azul turquesa) y de Epo beta (azul) antes del tiempo o. En el momento o, eS^a se cambió a CERA. Las mediciones experimentales de Hb (farmacodinámica) se indican mediante puntos rojos. Las líneas continuas representan las trayectorias del modelo y sombrean la desviación estándar de los datos. Todos los pacientes mostrados corresponden al ensayo clínico NCT00077623.

Figura 11: Parámetros específicos del paciente estimados por el modelo matemático en base a una cohorte de pacientes con CKD. Los dos gráficos mostrados describen la distribución de los dos parámetros específicos del paciente, los sitios de unión de ESA (panel izquierdo) y las tasas de degradación de la Hb (panel derecho). Los parámetros se obtuvieron mediante la estimación de los parámetros mediante el modelo matemático en base a los datos del ensayo clínico NCT00077623 que se muestra en la Figura 11.

Figura 12: Gráfico del riesgo relativo de un evento adverso frente al factor de riesgo acumulado aRF. El gráfico muestra la estratificación de los pacientes con CKD tratados con ESA según la probabilidad de que ocurran eventos adversos de alto o bajo riesgo. El factor de riesgo acumulado comprende los parámetros estimados específicos del paciente (sitios de unión de ESA y degradación de Hb) y las dosis de ESA administradas. La estratificación del riesgo se basa en la aparición de eventos adversos en el ensayo clínico NCT00077623. Los parámetros se obtuvieron mediante la estimación de parámetros mediante el modelo matemático en base a los datos del ensayo clínico que se muestran en la Figura 11.

Figura 13: Gráfico de los eventos adversos en alto riesgo y bajo riesgo en grupos de pacientes con CKD.

El gráfico muestra los pacientes estratificados en base a los sitios de unión de ESA, las tasas de degradación de la Hb y las dosis de ESA administradas a la cohorte de pacientes con CKD (NCT00077623). Los pacientes que tuvieron eventos adversos (AE) se representan con triángulos, y los pacientes que no tuvieron AE se representan con cuadrados. Los pacientes del grupo de alto riesgo se muestran en rojo y los pacientes del grupo de bajo riesgo se muestran en azul.

Figura 14: Tratamiento personalizado de la anemia recomendado por el modelo matemático en base a la tasa de degradación de la Hb estimada y los sitios de unión de ESA para cada paciente con CKD. El modelo matemático predice la dosificación optimizada de ESA cada tres semanas para todos los pacientes con CKD para Epo beta/Epo alfa (panel derecho), NESP (panel central) o CERA (panel derecho). Estos regímenes pueden calcularse para cualquier otro momento dado y para un cambio a otros ESA. Las recomendaciones se basan en la estimación de la tasa de degradación individual de la Hb y los sitios de unión de ESA para cada paciente mediante el modelo matemático. Los pacientes se muestran mediante puntos y la dosis recomendada de ESA y el tiempo se indican mediante sombras.

Figura 15: Tratamiento efectivo y más seguro de la anemia para pacientes individuales con CKD predicho por el modelo matemático. Se muestran tres gráficos diferentes por paciente: la dosificación de ESA (inyecciones, panel superior), la farmacocinética predicha por el modelo (ESA unido a EpoR, panel central) y la farmacodinámica predicha (niveles de hemoglobina, panel inferior). Las flechas indican inyecciones de Epo alfa (azul turquesa) y Epo beta (azul) antes del momento 0. Las mediciones experimentales de Hb (farmacodinámica) antes del momento 0 se indican mediante puntos (ensayo clínico NCT00077623). En el momento 0, el modelo recomienda la dosificación de CERA para cada paciente de una manera específica para cada paciente. Las líneas continuas representan las trayectorias del modelo y sombrean la desviación estándar.

Ejemplos

Materiales y Métodos

Plásmidos y reactivos.

Los vectores de expresión retroviral fueron pMOWS-puro (Ketteler y otros, 2002). La generación del receptor de Epo murino marcado con hemaglutinina (HA) (pMOWS-HA-mEpoR) y de EpoR humano marcado con HA (pMOWS-HA-hEpoR) se realizó como se describió anteriormente (Becker y otros, 2010). Las células se trataron con Epo alfa (Cilag-Jansen), Epo beta (Roche), NESP (Amgen) o CERA (Roche) en las concentraciones indicadas.

Cultivo celular y transfección.

Las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano A549, H838, H1299, H1944, H1650, H1975 y H2030 fueron compradas por ATCC y cultivadas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Lonza) suplementado con suero fetal de ternera al 10 % (FCS, Gibco) y penicilina/estreptomicina al 1 % (Invitrogen). Las líneas celulares de empaquetamiento Phoenix eco y Phoenix ampho (Kinsella & Nolan, 1996) se cultivaron en DMEM (Gibco) suplementado con FCS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Se cultivaron las células BaF³ (Palacios & Steinmetz, 1985) en RPMI-1640 (Invitrogen) que incluía FCS al 10 % y se suplementaron con medio acondicionado WEHI al 10 % como fuente de IL-3. Para líneas celulares H838 que sobreexpresan el EpoR (H838-hEPOR) y BaF³ (BaF³-mEpoR and BaF³-hEpoR) se añadiero 1,5 g/ml de puromicina (Sigma) al medio respectivo.

Para obtener células hCFU-E, las células CD³⁴+ se clasificaron mediante MACS (CD³⁴ -Multisort Kit, Miltenyi) de sangre de cordón umbilical de donantes sanos después del consentimiento por escrito. Las células CD³⁴+ se expandieron mediante el uso de Stem Span SFEM II complementado con Stem Span CC110 (ambas tecnologías StemCell). Después de siete días de expansión, las células se lavaron extensamente mediante el uso de IDMEM (Gibco) para eliminar las citocinas e iniciar la diferenciación o se usaron células para experimentos de agotamiento. Para la diferenciación, las células se cultivaron en Stem Span SFEM II complementado con 10 ng/ml de IL-³ (R&D Systems), 50 ng/ml de SCF (R&D Systems) y 6 U/ml de Epo alfa (Cilag-Jansen) según lo publicado por Miharada 2006. Después de 4 días de cultivo en este medio, se recogió hCFU-E para realizar experimentos de agotamiento. Todas las células se cultivaron a 37 °C con incubación con CO² al 5 %.

La transfección de las células Phoenix eco y Phoenix ampho se realizó mediante precipitación con fosfato de calcio. Los sobrenadantes de la transducción se generaron 24 h después de la transfección pasando a través de un filtro de 0,45 mm y complementados con 8 mg/ml de polibreno (Sigma). Se seleccionaron células BaF³ establemente transducidas que expresan EpoR murino marcado con HA (células BaF³-mEpoR) o EpoR humano marcado con HA (células BaF³-hEpoR) o células H838 que expresan EpoR humano marcado con HA (células H838-hEpoR) en presencia de 1,5 pg/ml de puromicina (Sigma) 48 h después de la transducción. La expresión superficial de EpoR en células BaF³ y H838-hEpoR se verificó mediante análisis de citometría de flujo.

Citometría de flujo.

La expresión de EpoR en la superficie se verificó mediante citometría de flujo. Por lo tanto, las células H838-hEpoR se separaron suavemente con solución de disociación celular (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células BaF³-EpoR y H838-hEPOR se tiñeron con el anticuerpo anti-HA (Roche) diluido 1:40 en 0,3 % de PBS/BSA durante 20 min a 4 °C. Seguido por el lavado de las células con 0,3 % de PBS/BSA e incubación de anticuerpo secundario marcado con Cy⁵ contra rata (Jackson Immuno Research), diluido 1:100 en 0,3 % de PBS/BSA, durante 20 min a 4 °C en la oscuridad. Después de lavar las muestras con PBS/BSA al 0,3 %, se añadió yoduro de propidio (BD Biosciences) para excluir las células muertas. Se usó Canto II (BD Bioscience) para el análisis de muestras.

Experimentos de agotamiento y ELISA

Se llevaron a cabo experimentos de agotamiento de ESA en líneas de células tumorales NSCLC, células BaF³ , BaF³-mEpoR, BaF³-hEpoR, hCFU-E, hHSC. Se sembraron las células tumorales en placas de 6 pocillos (TPP 92006) a una concentración celular de 4x105 células en 3 ml de medio de proliferación (DMEM suplementado con FCS al 10 % y al 1 %). Las células se mantuvieron a 37 °C, 95 % de H²O y 5 % de CO² durante tres días. Al tercer día, las células se lavaron con DMEM (penicilina/estreptomicina al 1 % y BSA 1 mg/ml) y se dejaron en inanición en 1 ml de medio de lavado durante 12 horas. Las células se estimularon con Epo alfa/beta dentro de los tiempos y concentraciones en los gráficos de agotamiento. Después del tiempo de incubación, se recuperó el medio y se mantuvo a -80 °C hasta la conclusión del experimento, las células se tripsinizaron y se contaron mediante una cámara de hemocitómetro. Una vez concluido el experimento, la concentración de ^eS^a se midió mediante ELISA (Quantikine IVD ELISA Kit, R&D DEPoo).

El escenario experimental para las medidas de agotamiento fue diferente en las células en suspensión; BaF³-hEpoR, BaF³-mEpoR, BaF³ , hCFU-E y hHSC. En las células BaF³ transducidas, los experimentos se llevaron a cabo entre 9­ 14 días de selección con puromicina (1,5 g/ml). Las células se lavaron tres veces en RPMI mediante centrifugación durante 5 minutos a 212 X g y se privaron de alimentos durante 3 horas en RPMI (penicilina/estreptomicina al 1 % y BSA 1 mg/ml) a una concentración de 1x106 células/ml. Después del período de inanición, las células se ajustaron a una concentración final de 40x106 células/ml en 350 pl a 37 °C y 900 rpm en un Thermomixer compacto de Eppendorf. Las células fueron estimuladas por ESA durante los tiempos indicados en el gráfico y centrifugadas durante 5 minutos, a 4 °C y 2500 rpm. Se eliminó el sobrenadante y se mantuvo a -80 °C. Las mediciones de ESA se realizaron mediante ELISA (Quantikine IVD ELISA Kit, R&D DEPoo). Las medidas de agotamiento de ESA se realizaron de la misma manera en hCFU-E y hHSC con la única diferencia de la concentración de células 303106 células/ml y el medio usado (Stem Span SFEM II).

Inmunoprecipitación e inmunotransferencia cuantitativa.

Para el análisis de proteínas fosforiladas y totales, se sembraron las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón humano, así como también la línea celular H838-hEpoR, se cultivaron durante 72 h, se privaron de alimentos durante 3 h en DMEM con penicilina/estreptomicina al 1 %, L-glutamina 2 mM (Gibco) y 1 mg/ml de BSA y luego se estimularon con Epo beta o CERA a las concentraciones indicadas durante 10 min. Antes de los experimentos, las células BaF3 se lavaron y se resuspendieron en RPMI-1640 con depleción de suero suplementado con penicilina/estreptomicina al 1 % y 1 mg/ml de BSA y se privaron de alimento durante 3 h. Posteriormente, las células se recolectaron y se dividieron en alícuotas en una densidad de 20x106/ml y se estimularon con Epo beta a las concentraciones indicadas durante 10 min.

Las células se lisaron con tampón de lisis NP-40 1,25x (NP-40 al 1,25 %, NaCl 187,5 mM, Tris 25 mM pH 7,4 NaF 12,5 mM, EDTA 1,25 mM pH 8,0, ZnCh 1,25 mM pH 4,0 MgCl2 1,25 mM, 1,25 mM de Na3VO4, 12,5 % de glicerol suplementado con aprotinina y AEBSF). Las concentraciones de proteína en los lisados se midieron mediante el uso del kit de ensayo de proteína BCA colorimétrico (Pierce Protein Research Products). Para el análisis de inmunoprecipitación, los lisados (1500-2000 pg de proteína para líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón, 400 pg de proteína para células BaF3) se suplementaron con anticuerpos para EpoR (R&D, MAB 307), JAK2 (Upstate) o STAT5 A/B (Santa Cruz, C17) y Proteína A sefarosa (GE Healthcare) y se rotó durante la noche 4 °C. Las proteínas inmunoprecipitadas se separaron mediante SDS-PAGE al 10 % y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (poro de 0,2 pm, Schleicher & Schuell). Para fines de cuantificación se realizó una carga de gel aleatoria no cronológica (Schilling y otros, 2005). Para la detección de las proteínas fosforiladas, las transferencias se sondaron con mAb específicos para fosfotirosina (pTyr) (Upstate, clon 4G10) y luego con anticuerpos secundarios anti-ratón acoplados a peroxidasa de rábano picante (Dianova). Para eliminar los anticuerpos, las membranas se trataron como se describió previamente (Klingmuller y otros, 1995) y posteriormente se incubaron con pAb para EpoR (Santa Cruz, C-20) y anticuerpos anti-conejo acoplados a peroxidasa de rábano picante (Dianova). La detección se realizó mediante el uso del sustrato ECL (GE Healthcare). Los datos de inmunotransferencia se adquirieron con la cámara CCD ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare) y la cuantificación se realizó con el software ImageQuant TL versión 7.0 (GE Healthcare).

Aislamiento de ARNm. Preparación de ADNc y qPCR

Para el análisis de la expresión de EpoR, las células se lisaron y la extracción de ARN se realizó mediante el uso del kit RNeasy Mini (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para obtener ADNc a partir de ARN, se utilizó el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (qRT-PCR) se realizó mediante el uso de LightCycler 480 (Roche Aplicado-Science). Las muestras se prepararon con reactivos del kit maestro de sondas LightCycler480 de Roche Applicated-Science. Se obtuvieron cebadores específicos de Eurofins MWG y sondas universales (UPL) para la cuantificación TaqMan de ADN de Roche Appled-Science. Las concentraciones se normalizaron mediante el uso de la media geométrica de p-glucuronidasa (GUSB) y esterasa D (ESD). Los cebadores dirigidos a EpoR humano: directo - ttggaggacttggtgtgtttc; inverso - agcttccatggctcatcct; ESD: directo - ttagatggacagttactccctgataa; inverso -ggttgcaat- gaagtagtagctatgat; GUSB: directo - cgccctgcctatctgtattc; inverso - tccccacagggagtgtgtag.

Análisis de espectrometría de masas.

El lisado celular se sometió a IP con una combinación de dos anticuerpos STAT5, sc-1081 y sc-836 de Santa Cruz Biotechnology. Se agruparon dos IP por carril. Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE al 10 % (GE Healthcare) en tampón 1x Laemmli (Laemmli 1970). Después de la tinción de coomassie con SimplyBlue™ SafeStain (Invitrogen), se cortaron bandas de gel STAT5 a aproximadamente 90 kDa y se cortaron en trozos pequeños (1 mm3). Las piezas de gel se destiñeron, se redujeron con DTT (ditiotreitol, SIGMA), se alquilaron con IAA (yodoacetamida, SIGMA) y se digirieron con 0,3 pg de tripsina en tampón de acetonitrilo NH4HCO3100 mM al 5 % durante la noche. Se agregaron a las digestiones estándares de proporción péptido/fosfopéptido de una sola fuente para STAT5A y STAT5B (Boehm 2014). Después de una extracción de péptidos de cuatro etapas realizada secuencialmente en tampón de acetonitrilo NH4HCO3 100 mM al 5 %, acetonitrilo, 5 % de ácido fórmico y acetonitrilo, las muestras se concentraron en un speedvac (Eppendorf) y se desalaron con C18 Ziptips (Millipore) mediante el uso de soluciones a base de agua, acetonitrilo y ácido fórmico. Las muestras se analizaron mediante EASY-nLC 1000 (Thermo Scientific) acoplado a un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-Orbitrap Q Exactive™ (Thermo Scientific). Como precolumna, los inventores usaron Acclaim PepMap 100, 75 pm x 2 cm, como columna analítica los inventores usaron Acclaim PepMap RSLC C18, 2 pm, 100 A, 75 pm x 25 cm. Se adquirieron espectros de exploración completa de MS a una resolución R = 70000 y se analizaron los pares de fosfopéptidos y péptidos STAT5 nativos y marcados con Xcalibur 3.0.63 (Thermo).

El modelo de tráfico in vitro (figura 6a) se extendió a un modelo farmacocinético/farmacodinámico (PK/PD) (figura 6b) al incluir compartimentos sanguíneo e intersticial y datos de PK específicos del paciente obtenidos por inyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) de ESA/CERA. Además, el modelo proporciona el vínculo entre el ESA unido al EpoR (ESA_EpoR) y los niveles de hemoglobina (Hb) medidos en los pacientes. El modelo consta de las siguientes reacciones adicionales:

7. Aclaramiento en el compartimento sanguíneo.

8. Transporte al compartimento sanguíneo.

9. Aclaramiento saturable en el compartimento intersticial.

10. Producción de Hb desencadenada por el complejo receptor activado.

11. Degradación de la Hb específica del paciente.

Las ecuaciones de velocidad de reacción vienen dadas por:

1. k^asociación*ESA*EpoR and k^disociadón*ESA_EpoR

2. "k^e *ESA_EpoR"

3. "k^ex *ESA_EpoR_i"

4. "k^t* Bmax" and "k^t *EpoR"

5. "k^di *ESA_EpoR_i"

6. "k^de *ESA_EpoR_i"

7. k^aclaram *ESA

8. "k^scfuera *ESA_SC"

9. "k^scaciaram *ESA_SC / (ksaclaramsat ESA_SC)"

10. "k^hb_pro *ESA_EpoR"

11. "k^hb_deg *Hb"

Calibración del modelo

Para la calibración de los parámetros del modelo, los inventores usaron el paquete de software D2D (Raue y otros, PloS ONE 2013) en M^a T^lAB (Versión 2012b, The MathWorks, Inc., Natick, MA, EE. UU.). Para minimizar la distancia entre las trayectorias del modelo simulado y los datos medidos, se aplicó un enfoque de máxima verosimilitud. Los inventores usaron un algoritmo de optimización determinista combinado con múltiples puntos de partida en el espacio de los parámetros de alta dimensión para encontrar el óptimo global de la probabilidad logarítmica negativa. Como los valores de los parámetros pueden variar en varios órdenes de magnitud y son, según su definición bioquímica, estrictamente positivos, la optimización se realizó en un espacio de parámetros logaritmizado. Para tener en cuenta el ruido de medición logarítmico normalmente distribuido de los datos del curso del tiempo de las proteínas (Kreutz y otros. Bioinformatics 2007), también los datos se transformaron en la escala logarítmica y se ajustó un modelo de error aditivo simultáneamente con los parámetros del modelo cinético. (Raue y otros. PloS ONE 2013)

Los parámetros de afinidad (k^asociación, d ^isociación o k^asociación y k^D) y el número de sitios de unión (B^máx) se estimaron individualmente para cada condición experimental, es decir, combinación de ESA y tipo de célula, ya que dependen de las propiedades bioquímicas del ESA y en el nivel de expresión de EpoR del tipo celular respectivo.

La identificabilidad estructural y práctica de los parámetros se analizó mediante el uso del enfoque de probabilidad de perfil descrito por Raue y otros. (Bioinformatics 2011). Además, este método permitió a los inventores determinar los intervalos de confianza del parámetro y las incertidumbres de las predicciones del modelo.

Para la predicción del riesgo en base a los parámetros específicos del paciente del modelo de efectos mixtos de múltiples escalas ESA-EpoR-PK/PD y las dosis de CERA administradas, se usó la regresión logística. La discriminación entre grupos de bajo y alto riesgo se basó en el índice de Youden, que maximiza la especificidad y la sensibilidad (Youden, índice WJ para calificar las pruebas de diagnóstico. Cancer 3, 32-35 (1950)).

Determinación en base a los modelos de las propiedades de unión del ESA

Para evaluar el papel de la Epo y derivados de la Epo en el contexto del cáncer de pulmón, fue esencial desarrollar un ensayo cuantitativo confiable que permita determinar el número de lados de unión por célula y las propiedades de unión específicas de diferentes ESA humanos (Epo alfa, Epo beta, NESP y CERA). Los inventores usaron el conocimiento del inventor de que el agotamiento rápido del ligando es característica del sistema Epo-EpoR (Becker y otros. 2010) y establecieron un ensayo ELISA robusto para controlar la eliminación de la Epo de los sobrenadantes celulares.

Como se muestra en la Figura 1a, esto permitió a los inventores cuantificar con precisión el agotamiento de Epo alfa y Epo beta por las células BaF³ murinas que expresan de manera estable el EpoR murino (BaF³-mEpoR) mientras que las células BaF³ parentales no tuvieron impacto subrayando la especificidad del ensayo. Estas cuantificaciones en combinación con el modelo de la vía dinámica del inventor de las interacciones Epo-EpoR (Becker y otros. 2010) permitieron calcular la constante de disociación K^d (Figura 1a) así como también la tasa de asociación k^asociación, la tasa de disociación k^disociación y el número de lados de unión (B^máx) para la interacción de Epo alfa y Epo beta con el EpoR murino.

La B^máx estimada estuvo de acuerdo con los resultados obtenidos por los ensayos tradicionales de unión por saturación mediante el uso de ligando marcado radiactivamente, validando aún más el ensayo. Para examinar comparativamente las propiedades de unión de diferentes ESA para el EpoR humano, los inventores midieron el agotamiento de ESA por las células BaF³ que expresan establemente el EpoR humano (BaF³-hEpoR) o las células BaF³ parentales (Figura 1b). Los resultados mostraron que mientras que Epo alfa y Epo beta se agotan muy rápidamente, el agotamiento de NESP y CERA es moderado. Los datos cuantitativos resueltos en el tiempo en combinación con el modelo de vía dinámica del inventor de la interacción ligando-receptor permitieron a los inventores calcular que la Kd de Epo alfa y Epo beta, respectivamente, son muy similares con 16 y 17 pM. Sin embargo, para NESP el modelo indica una Kd de 789 pM y para CERA una KD de 982 pM, lo que sugiere para ambos derivados de Epo una constante de disociación muy elevada.

Relacionar la Kd de los diferentes ESA con las respectivas tasas de asociación y disociación como se muestra en la Figura 1c revela que la asociación de NESP y CERA es mucho más lenta en comparación con Epo alfa y Epo beta mientras que la tasa de disociación aumenta. Por lo tanto, al combinar la cuantificación simple resuelta en el tiempo de la concentración de Epo en los sobrenadantes celulares con el modelo de la vía dinámica del inventor, fue posible determinar de manera confiable las propiedades de unión de ESA y demostrar que los ESA disponibles difieren significativamente en sus propiedades para unirse al EpoR humano.

Presencia de EpoR funcional en las líneas celulares de NSCLC

Para determinar la presencia de un EpoR funcional en células de cáncer de pulmón, los inventores primero seleccionaron un panel de líneas celulares de NSCLC para detectar la presencia de ARNm de EpoR. Entre estos, los inventores identificaron tres líneas celulares de NSCLC de adenocarcinoma que mostraban niveles significativos de transcritos de ARNm de EpoR. Como se muestra en la Figura 2a, H838 y H1299 mostraron niveles de expresión moderados de ARNm de EpoR y niveles bajos de A549. H1944 representa líneas celulares de NSCLC con niveles más abajo del límite de detección (Figura 2a). A continuación, se evaluó la expresión de la proteína EpoR en las cuatro líneas celulares de NSCLC seleccionadas, así como también su funcionalidad. El enriquecimiento por inmunoprecipitación y la detección por inmunotransferencia revelaron la presencia de la proteína EpoR en H838 y H1299 y en niveles muy bajos en A549, mientras que estaba ausente en H1944 (Figura 2b). De acuerdo con observaciones anteriores, el nivel de expresión global de la proteína EpoR fue muy bajo en comparación con BaF³-hEpoR.

Tras la estimulación con Epo como se esperaba, la forma fosforilada de tirosina del receptor estaba ausente en las células BaF³ parentales y H1944, pero era evidente en H838, H1299 y A549, lo que indica la presencia de un EpoR funcional y competente en la señalización en estas tres líneas celulares de NSCLC. Para determinar las propiedades de unión del EpoR expresado en las líneas celulares de NSCLC, los inventores aplicaron el ensayo de agotamiento y mostraron (Figura 2c) que las líneas celulares de NSCLC que tenían un EpoR negativo de Epo beta disminuían la Epo beta, pero no la línea celular H1944 de NSCLC negativa para EpoR (Figura 1b). Sin embargo, el agotamiento de Epo beta fue mucho más lento en comparación con las células BaF³-EpoR, lo que sugiere la presencia de un número significativamente menor de receptores de la superficie celular. En consecuencia, el análisis de los datos resueltos en el tiempo con el modelo de vía dinámica reveló lados de unión que iban desde indetectables hasta 90 por célula (Figura 2c y Tabla 2), sin embargo, la K^D estimada era comparable a las estimaciones con BaF³-hEpoR. Esto muestra que el agotamiento del ligando y el receptor competente de señalización están presentes en un subconjunto de líneas celulares de NSCLC.

Cinética de agotamiento de EpoR en células con altos números de EpoR

El objetivo principal del tratamiento con Epo durante la anemia son las células progenitoras eritroides en el estadio de unidades formadoras de colonias-eritroide (CFU-E) que expresan niveles elevados de EpoR. Para cuantificar la expresión en la superficie celular del EpoR en CFU-E humana y caracterizar las propiedades de unión, se prepararon células madre hematopoyéticas (hHSC) CD³⁴+ humanas a partir de sangre de cordón umbilical humano y se diferenciaron en CFU-E humana (hCFU-E). El análisis de resolución temporal del agotamiento de Epo beta reveló una rápida reducción de Epo beta de los sobrenadantes de hCFU-E, pero no de hHSC que carecen de EpoR (Figura 3a). El análisis basado en modelos mostró una Kd comparable a BaF³-hEpoR y una B^máx de 365 sitios de unión por célula que era un orden de magnitud menor en comparación con BaF³-hEpoR, pero un orden de magnitud mayor en comparación con la línea celular de NSCLC H838.

Para examinar si algunos de los ESA disponibles podrían tener ventajas en el contexto tumoral debido a las distintas propiedades de unión, los inventores se propusieron establecer un sistema de modelo celular con niveles elevados de expresión de hEpoR que imitaran la situación en hCFU-E ya que hCFU-E solo están disponibles en cantidades extremadamente limitantes. Los inventores expresaron de forma estable el hEpoR en H838 (H838-hEpoR) y demostraron mediante enriquecimiento mediante el uso de inmunoprecipitación e inmunotransferencia que la expresión del EpoR estaba muy aumentada y el EpoR fosforilado estaba sustancialmente elevado (Figura 3b). Los experimentos de agotamiento y el análisis basado en modelos revelaron propiedades de unión bastante similares a hCFU-E (Figura 3c) estableciendo la línea celular H838-hEpoR como un sistema modelo adecuado para examinar el impacto de diferentes ESA en células que tienen altos niveles de EpoR como se observa en el sistema hematopoyético frente a las células que expresan niveles bajos como en el contexto tumoral.

Identificación de CERA como un ESA que activa preferentemente células con alta expresión de EpoR

Para comparar el impacto de la ESA en las células tumorales que expresan niveles bajos de EpoR frente a las células que muestran niveles elevados de EpoR, tal como H838-EpoR, se realizaron simulaciones de modelos. Como lectura para la señalización de EpoR, los inventores calcularon la integral de ESA unido al EpoR (ESA_EpoR) durante los primeros 60 minutos después de la estimulación. En primer lugar, se llevaron a cabo estas estimulaciones para diferentes concentraciones de ESA y predijo la EC⁵⁰ para ambos Epo beta y CERA en las células con altos niveles de EpoR (Figura 4a). El modelo predice que se requiere una concentración 10 veces mayor de CERA para la misma activación. Este modelo de predicción se validó experimentalmente en células H838-EpoR mediante inmunotransferencia cuantitativa contra EpoR fosforilado.

Curiosamente, el modelo predijo que las concentraciones de ESA que inducen la misma activación en células con niveles altos de EpoR actúan de manera diferente en células con niveles bajos de EpoR tal como H838. Como estas células agotan menos Epo beta, Epo beta da como resultado una activación más fuerte que CERA en células con niveles bajos de EpoR (Figura 4b). Experimentalmente, este modelo de predicción se validó en células H838 mediante espectrometría de masas cuantitativa frente a STAT⁵ fosforilado. Por tanto, CERA se identificó como un ESA que activa preferentemente células con alta expresión de EpoR, tal como las células H838-EpoR y hCFU-E, en lugar de células con baja expresión de EpoR, tal como las células NSCLC.

Determinación del número de células CFU-E en sujetos sanos y pacientes con NSCLC mediante un modelo integrado de PK/PD

Habiendo identificado a CERA como un ESA que actúa preferentemente sobre células con altos niveles de EpoR, los inventores integraron el modelo del inventor con datos farmacocinéticos (PK) para describir la dinámica de CERA en pacientes (el modelo matemático ESA-EpoR integrativo (PK/PD); véase arriba). En una primera etapa, los inventores analizaron los valores de PK medios de CERA en el suero de sujetos sanos (Locatelli y otros.) así como también de pacientes con NSCLC en estadio IIIB-IV (Hirsh y otros). Como CERA, que está pegilado, no se aclara por el riñón, se planteó la hipótesis de que el aclaramiento de CERA en el torrente sanguíneo solo se logra mediante la unión al EpoR y la internalización, como se vio en los experimentos in vitro. Además, se asumió que la principal diferencia entre los sujetos sanos y los pacientes con NSCLC en la dinámica de Epo es el número de células CFU-E, que puede reducirse por la carga tumoral y por la quimioterapia. De hecho, estas suposiciones fueron suficientes para describir los datos de PK experimentales tanto para sujetos sanos como para pacientes con cáncer (Figura 5a). Además, el modelo determinó una disminución del 72 % en el número promedio de células CFU-E en los pacientes con NSCLC en estadio IIIB-IV, lo que resultó en tiempos de aclaramiento de CERA más prolongados.

Luego, los inventores aplicaron el mismo enfoque a los datos de PK de pacientes individuales con NSCLC. Si bien los datos parecen muy heterogéneos, el modelo podría describir nuevamente todos los conjuntos de datos en base únicamente a diferentes números de sitios de unión de ESA, es decir, células CFU-E. Si bien los sitios de unión de ESA también pueden estar presentes en otras células, tal como las células de NSCLC, no contribuirán significativamente al aclaramiento de CERA debido a sus bajos niveles de expresión. Es importante destacar que fue posible determinar el número de células CFU-E para cada paciente con cáncer, mostrando una alta variabilidad de paciente a paciente (Figura 5c).

Determinación del número de células CFU-E en sujetos sanos y pacientes con NSCLC en función de los niveles de hemoglobina (Hb) del paciente.

El modelo anterior también pudo correlacionar los incrementos de hemoglobina (Hb) con los datos de PK/PD en conjuntos de datos de pacientes individualizados. Los perfiles de PK se correlacionan con el número de CFU-E y este número con la recuperación de la anemia, indicada por los niveles de Hb. Los inventores establecieron la correlación entre los antecedentes individuales de los pacientes con los perfiles de PK y estos con el número de CFU-E por paciente, y estos con el resultado del tratamiento con ESA (incremento de los niveles de Hb). El modelo de Hb incluye por tanto las reacciones adicionales (figura 6c) de la producción de Hb por la señalización activa de ESA-EPO-R ya que la señalización de ESA-EPO-R induce la maduración de los eritrocitos que por tanto aumenta las concentraciones de Hb. Además, el modelo incluye la degradación específica de la Hb del paciente, que se determina fácilmente en pacientes anémicos, porque el estado de la Hb se controla regularmente.

Ejemplo 1: Estratificación del paciente en base al modelo

Se ha asociado un aumento del riesgo de mortalidad con el tratamiento con ESA en la anemia asociada al cáncer. Los inventores usaron regresión logística para correlacionar los dos parámetros específicos del paciente inferidos (número de sitios de unión de ESA y tasa de degradación de Hb) y el tratamiento de ESA dado con resultado fatal (Figura 7a) en dos ensayos clínicos de NSCLC (NCT00072059 y NCT00327535). El índice de Youden se usó para definir el valor pronóstico de los dos parámetros específicos del paciente y la dosis dada de CERA, que se visualizan individualmente o en combinación (Figura 7b) con correlación con el resultado fatal, definiendo un umbral para la estratificación del paciente. En base a la combinación del número de sitios de unión de ESA, la tasa de degradación de Hb y la dosis de CERA administrada en las primeras tres semanas, el modelo pudo clasificar a los pacientes en alto o bajo riesgo de resultado fatal y mostró una buena correlación entre pacientes del grupo de alto riesgo y pacientes fallecidos (Figura 8a y Figura 7c). Estos resultados corroboraron las observaciones previas de que la supervivencia general puede correlacionarse retrospectivamente con una disminución de la Hb durante la quimioterapia o un aumento de los niveles de hemoglobina por encima de 13 g/dl o con exposiciones a dosis altas de ESA. Posteriormente, los inventores validaron el enfoque del inventor mediante el uso solo de los valores de PD y los regímenes de ESA administrados en un grupo independiente de pacientes en el ensayo clínico de NSCLC (NCT00072059). El modelo matemático fue capaz de asignar correctamente a la mayoría relativa de los pacientes fallecidos al grupo de alto riesgo de resultado fatal (Figura 8b).

Los intentos anteriores de identificar estadísticamente los factores de riesgo de mortalidad y eventos trombovasculares durante el tratamiento con ESA apuntaban a dosis altas de ESA, hiporreactividad al tratamiento o niveles de Hb >13 g/dl. Sin embargo, estos factores de riesgo solo pueden obtenerse retrospectivamente. Con el modelo multiescala del inventor es posible estimar los dos parámetros específicos del paciente para cada paciente individual ya después de algunas mediciones de Hb. Sobre la base de estos parámetros, el modelo multiescala es capaz de predecir la dosis mínima efectiva y estratificar a los pacientes de acuerdo con el riesgo de mortalidad bajo o alto. El enfoque del inventor también proporciona una herramienta de farmacovigilancia para evaluar retrospectivamente el riesgo/beneficio en los estudios de seguridad de ESA. El umbral para tener un alto riesgo de sufrir un evento adverso se proporciona en la figura 9.

Ejemplo 2: Estratificación basada en el modelo en pacientes con CKD

Además, los inventores usaron el modelo no solo para la estratificación del riesgo de pacientes con cáncer, sino también en una situación no relacionada con el cáncer, tal como CKD. Los resultados en las figuras 10 a 15 y sus respectivas leyendas de figuras demuestran la aplicabilidad de la invención en una causa no cancerosa de anemia.

Se ha informado ampliamente que los siguientes factores de riesgo se correlacionan con eventos adversos y un mayor riesgo de mortalidad en pacientes con CKD: altas dosis de ESA (Regidor, DL y otros. J Am Soc Nephrol 17, 1181-1191, (2006)), valores de Hb no estables (Yang, W. y otros. J Am Soc Nephrol 18, 3164-3170, (2007)) y niveles altos de Hb (Singh, AK y otros. N Engl J Med 355, 2085-2098, (2006)). El modelo matemático descrito es capaz de describir la farmacocinética y farmacodinamia de ESA en pacientes con CKD (figura 10). El modelo estima dos parámetros clave específicos del paciente (tasa de degradación de la Hb y sitios de unión de ESA) siguiendo el mismo procedimiento mencionado anteriormente en pacientes con cáncer. Las diferencias en estos dos parámetros entre los diferentes pacientes con CKD (figura 11) resumen la diferente capacidad de respuesta al tratamiento con ESA. El modelo matemático es capaz de capturar las diferentes farmacodinámicas de diferentes dosis de ESA en diferentes pacientes y estratificar a los pacientes en alto y bajo riesgo de eventos adversos (figuras 12 y 13). Al igual que en el cáncer, el modelo puede predecir las dosis efectivas de ESA en pacientes con CKD (figura 14) para mantener niveles estables de Hb. Esto es particularmente importante en el cambio de tratamientos entre diferentes ESA, porque el tratamiento propuesto por el modelo matemático daría como resultado niveles de Hb estables (figura 15). Así, el tratamiento optimizado basado en el modelo matemático evita el estrés hemodinámico provocado por aumentos o descensos bruscos de Hb, que se asocian a un mayor riesgo de eventos adversos cardiovasculares y mortalidad en la CKD.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método in vitro para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con un agente estimulante de la eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un resultado fatal o adverso tras el tratamiento continuado con ESA, el método comprende las etapas de:

   (a) Proporcionar las muestras de pacientes del paciente de al menos dos momentos,

   (b) Determinar a partir de dichas muestras la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] para dicho paciente,

   (c) Determinar a partir de dicha tasa de degradación de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente,

   (d) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación individual de la Hb, (ii) el número de sitios de unión de eSa y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de eSa planeada/calculada para la administración, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF] determinado de acuerdo con la siguiente fórmula (1):

   (1) [aRF]=Bo+B1*[EpoR]+B2*[Hb degr]+B3*[ESA]

   (e) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF], en donde el paciente tiene un alto riesgo si el [aRF] es 0,1 o superior.

   2. Un método in vitro para estratificar a un paciente con anemia que recibe tratamiento con un agente estimulante de la eritropoyesis (ESA), en donde el paciente se estratifica en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, el método comprende las etapas de:

   (a) Proporcionar muestras de pacientes del paciente de al menos dos momentos durante el tratamiento inicial de la anemia con ESA en dicho paciente,

   (b) Determinar a partir de dichas muestras la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] y el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente,

   (c) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación individual de la Hb, (ii) el número de sitios de unión de ESA y (iii) la última dosis de ESA administrada, o la dosis de ESA que se planea administrar, a dicho paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF] determinado de acuerdo con la siguiente fórmula (1):

   (1) [aRF]=Bo+B1*[EpoR]+B2*[Hb degr]+B3*[ESA]

   (d) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF], en donde el paciente tiene un alto riesgo si el [aRF] es 0,1 o superior.

   3. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde ESA se selecciona del Activador continuo del receptor de la eritropoyetina (CERA), EPO alfa, EPO beta y proteína estimulante de la eritropoyesis novedosa (NESP), y preferentemente es CERA.

   4. El método in vitro de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde

   (a) Bo=2,3518, B1=-2,5840, B2=-0,3957, and B3=-0,1374, y preferentemente en donde el paciente se estratifica en un grupo alto de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA si el [aRF] es mayor que aproximadamente 0,18 para pacientes con cáncer, preferentemente cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC); o

   (b) Bo=-2,1927, B1=0,5392, B2=-0,82877, y B³=0,0046426, y preferentemente en donde el paciente se estratifica en un grupo alto de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA si el [aRF] es mayor que aproximadamente 0,37 para la enfermedad renal crónica (CKD).

   5. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2. 2 a 4, en donde el número de sitios de unión de ESA [EpoR] para dicho paciente está determinado por

   (a) evaluar el aclaramiento del ESA administrado en el suero de dicho paciente a lo largo del tiempo, y (b) Calcular a partir del aclaramiento de dicho ESA mediante el uso de un modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R la cantidad de sitios de unión de ESA en dicho paciente [EpoR], en donde dicho modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R de se basa en un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE):

   ⁽2^.1^.) dlE^ SC~ = - ¿ s c adaram ■ [ESASC]/(ícsc_aclaram _sat [ESASC]) - ¿scjuera ■ [ESASC]

   ^dLESAl = kscfuera ■ [ESASC] — ¿aclarara ■ [ESA] — ¿asociación ■ [ESA] • [EpoR] ¿disociación ■ (2.2.) dt

   [ESAEpoR] ¿ex ■ [ESAEpoRi]

   dlEpofc

   = —¿asociación ■ [ESA] ■ [EpoR] ¿disociación ■ [ESAEpoR] kt ■ Bmáx — kt • [EpoR] (2.3.) dt

   ¿ex ■ [ESAEpoRi]

   (2.4) dlE' ^ P°R' = ¿asociación ■ [ESA] ■ [EpoR] — ¿disociación ■ [ESAEpoR] — ¿e ■ [ESAEpoR]

   _(2.5.) diESA _¡7EpoRi. _ k e [ESAEpoR] _ kex . [ESAEpoRi] - ¿di ■ [ESAEpoRi] - ¿de ■ [ESAEpoRi]

   (2.6.) diESAil

   dr = ¿di ■ [ESAEpoRi]

   dLESAel

   (2.7.) = ¿de ■ [ESAEpoRi]

   , y

   en donde Bmáx es el número de sitios de unión de ESA.

   6. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la tasa de degradación individual de la hemoglobina (Hb) [Hb degr] se determina mediante el cálculo a partir de la concentración de hemoglobina del paciente a partir de al menos dos momentos separados de la tasa de degradación individual de la hemoglobina del paciente (degradación de la hemoglobina por tiempo).

   7. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde las muestras de pacientes son muestras de sangre.

   8. El método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la anemia es una anemia asociada con una enfermedad cancerosa, anemia inducida por quimioterapia o anemia asociada con inflamación crónica.

   9. Un ESA para el uso en el tratamiento de la anemia en un paciente, en donde el paciente tiene un bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuo con ESA según se determina con un método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y en donde el tratamiento comprende calcular en muestras de sangre de dicho paciente obtenidas en las primeras 1 a 5 semanas del tratamiento con ESA, el riesgo individual del paciente de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA mediante un método in vitro de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

   10. El ESA para el uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el ESA se selecciona del activador continuo del receptor de la eritropoyetina (CERA), EPO alfa, EPO beta y proteína novedosa estimulante de la eritropoyesis (NESP), y preferentemente es CERA.

   11. El ESA para el uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10, en donde el paciente padece anemia asociada con una enfermedad cancerosa, anemia inducida por quimioterapia o anemia asociada con inflamación crónica, tal como CKD.

   12. El ESA para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en donde el paciente padece anemia como patología secundaria inducida por otro trastorno tal como inflamación crónica, síndrome mielodisplásico o cáncer, preferentemente cáncer de pulmón y CKD.

   13. El ESA para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, y la transfusión de sangre para el uso en el tratamiento de la anemia, en donde el tratamiento que comprende las etapas de

   (a) Administrar al paciente una dosis baja de ESA durante las primeras 1 a 5 semanas, preferentemente 3 semanas,

   (b) Determinar a partir de al menos dos muestras que se han obtenido del paciente durante las primeras 1 a 5 semanas, preferentemente 3 semanas, el riesgo del paciente de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA,

   (c) Administrar al paciente ESA después de las primeras 1 a 5 semanas si el paciente tiene un bajo riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, o

   (d) Administrar al paciente una transfusión de sangre después de las primeras 1 a 5 semanas si el paciente tiene un alto riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA según lo determinado por el método de las reivindicaciones 1 a 8.

   14. El ESA para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, y la transfusión de sangre para el tratamiento de la anemia, en donde el tratamiento comprende las etapas de

   (a) Determinar a partir de al menos dos muestras obtenidas del paciente antes del tratamiento, el riesgo del paciente de sufrir un evento adverso tras el tratamiento con eSa ,

   (b) Administrar al paciente ESA si el paciente tiene un bajo riesgo de sufrir un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, o

   (c) Administrar al paciente una transfusión de sangre si el paciente tiene un alto riesgo de un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA según lo determinado por el método de las reivindicaciones 1 a 8.

   15. Un ESA para el uso en el tratamiento de la anemia en un sujeto, el tratamiento comprende las etapas de (a) Determinar o proporcionar concentraciones de hemoglobina en muestras del sujeto de al menos dos momentos separados y calcular a partir de ellas una tasa de degradación de la hemoglobina específica del sujeto,

   (b) Determinar la concentración actual de hemoglobina en una muestra del sujeto,

   (c) Calcular a partir de la tasa de degradación de la hemoglobina específica del sujeto y la concentración de hemoglobina en el sujeto, el número de sitios de unión de ESA en el paciente y la dosis de un ESA suficiente para tratar la anemia en el sujeto mediante el uso de un modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R de la hemoglobina (Hb),

   (d) Determinar a partir de (i) la tasa de degradación de la Hb del paciente, (ii) el número de sitios de unión de ESA del paciente, y (iii) la dosis de ESA calculada suficiente para tratar la anemia en el paciente [ESA], un factor de riesgo acumulado [aRF] de acuerdo con la siguiente fórmula (1):

   (1) [aRF]=Bo+B1*[EpoR]+B2*[Hb degr]+B3*[ESA], (e) Estratificar al paciente en un grupo de alto riesgo o bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA de acuerdo con el [aRF], en donde el paciente tiene un alto riesgo si el [aRF] es 0,1 o superior,

   (f) Administrar al sujeto la dosis calculada de ESA según se determina en (c) si el paciente se encuentra en un grupo de bajo riesgo de experimentar un evento adverso tras el tratamiento continuado con ESA, y (g) Opcionalmente, monitorizar la concentración de hemoglobina en el sujeto después de la administración de ESA y ajustar la siguiente dosis de ESA mediante la repetición de las etapas (b) a (d); en donde dicho modelo farmacocinético (PK) dinámico no lineal de la vía ESA-EPO-R de se basa en un sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (ODE):

   dlESASC:

   (2.1.) = — fcscaclaram ■ [ESASC]/(frsc_aclaram _sat [ESASC]) — fcsc_fuera ■ [ESASC] _dr

   (22 ) ^diESAl — = kscfuerc ' [ESASd — fcaclaram ■ [ESA] — ^asociación ■ [ESA] ■ [EpoR] ^disociación ■

   [ESAEpoR] fcex ■ [ESAEpoRi]

   (2.3.) diEpoRl _ _

   dr fcex ■ [ESA

   

   (2.4) d[E.AEpoR- _ ^asociación ■ [ESA] -[EpoR] — ^disociación ■ [ESAEpoR] — íce ■ [ESAEpoR] _di

   (2.5.) diESAEpoR.. _ ke _ [ESAEpoR] - fcex ■ [ESAEpoRi] - fcdi ■ [ESAEpoRi] - fcde ■ [ESAEpoRi]

   

   

   y

   en donde Bmáx es el número de sitios de unión de ESA.