ES2843626T3

ES2843626T3 - Métodos de tratamiento de enfermedades retinianas

Info

Publication number: ES2843626T3
Application number: ES15875361T
Authority: ES
Inventors: Eyal Banin; Benjamin Eithan Reubinoff; Osnat Bohana-Kashtan; Nir Netzer; Charles Sherard Irving
Original assignee: Cell Cure Neurosciences Ltd
Current assignee: Cell Cure Neurosciences Ltd
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2021-07-19
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CA3175175A1; CN114469998A; US20180008458A1; CN114533761A; EP3240612A1; JP2024023611A; PH12017501217A1; ZA201704359B; CA2972700A1; DK3240612T3; WO2016108219A1; EP3240612B1; BR112017014332A2; JP2022125160A; KR20220020422A; AU2023255009A1; IL253244B1; MX2017008818A; EA201791518A1; AU2015373111B2

Abstract

Composición farmacéutica, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con degeneración macular asociada a la edad (DMAE) en forma seca, que comprende: administrar en la subretina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende células del epitelio pigmentario retiniano (EPR) humanas, en la que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en la que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto, tratando de ese modo al sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de tratamiento de enfermedades retinianas

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a métodos de tratamiento de enfermedades retinianas y, más particularmente, degeneración macular asociada a la edad (DMAE).

La derivación de hESC hace más de una década ha suscitado un inmenso interés en el uso clínico potencial de estas células para la regeneración sirviendo como material de partida para células terapéuticas. Si bien las células derivadas de hESC aún no se han aprobado para uso clínico, se ha realizado un progreso significativo a lo largo de los años hacia el cumplimiento de este objetivo. Los avances importantes incluyen una mejor comprensión de la biología de las hESC, mejoras tecnológicas en la capacidad para diferenciarlas en diversos tipos de células y una prueba preclínica de su efecto terapéutico en modelos animales específicos de enfermedad.

El EPR es una monocapa de células pigmentadas que se encuentra entre la retina neural y la coriocapilar. El EPR se caracteriza por una polaridad funcional y estructural apical a basolateral. En el lado apical, las células hacen un contacto directo con los fotorreceptores. En sus paredes laterales forman uniones comunicantes adherentes estrechas y, en su lado basal, están en contacto con la membrana basal de Bruch subyacente que las separa de los vasos sanguíneos coroideos. Las células de EPR desempeñan papeles cruciales en el mantenimiento y la función de la retina y sus fotorreceptores. Estos incluyen la formación de la barrera hematorretiniana, la absorción de luz parásita, el suministro de nutrientes a la retina neural, la regeneración de pigmento visual y la captación y el reciclaje de los segmentos externos desprendidos de los fotorreceptores.

La disfunción, degeneración y pérdida de células de EPR son características prominentes de DMAE, enfermedad de Best y subtipos de retinitis pigmentosa (RP). La DMAE es la causa principal de discapacidad visual en el mundo occidental. Entre las personas mayores de 75 años de edad, el 25-30% están afectados por degeneración macular asociada a la edad (DMAE), con pérdida visual central progresiva que conduce a ceguera en el 6-8% de los pacientes. La degeneración retiniana implica principalmente la mácula, la parte central de la retina responsable del detalle visual fino y la percepción de los colores. La forma seca de DMAE se inicia por la hiperplasia del EPR y la formación de depósitos de drusas debajo del EPR o dentro de la membrana de Bruch que consisten en productos finales metabólicos. Puede progresar gradualmente hacia el estadio avanzado de atrofia geográfica (AG) con degeneración de células de EPR y fotorreceptores sobre grandes áreas de la mácula, provocando la pérdida visual central. El diez por ciento de pacientes con DMAE seca progresarán hacia DMAE neovascular (húmeda), con la aparición de vasos sanguíneos a través de la membrana de Bruch y con filtración y/o hemorragia intraocular posterior, lo que acelera la pérdida de visión central. Mientras que la neovascularización complicada puede tratarse con agentes anti-VEGF, actualmente no existe ningún tratamiento eficaz para detener la degeneración de EPR y fotorreceptores, y muchos pacientes perderán eventualmente su vista.

Los estudios de trasplante tanto en animales como en humanos proporcionan evidencias del efecto terapéutico potencial del trasplante de células de EPR en pacientes con DMAE. En humanos, la translocación macular sobre el EPR más periférico, así como el trasplante autólogo de EPR periférico como suspensiones celulares o parches de EPR y coroides, proporcionan una demostración de que la colocación de la mácula encima de células de EPR relativamente más sanas puede mejorar la función visual en algunos pacientes con DMAE. No obstante, los procedimientos quirúrgicos para el injerto autólogo constituyen un reto y están asociados a complicaciones significativas. Normalmente, las células de EPR se administran a través de una pequeña retinotomía después de un vitrectomía de 3 puertos convencional a un espacio subretiniano creado en el área macular a lo largo del borde entre las áreas de AG y la capa retiniana extrafoveal y de EPR mejor conservadas. El éxito de tal estrategia de reemplazo celular en el tratamiento de DMAE depende del establecimiento de un sistema de administración seguro que permita la supervivencia y función de las células trasplantadas y minimice el daño retiniano.

Los antecedentes de la técnica incluyen los documentos WO 2013/114360, WO 2013/074681, WO 2008/129554 y WO 2013/184809, la solicitud de patente estadounidense n.° 62/116.972 y la solicitud de patente estadounidense n.° 62/116.980.

Sumario de la invención

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto con degeneración macular asociada a la edad (DMAE) en forma seca, que comprende administrar en la subretina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende células de EPR humanas, en el que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en el que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto, tratando de ese modo al sujeto.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto con un estado o una enfermedad retiniana, que comprende administrar en la retina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende células de EPR poligonales humanas, en el que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en el que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto, en el que la cantidad terapéuticamente eficaz es de entre 50.000 y 5.000.000 células por administración, tratando de ese modo al sujeto.

Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto con un estado o una enfermedad retiniana, que comprende administrar en la retina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende células de EPR humanas usando un dispositivo, en el que el diámetro externo del dispositivo a través del cual se administran las células es de entre 90 y 100 pm, tratando de ese modo al sujeto, y en el que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en el que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, el dispositivo es una cánula.

Según algunas realizaciones de la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz es de entre 50.000 y 1.000. 000 células por administración.

Según algunas realizaciones de la invención, la cantidad terapéuticamente eficaz se selecciona del grupo que consiste en 50.000 células por administración, 200.000 células por administración, 500.000 células por administración y 1.000. 000 células por administración.

Según algunas realizaciones de la invención, las células se administran en el espacio subretiniano del sujeto.

Según algunas realizaciones de la invención, las células se administran en una sola administración.

Según algunas realizaciones de la invención, la composición farmacéutica comprende 500 células por pl -10.000 células por pl.

Según algunas realizaciones de la invención, cuando la cantidad es de 50.000 células por administración, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 500-1000 células por pl.

Según algunas realizaciones de la invención, cuando la cantidad es de 200.000 células por administración, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 2.000 células por pl.

Según algunas realizaciones de la invención, cuando la cantidad es de 500.000 células por administración, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 5.000 células por pl.

Según algunas realizaciones de la invención, cuando la cantidad es de 1.000.000 células por administración, la composición farmacéutica comprende aproximadamente 10.000 células por pl.

Según algunas realizaciones de la invención, el estado o la enfermedad retiniana se selecciona del grupo que consiste en retinitis pigmentosa, desprendimiento de retina, displasia retiniana, atrofia retiniana, retinopatía, distrofia macular, distrofia de conos, distrofia de conos y bastones, Malattia Leventinese, distrofia en panal de Doyne, distrofia de Sorsby, distrofias en patrón/mariposa, distrofia viteliforme de Best, distrofia de Carolina del Norte, distrofia coroidea areolar central, estrías angioides, maculopatía tóxica, enfermedad de Stargardt, miopía patológica, retinitis pigmentosa y degeneración macular.

Según algunas realizaciones de la invención, la enfermedad es degeneración macular asociada a la edad.

Según algunas realizaciones de la invención, , la degeneración macular asociada a la edad es degeneración macular asociada a la edad en forma seca.

Según algunas realizaciones de la invención, el sujeto cumple al menos uno de los criterios seleccionados del grupo que consiste en:

(i) tiene 55 años de edad o mayor;

(ii) tiene hallazgos funduscópicos de DMAE seca con atrofia geográfica en la mácula, área de disco por encima de 0,5 en al menos un ojo;

(iii) puede someterse a un procedimiento quirúrgico vitreorretiniano bajo cuidados de anestesia monitorizados; y (iv) no tiene ninguna enfermedad por inmunodeficiencia.

Según algunas realizaciones de la invención, el sujeto no tiene ninguna enfermedad retiniana distinta de DMAE. Según algunas realizaciones de la invención, el sujeto cumple cada uno de los criterios (i) - (iv).

Según algunas realizaciones de la invención, la apertura externa del dispositivo a través del cual se administran las células es de entre 90 y 100 |im.

Según algunas realizaciones de la invención, el dispositivo es una cánula.

Según algunas realizaciones de la invención, el dispositivo comprende además una aguja.

Según algunas realizaciones de la invención, el calibre de la cánula es 25G.

Según algunas realizaciones de la invención, el número de células Oct4+TRA-1-60+ en la población está por debajo de 1:250.000.

Según algunas realizaciones de la invención, al menos el 80% de las células expresan bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción.

Según algunas realizaciones de la invención, al menos el 80% de las células expresan factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF), tal como se mide mediante inmunotinción.

Según algunas realizaciones de la invención, más del 80% de las células expresan el gen 6 de caja emparejada (PAX-6), tal como se mide mediante FACS.

Según algunas realizaciones de la invención, las células secretan más de 500 ng de factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) por ml por día.

Según algunas realizaciones de la invención, las células secretan PEDF y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de forma polarizada.

Según algunas realizaciones de la invención, la razón de secreción apical de PEDF:secreción basal de PEDF es mayor de 1.

Según algunas realizaciones de la invención, la razón sigue siendo mayor de 1 después de incubación durante 8 horas a 2-8°C.

Según algunas realizaciones de la invención, la resistencia eléctrica transepitelial de las células sigue siendo mayor de 100 ohm después de incubación durante 8 horas a 2-8°C.

Según algunas realizaciones de la invención, la razón de secreción basal de VEGF:secreción apical de VEGF es mayor de 1.

Según algunas realizaciones de la invención, las células son capaces de rescatar la agudeza visual en la rata RCS después de administración subretiniana.

Según algunas realizaciones de la invención, las células son capaces de rescatar los fotorreceptores durante hasta 180 días tras la administración subretiniana en la rata RCS.

Según algunas realizaciones de la invención, las células se generan mediante diferenciación ex vivo de células madre embrionarias humanas.

Según algunas realizaciones de la invención, las células se generan:

(a) cultivando células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas humanas en un medio que comprende nicotinamida para generar células en diferenciación, en las que el medio está desprovisto de activina A; (b) cultivando las células en diferenciación en un medio que comprende nicotinamida y activina A para generar células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR; y

(c) cultivando las células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR en un medio que comprende nicotinamida, en las que el medio está desprovisto de activina A.

Según algunas realizaciones de la invención, las células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas se propagan en un medio que comprende bFGF y TGFp.

Según algunas realizaciones de la invención, las células madre embrionarias se cultivan en fibroblastos de cordón umbilical humanos.

Según algunas realizaciones de la invención, las etapas (a)-(c) se efectúan en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es menor de aproximadamente el 10%.

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además cultivar células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas en un medio en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es mayor de aproximadamente el 10% en presencia de nicotinamida antes de la etapa (a).

Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además cultivar las células diferenciadas en un medio en condiciones en las que el nivel de oxígeno atmosférico es mayor de aproximadamente el 10% en presencia de nicotinamida después de la etapa (c).

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado tal como entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de las realizaciones de la invención, a continuación se describen métodos y/o materiales a modo de ejemplo. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean necesariamente limitativos.

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

Algunas realizaciones de la descripción se describen en el presente documento, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos. Ahora, con referencia específica a los dibujos en detalle, se enfatiza que los particulares mostrados son a modo de ejemplo y están destinados para proporcionar discusión ilustrativa de las realizaciones de la descripción. A este respecto, la descripción, tomada con los dibujos, hace que sea evidente para los expertos en la técnica la manera de poner en práctica las realizaciones de la descripción.

En los dibujos:

La figura 1 es un dibujo del esquema de inyección subretiniana. Obsérvese que en este dibujo, la colocación de los puertos quirúrgicos no son anatómicamente precisos (Stout y Francis, 2011, Human Gene Ther. 22 de mayo de 2011 (5): 531-5)

Las figuras 2A-C son una fotografía que ilustra el ensamblaje del dispositivo de administración y carga de las células formuladas. A. Jeringa conectada a una aguja de llenado roma de 18G. B. Reemplazo de la aguja de llenado roma de 18G con el tubo de extensión. C. Dispositivo de administración ensamblado.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

Antes de explicar al menos una realización de la invención con detalle, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados por los ejemplos. La invención puede presentar otras realizaciones o practicarse o llevarse a cabo de diversos modos.

La DMAE es una enfermedad crónica progresiva de la retina central y la causa principal de pérdida de visión en todo el mundo. La mayor parte de la pérdida visual se produce en los últimos estadios de la enfermedad debido a uno de dos procesos: DMAE neovascular (“húmeda”) y atrofia geográfica (AG, “seca”). En la degeneración macular asociada a la edad neovascular, la neovascularización coroidea irrumpe en el sub-EPR o espacio subretiniano, filtrando líquidos, lípidos y sangre y conduciendo a la formación de cicatrices fibrosas. En la AG, se produce la atrofia progresiva del epitelio pigmentario retiniano, la coriocapilar y los fotorreceptores. La forma seca de DMAE es más común (el 85-90% de todos los casos), pero puede progresar hacia la forma “húmeda” que, si no se trata, conduce a una pérdida de visión rápida y grave.

La prevalencia estimada de la DMAE es de 1 de cada 2.000 personas en EE:UU: y otros países desarrollados. Se espera que esta prevalencia aumente junto con la proporción de ancianos en la población general. Los factores de riesgo de la enfermedad incluyen factores tanto medioambientales como genéticos.

La patogénesis de la enfermedad implica anomalías en cuatro tejidos funcionalmente interrelacionados, es decir, epitelio pigmentario retiniano (EPR), membrana de Bruch, coriocapilar y fotorreceptores. Sin embargo, el deterioro de la función de las células de EPR constituye un evento temprano y crucial en las rutas moleculares que conducen a cambios clínicamente relevantes en la DMAE.

Actualmente, no existe ningún tratamiento eficaz o aprobado para DMAE seca. Las medidas profilácticas incluyen suplementos de vitaminas/minerales. Estos reducen el riesgo de desarrollar DMAE húmeda, pero no afectan al desarrollo de progresión de atrofia geográfica.

Actualmente, existen aproximadamente veinte terapias en diversas fases de desarrollo clínico. Entre estas se encuentran los inhibidores del sistema del complemento y corticosteroides, moduladores del ciclo visual, antioxidantes, neuroprotectores, potenciadores vasculares y las terapias celular y génica; véanse, por ejemplo, Dugel et al., 2014, Retina Today, páginas 70-72; y Patel et al., 2015, Practical Retina, enero de 2015, vol. 46, n.° 1, páginas 8-13.

Las células madre embrionarias humanas se han propuesto como fuente celular para la generación de células de EPR. Se han usado dos enfoques generales para obtener células de EPR a partir de hESC, diferenciación espontánea y diferenciación dirigida. En la diferenciación espontánea, se deja que las hESC en colonias planas o en cuerpos embrionarios (EB) se diferencien de manera espontánea en una población de células que contiene células de EPR pigmentadas. El método de diferenciación dirigida usa varios factores para impulsar la diferenciación de hESC en células de EPR; véase, por ejemplo, el documento WO 2008/129554.

Los presentes inventores han descubierto ahora las condiciones óptimas para el tratamiento clínico con células de EPR, incluyendo las dosis y regímenes de tratamiento y los dispositivos para administrar las células. La presente invención proporciona además criterios para la selección de poblaciones de pacientes que se beneficiarían del tratamiento con las células.

Por tanto, según un aspecto de la presente invención, se proporciona un método de tratamiento de un sujeto con una enfermedad retiniana (por ejemplo, degeneración macular asociada a la edad (DMAE) en forma seca), que comprende administrar en la subretina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende células de EPR humanas, en el que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en el que la resistencia eléctrica transepitelial de las células es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto, tratando de ese modo al sujeto.

Los estados oculares para los que las composiciones farmacéuticas sirven como opción terapéutica incluyen, pero no se limitan a, trastornos o enfermedades retinianas asociados generalmente con disfunción retiniana, lesión retiniana y/o pérdida de epitelio pigmentario retiniano. Una lista no limitativa de estados que pueden tratarse según la invención comprende retinitis pigmentosa, amaurosis congénita de Leber, degeneración macular hereditaria o adquirida, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), enfermedad de Best, desprendimiento de retina, atrofia girata, coroideremia, distrofia en patrón así como otras distrofias del EPR, enfermedad de Stargardt, daño retiniano y del EPR debido al daño provocado por uno cualquiera de lesión fótica, por láser, inflamatoria, infecciosa, por radiación, neovascular o traumática.

Según una realización particular, la enfermedad es degeneración macular asociada a la edad en forma seca.

Los sujetos que pueden tratarse incluyen primate (incluyendo humanos), cánidos, félidos, ungulados (por ejemplo, equino, bovino, porcino (por ejemplo, cerdo)), aves y otros sujetos. Los humanos y animales no humanos que tienen importancia comercial (por ejemplo, animales de ganado y domesticados) son de particular interés. Los mamíferos a modo dejemplo que pueden tratarse incluyen cánidos; félidos; equinos; bovinos; ovinos; roedores, etc., y primates, particularmente humanos. Pueden usarse modeles de animales no humanos, particularmente mamíferos, por ejemplo, primate, murino, lagomorfos, etc., para las investigaciones experimentales.

Según una realización, el sujeto que se trata tiene 55 años de edad o mayor.

Según otra realización, el sujeto que se trata tiene hallazgos funduscópicos de DMAE seca con atrofia geográfica en la mácula, área de disco por encima de 0,5 (1,25 mm2y hasta 17 mm2) en al menos un ojo.

Según todavía otra realización, el sujeto que se trata está en un estado de tal manera que puede someterse a un procedimiento quirúrgico vitreorretiniano bajo cuidados de anestesia monitorizados.

Según todavía otra realización, el sujeto no tiene ninguna enfermedad por inmunodeficiencia.

Según todavía otra realización, el sujeto no tiene miopía axial mayor de -6 dioptrías.

Según todavía otra realización, el sujeto no tiene antecedentes de reparación de desprendimiento de retina.

Según todavía otra realización, el sujeto no tiene ninguna enfermedad retiniana distinta de DMAE.

Preferiblemente, el sujeto que se trata cumple al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos de los criterios anteriores.

Las células de EPR generadas tal como se describe en el presente documento pueden trasplantarse a diversos sitios diana dentro del ojo de un sujeto. Según una realización, las células de EPR se trasplantan al espacio subretiniano del ojo, que es la ubicación anatómica normal del EPR (entre los segmentos externos de los fotorreceptores y la coroides). Además, dependiendo de la capacidad migratoria y/o efectos paracrinos positivos de las células, puede considerarse el trasplante en compartimentos oculares adicionales, incluyendo el espacio vítreo, la retina interna o externa, la periferia retiniana y dentro de la coroides.

El número de células viables que pueden administrarse al sujeto está normalmente entre 50.000 y 5x106, entre 50.000 y 4x106, entre 50.000 y 3x106, entre 50.000 y 2x106, entre 50.000 y 1x106, entre 50.000 y 500.000 por inyección.

La presente invención contempla una sola administración o múltiples administraciones. Preferiblemente, el tiempo entre una primera administración a un ojo y una segunda administración al mismo ojo es de al menos un mes.

Según una realización específica, el número de células viables que pueden administrarse por ojo del sujeto está entre 50.000 y 2x106, entre 50.000 y 1x106, entre 50.000 y 500.000. Las dosis a modo de ejemplo incluyen 50.000 células por ojo, 100.000 células por ojo, 200.000 células por ojo, 300.000 células por ojo, 400.000 células por ojo, 500.000 células por ojo y 1x106 células por ojo.

Las células se formulan normalmente en un portador (por ejemplo, una disolución isotónica y/o una solución salina), tal como BSS plus™. El portador puede comprender opcionalmente factores adicionales que respaldan el injerto, la integración, supervivencia, potencia, etc., del EPR.

Una concentración a modo de ejemplo de una composición farmacéutica que comprende 50.000 células es de aproximadamente 500 células por pl o 1.000 células por pl. Una concentración a modo de ejemplo de una composición farmacéutica que comprende 200.000 células viables es de aproximadamente 500 células viables por pl o 1.000 células viables por pl. Una concentración a modo de ejemplo de una composición farmacéutica que comprende 500.000 células es de aproximadamente 5.000 células viables por pl o aproximadamente 10.000 células viables por pl. Una concentración a modo de ejemplo de una composición farmacéutica que comprende 1x106 células es de aproximadamente 10.000 células viables por pl.

El trasplante puede realizarse mediante diversas técnicas conocidas en la técnica. Los métodos para realizar trasplantes de EPR se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 5.962.027, 6.045.791 y 5.941.250 y en Eye Graefes Arch Clin Exp Opthalmol, marzo de 1997; 235(3):149-58; Biochem Biophys Res Commun, 24 de febrero de 2000; 268(3): 842-6; Opthalmic Surg, febrero de 1991; 22(2): 102-8. Los métodos para realizar trasplantes de córnea se describen en, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.755.785 y en Eye 1995; 9 (Pt 6 Su):6-12; Curr Opin Opthalmol, agosto de 1992; 3(4): 473-81; Ophthalmic Surg Lasers, abril de 1998; 29(4): 305-8; Ophthalmology, abril de 2000; 107(4): 719-24; y Jpn J Ophthalmol, noviembre-diciembre de 1999; 43(6): 502-8. Si van a utilizarse efectos principalmente paracrinos, las células también pueden administrarse y mantenerse en el ojo encapsuladas dentro de un recipiente semipermeable, que también disminuirá la exposición de las células al sistema inmunitario del huésped (Neurotech USAc Nt F administration system; PNAS, 7 de marzo de 2006, vol. 103(10): 3896 3901).

La etapa de administración puede comprender la administración intraocular de las células de EPR en un ojo que lo necesita. La administración intraocular puede comprender la inyección de las células de EPR en el espacio subretiniano.

Según una realización, el trasplante se realiza mediante cirugía por vitrectomía a través de la parte plana seguido por la administración de las células en el espacio subretiniano a través de una pequeña apertura retiniana o mediante inyección directa.

Las células de EPR pueden trasplantarse de diversas formas. Por ejemplo, las células de EPR pueden introducirse en el sitio diana en forma de suspensión de células, con matriz o adheridas sobre una matriz o una membrana, una matriz extracelular o un sustrato, tal como un polímero biodegradable, o una combinación. Las células de EPR también pueden trasplantarse junto (cotrasplante) con otras células retinianas, tal como con fotorreceptores.

Según una realización particular, se administra una disolución acuosa (por ejemplo, una disolución isotónica y/o una solución salina) o aire en el espacio subretiniano, formando de ese modo una ampolla inicial. Luego se administran las células de EPR como una suspensión o sobre un armazón en el mismo espacio subretiniano. La inyección puede ser a través de una aguja o cánula de inyección.

Según una realización particular, las células se administran como una suspensión celular usando un dispositivo de administración (por ejemplo, aguja o cánula de inyección) que tiene un diámetro externo entre 90 y 100 pm. Según otra realización, las células se administran como una suspensión celular usando un dispositivo de administración (por ejemplo, aguja o cánula de inyección) que tiene un diámetro de apertura interno entre 65 y 75 |im.

Según realizaciones de este aspecto de la presente invención, las células de EPR en su formulación final a una concentración de 70.000-1,4 x106 células viables/100 pl se cargan en un dispositivo de administración (por ejemplo, jeringa de 1 ml) usando una aguja de 18G (se cargan 70.000 células para la dosis de 50.000, se cargan 700.000 células para la dosis de 500.000 y se cargan 1,4 x106 células para la dosis de 1 x106). La aguja de 18G puede reemplazarse luego con un tubo de extensión (por ejemplo, entre 5 y 10 cm) y se retira el aire a través del tubo de extensión. Una cánula de inyección que tiene una punta que tiene un diámetro externo entre 90 y 100 |im (por ejemplo, 41G) puede unirse luego al extremo del tubo de extensión. Según otra realización, el diámetro interno de la apertura de la punta es de aproximadamente 65-75 |im (por ejemplo, aproximadamente 70 |im).

La concentración de las células de EPR tras la carga en la aguja o cánula de inyección puedes estar entre aproximadamente 2.000 células viables/pl y aproximadamente 14.000 células viables/pl. La concentración de células viables de EPR que van a administrarse desde la aguja o cánula de inyección puede estar entre aproximadamente 1.000 células viables/pl y aproximadamente 10.000 células viables/pl.

Según una realización particular, la cánula comprende una punta de 41G (por ejemplo, tal como fabrica Peregrine). Según todavía otra realización, la cánula es una cánula de 25G.

La presente invención proporciona un artículo de fabricación que comprende una aguja de 18G y una cánula de 25G/41G. Un dispositivo de este tipo puede usarse para la captación de células de EPR y la posterior administración intraocular de células de EPR.

El dispositivo puede comprender además un tubo de extensión (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 15 cm) y una jeringa (por ejemplo, jeringa de 1-2 ml).

Según otro aspecto, se proporciona un artículo de fabricación que comprende una cánula de 25G/41G, una jeringa (por ejemplo, jeringa de 1-2 ml) y un tubo de extensión (por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 15 cm). El artículo de fabricación puede comprender además una aguja de 18G.

La eficacia del tratamiento puede evaluarse mediante diferentes mediciones de la función y estructura visual y ocular, incluyendo, entre otros, agudeza visual mejor corregida (BCVA), sensibilidad retiniana a la luz tal como se mide mediante perimetría o microperimetría en estados adaptados a la oscuridad y luz, electrorretinografía (ERG) de campo completo, multifocal, focal o en patrón, sensibilidad por contraste, velocidad de lectura, visión de colores, examen biomicroscópico clínico, fotografía del fondo, tomografía de coherencia óptica (TCO), autofluorescencia del fondo (AFF), obtención de imágenes infrarrojas y multicolor, angiografía con fluoresceína o ICG, y medios adicionales usados para evaluar la función visual y la estructura ocular.

Pueden administrarse corticosteroides al sujeto antes de o simultáneamente con la administración de las células de EPR, tales como prednisolona o metilprednisolona, Predforte.

Según otra realización, no se administran corticosteroides al sujeto antes de o simultáneamente con la administración de las células de EPR, tales como prednisolona o metilprednisolona, Predforte.

Pueden administrarse fármacos inmunosupresores al sujeto antes de, simultáneamente con y/o después del tratamiento.

El fármaco inmunosupresor puede pertenecer a las siguientes clases:

Glucocorticoides, citostáticos (por ejemplo, agente alquilante o antimetabolito), anticuerpos (policlonales o monoclonales), fármacos que actúan sobre inmunofilinas (por ejemplo, ciclosporina, tacrolimús o sirolimús). Los fármacos adicionales incluyen interferones, opiodes, proteínas de unión a TNF, micofenolato y agentes biológicos pequeños.

Los ejemplos de fármacos inmunosupresores incluyen: células madre mesenquimatosas, anticuerpo policlonal globulina antilinfocítica (GAL), anticuerpo policlonal globulina antitimocítica (GAT), azatioprina, BAS1 L1X1MAB® (anticuerpo anti-receptor L-2Ra I), ciclosporina (ciclosporina A), DACLIZUMAB® (anticuerpo anti-receptor L-2Ra I), everolimús, ácido micofenólico, RITUXlMAB® (anticuerpo anti-CD20), sirolimús, tacrolimús, tacrolimús y/o micofenolato de mofetilo.

Pueden administrarse antibióticos al sujeto antes de, simultáneamente con y/o después del tratamiento. Los ejemplos de antibióticos incluyen Oflox, gentamicina, cloramfenicol, Tobrex, Vigamox o cualquier otra preparación antibiótica tópica autorizada para uso ocular.

“Células de epitelio pigmentario retiniano”, “células de EPR”, “EPR”, que pueden usarse de manera intercambiable según permita el contexto, se refieren a células de un tipo de células funcionalmente similar al de células de EPR nativas que forman la capa de células del epitelio pigmentario de la retina (por ejemplo, tras el trasplante dentro de un ojo, muestran actividades funcionales similares a las de células de EPR nativas). Por tanto, los términos “células de epitelio pigmentario retiniano”, “células de EPR”, o “EPR” pueden usarse para hacer referencia tanto a células de EPR nativas de la capa pigmentada de la retina como a células de EPR directamente diferenciadas de células madre humanas (hSC), según la presente divulgación.

El término “células de EPR derivadas de hSC” se usa en el presente documento para indicar células de EPR que se obtienen mediante la diferenciación dirigida de hSC. Según una realización preferida, las células de EPR derivadas de hSC son células de EPR funcionales tal como se muestran mediante los parámetros definidos a continuación en el presente documento. El término “diferenciación dirigida” se usa de manera intercambiable con el término “diferenciación inducida de EPR” y debe entenderse como que significa el procedimiento de manipulación de las hSC en condiciones de cultivo que inducen/fomentan la diferenciación en el tipo de células de EPR.

Según una realización particular, las células de EPR se obtienen mediante diferenciación dirigida de hSC en presencia de uno o más miembros de la superfamilia de TGFp, y muestran al menos una de las siguientes características:

- durante la diferenciación, las células cultivadas responden a la señalización de TGFP;

- las células de EPR expresan marcadores indicativos de la diferenciación terminal, por ejemplo, bestrofina 1, CRALBP y/o RPE65;

- después del trasplante (es decir, in situ), las células de EPR muestran fotorreceptores que respaldan el efecto trófico adyacentes a las células de EPR;

- además, in situ, las células de EPR son capaces de funcionar con fagocitosis de segmentos externos desprendidos de los fotorreceptores como parte del proceso de renovación normal de estos fotorreceptores;

- además, in situ, las células de EPR son capaces de generar una barrera retiniana y funcionar en el ciclo visual.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión “células madre” se refiere a células que son capaces de permanecer en una estado indiferenciado (por ejemplo, células madre pluripotentes o multipotentes) durante periodos de tiempo prolongados en cultivo hasta que se induzca su diferenciación en otros tipos de células que tienen una función especializada particular (por ejemplo, células completamente diferenciadas). Preferiblemente, la expresión “células madre” abarca células madre embrionarias (ESC), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre adultas, células madre mesenquimatosas y células madre hematopoyéticas.

Según una realización particular, las células de EPR se generan a partir de ESC.

La expresión “células madre embrionarias” se refiere a células embrionarias que son capaces de diferenciarse en células de las tres capas germinales embrionarias (es decir, endodermo, ectodermo y mesodermo) o permanecer en un estado indiferenciado. Como referencia, la expresión “células madre embrionarias” puede comprender células que se obtienen a partir del tejido embrionario formado después de la gestación (por ejemplo, blastocisto) antes de la implantación del embrión (es decir, un blastocisto preimplantación), células de blastocistos expandidos (EBC) que se obtienen a partir de un blastocisto en fase posimplantación/pregastrulación (véase el documento WO2006/040763) y células germinales embrionarias (EG) que se obtienen a partir del tejido genital de un feto en cualquier momento durante la gestación, preferiblemente antes de 10 semanas de gestación. Las células madre embrionarias de algunas realizaciones de la invención pueden obtenerse usando métodos de cultivo de células bien conocidos. Como ejemplo de referencia, las células madre embrionarias humanas pueden aislarse de blastocistos humanos. Los blastocistos humanos se obtienen normalmente a partir de embriones de preimplantación in vivo humanos o a partir de embriones fertilizados in vitro (IVF). Alternativamente, puede expandirse un embrión humano de una sola célula a la etapa de blastocisto. Para el aislamiento de células ES humanas, se retira la zona pelúcida del blastocisto y se aísla la masa celular interna (MCI) mediante un procedimiento en el que se lisan células de trofectodermo y se retiran de la MCI intacta mediante pipeteo suave. Luego se siembra la MCI en un matraz de cultivo tisular que contiene el medio apropiado que permite su excrecencia. Después de 9 a 15 días, la excrecencia derivada de la MCI se disocia en grupos, o bien mediante una disociación mecánica o bien mediante una degradación enzimática, y las células vuelven a sembrarse en placa luego en un medio de cultivo tisular nuevo. Las colonias que demuestran morfología indiferenciada se seleccionan individualmente mediante una micropipeta, se disocian mecánicamente en grupos y vuelven a sembrarse en placa. Las células ES resultantes se dividen luego de manera rutinaria cada 4-7 días. Para detalles adicionales sobre métodos de preparación de células ES humanas, véanse Reubinoff et al., Nat Biotechnol, mayo de 2000: 18(5): 559; Thomson et al., [patente estadounidense n.° 5.843.780; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7844, 1995]; Bongso et al., [Hum Reprod 4: 706, 1989]; y Gardner et al., [Fertil. Steril. 69: 84, 1998].

Se apreciará que también pueden usarse células madre disponibles comercialmente (como referencia sólo). Las células ES humanas pueden adquirirse del registro de células madre embrionarias humanas del NIH [protocolo de transferencia de hipertexto://grants (dot) nih (dot) gov/stem_ceNs/registry/current (dot) htm]. Los ejemplos de referencia no limitativos de líneas de células madre embrionarias disponibles comercialmente son HAD-C102, ESI, BG01, BG02, BG03, BG04, CY12, CY30, CY92, CY10, TE03, TE32, CHB-4, CHB-5, CHB-6, CHB-8, CHB-9, CHB-10, CHB-11, CHB-12, HUES 1, HUES 2, HUES 3, HUES 4, HUES 5, HUES 6, HUES 7, HUES 8, HUES 9, HUES 10, HUES 11, HUES 12, HUES 13, HUES 14, HUES 15, HUES 16, HUES 17, HUES 18, HUES 19, HUES 20, HUES 21, HUES 22, HUES 23, HUES 24, HUES 25, HUES 26, HUES 27, HUES 28, CyT49, RUES3, WA01, UCSF4, NYUES1, NYUES2, NYUES3, NYUES4, NYUES5, NYUES6, NYUES7, UCLA 1, UCLA 2, UCLA 3, WA077 (H7), WA09 (H9), WA13(H13), WA14 (H14), HUES 62, HUES 63, HUES 64, CT1, CT2, 17 CT3, CT4, MA135, Eneavour-2, WIBR1, WIBR2, WIBR3, WIBR4, WIBR5, WIBR6, HUES 45, Shef 3, Shef 6, BJNhem19, BJNhem20, SA001, SA001.

Según una realización de referencia, la línea de células madre embrionarias es HAD-C102 o ESI.

Además, también pueden obtenerse células ES a partir de otras especies, incluyendo ratón (Mills y Bradley, 2001), hámster dorado [Doetschman et al., 1988, Dev Biol. 127: 224-7], rata [lannaccone et al., 1994, Dev Biol. 163: 288-92], conejo [Giles et al. 1993, Mol Reprod Dev. 36: 130-8; Graves y Moreadith, 1993, Mol Reprod Dev. 1993, 36: 424-33], varias especies de mascotas [Notarianni et al., 1991, J Reprod Fertil, supl. 43: 255-60; Wheeler 1994, Reprod Fertil Dev. 6: 563-8; Mitalipova et al., 2001, Cloning. 3: 59-67] y especies de primates no humanos (mono Rhesus y tití) [Thomson et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92: 7844-8; Thomson et al., 1996, Biol Reprod. 55: 254-9].

Como referencia, pueden obtenerse células de blastocistos expandidos (EBC) a partir de un blastocisto de al menos nueve días después de la fertilización en una etapa antes de la gastrulación. Antes de cultivar el blastocisto, se digiere la zona pelúcida [por ejemplo, mediante disolución ácida de Tyrode (Sigma Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.)] para exponer la masa celular interna. Luego se cultivan in vitro los blastocistos como embriones completos durante al menos nueve y no más de catorce días después de la fertilización (es decir, antes del evento de gastrulación) usando métodos de cultivo de células madre embrionarias convencionales.

Otro método para preparar células ES se describe en Chung et al., Cell Stem Cell, volumen 2, edición 2, 113-117, 7 de febrero de 2008. Este método comprende retirar una sola célula de un embrión durante un proceso de fertilización in vitro. El embrión no se destruye en este proceso.

Aún otro método para preparar células ES es mediante partenogénesis. El embrión tampoco se destruye en el proceso.

Los métodos de cultivo de ES practicados en la actualidad se basan principalmente en el uso de capas de células alimentadoras que secretan factores necesarios para la proliferación de células madre, mientras que al mismo tiempo, inhiben su diferenciación. Las capas alimentadoras a modo de ejemplo incluyen fibroblastos embrionarios humanos, células epiteliales falopianas adultas, fibroblastos embrionarios primarios de ratón (PMEF), fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), fibroblastos fetales murinos (MFF), fibroblastos embrionarios humanos (HEF), fibroblastos humanos obtenidos a partir de la diferenciación de células madre embrionarias humanas, células de músculo fetal humanas (HFM), células de piel fetal humanas (HFS), células de piel adultas humanas, fibroblastos de prepucio humanos (HFF), fibroblastos humanos obtenidos a partir del cordón umbilical o la placenta y células estromales de médula humanas (hMSC). Pueden añadirse factores de crecimiento al medio para mantener las ESC en un estado indiferenciado. Tales factores de crecimiento incluyen bFGF y/o TGFp.

Los sistemas libres de células alimentadoras también se han usado en cultivos de células ES, tales sistemas utilizan matrices complementadas con reemplazo de suero, citocinas, IL6, quimera de receptor de IL6 soluble y/o factores de crecimiento como reemplazo de la capa de células alimentadoras. Las células madre pueden hacerse crecer en una superficie sólida tal como una matriz extracelular (por ejemplo, MatrigelRTM o laminina) en presencia de un medio de cultivo. A diferencia de los cultivos basados en alimentadoras que requieren el crecimiento simultáneo de células alimentadoras y células madre y que pueden dar como resultados poblaciones de células mixtas, las células madre hechas crecer en sistemas libres de alimentadoras se separan fácilmente de la superficie. El medio de cultivo usado para hacer crecer las células madre contiene factores que inhiben eficazmente la diferenciación y fomentan su crecimiento, tal como medio acondicionado con MEF y bFGF. Sin embargo, los sistemas de cultivo libres de alimentadoras usados comúnmente utilizan una matriz de origen animal (por ejemplo, MatrigelRTM) complementada con suero de ratón o bovino, o con medio acondicionado con MEF [Xu C, et al. (2001). Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19: 971-4], que presentan el riesgo de transferencia cruzada de patógenos de animales a las células ES humanas, comprometiendo de ese modo futuras aplicaciones clínicas.

Se conocen numerosos métodos para diferenciar ESC hacia el linaje de EPR, e incluyen tanto protocolos de diferenciación dirigida, tales como aquellos descritos en los documentos WO 2008/129554, 2013/184809, como protocolos de diferenciación espontánea, tales como aquellos descritos en la patente estadounidense n.° 8.268.303 y la solicitud de patente estadounidense 20130196369.

Según una realización particular, las células de EPR se generan a partir de células ESC usando un protocolo de diferenciación dirigida.

En un protocolo de diferenciación a modo de ejemplo, las células madre embrionarias se diferencian hacia el linaje de células de EPR usando un primer agente de diferenciación y luego se diferencian adicionalmente hacia células de EPR usando un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp) (por ejemplo, los subtipos TGFp1, TGFp2 y TGFp3, así como ligandos homólogos incluyendo activina (por ejemplo, activina A, activina B y activina AB), nodal, hormona antimülleriana (AMH), algunas proteínas morfogenéticas óseas (BMP), por ejemplo, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6 y BMP7, y factores de crecimiento y diferenciación (GDF)). Según una realización específica, el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp) es activina A, por ejemplo, entre 20 y 200 ng/ml, por ejemplo, 100-180 ng/ml.

Según una realización particular, el primer agente de diferenciación es nicotinamida (NA), por ejemplo, entre 1 y 100 mM, entre 5 y 50 mM, entre 5 y 20 mM, por ejemplo, 10 mM.

NA, también conocida como “niacinamida”, es la forma del derivado de amida de la vitamina B3 (niacina) que se piensa que conserva y mejora la función de células beta. NA tiene la fórmula química C6H6N2O. NA es esencial para el crecimiento y la conversión de alimentos en energía, y se ha usado en el tratamiento de artritis y en el tratamiento y la prevención de diabetes.

En el contexto de la presente divulgación, el término NA también indica derivados de NA y miméticos de nicotinamida. El término “derivado de nicotinamida (NA)”, tal como se usa en el presente documento, indica un compuesto que es un derivado químicamente modificado de la NA natural. La modificación química puede incluir, por ejemplo, una sustitución en el anillo de piridina de la estructura básica de la NA (a través del miembro de carbono o nitrógeno del anillo), a través de los átomos de nitrógeno u oxígeno del resto de amida, así como la deleción o el reemplazo de un grupo, por ejemplo, para formar un análogo de tiobenzamida de la NA, siendo todo ello tal como aprecian los expertos en química orgánica. El derivado en el contexto de la invención también incluye el derivado nucleosídico de la NA (por ejemplo, nicotinamida-adenina). Se describen una variedad de derivados de NA, algunos también en conexión con una actividad inhibidora de la enzima PDE4 (documento WO03/068233; documento WO02/060875; documento GB2327675A) o como inhibidores de tirosina cinasas del receptor de VEGF (documento WO01/55114). Por ejemplo, el procedimiento de preparación de derivados de 4-aril-nicotinamida (documento WO05/014549).

Los miméticos de nicotinamida pueden sustituirse por nicotinamida en los medios. Los miméticos de nicotinamida abarcan cualquier compuesto que recapitule los efectos de la nicotinamida en la diferenciación y maduración de células de EPR a partir de células pluripotentes.

Los miméticos de nicotinamida incluyen formas modificadas de nicotinamida y análogos químicos de nicotinamida. Los miméticos de nicotinamida a modo de ejemplo incluyen ácido benzoico, ácido 3-aminobenzoico y 6-aminonicotinamida. Otra clase de compuestos que pueden actuar como miméticos de nicotinamida son inhibidores de poli-(ADP-ribosa)-polimerasa (PARP). Los inhibidores de PARP a modo de ejemplo incluyen 3-aminobenzamida, iniparib (BSI 201), olaparib (AZD-2281), rucaparib (AG014699, PF-01367338), veliparib (ABT-888), CEP 9722, MK 4827 y BMN-673.

Según una realización particular, la diferenciación se efectúa de la siguiente manera:

a) cultivo de ESC en un medio que comprende un primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida); y

b) cultivo de las células obtenidas de la etapa a) en un medio que comprende un miembro de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, activina A) y el primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida).

Preferiblemente, la etapa (a) se efectúa en ausencia del miembro de la superfamilia de TGFp.

El protocolo descrito anteriormente puede continuarse cultivando las células obtenidas en la etapa b) en un medio que comprende el primer agente de diferenciación (por ejemplo, nicotinamida), pero desprovisto de un miembro de la superfamilia de TGFp (por ejemplo, activina A). Esta etapa se denomina en el presente documento etapa (c).

El protocolo descrito anteriormente se describe ahora con más detalle, con realizaciones adicionales.

Etapa (a): el proceso de diferenciación se inicia una vez que se obtienen cantidades suficientes de ESC. Se retiran normalmente del cultivo celular adherente (por ejemplo, usando colagenasa A, dispasa, TrypLE Select, EDTA) y se siembran sobre un sustrato no adherente (por ejemplo, placa de cultivo celular) en presencia de nicotinamida (y ausencia de activina A). Una vez que se siembran las células sobre el sustrato no adherente (por ejemplo, placa de cultivo celular), el cultivo celular puede denominarse suspensión celular, preferiblemente grupos flotantes libres en un cultivo de suspensión, es decir, agregados de células derivados de células madre embrionarias humanas (hESC). Las fuentes de células madre flotantes libres se describieron previamente en el documento WO 06/070370

Esta etapa puede efectuarse durante un mínimo de 1 día, más preferiblemente dos días, tres días, 1 semana o incluso 10 días. Preferiblemente, las células no se cultivan durante más de 2 semanas en suspensión junto con la nicotinamida (y en ausencia de activina).

Según una realización preferida, cuando las células se cultivan sobre el sustrato no adherente, por ejemplo, placas de cultivo celular, las condiciones de oxígeno atmosférico se manipulan de tal manera que el porcentaje es menor de aproximadamente el 20%, el 15%, el 10%, más preferiblemente menor de aproximadamente el 9%, menor de aproximadamente el 8%, menor de aproximadamente el 7%, menor de aproximadamente el 6% y más preferiblemente de aproximadamente el 5%.

Según una realización particular, las células se cultivan inicialmente sobre el sustrato no adherente en condiciones de oxígeno atmosférico normales y luego se reducen hasta condiciones de oxígeno atmosférico menores que las normales.

Los ejemplos de sustratos no adherentes incluyen, pero no se limitan a, fibronectina, laminina, poli-D-lisina y gelatina.

Los ejemplos de placas de cultivo celular no adherentes incluyen aquellas fabricadas por Hydrocell (por ejemplo, n.° de cat. 174912), Nunc, etc.

Etapa (b): después de la primera etapa de diferenciación dirigida, (etapa (a); es decir, cultivo en presencia de nicotinamida (por ejemplo, 10 mM) en condiciones de cultivo no adherentes en condiciones de oxígeno atmosférico bajas o normales), las células semidiferenciadas se someten luego a una etapa adicional de diferenciación sobre un sustrato adherente; cultivo en presencia de nicotinamida (por ejemplo, 10 mM) y activina A (por ejemplo, 140 ng/ml, 150 ng/ml, 160 ng/ml o 180 ng/ml). Esta etapa puede efectuarse durante al menos un día, al menos dos días, al menos tres días, al menos 5 días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas, al menos cuatro semanas, al menos cinco semanas, al menos seis semanas, al menos siete semanas, al menos ocho semanas, al menos nueve semanas, al menos diez semanas. Preferiblemente, esta etapa se efectúa durante aproximadamente dos semanas. Esta etapa de diferenciación puede efectuarse en condiciones de oxígeno atmosférico bajas o normales, tal como se detalló anteriormente en el presente documento.

Etapa (c): después de la segunda etapa de diferenciación dirigida (es decir, cultivo en presencia de nicotinamida y activina A sobre un sustrato adherente; etapa (b)), las células diferenciadas adicionalmente se someten opcionalmente a una etapa posterior de diferenciación sobre el sustrato adherente; cultivo en presencia de nicotinamida (por ejemplo, 10 mM), en ausencia de activina A. Esta etapa puede efectuarse durante al menos un día, 2, días, 5 días, al menos una semana, al menos dos semanas, al menos tres semanas o incluso cuatro semanas. Preferiblemente, esta etapa se efectúa durante aproximadamente una semana. Esta etapa de diferenciación también puede llevarse a cabo en condiciones de oxígeno atmosférico bajas o normales, tal como se detalló anteriormente en el presente documento.

Después de esta etapa de diferenciación, las condiciones de oxígeno atmosférico pueden devolverse opcionalmente a las condiciones atmosféricas normales y cultivarse durante al menos un día más, al menos 2 días más, al menos 5 días más, al menos una semana más (por ejemplo, hasta dos semanas) en presencia de nicotinamida (por ejemplo, 10 mM) y en ausencia de activina A.

El medio básico según la descripción es cualquier medio de cultivo celular conocido en la técnica para respaldar el crecimiento celular in vitro, normalmente, un medio que comprende una disolución de base definida, que incluye sales, azúcares, aminoácidos y cualquier otro nutriente requerido para el mantenimiento de las células en el cultivo en un estado viable. Los ejemplos no limitativos de medios básicos disponibles comercialmente que pueden utilizarse según la descripción comprenden Nutristem (sin bFGF ni TGFp para la diferenciación de ESC, con bFGF y TGFp para la expansión de ESC), Neurobasal™, KO-DMEM, DMEM, DMEM/F12, medio de crecimiento de células madre Cellgro™ o X-Vivo™. El medio básico puede complementarse con una variedad de agentes tal como se conoce en la técnica de los cultivos celulares. Lo siguiente es una referencia no limitativa a diversos complementos que pueden incluirse en el sistema de cultivo que va a usarse según la presente divulgación:

- medio que contiene suero o con un reemplazo de suero, tal como, sin limitarse a los mismos, reemplazo de suero KnockOut (KOSR), Nutridoma-CS, TCH™, N2, derivado de N2 o B27, o una combinación;

- un componente de la matriz extracelular (ECM), tal como, sin limitarse a los mismos, fibronectina, laminina, colágeno y gelatina. El ECM puede usarse luego para portar el uno o más miembros de la superfamilia de TGFp de factores de crecimiento;

- un agente antibacteriano, tal como, sin limitarse a los mismos, penicilina y estreptomicina;

- aminoácidos no esenciales (NEAA),

- neurotrofinas que se sabe que desempeñan un papel en el fomento de la supervivencia de SC en cultivo, tal como, sin limitarse a los mismos, BDNF, NT3, NT4.

Según una realización preferida, el medio usado para la diferenciación de las ESC es medio Nutristem (Biological Industries, 05-102-1A o 05-100-1A).

Según una realización particular, la diferenciación de ESC se efectúa en condiciones libres de contaminantes extraños. Según una realización, el medio de proliferación/crecimiento está desprovisto de contaminantes extraños, es decir, libre de componentes de origen animal tales como suero, factores de crecimiento de origen animal y albúmina. Por tanto, según esta realización, el cultivo se realiza en ausencia de contaminantes extraños.

Otros métodos para el cultivo de ESC en condiciones libres de contaminantes extraños se proporcionan en la solicitud de patente estadounidense n.° 20130196369.

Las preparaciones que comprenden células de EPR pueden prepararse según las Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) (por ejemplo, las preparaciones cumplen con las BPF) y/o las Buenas Prácticas Tisulares (BPT) actuales (por ejemplo, las preparaciones pueden cumplir con las BPT).

Durante las etapas de diferenciación, las células madre embrionarias pueden monitorizarse para determinar su estado de diferenciación. La diferenciación celular puede determinarse tras un examen de los marcadores específicos de células o tejidos que se sabe que son indicativos de la diferenciación.

Los marcadores específicos de tejidos/células pueden detectarse usando técnicas inmunológicas bien conocidas en la técnica [Thomson JA et al., (1998). Science 282: 1145-7]. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, citometría de flujo para los marcadores unidos a la membrana o intracelulares, inmunohistoquímica para los marcadores extracelulares e intracelulares e inmunoensayo enzimático para los marcadores moleculares secretados (por ejemplo, PEDF).

Por tanto, según otro aspecto de la presente descripción, se proporciona un método para generar células del epitelio retiniano, que comprende:

(a) cultivar células madre pluripotentes en un medio que comprende un agente de diferenciación para generar células en diferenciación, en el que el medio está desprovisto de un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp);

(b) cultivar las células en diferenciación en un medio que comprende el miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp) y el agente de diferenciación para generar células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR;

(c) analizar la secreción del factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) a partir de las células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR; y

(d) cultivar las células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR en un medio que comprende un agente de diferenciación para generar células de EPR, en el que el medio está desprovisto de un miembro de la superfamilia del factor de crecimiento transformante p (TGFp), en el que la etapa (d) se efectúa cuando la cantidad de PEDF está por encima de un nivel predeterminado.

Preferiblemente, la etapa (d) se efectúa cuando el nivel de PEDF está por encima de 100 ng/ml/día, 200 ng/ml/día, 300 ng/ml/día, 400 ng/ml/día o 500 ng/ml/día.

Otro método para determinar la potencia de las células durante o después del proceso de diferenciación es analizando la función de barrera y la secreción polarizada de PEDF y VEGF.

Una vez que las células se destinan al EPR, las células de EPR pueden seleccionarse y/o expandirse.

Según una realización particular, la selección se basa en una selección negativa, es decir, la retirada de células que no son de EPR. Esto puede realizarse mecánicamente mediante la retirada de células no pigmentadas o mediante el uso de marcadores de superficie.

Según otra realización, la selección se basa en una selección positiva, es decir, la selección de células pigmentadas. Esto puede realizarse mediante análisis visual o mediante el uso de marcadores de superficie.

Según todavía otra realización, la selección se basa en primer lugar en una selección negativa y luego en una selección positiva.

La expansión de células de EPR puede efectuarse sobre una matriz extracelular, por ejemplo, gelatina o colágeno, laminina y poli-D-lisina. Para la expansión, las células pueden cultivarse en KOM libre de suero, medio que comprende suero (por ejemplo, DMEM el 20%) o medio Nutristem (06-5102-01-1A, Biological Industries). En estas condiciones de cultivo, las células pigmentadas reducen la pigmentación y adquieren una morfología fibroidea. Después de cultivo prolongado y proliferación adicionalmente en cultivos de alta densidad, las células vuelven a adquirir la morfología en forma poligonal característica y aumentan la pigmentación de las células de EPR.

Las células de EPR pueden expandirse en suspensión o en una monocapa. La expansión de las células de EPR en cultivos de monocapa puede modificarse para dar una expansión a gran escala en biorreactores mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.

La población de células de EPR generada según los métodos descritos en el presente documento puede caracterizarse según varios parámetros diferentes.

Por tanto, por ejemplo, las células de EPR obtenidas tienen forma poligonal y están pigmentadas.

Según una realización, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos el 99% o incluso el 100% de las células de las poblaciones de células de EPR obtenidas expresan conjuntamente tanto proteína premelanosómica (PMEL17) como proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP).

Según una realización particular, las células coexpresan PMEL17 (n.° de SwissProt P40967) y al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP; n.° de SwissProt P12271), lecitina retinol aciltransferasa (LRAT; n.° de SwissProt 095327) e región determinante del sexo del cromosoma Y-caja 9 (SOX 9; P48436).

Según una realización particular, al menos el 80% de las células de la población expresan niveles detectables de PMEL17 y uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, CRALBP), más preferiblemente al menos el 85% de las células de la población expresan niveles detectables de PMEL17 y uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, CRALBP), más preferiblemente al menos el 90% de las células de la población expresan niveles detectables de PMEL17 y uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, CRALBP), más preferiblemente al menos el 95% de las células de la población expresan niveles detectables de PMEL17 y uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, CRALBP), más preferiblemente el 100% de las células de la población expresan niveles detectables de PMEL17 y uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, CRALBP), tal como se somete a ensayo mediante un método conocido por los expertos en la técnica (por ejemplo, FACS).

Según otra realización, el nivel de coexpresión de CRALBP y uno de los polipéptidos mencionados anteriormente (por ejemplo, PMEL17) (por ejemplo, tal como se mide mediante la intensidad de fluorescencia media) aumenta en al menos dos veces, más preferiblemente al menos 3 veces, más preferiblemente al menos 4 veces e incluso más preferiblemente en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces en comparación con ESC indiferenciadas.

En una realización, las células de EPR están terminalmente diferenciadas y no expresan Pax6.

En otra realización, las células de EPR están terminalmente diferenciadas y expresan Pax6.

Las células de EPR descritas en el presente documento también pueden actuar como células de EPR funcionales después del trasplante, en las que las células de EPR forman una monocapa entre la retina neurosensorial y la coroides en el paciente que recibe las células trasplantadas. Las células de EPR también pueden suministrar nutrientes a los fotorreceptores adyacentes y eliminar los segmentos externos desprendidos de los fotorreceptores mediante fagocitosis.

Según una realización, la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm.

Preferiblemente, la resistencia eléctrica transepitelial de las células es mayor de 150, 200, 250, 300, 300, 400, 500, 600, 700, 800 o incluso mayor de 900 ohm.

Los dispositivos para medir la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, medidor de tensión-resistencia epitelial EVOM2 (World Precisión Instruments).

Se apreciará que las poblaciones de células divulgadas en el presente documento están desprovistas de células madre embrionarias humanas indiferenciadas. Según una realización, menos de 1:250.000 células son células Oct4+TRA-1-60+, tal como se mide, por ejemplo, mediante FACS. Las células también tienen expresión regulada por disminución (en más de 5.000 veces) de GDF3 o TDGF, tal como se mide mediante PCR.

Las células de EPR de este aspecto de la presente invención no expresan marcadores de células madre embrionarias. Dichos uno o más marcadores de células madre embrionarias pueden comprender OCT-4, NANOG, Rex-1, fosfatasa alcalina, Sox2, TDGF-beta, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 y/o TRA-1-81.

Las preparaciones de EPR pueden estar sustancialmente purificadas, con respecto a células que no son de EPR, que comprenden al menos aproximadamente el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 9 l% , el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de células de EPR. La preparación de células de EPR puede estar esencialmente libre de células que no son de EPR o consistir en células de EPR. Por ejemplo, la preparación sustancialmente purificada de células de EPR puede comprender menos de aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2% o el 1% de tipos de células que no son de EPR. Por ejemplo, la preparación de células de EPR puede comprender menos de aproximadamente el 25%, el 20%, el 15%, el 10%, el 9%, el 8%, el 7%, el 6%, el 5%, el 4%, el 3%, el 2%, el 1%, el 0,9%, el 0,8%, el 0,7%, el 0,6%, el 0,5%, el 0,4%, el 0,3%, el 0,2%, el 0,1%, el 0,09%, el 0,08%, el 0,07%, el 0,06%, el 0,05%, el 0,04%, el 0,03%, el 0,02%, el 0,01%, el 0,009%, el 0,008%, el 0,007%, el 0,006%, el 0,005%, el 0,004%, el 0,003%, el 0,002%, el 0,001%, el 0,0009%, el 0,0008%, el 0,0007%, el 0,0006%, el 0,0005%, el 0,0004%, el 0,0003%, el 0,0002% o el 0,0001% de células que no son de EPR.

Las preparaciones de células de EPR pueden ser sustancialmente puras, tanto con respecto a células que no son de EPR como con respecto a células de EPR de otros niveles de madurez. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas con respecto a células que no son de EPR y enriquecidas en células de EPR maduras. Por ejemplo, en las preparaciones de células de EPR enriquecidas en células de EPR maduras, al menos aproximadamente el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99%, el 99% o el 100% de las células de EPR son células de EPR maduras. Las preparaciones pueden estar sustancialmente purificadas con respecto a células que no son de EPR y enriquecidas en células de EPR diferenciadas en lugar de células de EPR maduras. Por ejemplo, al menos aproximadamente el 30%, el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% de las células de EPR pueden ser células de EPR diferenciadas en lugar de células de EPR maduras.

Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección bacteriana, vírica o fúngica, incluyendo, sin limitarse a, la presencia de VIH 1, VIH 2, VHB, VHC, VHA, CMV, HTLV 1, HTLV 2, parvovirus B19, virus de Epstein-Barr o virus del herpes 1 y 2, SV40, HHV5, 6, 7, 8, CMV, virus del polioma, VPH, enterovirus. Las preparaciones descritas en el presente documento pueden estar sustancialmente libres de contaminación o infección micoplásmica.

Otro modo de caracterización de las poblaciones de células divulgadas en el presente documento es mediante la expresión de marcadores. Por tanto, por ejemplo, al menos el 80%, el 85%, el 90 %, el 95% o el 100% de las células expresan bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción. Según una realización, entre el 85 y 100% de las células expresan bestrofina.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF), tal como se mide mediante inmunotinción. Por ejemplo, entre el 85 y 100% de las células expresan MITF.

Según otra realización, al menos el 80%, el 85%, el 87%, el 89%, el 90%, el 95%, el 97% o el 100% de las células expresan el gen 6 de caja emparejada (PAX-6), tal como se mide mediante FACS.

Las células descritas en el presente documento también pueden caracterizarse según la cantidad y/o el tipo de factores que secretan. Por tanto, según una realización, las células secretan preferiblemente más de 500, 1000, 2000, 3000 o incluso 4000 ng de factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) por ml por día, tal como se mide mediante ELISA. Según una realización particular, las células secretan entre aproximadamente 1250 y 4000 ng de factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) por ml por día.

Se apreciará que las células de EPR generadas en el presente documento secretan PEDF y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de forma polarizada. Según realizaciones particulares, la razón de secreción apical de PEDF:secreción basal de PEDF es mayor de 1. Según realizaciones particulares, la razón de secreción apical de PEDF:secreción basal de PEDF es mayor de 2. Según realizaciones particulares, la razón de secreción apical de PEDF:secreción basal de PEDF es mayor de 3, mayor de 4, mayor de 5, mayor de 6, mayor de 7 o incluso mayor de 8. Además, la razón de secreción basal de VEGF:secreción apical de VEGf es mayor de 1. Según realizaciones particulares, la razón de secreción basal de VEGF:secreción apical de VEGF es mayor de 1,5, 2 ó 2,5.

La estabilidad de las células es otra característica de caracterización. Por tanto, por ejemplo, la cantidad de secreción de PEDF permanece estable en las células después de una incubación de 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas o incluso 24 horas a 2-8°C (cuando las células se formulan en BSS tampón). Además, la secreción polarizada de PEDF y VEGF permanece estable después de una incubación de 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas o incluso 24 horas a 2-8°C (cuando las células se formulan en BSS tampón). Además, la TEER de las células permanece estable en las células después de una incubación de 6 horas, 8 horas, 10 horas, 12 horas o incluso 24 horas a 2-8°C (cuando las células se formulan en BSS tampón).

En otra realización, las células se caracterizan mediante su efecto terapéutico. Por tanto, por ejemplo, los presentes inventores han mostrado que las poblaciones de células son capaces de rescatar la agudeza visual en la rata RCS después de administración subretiniana. Además, las poblaciones de células son capaces de rescatar los fotorreceptores (por ejemplo, fotorreceptores de conos) durante hasta 180 días tras la administración subretiniana en la rata RCS.

Se apreciará bien por los expertos en la técnica que la derivación de células de EPR es de gran beneficio. Pueden usarse como un modelo in vitro para el desarrollo de nuevos fármacos para fomentar su supervivencia, regeneración y función. Las células de EPR pueden servir para selección de alto rendimiento de compuestos que tienen un efecto tóxico o regenerativo sobre células de EPR. Pueden usarse para descubrir mecanismos, nuevos genes, factores solubles o unidos a la membrana que son importantes para el desarrollo, la diferenciación, el mantenimiento, la supervivencia y la función de células fotorreceptoras.

Las células de EPR también pueden servir como una fuente ilimitada de células de EPR para trasplante, reposición y respaldo de células de EPR defectuosas o degeneradas en degeneraciones retinianas. Además, las células de EPR genéticamente modificadas pueden servir como un vector para portar y expresar genes en el ojo y la retina después del trasplante.

Las células de EPR producidas mediante el método de la presente divulgación pueden usarse para el cultivo a gran escala y/o a largo plazo de tales células. Para este fin, el método de la invención es para realizarse en biorreactores adecuadas para la producción a gran escala de células, y en el que las hSC indiferenciadas son para cultivarse según la invención. Los requisitos generales para el cultivo de células en biorreactores se conocen bien por los expertos en la técnica.

La recogida de las células puede realizarse mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos no limitativos incluyen disección mecánica y disociación con papaína o tripsina (por ejemplo, TrypLE select). También son aplicables otros métodos conocidos en la técnica.

“Cantidad eficaz”, tal como se usa en el presente documento, se refiere ampliamente a la cantidad de un compuesto o células que, cuando se administra a un paciente para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar tal tratamiento para la enfermedad. La cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para la profilaxis y/o una cantidad eficaz para la prevención. La cantidad eficaz puede ser una cantidad eficaz para reducir, una cantidad eficaz para prevenir la incidencia de signos/síntomas, para reducir la gravedad de la incidencia de signos/síntomas, para eliminar la incidencia de signos/síntomas, para ralentizar el desarrollo de la incidencia de signos/síntomas, para prevenir el desarrollo de la incidencia de signos/síntomas y/o efectuar la profilaxis de la incidencia de signos/síntomas. La “cantidad eficaz” puede variar dependiendo de la enfermedad y su gravedad y la edad, el peso, los antecedentes médicos, la susceptibilidad y los estados preexistentes del paciente que va a tratarse. El término “cantidad eficaz” es sinónimo de “cantidad terapéuticamente eficaz” con los fines de esta divulgación.

Se espera que, durante la vida de un patente que madura a partir de esta solicitud, se desarrollen muchas tecnologías relevantes para la generación de células de EPR, y se pretende que el término células de EPR incluya todas de tales nuevas tecnologías a priori.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10%.

Los términos “comprende”, “que comprende”, “incluye”, “que incluye”, “que tiene” y sus conjugados significan “que incluye, pero sin limitarse a”.

El término “que consiste en” significa “que incluye y se limita a”.

El término “que consiste esencialmente en” significa que la composición, el método o la estructura puede incluir componentes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los componentes, las etapas y/o las partes adicionales no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la composición, el método o la estructura reivindicados.

Tal como se usa en el presente documento, la forma en singular “un”, “una” y “el/la” incluye las referencias en plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por ejemplo, el término “un compuesto” o “al menos un compuesto” puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.

A lo largo de esta solicitud, diversas realizaciones de esta invención pueden presentarse en formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, la descripción de un intervalo debe considerarse como que divulga específicamente todos los subintervalos posibles, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo, tal como desde 1 hasta 6, debe considerarse como que divulga específicamente subintervalos, tales como desde 1 hasta 3, desde 1 hasta 4, desde 1 hasta 5, desde 2 hasta 4, desde 2 hasta 6, desde 3 hasta 6, etc., así como los números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “método” se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para lograr una tarea dada, incluyendo, sin limitarse a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos, o bien conocidos o bien fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por los médicos de las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.

Tal como se usa en el presente documento, el término “que trata” incluye que suprime, que inhibe sustancialmente, que ralentiza o que revierte la progresión de un estado, que mejora sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos de un estado o que previene sustancialmente la aparición de síntomas clínicos o estéticos de un estado.

Se aprecia que determinadas características de la invención que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones independientes, también pueden proporcionarse en combinación en una realización individual. En cambio, diversas características de la invención que, por claridad, se describen en el contexto de una realización individual, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como adecuadas en cualquier otra realización descrita de la invención. Determinadas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización sea inoperativa sin esos elementos.

Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención, tal como se definieron anteriormente en el presente documento y tal como se reivindican en la sección de reivindicaciones a continuación, encuentran respaldo experimental en los siguientes ejemplos de referencia.

Ejemplos de referencia

Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos de referencia que, junto con las descripciones anteriores, ilustran algunas realizaciones de la invención de manera no limitativa.

Generalmente, la nomenclatura usada en el presente documento y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican a fondo en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology”, volúmenes I-III, Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, Nueva York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, vol. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías tal como se exponen en las patentes estadounidenses n.os 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique” por Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; “Current Protocols in Immunology”, volúmenes I-III, Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen extensamente en la bibliografía de patentes y científica, véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 y 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “ Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzymology” vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); todos de los cuales se incorporan por referencia como si se expusieran en su totalidad en el presente documento. Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos en esos documentos son bien conocidos en la técnica y se proporcionan por conveniencia del lector. Toda la información contenida en esos documentos se incorpora en el presente documento como referencia.

Ejemplo de referencia 1

Dispositivo de administración

Objetivo del estudio: comparar el rendimiento de dos cánulas retinianas: agujas de calibre 25(G) MedOne PolyTip con cánula flexible de 38G con respecto a aguja Peregrine de 25(G) con cánula flexible de 41G.

Diseño experimental: se descongelaron viales crioconservados de células de EPR (1,5 x106 células/vial/1 ml de suspensión celular congelada), se transfirió el contenido con cuidado a DMEM que contenía suero humano al 20%, se filtró, se lavó de nuevo con DMEM que contenía suero humano al 20% y luego se lavó con BSS Plus. Luego se resuspendió el sedimento celular en 0,5-1 ml de BSS Plus y se llevó a cabo el recuento de células viables mediante exclusión con azul de tripano. Se resuspendieron las células a diferentes densidades celulares que, después de la inyección a través del dispositivo de administración, producirían las dosis clínicas de fase I/IIa previstas de 50x103, 200x103 o 500x103 células viables por 100-150 ul de BSS Plus. Antes de la carga en el dispositivo de administración, se sometió a prueba el aspecto de las células de EPR formuladas para verificar la ausencia de partículas extrañas visibles. Se cargaron las células de EPR en su formulación final en una jeringa de 1 ml estéril usando una aguja de 18G estéril (figura 2A). Luego se reemplazó la aguja de 18G por un tubo de extensión de 10 cm estéril (figura 2B), se eliminó el aire a través del tubo de extensión y se unió una cánula de 25G/38G (MedOne) o una cánula de 25G/41G (Peregrine) estéril al extremo del tubo de extensión (figura 2C). Luego se eliminó el aire de la cánula hasta que apareció una gota de células en la punta de la cánula. Según una opción, se presiona el émbolo hacia atrás y se introducen 10 20 |il de aire en el extremo de la cánula.

Se administraron las células de EPR en fracciones de 100-150 ul a una tasa aproximada de 50 ul/minuto. Se determinaron la concentración, el volumen, la viabilidad celulares después de la administración y la tasa de administración (volumen/min) de células en cada estudio y se compararon.

Se determinaron la vitalidad y la actividad funcional de las células de EPR antes y después de la administración a través del dispositivo.

Se evaluó la reproducibilidad de la dosis de células real administrada por inyección para cada una de las dosis clínicas previstas (es decir, 50x103, 200x103 ó 500x103 células viables por 100-150 ul de BSS Plus) por 3 evaluadores.

Resultados

Los diámetros interno y externo de la cánula MedOne son 99 um y 120 um, respectivamente. La aguja Peregrine de 25(G) de la cánula retiniana con cánula flexible de 41G tiene un menor diámetro interno y externo de 71 um y 96,5 um, respectivamente. Se observó una recuperación celular similar con las cánulas MedOne y Peregrine (véase la tabla 1 a continuación en el presente documento).

Tabla 1

Determinación de la dosis celular inicial para la recuperación de las dosis clínicas alta, media y baja usando Peregrine 25G/41G:

Según los datos anteriores, la recuperación de la dosis celular clínica alta (500.000 células/100 ul) con Peregrine 25G/41G fue de 78,8 ± 14,6 % (media ± DE). Para producir la dosis celular clínica alta prevista de 500.000 células/100 ul, se sometieron a prueba varias dosis celulares iniciales de las que se seleccionó una dosis celular inicial de 700.000 células/100 ul que produjo 507.296 ± 81.803 células/100 ul (media ± DE, n=6, 3 evaluadores) para su uso. La tabla 2 a continuación resume los datos obtenidos por 3 evaluadores diferentes.

Tabla 2

Para producir la dosis celular clínica media prevista de 200.000 células/100 ul, se seleccionó una dosis celular inicial de 270.000 células/100 ul (intervalo de 247.000-292.000 células/100 ul) que produjo 191.250 ± 67.511 células/100 ul (media ± DE, n=6, 3 evaluadores) para su uso. La tabla 3 a continuación resume los datos obtenidos por 3 evaluadores diferentes.

Tabla 3

Para producir la dosis celular clínica baja prevista de 50.000 células/100 ul, se seleccionó una dosis celular inicial de 70.000 células/100 ul que produjo 50.688 ± 6.533 células/100 ul (media ± DE, n=5, 3 evaluadores) para su uso. La tabla 4 a continuación resume los datos obtenidos por 3 evaluadores diferentes.

Tabla 4

_________________

Potencia de EPR después de la administración a través de Peregrine 25G/41G:

Para calificar la cánula Peregrine de 26G/41G, se sometió a prueba la potencia de las células de EPR formuladas a la dosis clínica inicial alta de 700.000 células/100 j l después de la administración. Se evaluó la potencia usando el ensayo de polarización, en el que se sometieron a prueba la función de barrera de las células de EPR así como la capacidad de secretar factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) y factor derivado del endotelio vascular (VEGF) de forma polarizada usando el sistema Transwell. Tal como puede observarse en la tabla 5A, la función de barrera/resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la secreción polarizada de PEDF y VEGF fueron similares antes y después de la administración. La viabilidad y la concentración celular después de la administración estaban dentro del intervalo esperado (tabla 5B).

Tabla 5A

Tabla 5B

Además de la capacidad de polarización mantenida, se conservó la vitalidad de células de EPR después de la administración (datos no mostrados).

Los datos presentados anteriormente en el presente documento respaldan el uso de la cánula Peregrine de 25G/41G a las dosis clínicas previstas de 50.000, 200.000 y 500.000 células por 100 j l . Para alcanzar estas dosis clínicas finales, pueden prepararse células de EPR en una concentración final de 70.000, 270.000 y 700.000 células viables por 100 jl, respectivamente.

Determinación de la dosis de células de EPR inicial para la recuperación de la dosis clínica baja de 50.000 células/50 j :

Se sometió a prueba inicialmente una dosis celular de 70.000 células de EPR/50 j l para determinar la capacidad de producir la dosis celular clínica baja prevista de 50.000 células/50 jl. Tal como se muestra en la tabla 6, se preparó una dosis celular inicial de 70.000 células/50 j l que produjo 38.697 ± 5.505 células/50 j l (media ± DE, n=3, 3 evaluadores). Dado que la recuperación promedio fue del 55% ± 7,8% (media ± DE, n=3, 3 evaluadores) y dado que no se alcanzó la dosis prevista de 50.000 células/50 jl, se sometió a prueba una densidad celular inicial de 100.000 células/50 j l en el segundo conjunto de experimentos. Tal como se muestra en la tabla 7, una dosis celular inicial de 100.000 células/50 j l produjo 62.517 ± 4.625 células/50 j l (media ± DE, n=3, 3 evaluadores; OpRegen®, lote 5D). La recuperación promedio fue del 61% ± 4,5% (media ± DE, n=3, 3 evaluadores).

Tabla 6

Tabla 7

Ejemplo de referencia 2

Experimento clínico

Diseño del estudio: estudio en fase I/IIa unicéntrico de 15 pacientes con DMAE en forma seca avanzada y atrofia geográfica (AG) divididos en cuatro cohortes: las primeras 3 cohortes, que consistieron cada una en 3 pacientes legalmente ciegos con agudeza visual mejor corregida de 20/200 o menos, recibirán una sola inyección subretiniana de células de EPR, usando dosificación secuencialmente crecientes de 50x103, 200x103 y 500x103 células por cohorte, respectivamente. La cuarta cohorte incluirá 6 pacientes con agudeza visual mejor corregida de 20/100 o menos, que recibirán una sola inyección subretiniana de 500.000 células de EPR. Se aplicarán intervalos escalonados dentro y entre cohortes.

Después de una vitrectomía, se administrarán células en el espacio subretiniano en el área macular mediante una cánula a través de una pequeña retinotomía. Se inyectará un volumen total de hasta 50-150 ul de suspensión celular en áreas en riesgo de expansión de AG.

Junto con el procedimiento quirúrgico, los pacientes recibirán inmunosupresión por luz y tratamiento con antibióticos, que consiste en lo siguiente:

1. Tratamiento tópico con antibióticos y esteroides tal como es habitual después de vitrectomía: tratamiento de terapia tópica con esteroides (gotas de Predforte 4-8 veces al día, con disminución progresiva) y gotas tópicas de antibióticos (Oflox o equivalente 4 veces al día) durante el tratamiento de 6 semanas.

2. Tacrolimús sistémico (v.o.) 0,01 mg/kg al día (la dosis se ajustará para alcanzar una concentración en sangre de 3 7 ng/ml) desde una semana antes del trasplante y se continuará hasta 6 semanas después del trasplante.

3. Micofenolato de mofetilo sistémico (v.o.), 2 g/día en total, administrado desde 2 semanas antes del trasplante y se continuará durante un año después del trasplante.

Los pacientes se evaluarán en intervalos preestablecidos a lo largo de los 12 meses después de la administración de las células. El seguimiento posterior al estudio se producirá a los 15 meses, 2, 3, 4 y 5 años después de la cirugía. En pacientes que desarrollen efectos secundarios relacionados con el tratamiento inmunosupresor, se realizará un intento de controlar estos efectos secundarios (por ejemplo, mejorar el control de la presión sanguínea si se desarrolla hipertensión). En el caso de efectos secundarios que no se puedan controlar, se modificará el tratamiento con el agente inmunosupresor causante en consulta con el internista del estudio.

Criterios de inclusión:

1. 55 años y mayor;

2. Diagnóstico de degeneración macular asociada a la edad seca (no neovascular) en ambos ojos;

3. Hallazgos funduscópicos de DMAE seca con atrofia geográfica en la mácula, área de disco por encima de 0,5 (1,25 mm2 y hasta 17 mm2) de tamaño en el ojo de estudio y área de disco por encima de 0,5 en el otro ojo;

4. Agudeza visual central mejor corregida igual a o menor de 20/200 en las cohortes 1-3 e igual a o menor de 20/100 en la cohorte 4 en el ojo de estudio mediante la prueba de visión ETDRS;

5. La visión en el ojo sin operar debe ser mejor que o igual a la del ojo operado;

6. Se permite que los pacientes con salud suficientemente buena participen en todos los procedimientos relacionados con el estudio y completen el estudio (antecedentes médicos);

7. Capacidad para someterse a un procedimiento quirúrgico vitreorretiniano bajo cuidados de anestesia monitorizados; 8. Recuentos en sangre, análisis bioquímicos de la sangre, coagulación y análisis de orina normales;

9. Negativo para VIH, HBC y VHC, negativo para IgM de CMV e IgM de VEB;

10. Pacientes sin neoplasia maligna actual o antecedentes de neoplasia maligna (con la excepción de carcinoma de células basales/escamosas de la piel tratado con éxito) basándose en examen de selección emparejado por edad (a voluntad del médico del estudio);

11. Se permite que los pacientes interrumpan la toma de aspirina, productos que contienen aspirina y cualquier otro fármaco que modifique la coagulación 7 días antes de la cirugía;

12. Dispuestos a aplazar todas las futuras donaciones de sangre y tejido;

13. Capaces de entender y dispuestos a firmar el consentimiento informado.

Criterios de exclusión:

1. Evidencias de DMAE neovascular mediante los antecedentes, así como mediante examen clínico, angiografía con fluoresceína (AF) o tomografía de coherencia ocular (TCO) en el nivel inicial en cualquier ojo;

2. Antecedentes o presencia de retinopatía diabética, oclusiones vasculares, uveítis, enfermedad de Coat, glaucoma, cataratas u opacidad de los medios que impiden la visualización del polo posterior o cualquier enfermedad ocular significativa distinta de DMAE que haya comprometido o pueda comprometer la visión en el ojo de estudio y confunda el análisis del criterio de valoración primario;

3. Antecedentes de reparación de desprendimiento de retina en el ojo de estudio;

4. Miopía axial de más de -6 dioptrías;

5. Cirugía ocular en el ojo de estudio en los últimos 3 meses;

6. Antecedentes de deterioros cognitivos o demencia;

7. Contraindicación para inmunosupresión sistémica;

8. Antecedentes de cualquier estado distinto de DMAE asociado con neovascularización coroidea en el ojo de estudio (por ejemplo, miopía patológica o presunta histoplasmosis ocular);

9. Las siguientes enfermedades activas o antecedentes para las siguientes enfermedades: cáncer, enfermedad renal, diabetes, infarto de miocardio en los 12 meses previos, inmunodeficiencia;

10. Mujer; embarazo o lactancia;

11. Participación actual en otro estudio clínico. Participación anterior (plazo de 6 meses) en cualquier estudio clínico de un fármaco administrado por vía sistémica o al ojo.

La seguridad y la tolerabilidad del procedimiento quirúrgico y la seguridad del injerto de células se evaluarán por separado. La evaluación de la seguridad quirúrgica incluirá las siguientes mediciones:

1. Desprendimiento de retina sin curar

2. Vitreorretinopatía proliferativa (VRP)

3. Hemorragia subretiniana, retiniana o intravítrea

4. Lesión en la retina relativamente sana todavía en el sitio de cirugía

La seguridad y la tolerabilidad del injerto de células se evaluarán usando los siguientes acontecimientos adversos que se clasificarán según el sistema de clasificación del Instituto Nacional del Cáncer (NCI):

1. Formación de teratoma y/o tumor y/o tejido ectópico

2. Infección

3. Uveítis, Vasculitis o VRP

4. Progresión acelerada de AG

5. Progresión a DMAE neovascular en el ojo de estudio

6. Reacción inflamatoria grave contra las células alotrasplantadas

Los criterios de valoración exploratorios secundarios de la eficacia se medirán mediante la duración de la supervivencia del injerto y mediante el examen de lo siguiente:

1. Tasa de progresión de AG

2. Sensibilidad retiniana en las regiones injertadas, extensión y profundidad de escotoma central

3. Cambios en la agudeza visual

Procedimiento quirúrgico:

El ojo elegido para la administración de EPR será el ojo con peor función visual. La cirugía se realizará mediante bloqueo anestésico retrobulbar o peribulbar acompañado por sedación intravenosa monitorizada o por anestesia general, a voluntad del cirujano y en discusión con el paciente. El ojo que se somete a cirugía se preparará y cubrirá de forma estéril según el protocolo de la institución. Después de la colocación de un especúlo de párpados, se realizará una vitrectomía de 3 puertos convencional. Esta incluirá la colocación de una cánula de infusión de 23G y dos puertos de 23G. Después de la inspección visual de la cánula de infusión en la cavidad vítrea, se abrirá el tubo de infusión para garantizar que se mantenga la estructura del globo ocular durante toda la cirugía. Luego se realizará una vitrectomía central cuidadosa con instrumentos de 23G convencionales, seguido por el desprendimiento de la cara vítrea posterior. Esto permitirá un acceso sin obstrucciones al polo posterior.

El EPR se introducirá en el espacio subretiniano en un sitio predeterminado dentro del polo posterior, preferiblemente penetrando la retina en una área que todavía está relativamente conservada cercana al límite de AG. Se evitarán los vasos sanguíneos. Las células se administrarán al espacio subretiniano mediante la formación de una pequeña ampolla, con un volumen de 50-150 |il.

El sistema de administración se compone de una jeringa de 1 ml que se conecta a través de un tubo de extensión de 10 cm a una cánula retiniana flexible Peregrine de 25G/41G.

Se retirarán cualesquiera células que experimenten reflujo en el espacio vítreo y se realizará el intercambio fluido-aire. Antes de la retirada de la cánula de infusión, se realizarán un examen cuidadoso para garantizar que no se crearon desgarros o roturas retinianas iatrogénicas. Luego se retirará la cánula de infusión. Se administrarán esteroides y antibióticos subconjuntivales. El ojo se cubrirá con un parche y un protector de plástico. Se registrará el procedimiento de administración quirúrgica.

Dosis: Se usarán una dosis baja de 50.000 células/50 |il o 50.000 células/100 |il, una dosis media de 200.000 células/100 |il y una dosis alta de 500.000 células/100 |il. La selección de dosis se basó en la seguridad de la dosis factible máxima sometida a prueba en estudios preclínicos y la dosis equivalente humana calculada basándose en el tamaño del ojo y de la ampolla.

Parámetros de criterios de valoración:

1. Seguridad del procedimiento quirúrgico:

Desprendimiento de retina persistente/recurrente

Vitreorretinopatía proliferativa (VRP)

Hemorragia

Lesión a la retina relativamente sana todavía en el sitio de cirugía

2. Seguridad del producto:

Desarrollo de teratoma, tumor y/o tejido ectópico

Injerto voluminoso de células en proliferación

Infección

Reacción inmunitaria inflamatoria grave al injerto

Progresión acelerada de AG

Progresión a DMAE neovascular en el ojo de estudio

3. Eficacia:

Duración de la supervivencia del injerto

Tasa disminuida de progresión de AG

Sensibilidad retiniana a la luz en las regiones injertadas y profundidad del escotoma Agudeza visual

Claims

REIVINDICACIONES

i. Composición farmacéutica, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con degeneración macular asociada a la edad (DMAE) en forma seca, que comprende:

administrar en la subretina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende células del epitelio pigmentario retiniano (EPR) humanas,

en la que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en la que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto, tratando de ese modo al sujeto.
2. Composición farmacéutica, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con un estado o una enfermedad retiniana, que comprende:

administrar en la retina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica que comprende células del epitelio pigmentario retiniano (EPR) poligonales humanas,

en la que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en la que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto, en la que la cantidad terapéuticamente eficaz es de entre 50.000 y 5.000.000 células por administración, tratando de ese modo al sujeto.
3. Composición farmacéutica, para su uso en un método de tratamiento de un sujeto con un estado o una enfermedad retiniana, que comprende:

administrar en la retina del sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende células del epitelio pigmentario retiniano (EPR) humanas usando un dispositivo, en la que el diámetro externo del dispositivo a través del cual se administran las células es de entre 90 y 100 |im, tratando de ese modo al sujeto,

en la que al menos el 95% de las células de la misma expresan conjuntamente proteína premelanosómica (PMEL17) y proteína de unión al retinaldehído celular (CRALBP), en la que la resistencia eléctrica transepitelial de las células en una monocapa es mayor de 100 ohm con respecto al sujeto.
4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que la cantidad terapéuticamente eficaz es de entre 50.000 y 1.000.000 células por administración.
5. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, para su uso en el método según la reivindicación 2, en la que la composición farmacéutica comprende 500 células por pl - 10.000 células por pl.
6. Composición farmacéutica según la reivindicación 2, para su uso en el método según la reivindicación 2, en la que dicho estado o dicha enfermedad retiniana se selecciona del grupo que consiste en retinitis pigmentosa, desprendimiento de retina, displasia retiniana, atrofia retiniana, retinopatía, distrofia macular, distrofia de conos, distrofia de conos y bastones, Malattia Leventinese, distrofia en panal de Doyne, distrofia de Sorsby, distrofias en patrón/mariposa, distrofia viteliforme de Best, distrofia de Carolina del Norte, distrofia coroidea areolar central, estrías angioides, maculopatía tóxica, enfermedad de Stargardt, miopía patológica, retinitis pigmentosa y degeneración macular.
7. Composición farmacéutica según la reivindicación 6, para su uso en el método según la reivindicación 6, en la que dicha enfermedad es degeneración macular asociada a la edad.
8. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que el sujeto cumple al menos uno de los criterios seleccionados del grupo que consiste en:

(i) tiene 55 años de edad o mayor;

(ii) tiene hallazgos funduscópicos de DMAE seca con atrofia geográfica en la mácula, área de disco por encima de 0,5 en al menos un ojo;

(iii) puede someterse a un procedimiento quirúrgico vitreorretiniano bajo cuidados de anestesia monitorizados; y

(iv) no tiene ninguna enfermedad por inmunodeficiencia.
9. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que el número de células Oct4+TRA-1-60+ en la población está por debajo de 1:250.000.
10. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que al menos el 80% de las células expresan bestrofina 1, tal como se mide mediante inmunotinción, y/o en la que al menos el 80% de las células expresan factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF), tal como se mide mediante inmunotinción, y/o en la que más del 80% de las células expresan el gen 6 de caja emparejada (PAX-6), tal como se mide mediante FACS.
11. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que las células secretan más de 500 ng de factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) por ml por día y/o en la que las células secretan PEDF y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) de forma polarizada.
12. Composición farmacéutica según la reivindicación 11, para su uso en el método según la reivindicación 11, en la que la razón de secreción apical de PEDF:secreción basal de PEDF es mayor de 1.
13. Composición farmacéutica según la reivindicación 12, para su uso en el método según la reivindicación 12, en la que dicha razón sigue siendo mayor de 1 después de incubación durante 8 horas a 2-8°C.
14. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que dicha resistencia eléctrica transepitelial de las células sigue siendo mayor de 100 ohm después de incubación durante 8 horas a 2-8°C.
Composición farmacéutica según la reivindicación 11, para su uso en el método según la reivindicación 11, en la que la razón de secreción basal de VEGF:secreción apical de VEGF es mayor de 1.
Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que las células son capaces de rescatar la agudeza visual en la rata RCS después de administración subretiniana.
17. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que las células se generan mediante diferenciación ex vivo de células madre embrionarias humanas.
18. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, para su uso en el método según la reivindicación 1, en la que las células se generan:

(a) cultivando células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas humanas en un medio que comprende nicotinamida para generar células en diferenciación, en la que dicho medio está desprovisto de activina A;

(b) cultivando dichas células en diferenciación en un medio que comprende nicotinamida y activina A para generar células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR; y

(c) cultivando dichas células que se diferencian adicionalmente hacia el linaje de EPR en un medio que comprende nicotinamida, en la que dicho medio está desprovisto de activina A.
19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18, para su uso en el método según la reivindicación 18, en la que dichas células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas se propagan en un medio que comprende bFGF y TGFp.