ES2837927T3

ES2837927T3 - Terapias de combinación con conjugados de ligando de PSMA

Info

Publication number: ES2837927T3
Application number: ES14734570T
Authority: ES
Inventors: William C Olson; Vincent Dipippo
Original assignee: PSMA Development Co LLC
Current assignee: PSMA Development Co LLC
Priority date: 2013-10-18
Filing date: 2014-05-14
Publication date: 2021-07-01
Anticipated expiration: 2034-05-14

Abstract

Un método in vitro para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA), comprendiendo el método: poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con un antiandrógeno, en donde el antiandrógeno es abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel; y poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoácido, en donde el resto de glutamato-urea aminoácido es un glutamato-urea-lisina; en donde las células cancerosas que expresan PSMA comprenden células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias de combinación con conjugados de ligando de PSMA

ANTECEDENTES

El cáncer de próstata es el tumor maligno más común y la segunda causa principal de muerte por cáncer en el hombre en los Estados Unidos (Jemal A, et al., CA Cancer J Clin 2005;55:10-30). El cáncer de próstata localizado se trata normalmente con cirugía o radiación, y la enfermedad recurrente se puede controlar temporalmente con privación de andrógenos (Klein EA, et al., Urol Clin North Am 2003;30:315-30). Sin embargo, casi todos los carcinomas de próstata se vuelven con el tiempo resistentes a las hormonas y luego progresan rápidamente (Denmeade SR, et al., Nat Rev Cancer 2002;2:389-96). El cáncer de próstata resistente a hormonas o independiente de andrógenos ha demostrado ser en gran medida resistente a la quimioterapia convencional. Las terapias que se ha mostrado que prolongan la vida en los sujetos con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración (CPRCm) incluyen: Taxotere® (docetaxel), Jevtana® (cabazitaxel), Zytiga® (acetato de abiraterona), Provenge® (sipuleucel-T), Xtandi® (enzalutamida) y Xofigo® (dicloruro de radio Ra-223). Los beneficios en la supervivencia pueden ser modestos, como en el caso de Jevtana®, que ofrece un beneficio en la supervivencia de 2,4 meses (Gulley J, et al., Am J Ther. 2004;351:1513-20; Petrilak DP, et al., New Engl J Med 2004;351:1513-20). Se necesitan nuevas terapias para ampliar otras opciones terapéuticas, tales como para sujetos con CPRCm.

El documento de patente WO 2010/005721 A1 describió nanopartículas que comprendían GL2 y su uso para tratar cáncer de próstata. West Lafayette et al.: "Endocyte to advance development of EC 1069, a PSMA-targeted small molecule drug conjugate therapy for prostate cancer company expects to file IND for therapeutic agent in 2013 human study of companion imaging agent EC0652 demonstrates safety and binding specificity", 2013-01-29, XP055359848, describe EC1069 y su uso para tratar cáncer de próstata.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, al menos en parte, al sorprendente descubrimiento de que los antiandrógenos y los ligandos de antígeno prostático específico de membrana (PSMA) unidos a agentes terapéuticos (denominados en el presente documento "conjugados de ligando de PSMA"), tales como los agentes antineoplásicos o agentes citotóxicos (denominados en el presente documento, cuando se unen a un ligando de PSMA, "conjugados de ligando de PSMA-agente antineoplásico" o "conjugados de ligando de PSMA-agente citotóxico", respectivamente), pueden actuar sinérgicamente para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan PSMA. Inesperadamente, esta sinergia ocurre en tanto las células dependientes de andrógeno como independientes de andrógeno. También se descubrió que los inhibidores de mTOR y los conjugados de ligando de PSMA también actúan sinérgicamente para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan PSMA, tales como células independientes de andrógeno en particular. También se descubrió que los conjugados de prednisona y ligando de PSMA también actuaron sinérgicamente en combinación. Así, en el presente documento se proporcionan métodos, composiciones y kits para inhibir la proliferación, o destrucción, de células que expresan PSMA (por ejemplo, células cancerosas tales como células de cáncer de próstata), así como para sensibilizar o volver a sensibilizar células que pueden expresar PSMA, tales como células independientes de andrógeno que expresan PSMA, a la terapia con andrógenos.

Un aspecto de la invención proporciona un método in vitro de inhibición de la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA). El método comprende: poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con un antiandrógeno, en donde el antiandrógeno es abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel; y poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoácido, en donde el resto de glutamato-urea-aminoácido es un glutamato-urea-lisina; en donde las células cancerosas que expresan PSMA comprenden células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos.

En algunas realizaciones, el antiandrógeno es enzalutamida o abiraterona.

Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede estar en una cantidad eficaz para regulan por incremento la expresión de PSMA.

En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico son simultáneas. En otras realizaciones, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico son secuenciales.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno puede ser antes de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico puede ocurrir en una semana desde la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el antiandrógeno durante al menos 3 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 7 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 14 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 21 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 28 días.

En algunas realizaciones, las células cancerosas que expresan PSMA comprenden células cancerosas independientes de andrógeno que expresan PSMA.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA insensibles a terapia de antiandrógenos se pueden volver a sensibilizar a la terapia de antiandrógenos después de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno.

En algunas realizaciones, las células cancerosas que expresan PSMA son de un tumor.

En algunas realizaciones, las células cancerosas que expresan PSMA son células que expresan PSMA de cáncer de próstata. En otras realizaciones, las células cancerosas que expresan PSMA son células distintas de cáncer de próstata que expresan PSMA. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser de la neovasculatura de cáncer distinto de próstata o tumor distinto de próstata.

En algunas realizaciones, las células cancerosas que expresan PSMA son de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede haber recibido quimioterapia previa con uno o más taxanos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede haber recibido tratamiento anterior con uno o más antiandrógenos. En algunas realizaciones, el sujeto tiene cáncer de próstata que ha progresado a pesar del tratamiento anterior, tal como con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede tener cáncer de próstata que está empezando a progresar a pesar del tratamiento, tal como con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido quimioterapia citotóxica previa. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido tratamiento anterior con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido tratamiento anterior con enzalutamida o abiraterona. Como se describe en el presente documento, el sujeto que no ha recibido tratamiento anterior con antiandrógenos, tales como enzalutamida o abiraterona, puede ser uno con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. En algunas realizaciones, el sujeto es uno cualquiera de los sujetos descritos en el presente documento.

En el presente documento se describen además métodos de inhibición de la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA). Los métodos pueden comprender poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con un inhibidor de mTOR, y poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico.

Como se describe en el presente documento, el inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

Como se describe en el presente documento, el inhibidor de mTOR puede estar en una cantidad eficaz para regular por incremento la expresión de PSMA.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el inhibidor de mTOR y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico pueden ser simultáneas.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el inhibidor de mTOR y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico pueden ser secuenciales.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el inhibidor de mTOR puede ser antes de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el inhibidor de mTOR durante al menos 7 días.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas independientes de andrógeno que expresan PSMA.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas que expresan PSMA insensibles a terapia de antiandrógenos.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA insensibles a terapia de antiandrógenos se pueden volver a sensibilizar a la terapia de antiandrógenos después de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el inhibidor de mTOR.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser de un tumor.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser células que expresan PSMA de cáncer de próstata. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser células distintas de cáncer de próstata que expresan PSMA. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser de la neovasculatura de cáncer distinto de próstata o tumor distinto de próstata.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser de un sujeto. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede haber recibido quimioterapia previa con uno o más taxanos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede haber recibido tratamiento anterior con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede tener cáncer de próstata que ha progresado a pesar del tratamiento anterior, tal como con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede tener cáncer de próstata que está empezando a progresar a pesar del tratamiento, tal como con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido quimioterapia citotóxica previa. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido tratamiento anterior con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido tratamiento anterior con enzalutamida o abiraterona. Como se describe en el presente documento, el sujeto que no ha recibido tratamiento anterior con antiandrógenos, tales como enzalutamida o abiraterona, puede ser uno con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede ser uno cualquiera de los sujetos descritos en el presente documento.

En el presente documento se describen además métodos de inhibición de la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA). Los métodos pueden comprender poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con prednisona, y poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, el método puede comprender además poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, tal como un antiandrógeno.

Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede bloquear la enzima citocromo CYP17. Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede bloquear la enzima citocromo CYP17A1.

Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser un antagonista de receptores de andrógeno.

Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel. Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser enzalutamida o abiraterona.

Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede estar en una cantidad eficaz para regular por incremento la expresión de PSMA.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con prednisona y/o el compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, tal como un antiandrógeno, y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA pueden ser simultáneas. Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con prednisona y/o el compuesto, tal como un antiandrógeno, y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA pueden ser secuenciales.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con prednisona y/o el compuesto, tal como un antiandrógeno, puede ser antes de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA.

Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA puede ocurrir en una semana desde la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el compuesto, tal como un antiandrógeno.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto, tal como un antiandrógeno, durante al menos 3 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto, tal como un antiandrógeno, durante al menos 7 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto, tal como un antiandrógeno, durante al menos 14 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto, tal como un antiandrógeno, durante al menos 21 días. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto, tal como un antiandrógeno, durante al menos 28 días.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos.

Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos se pueden volver a sensibilizar a la terapia de antiandrógenos después de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el compuesto, tal como un antiandrógeno.

En el presente documento se describen además métodos de administración específica de un agente citotóxico a células que expresan PSMA en un sujeto. Los métodos pueden comprender administrar a un sujeto un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, y administrar al sujeto un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico.

Como se describe en el presente documento, el compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA puede ser un antiandrógeno.

Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser un antagonista de receptores de andrógeno. Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel. Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser enzalutamida o abiraterona.

Como se describe en el presente documento, el compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA puede ser un inhibidor de mTOR. Como se describe en el presente documento, el inhibidor de mTOR puede ser rapamicina.

Como se describe en el presente documento, la etapa de administrar el compuesto y la etapa de administrar el conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico pueden ser simultáneas. Como se describe en el presente documento, la etapa de administrar el compuesto y la etapa de administrar el conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico pueden ser secuenciales. Como se describe en el presente documento, la etapa de administrar el compuesto puede ser antes de la etapa de administrar el conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico.

Como se describe en el presente documento, la etapa de administrar el conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico puede ocurrir en una semana desde la etapa de administrar el compuesto.

Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 3 días. Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 7 días. Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 14 días. Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 21 días. Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden estar en contacto con el compuesto durante al menos 28 días.

Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas independientes de andrógeno que expresan PSMA.

Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos.

Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos se pueden volver a sensibilizar a la terapia de antiandrógenos después de la etapa de administrar el compuesto.

Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden ser de un tumor.

Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden ser células que expresan PSMA de cáncer de próstata. Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden ser células distintas de cáncer de próstata que expresan PSMA. Como se describe en el presente documento, las células que expresan PSMA pueden ser de la neovasculatura de cáncer distinto de próstata o tumor distinto de próstata.

En el presente documento se describen además compuestos que aumentan la expresión de la superficie celular de PSMA y un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico. Se describen además composiciones que comprenden prednisona y un conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, las composiciones pueden comprender además un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA.

Como se describe en el presente documento, las composiciones pueden comprender además un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un antiandrógeno seleccionado del grupo que consiste en abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en un sujeto, comprendiendo el método:

poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno; y

poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoácido, en donde el resto de glutamato-ureaaminoácido es un glutamato-urea-lisina;

en donde las células cancerosas que expresan PSMA comprenden células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos.

Según un aspecto de la invención se proporciona un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en un sujeto, comprendiendo el método:

poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con un antiandrógeno seleccionado del grupo que consiste en abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel; y

poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoácido, en donde el resto de glutamato-ureaaminoácido es un glutamato-urea-lisina;

Según un aspecto de la invención se proporciona una composición que comprende un antiandrógeno y un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA), en donde el antiandrógeno es abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel, y en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-ureaaminoácido, en donde el resto de glutamato-urea-aminoácido es un glutamato-urea-lisina;

En el presente documento se describen además kits que pueden comprender un recipiente que contiene un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA en una célula que expresa PSMA, y un recipiente que contiene un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico. En el presente documento se describen además kits que comprenden un recipiente que contiene prednisona, y un recipiente que contiene un conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, el kit puede comprender además un recipiente que comprende un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA.

Como se describe en el presente documento, los kits adicionales pueden comprender un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Como se describe en el presente documento, el compuesto y/o el conjugado de ligando de PSMA pueden ser en un medio acuoso. Como se describe en el presente documento, el compuesto y/o el conjugado de ligando de PSMA se pueden liofilizar.

Como se describe en el presente documento, los kits pueden comprender además un diluyente.

Como se describe en el presente documento, los kits pueden comprender además instrucciones para reconstituir el compuesto y/o el conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, los kits pueden comprender además instrucciones para reconstituir prednisona y/o el conjugado de ligando de PSMA y/o el compuesto (cuando dichos kits comprenden además el compuesto).

Como se describe en el presente documento, los kits pueden comprender además instrucciones para combinar el compuesto y/o el conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, los kits pueden comprender además instrucciones para combinar prednisona y/o el conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, los kits pueden comprender además instrucciones para combinar el compuesto con prednisona y/o el conjugado de ligando de PSMA (cuando dichos kits comprenden además el compuesto).

Según un aspecto de la invención, se proporciona un kit que comprende:

un recipiente que contiene antiandrógeno, en donde el antiandrógeno es abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel; y

un recipiente que contiene un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoácido, en donde el resto de glutamato-urea-aminoácido es un glutamato-urea-lisina;

en donde el kit es para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA), en donde las células cancerosas que expresan PSMA comprenden células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos;

opcionalmente en donde el compuesto y/o el conjugado de ligando de PSMA está en medio acuoso o se liofiliza; y

opcionalmente que comprende además un vehículo y/o un excipiente y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

En el presente documento se describe además un método para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostático específico de membrana (PSMA). Como se describe en el presente documento, el método puede comprender poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con prednisona; y poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser una cualquiera de las células proporcionadas en el presente documento. Como se describe en el presente documento, el conjugado de ligando de PSMA pueden ser uno cualquiera de los conjugados de ligando de PSMA proporcionados en el presente documento. En el presente documento se describe además una composición que comprende prednisona y un conjugado de ligando de PSMA. En el presente documento se describe además un kit que comprende un recipiente que contiene prednisona, y un recipiente que contiene un conjugado de ligando de PSMA.

En uno cualquiera de estos métodos, composiciones o kits descritos, el ligando de PSMA del conjugado puede comprender un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a PSMA. Como se describe en el presente documento, el ligando de PSMA puede ser uno cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno proporcionados en el presente documento.

En uno cualquiera de estos métodos, composiciones o kits descritos, el ligando de PSMA del conjugado puede comprender un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA. Como se describe en el presente documento, el ligando de PSMA puede ser uno cualquiera de los ligandos de molécula pequeña proporcionados en el presente documento.

En algunas realizaciones de los aspectos de la invención o en uno cualquiera de estos métodos, composiciones o kits descritos, el conjugado de ligando de PSMA comprende MIP-1095 o MIP-1072 conjugado con un radionúclido citotóxico seleccionado del grupo que consiste en I123, I125, I131, I124, Br75, Br77 y F18.

En algunas realizaciones de los aspectos de la invención o en uno cualquiera de estos métodos, composiciones o kits descritos, el agente antineoplásico o citotóxico del conjugado de ligando de PSMA es uno cualquiera de los agentes antineoplásicos o citotóxicos proporcionados en el presente documento. En algunas realizaciones, el agente comprende una auristatina, tubulisina, un dímero de pirrolobenzodiacepina, caliqueamicina, colchicina, ispinesib, combrestatina A4, maitansinoide DM1, maitansinoide DM4, doxorrubicina o un radionúclido citotóxico. Como se describe en el presente documento, la auristatina puede comprender monometilauristatina norefedrina o monometilauristatina fenilalanina.

En uno cualquiera de estos métodos descritos, el método puede comprender además poner en contacto las células que expresan PSMA con un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA. En una cualquiera de estas composiciones o kits descritos, las composiciones o kits pueden comprender además un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA. Como se describe en el presente documento, el compuesto puede ser un antiandrógeno o un inhibidor de mTOR. Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser uno cualquiera de los antiandrógenos proporcionados en el presente documento. Como se describe en el presente documento, el inhibidor de mTOR puede ser uno cualquiera de los inhibidores de mTOR proporcionados en el presente documento.

En uno cualquiera de estos métodos, composiciones o kits descritos, el antiandrógeno puede ser abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel. Como se describe en el presente documento, el antiandrógeno puede ser enzalutamida, abiraterona o ARN 509.

En uno cualquiera de los métodos descritos, las etapas de poner en contacto pueden ser simultáneas. Como se describe en el presente documento, las etapas de poner en contacto pueden ser secuenciales. Como se describe en el presente documento, la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con la prednisona y/o el compuesto puede ser antes de la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA.

En uno cualquiera de estos métodos, composiciones o kits descritos, las células cancerosas que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas independientes de andrógeno que expresan PSMA. Como se describe en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden comprender células cancerosas que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos.

En uno cualquiera de estos métodos descritos, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser de un sujeto. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede ser uno cualquiera de los sujetos proporcionados en el presente documento.

En una cualquiera de los métodos o composiciones o kits descritos anteriores, el antiandrógeno puede ser enzalutamida, abiraterona o ARN 509, y el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico puede ser un ADC de PSMA.

En una cualquiera de las composiciones o kits descritos anteriores, las composiciones o kits pueden comprender además un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En uno cualquiera de los kits descritos anteriores, uno cualquiera o todos de los componentes de los kits pueden estar en un medio acuoso. En uno cualquiera de los kits descritos anteriores, se pueden liofilizar uno cualquiera o todos de los componentes de los kits.

En uno cualquiera de los kits descritos anteriores, los kits pueden comprender además instrucciones para reconstituir uno cualquiera o todos de los componentes de los kits. En uno cualquiera de los kits descritos anteriores, los kits pueden comprender además instrucciones para combinar uno cualquiera o todos de los componentes de los kits.

En una cualquiera de las composiciones o kits descritos anteriores, las composiciones o kits pueden comprender además un diluyente.

En uno cualquiera de los métodos, kits o composiciones descritos anteriores, el ligando de PSMA del conjugado puede comprender un anticuerpo, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a PSMA. Como se describe en el presente documento, el ligando de PSMA puede ser un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a la porción extracelular de PSMA. Como se describe en el presente documento, el ligando de PSMA puede ser un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une al dímero de proteína de PSMA. Como se describe en el presente documento, el ligando de PSMA puede ser un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une preferentemente al dímero de proteína de PSMA, no al monómero de proteína de PSMA. Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se puede unir con al menos a 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o mayor afinidad a un dímero de proteína de PSMA en comparación con un monómero de proteína de PSMA. Como se describe en el presente documento, el dímero de proteína de PSMA y el monómero de proteína de PSMA pueden estar en una forma desnaturalizada, tal como una conformación nativa.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3,Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 y Abgenix 4.152.1, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender (i) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:15 y (ii) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 17.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender (i) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:19 y (ii) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 21.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender (i) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:23 y (ii) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 25.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender (i) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO:27 y (ii) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 29.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede comprender (i) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 31 y (ii) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta como SEQ ID NO: 33.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser el anticuerpo PSMA 10.3, AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026, AB-PG1-XG1-051, AB-PG1-XG1-069, AB-PG1-XG1-077, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser el anticuerpo E99, J415, J533 o J591 o un anticuerpo producido por un hibridoma que tiene número de acceso ATCC HB-12101, HB-12109, HB-12127or HB-12126, o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo pueden ser un anticuerpo producido por un hibridoma que tiene el Número de acceso ATCC HB12060 (3F5.4G6), HB12309 (3D7-1.1), HB12310 (4E10-1.14), HB12489 (1G3), HB12495 (1G9), HB12490 (2C7), HB12494 (3C4), HB12491 (3C6), HB12484 (3C9), HB12486 (3E6), HB12488 (3E11), HB12485 (3G6), HB12493 (4D4), HB12487 (4D8), HB12492 (4C8B9), HB12664 (3F6), HB12678 (2E4), HB12665 (3C2), HB12672 (2D4), HB12660 (4C8G8), HB12675 (2C4), HB12663 (4C11), HB12661 (1D11), HB12667 (4E8), HB12674 (2G5), HB12620 (4E6), HB12677 (1F4), HB12666 (2E3), HB12662 (3D8), HB12668 (4F8), HB12673 (3D2), HB12676 (1G7), HB12669 (3D4), HB12679 (5G10) o HB12671 (5E9), o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Según la invención, el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA. En una realización, el ligando de molécula pequeña se une o inhibe un sitio enzimático de PSMA. Como se describe en el presente documento, el ligando de molécula pequeña se puede unir o inhibir el sitio de glutamato carboxipeptidasa II (CCPII) en PSMA.

En una realización, el ligando de molécula pequeña puede comprender MIP-1095, MIP-1072 o DUPA.

Como se describe en el presente documento, el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico puede comprender EC1069 o EC1719.

Como se describe en el presente documento, el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico puede comprender BIND-014.

En una realización, el conjugado de ligando de PSMA comprende MIP-1095 o MIP-1072 conjugado con un radionúclido citotóxico seleccionado del grupo que consiste en I123, I125, I131, I124, Br75, Br77 y F18.

En una realización, el conjugado de ligando de PSMA puede comprender 123I-MIP-1095 o 123I-MIP-1072.

En una realización, el agente antineoplásico puede comprender una auristatina, tubulisina, un dímero de pirrolobenzodiacepina, caliqueamicina, colchicina, ispinesib, combrestatina A4, maitansinoide DM1, maitansinoide DM4, doxorrubicina, o un radionúclido citotóxico.

Como se describe en el presente documento, la auristatina puede comprender monometilauristatina norefedrina o monometilauristatina fenilalanina.

En uno cualquiera de los métodos proporcionados, el sujeto puede haber recibido tratamiento con un antiandrógeno y puede haber tenido ninguna sensibilidad o sensibilidad mínima a la terapia de antiandrógenos. En uno cualquiera de los métodos proporcionados, el sujeto puede haber sufrido una pérdida de sensibilidad a una terapia de antiandrógenos. Un sujeto que es sensible a la terapia de antiandrógenos es uno que sufre una reducción apreciable en el cáncer del sujeto, tal como una disminución en el número de células cancerosas, tales como una disminución en el número de células cancerosas circulantes o tamaño del tumor, o síntomas asociados al cáncer. La sensibilidad a la terapia de antiandrógenos se puede medir, por ejemplo, determinando el nivel de proliferación de las células cancerosas del sujeto después del tratamiento y se pueden comparar con el nivel de proliferación de las células cancerosas antes del tratamiento. La sensibilidad a la terapia de antiandrógenos se puede determinar durante un ciclo de tratamiento con un antiandrógeno, y cuando el nivel de reducción en el cáncer del sujeto ya no cambia apreciablemente o el sujeto sufre un aumento no deseado en la progresión del cancer, se puede considerar que el sujeto ha sufrido una pérdida de sensibilidad a la terapia de antiandrógenos. Un aumento en el cáncer de un sujeto se puede referir a un aumento en el número de células cancerosas o tamaño del tumor o a un aumento en los síntomas asociados al cáncer. El profesional clínico puede determinar la sensibilidad a la terapia de antiandrógenos se usando métodos rutinarios.

En uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, el sujeto puede ser uno que no tiene sensibilidad o tiene sensibilidad mínima a una terapia de antiandrógenos. Además, en uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, el sujeto puede ser uno que ha sufrido una pérdida de sensibilidad a la terapia de antiandrógenos. Se puede uno cualquiera de los métodos y composiciones proporcionados en el presente documento para sensibilizar o volver a sensibilizar dichos sujetos al tratamiento con un antiandrógeno cuando se administran simultáneamente o uno detrás de otro con los conjugados de ligando de PSMA proporcionados en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento puede incluir la etapa de identificar un sujeto que no tiene sensibilidad o tiene sensibilidad mínima a la terapia de antiandrógenos o que ha sufrido una pérdida de sensibilidad a la terapia de antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento puede incluir la etapa de evaluar el nivel de sensibilidad a la terapia de antiandrógenos en un sujeto. Como se describe en el presente documento, uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento puede incluir la etapa de administrar un antiandrógeno hasta que exista una pérdida de sensibilidad al mismo, así como una etapa de administrar un antiandrógeno simultáneamente o uno detrás de otro con un conjugado de ligando de PSMA como se proporciona en el presente documento.

Como se describe en el presente documento, uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento puede incluir una etapa de evaluar la progresión del cáncer en el sujeto. La progresión se puede evaluar de varias formas. Por ejemplo, la progresión se puede evaluar por uno cualquiera o más de los siguientes: determinando el nivel de PSA, evaluando las metástasis al hueso y evaluando la enfermedad medible. La progresión de metástasis al hueso puede ser la aparición de 2 o más lesiones al hueso nuevas en una gammagrafía ósea (TAC, IRM), o lesiones radiográficas nuevas. La progresión también se puede determinar por RECIST (Eisenhauer EA et al Eur J Cancer 2009:45(2):228-47). La progresión del cáncer puede ocurrir cuando existe un aumento en el dolor, tal como dolor de huesos. En uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, la evaluación de la progresión puede comprender evaluar una cualquiera o más de los anteriores.

En algunas realizaciones de uno cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, las células cancerosas que expresan PSMA pueden ser de un sujeto. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede haber recibido quimioterapia previa con uno o más taxanos. En algunas realizaciones, el sujeto puede haber recibido tratamiento anterior con uno o más antiandrógenos. En algunas realizaciones, el sujeto puede tener cáncer de próstata que ha progresado a pesar del tratamiento anterior, tal como con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede tener cáncer de próstata que está empezando a progresar a pesar del tratamiento, tal como con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido quimioterapia citotóxica previa. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido tratamiento anterior con uno o más antiandrógenos. Como se describe en el presente documento, el sujeto puede no haber recibido tratamiento anterior con enzalutamida o abiraterona. Como se describe en el presente documento, el sujeto que no ha recibido tratamiento anterior con antiandrógenos, tal como enzalutamida o abiraterona, puede ser uno con cáncer de próstata metastásico resistente a la castración. El sujeto puede ser uno cualquiera de los sujetos descritos en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La FIG. 1A presenta un esquema que muestra la estructura de dos ejemplos de antiandrógenos que aumentan la expresión de PSMA, enzalutamida y abiraterona; la FIG. 1B presenta un esquema que muestra la estructura química de ARN-509 (MW=477,43); la FIG. 1C presenta un esquema que muestra la estructura química de galeterona (TOK-001) (MW=388,55); la FIG. 1D presenta un esquema que muestra la estructura de un conjugado de ligando de PSMA que incluye un anticuerpo contra PSMA conjugado con monometil auristatina E (MMAE) (conjugado de anticuerpo contra PSMA-fármaco (PSMA ADC)), un promedio de cuatro moléculas de MMAE en esta realización.

La FIG. 2 muestra los valores de porcentaje de la inhibición de la proliferación celular y las diferencias de Bliss para células LNCaP (A) y células C4-2 (B) puestas en contacto con combinaciones de conjugado de ligando de PSMA y enzalutamida, abiraterona o rapamicina. Cada punto de datos representa la media de tres a siete ensayos independientes. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro) o casi cero (gris claro). Los parámetros de Bliss que son significativamente diferentes de cero (P<0,05) están resaltados por texto en negrita y bordes gris oscuro, y los valores de porcentaje de inhibición correspondientes están resaltados con sombreado y texto gris oscuro. NA = no aplicable. (C) Gráfico que muestra aumentos en la expresión de PSMA y la inhibición de la proliferación celular en función del aumento de concentración de enzalutamida.

La FIG. 3 muestra los valores de porcentaje de la inhibición de la proliferación celular y las diferencias de Bliss para células LNCaP (A) y células C4-2 (B) puestas en contacto con combinaciones de inhibidores de los microtúbulos y antiandrógenos. Cada punto de datos representa la media de tres a cinco ensayos independientes. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). Los parámetros de Bliss que son significativamente diferentes de cero (P<0,05) están resaltados por texto en negrita y bordes gris oscuro, y los valores de porcentaje de inhibición correspondientes están resaltados con sombreado y texto gris oscuro. NA = no aplicable.

La FIG. 4 muestra los valores de porcentaje de la inhibición de la proliferación celular y las diferencias de Bliss para células LNCaP (A) y células C4-2 (B) puestas en contacto con combinaciones de rapamicina con MMAE o enzalutamida. Cada punto de datos representa la media de tres ensayos independientes. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). Los parámetros de Bliss que son significativamente diferentes de cero (P<0,05) están resaltados por texto en negrita y bordes gris oscuro, y los valores de porcentaje de inhibición correspondientes están resaltados con sombreado y texto gris oscuro. NA = no aplicable.

La FIG. 5 muestra los valores de porcentaje de la inhibición de la proliferación celular y las diferencias de Bliss para células LNCaP (A) y células C4-2 (B) puestas en contacto con combinaciones de anticuerpo monoclonal contra PSMA y enzalutamida, abiraterona o rapamicina. Cada punto de datos representa la media de dos o tres ensayos independientes. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). Ningún parámetro de Bliss fue significativamente diferente de cero (P<0,05). NA = no aplicable.

La FIG. 6 muestra un análisis de citometría de flujo de la expresión de PSMA. La expresión de PSMA se midió por citometría de flujo en células tratadas durante 7 días con concentraciones variables de enzalutamida, abiraterona o rapamicina (A-F) o tratadas con enzalutamida 1 pM durante tiempos variables (G). En A-D, se muestra tinción anti-PSMA en función de concentraciones de antiandrógeno del siguiente modo: verde (0,125 pM), rosa (0,5 pM), cian (1 pM) y naranja (5 pM). En E-F, los histogramas verde, rosa y cian representan concentraciones de rapamicina de 1, 10 y 100 nM, respectivamente. Los histogramas violeta rellenos indican células sin tratar, y la línea azul representa la tinción de fondo con anticuerpo de control de isotipo. (G) Evolución temporal de la expresión de PSMA en células C4-2 tratadas con enzalutamida. Las barras verticales representan los valores de intensidad media de fluorescencia (IMF) en el eje izquierdo, y la línea roja representa el aumento en veces en la expresión de PSMA en células tratadas con respecto a células sin tratar en el eje derecho. (PR = días después de la retirada de enzalutamida)

La FIG. 7 muestra un análisis de expresión de proteínas por transferencia Western de extractos de células completas de células LNCaP (A) o C4-2 (B) dejadas sin tratar (Sin tr) o tratadas durante 7 días con enzalutamida (Enza), abiraterona (Abi) o rapamicina (Rapa) antes del análisis.

La FIG. 8 muestra los valores de porcentaje de la inhibición de la proliferación celular y las diferencias de Bliss para células LNCaP (A) y células C4-2 (B) puestas en contacto con combinaciones de conjugado de ligando de PSMA y prednisona o inhibidores de Akt, PI3K o proteína del huso de quinesina (inhibidores MK-2206, GDC-0941 y SB743921, respectivamente). Cada punto de datos representa la media de cuatro o cinco ensayos independientes. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). Los parámetros de Bliss que son significativamente diferentes de cero (P<0,05) están resaltados por texto en negrita y bordes gris oscuro, y los valores de porcentaje de inhibición correspondientes están resaltados con sombreado y texto gris oscuro. NA = no aplicable.

La FIG. 9 presenta un esquema que muestra una estructura química con un conector D-Y-Glu D-Asp-D-Phe-D-Cys.

La FIG. 10 muestra los valores de porcentaje de la inhibición de la proliferación celular y las diferencias de Bliss para células LNCaP (A) y células C4-2 (B) puestas en contacto con combinaciones de conjugado de ligando de PSMA de molécula pequeña, EC1069 y enzalutamida. Cada punto de datos representa un ensayo independiente.

Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). NA = no aplicable.

La FIG. 11 presenta un esquema que muestra la estructura de conjugado de ligando de PSMA de molécula pequeña que comprende un agente antineoplásico, tubulisina (también denominado en el presente documento EC1069).

La FIG. 12 presenta datos de combinaciones de ADC de PSMA con ARN-509 (Aragon Pharmaceuticals, inhibidor de receptores de andrógeno) y TOK-001 (Tokai Pharmaceuticals, inhibidor de CYP17 y antagonista de receptores de andrógeno). Los valores del porcentaje de inhibición y las diferencias de Bliss se muestran para las células LNCaP (A) y las células C4-2 (B). Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). NA = no aplicable. Se compraron ARN-509 y TOK-001 de Selleck Chemicals.

La FIG. 13 demuestra los efectos de enzalutamida sobre la proliferación y la expresión de PSMA. Estos datos muestran que los efectos sobre la proliferación y la expresión de PSMA ocurren en concentraciones similares en células LNCaP (pero no están acoplados en células C4-2).

La FIG. 14 demuestra los aumentos rápidos, significativos y dependientes de la dosis en la expresión de PSMA con enzalutamida. Los efectos se presentaron en un intervalo de dosis clínicamente significativo y se observaron para células dependientes de andrógeno (LNCaP) e independientes de andrógeno (C4-2).

La FIG. 15 también demuestra el aumento de la expresión de PSMA con enzalutamida. La expresión de PSMA fue máxima después de 3 a 4 semanas de exposición, pero volvió a niveles basales una semana después de la retirada de enzalutamida.

La FIG. 16 muestra la actividad antineoplásica sinérgica de enzalutamida y ADC de PSMA in vitro. Los resultados son el promedio de cuatro repeticiones para cada condición. Los valores en negrita indican sinergia estadísticamente significativa.

La FIG. 17 muestra que ADC de PSMA sinergiza con enzalutamida in vitro. Se mostró la sinergia en tanto células dependientes de andrógeno como independientes de andrógeno y se asoció al aumento de expresión de PSMA. Sorprendentemente, la sinergia se observó incluso cuando la enzalutamida sola tuvo actividad antitumoral mínima.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere, al menos en parte, a tratamientos de combinación para cáncer que expresa PSMA, tal como cáncer de próstata y, en particular, cáncer de próstata metastásico progresivo. Como se describe en el presente documento, los tratamientos pueden incluir la administración de al menos un agente que se dirige al antígeno prostático específico de membrana (PSMA) en combinación con un agente que se dirige a receptores de andrógeno (RA). La invención se basa, al menos en parte, en el sorprendente descubrimiento de que los antiandrógenos (por ejemplo, enzalutamida o abiraterona) aumentan significativamente y reversiblemente la expresión de PSMA y potencian la actividad de conjugados de ligando de PSMA. En células independientes de andrógeno, los efectos sobre la expresión de PSMA y la actividad de conjugado fueron sinérgicos y estuvieron desacoplados de cualquier efecto antiproliferativo de antiandrógenos. La inhibición sinérgica del crecimiento de células tumorales se asoció a una regulación por incremento de la expresión de PSMA por antiandrógenos, incluso en células que fueron resistentes al tratamiento con antiandrógenos solo. El tratamiento simultáneo, en efecto, puede volver a sensibilizar las células a la terapia de antiandrógenos.

Tanto la enzalutamida como la abiraterona sinergizaron potentemente con conjugados de ligando de PSMA a lo largo de un intervalo de concentraciones. Se observó sinergia en células que fueron tanto sensibles como insensibles al tratamiento con antiandrógenos solo. En células LNCaP dependientes de andrógeno, se observaron los efectos farmacológicos de antiandrógenos (por ejemplo, efectos anti proliferativos, efectos sobre la expresión génica y sinergia con conjugados de ligando de PSMA) a lo largo de un intervalo similar de concentraciones clínicamente relevantes. En células C4-2 independientes de andrógeno, se desacoplaron los efectos sobre la expresión génica y la sinergia de cualquier actividad antiproliferativa apreciable de enzalutamida o abiraterona. Así, estos antiandrógenos siguen siendo farmacológicamente activos para células C4-2; sin embargo, las células han adoptado mecanismos de supervivencia compensatorios que les permiten proliferar en presencia del bloqueo de receptores de andrógenos (RA) en curso.

Se observó de poca a ninguna sinergia entre los antiandrógenos y los componentes de los conjugados (es decir, MMAE libre y mAb PSMA sin modificar). MMAE libre mostró efectos de aditivos a débilmente sinérgicos cuando se combinó con los antiandrógenos. Hubo una sinergia modesta entre los antiandrógenos y docetaxel. El mAb sin modificar no mostró actividad antiproliferativa tanto solo como en combinación con antiandrógenos. Por tanto, la fuerte sinergia observada con conjugados de ligando de PSMA es específica por los conjugados y ni es un efecto secundario de sus componentes ni es generalizable a inhibidores de los microtúbulos como clase.

Se dobló la expresión de PSMA después de 7 días tratamiento con enzalutamida, y se cuadruplicó después de 21 días. La magnitud de la regulación por incremento de PSMA por enzalutamida o abiraterona se aproximó a la inducida por suero tratado con carbón vegetal, que se reduce en un intervalo de hormonas, citocinas y factores de crecimiento (40). Los hallazgos sugieren supresión de andrógeno próxima a la máxima en el sistema de los presentes inventores. Se monitorizó la evolución temporal de la expresión en células tratadas con enzalutamida. La expresión de PSMA aumentó con el tratamiento continuado durante tres semanas y luego volvió rápidamente al nivel inicial tras la retirada de enzalutamida. Los hallazgos tienen implicaciones para la combinación y secuenciación de antiandrógenos potentes y terapias dirigidas a PSMA en la clínica.

Además, los conjugados de ligando de PSMA sinergizaron con un inhibidor de la vía de PI3K/mTOR por un mecanismo multimodal que implica la elevada expresión de PSMA y la perturbación de la función de microtúbulos. En células C4-2, la rapamicina presentó actividad mínima de un único agente, pero potenció la actividad de conjugados de ligando de PSMA, que sugiere que la activación de la vía de PI3K es una respuesta adaptativa al tratamiento con ADC tratamiento en células C4-2. Así, también existe el sorprendente descubrimiento de que, en algunos casos, la actividad del inhibidor de mTOR, tal como rapamicina, sinergizó con la actividad de conjugados de ligando de PSMA.

Como se usa en el presente documento, un "conjugado de ligando de PSMA" comprende una molécula que se une específicamente a PSMA, tal como un dominio extracelular de PSMA, y está conjugado con un agente terapéutico. El agente terapéutico puede ser un agente antineoplásico o un agente citotóxico. Un "ligando de PSMA" en el presente documento se refiere, por tanto, a una molécula que se une específicamente a PSMA, como se describe en el presente documento. Cuando se conjuga un ligando de PSMA con un agente antineoplásico, el conjugado de ligando de PSMA también se denomina en el presente documento un "conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico". Cuando se conjuga un ligando de PSMA con un agente citotóxico, el conjugado de ligando de PSMA también se denomina en el presente documento un "conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico".

Como se usa en el presente documento, "células que expresan PSMA" se refiere a células que expresan PSMA o que pueden expresar PSMA (por ejemplo, PSMA humano). PSMA es una glucoproteína membrana de tipo II de 100 kD expresada en tejidos de próstata (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7:927-935; patente de EE. UU. N° 5.162.504). PSMA se caracterizó como una proteína transmembranaria de tipo II que tiene homología de secuencias con el receptor de transferrina (Israeli et al., 1994, Cancer Res. 54:1807-1811) y con actividad de NAALADasa (Carter et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:749-753). PSMA se expresa en elevadas cantidades en cáncer de próstata (Horoszewicz et al., 1987, Anticancer Res. 7:927-935; Rochon et al., 1994, P 25:219-223; Murphy et al., 1995, Prostate 26:164-168; y Murphy et al., 1995, Anticancer Res. 15:1473-1479). La expresión de PSMA en próstata cancerosa es aproximadamente 10 veces superior a en próstata normal. La expresión en próstata normal es aproximadamente 10 veces superior a en el cerebro y es 50 a 100 veces superior a en hígado o riñón. En la mayoría de los tejidos normales, no se observa expresión de PSMA.

La expresión de PSMA aumenta con la progresión de la enfermedad, llegando a ser la más alta en enfermedad metastásica resistente a hormonas. Además, el PSMA también se expresa abundantemente en la neovasculatura de una variedad de tumores no de próstata, que incluye vejiga, mama, colon, páncreas, sarcoma, melanoma, renal, hígado, pulmón (por ejemplo, carcinoma de pulmón de células no pequeñas) y tumores de riñón, pero no en vasculatura normal. "Células que expresan PSMA", por tanto, incluyen células cancerosas que expresan PSMA tales como células de cáncer de próstata, así como células que expresan PSMA (por ejemplo, células endoteliales) de la neovasculatura de varios cánceres no de próstata o tumores no de próstata.

Como se usa en el presente documento, una "célula que expresa PSMA dependiente de andrógeno" se refiere a una célula que expresa PSMA, tal como una célula cancerosa, que es sensible a antiandrógenos. Se considera en el presente documento que una célula es sensible a un antiandrógeno si la proliferación de la célula puede ser sustancialmente inhibida por el antiandrógeno.

Como se usa en el presente documento, una "célula que expresa PSMA independiente de andrógeno" se refiere a una célula que expresa PSMA, tal como una célula cancerosa, que es insensible a antiandrógenos, también denominada en el presente documento una "célula que expresa PSMA insensible a la terapia de antiandrógenos". Se considera en el presente documento que una célula no es sensible a un antiandrógeno si la proliferación de la célula no se inhibe sustancialmente por el antiandrógeno.

Las células que expresan PSMA insensibles a la terapia de antiandrógenos se pueden sensibilizar a terapia de antiandrógenos después de la etapa de poner en contacto las células que expresan PSMA con un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA (por ejemplo, antiandrógeno o inhibidor de mTOR). Dichas células se pueden poner entonces en contacto con un conjugado de ligando de PSMA como se proporciona en el presente documento, y dicho contacto puede ocurrir simultáneamente o uno detrás de otro. Así, las células independientes de andrógeno que expresan PSMA (por ejemplo, células cancerosas) que son de otro modo no sensibles a antiandrógenos pueden llegar a ser sensibles, y, por tanto, sensibilizarse a antiandrógenos cuando se ponen en contacto con un antiandrógeno, o un inhibidor de mTOR, y además se pueden poner en contacto con un conjugado de ligando de PSMA para efectuar la inhibición de la proliferación celular o destrucción celular. Como resultado, se puede inhibir sustancialmente la proliferación de dichas células cancerosas "sensibilizadas" que expresan PSMA. La sensibilización de células independientes de andrógeno que expresan PSMA a antiandrógenos puede ocurrir en 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días o más desde que se pusieron en contacto con un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA. La sensibilización de células independientes de andrógeno que expresan PSMA a antiandrógenos puede ocurrir en menos de 2 días.

Se pueden poner en contacto células que expresan PSMA con un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA durante un periodo de tiempo suficiente para aumentar (por ejemplo, regular por incremento) la expresión de PSMA sobre la superficie de las células. Un tiempo suficiente para regular por incremento expresión de la superficie celular de PSMA se puede determinar por ensayos de expresión de innumerables proteínas, que se conocen en la técnica, que incluye, por ejemplo, enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) y transferencia Western. Un tiempo suficiente para regular por incremento expresión de la superficie celular de PSMA puede ser 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19 días, 20 días, 21 días o más. Un tiempo suficiente para regular por incremento expresión de la superficie celular de PSMA puede ser menos de 1 día.

Los ejemplos de ligandos de PSMA para su uso como se proporciona en el presente documento incluyen, sin limitación, anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, así como ligandos de molécula pequeña que se unen específicamente a PSMA y pueden actuar como miméticos de sustrato de sitios enzimáticos en PSMA. Los anticuerpos que se unen específicamente a PSMA se pueden denominar en el presente documento "anticuerpos contra PSMA". Asimismo, los ligandos de molécula pequeña que se unen específicamente a PSMA se pueden denominar en el presente documento "ligandos de PSMA de molécula pequeña".

Como se usa en el presente documento, "unión específica" se refiere a una molécula (por ejemplo, anticuerpo) que se une a una diana predeterminada (por ejemplo, antígeno), en este caso PSMA (por ejemplo, PSMA humano). La secuencia de PSMA puede ser como se expone en SEQ ID NO: 1. Normalmente, la molécula se une con una afinidad que es al menos dos veces superior a su afinidad para unirse a una diana no específica (por ejemplo, BSA, caseína), que es una diana distante de PSMA, una isoforma o variante de PSMA, o una diana estrechamente relacionada.

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de un conjugado de ligando de PSMA puede ser cualquier anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a PSMA (por ejemplo, se une específicamente a un epítope de PSMA). Los ejemplos de anticuerpos contra PSMA para su uso como se proporciona en el presente documento incluyen, sin limitación, los enumerados en la Tabla 1. Los fragmentos de unión al antígeno de estos anticuerpos también son ejemplos de fragmentos de unión al antígeno para su uso en los métodos y composiciones como se proporciona en el presente documento.

El anticuerpo se puede producir por los hibridomas denominados en el presente documento. Estos hibridomas se depositaron según, y en satisfacción de, los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento International del Depósito de Microorganismos a Efectos del Procedimiento de Patente en la Colección Americana de Cultivos Tipo ("ATCC"), que tiene la dirección 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, como Autoridad de Depósito Internacional y se les dio Denominaciones de Depósito de Patente (Tabla 1):

Tabla 1

Un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo de un conjugado de ligando de PSMA puede comprender: (i) una cualquiera de las cadenas pesadas proporcionadas en el presente documento y (ii) una cualquiera de las cadenas ligeras proporcionadas en el presente documento. Un anticuerpo contra PSMA como se proporciona en el presente documento puede incluir (i) una cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada proporcionadas en el presente documento y (ii) una cualquiera de las regiones variables de la cadena ligera proporcionadas en el presente documento. Los anticuerpos contra PSMA pueden incluir (i) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una cualquiera de las regiones variables de la cadena pesada proporcionadas en el presente documento y (ii) las tres regiones determinantes de la complementariedad de una cualquiera de las regiones variables de la cadena ligera proporcionadas en el presente documento.

También se depositaron los plásmidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos a modo de ejemplo en la ATCC y se muestran en la Tabla 1 anterior.

También se proporcionan fragmentos de unión al antígeno de uno cualquiera de los anticuerpos anteriores para su uso como los ligandos de PSMA de los conjugados de ligando de PSMA proporcionados en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, los nombres de los hibridomas o plásmidos depositados se pueden usar indistintamente con los nombres de los anticuerpos. Sería evidente para un experto en la técnica cuando el nombre pretende referirse al anticuerpo o cuando se refiere a los plásmidos o hibridomas que codifican o producen los anticuerpos, respectivamente. Además, los nombres de anticuerpos puede ser una forma abreviada del nombre mostrado en la Tabla 1. Por ejemplo, el anticuerpo AB-PG1-XG1-006 se puede denominar "AB-PG1-XG1-006", "PG1-XG1-006", "XG1-006" o "006". En otro ejemplo, el anticuerpo PSMA 4.232.3 se puede denominar "PSMA 4.232.3", "4.232.3", "4.232.3" o "4.232." Se pretende que todas las variaciones en el nombre del anticuerpo se refieran al mismo anticuerpo y no a uno diferente.

Como se usa en el presente documento, una "región codificante" se refiere a una región de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos; la región codificante puede incluir una región que codifica una porción de una proteína que después se escinde, tal como un péptido señal.

Los expertos en la técnica apreciarán que los ácidos nucleicos y polipéptidos como se proporcionan en el presente documento incluyen secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos como se proporciona en el presente documento. En algunos casos, las secuencias de nucleótidos y las secuencias de aminoácidos pueden incluir secuencias que codifican, o que son, péptidos señal. Se contempla en el presente documento cada una de estas secuencias con, o sin, la porción de la secuencia que codifica o es un péptido señal.

Un anticuerpo contra PSMA se puede codificar por una molécula de ácido nucleico o molécula de aminoácido que es altamente homóloga a las moléculas de ácidos nucleicos o moléculas de aminoácido proporcionadas en el presente documento, respectivamente. Por ejemplo, la molécula homóloga de ácido nucleico o molécula de aminoácido puede comprender una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos que es al menos aproximadamente 90 % idéntica a una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos proporcionada en el presente documento. Como otro ejemplo, una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos es al menos aproximadamente 95 % idéntica, al menos aproximadamente 97 % idéntica, al menos aproximadamente 98 % idéntica, o al menos aproximadamente 99 % idéntica a una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos como se proporciona en el presente documento. La homología se puede calcular usando diversos software públicamente disponibles, que se conocen bien por un experto habitual en la técnica. Las herramientas a modo de ejemplo incluyen el sistema BLAST disponible del sitio web del Centro Nacional para Información Biotecnológica (NCBI) en los Institutos Nacionales de Salud.

Los anticuerpos contra PSMA pueden incluir los anticuerpos proporcionados en las patentes de EE. UU. 6.107.090, 6.649.163 y 6.962.981. Los anticuerpos contra PSMA incluyen, por tanto, los anticuerpos monoclonales E99, J415, J533 y J591; los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas que tienen números de acceso ATCC HB-12101, HB-12109, HB-12127 y HB-12126; y los anticuerpos monoclonales producidos por hibridomas que tienen números de acceso ATCC HB12060 (3F5.4G6), HB12309 (3D7-1.1), HB12310 (4E10-1.14), HB12489 (1G3), HB12495 (1G9), HB12490 (2C7), HB12494 (3C4), HB12491 (3C6), HB12484 (3C9), HB12486 (3E6), HB12488 (3E11), HB12485 (3G6), HB12493 (4D4), HB12487 (4D8), HB12492 (4C8B9), HB12664 (3F6), HB12678 (2E4), HB12665 (3C2), HB12672 (2D4), HB12660 (4C8G8), HB12675 (2C4), HB 12663 (4C11), HB12661 (1 D11), HB 12667 (4E8), HB 12674 (2G5), HB 12620 (4E6), HB12677 (1 F4), HB12666 (2E3), HB12662 (3D8), HB12668 (4F8), HB12673 (3D2), HB12676 (1G7), HB12669 (3D4), HB12679 (5G10) y HB12671 (5E9). Los fragmentos de unión al antígeno de estos anticuerpos también se contemplan para su uso como ligandos de PSMA de los conjugados de ligando de PSMA proporcionados en el presente documento.

En el presente documento también se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que codifican anticuerpos contra PSMA y fragmentos de unión al antígeno de los mismos y vectores que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos, como se describe en el presente documento. Los vectores proporcionados se pueden usar para transformar o transfectar células hospedadoras para producir anticuerpos contra PSMA y fragmentos de unión al antígeno de los mismos con la especificidad descrita en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento HCVR o V^h) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, C^h1 , C^h2 y C^h3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento LCVR o V^l) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones V^hy V^lse pueden subdividir además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones estructurales (FR). Cada V^hy V^lestá compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas de extremo amino a extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico.

Como se usa en el presente documento, "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo se refiere a una o más porciones de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, PSMA). La función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unión englobados dentro del término "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios V^l, V^h, C^ly C^h1 ; (ii) un fragmento F(ab')², un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios V^hy CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios V^ly V^hde un único brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio V^h; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, V y V^h, estén codificados por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un conector sintético que permite que se preparen como una única cadena de proteína en la que los pares de regiones V^ly V^hforman moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Dichos anticuerpos monocatenarios también pretenden estar englobados dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PSMA está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PSMA). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítope, isoforma o variante de PSMA puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especie de PSMA). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

Los anticuerpos aislados descritos en el presente documento engloban diversos isotipos de anticuerpos, tales como IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD, IgE. Como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgG 1) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada. Los anticuerpos puede ser de longitud completa o pueden incluir solo un fragmento de unión al antígeno, tal como el dominio constante y/o variable del anticuerpo de IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD o IgE o podrían consistir en un fragmento Fab, un fragmento F(ab^')2y un fragmento Fv.

Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, o una mezcla de anticuerpos policlonales y monoclonales. Los anticuerpos se pueden producir mediante una variedad de técnicas bien conocidas en la técnica. Se conocen bien procedimientos para producir anticuerpos policlonales. La producción de anticuerpos monoclonales se puede efectuar por técnicas que también se conocen bien en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo monoclonal" se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Un anticuerpo monoclonal muestra una única especificidad de unión y afinidad por un epítope particular.

Los anticuerpos recombinantes se contemplan para su uso como se proporciona en el presente documento. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo recombinante" se refiere a un anticuerpo que se prepara, expresa, crea o aísla por medios recombinantes, tales como un anticuerpo aislado de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para otros genes de inmunoglobulina de la especie, un anticuerpo expresado usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora, un anticuerpo aislado de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, o un anticuerpo preparado, expresado, creado o aislado por cualquier otro medio que implica el corte y empalme de las secuencias del gen de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.

Un anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que combina las regiones variables o hipervariables murinas con la región constante humana o regiones estructurales constantes y variables. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo humanizado" se refiere a un anticuerpo que retiene solo las CDR de unión al antígeno del anticuerpo parental en asociación con regiones estructurales humanas (véase, Waldmann, 1991, Science 252:1657). Se espera que dichos anticuerpos quiméricos o humanizados que retienen la especificidad de unión del anticuerpo murino tengan inmunogenicidad reducida cuando se administran in vivo para aplicaciones diagnósticas, profilácticas o terapéuticas como se proporciona en el presente documento.

Los anticuerpos monoclonales proporcionados aquí se pueden modificar para estar en forma de un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo multiespecífico. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo biespecífico" incluye cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido, o complejo de proteína o péptido, que tenga dos especificidades de unión diferentes que se unen a, o interaccionan con (a) un antígeno de la superficie celular y (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una célula efectora. Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo multiespecífico" incluye cualquier agente, por ejemplo, una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tiene más de dos especificidades de unión diferentes que se unen a, o interaccionan con, (a) un antígeno de la superficie celular, (b) un receptor de Fc sobre la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. Por consiguiente, los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser biespecíficos, triespecíficos, tetraespecíficos, u otros anticuerpos multiespecíficos dirigidos a antígenos de la superficie celular, tales como PSMA, y a receptores de Fc sobre las células efectoras. "Anticuerpos biespecíficos" también incluye diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los que los dominios V^hy V^lse expresan en una única cadena de polipéptidos y usan un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, obligando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y a crear dos sitios de unión al antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poijak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

Un anticuerpo biespecífico puede estar formado por una región de unión al antígeno específica para el dominio extracelular de PSMA y una región de unión al antígeno específica para una célula efectora que tiene actividad tumoricida o inhibidora de tumores. Las dos regiones de unión al antígeno del anticuerpo biespecífico están o químicamente unidas o se pueden expresar por una célula genéticamente manipulada para producir el anticuerpo biespecífico (véase, en general, Fanger et al., 1995 Drug News & Perspec. 8(3):133-137). Las células efectoras adecuadas que tienen actividad tumoricida incluyen, sin limitación, linfocitos T citotóxicos (principalmente linfocitos CD8+) y linfocitos citolíticos espontáneos.

Los anticuerpos proporcionados en el presente documento pueden ser anticuerpos humanos. Como se usa en el presente documento, "anticuerpos humanos" incluyen anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica de sitio in vitro o por mutación somática in vivo). El término "anticuerpos humanos", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de la región estructural humana (denominadas de otro modo en el presente documento como "anticuerpos humanizados"). Los anticuerpos humanos dirigidos contra PSMA se pueden generar usando ratones transgénicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en vez del sistema de ratón. Los anticuerpos contra PSMA humano proporcionados en el presente documento se unen específicamente a PSMA y/o PSMAsr (PSMA soluble recombinante, es decir, con la secuencia de la porción extracelular de PSMA) de la superficie celular con afinidad inferior a nanomolar. Los anticuerpos contra PSMA humano proporcionados en el presente documento pueden tener afinidades de unión de aproximadamente 1x10-9 M o menos, aproximadamente 1x10-1° M o menos, o 1x10-11 M o menos. La afinidad de unión de los anticuerpos contra PSMA humano como se proporcionan en el presente documento puede ser inferior a aproximadamente 5x10-10 M.

Se pueden seleccionar anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, por ejemplo, basándose en los siguientes criterios, que no pretenden ser excluyentes:

° 1) unión a células vivas que expresan PSMA;

° 2) alta afinidad de unión a PSMA;

° 3) unión a un único epítope en PSMA (para eliminar la posibilidad que anticuerpos con actividades complementarias que cuando se usan en combinación competirían para unirse al mismo epítope);

° 4) opsonización de células que expresan PSMA;

° 5) mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o destrucción de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras;

° 6) modulación (inhibición o potenciamiento) de las actividades de NAALADasa, folato hidrolasa, dipeptidil peptidasa IV y/o Y-glutamil hidrolasa;

° 7) inhibición del crecimiento, detención del ciclo celular y/o citotoxicidad en ausencia de células efectoras;

° 8) internalización de PSMA;

° 9) unión a un epítope conformacional en PSMA;

° 10) reactividad cruzada mínima con células o tejidos que no expresan PSMA; y

° 11) unión preferencial a formas diméricas de PSMA en vez de a formas monoméricas de PSMA.

anticuerpos contra PSMA y fragmentos de unión al antígeno de los mismos proporcionados en el presente documento normalmente cumplen uno o más, y en algunos casos, todos los criterios anteriores.

Se puede seleccionar un anticuerpo aislado o fragmento de unión al antígeno del mismo por su capacidad para unir células vivas que expresan PSMA. Para demostrar la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan el PSMA, se puede usar citometría de flujo. La unión del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo a células vivas que expresan PSMA puede inhibir el crecimiento de las células o mediar en la citólisis de las células. La citólisis puede estar mediada por el complemento o se puede mediar por células efectoras. La citólisis se puede llevar a cabo en un organismo vivo, preferentemente un mamífero, y la célula viva es una célula tumoral. Los ejemplos de tumores que pueden ser por anticuerpos contra PSMA (porejemplo, conjugados de PSMA-anticuerpo) proporcionados en el presente documento incluyen cualquier tumor que expresa PSMA tal como, por ejemplo, próstata, vejiga, páncreas, pulmón, colon, riñón, melanomas y sarcomas. Un tumor que expresa PSMA incluye tumores con neovasculatura que expresa PSMA.

Se puede unir un anticuerpo de PSMA, o fragmento de unión al antígeno del mismo, y ser internalizado con PSMA expresado en células. Así, un conjugado de ligando de PSMA que comprende un anticuerpo contra PSMA puede ser internalizado con PSMA expresado en células. El mecanismo por el que esta internalización ocurre no es crítico para la práctica de la presente divulgación. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo puede inducir la internalización de PSMA.

Se puede unir un anticuerpo contra PSMA, o fragmento de unión al antígeno del mismo, a un epítope conformacional dentro del dominio extracelular de la molécula de PSMA. Los anticuerpos que se unen a la proteína nativa pero no a proteína desnaturalizada son los anticuerpos que se unen a epítopes conformacionales, y pueden ser anticuerpos preferidos.

Un anticuerpo contra PSMA, o fragmento de unión al antígeno del mismo, se puede unir a un epítope específico de dímero en PSMA. En general, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a un epítope específico de dímero se unen preferentemente al dímero de PSMA en vez del monómero de PSMA. Los anticuerpos que se unen al dímero de PSMA pero no a la proteína monomérica de PSMA pueden ser anticuerpos preferidos.

Otros anticuerpos contra PSMA, o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, proporcionados en el presente documento incluyen anticuerpos que se unen específicamente a un epítope en PSMA definido por un segundo anticuerpo. Para determinar el epítope, se pueden usar métodos habituales de mapeado de epítopes conocidos en la técnica.

El anticuerpo contra PSMA de un conjugado de ligando de PSMA puede ser un anticuerpo monoclonal que se une al dímero de proteína de antígeno prostático específico de membrana (PSMA), dímero de proteína de PSMA que es un homodímero del monómero de proteína de PSMA que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo, o el fragmento de unión al antígeno, (i) se une células vivas y (ii) se une con al menos una afinidad dos veces mayor al dímero de proteína de PSMA que al monómero de la proteína de PSMA, como se describe en la patente de EE. UU. N° 8.114.965.

Los anticuerpos contra PSMA se pueden conjugar con moléculas radiactivas. Un ejemplo de dicho conjugado de ligando de PSMA, así, incluye 177Lu-J591, que contiene anticuerpo monoclonal contra PSMA J591 conjugado mediante ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA) con 177Lutecio (177Lu).

El ligando de PSMA de un conjugado de ligando de PSMA puede ser cualquier ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA. Dichos ligandos de molécula pequeña se pueden unir al sitio de PSMA enzimático en su conformación nativa. Por tanto, dichos ligandos de molécula pequeña pueden poseer una cualquiera o más de las características descritas anteriormente para anticuerpos contra ligandos de PSMA.

El ligando de molécula pequeña se puede basar en un heterodímero de glutamato-urea-lisina (por ejemplo, análogo de glutamato-urea-lisina), o un dímero basado en glutamato-urea-glutamato, que se une específicamente a un sitio enzimático en PSMA. Según la invención, el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-ureaaminoácido, en donde el resto de glutamato-urea-aminoácido es un glutamato-urea-lisina. En algunas realizaciones, dichos ligandos de molécula pequeña se conjugan con un radionúclido como en agente antineoplásico, o citotóxico (por ejemplo, radionúclido citotóxico o isótopo radioterapéutico). Así, los ejemplos de conjugados de ligando de PSMA incluyen ligandos de molécula pequeña de glutamato-urea-aminoácido conjugados con un radionúclido mediante un conector intermedio tal como 123I-MIP-1095 (también denominado 123I-MIP-1466) y 123I-MIP-1072 (Molecular Insight Pharmaceuticals, Inc.). Otros ejemplos de ligandos de PSMA de molécula pequeña y conjugados de ligando de PSMA se pueden encontrar en la patente de EE. UU. 8.465.725 y U.S. 8.487.129. En algunas realizaciones, I123 se puede sustituir con otros radiohalógenos que incluyen los seleccionados del grupo que consiste en I125, I131, I124, Br75, Br77 y F18.

La estructura química de 123I-MIP-1095 (es decir, ácido 123I-(S)-2-(3-((S)-1-carboxi-5-(3-(4-yodofenil)ureido)pentil)ureido)pentanodioico) es:

En otra realización, el conjugado de ligando de PSMA es 124I-MIP-1095. En otra realización, el conjugado de ligando de PSMA es 131I-MIP-1095.

La estructura química de 123I-MIP-1072 (es decir, ácido 123I-(S)-2-(3-((S)-1-carboxi-5-(4-yodobencilamino)pentil)ureido)pentanodioico) es:

El ligando de molécula pequeña de un conjugado de ligando de PSMA puede ser una molécula de GL2 como se describe en la publicación internacional N° WO2010/005723. Cualquiera de los ligandos de molécula pequeña proporcionados en el presente documento, que incluyen una molécula GL2, se puede conjugar con un agente terapéutico a modo de una nanopartícula (por ejemplo, nanopartículas basadas en polímero basadas en lípido y/o basadas en ácido nucleico). La nanopartícula puede contener el agente terapéutico. Así, el conjugado de ligando de PSMA puede comprender un ligando de molécula pequeña conjugado con una nanopartícula que contiene un agente antineoplásico o citotóxico. Los ejemplos de dichos conjugados de ligando de PSMA incluyen, sin limitación, BIND-014 (Bind Biosciences, Inc.) descrito en la publicación internacional N° WO2010/005723.

Los ligandos de molécula pequeña de PSMA se pueden seleccionar del grupo que consiste en los compuestos I, II, III y IV:

y enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, diaestereómeros, o racematos de los mismos; en donde m y n son cada uno, independientemente, 0, 1, 2 o 3; p es 0 o 1; R1, R2, R4 y R5 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste en alquilo sustituido o sin sustituir, arilo sustituido o sin sustituir, y cualquier combinación de los mismos; y R3 es H o CH3; en donde R1, R2, R4 o R5 comprenden un punto de unión covalente a la nanopartícula. Por ejemplo, R1, R2, R4 y R5 puede ser cada uno, independientemente, alquilo CÍ^1-6o fenilo, o cualquier combinación de alquilo Ci^1-6o fenilo, que se sustituyen independientemente una o más veces con OH, SH, NH2, o CO2H, y en donde el grupo alquilo se puede interrumpir por N(H), S u O. En algunos casos, por ejemplo, R1, R2, R4 y r 5 son cada uno, independientemente, CH²-Ph, (CH²)²-s H, CH²-SH, (CH²)²C(H)(NH²)CO²H, CH²C(H)(NH²)CO²H, CH(NH²)CH²CO²H, (CH²)²C(H)(SH)CO²H, CH²-N(H)-Ph, O-CH²-Ph, o O-(CH²)²-Ph, en donde cada Ph se puede sustituir independientemente una o más veces con OH, NH², CO²H o SH.

Se pueden seleccionar ligandos de molécula pequeña de PSMA del grupo que consiste en:

y enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, diaestereómeros, o racematos de los mismos; y en donde los grupos NH², OH o SH sirven de punto de unión covalente, o se pueden seleccionar del grupo que consiste en

y enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, diaestereómeros, o racematos de los mismos; en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste en NH², SH, OH, CO²H, alquilo Ci_6 que está sustituido con NH², SH, OH o CO²H, y fenilo que está sustituido con NH², SH, OH o CO²H, y en donde R sirve de punto de unión covalente.

Se pueden seleccionar los ligandos de molécula pequeña de PSMA del grupo que consiste en:

y enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, diaestereómeros o racematos de los mismos; cualquiera de los cuales se puede sustituir adicionalmente con NH2, SH, OH, CO2H, alquilo Ci^1-6que está sustituido con NH², SH, OH o CO²H o fenilo que está sustituido con NH², SH, OH o CO²H, en donde estos grupos funcionales sirven de punto de unión covalente. Por ejemplo, un ligando de PSMA de bajo peso molecular puede ser

y enantiómeros, estereoisómeros, rotámeros, tautómeros, diaestereómeros o racematos de los mismos; en donde los grupos NH²sirven de punto de unión covalente. La unión puede ser a un conector, polímero, partícula, etc.

En algunas realizaciones, el ligando de molécula pequeña de PSMA que comprende una molécula que es o imita un sustrato que se une al sitio enzimático en PSMA incluye ácido 2-[3-(1,3-dicarboxipropil)ureido]pentanodioico (DUPA). En algunas realizaciones, dichos ligandos de molécula pequeña se conjugan con un agente quimioterapéutico, tal como hidrazida de tubulisina (TubH). La síntesis y los usos de un ejemplo de dicho conjugado de ligando de PSMA (EC1069) se describen en Kularatne, SA et al J Med Chem 2010, 53, 7767-7777; Kularatne, SA et al Mol Pharmaceutics Vol 6, no 3, 780-789, 2009. EC1719 es otro ejemplo de un conjugado de ligando de PSMA que incluye TubH. EC1069 y EC1719 pueden dirigir el fármaco de quimioterapia a receptores de PSMA expresados en células de cáncer de próstata (endocito). Otros análogos de EC1069 y EC1719 que se unen a DUPA y TubH también pueden dirigirse a los receptores de PSMA expresados en células de cáncer de próstata. Así, también se contemplan en el presente documento análogos de EC1069 y análogos de EC1719. Los términos "EC 1069" y "EC1719" engloban, por tanto, EC 1069, EC1719 y sus análogos. Los conectores de los análogos pueden ser péptidos con D-amino-ácido(s), o péptidos unidos con restos de azúcar, amidas o ésteres. Un ejemplo de un conector es, por tanto, D-Y-Glu D-Asp-D-Phe-D-Cys (FIG. 9). Se pueden proporcionar otros conectores como se proporciona en el presente documento.

La conjugación de uno o más agentes terapéuticos a un ligando de PSMA puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada, unión electrostática y complejación. La conjugación también puede incluir encapsulación y pretende referirse a cualquier mecanismo por el que un componente se puede asociar a otro componente. La conjugación puede ser conjugación directa del agente terapéutico al ligando de PSMA o puede ser indirecta, tal como por un conector, polímero, partícula etc., y es el conector, polímero, partícula, etc., al que se une el agente terapéutico.

Se puede lograr la unión covalente por condensación directa de cadenas laterales existentes o por la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes bivalentes o polivalentes son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas a otras proteínas, péptidos o funciones amina, etc. Por ejemplo, la bibliografía está repleta con agentes de acoplamiento tales como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldehído, diazobencenos y hexametilendiaminas. La lista no pretende ser exhaustiva de los diversos agentes de acoplamiento conocidos en la técnica sino que, más bien, es a modo de ejemplo de los agentes de acoplamiento más comunes.

Si el ligando de PSMA es un anticuerpo, se contempla que el anticuerpo se pueda obtener primero, y entonces el agente terapéutico se puede unir al producto obtenido. Los agentes de reticulación adecuados para su uso de este modo incluyen, por ejemplo, SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), y SMPT, 4-succinimidil-oxicarbonilmetil-(2-piridilditio)tolueno.

Donde el agente es una toxina de proteína, se puede fusionar con el ligando de PSMA por métodos genéticos para formar una proteína de fusión de inmunotoxina híbrida. Las proteínas de fusión pueden incluir secuencias de péptidos adicionales, tales como espaciadores de péptido que se unen operativamente, por ejemplo, el ligando de PSMA y toxina, en tanto que dichas secuencias adicionales no afecten apreciablemente las actividades de direccionamiento o de toxina de la proteína de fusión. Las proteínas se pueden unir por un conector peptídico o espaciador, tal como un péptido espaciador de glicina-serina, o un péptido bisagra, como se conoce bien en la técnica. Así, por ejemplo, si el ligando de PSMA es un anticuerpo contra PSMA, el extremo C de anticuerpo contra PSMA se puede fusionar con el extremo N de la molécula de toxina de toxina para formar una inmunotoxina que retiene las propiedades de unión del anticuerpo contra PSMA. Otras disposiciones de fusión serán conocidas para un experto habitual en la técnica. Para expresar la inmunotoxina de fusión, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se inserta en un vector de expresión según métodos convencionales, para la expresión estable de la proteína de fusión, tal como en células de mamífero, tales como células CHO. La proteína de fusión se puede aislar y purificar de las células o sobrenadante de cultivo usando metodología estándar, tal como una columna de afinidad por PSMA.

Los ejemplos de agentes antineoplásicos para su uso como se proporciona en el presente documento incluyen, sin limitación, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos y agentes que actúan sobre la neovasculatura del tumor. Los agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, radionúclidos citotóxicos, toxinas químicas y toxinas de proteína. Los radionúclidos citotóxicos o isótopos radioterapéuticos incluyen isótopos emisores de alfa tales como, por ejemplo, 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra, 223Ra. Los radionúclidos citotóxicos o isótopos radioterapéuticos incluyen isótopos emisores de beta tales como, por ejemplo, 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 64Cu, 153Sm, 166Ho. En algunos casos, los radionúclidos citotóxicos pueden emitir electrones de Auger y/o de baja energía e incluyen los isótopos 123I, 124I, 125I, 131I, 75Br, 77Br y 18F.

Los radionúclidos normalmente se acoplan a un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo por quelación. Por ejemplo, en el caso de radionúclidos metálicos, se una un quelante bifuncional para unir comúnmente el isótopo al anticuerpo u otra proteína de interés. Normalmente, el quelante se une primero al anticuerpo, y el conjugado de quelante-anticuerpo se pone en contacto con el radioisótopo metálico. Se han desarrollado varios quelantes bifuncionales para este fin, que incluyen la serie de de aminoácidos del ácido dietilentriaminapentaacético (DTPA) descrita en las patentes de EE. UU. 5.124.471,5.286.850 y 5.434.287. Como otro ejemplo, en la patente de EE. UU.

5.756.825 se describen agentes quelantes bifuncionales basados en ácido hidroxámico. Otro ejemplo es el agente quelante denominado p-SCN-Bz-HEHA (ácido 1,4,7,10,13,16-hexaazaciclo-octadecano-N,N',N",N'",N'"',N.. -hexaacético) (Deal et al., J. Med. Chem. 42:2988, 1999), que es un quelante de radiometales eficaz tal como 225Ac. Otro ejemplo más es DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N",N'"-tetraacético), que es un agente quelante bifuncional (véase McDevitt et al., Science 294:1537-1540, 2001) que se puede usar en un método de dos etapas para marcado seguido por conjugación.

Las toxinas químicas o agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no se limitan a, miembros de la familia de moléculas de enediína, tales como caliqueamicina y esperamicina. Las toxinas químicas o agentes quimioterapéuticos también pueden incluir dímeros de pirrolobenzodiacepina (PBD) (por ejemplo, SJG-136, SG2000, SG2202, SG2285 como se describe en Hartley JA et al., Cancer Res. 2010, 70(17):6849-58), caliqueamicinas, colchicina, ispinesib (un novedoso inhibidor de molécula pequeña de proteína del huso de quinesina), combrestatina (por ejemplo, combrestatina A4), derivados de maitansina tales como maitansinoide DM4 (N2'-deacetil-N2'-(4-mercapto-4-metil-1-oxopentil)maitansina) y maitansinoide DM1 (mertansina), metotrexato, doxorrubicina, melfalán, clorambucilo, ARA-C, vindesina, mitomicina C, cis-platino, etopósido, bleomicina y/o 5-fluorouracilo. Otros agentes antineoplásicos incluyen dolastatinas (patentes de EE. UU. N° 6.034.065 y 6.239.104) y derivados de los mismos. Dolastatinas y derivados de los mismos incluyen dolastatina 10 (dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproína-dolafenina) y los derivados auristatina PHE (dolavalinavalina-dolaisoleuina-dolaproína-fenilalanina-éster metílico) (Pettit, G.R. et al., Anticancer Drug Des. 13(4):243-277, 1998; Woyke, T. et al., Antimicrob. Agents Chemother. 45(12):3580-3584, 2001), aurastatina E (por ejemplo, monometilauristatina norefedrina), aurastatina F (por ejemplo, monometilauristatina fenilalanina) y similares. Las toxinas también incluyen lectinas venenosas, toxinas de planta tales como ricina, abrina, modecina, botulina y toxinas diftéricas. Los expertos en la técnica conocen otros agentes quimioterapéuticos y se pueden usar como se proporciona en el presente documento.

Los agentes que actúan sobre la vasculatura tumoral incluyen, pero no se limitan a, agentes de unión a tubulina (por ejemplo, agentes antitubulina) tales como tubulisina y derivados de la misma (Kaur et al., Biochem J. 396(Pt 2):235-242, 2006), combrestatina A4 (Griggs et al., Lancet Oncol. 2:82, 2001), angiostatina y endostatina (revisado en Rosen, Oncologist 5:20, 2000) y proteína 10 inducible por interferón (patente de EE. UU. N° 5.994.292). También se contemplan varios otros agentes antiangiogénicos e incluyen: 2ME2, angiostatina, angiozima, anti-VEGF RhuMAb, Apra (Ct -2584), avicina, benefina, BMS275291, carboxiamidotriazol, CC4047, CC5013, CC7085, CDC801, CGP-41251 (PKC 412), CM101, profármaco de combretastatina A-4, Em D 121974, endostatina, flavopiridol, genisteína (GCP), IM-862, ImmTher, interferón alfa, interleucina-12, gefitinib (ZD1839), marimastat, metastat (Col-3), neovastat, octreotida, paclitaxel, penicilamina, fotofrina, fotopoint, PI-88, prinomastat (Ag -3340), PTK787 (ZK22584), RO317453, solimastat, escualamina, SU 101, SU 5416, SU-6668, suradista (FCE 26644), suramin (metaret), tetratiomolibdato, talidomida, TNP-470 y vitaxina. Se describen agentes antiangiogénicos adicionales por Kerbel, J. Clin. Oncol.

19(18s):45s-51s, 2001. Dichos agentes se contemplan para su uso en los conjugados de ligando de PSMA proporcionados en el presente documento.

Un conjugado de ligando de PSMA puede ser a conjugado de anticuerpo contra PSMA-fármaco. Los ejemplos no limitantes de conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco se describen en los documentos de patente US-2007-0160617-A1 y US-2011-0250216-A. Un conjugado de anticuerpo contra PSMA-fármaco puede comprender un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a PSMA y está conjugado con un derivado de dolastatina 10, en particular auristatinas tales como, MMAE (también denominado en el presente documento monometilauristatina E o monometilauristatina norefedrina) o MMAF (también denominado en el presente documento monometilauristatina F o monometilauristatina fenilalanina).

El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo se puede conjugar con MMAE o MMAF con un compuesto de la siguiente fórmula (Fórmula 1): -An-Ym-Zm-Xn-Wn-, en donde A es una unidad de acilo carboxílico; Y es un aminoácido; Z es un aminoácido; X y W son cada uno un espaciador auto-inmolativo; n es un número entero de 0 o 1; y m es un número entero de 0 o 1, 2, 3, 4, 5 o 6. El ADC se puede representar por la fórmula (Fórmula 2): L-{An-Ym-Zm-Xn-Wn-D}p en donde L es un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo que se une a PSMA, D es MMAE o MMAF y p es un número entero de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8. Los otros componentes son como se han descrito anteriormente. La unidad carboxílica "An" se puede unir al anticuerpo o fragmento de unión al antígeno por un átomo de azufre derivado del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno:

En un caso A puede ser

en la que q es 1-10. Por tanto, el conjugado puede ser:

en donde L, Y, Z, X, W, D, n, m, q y p son como se definieron previamente.

En otro caso, A puede ser 4-(N-succinimidometil)ciclohexano-1-carbonilo, m-succinimidobenzoílo, 4-(psuccinimidofenil)-butirilo, 4-(2-acetamido)benzoílo, 3-tiopropionilo, 4-(1-tioetil)-benzoílo, 6-(3-tiopropionilamido)-hexanoílo maleimida caproílo. En un caso adicional, A puede ser maleimida caproílo. Los ejemplos representativos de diversas unidades de acilo carboxílico y métodos para su síntesis y unión se describen en la patente de EE. UU. N° 6.214.345.

En otro caso, Y puede ser alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptófano o prolina. En otro caso más, Y puede ser valina. En un caso adicional, Z puede ser lisina, lisina protegida con acetilo o formilo, arginina, arginina protegida con grupos tosilo o nitro, histidina, ornitina, ornitina protegida con acetilo o formilo, o citrulina. En todavía un caso adicional, Z puede ser citrulina. En un caso, Ym-Zm puede ser valina-citrulina. En otro caso, Ym-Zm puede ser una secuencia de proteínas que es selectivamente escindible por una proteasa.

En un caso adicional, X puede ser un compuesto que tiene la fórmula

en la que T es O, N, o S. En otro caso, X puede ser un compuesto que tiene la fórmula -HN-R1-COT en la que R1 es alquilo C¹-C⁵, T es O, N o S. En un caso adicional, X puede ser un compuesto que tiene la fórmula

en la que T es O, N, o S, R2 es H o alquilo C¹-C⁵. En un caso, X puede ser p-aminobencilcarbamoiloxi. En otro caso, X puede ser alcohol p-aminobencílico. En un adicional caso, X puede ser p-aminobencilcarbamato. En aún un caso adicional, X puede ser p-aminobenciloxicarbonilo. En otro caso, X puede ser ácido Y-aminobutírico; ácido a ,a -dimetil Y-aminobutírico o ácido p ,p-dimetil Y-aminobutírico.

En algunos casos, W puede ser

en la que T es O, S o N.

En un caso, el compuesto de la fórmula 1 puede ser maleimidocaproilo. Se ha usado el maleimidocaproílo para la conjugación de dos auristatinas específicas con un mAb anti-CD30 (AC10) (Doronina, Svetlana et al. "Novel Linkers for Monoclonal Antibody-Mediated Delivery of Anticancer Agents", a Ac R, Anaheim, c A, Resumen N° 1421, 16-20 de abril de 2005). El maleimidocaproílo reacciona con grupos tiol para formar un tioéter.

Se pueden conjugar MMAE o MMAF con un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo usando métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica (por ejemplo, véase, Niemeyer, CM, Bioconjugation Protocols, Strategies and Methods, Humana Press, 2004) o como se describe en el presente documento. Se puede conjugar más de una molécula de MMAE o MMAF con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Se pueden conjugar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 moléculas de MMAE o MMAF con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Se pueden conjugar al menos 2, 3, 4 o 5 moléculas de MMAE o MMAF con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo. Se pueden conjugar 2, 3, 4 o 5 moléculas de MMAE o MMAF con el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo.

El conjugado de ligando de PSMA puede ser anticuerpo contra PSMA (o fragmento de unión al antígeno del mismo)-maleimida caproílo-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatina norefedrina, anticuerpo contra PSMA (o fragmento de unión al antígeno del mismo)-maleimida caproílo-valina-citrulina-p-aminobencilcarbamatomonometilauristatina norefedrina, anticuerpo contra PSMA (o fragmento de unión al antígeno del mismo)-maleimida caproílo-monometilauristatina norefedrina, anticuerpo contra PSMA (o fragmento de unión al antígeno del mismo)-maleimida caproílo-valina-citrulina-p-aminobenciloxicarbonil-monometilauristatina fenilalanina, anticuerpo contra PSMA (o fragmento de unión al antígeno del mismo)-maleimida caproílo-valina-citrulina-p-aminobencilcarbamatomonometilauristatina fenilalanina o anticuerpo contra PSMA (o fragmento de unión al antígeno del mismo)-maleimida caproílo-monometilauristatina fenilalanina. En cualquiera de los anteriores, el anticuerpo contra PSMA o fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno proporcionados en el presente documento.

Se ha encontrado que los conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco, por ejemplo, tienen niveles de selectividad particularmente altos cuando se compara la destrucción de células que no expresan PSMA con la destrucción de células que expresan PSMA. Por tanto, los conjugados de anticuerpo contra PSMA-MMAE o anticuerpo contra PSMA-MMAF puede tener una selectividad por célula PC-3™ con respecto a C4-2 célula o célula LNCaP™ de al menos 250. La selectividad puede ser al menos 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2250, 2500, 2750, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 17500, 20000 o más. La selectividad puede ser entre 250-500, 500-750, 750-1000, 1000-2000, 2000-5000, 5000-10000, 10000-15000 o 15000-20000. "Selectividad", como se define en el presente documento, se refiere a la relación de valores de CI⁵⁰de un conjugado de anticuerpo contra PSMA-MMAE o anticuerpo contra PSMA-MMAF conjugado en células PC-3™ (células que no expresan PSMA) con respecto a células C4-2 o LNCaP™ (células que expresan PSMA).

Los conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco pueden mediar en la destrucción específica de células que expresan PSMA a concentraciones muy bajas, tales como a concentraciones picomolares o casi picomolares. Los conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco pueden presentar CI⁵⁰a concentraciones inferiores a aproximadamente 1 X 10-10 M, inferiores a aproximadamente 1 X 10-11 M, o inferiores a aproximadamente 1 X 10-12M. Se puede lograr una CI⁵⁰a una concentración inferior a aproximadamente 1,5 X 10-11 M. Los conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco pueden presentar CI⁵⁰de entre 10-210, 40-210, 60-210 o 65-210 picomoles (pM). Los conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco pueden presentar CI⁵⁰de aproximadamente 10, 40, 60 u 80 pM. Los conjugados de anticuerpo contra PSMA-fármaco pueden presentar CI⁵⁰de aproximadamente 11,42, 60 u 83 pM.

Se puede determinar el nivel de destrucción celular por cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento o conocidos de otro modo para los expertos habituales en la técnica.

Un "antiandrógeno", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente que bloquea (por ejemplo, inhibe) la acción de hormonas andrógenas y moléculas reguladas por andrógeno. Se considera en el presente documento que los antagonistas de receptores adrenérgicos son antiandrógenos. El término "antiandrógeno" incluye antiandrógenos, análogos de antiandrógenos y derivados de antiandrógenos. En cáncer de próstata, los antiandrógenos bloquean la actividad de la testosterona, que normalmente ralentiza el crecimiento de cáncer de próstata. En algunas realizaciones, un antiandrógeno bloquea la enzima citocromo P450 17A1, codificada por el gen CYP17A. Los antiandrógenos pueden ser esteroideos o no esteroideos (también denominados "puros"). Los ejemplos de antiandrógenos para su uso como se proporciona en el presente documento incluyen, sin limitación, abiraterona (ZYTIGA®), enzalutamida (XTANDI®), nilutamida (NILANDRON®), flutamida (EULEXIN®), bicalutamida (CASODEX®), orteronel (TAK-700, Tokai Pharmaceuticals, Inc.), antiandrógenos potentes tales como, por ejemplo, enzalutamida, abiraterona, ARN 509 (Aragon Pharmaceuticals, Inc.) y galeterona (TOK-001 o VN/124-1, Tokai Pharmaceuticals, Inc.), que normalmente se usan en cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración y que afectan la expresión de un hospedador de moléculas reguladas por andrógeno, tales como la expresión de PSMA.

Antiandrógenos "potentes", o antiandrógenos de "segunda generación" en el presente documento incluyen antiandrógenos que retienen la actividad en un entorno celular de elevada expresión de receptor de andrógenos con respecto a expresión no mutante. Los antiandrógenos potentes incluyen los que son activos en sujetos con cáncer de próstata resistente a la castración. Los antiandrógenos potentes también incluyen antiandrógenos que se unen al receptor de andrógenos con mayor afinidad relativa que los antiandrógenos comunes clínicamente usados (por ejemplo, bicalutamida, nilutamida, flutamida). Los ejemplos de antiandrógenos potentes incluyen, sin limitación, enzalutamida, abiraterona, ARN-509, galeterona y diariltiohidantoínas RD162 y MDV310, 3-beta-hidroxiandrosta-5,16-dieno (HAD) y androsta-1,4-dieno-3,17-diona-17-etilencetal (OAK) (Miyamoto H et al., Int J Cancer 2005, 117(5) :866-72). La abiraterona, por ejemplo, inhibe la enzima CYP17A1. La enzalutamida, como otro ejemplo, es un antagonista de los receptores de andrógeno. Como otro ejemplo más, la galeterona es un inhibidor selectivo de CYP17 y un antagonista de receptores de andrógeno. Los métodos que se pueden usar para identificar antiandrógenos potentes se describen, por ejemplo, por Tran C et al., Science, 2009 324(5928):787-90. Se puede usar cualquiera de los antiandrógenos descritos en el presente documento en cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento.

El compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA también puede ser un inhibidor de mTOR. Los ejemplos de inhibidores de mTOR para su uso como se proporciona en el presente documento incluyen, sin limitación, rapamicina, everolimus (AFINITOR®, ZORTRESS®) y temsirolimus (TORISEL®). El término "inhibidor de mTOR" incluye inhibidores de mTOR, análogos de inhibidores de mTOR y derivados de inhibidores de mTOR.

En el presente documento también se proporcionan composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, que comprenden un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, un conjugado de ligando de PSMA, o una combinación de los dos. Como se describe en el presente documento, se puede administrar una composición a un sujeto (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano). Como se describe en el presente documento, se puede administrar una composición que comprende un conjugado de ligando de PSMA a un sujeto y se puede administrar por separado otra composición que comprende un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA al sujeto, ya sea una detrás de la otra o simultáneamente. Alternativamente, como se describe en el presente documento, se puede administrar a un sujeto una composición que comprende tanto un conjugado de ligando de PSMA como un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA.

Como se describe en el presente documento, primero se puede administrar a un sujeto una composición que comprende un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, y luego se puede administrar al sujeto inmediatamente después una composición que comprende un conjugado de ligando de PSMA, en el plazo de una hora, en el plazo de un par de horas, en el plazo de un día, en el plazo de 2 días, en el plazo de 3 días, en el plazo de 4 días, en 5 días, en el plazo de 6 días, o en el plazo de semana o más. Cualquier composición se puede administrar una vez o más de una vez (por ejemplo, dos veces, tres veces, etc.).

Como se usa en el presente documento, "un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA" se refiere a un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA en al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15 %, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40 %, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 100 %, al menos 125 %, al menos 150 %, al menos 175 %, al menos 200 % o más, con respecto a la expresión superficial de células normales de una célula que expresa PSMA o con respecto a la expresión de la superficie celular en ausencia de dicho compuesto. Por ejemplo, un antiandrógeno puede aumentar, en algunas realizaciones, aumentar la expresión de la superficie celular de PSMA en células cancerosas en al menos 20 %, o más.

Una composición, en algunas realizaciones, incluye un vehículo, excipiente o estabilizador fisiológicamente o farmacéuticamente aceptable combinado con un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA y/o un conjugado de ligando de PSMA. Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable" incluye todos y cada uno de sales, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, que son fisiológicamente compatibles. Un "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a una o más cargas sólidas o líquidas compatibles, diluyentes o sustancias de encapsulación que son adecuados para administración en un humano. El término "vehículo" indica un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la administración. Un vehículo puede ser adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, por inyección o infusión).

Como se describe en el presente documento, se puede administrar una composición a un sujeto en cantidades farmacéuticamente aceptables y en composiciones farmacéuticamente aceptables. El término "farmacéuticamente aceptable" significa un material no tóxico que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica de los principios activos (por ejemplo, ligandos de PSMA, agentes antineoplásicos, agentes citotóxicos, antiandrógenos, inhibidores de mTOR). Dichas composiciones pueden contener sales, agentes de tamponamiento, conservantes, vehículos compatibles y opcionalmente otros agentes terapéuticos, tales como agentes inmunopotenciadores suplementarios que incluyen adyuvantes, quimiocinas y citocinas. Cuando se usan en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero se pueden usar convenientemente sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas y no se excluyen.

Una sal retiene la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confiere efectos toxicológicos no deseados (véase, por ejemplo, Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Los ejemplos de dichas sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono- y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de base incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener agentes de tamponamiento adecuados, que incluyen: ácido acético en una sal; ácido cítrico en una sal; ácido bórico en una sal; y ácido fosfórico en una sal.

En algunas realizaciones, una composición puede contener conservantes adecuados, tales como: cloruro de benzalconio; clorobutanol; parabenos y/o timerosal.

En algunas realizaciones, una composición se puede presentar convenientemente en forma farmacéutica unitaria y se puede preparar por cualquiera de los métodos muy conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner el (los) compuesto(s) activo(s) (por ejemplo, ligando de PSMA, agente antineoplásico, agente citotóxico y/o compuesto que regula por incremento expresión de la superficie celular de PSMA) en asociación con un vehículo que constituye uno o más componentes accesorios. En algunas realizaciones, las composiciones se preparan poniendo uniforme e íntimamente el compuesto activo en asociación con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto.

Las composiciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación estéril acuosa o no acuosa de conjugados de ligando de PSMA y/o compuestos que aumentan la expresión de la superficie celular de PSMA (por ejemplo, antiandrógenos, inhibidores de mTOR), que preferentemente es isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación se puede formular según métodos conocidos usando dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente aceptable no tóxico por vía parenteral, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear están agua, disolución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico. Además, convencionalmente se emplean aceites no volátiles estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este se puede emplear cualquier aceite no volátil suave que incluye mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, se pueden usar ácidos grasos tales como ácido oleico en la preparación de inyectables. Las formulaciones de vehículo adecuadas para administración oral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, etc., se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. Cualquiera de las composiciones proporcionadas en el presente documento puede ser estéril.

Los compuestos activos (por ejemplo, ligando de PSMA, agente antineoplásico, agente citotóxico y/o compuesto que regula por incremento la expresión de la superficie celular de PSMA) se pueden preparar con vehículos que protegerán el compuesto contra la rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulada. Se pueden usar polímeros biocompatibles biodegradables, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o, en general, son conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Como se describe en el presente documento, se puede administrar una composición por cualquier vía convencional, que incluye inyección o por infusión gradual con el tiempo. La administración puede ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavitaria, intratumoral o transdérmica. Cuando las composiciones se usan terapéuticamente, las vías de administración preferidas incluyen intravenosa y por aerosol pulmonar. Los expertos en la técnica conocen bien las técnicas para preparar sistemas de administración por aerosol que contienen anticuerpos. En general, dichos sistemas deben utilizar componentes que no alterarán significativamente las propiedades biológicas de los anticuerpos, tales como la capacidad de unión al paratope (véase, por ejemplo, Sciarra y Cutie, "Aerosols," en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18a edición, 1990, pp. 1694-1712). Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los diversos parámetros y condiciones para producir aerosoles de anticuerpo sin recurrir a excesiva experimentación.

Como se describe en el presente documento, las composiciones como se proporcionan en el presente documento se pueden administrar en cantidades eficaces. Una "cantidad eficaz" es aquella cantidad de un compuesto activo (por ejemplo, conjugado de ligando de PSMA y/o compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA) que solo, o junto con dosis adicionales, produce la respuesta deseada, por ejemplo, inhibe la proliferación celular de células que expresan PSMA y/o destruye las células que expresan PSMA. Para el cáncer, esto puede implicar solo ralentizar la progresión de un cancer, por ejemplo, temporalmente, aunque más preferentemente, implica detener la progresión del cáncer permanentemente. Esto se puede monitorizar por métodos rutinarios. La respuesta deseada al tratamiento de cancer u otra enfermedad o afección también puede retrasar la aparición o incluso prevenir la aparición del cáncer u otra enfermedad o afección.

Dichas cantidades eficaces dependerán, por supuesto, de la afección particular que está tratándose (por ejemplo, cáncer que expresa PSMA), la intensidad de la afección, los parámetros del paciente individual que incluyen edad, estado físico, tamaño y peso, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia simultánea (si la hay), la vía de administración específica y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del profesional sanitario. Estos factores se conocen bien por los expertos habituales en la técnica y pueden ser tratados sin más que experimentación elemental. En general, se prefiere usar una dosis máxima de los componentes individuales o combinaciones de los mismos, es decir, la dosis segura más alta según el criterio médico sensato. Se entenderá por los expertos habituales en la técnica, sin embargo, que un paciente/sujeto puede insistir en una dosis más baja o dosis tolerable por motivos médicos, motivos psicológicos o por prácticamente cualquier otro motivo.

Las composiciones como se proporcionan en el presente documento, en algunas realizaciones, son estériles y contienen una cantidad eficaz de conjugados de ligando de PSMA y/o compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, etc., para producir la respuesta deseada en una unidad de peso o volumen adecuada para administración a un paciente/sujeto. La respuesta se puede medir, por ejemplo, determinando los efectos fisiológicos de la composición, tales como la regresión de un tumor o la disminución de los síntomas de la enfermedad. Un experto habitual en la técnica conocerá otros ensayos y se pueden emplear para medir el nivel de la respuesta.

Las dosis de composiciones administradas a un sujeto se pueden elegir según diferentes parámetros, en particular según el modo de administración usado y el estado del sujeto. Otros factores incluyen el periodo de tratamiento deseado. En el supuesto caso de que una respuesta en un sujeto sea insuficiente a las dosis iniciales aplicadas, se podrán emplear dosis más altas (o dosis eficazmente más altas por una vía de administración diferente, más localizada) en la medida que lo permita la tolerancia del paciente.

El efecto sinérgico proporcionado por diversas combinaciones de conjugados de ligando de PSMA con compuestos proporcionados en el presente documento, tales como antiandrógenos o inhibidores de mTOR, puede dar como resultado dosis eficaces que son inferiores a las dosis requeridas para la eficacia cuando se usa individualmente cualquier componente de la combinación. La ventaja añadida de un efecto reductor de la dosis puede tener el beneficio añadido de un perfil de seguridad más amplio, es decir, menos efectos secundarios adversos.

Por ejemplo, las dosis de conjugado de ligando de PSMA y/o compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA puede variar desde aproximadamente 10 pg/kg hasta aproximadamente 100.000 pg/kg. Basándose en la composición, la dosis se puede administrar continuamente, tal como por bomba continua, o en intervalos periódicos. Un experto en la técnica puede determinar intervalos de tiempo deseados de dosis múltiples de una composición particular sin excesiva experimentación. Un experto habitual en la técnica conocerá otros protocolos para la administración de composiciones, en los que la cantidad de dosis, programa de administración, sitios de administración, modo de administración y similares varían de lo anterior.

Como se describe en el presente documento, la dosis de conjugado de ligando de PSMA se puede administrar por vía intravenosa. En dichos casos, la dosis de conjugado de ligando de PSMA puede ser aproximadamente 1,0 mg/kg a 2,5 mg/kg. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis de conjugado de ligando de PSMA administrada por vía intravenosa puede ser 1,0 mg/kg, 1,1 mg/kg, 1,2 mg/kg, 1,3 mg/kg, 1,4 mg/kg, 1,5 mg/kg, 1,6 mg/kg, 1,7 mg/kg, 1,8 mg/kg, 1,9 mg/kg, 2,0 mg/kg, 2,1 mg/kg, 2,2 mg/kg, 2,3 mg/kg, 2,4 mg/kg o 2,5 mg/kg. En algunos casos, la dosis de conjugado de ligando de PSMA administrado por vía intravenosa puede ser aproximadamente 1,0 mg/kg a 2,3 mg/kg. En un caso, el conjugado de ligando de PSMA es un ADC de PSMA, y el ADC de PSMA se proporciona en una dosis de aproximadamente 1,8 mg/kg a 2,3 mg/kg.

Puede variar la longitud de tiempo durante la que se administra un conjugado de ligando de PSMA administrado por vía intravenosa. En algunos casos, un conjugado de ligando de PSMA se puede administrar por vía intravenosa durante 30 minutos, 35 minutos, 40 minutos, 45 minutos, 50 minutos, 55 minutos, 60 minutos, 65 minutos, 70 minutos, 75 minutos, 80 minutos, 85 minutos o 90 minutos.

En algunos casos, un conjugado de ligando de PSMA se puede administrar por vía intravenosa en intervalos repetidos, tales como, por ejemplo, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, o una vez cada tres semanas durante hasta un total de cuatro, seis u ocho dosis. En algunos casos, el conjugado de ligando de PSMA se puede administrar por vía intravenosa dos veces a la semana, o más.

En algunos casos, un conjugado de ligando de PSMA se puede administrar por vía intravenosa durante aproximadamente 60 minutos una vez cada tres semanas a una dosis de aproximadamente 1,0 mg/kg a 2,3 mg/kg durante hasta un total de ocho dosis.

En algunos casos, un compuesto como se proporciona en el presente documento, tal como un antiandrógeno, se puede administrar en forma de cápsulas orales. En dichos casos, la dosis de dicho compuesto puede ser aproximadamente 40 mg a aproximadamente 160 mg (por ejemplo, 20 mg o 40 mg por cápsula). Por ejemplo, en algunos casos, la dosis de dicho compuesto administrado por vía oral puede ser 40 mg, 60 mg, 80 mg, 100 mg, 120 mg, 140 mg o 160 mg. En algunos casos, la dosis oral de dicho compuesto se puede administrar una vez al día, o dos veces al día, durante aproximadamente 21 a aproximadamente 28 días. En algunos casos, la dosis de dicho compuesto puede ser 80 mg (por ejemplo, 2 cápsulas orales, 40 mg cada una) a 160 mg (por ejemplo, 4 cápsulas orales, 40 mg cada una) y se puede administrar una vez al día (1D) durante 28 días. En algunos casos, dicho compuesto puede ser enzulatamida, a una dosis de 80 mg (por ejemplo, 2 cápsulas orales, 40 mg cada una) a 160 mg (por ejemplo, 4 cápsulas orales, 40 mg cada una) y se puede administrar una vez al día (1D) durante 28 días.

En algunos casos, la dosis oral de un compuesto como se proporciona en el presente documento, tal como un antiandrógeno, puede ser aproximadamente 500 mg a aproximadamente 1000 mg. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis de dicho compuesto administrado por vía oral puede ser 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 950 mg o 1000 mg. En algunos casos, la dosis oral de dicho compuesto se puede administrar una vez al día, o dos veces al día, durante aproximadamente 21 a aproximadamente 28 días. En algunos casos, la dosis de dicho compuesto puede ser 500 mg a 1000 y se puede administrar una vez al día (1D) durante 28 días. En algunos casos, dicho compuesto puede ser abiraterona o acetato de abiraterona, a una dosis de 500 mg a 1000 mg, y se puede administrar una vez al día (1D) durante 28 días.

En algunos casos, un inhibidor de mTOR se puede administrar en una dosis I.V. de aproximadamente 5 a 25 mg en intervalos semanales. En otro caso, el inhibidor de mTOR se puede administrar en una dosis I.V. de 5 a 10 mg en intervalos semanales. En un caso, el inhibidor de mTOR puede ser temsirolimus (Toresal®) administrado a 25 mg I.V. durante 30 a 60 minutos en intervalos semanales.

En general, las dosis de radionúclidos administradas por un conjugado de ligando de PSMA proporcionado en el presente documento pueden variar desde aproximadamente 0,01 mCi/Kg hasta aproximadamente 10 mCi/kg. En algunos casos, la dosis de radionúclido puede variar desde aproximadamente 0,1 mCi/Kg hasta aproximadamente 1,0 mCi/kg. En un caso, el conjugado de ligando de PSMA puede ser 131I-MIP-1095 proporcionado en una dosis I.V. de aproximadamente 1 a 10 GBq. En otros casos, 131I-MIP-1095 se puede proporcionar en un intervalo de dosis de 2 a 8 GBq. En otros casos más, la dosis media puede ser aproximadamente 5 GBq. La dosis óptima de un isótopo administrado se puede determinar empíricamente por experimentos de valoración rutinaria simple bien conocidos para un experto habitual en la técnica.

La administración de las composiciones proporcionadas en el presente documento a mamíferos distintos de seres humanos, por ejemplo, para fines de ensayo o fines terapéuticos veterinarios, se lleva a cabo en sustancialmente las mismas condiciones que se ha descrito anteriormente.

Las composiciones (por ejemplo, que comprenden conjugado de ligando de PSMA y/o compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA) como se proporciona en el presente documento tienen utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estos compuestos se pueden administrar a células en cultivo, por ejemplo, in vitro o ex vivo, o en un sujeto, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir o diagnosticar cáncer u otra enfermedad o afección. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" pretende incluir seres humanos y animales no humanos. Los sujetos preferidos incluyen un paciente humano que tiene un trastorno caracterizado por la expresión, normalmente la expresión aberrante (por ejemplo, expresión en exceso) de PSMA.

Las composiciones proporcionadas en el presente documento, en algunas realizaciones, se pueden usar junto con otras modalidades de tratamiento terapéutico. Dichos otros tratamientos incluyen cirugía, radiación, criocirugía, termoterapia, tratamiento hormonal, quimioterapia, vacunas y otras inmunoterapias.

Los sujetos con cáncer de próstata pueden haber recibido, o estar recibiendo, o recibirán terapia hormonal. Así, como se describe en el presente documento, las composiciones proporcionadas en el presente documento se pueden administrar a un sujeto después de, junto con, o antes de la terapia hormonal, tal como para cáncer de próstata. Los ejemplos de terapias hormonales para cáncer de próstata incluyen, sin limitación: agonistas de la hormona liberadora de hormona luteinizante (por ejemplo, leuprolida, goserelina y buserelina), que pueden detener la producción de testosterona por los testículos; antiandrógenos (por ejemplo, flutamida, bicalutamida, enzalutamida y nilutamida), como se trata en cualquier parte en el presente documento, que pueden bloquear la acción de andrógenos tales como testosterona; fármacos que pueden prevenir la producción de andrógenos por las glándulas suprarrenales (por ejemplo, ketoconazol y aminoglutetimida); orquiectomía, que es un procedimiento quirúrgico para retirar uno o ambos testículos, la fuente principal de las hormonas masculinas tales como la testosterona, para reducir la cantidad de hormona que se produce; y estrógenos, que pueden prevenir la producción de testosterona por los testículos.

Una gran cantidad de sujetos se puede beneficiar de los métodos y las composiciones proporcionadas en el presente documento. Dicho sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración a pesar de tener un nivel de castración de testosterona en suero (por ejemplo, < 50 mg/dL) y que haber recibido quimioterapia previa con docetaxel. El sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico resistente a la castración, haber recibido un tratamiento anterior con quimioterapia con taxano y haber recibido y progresado con abiraterona y/o enzalutamida. El sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración a pesar de tener un nivel de castración de testosterona en suero, haber recibido tratamiento anterior con abiraterona y/o enzalutamida y no haber recibido tratamiento anterior con quimioterapia citotóxica. El sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración a pesar de tener un nivel de castración de testosterona en suero y de haber recibido un tratamiento anterior con abiraterona y/o enzalutamida. El sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico progresivo resistente a la castración a pesar de tener un nivel de castración de testosterona en suero y de no haber recibido tratamiento anterior con abiraterona y/o enzalutamida. El sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico resistente a la castración asintomático o mínimamente sintomático a pesar de tener un nivel de castración de testosterona en suero y de no haber recibido tratamiento anterior con abiraterona y/o enzalutamida. El sujeto puede tener cáncer de próstata metastásico resistente a la castración estable y estar recibiendo tratamiento con abiraterona y/o enzalutamida. El sujeto puede tener cáncer de próstata bioquímicamente recurrente y puede haber recibido previamente una terapia primaria (por ejemplo, prostatectomía radical (por ejemplo, abierta, laparoscópica o asistida por robot) o radioterapia (por ejemplo, rT conformada tridimensional de aumento de dosis, RT de intensidad modulada, braquiterapia, o una combinación de las mismas)). El sujeto puede tener cáncer de próstata localizado de alto riesgo (por ejemplo, antígeno prostático específico (PSA) superior a 10 nanogramos por mililitro (ng/ml); velocidad de PSA superior a 2 ng/ml por /año (definida como un aumento en PSA superior a 2 ng/ml en el periodo de 12 meses precedente); puntuación de Gleason superior o igual a 7 (4+3); o puntuación de Gleason 6 si PSA superior o igual a 10 ng/ml o velocidad de PSA superior o igual a 2 ng/ml/año) y es un candidato para prostatectomía.

En el presente documento también se proporcionan kits que comprenden la(s) composición (composiciones). Los kits pueden comprender un recipiente que contiene un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA, y un recipiente que contiene un conjugado de ligando de PSMA (o los componentes de los mismos). Los kits pueden contener además al menos un reactivo adicional como se proporciona en el presente documento. El kit puede comprender un vehículo que está compartimentalizado para recibir en estrecho confinamiento en su interior uno o más receptores o series de receptores tales como tubos de ensayo, viales, matraces, botellas, jeringas o similares. Un recipiente o serie de recipientes puede contener uno o más compuestos que aumentan la expresión de la superficie celular de PSMA. Otro recipiente, o series de recipientes, puede contener un conjugado de ligando de PSMA (o los componentes del mismo). Los componentes de los kits se pueden envasar en medio acuoso o en forma liofilizada. Los componentes de los conjugados se pueden suministrar o en forma completamente conjugada, en forma de productos intermedios, o como restos separados a conjugar por el usuario del kit.

Los kits también pueden comprender un diluyente y/o instrucciones para reconstituir formas liofilizadas de los conjugados de ligando de PSMA y/o compuestos para aumentar la expresión de la superficie celular de PSMA, o instrucciones para diluir componentes acuosos de los kits. Los kits también pueden comprender instrucciones para combinar un compuesto que aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA y/o un conjugado de ligando de PSMA.

La presente invención se ilustra además por los siguientes ejemplos, que de ninguna forma se deben interpretar como limitación adicional. La citación de cualquier referencia no pretende ser admisión de que dicha referencia sea estado de la técnica.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: ADC de PSMA sinergiza con antiandrógenos y rapamicina.

Se probaron inhibidores para la actividad antiproliferativa individualmente y en combinación en un intervalo de concentraciones en un modo de matriz. Se compararon datos de inhibición con predicciones de Bliss y se calcularon las diferencias entre los resultados experimentales y predichos para cada punto en la matriz. Diferencias positivas indican efectos supra-aditivos o sinérgicos. Diferencias negativas indican antagonismo. Los resultados se evaluaron para significación estadística, como se describe a continuación.

Se muestran en la FIG.2 datos de la inhibición media y las diferencias de Bliss para el conjugado de anticuerpo contra PSMA-fármaco (ADC de PSMA) combinado con enzalutamida, abiraterona o rapamicina. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). Se usan recuadros para indicar diferencias de Bliss estadísticamente significativas y el porcentaje de inhibiciones correspondiente. El ADC de PSMA presentó actividad de un único agente similar contra células LNCaP y C4-2, con valores de CI⁵⁰de aproximadamente 200 pM en cada caso. Estos resultados están en línea con los informes previos (20, 21). Enzalutamida, abiraterona y rapamicina inhibieron cada uno la proliferación de células LNCaP (FIG.

2A), pero tuvieron efectos antiproliferativos mínimos sobre las células C4-2 cuando se usaron como agentes únicos (FIG. 2B).

A pesar de carecer de actividad antiproliferativa directa en células C4-2, enzalutamida, abiraterona y rapamicina potenciaron todos significativamente la actividad de ADC de PSMA. Las diferencias de Bliss variaron hasta casi el 40 % y fueron estadísticamente significativas en un intervalo de concentraciones de inhibidor y niveles de inhibición (FIG. 2B). No se observó antagonismo significativo para estas combinaciones en ninguna condición. También se observó sinergia estadísticamente significativa para combinaciones de ADC de PSMA/enzalutamida y ADC de PSMA/abiraterona en células LNCaP (FIG. 2A); sin embargo, la amplitud y la magnitud estuvieron más limitados en comparación con las células C4-2. Similarmente, las diferencias de Bliss fueron, en general, positivas en la matriz de concentraciones para la combinación de ADC de PSMA/rapamicina en células LNCaP; sin embargo, ningún valor alcanzó significación estadística.

Se muestran los datos de inhibición media y las diferencias de Bliss en la FIG. 13 para ADC de PSMA combinado con los antiandrógenos, ARN-509 o TOK-001. Las diferencias de Bliss se representan por mapas de calor de valores que son positivos (gris medio), negativos (gris oscuro), o casi cero (gris claro). ARN-509 y TOK-001 inhibieron cada uno la proliferación de células LNCaP, pero tuvieron efectos antiproliferativos mínimos en células C4-2 cuando se usaron como agentes únicos. A pesar de carecer de actividad antiproliferativa directa en células C4-2, ARN-509 y TOK-001 potenciaron la actividad de ADC de PSMA.

Para determinar si las sinergias observadas fueron únicas para las combinaciones de ADC de PSMA/antiandrógeno, se probó un ligando de molécula pequeña en combinación con antiandrógenos. Los datos de inhibición media y las diferencias de Bliss se muestran en la FIG. 10 para el conjugado de ligando de PSMA molécula pequeña-agente antineoplásico, EC1069, combinado con enzalutamida. Los mapas de calor ilustran las diferencias de Bliss que son positivas para la sinergia (gris medio), negativas (gris oscuro), o casi cero (gris claro).

Como etapa inicial hacia los mecanismos de disección de la sinergia, se combinaron los antiandrógenos y la rapamicina con MMAE libre y con mAb contra PSMA sin modificar. MMAE libre mostró potencia subnanomolar (CI⁵⁰~ 0,5 nM) contra tanto células LNCaP como C4-2, como era de esperar (21). Cuando se emparejó con enzalutamida o abiraterona, MMAE libre presentó actividad aditiva en células LNCaP y actividad de aditiva a débilmente sinérgica en C4-2 (FIG.3). Se obtuvieron resultados similares cuando docetaxel, otro inhibidor de los microtúbulos, se combinó con enzalutamida. Solo hubo casos esporádicos de sinergia estadísticamente significativa para la combinación de docetaxel/enzalutamida (FIG. 3).

La combinación de rapamicina/MMAE mostró efectos aditivos en LNCaP y sinergia moderada en células C4-2 (FIG. 4). Así, la rapamicina sinergizó menos potentemente con MMAE en comparación con ADC de PSMA en ambas líneas celulares. Sin embargo, la combinación de rapamicina/MMAE pareció ser tan potente como o más que la combinación de enzalutamida/MMAE o abiraterona/MMAE en células C4-2. Se observó sinergia de débil a moderada entre rapamicina y enzalutamida en ambas líneas celulares. En células C4-2, concentraciones no inhibidoras de enzalutamida potenciaron la débil actividad antiproliferativa de la rapamicina (FIG. 4).

El mAb PSMA sin modificar fue inactivo tanto solo como en combinación con enzalutamida, abiraterona o rapamicina (FIG. 5). Debido a la actividad muy limitada de los agentes o combinaciones individuales, se realizaron ensayos solo dos veces en algunos casos. Así, las robustas sinergias observadas tras la combinación de ADC de PSMA con antiandrógenos son específicas para el conjugado y no se reproducen con ninguno de sus componentes individuales.

Como control, se preparó una combinación de simulación y se evaluó para sinergia añadiendo ADC de PSMA a la placa de ensayo por dos adiciones separadas. Como era de esperar, la combinación de simulación no mostró sinergia o antagonismo estadísticamente significativo en ninguna línea celular.

Ejemplo 2: Los antiandrógenos aumentan reversiblemente la expresión de PSMA en un modo dependiente del tiempo y de la dosis.

Estudios adicionales examinaron los cambios inducidos por el tratamiento en la expresión de PSMA como un posible indicador de sinergia. Se usaron citometría de flujo y transferencia Western para evaluar PSMA de la superficie celular y total, respectivamente.

Enzalutamida y abiraterona aumentaron los niveles de PSMA de la superficie celular de un modo dependiente de la dosis en ambas líneas celulares (FIG. 6A-D). La expresión de PSMA se duplicó aproximadamente a las concentraciones de antiandrógenos superiores a 1 mM a 7 días después del tratamiento. A diferencia, la rapamicina aumentó la expresión de PSMA en células C4-2 solo (FIG. 6E-F). Bajas concentraciones de rapamicina nanomolar fueron suficientes para inducir un aumento de >2 veces en la expresión de PSMA en células C4-2.

Para investigar la dinámica de expresión, se cultivaron células C4-2 en enzalutamida (1 mM) durante 3 semanas antes del cultivo continuado en ausencia de fármaco durante 8 días adicionales. Se midió PSMA de la superficie celular por citometría de flujo. La expresión de PSMA aumentó continuamente con el tiempo en presencia de enzalutamida. Después de 21 días, la expresión de PSMA en células tratadas fue casi 4 veces superior a la expresión en células sin tratar sometidas a pases en paralelo. La expresión de PSMA volvió a los niveles basales en 7 días desde el cultivo en ausencia de enzalutamida (FIG. 6G).

Los aumentos inducidos por el tratamiento en PSMA también fueron evidentes por transferencia Western (FIG. 7). La magnitud del aumento fue aproximadamente 5 veces para células LNCaP tratadas con enzalutamida como se ha determinado por dilución sucesiva de lisados y análisis semicuantitativo de las transferencias Western (datos no mostrados). Enzalutamida, abiraterona y rapamicina regularon por incremento PSMA a grados similares en células C4-2. La magnitud de la expresión de PSMA en presencia del antiandrógeno se aproximó, pero raramente superó, a la expresión observada en células cultivada en suero tratado con carbón vegetal. En general, los datos de citometría de flujo y de transferencia Western mostraron cambios coherentes inducidos por los patrones de tratamiento en la expresión de PSMA.

Ejemplo 3: Cambios inducidos por el tratamiento en componentes de la vía de AR, PSA y PI3K.

También se evaluaron los niveles de AR, PSA, Akt total, fosfo-Akt (S473), S6 total, y fosfo-S6 pre- y post-tratamiento por transferencia Western. Se investigó actina como una medida de la carga de células totales. Como era de esperar, la regulación por incremento de PSMA inducida por antiandrógenos fue acompañada por la regulación por disminución de PSA (FIG. 7). A diferencia, la rapamicina aumentó la expresión de PSA. Este resultado está de acuerdo con observaciones previas para rapamicina o sus análogos (28, 29). La regulación por incremento conjunta de PSMA y PSA por rapamicina contrasta con los efectos opuestos sobre PSMA y PSA ejercidos por antiandrógenos. Los niveles de proteína AR se vieron modestamente afectados por el tratamiento (FIG. 7).

La activación de Akt fue una respuesta común al tratamiento con antiandrógeno o rapamicina de células LNCaP. Sin embargo, el tratamiento tuvo efectos limitados sobre la activación de Akt en células C4-2. Similarmente, los antiandrógenos aumentaron los niveles de fosfo-S6 en células LNCaP, pero no en C4-2. Estos resultados están de acuerdo con una adaptación mediada por mTOR al tratamiento de antiandrógenos en células LNCaP. Se conoce que la activación de Akt mediada por rapamicina ocurre por la alteración de un bucle de retroalimentación negativo que implica al sustrato 1 del receptor de insulina (30-33). Como era de esperar, la rapamicina suprimió eficazmente la fosforilación de S6 en tanto LNCaP y C4-2, que indica que la rapamicina es farmacológicamente activa en ambas líneas celulares (FIG. 7).

Ejemplo 5: Aditivo a los efectos débilmente sinérgicos para otras combinaciones de fármacos.

En estudios exploratorios, se investigó un grupo adicional de compuestos para actividad solos y en combinación con ADC de PSMA. Estos agentes incluyen el inhibidor de Akt MK-2206 (34); el inhibidor de PI3K GDC-0941 (35); prednisona; y SB-743921 (36), un inhibidor de la proteína del huso de quinesina (ksp) Eg5. MK-2206 y GDC-0941 son inhibidores selectivos de los componentes aguas arriba de la vía de PI3K/mTOR. La prednisona es un componente de las pautas de tratamiento basadas en abiraterona y docetaxel en cáncer de próstata. SB-743931 se incluyó en el estudio de los presentes inventores basándose en la pauta de expresión génica dentro de la base de datos de genómica del cáncer cBio (37), que reveló la expresión coordinada (P=0,000004) de los genes para PSMA y Eg5 dentro de los tumores primarios y metastásicos de cáncer de próstata. Cada uno de estos compuestos mostró actividad de aditiva a débilmente sinérgica cuando se combinaron con ADC de PSMA (FIG. 8). Es decir, las diferencias de Bliss tendieron hacia la sinergia para la mayoría de las condiciones y alcanzaron significación estadística en algunos casos aislados. No se observó antagonismo significativo para ninguna combinación. Se obtuvieron resultados similares cuando la prednisona se sustituyó por su metabolito activo, prednisolona.

La Tabla 2 proporciona una visión general de las sinergias observadas en este estudio. Para cada combinación de fármaco:fármaco, la amplitud de la sinergia se representa como el porcentaje de condiciones evaluables que produjeron una sinergia estadísticamente significativa en la matriz de concentraciones de fármaco. Las combinaciones están clasificadas, de más alta a más baja, según la amplitud de la sinergia observada en células LNCaP. Las combinaciones de ADC de PSMA/enzalutamida y ADC de PSMA/abiraterona mostraron la sinergia más amplia en células LNCaP. A continuación, estuvieron las combinaciones de ADC de PSMA con prednisona o SB-743921. Para la combinación de ADC de PSMA/SB-743921, los datos se deben interpretar con precaución, puesto que varias combinaciones de fármaco-fármaco produjeron >100 % de inhibición y así no fueron evaluables para diferencias de Bliss. Se garantiza el análisis adicional de esta combinación con respecto a un intervalo de concentraciones más centrado. La mayoría de las combinaciones no mostraron sinergia significativa en células LNCaP.

Tabla 2. Resumen de sinergias observadas para diferentes combinaciones de fármacos.

La sinergia fue más generalizada en células C4-2. Las combinaciones de ADC de PSMA/enzalutamida y ADC de PSMA/abiraterona presentaron una alta frecuencia de condiciones sinérgicas en células C4-2, al igual que la rapamicina en las combinaciones con ADC de PSMA o MMAE. Otras combinaciones (por ejemplo, ADC de PSMa en combinación con MK-2206 o GDC0941) también presentaron una sinergia significativa en células C4-2, pero no en LNCaP (Tabla 2). Las combinaciones que no mostraron sinergia significativa ni en células LNCaP ni C4-2 fueron aquellas que implicaron al mAb PSMA y la combinación simulada de ADC de PSMA.

Materiales y Métodos

Materiales Se obtuvieron células LNCaP de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). C4-2 es un subclon independiente de andrógenos de LNCaP (22). Se caracterizan LNCaP y C4-2 por una mutación T877A en AR y pérdida de expresión de PTEN (23, 24). Las líneas celulares permiten las investigaciones de dependencia de andrógenos en un fondo isogénico. Ambas líneas celulares se sometieron a pases en RPMI1640 (Mediatech Inc.) complementado con L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales100 gM, 1 % de penicilina/estreptomicina y 10 % de suero bovino fetal (FBS, Life Technologies). Se extrajeron las células de un banco común y luego se usaron en el plazo de 10 pases. Se preparó ADC de PSMA como se describe (20), y se obtuvieron enzalutamida y abiraterona (fármaco original) de MedKoo Biosciences (FIG. 1). Se compraron prednisona y prednisolona de Sigma; la rapamicina fue de EMD Millipore. GDC0941, MK-226 y SB-743921 fueron de Selleck Chemicals. Se obtuvieron los siguientes anticuerpos de Santa Cruz Biotechnology: Anti-AR (sc-7305, 441) y anti-PSA (sc-7638, C-19). Se usaron dos mAb anti-PSMA murinos, MAB544 (Maine Biotechnology) para Western y 3.9 (Progenics) para citometría de flujo. Se obtuvieron los siguientes anticuerpos de Cell Signaling: Akt total (N° 2920S), fosfo-Akt (S473, N° 4051L), S6 total (N° 2317S) y fosfo-S6 (N° 2211L). El anticuerpo anti-actina (MAB1501) fue de Millipore. Los anticuerpos IRDye secundarios específicos de isotipo fueron de LI-COR Biosciences.

Ensayo de viabilidad celular Se sembraron células a una densidad de 1 x103 células en 25 gL en microplacas de 384 pocillos de color blanco (Perkin Elmer) y se cultivaron durante la noche. Al día siguiente, las células se trataron con 1 o 2 fármacos en un volumen total de 50 gL. Los cultivos se incubaron a 37 °C durante 7 días. La viabilidad se evaluó en los días 0 y 7 usando CellTiter-Glo (Promega) y un lector de luminiscencia Analyst GT a 560 nm de emisión (Molecular Devices). Se calculó el porcentaje de inhibición de la proliferación como (Vu - Vt)/(Vu - V⁰) x 100, donde Vu, Vt y V⁰representan los valores de viabilidad para células sin tratar en el día 7, células tratadas en el día 7 y células antes del tratamiento en el día 0, respectivamente. Un valor de 100 % refleja inhibición completa de la proliferación (Vt = V⁰). Los valores de >100 % reflejan compuestos citotóxicos o combinaciones, donde Vt < V⁰.

Citometría de flujo Para tratamientos a corto plazo (<7 días), se sembraron células en placas de 24 pocillos (BD Falcon) durante la noche, a una densidad de 200.000 células por 500 gL. Al día siguiente, los pocillos se intercambiaron con 500 gL de medio fresco que incluyó inhibidor, y se incubaron a 37 °C hasta el momento de tiempo indicado. Para los tratamientos a largo plazo (>7 días), las células se sembraron en matraces T-25 (BD Falcon) durante la noche, a una densidad de 500.000 células por matraz en 5 mL de medio. Se intercambió 5 mL de medio fresco con o sin tratamiento al día siguiente. En divisiones semanales a partir de aquí, las células se desprendieron con disolución de desprendimiento de células (Sigma), se lavaron con medio fresco, se contaron usando Vi-CELL XR (Beckman Coulter) y se dividieron en dos matraces T-25 para el cultivo continuo con o sin inhibidor. Antes del análisis, se desprendieron las células, se contaron y se suspendieron en PBS (PBS(-), sin Ca/Mg, Life Technologies) que contenía 0,3 % de albúmina de suero bovino (BSA, Sigma) y 0,1 % azida de sodio (VWR). Se dispusieron las células (100.000 en 100 gL) en placas de 96 pocillos de fondo redondo (Falcon) y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con 1 gg/mL de mAb anti-PSMA 3.9 conjugado con ficoeritrina (PE). Entonces se lavaron dos veces las células con 200 pL de tampón PBS/BSA/azida y se leyeron usando un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences). Se incluyó un conjugado de IgG2b-PE de ratón de especificidad irrelevante (Abcam) como control de isotipo.

Transferencia Western Se incubaron células (300.000) durante la noche en placas de 6 pocillos (BD Falcon) en 4 mL de 10 % de medio FBS RPMI1640 antes de la adición de inhibidores. Las placas se incubaron a 37 °C durante 7 días adicionales, se lavaron una vez con 5 mL de PBS(-) frío y se dispusieron sobre hielo. Se lisaron las células con 130 pL de tampón de lisis RIPA (Santa Cruz Biotechnology) y luego se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante se cuantificó para la concentración de proteína usando un kit BCA (Pierce/Thermo), se resolvió en condiciones reductoras usando geles de NuPAGE Novex al 4-12 % de Bis-Tris (Life Technologies) y se transfirieron a nitrocelulosa usando el sistema de transferencia iBlot 7-Minute (Life Technologies). Se bloquearon las membranas usando el reactivo de bloqueo Odyssey (LI-COR Biosciences), se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios, y se visualizaron usando un aparato de infrarrojos Odyssey (LI-COR Biosciences).

Cálculos de sinergia y métodos estadísticos Se probaron combinaciones de fármacos en 3 a 7 ensayos de viabilidad celular de repeticiones independientes, a menos que se indique lo contrario. Se ajustaron los datos de inhibición a una ecuación logística de cuatro parámetros usando GraphPad Prism. Se evaluaron los posibles efectos no aditivos por el método de independencia de Bliss (25-27). Brevemente, el valor de Bliss predicho para la combinación (Fc) se calculó como Fc = Fa Fb -(Fa x Fb), donde Fa y Fb representan la inhibición fraccionada observada de los crecimientos provocados por los compuestos A y B usados solos. Se calcularon las diferencias de Bliss restando el valor predicho (Fc) de la inhibición experimentalmente observada. Se calcularon diferencias medias de Bliss para cada punto en una matriz de combinaciones de fármaco-fármaco, se convirtieron en porcentajes y se evaluaron para significación estadística desde el valor nulo de cero usando pruebas bilaterales de la t con un nivel de significancia de 0,05. No se realizaron evaluaciones estadísticas en los casos en los que la inhibición fraccionaria del crecimiento superara la unidad, puesto que dichos valores se encuentran fuera del marco de Bliss. Además, se consideró que las diferencias de Bliss inferiores a 5 % eran de relevancia biológica limitada y se excluyeron de las consideraciones de sinergia.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método in vitro para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostético específico de membrana (PSMA), comprendiendo el método:

poner en contacto células cancerosas que expresan PSMA con un antiandrógeno, en donde el antiandrógeno es abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel; y

poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplésico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoécido, en donde el resto de glutamato-ureaaminoécido es un glutamato-urea-lisina;

2. Un antiandrógeno seleccionado del grupo que consiste en abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostético específico de membrana (PSMA) en un sujeto, comprendiendo el método:

3. Un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplésico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostético específico de membrana (PSMA) en un sujeto, comprendiendo el método:

poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplésico o un conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoécido, en donde el resto de glutamato-ureaaminoécido es un glutamato-urea-lisina;

4. El antiandrógeno para su uso según la reivindicación 2, o el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplésico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico para su uso según la reivindicación 3, en donde el sujeto tiene céncer de próstata que ha progresado a pesar del tratamiento anterior con uno o més antiandrógenos.

5. El conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplésico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico para su uso según la reivindicación 4, en donde el sujeto tiene céncer de próstata metastésico resistente a la castración.

6. Una composición que comprende un antiandrógeno y un conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplésico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico, para su uso en un método in vivo para inhibir la proliferación de células cancerosas que expresan antígeno prostético específico de membrana (PSMA), en donde el antiandrógeno es abiraterona, enzalutamida, nilutamida, flutamida, bicalutamida, ARN 509, galeterona u orteronel, y en donde el ligando de PSMA del conjugado comprende un ligando de molécula pequeña que se une específicamente a PSMA y el ligando de molécula pequeña comprende un resto de glutamato-urea-aminoécido, en donde el resto de glutamato-ureaaminoécido es un glutamato-urea-lisina;

7. Un kit que comprende:

opcionalmente que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable y/o un excipiente y/o un diluyente.

8. El método de la reivindicación 1, los compuestos para el uso de las reivindicaciones 2 a 5, la composición para el uso de la reivindicación 6, o el kit de la reivindicación 7, en donde el ligando de molécula pequeña se une a un sitio enzimático en PSMA.

9. El método de la reivindicación 1, los compuestos para el uso de las reivindicaciones 2 a 5, la composición para el uso de la reivindicación 6, o el kit de la reivindicación 7, en donde el ligando de molécula pequeña comprende MIP-1095, MIP-1072 o DUPA.

10. El método, compuestos para su uso, o composición para el uso o kit de la reivindicación 9, en donde el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico comprende MIP-1095 o MIP-1072 conjugado con un radionúclido citotóxico seleccionado del grupo que consiste en I123, I125, I131, I124, Br75, Br77 y F14 *8.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 a 10 cuando es dependiente de la reivindicación 1, los compuestos para el uso de las reivindicaciones 2 a 5 o 8 a 10 cuando son dependientes de las reivindicaciones 2 a 5, la composición para el uso de las reivindicaciones 6 o 8 a 10 cuando son dependiente de la reivindicación 6 o el kit de las reivindicaciones 7 o 8 a 10 cuando son dependientes de la reivindicación 7, en donde el agente antineoplásico comprende una auristatina, tubulisina, un dímero de pirrolobenzodiacepina, caliqueamicina, colchicina, ispinesib, combrestatina A4, maitansinoide DM1, maitansinoide DM4, doxorrubicina o un radionúclido citotóxico.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 a 11 cuando son dependientes de la reivindicación 1, los compuestos para el uso de las reivindicaciones 2 a 5 o 8 a 11 cuando son dependientes de las reivindicaciones 2 a 5, la composición para el uso de las reivindicaciones 6 o 8 a 11 cuando son dependientes de la reivindicación 6 o el kit de las reivindicaciones 7 o 8 a 11 cuando son dependientes de la reivindicación 7, en donde el antiandrógeno aumenta la expresión de la superficie celular de PSMA en células que expresan PSMA.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 a 12 cuando son dependientes de la reivindicación 1, o los compuestos para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o 8 a 12 cuando son dependientes de las reivindicaciones 2 a 5, en donde la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico son simultáneas, o en donde la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el antiandrógeno y la etapa de poner en contacto las células cancerosas que expresan PSMA con el conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico son secuenciales.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 8 a 13 cuando son dependientes de la reivindicación 1, los compuestos para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o 8 a 13 cuando son dependientes de las reivindicaciones 2 a 5, o la composición para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 6 o 8 a 13 cuando son dependientes de la reivindicación 6, en donde las células cancerosas que expresan PSMA:

(a) comprenden células cancerosas independientes de andrógeno que expresan PSMA; y/o

(b) comprenden células cancerosas que expresan PSMA que han dejado de responder a una terapia de antiandrógenos; y/o

(c) son de un tumor; y/o

(d) son células que expresan PSMA de cáncer de próstata; y/o

(e) son células distintas de cáncer de próstata que expresan PSMA.

15. El conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico para su uso según la reivindicación 3 a 5, o el kit según la reivindicación 7, en donde el ligando de PSMA-agente citotóxico comprende un radionúclido citotóxico.

16. El conjugado de ligando de PSMA-agente antineoplásico o conjugado de ligando de PSMA-agente citotóxico para su uso según la reivindicación 15, o el kit según la reivindicación 15, en donde el radionúclido citotóxico es I123, I125, I131, I124, Br75, Br77, F18, 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 212Pb, 224Ra, 223Ra, 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 67Cu, 64Cu, 153Sm o 166Ho.