ES2834906T3 - Oligonucleótidos de cadena sencilla para la utilización en el tratamiento médico de trastornos de la piel - Google Patents

Abstract

Oligonucleótido de cadena sencilla (ONcs) para la utilización en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo, incluyendo el prurito, en el que: (a) la longitud de dicho ONcs es de entre 25 y 70 nucleótidos, (b) o bien (i) por lo menos 90% de los enlaces internucleótidos en dicho ONcs son enlaces internucleótido fosforotioato, o bien (ii) dicho ONcs comprende por lo menos cuatro enlaces internucleótido fosforotioato y por lo menos cuatro modificaciones 2'-O-metilo, y (c) dicho ONcs no contiene ningún motivo CpG.

Description

DESCRIPCIÓN

Oligonucleótidos de cadena sencilla para la utilización en el tratamiento médico de trastornos de la piel

Campo técnico

La invención se refiere a oligonucleótidos de cadena sencilla (ONcs) no CpG para la utilización en el tratamiento o la profilaxis de trastornos de la piel y/o tejido subcutáneo, incluyendo el prurito. Dichos ONcs presentan una longitud de por lo menos 25 nucleótidos y están estabilizados por enlaces internucleótido fosforotioato y/o modificaciones 2'-O-metilo.

Antecedentes de la técnica

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano. Sirve de barrera para la protección frente a la infección, toxinas, microbios y radiación. Los trastornos de la piel no solo comprometen dichas funciones, sino que causan además problemas psicológicos, sociales y ocupacionales significativos. Una parte significativa de la población mundial está afligida por problemas de la piel. Los trastornos de la piel y/o subcutáneos están codificados en ICD-10 (Clasificación Estadística Internacional de Enfermedades y Problemas Sanitarios Relacionados - 10a Revisión), capítulo XII, y entre ellos se incluyen, p.ej., dermatitis atópica, soriasis, rosácea, acné, pitiriasis rosea, urticaria, eritema y prurito. Dichos trastornos explican una gran parte de los costes sanitarios anuales, además de los costes no financieros, tales como el prurito intratable, la privación de sueño, las comorbolidades psiquiátricas, el tiempo dedicado al tratamiento, las incomodidades y el estigma social asociado. Los niños con dermatitis atópica (DA) moderada a severa consistentemente estiman que su condición presenta un impacto sobre la calidad de vida que es comparable al de la diabetes dependiente de insulina [1]. Existe una necesidad de tratamiento de los trastornos de la piel. Muchos de estos trastornos de la piel están asociados a diversos grados de inflamación y picor. La inflamación es un proceso estrictamente regulado que está destinado a eliminar los patógenos intrusos y eliminar las células dañadas. La acción concertada de fagocitos profesionales, tales como macrófagos, monocitos, neutrófilos y determinadas células dendríticas, resulta esencial para limpiar eficazmente el sitio de células muertas y patógenos invasores, así como para restaurar la homeostasis [2]. Las células dendríticas (CD) son potentes células presentadoras de antígenos con capacidad para sensibilizar células T no expuestas tras la incorporación de antígenos, aunque también participan en el mantenimiento de la tolerancia [3]. El resultado funcional de la acción de las CD está dictado por la expresión diferencial de receptores coestimuladores y receptores inhibidores, así como los patrones de secreción de citoquinas/quimioquinas. La piel humana sana aloja por lo menos tres poblaciones de CD: las células de Langerhans (CL) en la epidermis y las CD CD1a+ y CD14+ intersticiales, en la dermis [4, 5].

Los oligonucleótidos son moléculas de ADN o ARN cortas, oligómeros, que presentan un amplio abanico de aplicaciones. Los “oligonucleótidos CpG” (o ONcs-CpG) son moléculas de ADN o ARN sintéticas de cadena sencilla que contienen un nucleótido citosina trifosfato (“C”) seguido de un nucleótido guanina trifosfato (“G”). Es conocido de la técnica que los ácidos nucleicos que contienen CpG estimulan el sistema inmunitario y pueden utilizarse para tratar enfermedades infecciosas, alergias, asma y otros trastornos. La secuencia de CpG en los ligandos de ADNcs-ODN se ha demostrado que resulta indispensable para la activación del receptor 9 de tipo Toll (TLR9), que desempeña un papel fundamental en el reconocimiento de patógenos y la activación de la inmunidad innata. El efecto estimulador del ligando se pierde al eliminar las repeticiones de CpG. En consecuencia, el efecto inmunoestimulador mediado por TLR no se ha demostrado en oligonucleótidos de cadena sencilla que no presentan motivos de CpG (“Oncs no-CpG”).

Se ha demostrado que la estimulación del sistema inmunitario con motivos inmunoestimuladores que contienen CpG conduce a la inducción de respuestas proinflamatorias acompañadas de la inducción de IL-10 (ver los ejemplos en el documento n° US 7.807.803 B2). La citoquina antiinflamatoria IL-1 es bien conocida por su contribución a la restauración de la homeostasis tras el daño celular. Numerosos estudios en ratones han demostrado que IL-10 resulta importante para limitar las patologías autoinmunes. Se han atribuido muchas funciones a IL-10, incluyendo la represión de las citoquinas proinflamatorias principales IL-1, IL-6, IL-12 y TNF-a, así como quimioquinas tanto del tipo CC como del tipo CXC [6]. La ILT-6 soluble, con efectos antiinflamatorios, se ha demostrado que resulta regulada positivamente por IL-10 [7]. Aunque los efectos antiinflamatorios de IL-10 se han conocido desde hace mucho tiempo y muchas condiciones podrían mejorarse mediante la inducción de IL-10, se han encontrado dificultades con los intentos para desarrollar terapéuticos basados en la administración de IL-10. En ensayos clínicos en seres humanos de IL-10 recombinante ha tenido escaso éxito.

Se ha dado a conocer (Duffy et al., documentos n° US2008/0299138 y n° WO2008/147956; Ranjith-Kumar, C.T. et al., Molecular and Cellular Biology 28:4507-4519, 2008) que los ADN de cadena sencilla pueden utilizarse para regular la respuesta inflamatoria mediante el receptor 3 de tipo Toll (TLR3). También ha sido demostrado por Skold et al. [8] que los oligonucleótidos de cadena sencilla (ONcs) inhiben las respuestas mediadas por TLR3 en células dendríticas derivadas de monocitos humanos e in vivo en macacos Cynomolgus. TLR3 es un receptor clave para el reconocimiento del ARN de doble cadena y el inicio de respuestas inmunitarias contra las infecciones víricas. Sin embargo, las respuestas hiperactivas pueden presentar efectos adversos, tales como el asma inducido por virus. Se ha demostrado [8] que las células dendríticas derivadas de monocitos humanos regulan positivamente marcadores de maduración y secretan citoquinas proinflamatorias en el tratamiento con el ligando sintético de TLR3 ácido poliinosín-policitidílico (poli(I:C)). Poli(I:C) es un agonista sintético de, por ejemplo, TLR3, y con frecuencia se utiliza como un adyuvante en vacunas [ver, p.ej., la ref. 28]. También es bien conocido que la inyección de poli(I:C) conduce a una respuesta inflamatoria, por ejemplo en el caso de que se administre en la piel [10]. Se ha demostrado [8] que los sucesos mediados por TLR3 resultan inhibidos en cultivos con ONcs CpG. La activación de poli(I:C) de células no hematopoyéticas también resultó inhibida por ONcs CpG. La incorporación de poli(I:C) en células se redujo en presencia de ONcs CpG, evitando que se produjese el acoplamiento de TLR3. En macacos Cynomolgus, se redujeron los niveles de citoquinas proinflamatorias en secreciones nasales al administrar ONcs por la vía intranasal. Las secuencias de ONcs utilizadas por Skold et al. fueron:

5-GTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTGTTGGTGGTGGTG-3' (ONcs CpG; SEC ID n° 1) y

5-GAAGTTTTGAGGTTTTGAAGTTGTTGGTGGTGGTG-3' (ONcs no CpG; SEC ID n° 2).

Dorn et al. [31] dan a conocer un oligonucleótido 20-mero modificado con fosforotioato de cadena sencilla no CpG en relación a la supresión de IL-8 in vitro.

El tratamiento actual de los trastornos inflamatorios de la piel con frecuencia incluye tratamientos inmunosupresores, tales como corticoesteroides e inhibidores de calcineurina [9] y con frecuencia se acompaña de infecciones secundarias de la piel debido a defectos de la barrera y defensas inmunitarias no funcionales. Además, el tratamiento prolongado con corticoesteroides se asocia a efectos secundarios tóxicos bien conocidos. La patogénesis de los trastornos de la piel, tales como, por ejemplo, la dermatitis atópica y la soriasis, se sugiere que incluye una producción desregulada de IL-10 [10-13].

Muchos de los trastornos o patologías de la piel se ven acompañados por prurito, una condición que implica picor localizado o general. Se conoce una diversidad de causas para la condición del prurito, entre ellas causas externas y endógenas, trastornos de la piel localizados y enfermedades sistémicas. El picor también puede ser producido por una diversidad de estímulos químicos, mecánicos, térmicos y eléctricos [14, 15].

Generalmente, las opciones para tratar eficazmente dichos trastornos son limitadas. Entre las modalidades de tratamiento actualmente disponibles para dichas patologías se incluyen agentes tópicos no específicos, tales como emolientes y contrairritantes, fármacos tópicos y orales, tales como esteroides, anestésicos locales y antihistamínicos, y modalidades físicas, tales como fototerapia de ultravioleta y estimulación térmica. Algunos de dichos tratamientos resultan eficaces en condiciones pruríticas de una etiología particular, mientras que otros pueden mostrar un beneficio general pero no específico. Es conocido que muchos corticoesteroides pueden aliviar el pico y pueden resultar eficaces en el tratamiento de algunos trastornos de la piel. Sin embargo, la utilización prolongada de dichos corticoesteroides se asocia a efectos secundarios tóxicos tanto cutáneos como sistémicos y su utilización generalizada es limitada sin supervisión médica. El sulfuro de selenio, el azufre y el ácido salicílico o el champú de alquitrán también se han utilizado para tratar dichas condiciones de la piel. En cualquier caso, la remisión de la patología o el prurito con frecuencia es lenta y frecuentemente incompleta.

Las preparaciones locales no específicas pueden actuar como lociones o cremas hidratantes o como pomadas de base aceitosa que son oclusivas y sirven para suavizar la piel seca, así como para proporcionar una capa protectora. Aunque dichas preparaciones pueden presentar propiedades valiosas de hidratación y suavización de la piel, también poseen efectos no deseables en el aspecto de que generalmente proporcionan a la piel una incómoda sensación de calor además de una sensación pegajosa, aceitosa, grasa o cerosa. Más importante, estos materiales por sí solos presentan poco efecto, si alguno, sobre la reducción del picor.

Por lo tanto, el tratamiento actual no resulta suficiente y existe una necesidad de compuestos antiinflamatorios selectivos que puedan incrementar las defensas antibacterianas y aliviar el picor. Existe una necesidad de métodos mejorados para el tratamiento o la profilaxis de condiciones médicas, tales como “trastornos de la piel y/o tejido subcutáneo” tal como se define en ICD-10.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: (A) CD humanas inmaduras expuestas a 25 pg/ml de poli(I:C), en presencia de 0,2 pM de ONcs. La expresión de molécula coestimuladoras se midió mediante citometría de flujo. Se midieron las diferencias significativas mediante ANOVA de un factor (****P<0,0001). (B) CD humanas inmaduras expuestas a 25 pg/ml de poli(I:C), en presencia de ONcs. La inhibición de la expresión de CD80 y CD86 era dependiente de la concentración. Se muestran los datos individuales con medias ± SD. (C) Se midió IL-6, IP-10 e IL-1ra en sobrenadantes de cultivo veinticuatro horas después de la estimulación de las CD (n=6). Se evaluaron las diferencias significativas mediante pruebas de Kruskal-Wallis no paramétricas con comparaciones múltiples de Dunn que comparaban poli(I:C) con diferentes concentraciones de ONcs (*P<0,05, ** P<0,01, ***P<0,001).

Figura 2: inyección intradérmica de ARNdc (poli(I:C)) induce inflamación local en primates no humanos, tal como se esperaba. El número de las poblaciones de células inmunitarias se identificó mediante citometría de flujo en capas (A) epidérmicas y (B, C) dérmicas. Se recolectaron células de biopsias, veinticuatro horas después de la inyección de PBS (n=12), poli(I:C) (n=6) o poli(I:C)/ONcs (n=6). Se excluyó de los resultados ilustrados de células epidérmicas un animal con valor atípico. Se muestran los datos individuales con medias ± SEM. Se evaluaron las diferencias significativas mediante prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica y pruebas a posteriori de Dunn (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). Se compararon los diferentes grupos de tratamiento utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica para muestras no apareadas (flechas de línea discontinua).

Figura 3: el tratamiento de ONcs amortigua la expresión de varios quimioquinas (A, B) inducida por ARNdc en primates no humanos y regula positivamente los receptores inhibidores (C) y las moléculas antibacterianas (D). Los valores relativos de expresión de ARNm obtenidos de los análisis de micromatrices de biopsias de piel de macacos individuales recogidos veinticuatro horas después de la estimulación se muestran con medias ± SEM. Se evaluaron las diferencias significativas mediante prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica y pruebas a posteriori de Dunn (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). Se compararon los diferentes grupos de tratamiento utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica para muestras no apareadas, tal como se indica (flechas de línea discontinua).

Figura 4: los valores relativos de expresión de ARNm obtenidos de los análisis de micromatrices de biopsias de piel de macaco para RAX, LRG1 y LCN2 (A), así como IL-6, IFN-y e IL-12p40 (B) se muestran con medias ± SEM. Se recogieron biopsias veinticuatro horas después de las inyecciones intradérmicas de PBS, poli(I:C), poli(I:C)/ONcs o ONcs. Se evaluaron las diferencias significativas mediante prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica y pruebas a posteriori de Dunn (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). Se compararon los diferentes grupos de tratamiento utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica para muestras no apareadas, tal como se indica (flechas de línea discontinua).

Figura 5: el tratamiento de ONcs induce IL-10 y atenúa la producción de IL-6 in vivo. Las concentraciones de las proteínas de citoquina indicadas presentes en los sobrenadantes de dermis digerida enzimáticamente se midieron mediante la tecnología Bio-Plex™. Se muestran datos de medias ± SEM de animales individuales. El panel derecho inferior muestra un experimento de escalado de dosis con dos animales tratados con ONcs en una dosis comprendida entre 85 y 680 |jg en cada inyección. Se evaluaron las diferencias significativas mediante prueba de Kruskal-Wallis no paramétrica y pruebas a posteriori de Dunn (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001). Se compararon los diferentes grupos de tratamiento utilizando una prueba de Mann-Whitney no paramétrica para muestras no apareadas, tal como se indica (flechas de línea discontinua).

Figura 6: maduración inducida por poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos. Células tratadas con 25 jg/m l de poli(I:C) y 0,2 jM de ONcs, secuencias en la Tabla II. Se utilizaron 100 ng/ml de LPS como control positivo. Todas las células tratadas con oligonucleótidos se expusieron a 25 jg/m l de poli(I:C). Los marcadores de CD maduras (CD86, CD83 y CD80) se midieron mediante citometría de flujo. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando dos donantes por duplicado.

Figura 7: efectos de inhibición de las respuestas de poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos por ONcs-PS rico en las nucleobases A, T, C y G, respectivamente.

Figura 8: efectos de inhibición de las respuestas de poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos por ONcs que habían sido modificados con grupos 2'-O-metilo. Los ONcs presentaban un esqueleto de fosforioato (PS) o de fosfodiéster (PO).

Figura 9: efecto de las cantidades crecientes de ADN PO complementario (que permite la formación de ADNdc) sobre la maduración de las CD. Los datos de FACS proceden de 3 donantes diferentes por duplicado. Las barras de error se proporcionan como SEM.

Figura 10: efectos de inhibición de las respuestas de poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos por ONcs de la misma longitud y esqueleto de (PS), aunque secuencia diferente.

Figura 11: efecto de inhibición de las respuestas de poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos por ONcs utilizando un ONcs 35-mero mutado aleatoriamente con esqueleto de PS.

Figura 12: el efecto de inhibición de las respuestas de poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos por ONcs es dependiente de la longitud. Se midió la secreción de CD86 e IL-6 utilizando ONcs de longitud variable.

Descripción de la invención

Tal como se muestra en los Ejemplos, posteriormente, el perfilado transcripcional de biopsias de piel reveló una atenuación dependiente de ONcs de las respuestas proinflamatorias inducidas por ARNdc en macacos. El patrón de citoquinas moduladas por ONcs se confirmó mediante análisis de las proteínas directamente ex vivo procedentes de biopsias de piel e inesperadamente reveló la inducción de IL-10 y la inhibición de la secreción de iL-6. El perfilado transcripcional reveló adicionalmente un incremento inesperado de la expresión de los péptidos antibacterianos tras el tratamiento con ONcs.

Tal como se comenta en la sección de Antecedentes de la técnica, es conocido de la técnica que los ONcs CpG son capaces de inducir respuestas proinflamatorias acompañadas de la inducción de IL-10. También ha sido dado a conocer por Skold et al. [8] que un ONcs no CpG (SEC ID n° 2) podría inhibir la producción inducida por poli(I:C) de citoquinas proinflamatorias. Sin embargo, según la invención, resultó inesperado que los ONcs no CpG son capaces de inducir IL-10, así como péptidos antibacterianos, sin respuestas proinflamatorias concomitantes.

En consecuencia, inesperadamente se ha demostrado que los ONcs (no CpG) resultan útiles en el tratamiento y la profilaxis de trastornos de la piel y/o el tejido subcutáneo, incluyendo el prurito.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un oligonucleótido de cadena sencilla (ONcs) para la utilización en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo, incluyendo el prurito, en el que:

(a) la longitud de dicho ONcs es de entre 25 y 70 nucleótidos,

(b) o bien (i) por lo menos 90% de los enlaces internucleótidos en dicho ONcs son enlaces internucleótido fosforotioato, o bien (ii) dicho ONcs comprende por lo menos cuatro (preferentemente por lo menos cinco o seis) enlaces internucleótido fosforotioato y por lo menos cuatro (preferentemente por lo menos cinco o seis) modificaciones 2'-O-metilo, y

(c) dichos ONcs no contienen ningún motivo CpG.

La expresión "trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo" comprende las condiciones médicas codificadas en ICD-10 (Clasificación Estadística Internacional de Enfermedades y Problemas de Salud Conexos, 10° revisión). Entre dichas condiciones se incluyen, p.ej., infecciones de la piel y el tejido subcutáneo (p.ej., celulitis), dermatitis y eccema (p.ej., dermatitis atópica y/o prurito), trastornos bullosos (p.ej., pénfigo), trastornos papuloescamosos (p.ej., soriasis), urticaria y eritema, trastornos de los apéndices de la piel (p.ej., rosácea) u otros trastornos de la piel y el tejido subcutáneo (p.ej., lupus eritematoso). Dichos ejemplos son puramente ilustrativos de cada categoría y no pretenden ser limitativos del alcance de la invención.

En un aspecto preferente, la expresión "trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo" comprende las condiciones médicas codificadas en ICD-10, capítulo XII, L20-L30, "Dermatitis y eccema", tal como, en particular, L20, "Dermatitis atópica" y/o L29, "Prurito".

Además, los ONcs resultan útiles en el caso de que una infección se encuentre asociada a dicho trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo. La infección puede estar causada por una rotura de la barrera de la piel, el tratamiento inicial o por cambios en el sistema inmunitario.

Tal como se ha indicado anteriormente, la longitud de los ONcs es de entre 25 y 70 nucleótidos. Más preferentemente, la longitud es de entre 25 y 50 o de entre 25 y 35 nucleótidos.

Las expresiones "enlaces internucleótido fosforotioato" y "enlaces PS" se refieren a enlaces internucleótido en los que uno de los oxígenos no de puente en el esqueleto de ADN-fosfato (PO) ha sido sustituido por azufre [16]. Preferentemente 95%, o más preferentemente 100% de los enlaces internucleótido en dicho ONcs para la utilización según la invención son enlaces internucleótido fosforotioato (PS). En consecuencia, la invención incluye la utilización de ONcs en los que algunos enlaces internucleótido (tal como uno, dos, tres o más enlaces internucleótido) son enlaces PO sin azufre, mientras que el resto de enlaces son enlaces PS. En los casos en que el ONcs comprende grupos fosfato en el extremo 5'-terminal y/o 3'-terminal, dichos grupos fosfato pueden ser grupos modificados (PS) o no modificados (PO).

La expresión "modificaciones 2'-O-metilo" se refiere a modificaciones de nucleótidos en los que se añade un grupo metilo al grupo 2'-hidroxilo de la fracción de ribosa de un nucleósido.

Los ONcs para la utilización según la invención pueden comprender modificaciones químicas adicionales. Los oligonucleótidos químicamente modificados son conocidos de la técnica y se dan a conocer en, p.ej., Jarver P. et al., Nucleic acid therapeutics 24:37-47, 2014 y Deleavey, G.F. y Damha, M.J., Chemistry & Biology 19:937-954, 2012. Entre las posibles modificaciones químicas se incluyen, p.ej., ANB (ácido nucleico bloqueado), en el que la fracción de ribosa está modificada con un puente adicional que conecta el oxígeno 2' y el carbono 4'. Además, el ONcs puede comprender una mezcla de ribosas y desoxirribosas como pentasacárido. Además, una o más nucleobases en el ONcs pueden estar modificadas. Entre las modificaciones de bases de oligonucleótidos se incluyen la metilación de las citosinas para formar 5-metilcitosina y la metilación de la adenosina para formar N6-metiladenosina.

La expresión "motivos CpG" se entiende que se refiere a oligonucleótidos Cpg inmunoestimuladores, es decir, moléculas de ácidos nucleicos sintéticos de cadena sencilla cortos que contienen un desoxinucleótido citosina ("C") trifosfato seguido de un desoxinucleótido guanina ("G") trifosfato. La "p" se refiere al enlace fosfodiéster o fosforotioato entre nucleótidos consecutivos. Los motivos CpG se consideran patrones moleculares asociados a patógenos (PMAP) debido a su abundancia en los genomas microbianos, aunque raramente en genomas de vertebrados. El PMAP CpG resulta reconocido por el receptor de reconocimiento de patrón (RRP) receptor 9 de tipo Toll (TLR9), que se expresa constitutivamente principalmente en las células B y células dendríticas plasmacitoides (CDp) en el ser humano y en otros primates superiores. En consecuencia, la invención no incluye la utilización de ONcs que comprenden motivos CpG capaces de estimular una respuesta de TLR9.

Preferentemente, los ONcs para la utilización según la invención presentan un modo de acción "independiente de la secuencia", no presentan actividad antisentido y no son complementarios a un gen. Más específicamente, no más de 16 nucleótidos consecutivos en dichos ONcs son complementarios a cualquier secuencia de ARNm humano. En consecuencia, los ONcs son esencialmente "no complementarios" a cualquier secuencia de ARNm humano. La expresión "no complementario" se entiende que se refiere a secuencia de ácidos nucleicos que no son capaces de un emparejamiento preciso (de bases de purina o pirimidina entre las dos cadenas de las secuencias de ácidos nucleicos) bajo condiciones de hibridación moderadas o restrictivas (es decir, 5°C a 10°C inferiores a la Tf). En particular, el ONcs es no complementario a secuencias de nucleótidos codificantes de proteínas receptoras, p.ej., receptores de tipo Toll, tales como TLR3 o TLR9, o cualquier otra proteína que reconozca los PMAD (patrón molecular asociado a daño) o PMAP (moléculas de patrón asociado a patógeno). De esta manera, se entenderá que los ONcs para la utilización según la invención no son moléculas "antisentido" que son complementarias a una cadena de ARN mensajero (ARNm) transcrita dentro de una célula.

El experto ordinario en la materia podrá identificar secuencias de oligonucleótido que son "no complementarias" tal como se definen según la presente invención. Por ejemplo, el experto en la materia podrá utilizar herramientas bien conocidas, tales como el algoritmo BLAST tal como es implementado en internet por el US National Center for Biotechnology Information. Ver, p.ej., Madden, T., The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCB1Handbook [Internet], 2a edición, 20l3. (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK153387)

Preferentemente, dicho ONcs es no autocomplementario. La expresión "no autocomplementario" se entiende que se refiere a que el ONcs no presenta ninguna secuencia autocomplementaria que permita que dos ONcs dimericen o que pueda permitir que partes del oligonucleótido se plieguen y emparejen consigo mismas formando horquillas. Es bien conocido que el apareamiento de bases de horquilla (también denominado "bucle de horquilla") puede producirse en el ADN o ARN de cadena sencilla. Se produce en el caso de que dos regiones de la misma cadena, habitualmente complementarias al leerlas en sentidos contrarios, aparean sus bases formando una doble hélice que termina en un bucle no apareado.

El experto ordinario en la materia podrá identificar las secuencias autocomplementarias mediante la comparación de las partes de la secuencia de ONcs y la detección de si podría ocurrir el apareamiento de bases de Watson-Crick (CG y AT/AU). Alternativamente, una herramienta de software, tal como Oligo Calc: Podría utilizarse el calculador de propiedades del oligonucleótido (www.basic.northwestem.edu/biotools/oligocalc.html) para detectar las secuencias autocomplementarias. Los modelos para la autodimerización y formación de horquillas en oligonucleótidos son conocidos de la técnica y se describen en, p.ej., Hilbers, C.W., Anal. Chem. 327:70, 1987; Serra, M.J., Nucleic Acids Res. 21:3845-3849, 1993, y Vallone, P.M., Biopolymers. 50:425-442, 1999. Como regla general, se requerirían por lo menos 5 pares de bases para la autodimerización y se requerirían por lo menos 4 pares de bases para la formación de horquilla. En consecuencia, preferentemente el ONcs tal como se ha definido anteriormente no comprende más de 3 nucleótidos consecutivos que podrían formar pares de bases con otra secuencia de 3 nucleótidos consecutivos en la misma molécula de ONcs.

Preferentemente, dicho ONcs es un oligodesoxinucleósido de cadena sencilla (ODNcs). Sin embargo, la invención proporciona además la utilización de ONcs que son moléculas de ARN (ácido ribonucleico) de cadena sencilla estabilizada. Tal como entenderá el experto en la materia, en el caso de que el ONcs sea un oligodesoxinucleósido, los monosacáridos en el ONcs son de 2'-desoxirribosa. Sin embargo, en el presente contexto, el término "ODNsc" también incluye oligonucleótidos que comprenden uno o más monosacáridos modificados, tales como 2'-O-metilribosa.

En aspectos preferentes de la invención, el ONcs comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 2, 12, 13, 14, 15, 16 o 19 en el Listado de secuencias. Más preferentemente, el ONcs presenta (consiste en) las secuencias mostradas como SEC ID n° 2, 12, 13, 14, 15, 16 o 19.

En un aspecto preferente adicional de la invención, por lo menos 30% de las nucleobases en el ONcs se seleccionan de A (adenina), T (timina) y U (uracilo). Preferentemente, por lo menos 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o 60% de las nucleobases en el ONcs se seleccionan de A, T y U. En el caso de que el ONcs sea un oligodesoxinucleótido (ODNsc), que contiene desoxirribosa como su componente pentosa, las nucleobases normalmente se seleccionan de A y T. En el caso de que el ONcs sea un ribonucleótido que contiene ribosa, las nucleobases se seleccionan normalmente de A y U. Sin embargo, los ONcs según la invención podrían incluir variantes sintéticas, que pueden diferir de los oligonucleótidos naturales. Por ejemplo, el ONcs podría comprender una fracción desoxiuridina (es decir, uracilo unido a desoxirribosa). El ONcs también podría comprender análogos de nucleobase, que son bien conocidos de la técnica y entre los que se incluyen, p.ej., xantina, hipoxantina, 7-metilguanina, 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina.

La invención proporciona ONcs tal como se ha dado a conocer anteriormente para la utilización en el tratamiento o la profilaxis de condiciones médicas en mamíferos, en particular seres humanos, en el que la vía de administración se selecciona de parenteral, intramuscular, subcutánea, epidérmica, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa, administración mucosal, oral, sublingual, dérmica, transdérmica, tópica, por inhalación, intranasal, aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, pistola génica, parche dérmico, gota ocular o enjuague bucal.

En un aspecto, dicho ONcs puede administrarse localmente en un tejido en una cantidad de entre aproximadamente 70 |jg y aproximadamente 5 mg/dosis, preferentemente de entre aproximadamente 70 |jg y aproximadamente 700 jg/dosis. El intervalo de 70 a 700 jg corresponde a aproximadamente 60 a 60 nmoles de ONcs y preferentemente se aplica por cm2 de piel o mucosa. Alternativamente, dicho ONcs puede administrarse sistémicamente en una cantidad de entre 10 jg/kg y 10 mg/kg de peso corporal, preferentemente de entre aproximadamente 10 jg/kg y aproximadamente 1 mg/kg, más preferentemente de entre aproximadamente 10 jg/kg y aproximadamente 100 jg/kg.

Se entenderá que el ONcs para la utilización según la invención puede administrarse en combinación con otros agentes, p.ej., agentes antiinflamatorios y/o antipruríticos, tales como inhibidores de calcineurina, corticoesteroides, anti-IL31, inhibidor de PDE-4, anticuerpo de IL-4R, anti-IL13, anti-IL22, anti-IL12/23, eliminación/inhibición de IgE por SB011 (corta el ARNm de GATA-3), antagonista de DP2, antagonista de receptor de neuroquinina-1, reactivos antiinflamatorios no esteroides tópicos, tales como LEO32731 y GSK2894512, clonidina, naltrexona, antagonista de receptor de 5-HT2B y/o tratamientos antihistamínicos.

En otro aspecto, la presente exposición proporciona un método para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo y prurito; dicho método comprende administrar en un mamífero, tal como un ser humano, que necesita dicho tratamiento o la profilaxis de una cantidad eficaz de un ONcs tal como se ha definido anteriormente. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un ONcs tal como se ha definido anteriormente, junto con un portador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto preferente, la composición farmacéutica está adaptada para la utilización en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo, incluyendo el prurito.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un oligonucleótido de cadena sencilla (ONcs), en el que dicho ONcs comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 15 o í 6, con la condición de que el ONcs no presente la secuencia mostrada en SEC ID n° 2.

Preferentemente, dicho ONcs que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 15 o 16 presenta por lo menos una, más preferentemente dos, tres, cuatro o cinco de las características a continuación:

(a) la longitud de dicho ONcs es de entre 25 y 70 nucleótidos, más preferentemente de entre 25 y 35 nucleótidos, (b) o bien (i) por lo menos 90% (preferentemente 95% o 100%) de los enlaces internucleótidos en dicho ONcs son enlaces internucleótido fosforotioato, o bien (ii) dicho ONcs comprende por lo menos cuatro (preferentemente por lo menos cinco o seis) enlaces internucleótido fosforotioato y por lo menos cuatro (preferentemente por lo menos cinco o seis) modificaciones 2'-O-metilo, y

(c) dicho ONcs no contiene ningún motivo CpG,

(d) no más de 16 nucleótidos consecutivos en dichos ONcs son complementarios a cualquier secuencia de ARNm humano,

(e) dicho ONcs es no autocomplementario.

Preferentemente, dicho ONcs comprende una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 12, 13, 14 o 19. Más preferentemente, dicho ONcs que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 12, 13, 14, 15, 16 o 19.

Métodos experimentales

Síntesis de oligonudeótidos

Se sintetizaron oligonucleótidos sintéticos libres de endotoxinas según métodos conocidos de la técnica, tal como se da a conocer en, p.ej., Artificial DNA: Methods and Applications (Khudyakov, Y.E. & Howard A. Fields, H.A., editores) CRC Press, 2002 (ISBN 9780849314261). Los oligonucleótidos sintetizados no portan ningún grupo fosfato en el extremo 5'-terminal ni en el extremo 3'-terminal.

Reactivos

Se utilizó poli(I:C) (InvivoGen) de peso molecular elevado a una concentración de 25 pg/ml, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó lipopolisacárido (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) como control positivo para la maduración de las CD.

CD humanas derivadas in vitro

Los monocitos se seleccionaron negativamente a partir de capas leucocitarias utilizando el kit RosetteSep Monocyte Enrichment Kit™ (1 ml/10 ml de capa leucocitaria; StemCell Technologies) y se diferenciaron en CD, tal como se ha descrito anteriormente [8] a una densidad de 5x105 células/ml en medio RPMI 1640 completado con FCS al 10%, piruvato sódico 1 mM, HEPES 10 mM, L-glutamina 2 mM y estreptomicina al 1% y penicilina (todos de Invitrogen Life Technologies), con GM-CSF (250 ng/ml; PeproTech) e IL-4 (6,5 ng/ml, R&D Systems) durante 6 o 7 días. Las células se fenotiparon con anticuerpos contra CD14, CD1a (ambos de DakoCytomation), CD3 y CD19 (ambos de BD Biosciences). La maduración se evaluó 48 h después de la estimulación utilizando anticuerpos con diana en CD1a (DakoCytomation), CD80 y CD86 (ambos de BD Biosciences). Los datos de las muestras se adquirieron en un FACSCalibur™ o Fortessa™ (BD Biosciences); el análisis se llevó a cabo con software FlowJo™ (TreeStar).

Animales e inyecciones

Se alojaron macacos Cynomolgus adultos (Macaca fascicularis), importados de Mauricio, se alojaron en instalaciones de CEA (acreditación n° B 92-032-02) y se manipularon según directrices europeas para el cuidado NHP (Directiva de la UE n° 63/2010). El estudio fue aprobado por el comité regional para el cuidado y uso de animales (Comité Régional d'Ethique Ile de France Sud). Los animales, una vez sometidos a ensayo se encontró que eran seronegativos para varios patógenos (virus VIS, VHB, filovirus, sarampión y herpes B), fueron manipulados bajo sedación con una inyección intramuscular (i.m.) de 10 mg/kg de clorhidrato de quetamina (Imalgen) y 0,5 mg/kg de acepromazina (Vtranquil™, CEVA SANTE ANIMALE). Se llevaron a cabo inyecciones intradérmicas (i.d.), mediante una aguja de calibre 29, en el blanco izquierdo superior y derecho posterior con 170 |jg de poli(I:C) (InvivoGen), solo o con l70 |jg de ONcs (DNA Technology A/S) en 100 j l de PBS o con PBS solo. Alternativamente, se llevó a cabo un escalado de la dosis con ONcs tal como se indica en las leyendas de figura.

Recolección de tejidos de macaco y citometría de flujo

Las células se extrajeron de biopsias de piel frescas (8 mm de diámetro) recogidas de animales anestesiados 24 h después de la inyección. Los estudios anteriores en sujetos humanos revelan respuestas máximas a las 24 horas en la mayoría de individuos tras la inoculación de poli(I:C) [17]. Los análisis cinéticos del proteoma de CD derivadas de monocitos humanos estimulados con poli(I:C) presentados en la presente memoria mostraron respuestas máximas 8 a 24 horas después de la estimulación, sin detección de respuestas más tempranas. Las respuestas posteriores, medidas 48 horas después de la estimulación de CD humanas in vitro, muestran una producción de citoquinas disminuida. Conjuntamente, lo anterior constituyó el argumento para seleccionar el punto temporal de las 24 horas para las recolecciones de biopsias y análisis transcripcionales en los primates no humanos.

Se eliminó la grasa subcutánea y las biopsias recolectadas para los análisis de suspensiones celulares se incubaron en PBS que contenía 4 mg/ml de dispasa de grado II (Roche Diagnostic) y 100 jg/m l de penicilina/estreptomicina/neomicina (Life Technologies) durante la noche a 4°C y después durante una hora a 37°C con 5% de CO2. Se separaron las capas de epidermis y dermis; la dermis se cortó en trozos pequeños y las capas se incubaron durante 20 o 40 min, respectivamente, a 37°C bajo agitación en RPMI-1640 (Life Technologies) que contenía 2 mg/ml de colagenasa D, 0,02 mg/ml de ADNasa I (ambos de Roche Diagnostic), HEPES 10 mM (Life Technologies), suero de feto bovino al 5% (Lonza) y 100 jg/m l de penicilina/estreptomicina/neomicina. A continuación, las suspensiones celulares se filtraron a través de un filtro de 70 jm de tamaño de poro. Los residuos en el filtro se descartaron en el caso de la epidermis, mientras que los residuos dérmicos se disociaron mecánicamente con un disociador GentleMACDS™ (Miltenyi) y después se filtraron nuevamente. Los filtrados se centrifugaron a 1800 rpm durante 10 min antes de la incubación con el kit de tinción de células muertas LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit™ (Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante. La totalidad de las células epidérmicas y dérmicas aisladas se tiñó con una mezcla de anticuerpos monoclonales (mAb) y se adquirieron en un citómetro de flujo Fortessa™ (BD Biosciences). Se detectó el anticuerpo libre de fluorocromo con un anticuerpo secundario acoplado con un fluorocromo Alexa Fluor 700™ con el kit Zenon® (InvitroGen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los datos se analizaron con el software FlowJo™ (Tree Star, versión 9.6.4).

Ensayos de secreción de citoquinas

Con el fin de evaluar la producción de citoquinas y quimioquinas en biopsias de piel de macaco directamente ex vivo, se recogieron alícuotas de sobrenadantes de dermis filtrados y se midieron con el panel de perlas magnéticas de citoquinas MILLIPLEX MAP NHP Cytokine Magnetic Bead Panel™ (Millipore) en un dispositivo Bio-Plex™ (Bio-Rad), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los sobrenadantes de cultivo de CD humanas recogidos 24 horas después de la estimulación in vitro se midieron con análisis multiplex preparados al efecto, en un dispositivo MAGPIX™ (Bio-Rad).

Análisis de micromatrices

Se extrajo ARN total de piel a partir de biopsias de piel de macaco, se almacenaron durante por lo menos 24 h a 4°C en RNA Later, utilizando Tissue Ruptor®, seguido del kit RNeasy Plus Universal K it™ (QIAgen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recogió sangre de los macacos en tubos de ARN sanguíneo Tempus™ (Applied Biosystems) para el aislamiento de ARN de sangre completa en la línea base (día 0) y 24 h después de la administración de poli(I:C) o poli(I:C)/ONcs. Brevemente, se extrajo el ARN utilizando el kit de aislamiento de ARN mediante centrifugación Tempus™ (Applied Biosystems), siguiendo el protocolo del fabricante. Se comprobó la calidad del ARN total en un Agilent 2100 Bioanalyzer™. Se midió la cantidad de ARN utilizando el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000™. Se preparó ARNc marcado con cianina-3 (Cy3) a partir de 200 ng de ARN total utilizando el kit de marcaje Quick Amp Labeling Kit™ (Agilent) siguiendo las instrucciones del fabricante, seguido de la purificación en columna RNeasy™ (QIAGEN, Valencia, CA). La incorporación de pigmento y el rendimiento de ARNc se comprobó con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000™. Se fragmentaron 1,65 jg de ARNc marcado con Cy3 a 60°C durante 30 minutos en un volumen de reacción de 55 j l que contenía tampón de fragmentación 1x Agilent y agente de bloqueo 2x Agilent siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras completar la reacción de fragmentación, se añadieron 55 j l de tampón de hibridación 2x Agilent a la mezcla de fragmentación y se hibridó con micromatrices de expresión génica en el macaco Rhesus Agilent v2 durante 17 h a 65°C en un horno de hibridación Agilent rotatorio. Tras la hibridación, las micromatrices se lavaron durante 1 min a temperatura ambiente con tampón de lavado GE 1 (Agilent) y durante 1 min a 37°C con tampón de lavado GE 2 (Agilent). Los portaobjetos se escanearon inmediatamente tras el lavado en el escáner de micromatrices de ADN Agilent DNA Microarray Scanner™ (G2505C) utilizando una configuración de escaneo de un color para portaobjetos de matriz 4x44K (área de escaneo: 61x21,6 mm, resolución de escaneo: 5 pm, el canal de pigmento se fijó en verde, PMT se fijó en 100%). Las imágenes escaneadas se analizaron con software de extracción de características Feature Extraction Software10.7.3.1™ (Agilent) utilizando parámetros por defecto para obtener intensidades de señal procesadas de las que se había restado el fondo y suavizado las tendencias espaciales. Las señales se corrigieron para el fondo mediante el método RMA y se normalizaron en cuantiles. Antes de generar mapas térmicos, se aplicó la transformación log² en los datos de expresión génica.

Para los datos tanto de proteínas como de ARN, se hicieron corresponder los subgrupos de moléculas reguladas frente a genes relacionados con interferón conocidos [17] y frene a 84 genes clave relacionados con la transducción de señales mediada por NP-kB (matriz de PCR perfilador Rt 2 de ruta de señalización NF-kB humana, Qiagen.com). Análisis de rutas

Se utilizó el software Ingenuity Pathway Analysis™ (Ingenuity Systems) para identificar las rutas de señalización canónica reguladas por poli(I:C) únicamente o en combinación con ONcs. Para el cálculo de las significancias de enriquecimiento (prueba exacta de Fisher realizada en el software), los datos de referencia utilizados fueron las micromatrices de expresión génica en el macaco Rhesus Agilent v2.

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo con Prism 5.0™ (Graph-Pad Software Inc.) utilizando pruebas de Kruskal-Wallis no paramétricas para muestras no apareadas, seguido de pruebas a posterior de Dunn (*P<0,05, **P<0,01 y ***P<0,001) o ANOVA de un factor. En su caso, se compararon diferentes grupos de tratamiento utilizando pruebas no paramétricas de Mann-Whitney para muestras no apareadas.

Ejemplos

EJEMPLO 1: ONcs inhibe la maduración de las CD y las respuestas de citoquinas proinflamatorias in vitro.

Se ha demostrado que las CD inmaduras regulan positivamente las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86, así como el marcador de maduración CD83, tras la estimulación con el mimético de ARNdc poli(I:C) (fig. 1A). La maduración inducida por ARNdc resultó significativamente inhibida por la presencia del ONcs 35-mero denominado "35 PS no CpG" (Tabla II) (p<0,0001) (fig. 1A). El ONcs "35 PS no CpG" contenía modificaciones fosforotioato (PS) que se han utilizado para incrementar la semivida de los ONcs [18].

Se titularon los ONcs en CD derivadas de monocitos humanos utilizando poli(I:C) (fig. 1B). Se utilizó la citometría de flujo para medir la expresión de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86. Se utilizó el análisis Bio-Plex™ para cuantificar las citoquinas liberadas en los sobrenadantes. Poli(I:C) indujo una maduración significativa de las CD, tal como define la regulación positiva de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 (fig. 1B) y la liberación de citoquinas proinflamatorias (IL-6, IP-10 e IL-1 ra) (fig. 1C). Se produjo una inhibición dependiente de la dosis de la maduración de CD mediada por ARNdc y liberación de citoquinas proinflamatorias por el ONcs con una IC⁵⁰ de aproximadamente 0,2 pM.

EJEMPLO 2: la inyección intradérmica de ONcs modula la infiltración celular local en primates no humanos.

Con el fin de evaluar la inflamación local inducida tras la inyección intradérmica de poli(I:C) en macacos Cynomolgus, se recolectaron biopsias de la piel de los sitios de inyección veinticuatro horas después de la inyección. Se utilizó la citometría de flujo multicolar para fenotipar las células aisladas de las capas epidérmica y dérmica.

En la epidermis, se identificaron tres poblaciones principales de leucocitos. Las células de Langerhans (CL) expresaban CD45 y niveles elevados de HLA-DR, así como CD1a. Las células CD45⁺ que expresaban HLA-DR pero no CD1a se denominaron células presentadoras de antígeno (CPA). Las células polimorfonucleares (PMN), que incluían neutrófilos, eosinófilos y basófilos, se definieron a partir de su fenotipo CD45⁺ CD66⁺ [19]. Las PMN se encontraban mayoritariamente ausentes en el sitio de control de PBS. Sin embargo, se detectó un flujo de entrada significativo de PMN y CPA tras la inyección de poli(I:C) y se observó una clara tendencia a un número incrementado de CL (fig. 2A). Se produjo una infiltración significativa de PMN tras la inyección simultánea de ONcs y poli(I:C) (p<0,005) (fig. 2A, panel superior). Sin embargo, se observaron significativamente menos APC en la epidermis tras el tratamiento de poli(I:C)/ONcs en comparación con poli(I:C) solo (fig. 2A, panel intermedio) y se observó una tendencia similar para la población de CL (fig. 2A, panel inferior). La ONcs utilizada era "35 PS no CpG" (Tabla II).

En la dermis, se identificaron poblaciones de células inmunitarias adicionales a través de su expresión diferencial de cuatro marcadores de superficie complementarios (CD11c, CD163, CD123, CD14) (Zaba, L.C. et al., The Journal of Clinical Investigation 117:2517-2525, 2007; Klechevsky, E. et al., Immunity 29:497-510, 2008). Tal como se detectó en la epidermis, la inyección de poli(I:C) provocó una producción significativa de PMN que se fortaleció en presencia de ONcs (fig. 2B). Se detectaron dos poblaciones diferentes de PMN: una que expresaba niveles elevados de CD66 (fig. 2B, panel superior) y la otra que mostraba un nivel de expresión intermedio de CD66 (fig. 2B, panel inferior). Los macrófagos, definidos por la expresión CD45+ CD11clow HLA-DR+ CD14+, se encontraban prácticamente ausentes en las biopsias de control (inyección de PBS) y se acumulaban al administrar poli(I:C) solo, mientras que la adición de ONcs resultó en un flujo de entrada más bajo. Finalmente, las CD dérmicas CD1a+ y CD14+, definidos ambos subgrupos por la expresión adicional de CD45+ CD11c+ HLA-DR+, se recuperaron a partir de biopsias de control y aparentemente desaparecieron tras inyecciones intradérmicas de poli(I:C) o poli(I:C)/ONcs (fig. 2C). Resulta importante que la cantidad de células recolectada era dependiente del tratamiento debido a que se encontraron pocas o ninguna PMN CD45+ CD66+ en el sitio de control de PBS.

En resumen, las PMN se consideran una población de células inflamatorias típica. Por lo tanto, el fenotipo de los PMN infiltrantes tras la administración de ONcs sugeriría la atracción de "células inflamatorias" al sitio de inyección. En consecuencia, resultó inesperado que los ONcs, sin ningún motivo CpG, eran nulos para el sistema inmunitario o solo poseían firmas "antiinflamatorias".

EJEMPLO 3: perfilado transcripcional.

Con el fin de evaluar la respuesta innata global a poli(I:C) en presencia o en ausencia de ONcs, se llevó a cabo el perfilado transcripcional completo de muestras de sangre completa y biopsias de piel obtenidas de macacos tal como se indica en "Métodos experimentales". La mayoría de los 50 genes sensibles mejores (intervalo de FC 3,5 a 22, p<0,05) detectados en sangre veinticuatro horas después de la inyección intradérmica con poli(I:C) eran genes regulados por IFN o asociados a la activación de n F-kB, confirmando los patrones de respuesta anteriormente informados en sangre de sujetos humanos [17]. No se detectó una expresión diferencial significativa en sangre en el grupo que recibió poli(I:C) y ONcs ("35 PS no CpG", Tabla II) respecto a la línea base (15% de FDR).

Los perfiles de expresión de las biopsias de piel mostraron una inducción todavía más robusta y elevada de genes de respuesta inmunitaria innata, reflejando también el flujo de entrada de células. Muchos de los 50 genes inducidos principales en la piel eran, de manera similar, genes regulados por IFN con un intervalo de FC de 29 a 1870 con una FDR de 5% tras la inyección de poli(I:C) y un intervalo de FC de 28 a 929 con una FDR de 5% tras la coadministración de poli(I:C)/ONcs. A fin de conocer mejor qué genes resultaban diferencialmente regulados negativamente en la piel por la adición de ONcs, se calculó el factor de cambio (FC) entre el grupo de tratamiento que recibió la inyección intradérmica de poli(I:C) en combinación con ONcs y el grupo que recibió únicamente poli(I:C). Entre los genes regulados de arriba a abajo (FC negativa>2, p<0,05) tras la adición de ONcs (Tabla I) se incluyen las quimioquinas y los genes implicados en las condiciones inflamatorias.

Para detectar las firmas moleculares en un grupo de genes que se coexpresan o se coregulan, se llevó a cabo un análisis de rutas canónicas utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis™. Participaron varias rutas de inmunidad innata, tales como "Comunicación entre células inmunitarias innatas y adaptativas", "Interacción entre células dendríticas y células asesinas naturales" y "Señalización TREMI" e incluía la inducción de citoquinas proinflamatorias y la señalización de interferón, consistente con las firmas moleculares encontradas en el perfilado proteómico de las células dendríticas. Además, poli(I:C) estimuló la maduración de las CD en concordancia con los datos de citometría de flujo obtenidos.

Los 50 genes regulados principales tras la estimulación con poli(I:C) o poli(I:C)/ONcs se listan en mapas térmicos. A partir de la inspección de dichas listas, se puso de manifiesto que varias quimioquinas se inducían diferencialmente tras la adición de ONcs. El tratamiento de poli(I:C) resultó en una inducción significativa de Ccl5, Cxcl9, Cxcl10 (fig.

3A), así como de Cxcl11 y Ccl11 (fig. 3B), concordando con el reclutamiento de las células a la piel (ver el Ejemplo 2). La inducción de quimioquinas estaba modulada por ONcs, mostrando una expresión reducida de Ccl5, Cxcl9, Cxcl10, Cxcl11 y un incremento adicional de la expresión de Ccl11 [20], consistente con un flujo de entrada incrementado de PMN, en animales que recibieron el tratamiento combinado de Poli(I:C)/ONcs. Además, la inyección de ARNdc resultó en un incremento significativo de la expresión de Icam l, mientas que el tratamiento simultáneo con poli(I:C)/ONcs condujo a una menor expresión de Icam l (fig. 3B).

Otro grupo de genes entre los genes regulados principales son los receptores de transcrito similares a inmunoglobulina (RTI) [21, 22]. Los RTI se expresan a nivel elevado sobre monocitos, macrófagos y células dendríticas, en donde pueden inhibir las respuestas mediadas por TLR y modular las respuestas adaptativas [23-25]. ILT6 (también denominado LILRA3) se ha propuesto que es una proteína antiinflamatoria soluble que se encuentra regulada positivamente por IL-10 y regulada negativamente por TNF-a. Se muestra la expresión incrementada de Ilt5 e Ilt6 tras la inyección intradérmica de poli(I:C), así como una clara tendencia de una expresión todavía más elevada tras el tratamiento de poli(I:C)/ONcs (fig. 3C). Se detectó una regulación positiva similar tras el tratamiento de ONcs para Siglec 5, que es otro receptor inhibidor sobre fagocitos [26].

Se observó además que varios genes antimicrobianos mostraban una expresión relativamente más elevada tras el tratamiento combinado de poli(I:C) y ONcs en comparación con poli(I:C) solo, tal como alfa-defensina 1A (MNP1A) y demidefensina (RTDB1) (29). También la ectodisplasina A (EDA), perteneciente a la familia de TNF (30), mostró una expresión relativa más elevada tras el tratamiento combinado de poli(I:C) y ONcs, en comparación con poli(I:C) solo (fig. 3D).

En resumen, los análisis transcripcionales revelaron una firma inmunomoduladora inesperada compleja. La adición de ONcs resultó en la inhibición selectiva de respuestas proinflamatorias, tales como IL-6, IFN-gamma, CCL5, CXCL9, CXCL10 (también conocidos como IP-10) y CXCL11. Sin embargo, el tratamiento de ONcs en la piel indujo CCL11 y péptidos antibacterianos.

EJEMPLO 4: el ONcs reduce las citoquinas proinflamatorias inducidas por poli(I:C) e induce la secreción de IL-10. El análisis adicional de las moléculas listadas en la Tabla I mostró que Rax (el activador celular de proteína quinasa activada por ARN de doble cadena inducido por interferón, PKR), así como los genes implicados en condiciones inflamatorias, tales como Lrg1 y Lcn2 se redujeron significativamente tras el tratamiento de poli(I:C)/ONcs, añadiendo apoyo adicional a que ONcs media en la atenuación de la inflamación (fig. 4A). Poli(I:C) indujo citoquinas proinflamatorias, tales como IL-6, IFN-y y IL12p40 (fig. 4B). Sin embargo, la adición de ONcs ("PS 35 no CpG", Tabla II) atenuó la respuesta proinflamatoria, incluyendo IFN-y, que es conocido que regula muchas quimioquinas [27]. Con el fin de validar si la secreción de citoquinas era inducida en la piel, se recogieron alícuotas de sobrenadantes de dermis filtrados y, sin estimulación adicional in vitro, se analizaron mediante análisis Bio-Plex™ (fig. 5). Se detectó una inducción significativa (p<0,005) de Il-6 e IFN-y tras el tratamiento de poli(I:C). Se observó una clara tendencia a que la adición de ONcs redujese la producción de Il-6 e IFN-y y, por el contrario, provocase una liberación significativa de IL-10. Cabe destacar que ONcs solo pudo inducir una secreción de IL-10 dependiente de la dosis in vivo (fig. 5, panel derecho inferior).

En resumen, en los Ejemplos 1 a 4, el perfilado transcripcional de biopsias de piel reveló una atenuación dependiente de ONcs de las respuestas proinflamatorias inducidas por ARNdc en macacos. El patrón de citoquinas moduladas por ONcs se confirmó mediante análisis de las proteínas directamente ex vivo procedentes de biopsias de piel y reveló la inducción de IL-10 y la inhibición de la secreción de IL-6. Estos datos demuestran que el tratamiento con el ONcs puede atenuar la inflamación inducida por ARNdc en macacos. Además, los datos inesperadamente muestran inducción de Il-10 y los péptidos antibacterianos tras la administración de ONcs incluso sin ninguna inducción de inflamación.

EJEMPLO 5: introducción de enlaces no naturales y nucleósidos modificados en ONcs.

Tal como se muestra en el Ejemplo 1, el ONcs 35-mero denominado "PS 35 no CpG" (SEC ID n° 2, Tabla II) con un esqueleto fosforotioato (PS) totalmente sustituido, podía bloquear la maduración inducida por poli(I:C) de CD de una manera dependiente de la concentración. La maduración de las CD se monitorizó mediante la expresión de las moléculas coestimuladoras CD86 y CD80 (fig. 1B).

Aunque el ONcs totalmente sustituido con PS ("PS 35 no CpG") puede bloquear la maduración inducida por poli(I:C) de CD derivadas de monocitos humanos, el ONcs natural con un esqueleto de fosfato (PO) ("ADN 35 no CpG") perdió el efecto inhibidor (fig. 6). Se midió la eficacia de ONcs mediante monitorización de la expresión de los marcadores de diferenciación de las CD, CD86, CD83 y CD80.

Un ONcs 35-mero con tres enlaces PS en los extremos 3' y 5' ("3ePS") también carecía de efecto inhibidor, sugiriendo que el esqueleto de PS resulta esencial para retener el efecto de inhibición. Sin embargo, mediante la estabilización adicional del ONcs mediante introducción del análogo de ARN 2'-O-metilo (2'OMe) en las tres bases terminales ("3eOMe"), se restauró parcialmente el efecto inhibidor (fig. 6).

Un ONcs sustituido con PS en el que la totalidad de las bases de G se había sustituido por A ("GtA") sólo perdió ligeramente su eficacia, mostrando que la secuencia del ONcs totalmente sustituido con PS aparentemente no influía sobre la inhibición en un grado elevado (fig. 6).

En experimentos con diferentes ONcs 35-meros (0,2 j M, Tabla III), se demostró que los ONcs ricos en A y en T mostraban efectos de inhibición de los efectos inducidos por poli(I:C) (regulación positiva de las moléculas coestimuladoras CD86 y CD83), mientras que los PS-ONcs ricos en C y G no mostraron dichos efectos (fig. 7). Se investigaron los efectos inhibidores sobre las respuestas de poli(I:C) por los ONcs que resultan totalmente modificados por los grupos 2'-O-metilo (2'OMe). La 2'-O-metilación es una modificación de nucleósido común del ARN, en la que se añade un grupo metilo al grupo 2'-hidroxilo de la fracción ribosa de un nucleósido. Los ONcs presentaban un esqueleto fosforotioato ("PS 2'OMe no CpG", Tabla II) o un esqueleto fosfodiéster ("PO 2'OMe no CpG", Tabla II). Se demostró (fig. 8) que 2'OMe podía inhibir la maduración de las CD de la misma manera que el ADN en el caso de que el esqueleto del oligonucleótido se estabilizase con enlaces PS. Un esqueleto de PO nativo era menos estable y no se retenía el efecto inhibidor.

Se investigaron los efectos de cantidades crecientes de ADNdc complementario ("ADN 35 no CpG complementario", ver la Tabla II) sobre la maduración de las CD. Se demostró que el ADNdc (en contraste con los ONcs) no inhibía la maduración de las CD. Por el contrario, la adición de cadena de ADN complementaria (formación incrementada de ADNdc) redujo la inhibición inducida por ONcs de los efectos de poli(I:C) (fig. 9).

EJEMPLO 6: estructuras de oligonucleótido.

Los ONcs mostrados en la Tabla V se prepararon tal como se indica en, p.ej., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry (Wiley Online Library).

El efecto de inhibición aparentemente es independiente de la secuencia de ONcs. Al comparar tres secuencias de ONcs diferentes: ONcs PS 35 (SEC ID n° 2), ONcs PS GtA (SEC ID n° 3) y ONcs PS Compl. (SEC ID n° 5) (Tabla V), todas muestran el mismo efecto inhibidor tras 48 horas en CD derivadas de monocitos tratadas con poli(I:C) (fig. 10). ONcs GtA se basa en la secuencia parental ONcs 35 (SEC ID n° 2), aunque todas las bases de guanosina (G) han sido sustituidas por adenosina (A), mientras que el ONcs Compl. es la secuencia complementaria a ONcs 35. Los tres ONcs presentan 35 bases de longitud y presentan un esqueleto totalmente sustituido con PS. Además, una sustitución aleatoria de G por A en la posición 29 (SEC ID n° 19) mostró una inhibición similarmente eficaz de la expresión de CD80 y CD86 en las CD que el ONcs 35 parental (Se C ID n° 2) (fig. 11). Aunque de manera independiente a la secuencia, los presentes inventores inesperadamente revelaron un requisito dependiente de la longitud definido para la inhibición de la expresión de CD86 sobre las CD y la liberación de IL-6 (fig. 12). Los ONcs 30 y 25 más cortos (SEC ID n° 13 y 15) mostraban un efecto inhibidor similar al del ONsc 35 (SEC ID n° 2), mientras que se observó una eficacia reducida marcada utilizando ONcs 20 (SEC ID n° 17) o ONcs 15 (Se C ID n° 20).

EJEMPLO 7: modelo animal de prurito.

Las respuestas pruríticas o de picor son inducidas por la activación de receptores sensoriales expresados sobre aferentes primarios por la liberación de agentes inductores de picor. La capacidad de los ONcs de influir sobre el picor en modelos murinos que registran el número de episodios de rascado/h se evaluó utilizando una cámara digital. Por lo tanto, se midió tanto la intensidad como la duración del pico utilizando un observador ciego al tratamiento, utilizando la herramienta de software AniTracker™ versión 1.0 para el análisis del comportamiento animal en ciencias de la vida. Se evaluó el efecto de los ONcs sobre el picor histaminérgico/inducido por PLCp3 tras la inoculación intradérmica de: (a) histamina, (b) compuesto 48/80, un compuesto induce la liberación de histamina, y/o (c) a-5HT (también conocido como a-metilserotonina), que es conocido que son pruritogénicos.

Además, se evaluaron los efectos de los ONcs sobre el picor inducido por poli(I:C) y otro picor no histaminérgico inducido por: (a) endotelina-1, que induce picor en seres humanos y en modelos animales, (b) BAM(8-22) (péptido 8­ 22 de médula adrenal bovina, un producto de escisión proteolítica de la proencefalina A) que es un potente activador de los receptores acoplados a proteína G relacionados con Mas (Mrgprs), MrgprC11 y hMrgprX1, e induce el rascado en ratones de una manera dependiente de Mrgpr, (c) cloroquina, que es conocido que induce prurito, y/o (d) SLIGRL, un péptido agonista derivado del extremo N-terminal del receptor 2 activado por proteasa (PAR2) [14, 15].

Tabla I. Transcritos regulados de arriba a abajo en piel de macaco tras la adición de ONcs in vivo

Tabla II. Estructura de oligonucleótidos. Todas las secuencias se escriben de 5' a 3'. Los asteriscos (*) indican enlaces fosforotioato. Las letras subrayadas indican modificaciones 2'-O-metilribosa; todos los demás nucleótidos son desoxinucleótidos.

Tabla III. Estructura de oligonucleótidos. Todas las secuencias se escriben de 5' a 3'. Los asteriscos (*) indican enlaces fosforotioato. Todos los nucleótidos son desoxinucleótidos.

Tabla IV. Estructura de oligonucleótidos. Todas las secuencias se escriben de 5' a 3'. Todos los oligonucleótidos están totalmente fosforotioados y consisten en desoxinucleótidos

continuación

Tabla V: explicación de ONcs utilizados en el Ejemplo 6. Todos los oligonucleótidos están totalmente fosforotioados y consisten en desoxinucleótidos

REFERENCIAS

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3. Banchereau, J., and Steinman, R.M. 1998. Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392:245-252. 4. Nestle, F.O., Zheng, X.G., Thompson, C.B., Turka, L.A., and Nickoloff, B.J. 1993. Characterization of dermal dendritic cells obtained from normal human skin reveals phenotypic and functionally distinctive subsets. Journal of immunology 151:6535-6545.

5. Klechevsky, E., Morita, R., Liu, M., Cao, Y., Coquery, S., Thompson-Snipes, L., Briere, F., Chaussabel, D., Zurawski, G., Palucka, A.K., et al. 2008. Functional specializations of human epidermal Langerhans cells and CD14+ dermal dendritic cells. Immunity 29:497-510.

6. Mosser, D.M., and Zhang, X. 2008. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunological reviews 226:205-218.

7. An, H., Chandra, V., Piraino, B., Borges, L., Geczy, C., McNeil, H.P., Bryant, K., and Tedla, N. 2010. Soluble LILRA3, a potential natural antiinflammatory protein, is increased in patients with rheumatoid arthritis and is tightly regulated by interleukin 10, tumor necrosis factor-alpha, and interferon-gamma. The Journal of rheumatology 37:1596-1606.

8. Skold, A.E., Hasan, M., Vargas, L., Saidi, H., Bosquet, N., Le Grand, R., Smith, C.I., and Spetz, A.L. 2012. Singlestranded DNA oligonucleotides inhibit TLR3-mediated responses in human monocyte-derived dendritic cells and in vivo in cynomolgus macaques. Blood 120:768-777.

9. Saeki, H., Nakahara, T., Tanaka, A., Kabashima, K., Sugaya, M., Murota, H., Ebihara, T., Kataoka, Y., Aihara, M., Etoh, T., et al. 2016. Clinical Practice Guidelines for the Management of Atopic Dermatitis 2016. The Journal of dermatology.

10. Biedermann, T., Skabytska, Y., Kaesler, S., and Volz, T. 2015. Regulation of T Cell Immunity in Atopic Dermatitis by Microbes: The Yin and Yang of Cutaneous Inflammation. Frontiers in immunology 6:353.

11. Hamilton, J.D., Ungar, B., and Guttman-Yassky, E. 2015. Drug evaluation review: dupilumab in atopic dermatitis. Immunotherapy 7:1043-1058.

12. Saxena, A., Khosraviani, S., Noel, S., Mohan, D., Donner, T., and Hamad, A.R. 2015. Interleukin-10 paradox: A potent immunoregulatory cytokine that has been difficult to harness for immunotherapy. Cytokine 74:27-34. 13. Boniface, K., Lecron, J.C., Bernard, F.X., Dagregorio, G., Guillet, G., Nau, F., and Morel, F. 2005. Keratinocytes as targets for interleukin-10-related cytokines: a putative role in the pathogenesis of psoriasis. European cytokine network 16:309-319.

14. Rogoz, K., Andersen, H.H., Lagerstrom, M.C., and Kullander, K. 2014. Multimodal use of calcitonin gene-related peptide and substance P in itch and acute pain uncovered by the elimination of vesicular glutamate transporter 2 from transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 neurons. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience 34:14055-14068.

15. Rogoz, K., Aresh, B., Freitag, F.B., Pettersson, H., Magnusdottir, E.I., Larsson Ingwall, L., Haddadi Andersen, H., Franck, M.C., Nagaraja, C., Kullander, K., et al. 2016. Identification of a Neuronal Receptor Controlling Anaphylaxis. Cell reports 14:370-379.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Oligonucleótido de cadena sencilla (ONcs) para la utilización en el tratamiento o la profilaxis de un trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo, incluyendo el prurito,

   en el que:

   (a) la longitud de dicho ONcs es de entre 25 y 70 nucleótidos,

   (b) o bien (i) por lo menos 90% de los enlaces internucleótidos en dicho ONcs son enlaces internucleótido fosforotioato, o bien (ii) dicho ONcs comprende por lo menos cuatro enlaces internucleótido fosforotioato y por lo menos cuatro modificaciones 2'-O-metilo, y

   (c) dicho ONcs no contiene ningún motivo CpG.
2. 2. Oligonucleótido de cadena sencilla (ONcs), en el que dicho ONcs comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 15 o 16, con la condición de que el ONcs no sea la secuencia mostrada en SEC ID n° 2, y en el que:

   (a) la longitud de dicho ONcs es de entre 25 y 70 nucleótidos,

   (b) o bien (i) por lo menos 90% de los enlaces internucleótidos en dicho ONcs son enlaces internucleótido fosforotioato, o bien (ii) dicho ONcs comprende por lo menos cuatro enlaces internucleótido fosforotioato y por lo menos cuatro modificaciones 2'-O-metilo, y

   (c) dicho ONcs no contiene ningún motivo CpG.
3. 3. ONcs para la utilización según la reivindicación 1 o el ONcs según la reivindicación 2, en el que dicho ONcs comprende por lo menos seis enlaces internucleótido fosforotioato y por lo menos seis modificaciones 2'-O-metilo.
4. 4. ONcs para la utilización según la reivindicación 1 o 3, o el ONcs según la reivindicación 2 o 3, en el que todos los enlaces internucleótido en dicho ONcs son enlaces internucleótido fosforotioato.
5. 5. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 4, o el ONcs según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la longitud de dicho ONcs es de entre 25 y 35 nucleótidos.
6. 6. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 5, en el que no más de 16 nucleótidos consecutivos en dicho ONcs son complementarios a cualquier secuencia de ARNm humano y/o en el que dicho ONCs es no autocomplementario.
7. 7. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 6, o el ONcs según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que los monosacáridos en dicho ONcs se seleccionan del grupo que consiste en 2'-desoxirribosa y 2'-O-metilribosa.
8. 8. ONcs para la utilización según la reivindicación 7, en el que dicho ONcs comprende la secuencia mostrada en SEC ID n° 2, 12, 13, 14, 15, 16 o 19.
9. 9. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8, en el que dicho trastorno implica dermatitis y/o eccema, y es, por ejemplo, dermatitis atópica y/o en el que dicho trastorno implica prurito.
10. 10. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 9, en el que una infección está asociada a dicho trastorno de la piel y/o tejido subcutáneo.
11. 11. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 10, en el que dicho ONcs se utiliza en combinación con un agente antiinflamatorio o antiprurito.
12. 12. ONcs para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 11 en un sujeto humano.
13. 13. ONcs según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 y 7, en el que dicho ONcs presenta la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 12, 13, 14, 15, 16 o 19.
14. 14. ONcs según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, 7 y 13 para la utilización en terapia.
15. 15. Composición farmacéutica que comprende el ONcs según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, 7, 13 a 14, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.