ES2834732B2 - Solucion acuosa que comprende un complejo de inclusion, metodo de obtencion y su uso para aplicacion en cultivos y la mejora de su rendimiento - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

SOLUCIÓN ACUOSA QUE COMPRENDE UN COMPLEJO DE INCLUSIÓN, MÉTODO DE OBTENCIÓN Y SU USO PARA APLICACIÓN EN CULTIVOS Y LA MEJORA DE SU

RENDIMIENTO

Sector técnico de la invención

La invención que se presenta se encuadra en el ámbito de la Bioquímica y halla su aplicación en el sector agrícola. Específicamente, trata de un complejo de origen natural, que es un complejo binario formado por quitosano de alto peso molecular y uno o más compuestos biológicamente activos (CBA) aplicables en agricultura, y de origen natural que generalmente están presentes en los extractos de plantas.

Antecedentes de la invención

La Bioquímica es un campo de notable amplitud y en continuo progreso tecnológico, aplicable a las industrias farmacéutica, alimentaria, agrícola y cosmética, las cuales necesitan evolucionar para mejorar la eficacia de las sustancias aplicadas en el uso pretendido, proporcionando soluciones adaptadas a unas necesidades cada vez más exigentes. Cada campo de aplicación requiere unas condiciones concretas para poder utilizar dichas sustancias, y la primera de ellas es su toxicidad, ya que deben descartarse todas aquellas que pueden ser peligrosas para la salud en mayor o menor medida; algo que, por ejemplo, sucede con la mayoría de los aceites esenciales conocidos. En este sentido, las sustancias básicas, que son naturales, inocuas, de grado alimentario y que no están catalogadas como fitosanitarias, se configuran como las de uso más aceptable para este fin. Si se aceptan para un determinado uso (por ausencia de toxicidad), la eficacia de las sustancias activas depende principalmente de su biodisponibilidad.

Es bien sabido que la biodisponibilidad de los ingredientes activos mejora con la solubilidad, y disponer de soluciones sin turbidez es fundamental para aumentar la biodisponibilidad y aprovechamiento físico de los mismos. Dentro de las sustancias bioactivas aplicables en el campo de la agricultura, como son las de origen natural, existe un gran número de ellas que no son solubles en agua, o que lo son sólo parcialmente, por lo que no son eficaces en la práctica. Entre estas sustancias destacan una serie de compuestos fitoquímicos, presentes de forma natural en las plantas o sus derivados (por ejemplo, la harina), como son los polifenoles, terpenos y muy pocos aceites esenciales, quinonas y antraquinonas, flavonoides, proteínas, lignanos y otros, que tienen actividad antimicrobiana y cuya solubilidad es prácticamente nula y, por tanto, en su formulación normal, no son aprovechables en el interior de los organismos a los que se aplica, ya que su absorción ocurre de forma natural a través del agua. En estos casos, el concepto de biodisponibilidad es esencial para garantizar que el compuesto aplicado tenga un aprovechamiento por parte del organismo y sea útil para el fin pretendido.

Lamentablemente, la administración de muchos de los compuestos mencionados a menudo sufre de problemas de solubilidad y/o permeabilidad (Thanki, K., Gangwal, R.P., Sangamwar, A.T., Jain, S., 2013. Oral delivery of anticancer drugs: challenges and opportunities. J. Control. Release 170, 15-40). El desarrollo de nuevas técnicas de solubilización, encapsulación y vehiculación de estos CBAs aplicables en agricultura, a efectos de su conversión en biodisponibles, es uno de los caballos de batalla de la Química actual y encierra una gran aplicación futura. Las técnicas más conocidas para mejorar la biodisponibilidad de compuestos hidrófobos o parcialmente insolubles en agua son: la reducción del tamaño de partícula, la preparación de una dispersión sólida, el uso de surfactantes, y la formación de complejos de inclusión, emulsificación y encapsulación en liposomas.

En Química se conoce la figura de los complejos de inclusión como aquellos que son capaces de producir complejos anfitrión-huésped mediante la inclusión de moléculas hidrofóbicas. La complejación de diversos monómeros da lugar a cambios importantes de la solubilidad y facilita la misma mediante la formación de radicales libres en medio acuoso. En el diseño de vehículos de acomplejamiento de CBAs es muy importante seleccionar correctamente el material utilizado como agente acomplejante o matriz. Se debe tener en cuenta la forma de administración, la potencial toxicidad, la naturaleza del producto a ser incorporado, su dosis prevista, etc. A este respecto, en el estado de la técnica se ha documentado el uso de polímeros sintéticos y de polímeros naturales como vehículos de acomplejamiento. Sin embargo, la proclividad de los polímeros sintéticos a producir problemas de toxicidad los hace poco recomendables para su utilización, mientras que la alternativa de utilizar polímeros naturales, que no poseen estos inconvenientes, requiere, en cambio, el desarrollo de métodos de producción específicos más complicados y costosos.

Un conocido agente encapsulante es la ciclodextrina, que puede ser del tipo a (con un anillo de 6 glucosas), ¡3 (anillo de 7 glucosas) y y (8 glucosas). La ciclodextrina más soluble en agua es un derivado de la /3, denominado hidroxipropil betaciclodextrina. En ellas, el CBA se aloja en el interior del toroide formado por las glucosas, pero tiene como inconveniente la dificultad para hacer disponible dicho CBA y, de esta forma, convertirlo en activo. Existen numerosas patentes (por ejemplo, EP0422497B1) que describen este método, pero no se ha trasladado a la escala comercial por el inconveniente mencionado.

Otro conocido agente encapsulante, y relevante en el caso de la presente invención al tratarse de una sustancia básica aprobada bajo el artículo 23 del Reglamento (CE) n° 1107/2009, es el quitosano, también llamado chitosán. Este uso del compuesto no está muy desarrollado a nivel industrial aunque sí descrito en la literatura técnica En la actualidad se dispone en la bibliografía de técnicas de encapsulación de compuestos activos (CBAs) con biopolímeros o polielectrolitos de base quitosano-alginato. Sin embargo, en estos casos se precisan agentes entrecruzadores, como el tripolifosfato, para su formación, y el proceso de preparación requiere un tiempo prolongado. El uso de nanopartículas de quitosano para vehiculizar compuestos activos en el tratamiento de plantas frente a patógenos ha sido analizado en la literatura, véase Malerba, M. and Cerana, R. (2019 ): Recent applications of chitin- and chitosan-based polymers in plants; Polymers (Basel) 11(5): 839. Existen otros documentos que también han analizado el papel encapsulante del quitosano cuando se combina con compuestos biológicamente activos, como los aceites esenciales. Así, Kalagatur et al. (2018): Antifungal Activity of Chitosan Nanoparticles Encapsulated With Cymbopogon martinii Essential Oil on Plant Pathogenic Fungi Fusarium graminearum; Frontiers in pharmacology, 9: 610, describen un compuesto sólido formado por nanopartículas de quitosano con un peso molecular de 100.000 g/mol, que se combinan con un aceite esencial de Cymbopogon martinii, a modo de complejo formado por los grupos amino del quitosano y los grupos funcionales de los componentes del aceite (geraniol, limoneno...). Cabe recordar que el uso de estos aceites esenciales no está permitido en agricultura, ya que son citotóxicos. Otra referencia se encuentra en Khalili, S.T. et al. (2015): Encapsulation of Thyme essential oils in chitosan-benzoic acid nanogel with enhanced antimicrobial activity against Aspergillus flavus; LWT - Food Science and Technology, 60(1): 502-508, donde se divulga la formación de un complejo a partir de gel de quitosano y ácido benzoico con aceite esencial de Thymus vulgaris (estos dos últimos no permitidos en agricultura), mediante sonicación a 70 kHz. La obtención de geles de quitosano también se divulga en Hamdine, M. et al. (2005): Effect of organic and inorganic acids on concentrated chitosan Solutions and gels; Int J Biol Macromol. 2005 Nov 15; 37(3):134-42, aunque no de su acomplejamiento con otras sustancias.

El poder potenciador del quitosano en la solubilidad de los compuestos biológicamente activos ha sido analizado en la solicitud de patente española ES2718225B2 (Univ. Valladolid), de los mismos inventores, donde se emplean oligómeros de quitosano de bajo peso molecular y glucósidos de esteviol como agentes encapsulantes. Dicho complejo se forma por sonicación. Estos oligómeros son difíciles de fabricar, con el coste que conlleva, y requiere un paso previo de formación por hidrólisis enzimática, mientras que el uso del glucósido de esteviol en agricultura no está aprobado.

En definitiva, desde el punto de vista de la biosostenibilidad en la explotación de los cultivos agrícolas, el quitosano se perfila como una sustancia ventajosa, ya que no es quimioterápica (como sí lo son los fitosanitarios) pero consigue inducir las defensas de la planta; es considerada actualmente una sustancia básica para su uso en la agricultura, inocua y sin connotaciones fitosanitarias.

De lo tratado anteriormente, se deduce la necesidad de desarrollar sistemas de solubilización de CBAs que superen los inconvenientes mencionados, no sólo preservando la integridad de dichos compuestos bioactivos sino también vehiculizándolos, en especial para compuestos hidrofóbicos o parcialmente solubles en agua, y más en particular compuestos cuya biodisponibilidad entrañe dificultades, como es el caso de los polifenoles, terpenos, antraquinonas y en general, de los compuestos antioxidantes.

La presente invención trata de superar los inconvenientes planteados hasta el momento en el uso y aplicación de compuestos biológicamente activos para el tratamiento de cultivos en agricultura, a través de un nuevo preparado, un complejo formado por dos sustancias naturales (quitosano de alto peso molecular y al menos un compuesto bioactivo de solubilidad variable), en las proporciones que se establecen a continuación, que es totalmente soluble y capaz de ser diluido en agua de forma sucesiva, para ser aplicado de forma foliar o radicular. La ventaja de esta formulación radica en el uso exclusivo de polímeros naturales de carácter básico, sin la necesidad de emplear surfactantes.

Descripción de la invención

Un primer objeto de la invención es una solución acuosa de un complejo de inclusión que comprende: un quitosano con peso molecular comprendido entre 100.000 a 300.000 g/mol (es decir, alto peso molecular), como agente de vehiculización, y al menos un compuesto biológicamente activo (CBA) de aplicación en agricultura seleccionado dentro del grupo formado por: extracto de Equisetum arvense (Cola de caballo), extracto de Urtica spp (Ortiga), un aminoácido y cualquier combinación de los mismos. Ambos componentes, quitosano y CBA, se encuentran unidos entre sí por enlaces de hidrógeno y, en el caso concreto de los aminoácidos, adicionalmente por la formación de sales de amonio cuaternario entre un grupo amino (presente en la estructura molecular del quitosano) y un ácido carboxílico presente en los aminoácidos.

El complejo descrito, aparte de estar en una solución acuosa que es inocua, presenta una composición natural (sin polímeros sintéticos y sin necesidad de emplear surfactantes, como suele ser habitual en el estado de la técnica), siendo además los compuestos que lo forman reconocidos como generalmente seguros (GRAS), lo que favorece totalmente su empleo en el tratamiento de cultivos, al ser un complejo químico que respeta el medio ambiente y que no daña los ecosistemas al no incluir sustancias sintéticas o tóxicas. Además, al estar disueltos en solución acuosa, gracias a que se incrementa significativamente su solubilidad, están así totalmente disponibles para su aplicación.

Respecto al quitosano de alto peso molecular, cabe resaltar que se trata una molécula de gran tamaño, lo que, como se explica más adelante, juega un papel fundamental en la retención y protección de los CBAs seleccionados, y a la vez en el incremento de su biodisponibilidad.

En el ámbito de la presente invención, se denomina compuesto biológicamente activo o bioactivo (CBAs) a aquella sustancia química natural que se encuentra en las plantas, así como en los productos derivados de ellas (por ejemplo, en la harina, en el aceite...), en pequeñas cantidades, y que tienen un efecto (beneficioso o perjudicial) en los organismos vivos. Más concretamente, en el ámbito de la presente invención el término CBA se refiere a compuestos permitidos para su empleo en la agricultura, que como se ha mencionado son generalmente seguros (GRAS) y que están clasificados como sustancias básicas aprobadas bajo el artículo 23 del Reglamento (CE) n° 1107/2009 porque, básicamente, son inocuas, tienen grado alimentario y no están clasificados como compuestos fitosanitarios. Los CBAs habitualmente se definen por su actividad antimicrobiana pero, desde un punto de vista más amplio, se puede definir de la misma manera aquellos que actúan en el interior de las plantas como inductores de crecimiento o fortalecedores del sistema inmunitario, mediante la promoción de la producción de fitoalexinas. Pueden ser obtenidos de forma individual, aunque en muchos casos se encuentran en forma de extracto o aceite esencial, y se encuentran en combinación con otros, aunque el uso de la mayoría de estos aceites no está permitido en agricultura por su toxicidad (a excepción, por ejemplo, del aceite de cebolla o el aceite de girasol, clasificados como sustancias básicas). En el caso concreto de la presente invención el CBA de la presente invención, que cumple todas estas condiciones, se limita a tres casos concretos, por las propiedades observadas al acomplejarse con el quitosano de alto peso molecular: por un lado, los dos extractos, de Equisetum arvense (Cola de caballo) y Urtica spp (Ortiga), cuya composición se caracteriza por el alto contenido de fenoles y polifenoles (como son los flavonoides), y por otro, los aminoácidos, que pueden ser seleccionados dentro del grupo compuesto por: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido aspártico, Cisteína, Glutamina, Ácido glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina; y más preferentemente puede ser seleccionado entre Prolina y Glicina.

Los extractos de Equisetum arvense (Cola de caballo) y Urtica spp (Ortiga) contienen sustancias activas que son insolubles o parcialmente solubles en agua, por lo que la formación del complejo de inclusión con el quitosano, de acuerdo con la presente invención, es esencial para aumentar la biodisponibilidad de sus componentes, flavonoides (quercetina e isoquercitrina, kaempferol, galuteolina y equisetrina, entre los más importantes), polifenoles, aloína y ácido felúrico, entre los más importantes. Componentes minoritarios de estos extractos pero importantes para la invención son: trazas de alcaloides (nicotina, 3-metoxipiridina, equisetina, palustrinina y palustrina), taninos, fitosteroles (P-sitosterol, campesterol, isofucosterol), equisetonina (5%), saponina que por hidrolisis produce arabinosa, fructosa y equisetogenina; ácidos grasos (linoleico, linólico, y oleico), ácido aconitínico (ácido equisético), ácido benzoico, ácido málico, ácido gálico, ácido cítrico, ácido péctico, vitamina C, resina, articulina e isoarticulina (esporas), lignanos (ácido cafeico, ácidio ferúlico, dicafeoil-mesotartárico y p-cumarínico).

En una realización preferente del complejo, éste contiene una combinación de ambos CBAs, Equisetum arvense (Cola de caballo) y Urtica spp (Ortiga). Se ha comprobado el mejor efecto sinérgico con esta combinación del complejo en el crecimiento de la planta y la producción de su biomasa, como se muestra en los ejemplos.

La gran innovación de estos complejos y su ventaja en el mundo de la agricultura es que, al encontrarse en solución acuosa pueden aplicarse sobre un cultivo, obteniéndose resultados inesperadamente mejorados: su efecto sobre el crecimiento de las plantas y su capacidad de fortalecer el sistema inmune es muy superior al de los componentes por separado, existiendo sinergia entre ellos, habiendo sido constatado en una mayor producción de fitoalexinas y un aumento del crecimiento foliar y de los frutos de la planta. Este efecto sinérgico no se ha descrito hasta el momento y las pruebas realizadas en campo en diversos cultivos así lo atestiguan, tal como se expone aquí. Es decir, la ventaja no es sólo que se transforme el CBA en biodisponible, sino que al formarse un complejo con el quitosano de alto peso molecular y estar en solución acuosa, los efectos conseguidos al aplicarse a las plantas es mucho mayor de lo esperado. Además, otra ventaja muy importante del complejo es que sus propiedades y, por ende, sus efectos ventajosos no se ven alterados al diluirlo en grandes cantidades de agua, habiéndose también verificado la total solubilización de los CBAs en estas situaciones, lo que constituye un resultado muy ventajoso, dada la sencillez del procedimiento y los resultados obtenidos.

Como se ha dicho en el apartado anterior, muchos compuestos bioactivos son insolubles en agua, aunque por regla general presentan un grado de solubilidad en agua variable, desde insoluble a parcialmente soluble. En todos los casos de la presente invención, la solubilidad del CBA se ve significativamente mejorada en el complejo descrito, lo que incrementa también significativamente la biodisponibilidad de los componentes activos que comprenden los dos extractos descritos, como flavonoides y polifenoles, aloína y ácido felúrico, entre otros, que son insolubles en agua, y, además, activa los aminoácidos al protonarlos. En definitiva, la técnica propuesta en la presente invención para formación de la solución acuosa de los complejos incrementa la estabilidad acuosa y a la vez la solubilidad de estos CBAs con el fin de protegerlos y mantenerlos estables durante su almacenamiento, por un lado, y facilitar su administración, por otro, lo que favorece su aplicación y efectividad en el sector agrícola.

Se ha comprobado que los efectos ventajosos observados en el complejo descrito se fundamentan en las interacciones débiles que se producen por la formación de enlaces por puente de hidrógeno entre los grupos amino del quitosano de alto peso molecular con los CBAs cuando se mezclan (como se verá, por sonicación) y, adicionalmente, gracias a la formación de sales de amonio cuaternario entre un grupo amino y un ácido carboxílico, en el caso de los aminoácidos, lo que favorece su biodisponibilidad.

El enlace de hidrógeno, a pesar de ser una interacción débil, es una fuerza electrostática fuerte cuando muchas moléculas están unidas simultáneamente, lo que proporciona gran estabilidad al complejo, porque retiene el compuesto bioactivo (ver Figura 1), a la vez que permite su posterior dilución en grandes cantidades de agua. En la aparición de estos enlaces lo esencial es la acción de los ultrasonidos que se aplican, lo que se verá en uno de los puntos siguientes referidos al método de obtención del complejo; la presente invención se sustenta en el hecho de que la sonicación de la mezcla (aplicación directa de ultrasonidos en la solución que contiene ambos compuestos) es necesaria para que aparezca y se acelere la formación de estos enlaces de hidrógeno, ya que si no se aplican dichos ultrasonidos, no aparecen los enlaces o lo hacen de forma muy lenta, inviabilizando el proceso industrial que se describe en este informe. Se ha comprobado que las interacciones entre los complejos formados son más débiles que los mostrados con otros complejos como las ciclodextrinas, ya que el tamaño del complejo es superior, al ser el quitosano de alto peso molecular. La consecuencia de esta propiedad es que los bioproductos basados en complejos de quitosano como los aquí descritos presentan mayor capacidad de liberación de los CBA que los que pudieran obtenerse con ciclodextrinas como agente vehiculizante.

El nuevo complejo descrito tiene un efecto sinérgico en el crecimiento de cultivos, donde es fácilmente aplicable porque es soluble en agua aunque incorpore CBAs que en origen muestran incluso un grado de solubilidad nulo, y, lo que es más importante, la actividad del complejo es sinérgica, ya que los efectos de los compuestos bioactivos que forman parte del complejo es mayor que la de los compuestos por separado. Ante lo inesperado del resultado, se ha analizado la solución acuosa y se ha comprobado que este efecto sinérgico se puede deber a que se produce una protonación de los CBAs utilizados al combinarse con el quitosano de alto peso molecular (en la solución acuosa ligeramente ácida, pH desde 3,5 hasta 5). Al formarse el complejo y generarse un medio ácido, se produce una liberación de protones, de tal forma que los compuestos seleccionados, cola de caballo, ortiga y los aminoácidos aumentan su actividad como CBAs. En este caso, y esto es esencial en el caso de los aminoácidos, se verifica que el grupo amino de los mismos se encuentra protonado, es decir, no está en su forma habitual NH2 sino como NH3+. Esta es la clave para que los aminoácidos, que en su forma normal no actúan como CBAs, sí lo hagan en su forma protonada, activándose.

Preferentemente, la proporción en peso entre los componentes, quitosano de alto peso molecular y los CBAs enumerados, obedece a una relación seleccionada entre 1:1 y 2:1, aunque es más preferible ésta última por ser más económica, sin que por ello se vea alterado el resultado final. Es decir, dado que la solubilidad de los CBA se incrementa con la concentración de quitosano en peso, puede emplearse una relación 1:1 pero se recomienda como preferente en esta invención (o más económica) el empleo de la estequiometría (1 CBA : 2 Quitosano) para la formación de estructuras supramoleculares y en los que el CBA queda atrapado por interacciones moleculares débiles o de corto alcance con el grupo amino del polímero de quitosano. Si se incrementa la concentración de quitosano se puede incrementar la solubilización del CBA, pero ello también implica un mayor gasto económico sobre las concentraciones teóricas requeridas.

La solución acuosa del complejo puede presentar múltiples concentraciones del mismo sin que por ello tampoco se vea alterado el resultado. Así puede ser desde una solución acuosa concentrada (de al menos 75-100 gramos de complejo -50 gramos de quitosano por cada 25-50 gramos de CBA/litro de agua) a una solución acuosa diluida, es decir, cualquier dilución desde la concentración antes dada para 1 litro de solución acuosa, con 75-100 gramos de complejo -50 gramos de quitosano por cada 25-50 gramos de CBA, hasta un dilución de 1 litro de solución acuosa por cada 200 litros de agua.

También de manera preferida, la cantidad de quitosano de alto peso molecular en la solución acuosa es igual o inferior a 8% en peso con respecto al volumen total de la solución.

Un segundo objeto de la presente invención lo constituye un método para obtener la solución acuosa de los complejos descrita anteriormente, que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una solución acuosa que comprende el quitosano de peso molecular comprendido entre 100.000 y 300.000 g/mol y un ácido carboxílico;

b) aplicar ultrasonidos a la mezcla hasta formar un gel del quitosano, estable y homogéneo; y

c) añadir el al menos un CBA y aplicar ultrasonidos para formar el complejo en la solución acuosa.

El método esencial de preparación del complejo en solución acuosa se reduce a mezclar los componentes y llevar a cabo una simple agitación asistida por ultrasonidos mediante la introducción del cabezal de sonicación en la solución acuosa, para asegurarse de la formación del complejo y facilitar la solubilización de los CBA. Mediante procesos de sonicación (aplicación directa de ultrasonidos sobre la solución) en medio acuoso se obtienen en forma líquida nuevos bioproductos o macromoléculas, al generarse interacciones débiles por formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos amino presentes en el quitosano con los CBA y por ende, de sales de amonio cuaternarias. Esto permite su posterior dilución en grandes cantidades de agua, que es también un objetivo de la presente invención. En este momento, el CBA se encuentra completamente solubilizado.

El proceso se lleva a cabo en dos etapas, y el ácido carboxílico es necesario en la primera de ellas para conseguir la formación del gel de quitosano antes de mezclarlo con el CBA, ya que se debe bajar el pH para que se produzca la solubilización del quitosano en agua; el pH del gel que se forma se encuentra así en torno a 4, esto es, particularmente entre 3,5 y 5.

A continuación se representa la estructura química del gel de quitosano formado con el ácido carboxílico, que es ácido cítrico. Se representan las moléculas con las cargas electrostáticas, formando las sales de amonio cuaternario:

A continuación se muestra la estructura química de diferentes complejos de inclusión obtenidos en la solución acuosa en la presente invención:

- Complejo de quitosano con la aloína, un glicósido antraquinónico que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como compuesto biológicamente activo en la presente invención:

- Complejo de quitosano con ácido felúrico, un ácido hidroxicinámico que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como

- Complejo de quitosano con ácido gálico, que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como compuesto biológicamente

- Complejo de quitosano con kaempferol, que es uno de los componentes de los extractos de cola de caballo y de ortiga que se emplean como compuesto biológicamente activo en la presente invención:

- Complejo de quitosano con el aminoácido histidina como compuesto biológicamente activo:

- Complejo de quitosano con el aminoácido tirosina como compuesto biológicamente activo:

- Complejo de quitosano con el aminoácido cisteína como compuesto biológicamente activo:

- Complejo de quitosano con el aminoácido glicina como compuesto biológicamente activo:

- Complejo de quitosano con el aminoácido arginina como compuesto biológicamente activo:

- Complejo de quitosano con el aminoácido prolina como compuesto biológicamente activo, unido a dos cadenas diferentes de quitosano de alto peso molecular, y en dos posiciones diferentes:

La solubilidad y caracterización de los CBAs se han estudiado con un espectrofotómetro de UV-VIS y/o un cromatógrafo-masas HPLC- Masas, y se ha verificado que, de forma sorprendente e inesperada, la solubilidad en agua de los CBAs, incluso en el caso de aquellos que originalmente son insolubles, se mantiene incluso en diluciones consecutivas (de hasta 1 litro de solución acuosa del complejo por 100 litros de agua). Este inesperado resultado es clave para la aplicación del producto en el tratamiento del cultivo, al formularse un producto concentrado y poder comercializarse así, de tal forma que en su aplicación los agricultores puedan diluir 1 litro del complejo en forma acuosa en al menos 100 litros de agua.

Preferentemente, la proporción en peso en la mezcla de quitosano y ácido carboxílico es de 1:1 (por ejemplo, 50 gramos de quitosano con 50 gramos del ácido carboxílico en un litro de agua).

También preferentemente, el ácido carboxílico puede ser seleccionado dentro del grupo compuesto por ácido cítrico, ácido acético y ácido propiónico.

Aunque no es determinante para la preparación de la solución acuosa del complejo, de forma preferida las etapas a) y b) para formar el gel estable de quitosano se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 50-70°C, más preferentemente aún a 60°C.

En una realización preferida de la etapa c), la proporción en peso en la mezcla de quitosano y CBA se selecciona entre 1:1 y 2:1 (por ejemplo, 50 gramos de quitosano por 50 gramos de CBA, o 50 gramos de quitosano por 25 gramos de CBA en 1 litro de agua), para conseguir solubilizar el CBA al formarse las estructuras supramoleculares, quedando el CBA atrapado por interacciones moleculares débiles o de corto alcance con el grupo amino del polímero de quitosano. Como se ha dicho anteriormente, es más preferible aún la relación estequiométrica 2:1, al conseguirse el mismo resultado pero de forma más económica. La mezcla puede incluir más de un CBA, de tal forma que entre ellos en conjunto mantengan la proporción antes definida.

También de manera preferida, la cantidad de quitosano en agua es igual o inferior al 8% en peso del total del volumen de la solución.

Preferentemente, en las etapas b) y c), la mezcla por sonicación, es decir, aplicación directa de ultrasonidos en la solución, se lleva a cabo a 20 kHZ, primero para formar el gel de quitosano y después para favorecer la formación del complejo, solubilizando el CBA. Las mezclas preparadas son dispersadas por sonicación directa con un cabezal de ultrasonidos, durante un tiempo comprendido preferentemente entre 3 y 10 min en la etapa b) y entre 5 y 15 min en la etapa c), suficiente para formar las interacciones intermoleculares débiles por enlaces de hidrógeno y la formación de sales de amonio cuaternario. Más preferentemente, se aplican los ultrasonidos durante 10 minutos en cada una de las etapas b) y c).

De manera preferida, el método antes descrito comprende diluir en agua el complejo obtenido en solución acuosa, en una o varias diluciones sucesivas, en una proporción comprendida entre 1:1 (1 litro de solución acuosa del complejo -que contiene 50 gramos de quitosano por cada 25-50 gramos de CBA- por 1 litro de agua) hasta 1:100 (1 litro de solución acuosa del complejo por 200 litros de agua).

Es un tercer objeto de la presente invención el uso de la solución acuosa del complejo que se define anteriormente, como estimulador del crecimiento vegetal, es decir, para potenciar el crecimiento de las plantas (incremento de la producción de biomasa). Su aplicación en el campo de la agricultura se antoja muy relevante, como prueban los resultados de los experimentos llevados cabo con la invención.

Se ha comprobado que al aplicar la solución del complejo en un cultivo, se incrementa de manera significativa su producción, principalmente gracias a que incrementa la solubilidad y biodisponibilidad en el agua de los compuestos bioactivos que contiene, no sólo de los no solubles, sino también de aquellos que son parcialmente solubles en dicho medio. De hecho, el complejo de la presente invención presenta una actividad mayor que la obtenida de utilizarse los componentes por separado, existiendo sinergia entre los componentes. Una ventaja de este complejo en solución acuosa es que no precisa de la incorporación de emulsionantes o surfactantes para mejorar su solubilidad y biodisponibilidad, como suele ocurrir en el arte previo. Además, dicha biodisponibilidad no se ve afectada cuando se realizan, a partir del preparado concentrado del complejo, diluciones consecutivas que permiten su uso en la Agricultura, mediante aplicación foliar o radicular.

Por último, otro objeto de la invención es el uso de la solución acuosa del complejo que se ha definido para prevenir y tratar enfermedades patógenas en plantas. El tipo de patógenos cuyo crecimiento se previene en las plantas con el uso de la solución acuosa objeto de la invención es muy diverso y amplio. En un caso preferido, el complejo se usa para prevenir bacterias gran negativas. En otro caso preferido, la solución acuosa del complejo se usa para prevenir el crecimiento de hongos, tan diversos en su género como son los causantes de la yesca de la vid, que originan la pudrición de la madera, o el hongo Fusarium culmorum. En estos casos particulares, es más preferido que el CBA del complejo sea la prolina, un aminoácido insoluble en agua que, al estar formando parte del complejo, presenta una alta biodisponibilidad.

Ambos usos comprenden preferentemente aplicar una disolución acuosa del complejo descrito sobre el cultivo, mediante pulverización (foliar) o en el suelo (radicular), aunque la aplicación foliar es siempre preferida porque la eficacia y absorción por parte de la planta es siempre mayor. Por cuestiones prácticas y económicas, el uso implica preferentemente la aplicación de una solución del complejo muy diluida, de 1 litro de solución acuosa del complejo por 50, 100 o hasta 200 litros de agua, aunque lógicamente, como el efecto no se ve alterado por el volumen de disolución, puede aplicarse en cualquiera de las concentraciones protegidas en esta memoria.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Parcela de experimentación correspondiente al Ejemplo 2, en las inmediaciones de Veguellina de Órbigo (León). Se delimitan 3 zonas: control donde no se aplica tratamiento, y las correspondientes parcelas de aplicación 1 y 2.

Figura 2: Fotografías tomadas de plantas de alubia recolectadas en cada una de las parcelas de análisis: a) Parcela 1; b) Parcela 2; y c) Parcela control.

Figura 3: Fotografías de placas Petri con resultados de la aplicación de una solución acuosa del complejo con aminoácidos como CBA. En concreto se han testado los complejos de quitosano con Arginina y Tirosina en dos cepas de hongos diferentes: Diplodia seriata y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Minima Inhibitoria (MIC).

Figura 4: Fotografías de placas Petri con resultados de la aplicación de una solución acuosa del complejo con aminoácidos como CBA. En concreto se han testado los complejos de quitosano con Glicina e Histidina en las mismas cepas de hongos que en la Figura 3: Diplodia seriata y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Minima Inhibitoria (MIC).

Figura 5: Fotografías de placas Petri con resultados de la aplicación de una solución acuosa del complejo, formado a partir de un gel de quitosano y ácido cítrico con diferentes aminoácidos como CBA (arginina, glicina, prolina, histidina y tirosina), para prevenir y tratar el crecimiento de dos hongos: Diplodia seriata y Fusarium culmorum. Aquí se exponen resultados de diferentes mezclas, incluso utilizando glicerina en lugar de quitosano como agente vehiculizante, con prolina y ácido cítrico, y se evaluó su comportamiento en el crecimiento de los hongos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Métodos de obtención y caracterización de una solución acuosa del complejo descrito en la presente invención, con Urtica spp. como CBA y con una combinación de Equisetum arvense y Urtica spp como CBA.

1.1 Primer procedimiento de obtención

En 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido cítrico y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra desde 3,5 a 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y una vez estabilizado el gel, se añaden de 25 a 50 gramos de extracto de Equisetum arvense y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado. Para ser aplicado foliar o radicularmente, cada litro de la solución descrita en este ejemplo de realización debe ser disuelta al menos en 100 litros de agua hasta 200 litros de agua.

1.2. Segundo procedimiento de obtención

En 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido acético y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra entre 3,5 a 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y estabilizado el gel, se añaden de 25 a 50 gramos de extracto de Urtica spp y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado. Para ser aplicado foliar o radicularmente, cada litro de la solución descrita en este ejemplo de realización debe ser disuelta al menos en 100 litros de agua hasta 200 litros de agua.

1.3. Tercer procedimiento de obtención

En 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido propiónico y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra en un valor comprendido ente 3,5 hasta 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y estabilizado el gel, se añaden de 15 a 25 gramos de extracto de Urtica spp y la misma cantidad en peso de extracto de Equisetum arvense y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado. Para ser aplicado foliar o radicularmente, cada litro de la solución descrita en este ejemplo de realización debe ser disuelta al menos en 100 litros de agua hasta 200 litros de agua.

En las tres realizaciones se observa que para la formación del gel de quitosano se pueden usar diferentes ácidos carboxílicos, ya que se busca bajar el pH de forma que se produzca la solubilización del quitosano en agua.

Ejemplo 2: Uso de las soluciones acuosas del complejo descritas en el Ejemplo 1 para potenciar el crecimiento vegetal

Se han llevado a cabo estudios experimentales con las soluciones acuosas de los complejos descritos en el ejemplo anterior (que contienen como CBA, Urtica spp. En un primer caso y una combinación de Equisetum arvense y Urtica spp en un segundo caso,) en parcelas con cultivo de alubia y lúpulo, diferenciando entre:

- una parcela control,

- una parcela de aplicación 1, donde el complejo de la solución acuosa comprende quitosano y Urtica spp.; y

- una parcela de aplicación 2, donde el complejo de la solución acuosa comprende quitosano, Equisetum arvense y Urtica spp.

Estas parcelas se muestran en la Figura 1. La aplicación de la solución acuosa en los cultivos fue foliar.

Al analizar la producción de biomasa, medida en número de hojas y número de frutos en las plantas de alubia recolectadas en cada una de las parcelas de análisis tras los diferentes tratamientos (sin tratamiento -control-; complejo conteniendo Urtica spp. -parcela de aplicación 1-; y complejo conteniendo Equisetum arvense y Urtica spp. -parcela de aplicación 2-) se obtuvieron los siguientes resultados:

* En el presente estudio, se considera una vaina válida aquella que presenta más de 3 granos.

El análisis comparativo de estos resultados muestran un incremento significativo del 17% en hojas y del 25% en las vainas de la planta en la parcela de aplicación 1 con respecto a la parcela control, y un incremento significativo del 45% en la producción de hojas y del 50% de incremento en la producción de vainas en la parcela de aplicación 2 con respecto a la parcela control. Estos resultados muestran así un efecto sinérgico entre los componentes del complejo en su efecto de favorecer el crecimiento de las plantas.

Ejemplo 3: Uso de las soluciones acuosas del complejo descritas en el Ejemplo 1 Para prevenir enfermedades patógenas

En las parcelas anteriores se comprobó no sólo un mayor crecimiento vegetal, sino que por casualidad se observó una resistencia significativamente mayor frente a patógenos. Así, durante el experimento, las parcelas sufrieron un ataque fuerte de Oídio. Ante esta situación, tras la recolecta, se vio que las parcelas en las que el cultivo fue tratado con el complejo de la presente invención, en sus dos variantes de aplicación aquí, estaban limpias de Oídio, no así en la parcela control.

Ejemplo 4: Obtención de una solución acuosa del complejo descrito en la presente invención, con aminoácidos.

Se procedió a la preparación de soluciones acuosas siguiendo la misma metodología que en el Ejemplo 1, pero donde el CBA era un aminoácido: en 1 litro de agua caliente a 60°C se introducen 50 gramos de ácido cítrico y la misma cantidad de quitosano, se introduce el cabezal de ultrasonidos (20 kH) de alta potencia y se forma el gel de quitosano correspondiente, de forma que el pH de este gel se encuentra desde 3,5 a 5. Una vez disuelto todo el quitosano, de forma que no aparezcan grumos y una vez estabilizado el gel, se añaden de 25 a 50 gramos de arginina y se aplica al menos durante 10 minutos el cabezal de ultrasonidos. En este momento se verifica la solubilización total en el gel de quitosano del extracto comentado.

Este mismo protocolo se aplicó para obtener soluciones acuosas del complejo formado por quitosano y otros aminoácidos, concretamente: glicina, prolina, histidina y tirosina.

Ejemplo 5: Aplicación de las soluciones acuosas con aminoácidos como CBAs según en Ejemplo 4, cuyos resultados son mostrados en las figuras 3-5.

5.1. Soluciones acuosas de complejos de quitosano con arginina y con tirosina (por separado) como CBA

En un primer experimento, se han testado los complejos de quitosano con Arginina y Tirosina en dos cepas de hongos de género muy diferente: Diplodia seriata, causante de la yesca de la vid, y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Minima Inhibitoria (MIC).

Concretamente, de cada una de las dos soluciones acuosas con Arginina y con Tirosina preparadas en el Ejemplo 4, se extrajo por pipeta 1 gramo en peso, y se diluyó en tres volúmenes diferentes de agua: 10 ml, 25 ml y 50 ml. Posteriormente, se extrajo 5 ml de cada dilución y se añadió a otras tantas placas Petri que contenían 15 ml de medio de crecimiento PDA (pectonas y glicósidos) y se mezcló homogéneamente. De las dos placas Petri donde se han cultivado los hongos Diplodia seriata y Fusarium culmorum, se extrajeron muestras de los mismos y se añadieron a las placas con la solución acuosa.

Los resultados se muestran en las Figuras 3. Se observó que la MIC es de 120 ppm para los dos casos estudiados.

5.2. Soluciones acuosas de complejos de quitosano con glicina y con tirosina (por separado) como CBA

En un segundo experimento, se han testado las soluciones acuosas de complejos de quitosano con Glicina e Histidina en las mismas cepas de hongos que en el experimento anterior: Diplodia seriata y Fusarium culmorum. Se utilizaron diversas concentraciones del complejo (desde 100 ppm hasta 500 ppm del mismo) en un medio de crecimiento de los hongos (PDA), para determinar la Cantidad Mínima Inhibitoria (MIC).

La metodología de preparación del experimento, así como los resultados (mostrados en la Figura 4), se repitieron: se observó que la MIC es de 120 ppm para los dos casos estudiados.

5.3. Soluciones acuosas de complejos de quitosano con arginina, glicina, prolina, histidina y tirosina (por separado) como CBA

Los experimentos 5.1 y 5.2 se repitieron exactamente igual, pero ahora con cada una de las cinco soluciones obtenidas en el Ejemplo 4, donde cada una de ellas se definía por un CBA diferente que era uno de los aminoácidos seleccionado de: arginina, glicina, prolina, histidina y tirosina.

Los resultados, mostrados en la figura 5, se volvieron a repetir: se observó que la MIC es de 120 ppm para los dos casos estudiados.

Para contrastar y confirmar el efecto ventajoso de las composiciones objeto de la presente invención y su efecto sinérgico, se preparó una solución acuosa con los complejos de CBAs, pero donde el agente vehiculizante era glicerina, no el quitosano. Esto nor permitió confirmar el efecto del quitosano. Así, se confirmó que una composición a base de glicerina y prolina no funcionó frente a los patógenos. Se preparó también otra composición, siguiendo la misma metodología que antes se ha descrito, pero con prolina, glicerina y ácido cítrico. Esta composición mejoró los resultados frente a la anterior (sin ácido cítrico), pero no llegó a alcanzar los mismo resultados de MIC que con las soluciones de la presente invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Una solución acuosa de un complejo de inclusión que comprende: un quitosano con peso molecular comprendido entre 100.000 a 300.000 g/mol, como agente de vehiculización, y al menos un compuesto biológicamente activo de aplicación en agricultura seleccionado dentro del grupo formado por: extracto de Equisetum arvense, extracto de Urtica spp, un aminácido y cualquier combinación de los mismos; donde el quitosano y el compuesto biológicamente activo se encuentran unidos entre sí por enlaces de hidrógeno y, en el caso de los aminoácidos, también por la formación de sales de amonio cuaternario entre un grupo amino presente en la estructura molecular del quitosano y un ácido carboxílico presente en dicho aminoácido.

2. La solución acuosa del complejo según la reivindicación anterior, donde el aminoácido es seleccionado dentro del grupo compuesto por: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido aspártico, Cisteína, Glutamina, Ácido glutámico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Usina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Treonina, Triptófano, Tirosina y Valina.

3. La solución acuosa del complejo según la reivindicación anterior, donde el aminoácido es seleccionado entre Prolina y Glicina.

4. La solución acuosa del complejo según la reivindicación 1, donde el compuesto biológicamente activo es una combinación de Equisetum arvense y Urtica spp.

5. La solución acuosa del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proporción en peso entre el quitosano de alto peso molecular y el compuesto biológicamente activo presenta una relación seleccionada entre 1:1 y 2:1.

6. La solución acuosa del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que presenta una concentración de complejo desde 75 g-100 g de complejo por 1 litro de agua, donde se mantiene una proporción 1:1 a 2:1 del quitosano y el complejo biológicamente activo, hasta una concentración de 75 g-100 g de complejo por 200 litro de agua.

7. La solución acuosa del complejo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la cantidad de quitosano de alto peso molecular en la solución acuosa es igual o inferior a 8% en peso con respecto al volumen total de la solución.

8. Un método para obtener la solución acuosa de los complejos definidos en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende las siguientes etapas:

a) preparar una solución acuosa que comprende el quitosano de peso molecular comprendido entre 100.000 y 300.000 g/mol y un ácido carboxílico;

b) aplicar ultrasonidos a la mezcla hasta formar un gel del quitosano estable y homogéneo; y

c) añadir el al menos un CBA y aplicar ultrasonidos para formar el complejo en la solución acuosa.

9. El método según la reivindicación anterior, donde la proporción en peso en la mezcla de quitosano y ácido carboxílico es de 1:1.

10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, donde el ácido carboxílico es seleccionado dentro del grupo compuesto por ácido cítrico, ácido acético y ácido propiónico.

11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde las etapas a) y b) para formar el gel estable de quitosano se llevan a cabo a una temperatura comprendida entre 50-70°C.

12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la proporción en peso en la mezcla de quitosano y el compuesto biológicamente activo se selecciona entre 1:1 y 2:1.

13. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde la cantidad de quitosano en agua es igual o inferior al 8% en peso del total del volumen de la solución.

14. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde, en las etapas b) y c), la mezcla por sonicación se lleva a cabo a 20 kHZ.

15. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, donde la sonicación se aplica durante un tiempo comprendido entre 3 y 10 min en la etapa b) y entre 5 y 15 min en la etapa c).

16. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, que comprende diluir en agua el complejo obtenido en solución acuosa, en una o varias diluciones sucesivas, en una proporción comprendida entre 1 litro de solución acuosa/1 litro de agua y hasta 1 litro de solución acuosa/200 litros de agua.

17. Uso de la solución acuosa definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, como estimulador del crecimiento vegetal para potenciar el incremento de la producción de biomasa.

18. Uso de la solución acuosa definida en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para prevenir enfermedades patógenas en plantas.

19. El uso según la reivindicación 18, donde el patógeno es seleccionado entre un hongo y una bacteria gran negativa.

20. El uso según la reivindicación 19 donde el patógeno es un hongo causante de la yesca de la vid.

21. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, donde la solución acuosa del complejo se aplica mediante pulverización sobre la planta o mediante aplicación en el suelo.