ES2827849B2 - Celulas madre de la decidua parietalis de la placenta para su uso en la incontinencia urinaria de esfuerzo cronica - Google Patents

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre de la decidua parietalis de la placenta para su uso en la incontinencia urinaria de esfuerzo crónica

La presente invención se refiere a células madre de la decidua parietalis de placenta para su uso en el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo crónica. Dicho método es útil en la regeneración del tejido de sostén que rodea a la uretra, que, por ejemplo, se daña tras embarazo o parto, por lo que es útil en el campo de la medicina.

Estado de la técnica

La incontinencia urinaria (IU) es la pérdida involuntaria de orina. Existen varios tipos de IU, entre los que se encuentra la IU de esfuerzo o de estrés (IUE) asociada a un esfuerzo que provoca un aumento de la presión abdominal (por ejemplo, toser, estornudar, reír, correr o incluso andar). Se estima que, en aproximadamente el 50% de las mujeres con incontinencia urinaria, su síntoma principal es la IUE (Deng DM 2011 Med. Clin. N. Am. 95:101-109).

La IUE se debe a una deficiencia esfinteriana e hipermovilidad uretral debida a un soporte insuficiente de la musculatura pélvica y del tejido conectivo que rodea a la uretra y el cuello vesical, que afecta tanto a mujeres como a hombres. La IUE es más frecuente en mujeres y aumenta con la edad, la falta de estrógenos, la obesidad y los partos múltiples. En mujeres que han tenido hijos el mecanismo que da lugar a la incontinencia suele ser la hiperdistensión de los tejidos del suelo pélvico durante el embarazo y parto, principalmente durante este último, debido sobre todo al paso de la cabeza fetal (Deng DM 2011 Med. Clin. N. Am. 95:101-109). En hombres se dan casos de IUE tras cirugía de próstata o radiaciones (Juarranz M et al. Aten. Primaria 200230(5):323-332).

La calidad de vida de los pacientes con IUE se ve comprometida. Entre los tratamientos de la IUE se encuentra, por ejemplo, métodos no invasivos como ejercicios de fortalecimiento del suelo pélvico (es decir, rehabilitación del suelo pélvico, por ejemplo, ejercicios de Kegel, fisioterapia), tratamiento farmacológico (por ejemplo, agonistas alfa-adrenérgicos, duloxetina) y tratamientos invasivos como la inyección de agentes de relleno (por ejemplo, politetrafluoroetileno, colágeno bovino o partículas de silicona) y cirugía (por ejemplo, bandas suburetrales). Los métodos que se usan habitualmente frente a la IUE no corrigen la incontinencia de forma permanente. Además, la eficacia de las técnicas no invasivas, como en el caso de los ejercicios de fortalecimiento del suelo pélvico, depende de la motivación del paciente y del cumplimiento de las mismas por parte del paciente. En el caso de los tratamientos farmacológicos, la eficacia depende de la tolerancia a los efectos secundarios. Si no se resuelven los casos de IUE tempranos, estos tienden a cronificarse. En los casos crónicos es la cirugía el método que se usa habitualmente, sin embargo, esta técnica invasiva, suele provocar complicaciones, por ejemplo, adherencias, y generalmente fracasa en un plazo de pocos años por lo que los pacientes se deben someter a cirugías posteriores, que no suelen tener un alto porcentaje de éxito (Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (SEGO). Diagnóstico de la incontinencia urinaria. Prog. Obstet. Ginecol. 2019;62(1):79-91; Deng DM 2011 Med. Clin. N. Am. 95:101-109; y Puyol M et al. 2009 Arch. Esp. Urol. 62:882-888).

La IU causada por vejiga neurógena (que aparece, por ejemplo, tras accidentes cerebrovasculares, esclerosis múltiple y lesiones medulares) presenta síntomas similares a la IUE, sin embargo, en la IU ocasionada por vejiga neurógena, el nervio pudendo está afectado y el cuadro clínico es diferente a la IUE, ya que el paciente acusa incontinencia generalmente por rebosamiento donde no existe contracción del músculo detrusor para el vaciado y se producen constantes pérdidas de orina en relación a un hiper-llenado de la vejiga y no por el fallo primario esfinteriano. Sin embargo, en la IUE por debilidad del suelo pélvico, por ejemplo, tras embarazo o tras el parto, no está asociada a alteraciones en cuanto a la contracción detrusoriana ni a la capacidad vesical, sino que es debida a la hiperdistensión de los tejidos del suelo pélvico y al daño muscular a los sistemas de soporte pélvicos. La IUE por debilidad del suelo pélvico no es debida a un daño neurológico profundo, como sucede en la IU causada por vejiga neurógena por la transección del nervio pudendo o por lesiones nerviosas centrales; lo que da lugar a una clínica totalmente distinta (Blok B, et al. European Association of Urology (EAU) Guidelines on Neuro-Urology European Association of Urology 2018). La IUE por debilidad del suelo pélvico, se produce, por lo tanto, por una lesión de daño pélvico primaria, no es secundaria a un daño nervioso.

Las diferencias entre la IU por vejiga neurógena y la IUE son tales que incluso en el estudio de la vejiga neurógena se utiliza otro modelo animal (mediante la denervación de nervios, por ejemplo, el nervio pudendo, que causa una disfunción vesical completa), mientras que en el estudio de la IUE se utiliza el modelo de dilatación vaginal (que produce una disfunción del cierre uretral) (Hijaz A et al. 2008 The Journal of Urology 179(6):21032110; y Koike et al. 2013 International Journal of Urology 20.1:64-71). El tratamiento de ambos tipos de IU es por lo tanto diferente, ya que la IU por vejiga neurógena requiere de la regeneración del nervio, mientras que en el tratamiento de la IUE lo que se requiere es la regeneración de los tejidos de soporte. Según la SEGO, la incontinencia neurógena tiene protocolo de tratamiento quirúrgico diferente. La IU por vejiga neurógena y la IUE son patologías diferentes.

De lo que se conoce en el estado de la técnica, todavía existe la necesidad de encontrar un método que consiga un tratamiento efectivo a largo plazo de la IUE crónica, evitando así someter al paciente a procedimientos invasivos y a sus complicaciones.

Explicación de la invención

Los inventores han desarrollado una herramienta que permite el tratamiento de la incontinencia urinaria de esfuerzo (IUE) crónica. Mediante el uso de células madre de la decidua parietalis de la placenta (DMSCs) los investigadores han podido regenerar aquellas estructuras del tejido de sostén que rodea a la uretra. Por lo tanto, se han podido regenerar los mecanismos de cierre pasivo que tiene la uretra gracias al soporte conectivo, que se dañan, por ejemplo, en el parto.

Los inventores han demostrado en experimentos in vitro que las DMSCs humanas son capaces de migrar hacia las células de la mucosa suburetral pertenecientes a pacientes con IUE y esta migración es significativamente mayor que la migración de DMSCs hacia células de la mucosa suburetral pertenecientes a pacientes sin daño en el tejido de sostén de la uretra (ver ejemplo 2.1, figura 1). Las DMSCs de la invención migran, por lo tanto, hacia el daño de la mucosa suburetral.

Además, han demostrado que las células de la mucosa suburetral de pacientes con IUE proliferan significativamente más in vitro en presencia de las DMSCs que las células de la mucosa suburetral de pacientes sin daño en ese tejido conectivo (ver ejemplo 2.2, figura 2). Los investigadores creen que este resultado indica que son las propias células de la mucosa las que realizan la función de regenerar el tejido dañado cuando están en presencia de las DMSCs, sin que intervenga diferenciación de las DMSCs, probablemente por liberación de factores por parte de las DMSCs.

En experimentos in vivo de IUE con un modelo de dilatación vaginal de IUE, los inventores han demostrado que las DMSCs inyectadas en la mucosa suburetral revierten la IUE (ver ejemplo 3), tanto la IUE aguda (figura 3), como la IUE crónica (figura 4). En el caso de la IUE crónica, la presión que se ha de ejercer para fugar se aumenta (fig. 4, 5A, 5B), aumentando la presión necesaria para que rebose en el llenado máximo en cada animal (fig. 6).

Con técnicas de imagen los investigadores fueron capaces de visualizar las DMSCs en la región de la uretra incluso 2 o 3 semanas después de su inyección en la mucosa suburetral en el modelo animal in vivo (ver figura 7).

En la presente invención, mediante el uso de las DMSCs se consigue la regeneración tanto estructural como funcional de la uretra de los pacientes de IUE crónica.

Por lo tanto, el primer aspecto de la invención se refiere a células madre de la decidua parietalis de la placenta (DMSCs) para su uso en el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo crónica en un sujeto, caracterizado porque dichas células DMSCs expresan las proteínas CD44, CD90, CD117, CD73, CD29, CD13, CD105, Oct-4, Rex1, GATA-4 y HLA clase I (HLA-ABC); y, además, no expresan las proteínas CD34, CD45, CD133, BCRP1, STRO-1, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, HLA clase II (HLA-DR), CD40L, CD80 y CD86.

En particular el primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada abajo, se refiere a células madre de la decidua parietalis de la placenta (DMSCs) para su uso en el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo crónica en un sujeto, caracterizado porque dichas células DMSCs expresan las proteínas CD44, CD90, CD117, CD73, CD29, CD13, CD105, Oct-4, Rex1, GATA-4 y HLA clase I (HLA-ABC); y, además, no expresan las proteínas CD34, CD45, CD133, BCRP1, STRO-1, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, HLA clase II (HLA-DR), CD40L, CD80 y CD86; y caracterizado por que las DMSCs se administran de forma repetida en al menos dos ocasiones al sujeto. En la presente invención, las DMSCs se utilizan como ingrediente activo.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, las DMSCs se pueden utilizar después de haber sido obtenidas y caracterizadas o, alternativamente, se pueden congelar tras su obtención y caracterización y utilizarlas tras descongelación o cultivarlas tras descongelación para utilizarlas posteriormente, siguiendo protocolos conocidos por el experto en la materia.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, la IUE está causada por déficit del esfínter uretral.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el tratamiento de la IUE se realiza mediante regeneración del tejido conectivo que rodea la uretra o la vejiga, o, alternativamente, mediante regeneración del esfínter uretral, o, mediante la regeneración de ambos.

La decidua es el componente de la placenta de origen materno que se origina desde el endometrio y contiene células madre de origen mesodérmico, denominadas células madre mesenquimales de la decidua (“Decidua-derived Mesenchymal Stem Cell”, DMSC). Las DMSCs de la presente invención están caracterizadas por marcadores que se describen en Macías MI et al.2010 Am. J. Obstet. Gynecol. 203(5):495.e9-495.e23.

La incontinencia urinaria de esfuerzo (o de estrés) (IUE) en la presente invención es una IUE que se produce en un sujeto con debilidad del suelo pélvico, por ejemplo, por pérdida del tejido conectivo y/o de músculo liso que rodea la uretra y que conlleva un déficit del esfínter de la uretra y/o hipermovilidad uretral.

En la presente invención se entiende por IUE crónica a aquella IUE que persiste tras un año del parto o del embarazo o post-cirugía o la que, apareciendo en cualquier momento, es de un año o más de duración.

En la presente invención se entiende por IUE aguda a aquella IUE que aparece tras el parto o embarazo o post-cirugía o en cualquier momento y que es de una duración de menos de un año. En el caso de IUE tras un parto, se considera que la IUE aguda sucede cuando han pasado tres meses tras el mismo pero no es superior a un año de duración, pues antes se considera que la incontinencia es normal según los expertos. Una vez que la IUE supera la duración de un año se considera IUE crónica.

En la presente invención se entiende por "déficit del esfínter uretral” al fallo en la función del esfínter uretral (entendiéndose por "esfínter uretral” al músculo que rodea la uretra) que provoca la pérdida de orina y la aparición de la IUE. El déficit del esfínter uretral, por ejemplo, puede ser causado por déficit de tejido conectivo y/o por presencia de células con fenotipo de miofibroblastos que no son capaces de ejercer una correcta contracción.

En la presente invención los pacientes no tienen una patología neurológica, por ejemplo, en el nervio pudendo, que sea causante de la incontinencia.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, las DMSCs se administran por vía local en la uretra, por ejemplo, en la mucosa suburetral, por vía intravenosa, o por vía vaginal.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, las DMSCs se administran a través de inyección local en la mucosa suburetral, por ejemplo, en al menos dos localizaciones. Dado que el tratamiento de la IUE mediante el uso de las DMSCs de la presente invención no es agresivo para el paciente, éste puede ser repetido cuantas veces sea necesario.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, las DMSCs se administran en al menos dos ocasiones al sujeto; por ejemplo, en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, o diez ocasiones al sujeto.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, cuando las DMSCs se administran en al menos dos ocasiones, entre cada administración de DMSCs se evalúa la IUE para decidir si el tratamiento ha sido efectivo o si el sujeto necesita una nueva administración. En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, cuando se evalúa la IUE para decidir si el tratamiento ha sido efectivo o si el sujeto necesita una nueva administración, la ausencia de IUE es indicativa de que la terapia con DMSCs ha sido efectiva y no necesita una nueva administración de DMSCs.

Los métodos para evaluar si las DMSCs han sido efectivas son conocidos por el experto, por ejemplo: utilizando cuestionarios reconocidos que miden incontinencia, por ejemplo, descritos en "Sociedad Española de Ginecología y Obstetricia (SEGO). Diagnóstico de la incontinencia urinaria. Prog. Obstet. Ginecol 2019;62(1):79-91”.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se obtienen de la placenta de un mamífero, por ejemplo, de un humano.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se obtienen de placenta humana.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se obtienen de una placenta tras el alumbramiento, por ejemplo, de una placenta humana tras el alumbramiento.

Los métodos de obtención de las DMSCs son los que se describen, por ejemplo, en Macías MI et al.2010 Am. J. Obstet. Gynecol. 203(5):495.e9-495.e23.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se utilizan combinadas con un medicamento, por lo que se utilizan en terapia de combinación con un medicamento; por ejemplo, donde el medicamento es uno o más inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, o uno o más agonistas alfa adrenérgicos, o uno o más estrógenos, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el inhibidor de la recaptación de serotonina y noradrenalina es duloxetina (por ejemplo, Cymbalta®).

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el agonista alfa adrenérgico es efredina, pseudoefedrina, fenilpropanolamina o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, los estrógenos son estrógenos de aplicación local o estrógenos administrados por vía oral, o la combinación de ambos; por ejemplo, promestrieno (por ejemplo, Colpotrofin®), estriol (por ejemplo, Blissel®), estradiol hemihidrato (por ejemplo, Vagifem®), deshidroepiandrosterona (por ejemplo, Prasterona®), o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, cuando las DMSCs se utilizan combinadas con un medicamento, éste se administra antes y/o después de la administración de las DMSCs.

En una realización particular del primer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se utilizan combinadas con rehabilitación de suelo pélvico, por lo que se utilizan en terapia de combinación con rehabilitación del suelo pélvico del paciente, por ejemplo, en combinación con la realización de ejercicios de Kegel (ejercicios de contracción del músculo pubocoxígeo) antes 0 después de recibir el tratamiento con las DMSCs.

La rehabilitación del suelo pélvico se realiza de acuerdo con métodos estándares conocidos por el experto en la materia.

El primer aspecto de la invención se puede formular alternativamente como el uso de DMSCs para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo crónica en un sujeto, caracterizado porque dichas células DMSCs expresan las proteínas CD44, CD90, CD117, CD73, CD29, CD13, CD105, Oct-4, Rex1, GATA-4 y HLA clase 1 (HLA-ABC); y, además, no expresan las proteínas CD34, CD45, CD133, BCRP1, STRO-1, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, HLA clase II (HLA-DR), CD40L, CD80 y CD86. En una realización particular, las DMSCs se administran de forma repetida en al menos dos ocasiones al sujeto.

El primer aspecto de la invención se puede formular alternativamente como el método de tratamiento de IUE crónica que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de DMSCs en un sujeto con IUE crónica, donde dichas células DMSCs expresan las proteínas CD44, CD90, CD117, CD73, CD29, CD13, CD105, Oct-4, Rex1, GATA-4 y HLA clase I (HLA-A^bC); y, además, no expresan las proteínas CD34, CD45, CD133, BCRP1, STRO-1, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, HLA clase II (HLA-DR), CD40L, CD80 y CD86. En una realización particular, las DMSCs se administran de forma repetida en al menos dos ocasiones al sujeto.

Un segundo aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica caracterizada por comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de las DMSCs del primer aspecto de la invención y que además comprende uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo crónica en un sujeto.

La expresión "cantidad terapéuticamente efectiva” tal y como se usa aquí, se refiere a la cantidad de las DMSCs que, cuando se administran, es suficiente para tratar o aliviar en cierto grado uno o más síntomas de la IUE crónica en un sujeto. La dosis concreta de DMSCs administrada de acuerdo con la invención vendrá determinada por las circunstancias concretas del caso, incluyendo la ruta de administración, y la gravedad de la enfermedad a tratar, entre otras.

Las composiciones de la presente invención se pueden preparar mediante métodos bien conocidos en el estado de la técnica. El experto en la materia puede determinar los excipientes y/o vehículos, y cantidades adecuadas a usar, dependiendo de la formulación a preparar.

El término "excipiente” hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de las DMSCs de la invención o la composición farmacéutica de la invención o estabiliza dichas células o composición farmacéutica o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

El término “farmacológicamente aceptable” se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño al organismo al que se administra.

En una realización particular del segundo aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, la composición farmacéutica, además comprende uno o más inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, o uno o más agonistas alfa adrenérgicos, o uno o más estrógenos, o cualquiera de sus combinaciones.

Todas las realizaciones particulares del primer aspecto de la invención también forman parte del segundo aspecto de la invención.

Un tercer aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende las DMSCs definidas en el primer aspecto de la invención o la composición farmacéutica definida en el segundo aspecto de la invención y que además comprende uno o más inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, o uno o más estrógenos, o uno o más antagonistas alfa adrenérgicos, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización particular del tercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el inhibidor de la recaptación de serotonina y noradrenalina es duloxetina.

En una realización particular del tercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el agonista alfa adrenérgico es efredina, pseudoefedrina, fenilpropanolamina, o cualquiera de sus combinaciones.

En una realización particular del tercer aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, los estrógenos son estrógenos de aplicación local o estrógenos administrados por vía oral o la combinación de ambos; por ejemplo, promestrieno (por ejemplo, Colpotrofin®), estriol (por ejemplo, Blissel®), estradiol hemihidrato (por ejemplo, Vagifem®), deshidroepiandrosterona (por ejemplo, Prasterona®), o cualquiera de sus combinaciones.

El kit del tercer aspecto de la invención puede contener instrucciones para llevar a cabo el uso del primer aspecto de la invención.

Todas las realizaciones particulares del primer y segundo aspectos de la invención también forman parte del tercer aspecto de la invención.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere al uso de un kit que comprende las DMSCs definidas en el primer aspecto de la invención o la composición farmacéutica definida en el segundo aspecto de la invención o del kit del tercer aspecto de la invención para el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo crónica de un sujeto.

En una realización particular del tercer o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el kit comprende además un dispositivo que comprende las DMSC, por ejemplo, una jeringa precargada con las DMSCs definidas en el primer aspecto de la invención o la composición farmacéutica definida en el segundo aspecto de la invención.

Todas las realizaciones particulares del primer, segundo y tercer aspectos de la invención también forman parte del cuarto aspecto de la invención.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a un dispositivo que comprende las DMSCs definidas en el primer aspecto de la invención o la composición farmacéutica definida en el segundo aspecto de la invención.

En una realización particular del quinto aspecto de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el dispositivo es una jeringa. Todas las realizaciones del primer, segundo, tercer o cuarto aspectos de la invención son realizaciones particulares del quinto aspecto de la invención.

En una realización particular del primer, segundo, tercer, cuarto o quinto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, las DMSCs pueden estar marcadas para su visualización.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el uso se realiza en combinación con la obtención de imágenes del sujeto para observar la correcta administración de las DMSCs y/o su distribución en la mucosa suburetral y/o en el tejido circundante.

En una realización particular del primer, segundo, tercer, cuarto o quinto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, cuando se administra duloxetina, ésta se administra al sujeto en una cantidad de 40-80 mg al día durante al menos 2 semanas, por ejemplo 2-4 semanas.

En la presente invención, los términos "sujeto”, "paciente” o "individuo” se usan indistintamente. En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el sujeto que presenta IUE crónica es un humano. El paciente puede ser de cualquier edad, género o raza.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el sujeto es una mujer; por ejemplo, es una mujer que se selecciona del grupo que consiste en: nulípara, primípara, multípara, nuligesta, primigesta y multigesta.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el sujeto es una mujer nulípara y nuligesta (nuligrávida); o, alternativamente, nulípara y primigesta (primigrávida) (por ejemplo, la mujer que ha tenido uno o más hijos mediante una cesárea); o, alternativamente, nulípara y multigesta (multigrávida) (por ejemplo, la mujer que ha tenido uno o más hijos mediante dos o más cesáreas); o, alternativamente, la mujer que ha tenido un parto o más (multípara, por ejemplo, secundípara, tercípara, cuartípara, quintípara, sextípara, septípara, octípara, nonípara o decípara).

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el sujeto es una mujer con menopausia.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el sujeto es una mujer con IUE crónica que no tiene afectado ningún nervio que estando dañado induzca a padecer IU, por ejemplo, no tiene afectado el nervio pudendo.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el sujeto es una mujer que ha recibido previamente otro tratamiento para la IUE pero que no ha sido efectivo, por ejemplo, una o más cirugías.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, el sujeto es un hombre que presenta déficit en el esfínter uretral; por ejemplo, es un hombre que presenta un daño en el esfínter uretral por haber sido previamente sometido a una cirugía de próstata, por ejemplo, para extirpar un tumor de próstata.

En una realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se obtienen de la placenta de un individuo diferente al sujeto receptor de las DMSCs; es decir, es un uso alogénico.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquiera de las realizaciones particulares proporcionadas arriba o abajo, las DMSCs se obtienen de la placenta de una mujer que es el sujeto receptor de las DMSCs; es decir, es un uso autólogo.

En una realización particular del primer, segundo, tercer o cuarto aspectos de la invención, opcionalmente en combinación con cualquier realización particular proporcionada arriba o abajo, el sujeto es menor de 65 años; o, alternativamente, el sujeto tiene 65 años o más.

En una realización particular del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención, el uso de la invención comprende además los pasos de (i) recopilar la información resultante de utilizar las DMSCs, o la composición farmacéutica o el kit, y (ii) guardar la información en un soporte de datos.

En el sentido de la invención, un "soporte de datos” debe entenderse como cualquier medio que contiene datos de información del uso del primer, segundo o cuarto aspectos de la invención o de la respuesta del paciente a dichos usos, como el papel. El soporte también puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de transportar los datos. Por ejemplo, el soporte de datos puede comprender un medio de almacenamiento, tal como un ROM, por ejemplo, un CD ROM o un semiconductor ROM, un DVD, o un medio de grabación magnético, por ejemplo, un disco duro. Además, el portador puede ser un portador transmisible como una señal eléctrica u óptica, que se puede transmitir a través de una señal eléctrica u óptica, cable o por radio u otros medios. Cuando los datos están incorporados en una señal que puede ser transportado directamente por un cable u otro dispositivo o medio, el soporte puede ser constituido por dicho cable u otro dispositivo o medio. Otros operadores se relacionan con dispositivos USB y archivos informáticos. Ejemplos de portadores de datos adecuados son papel, CD, USB, computadora, archivos en PC, o registro de sonido con la misma información. Para los propósitos de la presente invención, cualquier rango dado incluye los puntos finales inferior y superior del rango.

Todos los términos utilizados en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario, se entenderán en su significado ordinario tal como se conocen en el arte. Otras definiciones más específicas de ciertos términos utilizados en la presente solicitud son las que se exponen aquí y están destinadas a aplicarse uniformemente en toda la descripción y en las reivindicaciones, a menos que una definición expresamente establecida de otro modo ofrezca una definición más amplia. Las definiciones que se dan en el presente documento se incluyen con el fin de comprender y se espera que se apliquen a lo largo de la descripción, las reivindicaciones y los dibujos.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende” y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Además, la palabra "comprende” incluye el caso "consiste en”. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. Además, la presente invención cubre todas las posibles combinaciones de realizaciones particulares y preferidas aquí indicadas.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1, muestra la migración in vitro de DMSCs en una cámara de migración cuando están en presencia de células de la mucosa suburetral de pacientes con IUE ("IUE”) o de células de la mucosa de pacientes sin daño en el tejido de sostén del suelo pélvico (pacientes con prolapso uterino y sin IUE, "POP”).

FIG. 2, muestra una comparativa entre la proliferación in vitro de células de la mucosa suburetral de pacientes con IUE ("IUE”) y de células de la mucosa suburetral de pacientes sin daño en el tejido de sostén del suelo pélvico (pacientes con prolapso uterino y sin IUE, "POP”), cuando estaban en presencia de DMSCs.

FIG. 3, comparativa de la presión necesaria para fugar entre el grupo control (HBSS) y el grupo de ratas con daño agudo (IUE aguda) que recibió dos dosis de 2x106 DMSCs inyectadas en la mucosa suburetral, medidas con 200 microlitros de llenado. Datos a las 1, 3, 5 y 6 semanas tras la primera administración de las DMSCs.

FIG. 4, comparativa de la presión necesaria para fugar entre el grupo control (HBSS) y el grupo de ratas con daño crónico (IUE crónica) que recibió dos dosis de 2x106 DMSCs inyectadas en la mucosa suburetral, medidas con 200 microlitros de llenado. Datos a las 1, 2, 3 y 4 semanas tras la primera administración de las DMSCs.

FIG. 5, comparativa de la presión necesaria para fugar entre el grupo control (HBSS) y el grupo de ratas con daño crónico (IUE crónica) que recibió dos dosis de 2x106 DMSCs inyectadas en la mucosa suburetral, medidas con 100 (A) o 200 (B) microlitros de llenado, tras aplicación repetida del tratamiento. Datos a las 11 semanas tras la primera administración de las DMSCs.

FIG. 6, comparativa de la presión necesaria para fugar entre el grupo control (HBSS) y el grupo de ratas con daño crónico (IUE crónica) que recibió dos dosis de 2x106 DMSCs inyectadas en la mucosa suburetral, cuando se midió con el volumen máximo que cada rata tenía, tras aplicación repetida del tratamiento. Datos a las 11 semanas tras la primera administración de las DMSCs.

FIG. 7, visualización de las células DMSCs humanas in vivo teñidas e inyectadas a una rata post-daño a diferentes tiempos (días). Panel "A”, ratas que recibieron tratamiento con DMSCs; panel "B”, ratas que recibieron el control (HBSS).

Ejemplos

1. Obtención y caracterización de células madre mesenquimales de la decidua parietalis de la placenta:

Las células madre de la decidua parietalis se obtuvieron y se caracterizaron siguiendo los protocolos descritos en el documento Macías MI et al. 2010 Am. J. Obstet. Gynecol.

203(5):495.e9-495.e23. A continuación se indica brevemente el material y métodos utilizado:

Material y métodos:

Obtención de las placentas:

Las placentas humanas de embarazos a término se obtuvieron mediante consentimiento informado aprobado por el Comité Ético para la Investigación Clínica (CEIC) del Hospital Universitario 12 de Octubre (Madrid, España).

Obtención de células del saco amniótico:

Las placentas se procesaron inmediatamente tras el alumbramiento. Para la obtención de las células el saco amniótico se separó mecánicamente del villi coriónico con ayuda de pinzas y tijeras y el villi coriónico se descartó. Las membranas del saco amniótico se lavaron con Tampón Fosfato Salino 1X (PBS) y las células se obtuvieron mediante dos digestiones de treinta minutos cada una con 0,05% de tripsina-EDTA. Las células obtenidas se sembraron a una densidad de 1,16 x 105 células/cm2 en el medio de cultivo compuesto por Medio Esencial Dulbecco Modificado (DMEM, Lonza), 2 mM de glutamina, 1 mM de piruvato sódico, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF, Sigma), 10% de suero bovino fetal (Lonza), 1% de antibióticos (Penicilina-Estreptomicina 10.000 Unidades, Lonza), 1% de aminoácidos no esenciales (Lonza) y 55 pM de p-mercaptoetanol (Sigma) y se mantuvieron en un incubador a 37°C y 5% CO².

Mantenimiento de los cultivos:

Las células no adherentes se retiraron a los cinco días del inicio de los cultivos, mediante aspiración del medio de cultivo y lavado con PBS 1X (Lonza). El medio de cultivo se reemplazó cada cuatro días hasta que las células alcanzaron un 90-100% de confluencia. Las células se despegaron de la placa de cultivo mediante digestión con tripsina-Versene (cinco minutos a 37°C y 5% de CO²) y se sembraron a una concentración de 4-5 x 104 células/cm2. Las DMSCs no se diferenciaron, se mantuvieron en medio DMEM completo hasta su utilización o se congelaron para su posterior utilización (congelación según procedimientos estándares, en pases tempranos, es decir, a los 2, 3 o 4 pases). Cuando las células se congelaron, se utilizaron tras su descongelación y expansión. Las DMSCs se utilizaron en general en el pase 6-10.

Estudio de la procedencia materno-fetal:

Se analizó la procedencia fetal o materna de las DMSCs mediante dos técnicas diferentes de las células obtenidas de tres placentas en las que el niño nacido era varón; mediante la técnica de hibridación in situ fluorescente y mediante el estudio de repeticiones cortas en tándem.

a) - Hibridación in situ fluorescente (FISH):

Para realizar este estudio se utilizó el Poseidon FISH Kit (Kreatech). De acuerdo con las instrucciones del fabricante, las células se crecieron adheridas en un cubreobjetos estéril y una vez alcanzado el 70% de confluencia en el cultivo, se lavaron con PBS durante diez minutos a 37°C y se fijaron con Fijador de Carnoy (Metanol acético 3:1) fresco durante diez minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se permeabilizaron durante 15 minutos a 37°C en tampón de permeabilización (0,5% de Igepal CA-630 (Sigma) diluido en Citrato Sódico Salino 2X (SSC 2X) y se deshidrataron mediante la incubación en una serie de etanol al 70%, 85% y 100% de un minuto cada una. Las células se incubaron con 10 pL de las sondas fluorescentes (Poseidon repeat-free XY probes, Kreatech) a 75°C durante diez minutos para desnaturalizar tanto el ácido desoxirribonucleico (ADN) celular como las sondas y se incubaron a 37°C en una cámara húmeda durante toda la noche para permitir la hibridación de la sonda con el ácido desoxirribonucleico (ADN) celular. A continuación, las células ya hibridadas se lavaron en presencia de tampón de lavado I (0,3% de Igepal en 0,4% de ^s S^c , contenido en el Poseidon FISH Kit, Kreatech) durante dos minutos a temperatura ambiente y con agitación. Seguidamente, la muestra se lavó en este mismo tampón durante dos minutos a 72°C sin agitación. Finalmente, la muestra se lavó en tampón de lavado II (0,1% de Igepal en SSC 2X, contenido en el Poseidon FISH kit, Kreatech) durante un minuto a temperatura ambiente y sin agitación. La muestra se deshidrató nuevamente, mediante una serie de etanol al 70%, 85% y 100% de un minuto cada una y se secó a temperatura ambiente. Los núcleos de las células se tiñeron con 0,2 pg/mL de 4',6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Fluka) durante un minuto a temperatura ambiente y oscuridad. Finalmente, las células se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia.

b) - Estudio de repeticiones cortas en tándem (STRs del inglés short tandem repeats):

Este estudio se realizó mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa fluorescente (QF-PCR) con el kit Aneufast™ QF-PCR (Molgentix). Esta técnica permitió detectar la presencia o ausencia de un determinado fragmento cromosómico mediante el uso de sondas fluorescentes. Siguiendo las instrucciones del fabricante, se realizó un estudio múltiple de los marcadores AMXY, SRY, X22, DXYS218, HPRT, tal y como se describe en Macías MI et al.2010.

La mezcla de reacción se realizó según las instrucciones indicadas por el fabricante del kit Aneufast™ QF-PCR y el ciclo termal se llevó a cabo en un analizador genético 3100, con tecnología basada en electroforesis capilar (Applied Biosystems) de acuerdo con el protocolo publicado por Mann y col. en 2001 (Mann K, et al.2001 The Lancet 358:1057-1061).

Dinámica de la población:

Para medir la cantidad de células que era capaz de producir la placenta, es decir, para medir el número de veces que se duplicaba y el tiempo que tardaba en hacerlo, se realizó un estudio de la dinámica de población.

La dinámica de crecimiento de los cultivos (n=9) se determinó mediante el recuento de las células en una cámara de Neubauer en cada pase. El número de duplicaciones celulares se calculó mediante la fórmula: Nt = N⁰ x 2d, donde “Nt” era el número de células a tiempo t, “N⁰” era el número de células iniciales y "d” el número de divisiones celulares que habían sucedido a lo largo del cultivo (en un tiempo t). Los datos obtenidos de nueve placentas diferentes se analizaron con el programa informático Microsoft Excel® para la obtención de la media y la desviación estándar de los parámetros tiempo de generación, tiempo de cultivo, número de pases y número de divisiones celulares y los gráficos se construyeron con el programa informático SigmaPlot® V 11.0 (Sigma).

Estudio de marcadores de las células DMSCs:

El análisis se realizó siguiendo el protocolo descrito en Macías MI et al. 2010 Am. J. Obstet. Gynecol. 203(5):495.e9-495.e23.

a) - Citometría de flujo:

Para el análisis por citometría de flujo se obtuvieron suspensiones de las células mediante digestión con tripsina-Versene (como indicado anteriormente). Las células se resuspendieron en PBS 1X con 2% de suero de caballo a una concentración de 5 x105 células por cada 100 pl de tampón. Las células se tiñeron con los anticuerpos específicos para los marcadores humanos CD45 PerCP (BD Pharmingen), CD34 FITC, CD133/1 PE (Miltenyi), CD105 FITC (Serotec), BCRP1 FITC (Millipore), CD73 PE, CD29 PE, CD44 FITC, CD117 PE, CD90 FITC y CD13 PE (BD Pharmingen), HLAABC FITC (MHC clase I), HLA-DR FITC (MHC clase II), CD40 FITC, CD80 (B7-1) FITC, CD86 (B7-2) PE, SSEA-1 PE, SSEA-3 PE, SSEA-4 PE, TRA-1-60 PE y TRA-1-81 PE (eBioscience). Para calcular y corregir la unión inespecífica de los anticuerpos se realizó el análisis de los isotipos control para cada marcador. Los isotipos examinados fueron Ratón IgG1 FITC, Ratón IgG2a FITC (Serotec), Ratón IgG1 PE, Ratón IgG1 PerCP, Ratón IgG2a PE (Becton Dickinson), Ratón IgG3 FITC y Ratón IgM PE (eBioscience). Los anticuerpos se usaron a una concentración 1:10 o 1:20, según las instrucciones del fabricante y tomando como referencia sus isotipos control. Las células se incubaron en presencia de los anticuerpos durante quince minutos a temperatura ambiente y oscuridad. Posteriormente, se analizaron al menos 20.000 eventos para cada marcador, en un citómetro de flujo FACScan® (Becton Dickinson) equipado con el programa informático CellQuest Pro®.

b) - Transcripción inversa y reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR):

Se realizó para estudiar la expresión de los genes Oct-4, Rex-1, GATA-4, HLA-ABC y HLA-DR.

La purificación de ácido ribonucleico (ARN) a partir de las células obtenidas de la placenta se realizó con el kit de aislamiento de ARN "AquaPure” (Bio-Rad) o con el kit de purificación de ARN MasterPureTM (Ecogen) siguiendo instrucciones del fabricante. Para la obtención de ARN se procesaron muestras tanto congeladas a -80°C como muestras frescas una vez lavadas las células dos o tres veces con PBS 1X. Tras la obtención del ácido nucleico éste se resuspendió en 35 pL de tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH=7,5 y EDTA 1mM) y se procesó inmediatamente o se almacenó hasta su uso a -80°C. La cantidad de ARN obtenido, así como su posible contaminación con proteínas y/o sales se determinó mediante su medición en un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop, Thermo Scientific). La calidad del ARN se determinó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% (Sigma) en tampón Tris/Ácido Acético/EDTA (TAE, Bio-Rad) 1X. Como patrón de peso de molecular se utilizaron los marcadores preteñidos EZ LoadTM Molecular Rulers (Bio-Rad). Los geles de agarosa se tiñeron con SYBR® Gold (Molecular Probes) y se visualizaron con un transiluminador ChemiDoc XRS equipado con el programa informático Quantity One 1D (Bio-Rad).

La síntesis del ADN complementario (ADNc) se realizó mediante la técnica de transcripción inversa (reversa) a partir del ARN purificado.

Para estudiar la expresión de los genes Oct-4, Rex-1, GATA-4, HLA-ABC y HLA-DR, mediante la RT-PCR, se utilizaron los oligonucleótidos y las condiciones tal y como se describieron en Macías MI et al.2010 Am J Obstet Gynecol 203(5):495.e9-495.e23.

c)- Inmunofluorescencia:

Se utilizó para analizar la expresión de STRO-1.

A las células se les retiró el medio de cultivo, se lavaron con PBS 1X y se fijaron con 10% de formalina (Sigma) en PBS 1X durante diez minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavaron dos o tres veces con PBS 1X, se permeabilizaron con 0,5% de Tween-20 en PBS 1X (PBT) durante 10 minutos y se incubaron durante dos horas en solución de bloqueo (5% de suero de caballo (Lonza) disuelto en PBS 1X). Las células se incubaron con el anticuerpo primario obtenido en ratón contra la proteína STRO-1 (R&D Systems) a una dilución 1:50 durante toda la noche a 4°C. A continuación, el anticuerpo primario se retiró, las células se lavaron tres veces en PBS 1X durante cinco minutos y se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados a un fluorocromo (Jackson Inmunoresearch) a una concentración 1:200 durante una hora. Las células se lavaron tres veces con PBS 1X durante cinco minutos y los núcleos se tiñeron con 0,2 mg/mL de DAPI durante un minuto. Finalmente, las células se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia en un microscopio Leica DMIL.

Resultados:

Mediante FISH, analizando la presencia de los cromosomas sexuales X e Y, se observó en todas las muestras analizadas la presencia de dos cromosomas X en la totalidad de las células obtenidas de placentas en las que el bebé nacido era de sexo masculino (n=3). Este resultado indicaba que las DMSCs obtenidas en las tres placentas analizadas eran de procedencia materna.

Por otro lado, los resultados obtenidos utilizando el estudio de las secuencias repetidas en tándem, mostraron que las DMSCs presentaban ausencia del fragmento SRY sumada a la presencia de un único pico de expresión para el marcador AMXY y dos picos para HPRT, poniéndose de manifiesto que las células obtenidas de las tres placentas presentaban un patrón de fragmentos cromosómicos similar al de las células de hembra. Las DMSCs se compararon con células epiteliales control de varón y hembra. En conclusión, el análisis cromosómico de las tres muestras analizadas mostró un patrón de expresión compatible con el sexo femenino.

La dinámica de crecimiento de las DMSCs fue de tipo exponencial. Las DMSCs alcanzaron 19,08 ± 2,68 pases en los cuales se sucedieron 19,5 ± 4,32 divisiones de la población original con un tiempo de generación medio de 96 ± 24,72 horas. El número medio inicial de células adherentes a confluencia fue de 6,88 ± 5,23 x 106 y el número medio de células alcanzado en la población final fue de 2,54 ± 4,97 x 1014 en un tiempo de 122,33 ± 25,62 días. Los datos se expresaron como media ± desviación estándar.

Los estudios realizados concluyeron que las células eran efectivamente células madre mesenquimales de la decidua de la placenta (DMSCs) humana, tal y como se describió en Macías MI et al.2010 Am. J. Obstet. Gynecol. 203(5):495.e9-495.e23.

Las DMSCs expresaban los marcadores CD44, CD90, CD117, CD73, CD29, CD13, CD105, Oct-4, Rex1, GATA-4 y HLA clase I (HLA-ABC); y, además, no expresaban las proteínas CD34, CD45, CD133, BCRP1, STRO-1, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, HLA clase II (HLA-DR), CD40L, CD80 y CD86.

Las células DMSCs obtenidas y caracterizadas se utilizaron en los ejemplos descritos a continuación.

2. Estudios in vitro de migración de DMSCs y de proliferación de las células de la mucosa suburetral:

Material y métodos:

Para saber si la migración de las DMSCs se veía afectada por la presencia de células de la mucosa suburetral (miofibroblastos) y comprobar si la proliferación celular de las células de la mucosa suburetral se veía afectada por la presencia de DMSCs, se realizaron experimentos con células de la mucosa suburetral obtenidas de mujeres operadas en el hospital 12 de Octubre (Madrid, España) (obtenidas mediante consentimiento informado previamente aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC) del Hospital Universitario Hospital 12 de Octubre) y las DMSCs obtenidas en el ejemplo 1. Se compararon los resultados entre un grupo de pacientes que presentaban incontinencia urinaria de esfuerzo crónica con un grupo control (control negativo) donde las células se obtuvieron de pacientes que tenían prolapso de órganos pélvicos (POP) pero que no presentaban incontinencia urinaria de esfuerzo.

Se obtuvieron células con morfología de fibroblastos de la mucosa suburetral mediante digestión con colagenasa al 0,15% colagenasa tipo II durante toda la noche a 37°C. Las células una vez disgregadas y obtenidos los fibroblastos, fueron cultivados en medio DMEM completo (Gibco) con suero fetal bovino (FBS) (Hyclon). Las células obtenidas se cultivaron en medio DMEM con 10% de suero fetal. Los experimentos se realizaron con las células en pases parecidos, siempre intentando que fueran en pases intermedios, entre el pase 5 y el pase 9, aproximadamente.

2.1. Experimento in vitro de migración:

En este caso se comparó la migración de DMSCs en presencia de células de la mucosa suburetral de 8 pacientes con IUE crónica frente a los de 7 pacientes control (POP). Los datos se obtuvieron con al menos 2 experimentos por cada paciente, con al menos 3 replicados.

Se utilizó el kit de migración de Cell Biolabs “Cyto Select TM 24-well cell migration assay” (referencia CDA-100), siguiendo las instrucciones del fabricante. En placas de 24 pocillos, en la parte inferior se sembraron 30.000 células de la mucosa suburetral (excepto en un pocillo que sirvió como control), mientras que en el pocillo (“transwell”) que luego se colocó encima, se sembraron las DMSCs (1/5 de las células que había abajo, es decir, 6.000 células DMSC). El “transwell” tenía un tamaño de poro de 8 micras, por lo que las DMSCs podían atravesarlo y migrar hacia el otro lado. El pocillo control sin células de la mucosa suburetral sirvió para observar la migración de las DMSCs hacia un pocillo vacío. El pocillo con las DMSCs se colocó encima y tras una incubación de entre 16-18 horas (en medio DMEM con 10% de FBS) se evaluó la migración de las DMSCs hacia las células de la mucosa de cada paciente mediante tinción, siguiendo las instrucciones del fabricante del kit utilizado. Las células que habían pasado al otro pocillo se tiñeron, se extrajo el colorante y con una reacción colorimétrica a 560 nM se midió la capacidad de migración.

Resultados del experimento in vitro de migración celular:

Los resultados tras 24 o 48h, fueron parecidos. En la figura 1 se muestran los resultados a las 24 horas.

Se observaron diferencias significativas entre la migración de las DMSCs que estaban en los “transwell” de los pocilios con las células de la mucosa de pacientes con IUE frente a las que estaban en los “transwell” de los pocillos con el control (las pacientes con POP), siendo la migración mayor en las DMSCs que estaban en los “transwell” de los pocillos con las células de la mucosa de pacientes con ⁱU^e (p=0,0127, obtenida con t de student) (ver fig. 1). Los resultados mostraron que las DMSCs migraron significativamente más con las células de pacientes con IUE donde el tejido de sostén estaba dañado, de modo que las DMSCs respondieron a un estímulo del daño celular migrando hacia la zona dañada.

2.2 Experimento in vitro de proliferación:

En este caso se comparó la proliferación de las células de la mucosa suburetral de 5 pacientes con IUE crónica en presencia de las DMSCs. También se estudió la proliferación de las células obtenidas de 5 pacientes control (con POP) en presencia de las DMSCs. Los datos se obtuvieron con al menos 3 experimentos por cada paciente, la mayoría con 4 replicados.

En este caso, se utilizó el kit de viabilidad de Invitrogen “PrestoBlue Cell Viability Reagent” (número de catálogo A13261) siguiendo las instrucciones del fabricante.

En las placas de 24 pocillos (NUNC) se sembraron 30.000 células de la mucosa de cada patología en el pocillo de abajo (excepto en un pocillo que sirvió como control), mientras que en el pocillo que luego se colocó encima (“transwell”) se sembraron las DMSCs (en una relación de 1/5 o % es decir 6000 o 15000 respecto al número de células sembradas abajo). El “transwell” fue de 0,4 micras, con lo cual, las células compartían el medio de cultivo (DMEM con 10% FBS), citoquinas o cualquier otra señal que intercambien los dos tipos celulares, pero no podían pasar las células DMSCs al otro lado del “transwell”. Se dejó que ambas células estuvieran 24 horas en sus condiciones en sus pocillos, para que las células de la mucosa se adhirieran al plástico y las DMSCs a los “traswells”. Al día siguiente, se unieron los “transwell” (se colocaron encima del pocillo con las células de la mucosa), y se esperó 24h o 48h para hacer las mediciones de actividad y viabilidad celular con el reactivo AlamarBlue™.

Resultados del experimento in vitro de proliferación celular:

Entre las dos cantidades de DMSCs utilizadas, 1/5 y % es decir 6.000 o 15.000 respecto al número de células sembradas de mucosa, los resultados fueron parecidos, en la figura 2 se muestran los resultados que se obtuvieron con 6.000 DMSCs.

La proliferación de las células de la mucosa fue significativamente mayor en el caso de la de los pacientes con IUE, comparada con el control (las pacientes con POP) (p=0,0181, obtenida con t de student) (ver figura 2) cuando estaban en presencia de DMSCs. Estos resultados indicaron que las DMSCs provocaron un aumento significativo en la viabilidad celular del tejido de sostén que estaba dañado, es decir en las células de pacientes con IUE, en comparación con las células de sostén de pacientes con el tejido de sostén no dañado (pacientes con POP sin IUE).

3. Estudios in vivo en modelo animal de IUE:

Material y métodos:

Modelo de IUE:

Para realizar la distensión vaginal simulando un daño provocado en el momento del parto, se utilizaron ratas Sprague-Dawley (225-250g) a las que se les dilató la vagina usando dilatadores uretrales Otis Bougie de tamaños entre 24-32 previamente lubricados y bajo anestesia. Posteriormente, un catéter 10Fr Foley se introdujo en la vagina y se infló el balón hasta 3 mL. Este balón se mantuvo en los animales durante 4 horas con anestesia (isoflorano (AbbVie) en flujo inhalado al 5% para inducción de la analgesia y al 2% para mantenimiento) y analgesia (meloxicam, 5 miligramos por mililitro, diluido 1/10 en suero fisiológico estéril; se inyectaron 200 microlitros, de forma subcutánea; Metacam®, casa comercial Boehringer Ingelheim) para evitar el dolor posterior al tratamiento, durante las 6 horas posteriores al daño. Además, se vigilaron sus constantes (mediante pulsioxímetro para vigilar el ritmo cardíaco y la saturación de oxígeno mientras dura el daño), se les aplicó protección ocular (vaselina ocular) y se les inyectó atropina para evitar problemas respiratorios por generación de mucosidad pulmonar (atropina sulfato, 1 miligramo por mililitro diluido a 1/10 en suero fisiológico estéril; se inyectaron 200 microlitros, de forma subcutánea; casa comercial, B Braun). La incontinencia urinaria de esfuerzo se midió mediante medida de la presión de vaciado.

A las ratas se les realizó una medida basal de sus presiones de fuga de orina, antes del daño y después del daño. Cuando a las ratas se les midió la presión mínima con la que fugaban (es decir, se veía rebosamiento del PBS teñido de azul que se les introdujo vía sonda en la vejiga previamente vaciada) tras el daño, se observó que apenas con rozarlas se producía ese rebosamiento, es entonces cuando se concluyó que estaban incontinentes (de acuerdo con Cannon TW, et al. "Effects of vaginal distensión on urethral anatomy and function.” BJU Int.

2002;90(4):403-407).

Trasplante de DMSCs en el modelo animal:

Posteriormente, las DMSCs se trasplantaron (se inyectaron) en las ratas con IUE. Se diseñaron dos grupos de ratas en las que se procedió a realizar el trasplante, a un grupo de ratas se les inyectó las DMSCs resuspendidas en HBSS y al otro grupo de ratas sólo se les inyectó HBSS, en la primera, o en la quinta semana después de provocar el daño. El motivo de elegir dos periodos distintos fue para evaluar el efecto del trasplante tanto en ratas con daño reciente (lo que se asemejaba al daño inmediato postparto) o bien con daño antiguo (que corresponde a la IU que aparece en la mujer años después del parto, normalmente tras aparecer la menopausia y que se produce, con mayor frecuencia entre los 50 y 60 años de edad).

Por lo que, una semana (para la evaluación en daño agudo) o 5 semanas (para la evaluación del daño crónico) después de provocar el daño, las ratas se anestesiaron y se les inyectó suburetralmente a cada lado de la uretra las DMSCs, 2 millones de DMSCs en 120 microlitros de HBSS directamente en la zona dañada (se pinchó aproximadamente la mitad a cada lado de la uretra). A la semana de la primera administración se volvió a realizar otra inyección con la misma cantidad de células y de la misma manera. Se realizó la administración de las células en dos semanas consecutivas (una vez a la semana) para asegurar que no se produjera un daño tisular por la alta concentración de células y que fuera bien tolerado por el animal. Por lo tanto, dado que en cada inyección se administraron al animal 2 millones de células, en conjunto, se administraron un total de 4 millones de DMSCs a cada animal.

Como grupo control se utilizaron ratas inyectadas con suero salino (HBSS). Se incluyeron al menos 10 animales por grupo (n=10) para obtener datos que pudieran ser evaluados estadísticamente. En el caso de los experimentos con daño crónico se realizaron un total de cuatro experimentos, de modo que se utilizaron un total de 18 animales con HBSS y 20 con DMSCs.

Además, también se evaluó el efecto de las células DMSCs en la IUE crónica cuando se inyectaron de forma repetida durante varias semanas en 5 ratas, como se ha indicado anteriormente (en cada administración se utilizaron 2 millones de DMSCs en 120 microlitros de HBSS y se inyectó la mitad a cada lado de la uretra). En este experimento se repitió las dosis de dos inyecciones en dos semanas consecutivas y se hicieron tres tandas de repeticiones, esperando dos semanas entre cada intervalo de inyecciones. Es decir, se tomó la medida basal en la semana 0 y luego en la primera semana se hizo la distensión vaginal (el daño), después de 5 semanas (a la sexta semana del comienzo del experimento) se administraron las células y también a la siguiente semana (en la séptima semana), se esperaron dos semanas (semanas 8 y 9) y se repitió la administración en las semanas 10 y la 11 (segunda tanda de administración), se esperaron dos semanas (semanas 12 y 13), se administró la tercera tanda de DMSCs en la semanas 14 y 15 y se esperó dos semanas (semanas 16 y 17) para ver evolución y sacrificio de los animales. En cada semana se hicieron mediciones de la presión de la vejiga.

También se vació por completo la vejiga en las ratas y se midió el volumen máximo que eran capaces de retener en vejiga todas las ratas.

Análisis funcional in vivo:

La regeneración funcional se evaluó después del trasplante de células mediante el test del punto de presión de goteo (LPP, Leak Point Pressure). El método consistió en introducir un catéter en la uretra conectado a una jeringa con presión de flujo y a un traductor de presión. La vejiga se llenó con diferentes cantidades desde 0,1 mL, o 0,2 mL de suero salino (teñido de azul con azul de metileno para su mejor visualización) para alcanzar la mitad de su capacidad de llenado para ratas del peso utilizado en este estudio y como última medida el máximo de volumen admitido hasta el rebosamiento. También se realizó la medida con el volumen máximo admitido antes de rebosar de cada animal.

Se aplicó una presión suave en el abdomen de las ratas hasta obtener goteo de salino que se registró con el sistema de adquisición de datos Biopac (Astromed). Los datos se refirieron a la presión de la vejiga sin presión abdominal. La presión basal dentro de vejiga cuando estaba vacía fue de entorno a los 2 milímetros de mercurio de presión (calibrado con un manómetro manual y medido por el aparato Biopac de AstroMed). Para obtener el dato de diferencia de presión en la vejiga (presión de fuga) se sustrajo el valor de la presión tras la introducción del suero salino de la presión que se aplicó manualmente hasta ver cuando rebosaba el suero introducido.

El test se repitió 3 veces en cada animal durante varias semanas y se calculó la media de la LPP para cada animal.

Los resultados se evaluaron mediante la "t de student” calculada con el programa estadístico Graph Pad.

Visualización de las DMSCs en el modelo animal in vivo:

Para ver durante cuánto tiempo permanecían las células en la zona dañada en el modelo animal in vivo, se usaron células DMSCs marcadas con un marcador fluorescente en la zona del infra-rojo cercano Vivotrack 680nm (Perkin Elmer Ref: NEV12001). Las ratas control negativo fueron inyectadas con HBSS.

La tinción celular se realizó siguiendo el protocolo del fabricante, se concentraron las células a un volumen conocido, 25 microlitros de DMEM y otros 25 microlitros del colorante (VIVOTRACK 680, Perkin Elmer) resuspendido en agua, por cada 10 millones de células, durante 15 minutos a temperatura ambiente, se realizaron dos lavados con medio DMEM sin FBS o con PBS. Se resuspendieron al final del proceso a 2 millones de células en 120 microlitros de HBSS. La tinción celular se comprobó con el Citómetro Facscalibur, para ver el porcentaje de células vivas y teñidas. En general en cada tinción se observó que las células presentan un 95% de células vivas y un 80% de células teñidas.

Tras el trasplante de las células marcadas en la mucosa suburetral tal y como se ha indicado anteriormente, se examinaron in vivo durante las 3 semanas siguientes después del trasplante, mediante el aparato de bioluminiscencia in vivo XTREME I (Bruker).

3.1 Resultados en ratas con daño agudo:

En el caso de ratas con daño agudo, en la presión necesaria para el goteo (tras administrar 200 ^l) se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo tratado con las DMSCs y el grupo control en la quinta semana post-tratamiento (p=0,02), lo que sucedió también en la sexta semana post-tratamiento (p=0,03) (contado desde la primera semana de administración de las células); donde la diferencia de presión requerida para el goteo en las ratas tratadas con DMSCs fue mayor que en las ratas tratadas con el control (figura 3).

3.2 Resultados en ratas con daño crónico:

En relación a los experimentos de daño crónico, cuando se aplicaron las células y se esperó 4 semanas (tras administrar 200 ^l), como se puede apreciar en la figura 4, los resultados fueron muy consistentes y en la cuarta semana post-tratamiento (contado desde la primera vez desde la administración de las células) se observó una diferencia estadísticamente significativa entre el grupo tratado con las DMSCs y el grupo control (p=0,03) a las cuatro semanas post­ tratamiento; de modo que la presión requerida para el goteo en las ratas tratadas con DMSCs fue mayor que en las ratas tratadas con el control (figura 4).

En las ratas del experimento de repetición del tratamiento, al final del mismo (11 semanas contando desde la primera administración de las células, las cuales se inyectaron a la sexta semana del comienzo del experimento) (es decir, 17 semanas desde el daño, pero 11 semanas desde la primera inyección) se observó una diferencia estadísticamente significativa, en relación a la diferencia de presión requerida para el goteo, entre el grupo tratado con las DMSCs y el grupo control (p=0,0034 tras administrar 100 ^l; p=0,01 tras administrar 200 ^l) de modo que la presión requerida para el goteo en las ratas tratadas con DMSCs fue mayor que en las ratas tratadas con el control (figuras 5A y 5B). La diferencia con la media de todo el grupo y todas las semanas entre ambos grupos fue también significativamente estadística (p=0,005, tras administrar 200 ^l).

En la comparativa del llenado máximo de la vejiga entre el grupo control (HBSS) y el grupo de ratas con daño crónico que recibió las DMSCs inyectadas en la mucosa suburetral, tras aplicación repetida del tratamiento, se observó que las ratas que recibieron el control (HBSS) retenían mucho menos volumen (medido por la diferencia de presión) que las que habían recibido el tratamiento con las células (ver figura 6), con una diferencia estadística significativa de p=0,01 al final del experimento (11 semanas tras la primera administración de las DMSCs).

Se midió el volumen máximo de todas las ratas durante todo el proceso, el dato estadístico se refirió al grupo completo tanto control como animales con células, durante todo el proceso (es decir, cada animal tuvo 11 medidas). Se apreció que en aquellas ratas con mejores datos de presión de fuga (las que recibieron el tratamiento con las DMSCs) aumentó el volumen que eran capaces de retener en la vejiga (datos no mostrados).

3.3 Resultados de la localización de las células DMSCs en las ratas:

Con técnicas de imagen los investigadores fueron capaces de visualizar las DMSCs en la región de la uretra incluso 2 o 3 semanas después de su inyección en la mucosa suburetral en el modelo animal in vivo (ver figura 7, donde se aprecia dicha localización hasta los 10 días tras administración de las células).

Lista de citas

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Cannon TW, et al. BJU Int. 2002;90(4):403-407.

Claims (25)

REIVINDICACIONES

1. Células madre de la decidua parietalis de la placenta (DMSCs) que expresan las proteínas CD44, CD90, CD117, CD73, CD29, CD13, CD105, Oct-4, Rex1, GATA-4 y HLA clase I (HLA-ABC); y, además, no expresan las proteínas CD34, CD45, CD133, BCRP1, STRO-1, SSEA-1, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81, HLA clase II (HLA-DR), CD40L, CD80 y CD86; para su uso en el tratamiento de incontinencia urinaria de esfuerzo (IUE) crónica en un sujeto, donde las DMSCs se administran de forma repetida en al menos dos ocasiones al sujeto.

2. Las DMSCs para su uso según la reivindicación 1 donde la IUE crónica está causada por déficit del tejido conectivo que rodea el esfínter uretral.

3. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde el tratamiento de la IUE crónica se realiza mediante regeneración del tejido conectivo que rodea la uretra o la vejiga.

4. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que las DMSCs se administran en la mucosa suburetral, por vía intravenosa o por vía vaginal.

5. Las DMSCs para su uso según la reivindicación 4, caracterizado por que las DMSCs se administran a través de inyección local en la mucosa suburetral en al menos dos localizaciones.

6. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que entre cada administración de DMSCs se evalúa la IUE para decidir si el tratamiento ha sido efectivo o si el sujeto necesita una nueva administración.

7. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde las DMSCs se obtienen de placenta humana.

8. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en terapia de combinación con un medicamento, donde el medicamento es uno o más inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, o uno o más agonistas alfa adrenérgicos, o uno o más estrógenos, o cualquiera de sus combinaciones; y/o en combinación con rehabilitación del suelo pélvico.

9. Las DMSCs para su uso según la reivindicación 8, donde el inhibidor de la recaptación de serotonina y noradrenalina es duloxetina.

10. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, donde el agonista alfa adrenérgico es efredina, pseudoefedrina, fenilpropanolamina o cualquiera de sus combinaciones.

11. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el estrógeno es promestrieno, estriol, estradiol hemihidrato, deshidroepiandrosterona o cualquiera de sus combinaciones.

12. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el sujeto es una mujer.

13. Las DMSCs para su uso según la reivindicación 12, donde el sujeto es una mujer que se selecciona del grupo que consiste en: nulípara, primípara, multípara, nuligesta, primigesta y multigesta.

14. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13, donde el sujeto es una mujer con menopausia.

15. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el sujeto es un hombre que presenta déficit en el tejido conectivo que rodea el esfínter uretral.

16. Las DMSCs para su uso según la reivindicación 15, donde el sujeto es un hombre que presenta un daño en el tejido conectivo que rodea el esfínter uretral por haber sido previamente sometido a una cirugía de próstata.

17. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde las DMSCs se obtienen de la placenta de un individuo diferente al sujeto receptor de las DMSCs.

18. Las DMSCs para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde las DMSCs se obtienen de la placenta de una mujer que es el sujeto receptor de las DMSCs.

19. Una composición farmacéutica caracterizada por comprender una cantidad terapéuticamente efectiva de las DMSCs definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 y que además comprende uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables, para su uso en el tratamiento de IUE crónica en un sujeto.

20. Kit que comprende las DMSCs definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o la composición farmacéutica definida en la reivindicación 19 y que además comprende uno o más inhibidores de la recaptación de serotonina y noradrenalina, o uno o más estrógenos, o uno o más antagonistas alfa adrenérgicos, o cualquiera de sus combinaciones.

21. El kit según la reivindicación 20, donde el inhibidor de la recaptación de serotonina y noradrenalina es duloxetina.

22. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 o 21, donde el agonista alfa adrenérgico es efredina, pseudoefedrina, fenilpropanolamina, o cualquiera de sus combinaciones.

23. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, donde el estrógeno es promestrieno, estriol, estradiol hemihidrato, deshidroepiandrosterona o cualquiera de sus combinaciones.

24. Uso de un kit que comprende las DMSCs definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o la composición farmacéutica definida en la reivindicación 19 o del kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23 para el tratamiento de IUE crónica de un sujeto.

25. Un dispositivo que comprende las DMSCs definidas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o la composición farmacéutica definida en la reivindicación 19.