ES2803350T3 - Novedosos conjugados de anticuerpos adecuados para su uso en inmunoensayos aislados de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia - Google Patents

Abstract

Un conjugado para inmunoensayos de inactivación de la fluorescencia que comprende un anticuerpo unido a un conector, caracterizado por que en su extremo proximal, el conector está unido a la cadena de carbohidrato de la asparagina del sitio de N-glicosilación en la posición 297 o de la asparagina del sitio de N-glicosilación en una posición en estrecha proximidad con la posición 297 de la cadena Fc del anticuerpo, estando la longitud del conector en el intervalo de entre 5 y 85 Å de forma que el terminal distal del conector es capaz de interactuar con una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo; dicho conector es una molécula según la fórmula (I): A-L1-B-C-L2-D-E (I), en donde A es hidrazida, aminooxi o tiosemicarbazida; L1 y L2 se seleccionan entre un enlace, alquilo C1-10 o polietilenglicol (PEG); B es alquino, azida, tiol, tetrazina, DBCO, TCO, vinilo o metilciclopropeno; C es azida, alquino, maleimida, TCO, vinilo, metilciclopropeno, azida o tetrazina; D es un grupo seleccionado entre amino y tiol; y E es un inactivador oscuro seleccionado entre Atto612Q, DABCYL, rojo de metilo, colorantes de QSY-7 diarilrodamina y perclorato de 6-(dimetilamino)-2-[4-[4 (dimetilamino)fenil]- -1,3-butadienil]-1-etil quinolinio, un colorante de rodamina o Cy5, que comprende además un grupo NHS-éster o un grupo maleimida; y dicha molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo es un antígeno o un fragmento del mismo o un péptido, que es capaz de unirse al sitio de unión al antígeno del anticuerpo.

Description

DESCRIPCIÓN

Novedosos conjugados de anticuerpos adecuados para su uso en inmunoensayos aislados de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general al campo de los inmunoensayos de inactivación de la fluorescencia. Específicamente, la invención proporciona novedosos conjugados de anticuerpos adecuados para su uso en inmunoensayos de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia aislados, y métodos para producir estos conjugados de anticuerpos. La invención se refiere adicionalmente al uso de los novedosos conjugados de anticuerpos y a un kit que comprende los mismos.

Antecedentes de la técnica

Los anticuerpos son herramientas moleculares ampliamente usadas en el diagnóstico clínico, en terapia y en investigación (Chames, Van Regenmortel, Weiss, & Baty, 2009; Ecker, Jones, & Levine, 2015; Morgan & Levinsky, 1985; Scolnik, 2009; Siddiqui, 2010; Waldmann, 2003). En el campo del inmunodiagnóstico, los anticuerpos se usan para cuantificar biomarcadores clínicos en muestras biológicas complejas como la sangre (Wild, 2013). Estos denominados inmunoensayos pueden dividirse en técnicas homogéneas y heterogéneas (Wild, 2013). Estos inmunoensayos heterogéneos son el método de referencia actual para el diagnóstico clínico. Los inmunoensayos heterogéneos usan un par de anticuerpos para capturar y detectar el analito (Wild, 2013). Estos ensayos consiguen unas buenas sensibilidades, pero requieren etapas de lavado, lo que los hace complicados y lentos.

En los inmunoensayos homogéneos, el anticuerpo reacciona con el analito en solución, lo que permite unos tiempos de análisis mucho más cortos. Adicionalmente, los inmunoensayos homogéneos sólo requieren un anticuerpo específico para el analito, lo que los hace adecuados para detectar biomarcadores más pequeños. Debido a su velocidad y simplicidad, los inmunoensayos homogéneos son muy apropiados para el diagnóstico clínico (Hemmil & Mukkala, 2001; Leuvering, Thai, Waart, & Schuurs, 1980; Nargessi, Landon, & Smith, 1979a; Ullman, Schwarzberg, & Rubenstein, 1976; Wild, 2013). Sin embargo, al contrario que los ensayos heterogéneos, los inmunoensayos homogéneos tienen problemas en la generación de la señal, lo que hasta ahora da como resultado unos ensayos menos sensibles.

En la mayoría de los inmunoensayos homogéneos, la etapa de generación de la señal se basa en una competición entre el analito y una cantidad conocida de un analito marcado fluorescentemente. El denominado inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia usa dos anticuerpos: un anticuerpo específico del analito y un anticuerpo específico del fluoróforo, mediante lo cual la unión del anticuerpo específico del fluoróforo al fluoróforo reduce la intensidad de la fluorescencia. Ambos anticuerpos compiten por la unión al analito marcado fluorescentemente. En el estado estacionario se genera una señal fluorescente dada. Mediante la unión de un analito adicional sin marcar, a través de la aplicación de una muestra, el estado estacionario cambia y el anticuerpo específico del fluoróforo puede inactivar más señal de fluorescencia. La Figura 1 muestra un esquema de un inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia típico. La concentración de analito es, sin embargo, desproporcionada con respecto a la señal de fluorescencia (Nargessi, Landon, & Smith, 1979b; Zuk, Rowley, & Ullman, 1979).

Kreisig et. al han propuesto una versión modificada del inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia (Kreisig, Hoffmann, & Zuchner, 2011). Este inmunoensayo homogéneo basado en FRET consiste en un anticuerpo marcado con un inactivador oscuro y un péptido marcado fluorescentemente. Tanto el analito como el péptido se mezclan entre sí y compiten por la unión al anticuerpo posteriormente añadido. Cuando el péptido es unido por el anticuerpo, el inactivador oscuro y el fluoróforo están en proximidad espacial, dando como resultado una reducción en la señal de fluorescencia. Por el contrario, cuando el analito está unido, el péptido es desplazado y el fluoróforo unido ya no es inactivado y emite luz. En el estado estacionario de esta reacción, la luz emitida es proporcional a la concentración de analito, como se muestra en la Figura 2. Debido a que el estado estacionario de esta reacción puede alcanzarse ya después de 90 segundos, este ensayo es muy atractivo como análisis de diagnóstico inmediato (POCT). Sin embargo, el inmunoensayo homogéneo basado en FRET de Kreisig et. al no permite la cuantificación de biomarcadores a las concentraciones clínicamente pertinentes.

Las publicaciones adicionales de Kreisig et. al describen adicionalmente el principio de un inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia. Al contrario que el inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia, en el inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia, el anticuerpo marcado con el inactivador oscuro se mezcla previamente con el péptido marcado con el fluoróforo. Esta etapa de preincubación da como resultado una señal de partida más baja, aspirando a generar unos mayores cocientes entre señal y ruido, que deberían incrementar la sensibilidad del ensayo. Con objeto de generar una elevada señal específica del analito, el analito añadido consecuentemente debe desplazar activamente el péptido unido. Sin embargo, Kreisig et. al no pudieron demostrar la funcionalidad del inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia, y, por lo tanto, se formuló la hipótesis de que la etapa de generación de la señal es problemática mediante el uso de este método (Kreisig et al., 2013, 2015).

Después de analizar los componentes del ensayo, hemos formulado además la hipótesis de que el anticuerpo marcado con el inactivador oscuro impide la etapa de generación de la señal. Kreisig et. al generaron el anticuerpo marcado con el inactivador oscuro mediante reacciones de NHS-éster. Como consecuencia de esta estrategia de bioconjugación, los inactivadores oscuros están distribuidos aleatoriamente en la superficie del anticuerpo, dando potencialmente como resultado una inactivación no dirigida de los péptidos de difusión libre en el estado estacionario de la reacción (Fig. 3). Dicha inactivación no dirigida de los péptidos de difusión libre podría explicar tanto la limitada sensibilidad del inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia como la ausencia de funcionalidad del inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia.

Se han propuesto varias técnicas de bioconjugación, pero no se ha descrito que ninguna estrategia genere específicamente una interacción intramolecular con el sitio de unión al antígeno sin interferir en la afinidad de los anticuerpos (Agarwal & Bertozzi, 2015; Kim, Ko, Park, & Lee, 2016; Kumar et al., 2015; Liberatore et al., 1990; Packard, Edidin, & Komoriya, 1986; Schumacher et al., 2015; Schumacher, Hackenberger, Leonhardt, & Helma, 2016; Sochaj, Swiderska, & Otlewski, 2015; Zimmerman et al., 2014).

Le, H. T. et al. (2013) divulga anticuerpos funcionalizados con un reticulador de reactividad doble de etinil hidrazida/clic. La longitud del reticulador divulgado en D1 es fija debido a su estructura química definida. El reticulador divulgado en Le et al. no es capaz de realizar una unión intramolecular con una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del mismo anticuerpo.

Fischer-Durand, N. et al. (2012) divulga un conjugado de IgG-colorante de cumarina, pero no enseña el sitio del anticuerpo en el que está conjugado el reticulador con grupos terminales alquino e hidrazida.

Dovgan, I. et al. (2017) y RESCHKE M. L. et al. (2014) divulgan conjugados de anticuerpos en los que se acopla una molécula de interés a un resto de lisina del anticuerpo a través de química de clic.

Liu, G. et al. (2017) divulga conjugados de anticuerpos, en los que se acopla una molécula de interés a un resto de cisteína del anticuerpo a través de química de clic.

El documento WO 2015/157446 A1 divulga glicoconjugados de anticuerpo-fármaco específicos de sitio, que están funcionalizados con al menos una fracción de ácido siálico a través de un remodelado enzimático de glicano. La sialilación del anticuerpo se consigue poniendo en contacto el anticuerpo o un fragmento del mismo con CMP-ácido siálico funcionalizado y una sialiltransferasa y en unas condiciones y durante un tiempo suficiente para unir al menos un ácido siálico funcionalizado en un oligosacárido unido por N del anticuerpo o en un fragmento del mismo, tal como un fragmento Fc. Un ejemplo de sialiltransferasa es la ST6Gal.

El documento WO 2014/065661 A1 divulga conjugados de anticuerpos que comprenden un sustituyente núcleo-GlcNAc-S(A)x de fórmula (4):

en donde AB en la fórmula (4) representa un anticuerpo. Con objeto de producir dichos anticuerpos modificados, en primer lugar, se recortan los anticuerpos monoclonales, es decir, se desglicosilan con endo S de Streptomyces pyogenes y después se someten a una introducción enzimática de un derivado de galactosa.

El documento US 2015/361090 A1 divulga conjugados marcados con fluoróforo, bi- o multifuncionales, químicamente activos y/o biológicamente activos, y composiciones y métodos relacionados de los mismos.

Descripción de la invención

Por consiguiente, el problema de invención es proporcionar una técnica de bioconjugación que supere los problemas de la técnica anterior, en particular que supere la limitada sensibilidad y la ausencia de funcionalidad de los inmunoensayos de inactivación de la fluorescencia conocidos.

Este problema es resuelto mediante la provisión de un conjugado según la reivindicación 1.

En una realización preferida, la invención proporciona un conjugado que comprende un anticuerpo unido a un conector, caracterizado porque la longitud del conector es adaptable de forma que el terminal libre del conector es capaz de interactuar con una molécula capturada en el sitio de unión al anticuerpo.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y abarca específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada. El anticuerpo puede ser una IgM, una IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4), una IgD, una IgA o una IgE, por ejemplo.

Los "fragmentos de anticuerpos" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente, la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Algunos ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y fragmentos Fv: diacuerpos; moléculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.

La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en pequeñas cantidades. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos, estando dirigidos contra un único sitio antigénico. Asimismo, a diferencia de las preparaciones de un "anticuerpo policlonal", que normalmente incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra determinantes (epítopos) diferentes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales pueden ser frecuentemente ventajosos porque son sintetizados mediante el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido a partir de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo mediante cualquier método en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales para su uso según la presente invención pueden elaborarse mediante el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler y col., Nature, 256: 495 (1975), o pueden elaborarse mediante los métodos generalmente bien conocidos de ADN recombinante. Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse a partir de fagotecas de anticuerpos usando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales del presente documento incluyen específicamente anticuerpos quiméricos (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las correspondientes secuencias de los anticuerpos procedentes de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo en particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión al antígeno de los anticuerpos) que contienen una secuencia mínima procedente de una inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los restos de una región determinante de la complementariedad (CDR) del receptor se reemplazan por restos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los restos de la región flanqueante (FR) del Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los correspondientes restos no humanos. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender restos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en las CDR o las secuencias flanqueantes importadas.

Estas modificaciones se realizan para refinar y optimizar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. Generalmente, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y normalmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas regiones las CDR corresponden a los de una inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado comprenderá también óptimamente al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina (Fc), normalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Reichmann et al, Nature. 332: 323-329 (1988): y Presta, Curr. Op. Struct. Biel., 2: 593-596 (1992). El anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo Primatized™ en donde la región de unión al antígeno del anticuerpo procede de un anticuerpo producido mediante la inmunización de monos macacos con el antígeno de interés.

Los fragmentos de anticuerpos "Fv monocatenarios" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL de un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En general, el polipéptido Fv comprende además un conector polipeptídico entre los dominios VH y VL que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión del antígeno. Para una revisión de sFv véase Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.

113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994).

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos con dos sitios de unión al antígeno, fragmentos que comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VD) en la misma cadena polipeptídica (VH -VD). Usando un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, se obliga a los dominios a emparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sol. EE.UU., 90: 6444-6448 (1993). Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir con los usos diagnósticos o terapéuticos del anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos o no proteicos. En algunas realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará (1) hasta más de un 95 % en peso de anticuerpo determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más de un 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 restos de la secuencia de aminoácidos N terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria o (3) hasta homogeneidad mediante una SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, una tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ en el interior de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Habitualmente, sin embargo, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación.

Como se usan en el presente documento, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se pueden usar indistintamente, y todas estas denominaciones incluyen la descendencia. Por lo tanto, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objeto primaria y los cultivos procedentes de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. Se entiende también que toda la descendencia puede no ser exactamente idéntica en el contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o involuntarias. Se incluyen descendientes mutantes que tienen la misma función o actividad biológica que la usada para cribar la célula transformada originalmente. Cuando se pretendan denominaciones distintas, esto resultará evidente a partir del contexto.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", como se usan en el presente documento, son intercambiables y están definidos para significar una biomolécula formada por aminoácidos unidos por un enlace peptídico.

Los términos "un", "uno/a" y "el/la" como se usan en el presente documento están definidos para significar "uno/a o más" e incluyen el plural salvo que el contexto sea inapropiado.

En una realización preferida, en el conjugado y/o en los métodos de la invención puede usarse cualquier anticuerpo que ya sea conocido en la técnica.

En una realización más, el conjugado según la invención comprende un anticuerpo monoclonal o policlonal, preferentemente un anticuerpo monoclonal. En una realización preferida adicional, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo quimérico.

En una realización preferida adicional más, el anticuerpo es un anticuerpo aislado.

El "polipéptido objetivo" puede ser cualquier polipéptido, péptido, sustrato, antígeno o analito, que puede ser el objeto de investigación en un inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia. La invención no está limitada a un polipéptido objetivo específico. Por consiguiente, la invención tampoco está limitada a un anticuerpo definido específicamente. Los anticuerpos van a ser producidos, por ejemplo, con cualquier técnica conocida en la técnica, para que el propósito deseado esté comprendido en un conjugado para su uso en un inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, puede usarse cualquier anticuerpo, preferentemente un anticuerpo monoclonal conocido en la técnica.

Un anticuerpo, que puede estar comprendido en el conjugado de la invención, puede seleccionarse, por ejemplo, entre:

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la Troponina-I cardíaca, (marcador clínico para validar trastornos cardíacos), por ejemplo, clones de hibridoma monoclonal de ratón seleccionados entre 8E10, C5, 4C2, 19C7, 16A11, 3C7, P4-14G5, M18, M155, MF4, 16A12, P4-9F6, 228, 625, 458, 267, 596, 84, 415, 581, 10F4, 247, 560, 17F3, p45-10, 916, 909, 820, 810, 801. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4T21.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la Troponina-T cardíaca, (marcador clínico para validar trastornos cardíacos), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón 9G6, 7F4, 7G7, 2F3, 1A11, 1C11, 1F11, 7E7. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4T19.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar el NT-ProBNP, (marcador clínico para validar trastornos cardíacos), por ejemplo, clones de hibridoma monoclonal de ratón. 5F11cc, 13G12cc, 15C4cc, 24E11cc, 29D12cc, 18H5cc. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4NT1cc.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la mioglobina cardíaca, (marcador clínico para validar trastornos cardíacos), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón 4E2, 7C3, IB4. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4M23.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar el dímero D, (marcador de la coagulación sanguínea), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón DD1, DD2, DD3, DD4, DD5, DD6, DD22, DD41, DD44, DD46, DD93, DD189, DD255. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4D30.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la insulina, (marcador clínico para validar el síndrome metabólico), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón C7C9, D4B8, 7F8, 3A6, 7F5. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 211.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar el péptido C, (marcador clínico para validar el síndrome metabólico), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón 1H8, 2B7, 4H8, 5B8, 7E10, 2A11. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 2I2.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la cistatina-C, (marcador clínico para validar enfermedades renales), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón Cyst10, Cyst13, Cyst16, Cyst18, Cyst19, Cyst23, Cyst24, Cyst28, Cyst11, Cyst20, Cyst29. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4CC1.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la proteína C reactiva, (marcador clínico para validar el estado de inflamación), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7, CRP11, CRP30, CRP36, CRP103, CRP135, CRP169. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4C28.

• los anticuerpos adecuados capaces de detectar la interleucina-6, (marcador clínico para validar el estado de inflamación), por ejemplo, los clones de hibridoma monoclonal de ratón B10, G5. Estos clones de hibridoma monoclonal de ratón se describen y pueden adquirirse en HyTest Ltd., ID de catálogo 4IL6.

La "molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo" puede ser idéntica al anteriormente descrito "polipéptido objetivo", es decir, se selecciona entre cualquier polipéptido, péptido, sustrato, antígeno o analito, contra el cual se ha creado el anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención, y que es capaz de unirse a la región de unión del anticuerpo. Más preferentemente, la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo es un antígeno o un fragmento del mismo, que es capaz de unirse a la región de unión del anticuerpo.

La molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo es adecuadamente un derivado (por ejemplo, un péptido pequeño, un fragmento, etc.) derivado del analito o el antígeno intacto natural o completo presente en una muestra. La molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo puede ser modificada adicionalmente de tal forma (por ejemplo, mediante mutaciones puntuales) que se altere la afinidad por la unión al anticuerpo, en particular que se reduzca, en comparación con el analito intacto. Por lo tanto, se mejora la capacidad del analito para desplazar la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo. Alterando, es decir, la reducción de la afinidad de la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo también puede conseguirse mediante cualquier otro método conocido en la técnica, tal como una modificación química mediante, por ejemplo, una biotinilación, una glicosilación, etc.

Algunos ejemplos de antígenos que pueden detectarse usando el conjugado y los métodos de la invención son, por ejemplo, biomarcadores clínicos pertinentes como:

Troponina-I, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

Troponina-T, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

• CRP, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

• Procalcitonina, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Interleucina-6, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Interleucina-8, un marcador clínico para validar el estado de inflamación

Interleucina-11, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Hormona paratiroidea, un marcador clínico to monitorizar y validar una paratiroidectomía;

Dímero D, un marcador clínico para validar la coagulación sanguínea;

NT-proBNP, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

BNP, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

Insulina, (marcador clínico para validar el síndrome metabólico;

Péptido C, un (marcador clínico para validar el síndrome metabólico; y

Cistatina C, un marcador clínico para validar enfermedades renales.

La invención no está limitada, sin embargo, a los antígenos mencionados anteriormente. El conjugado y los métodos de la invención pueden ser adaptados a cualquier antígeno, analito o biomarcador conocido o desconocido hasta ahora.

En otra realización preferida, la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo es un fragmento de un antígeno, que puede ser conocido en la técnica, o que es un péptido sintético. La secuencia de aminoácidos de un péptido sintético se adapta adecuadamente de forma que se facilite la unión en el sitio de unión del anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención. En una realización más preferida, dicho fragmento de antígeno o péptido sintético tiene una longitud de la cadena de entre 4 y 22 aminoácidos, más preferentemente de entre 5 y 15 aminoácidos, lo más preferentemente de entre 6 y 12 aminoácidos. Esto tiene la ventaja de que puede asegurarse una inactivación intramolecular específica únicamente en el sitio de unión al antígeno.

La invención proporciona un novedoso conjugado para su uso en inmunoensayos de inactivación de la fluorescencia. Por consiguiente, en una realización preferida adicional de la invención, la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo se marca con una molécula generadora de señal.

La molécula generadora de señal se selecciona adecuadamente entre el grupo que consiste en: marcadores fluorescentes, marcadores enzimáticos, radioisótopos, marcadores quimioluminiscentes, marcadores electroquimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, polímeros, partículas de polímero, puntos cuánticos, partículas metálicas, haptenos y colorantes. En otras realizaciones en particular, la fracción generadora de señal comprende un marcador enzimático.

Según la invención se prefiere una molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo, que está marcada con un fluoróforo o un quimioluminóforo. Los fluoróforos o quimioluminóforos adecuados están, en general, disponibles comercialmente en diversas fuentes. Según la invención se prefieren los colorantes TRF y los puntos cuánticos.

Un "fluoróforo" según la invención se selecciona preferentemente entre la clase general conocida como colorantes de cianina, con unas longitudes de onda de emisión de entre 550 nm y 900 nm. Estos colorantes pueden contener grupos metino y su número afecta a las propiedades espectrales del colorante. Los colorantes de monometina, que son piridinas, tienen normalmente una emisión de fluorescencia de color azul verdoso, mientras que las quinolinas tienen una emisión de fluorescencia de color amarillo verdoso. Los análogos de los colorantes de trimetina están sustancialmente desplazados hacia longitudes de onda del rojo, y los de colorantes de pentametina están desplazados incluso más, mostrando a menudo una emisión de fluorescencia infrarroja. Los fluoróforos o los quimioluminóforos están, en general, disponibles comercialmente en diversas fuentes. Según la invención se prefieren los colorantes TRF y los puntos cuánticos.

Los colorantes TRF (fluorometría de resolución tardía) implican fluoróforos que están basados en complejos de iones de lantánidos. Los metales lantánidos son particularmente útiles. Algunas aplicaciones en las ciencias biosanitarias aprovechan las propiedades de fluorescencia únicas de los complejos de iones de lantánidos (Ln(III) quelatos o criptatos). Estos son muy adecuados debido a sus grandes desplazamientos de Stokes y a las extremadamente largas duraciones de la emisión (desde microsegundos hasta milisegundos) en comparación con los fluoróforos más tradicionales (por ejemplo, fluoresceína, aloficoianina, ficoeritrina y rodamina).

Los dos lantánidos usados más habitualmente en los ensayos de ciencias biosanitarias son europio3+/aloficocianina y terbio3+/ficoeritrina.

La ventaja de usar colorantes TRF es porque los líquidos biológicos o el suero usados habitualmente en estos ensayos contienen muchos compuestos y proteínas que son autofluorescentes. Por tanto, el uso de una medición de la fluorescencia convencional en el estado estacionario presenta unas graves limitaciones en la sensibilidad del ensayo. Los fluoróforos de vida larga, tales como los lantánidos, combinados con una detección de resolución tardía (un retraso entre la excitación y la detección de la emisión) minimiza la rápida interferencia de la fluorescencia.

Los colorantes TRF son especialmente útiles en los ensayos de FRET.

Según la invención, pueden usarse colorantes relacionados y se seleccionan adicionalmente entre derivados de ciclobutenodiona, compuestos de cefalosporina sustituidos, composiciones de escuaraína fluorada, escuaraínas simétricas y asimétricas, alquilalcoxi escuaraínas o compuestos de escuarilio. Algunos de estos colorantes pueden fluorescer en el infrarrojo cercano, así como en longitudes de onda infrarrojas que ampliarían eficazmente el intervalo del espectro de emisión hasta aproximadamente los 1.000 nm. Además de las escuaraínas, es decir, los derivados del ácido escuárico, también pueden seleccionarse colorantes hidrófobos tales como ftalocianinas y naftalocianinas para operar a unas longitudes de onda más largas. Otras clases de fluoróforos incluyen ácido 3-hidroxipiren 5,8,10-trisulfónico, 5-hidroxitriptamina (5-HT), fucsina ácida, naranja de acridina, rojo de acridina, amarillo de acridina, acriflavina, AFA (acriflavina Feulgen SITSA), Alizarin Complexon, Alizarin Red, aloficocianina, ACMA, aminoactinomicina D, aminocumarina, estearato de antroílo, poliolefina sustituida con arilo o heteroarilo, Astrazon Brilliant Red 4 G, Astrazon Orange R, Astrazon Red 6B, Astrazon Yellow 7 GLL, Atabrina, Auramina, Aurofosfina, Aurofosfina G, BAO 9 (Bisaminofeniloxadiazol), BCECF, sulfato de berberina, bisbenzamida, BOBO 1, solución de Blancophor FFG, Blancophor SV, Bodipy F1, BOPRO 1, Brilliant Sulphoflavin FF, Calcien Blue, verde de calcio, solución de calcoflúor rW, blanco de calcoflúor, solución de Calcophor White ABT, solución de Calcophor White Standard, carbocianina, carboestirilo, Cascade Blue, Cascade Yellow, catecolamina, quinacrina, corifosfina O, cumarina, cumarina-faloidina, CY3.1 8, CY5.1 8, CY7, Dans (ácido 1-dimetilaminonafalin 5 sulfónico), Dansa (ácido diaminonaftilsulfónico), Dansil NH-CH3, DAPI, diaminofenil oxidiazol (DAO), ácido dimetilamino-5-sulfónico, difluoruro de dipirrometenboro, Diphenil Brilliant Flavine 7GFF, dopamina, eosina, eritrosina ITC, bromuro de etidio, eucrisina, FIF (fluorescencia inducida por formaldehído), Flazo Orange, Fluo 3, fluorescamina, Fura-2, Genacril Brilliant Red B, Genacril Brilliant Yellow 10GF, Genacril Pink 3G, Genacril Yellow 5GF, ácido gloxálico, Granular Blue, hematoporfirina, Hoechst 33258, Indo-1, Intrawhite Cf Liquid, Leucophor PAF, Leucophor SF, Leucophor WS, Lissamine Rhodamine B200 (RD200), Lucifer Yellow CH, Lucifer Yellow Vs , Magdala Red, Marina Blue, Maxilon Brilliant Flavin 10 GFF, Maxilon Brilliant Flavin 8 GFF, MPS (Verde de metilo pironina estilbeno), mitramicina, NBD amina, rojo del Nilo, nitrobenzoxadidol, noradrenalina, Nuclear Fast Red, Nuclear Yellow, Nilosan Brilliant Flavin E8G, verde Oregón, oxazina, oxazol, oxadiazol, Pacific Blue, pararosanilina (Feulgen), solución de Phorwite AR, Phorwite BKL, Phorwite Rev, Phorwite RPA, fosfina 3R, ftalocianina, ficoeritrina R, Polyazaindacene Pontochrome Blue Black, porfirina, primulina, Procion Yellow, yoduro de propidio, pironina, pironina B, Pyrozal Brilliant Flavin 7GF, mostaza de quinacrina, rodamina 123, rodamina 5 GLD, rodamina 6G, rodamina B, rodamina B 200, rodamina B Extra, rodamina BB, rodamina BG, rodamina WT, Rose Bengal, serotonina, Sevron Brilliant Red 2B, Sevron Brilliant Red 4G, Sevron Brilliant Red B, Sevron Orange, Sevron Yellow L, SITS (primulina), SITS (Ácido estilbeno isotiosulfónico), estilbeno, Snarf 1, Sulfo Rodamina B Can C, Sulfo Rodamina G Extra, tetraciclina, rojo de Texas, Thiazine Red R, tioflavina S, tioflavina TCN, tioflavina 5, Thiolyte, Thiozol Orange, Tinopol CBS, TOTO 1, TOTO 3, True Blue, Ultralite, Uranine B, Uvitex SFC, naranja de xileno, XRITC, YO PRO 1 o combinaciones de los mismos.

Un experto en la técnica sabría cuál seleccionar entre dichos colorantes de fluorescencia siempre que las deseadas propiedades de emisión y de absorción, así como sus propiedades químicas, tales como las propiedades hidrófobas, sean apropiadas. Las propiedades espectrales de los colorantes fluorescentes deberían, según una realización preferida de la invención, ser suficientemente similares en las longitudes de onda de excitación y en intensidad con respecto a los derivados de fluoresceína o de rodamina como para permitir el uso de los mismos.

La unión del fluoróforo a la molécula, que es capturada o que va a ser capturada en el sitio de unión del anticuerpo que está comprendido en el conjugado de la invención, puede conseguirse mediante cualquiera de las técnicas familiares para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el fluoróforo puede unirse covalentemente a la sonda biomolecular mediante los métodos divulgados en los documentos US 5.194.300 y US 4.774.189.

En una realización preferida adicional de la invención, el fluoróforo facilita la inactivación, en particular, la inactivación oscura en combinación con una molécula inactivadora o una molécula inactivadora oscura, que está unida al conector.

Por consiguiente, la invención proporciona además un conjugado, en donde el conector comprende un inactivador o funciona como una molécula inactivadora. Más preferentemente, el conector comprende un inactivador oscuro.

La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) es un proceso mediante el cual un primer colorante fluorescente (el colorante "donante") es excitado, normalmente mediante iluminación, y transfiere su energía absorbida a un segundo colorante (el colorante "aceptor") que tiene una longitud de onda más larga, y, por lo tanto, una menor emisión de energía. Cuando el segundo colorante es fluorescente, la transferencia de energía da como resultado una emisión fluorescente en la longitud de onda del segundo colorante. Sin embargo, cuando el segundo colorante no es fluorescente, la energía absorbida no da como resultado la emisión de fluorescencia, y se dice que la fluorescencia del colorante donante inicial está "inactivada". La transferencia de energía también puede utilizarse para inactivar la emisión de donantes luminiscentes, incluyendo donantes fosforescentes y quimioluminiscentes. Cuando una emisión luminiscente es restaurada al impedir la transferencia de energía, se dice que la luminiscencia está "desinactivada" o "no inactivada". El uso de diversos colorantes para inactivar la fluorescencia es conocido en la técnica. La aplicación de este fenómeno para analizar sistemas biológicos también está bien detallada. La FRET se ha utilizado para estudiar la hibridación y la amplificación del ADN, la dinámica del plegamiento de las proteínas, la degradación proteolítica y las interacciones entre otras biomoléculas.

El propio inactivador puede ser una molécula fluorescente que emite fluorescencia a una longitud de onda característica. Por lo tanto, un fluoróforo puede actuar como inactivador cuando se acopla apropiadamente a otro colorante, y viceversa. En este caso, el aumento en la fluorescencia de la molécula aceptora, que está en una longitud de onda diferente a la del marcador donante, también indicará la unión del sitio de unión del anticuerpo. Alternativamente, el aceptor no fluoresce ("aceptor oscuro" o "inactivador oscuro"): Dichos aceptores incluyen DABCYL, rojo de metilo, los colorantes QSY-7 diarilrodamina y perclorato de 6-(dimetilamino)-2-[4-[4 (dimetilamino)fenil]-1,3-butadienil]-1-etil quinolinio (número de CAS 181885-68-7). Algunos compuestos típicos de fluoróforo/inactivador incluyen ciertos colorantes de rodamina o Cy5.

DABCYL ácido (4'dimetilaminofenilazo) benzoico es un inactivador oscuro habitual ampliamente usado en muchos ensayos, tales como "balizas moleculares" para la detección de ADN (documento US 5.989.823). Los colorantes diazo de la serie BHQ, que se denominan "inactivadores de agujero negro" (documento WO 01/86001), proporcionan un amplio intervalo de absorción que se solapa bien con la emisión de muchos fluoróforos. Los colorantes de la serie QSY de Molecular Probes son otra serie de Inactivadores oscuros usados ampliamente como reactivos de inactivación en muchos bioensayos (documento US 6.399.392). La estructura del QSY 7 se ilustra en el documento US 2005/0014160. El QSY-7 es un derivado no fluorescente de la diarilrodamina. El QSY21 es un cromóforo no fluorescente de diarilrodamina con una fuerte absorción en el espectro visible, y es un eficaz inactivador de la fluorescencia.

Con mucho, la pareja de colorante dador-aceptor más habitual utilizada en aplicaciones biomédicas es DABCYL (el colorante de inactivación) y EDANS (el fluoróforo).

Una pareja de inactivador oscuro - fluoróforo preferida según la invención se selecciona entre Atto612Q (Kokko, T. et al., 2007) y DyQ2 (Dyomics GmbH, Alemania; PM: 842,88 g/mol; Fórmula molecular: C40H39N2O13S2 * Na) (inactivador oscuro) y EuLH (como fluoróforo). EuLH es el ácido (6,9-dicarboximetil-3-{4-([1,10]-fenantrol-2-iletinilfenilcarbamoil)-metil}-3,6,9-triaza-)-undeca-1,11-dicarboxílico (LH4) en un complejo con Eu3+ (Zuchner et al., 2009).

El inactivador, como se cita en el presente documento, es acoplado a un conector. El conector se selecciona entre diversos grupos conectores, que incluyen grupos conectores de alquilo inferior, cicloalquilo y heterocicloalquilo que se extienden desde el inactivador activo a la estructura del núcleo, es decir, la región Fc del anticuerpo comprendida en el conjugado de la invención, donde se une el conector-molécula inactivadora. Preferentemente, el inactivador, más preferentemente el inactivador oscuro, se une al extremo distal del conector. A este respecto, unido significa que el inactivador oscuro está unido al extremo distal del conector a través de un grupo amino-éster de NHS o un grupo tiolmaleimida.

En una realización preferida de la invención, el inactivador oscuro está unido al extremo distal del conector a través de un grupo amino-éster de NHS.

En otra realización de la invención, el inactivador oscuro está unido al extremo distal del conector a través de un grupo tiolmaleimida.

En su extremo proximal, el conector está unido a través de una novedosa estrategia de acoplamiento con conector de carbohidrato (CLC) usando un resto de asparagina N-glicosilada en la cadena Fc del anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención como grupo químico reactivo. Preferentemente, como grupo químico reactivo se usa la asparagina 297 N-glicosilada del fragmento Fc del anticuerpo del anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención. La asparagina aparece de forma natural en prácticamente todos los anticuerpos, particularmente en los anticuerpos monoclonales, en la posición 297 de la cadena Fc. Sin embargo, el ámbito de la invención también comprende anticuerpos genotecnológicos, en los que, por ejemplo, mediante mutaciones puntuales, sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, la posición de la asparagina se mueve a una posición en estrecha proximidad con la posición 297. Una estrecha proximidad significa una posición en el intervalo de entre 294 y 300 de la cadena Fc, preferentemente en el intervalo de entre 295 y 299, más preferentemente en el intervalo de entre 296 y 298. Dado que la glicosilación en los anticuerpos es específica de la asparagina 297, sorprendentemente se averiguó que este sitio específico podría usarse como un punto de referencia intramolecular. Esto significa que la distancia entre el punto de referencia y el sitio de unión al antígeno permanece constante, incluso entre anticuerpos monoclonales diferentes (Mizuochi, Taniguchi, Shimizu, & Kobata, 1982; Weitzhandler et al., 1994; Wright et al., 1997). Sin embargo, para facilitar las interacciones moleculares directas, se requieren unas distancias en el intervalo nanométrico bajo (por ejemplo, para interacciones de FRET: 2-9 nm) (Mizuochi et al., 1982; Weitzhandler et al., 1994; Wright et al., 1997). Con objeto de facilitar esas interacciones, el conector entre el grupo de carbohidrato terminal y el inactivador oscuro muestra las siguientes características:

En general, los conectores preferidos tienen entre 5 y 100 enlaces de un extremo a otro, preferentemente entre 20 y 40 enlaces, y pueden ser de cadena ramificada o lineal o contener anillos. Los enlaces pueden ser enlaces carbonocarbono o carbono-heteroátomo o heteroátomo-heteroátomo. La unión puede estar diseñada para ser hidrófoba o hidrófila. El conector puede contener enlaces simples y/o dobles, un número de 0 -10 heteroátomos (se prefieren O, S), y anillos saturados o aromáticos. El conector puede contener agrupamientos tales como éster, éter, sulfuro, disulfuro y similares.

En una realización más preferida, la longitud del conector es adaptable que forma que la molécula inactivadora del conector está interactuando intramolecularmente con el fluoróforo de la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo, siendo por tanto inhibida (inactivada) la fluorescencia del fluoróforo mediante esta unión.

Con objeto de garantizar una inactivación intramolecular específica únicamente en el sitio de unión al antígeno en el conjugado de la invención, el conector tiene normalmente una longitud en el intervalo de entre 5 y 85 A, de entre 10 y 65 A, preferentemente en el intervalo de entre 15 y 45 A, más preferentemente en el intervalo de entre 15 y 40 o de entre 15 y 35 A, lo más preferentemente en el intervalo de entre 15 y 30, de entre 20 y 30 o de entre 20 y 25 A. Los mejores resultados de inactivación podrían conseguirse con una longitud de conector de entre 20 y 30 A, particularmente con una longitud de conector de 25 A.

En una realización preferida, el conector de la invención es una molécula según la fórmula (I):

A-L1-B-C-L2-D-E (I),

en donde

A es hidrazida, aminooxi o tiosemicarbazida;

L1 y L2 se seleccionan entre un enlace, alquilo, polietilenglicol (PEG), poliamida, péptido, carbohidrato, oligonucleótido o polinucleótido;

B es alquino, azida, tiol, tetrazina, DBCO, TCO, vinilo o metilciclopropeno;

C es azida, alquino, maleimida, TCO, vinilo, metilciclopropeno, azida o tetrazina;

D es un grupo seleccionado entre amino y tiol; y

E es un inactivador, preferentemente un inactivador oscuro como se describe en el presente documento, que comprende además un grupo NHS-éster o un grupo maleimida, como se describe en el presente documento, En una realización más preferida de la invención, el conector es una molécula según la fórmula (I) con los prerrequisitos de que:

cuando B es alquino, entonces C es azida;

cuando B es azida, entonces C es alquino;

cuando B es tiol, entonces C es maleimida;

cuando B es tetrazina, entonces C es TCO, vinilo o metilciclopropeno;

cuando B es DBCO, entonces C es azida; y

cuando B es TCO, vinilo o metilciclopropeno, entonces C es tetrazina.

El grupo químico A está unido al extremo proximal del conector y conecta el conector a la cadena de carbohidrato de la asparagina del sitio de N-glicosilación en la posición 297 o una posición en estrecha proximidad con la posición 297 de la cadena Fc del anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención.

Los grupos químicos B y C se hacen reaccionar y se unen a través de una química de clic.

El grupo químico D está unido al extremo distal del conector y conecta el extremo distal del conector a la molécula inactivadora E.

Los compuestos del grupo químico A pueden combinarse y usarse con cualquier compuesto del grupo químico B. Los grupos químicos A y B pueden formar conjuntamente un grupo hidrazida alquino. Preferentemente, el grupo hidrazina alquino formado por los grupos químicos A y B es un compuesto de fórmula (II):

H²N-NH-(C=O)-L 1-CECH (II),

en donde

L1 es un enlace o alquilo C^1-10.

Preferentemente, L1 es alquilo C^2-7.

Más preferentemente, L1 es etilo, propilo o butilo.

Lo más preferentemente, L1 es etilo.

Los compuestos de fórmula (II) de la invención son adecuadamente conocidos en la técnica. Los compuestos de fórmula (II) preferidos tienen asignado un registro de CAS y/o número de ReaxysFile y se seleccionan entre los compuestos mostrados en la Tabla 1.

Tabla 1: Com uestos de hidrazida-al uino de fórmula II

L1 y /o L2 pueden comprender, consistir esencialmente o consistir en alquilo C1-10, polietilenglicol (PEG), una poliamida, un péptido, un carbohidrato, un oligonucleótido o un polinucleótido.

En una realización preferida según la invención, el extremo proximal del conector comprende, consiste esencialmente o consiste en un compuesto de fórmula (II) y L2 es PEG.

Además, preferentemente, L1 y L2 pueden ser ambos PEG.

Además, preferentemente, L1 es alquilo C1-10 y L2 es PEG.

Además, preferentemente, L1 es PEG y L2 es alquilo C1-10.

El PEG es un oligómero o un polímero formado por monómeros de óxido de etileno. Debido a que las diferentes aplicaciones requieren diferentes longitudes de la cadena polimérica, los PEG se preparan mediante la polimerización de óxido de etileno, y están disponibles comercialmente en un amplio abanico de pesos moleculares desde 300 g/mol hasta 10.000.000 g/mol. Mientras que los PEG con diferentes pesos moleculares hallan uso en diferentes aplicaciones y tienen diferentes propiedades físicas (por ejemplo, viscosidad) debido a los efectos de la longitud de la cadena, sus propiedades químicas son prácticamente idénticas. También hay disponibles diferentes formas de PEG, dependiendo del iniciador usado para el proceso de polimerización - el iniciador más habitual es un PEG metil éter monofuncional o metoxipoli(etilenglicol), abreviado como mPEG. También hay disponibles PEG con un peso molecular menor en forma de oligómeros más puros, denominados monodisperso, uniforme o aislado.

Los PEG también están disponibles con diferentes geometrías:

• PEG lineales, donde los monómeros de óxido de etileno están unidos entre sí en una cadena polimérica no ramificada;

• PEG ramificados, que tienen entre tres y diez cadenas de PEG que parten de un grupo de núcleo central;

• PEG en estrella, que tienen entre 10 y 100 cadenas de PEG que parten de un grupo de núcleo central; y

• PEG en peine, que tienen múltiples cadenas de PEG normalmente injertadas en un esqueleto polimérico.

Las cifras que se incluyen a menudo en los nombres de los PEG indican sus pesos moleculares promedio (por ejemplo, un PEG con n = 9 tendría un peso molecular promedio de aproximadamente 400 daltons, y se denominaría PEG 400). La mayoría de los PEG incluyen moléculas con una distribución de pesos moleculares (es decir, son polidispersos). La distribución del tamaño puede caracterizarse estadísticamente por su peso molecular medio en peso (Mw) y su peso molecular medio en número (Mn), cuyo cociente se denomina índice de polidispersidad (Mw/Mn). El Mw y el Mn pueden medirse mediante una espectrometría de masas.

El PEG es soluble en agua, metanol, etanol, acetonitrilo, benceno y diclorometano, y es insoluble en dietil éter y hexano.

En una realización preferida, el conector de la invención comprende un PEG lineal. El uso de PEG lineales tiene la ventaja de que los PEG lineales son baratos y poseen una distribución del peso molecular más estrecha.

Cuando se usa un PEG lineal para formar el conector del conjugado de la invención, tiene adecuadamente un peso molecular en el intervalo de entre 40 Da y 1.000 Da, preferentemente en el intervalo de entre 100 Da y 800 Da y de entre 150 Da y 600 Da, más preferentemente en el intervalo de entre 200 Da y 400 Da, lo más preferentemente en el intervalo de entre 200 Da y 300 Da o de entre 220 Da y 310 Da. Incluso lo más preferentemente, el PEG lineal comprendido en el en el conector según la invención tiene un peso molecular seleccionado entre 176 Da, 220 Da, 264 Da, 308 Da y 352 Da.

En otra realización preferida, el PEG lineal usado para formar el conector conjugado de la invención consiste adecuadamente en entre 1 y 20, preferentemente entre 2 y 15 o entre 3 y 10, más preferentemente entre 4 y 9 o entre 4 y 8, lo más preferentemente entre 5 y 7 monómeros de óxido de etileno. Además, preferentemente, el PEG lineal comprendido en el conector según la invención consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, más preferentemente en 4, 5, 6, 7 u 8, lo más preferentemente en 5, 6 o 7 monómeros de óxido de etileno.

Debería apreciarse que la totalidad del conector (fórmula (I) como se describe en el presente documento) tiene una longitud en el intervalo de entre 5 y 85 A, de entre 10 y 65 A, preferentemente en el intervalo de entre 15 y 45 A, más preferentemente en el intervalo de entre 15 y 40 o de entre 15 y 35 A, lo más preferentemente en el intervalo de entre 15 y 30, de entre 20 y 30 o de entre 20 y 25 A. Los mejores resultados de inactivación podrían conseguirse con una longitud de conector de entre 20 y 30 A, particularmente con una longitud de conector de 25 A. Por consiguiente, la cantidad de monómeros de etileno para L1 y L2 conjuntamente debe estar en el intervalo analizado anteriormente. Esto garantiza una inactivación intramolecular específica según la invención.

Si uno de L1 o L2 es, por ejemplo, un alquilo C1-10, el número de monómeros de óxido de etileno en el otro de L1 y L2 debe reducirse consecuentemente con objeto de garantizar que pueda producirse la inactivación intramolecular específica.

En el extremo proximal, el conector está unido covalentemente a la región Fc glicosilada del anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención, preferentemente en la asparagina N-glicosilada de la posición 297 o en una posición en estrecha proximidad con la posición 297. La unión del extremo proximal del conector a la región Fc del anticuerpo se realiza adecuadamente a través del acoplamiento de un conector de carbohidrato, lo que en la técnica se conoce como "química de clic".

Adecuadamente, la unión del extremo proximal del conector a la región Fc del anticuerpo se realiza con un compuesto seleccionado entre

i. el grupo que consiste en hidrazida-alquino-azida, hidrazida-azida-alquino, hidrazida-tiol-maleimida, hidrazida-DBCO-azida, hidrazida-TCO-tetrazina, hidrazida-metilciclopropeno-tetrazina e hidrazina-vinilo-tetrazina, en donde el grupo hidrazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo;

ii. el grupo que consiste en aminooxi-alquino-azida, aminooxi-azida-alquino, aminooxi-tiol-maleimida, aminooxi-DBCO-azida, aminooxi-TCO-tetrazina, aminooxi-metilciclopropeno-tetrazina y aminooxi-vinilo-tetrazina, en donde el grupo aminooxi del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo; y

iii. el grupo que consiste en tiosemicarbazida-alquino-azida, tiosemicarbazida-azida-alquino, tiosemicarbazida-tiolmaleimida, tiosemicarbazida-DBCO-azida, tiosemicarbazida-TCO-tetrazina, tiosemicarbazida-metilciclo-propenotetrazina y tiosemicarbazida-vinilo-tetrazina, en donde el grupo tiosemicarbazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo;

en donde dichos compuestos de los grupos i. a iii. contienen un grupo L1 como se muestra en la fórmula (I) en el presente documento y en la figura 8.

DBCO se refiere dibenzociclooctino y TCO se refiere trans-cicloocteno.

Según la invención se prefiere la unión del extremo proximal del conector a la región Fc del anticuerpo con un compuesto seleccionado entre grupo i. que consiste en hidrazida-alquino-azida, hidrazida-azida-alquino, hidrazidatiol-maleimida, hidrazida-DBCO-azida, hidrazida-TCO-tetrazina, hidrazida-metilciclopropeno-tetrazina e hidrazidavinilo-tetrazina, en donde dichos compuestos del grupo i. contienen el grupo L1 como se muestra en la fórmula (I) en el presente documento y en la figura 8, y en donde el grupo hidrazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo.

Según la invención lo más preferido es la unión del extremo proximal del conector a la región Fc del anticuerpo a través de un compuesto hidrazida-alquino-azida, en donde el compuesto hidrazida-alquino es un compuesto de fórmula (II).

Según la invención se prefiere además la unión del extremo proximal del conector a la región Fc del anticuerpo a través de un compuesto hidrazida- tetrazina-TCO.

Según la invención se prefiere aún más la unión del extremo proximal del conector a la región Fc del anticuerpo a través de un compuesto aminooxi-azida-alquino.

En una realización preferida, el conjugado de la invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en • un anticuerpo o un fragmento del mismo,

• un conector de fórmula (I);

o en donde dicho conector de fórmula (I) está unido al anticuerpo en el extremo proximal a través de un compuesto seleccionado entre

i. el grupo que consiste en hidrazida-alquino-azida, hidrazida-azida-alquino, hidrazida-tiol-maleimida, hidrazida-DBCO-azida, hidrazida-TCO-tetrazina, hidrazida-metilcidopropeno-tetrazina e hidrazinovinil-tetrazina, en donde el grupo hidrazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo;

ii. el grupo que consiste en aminooxi-alquino-azida, aminooxi-azida-alquino, aminooxi-tiol-maleimida, aminooxi-DBCO-azida, aminooxi-TCO-tetrazina, aminooxi-metilciclopropeno-tetrazina y aminooxi-vinilo-tetrazina, en donde el grupo aminooxi del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo; y iii. el grupo que consiste en tiosemicarbazida-alquino-azida, tiosemicarbazida-azida-alquino, tiosemicarbazidatiol-maleimida, tiosemicarbazida-DBCO-azida, tiosemicarbazida-TCO-tetrazina, tiosemicarbazidametilciclopropeno-tetrazina y tiosemicarbazida-vinilo-tetrazina, en donde el grupo tiosemicarbazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo;

o en donde dichos compuestos de los grupos i. a iii. contienen un grupo L1 según la fórmula (I); y

o en donde dicho conector comprende, en el extremo distal, un inactivador oscuro seleccionado entre Atto612Q, DABCYL, rojo de metilo, colorantes de QSY-7 diarilrodamina y perclorato de 6-(dimetilamino)-2-[4-[4 (dimetilamino)fenil]-- 1,3-butadienil]-1 -etil quinolinio, un colorante de rodamina o Cy5;

• una molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo, que comprende un fluoróforo.

En una realización más preferida, el conjugado de la invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en

• un anticuerpo monoclonal,

• un conector de fórmula (I);

o en donde dicho conector está en el extremo proximal unido a la región Fc del anticuerpo a través de un compuesto seleccionado entre:

• hidrazida-alquino-azida;

• hidrazida-tetrazina-TCO; y

• aminooxi-azida-alquino;

o en donde L1 es PEG o alquilo Ci-ioy L2 es PEG

o y en donde dicho conector comprende, en el extremo distal, el inactivador Atto612Q;

• una molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo, que comprende el fluoróforo EuLH.

En una realización más preferida, el conjugado de la invención comprende, consiste esencialmente en o consiste en

• un anticuerpo monoclonal,

• un conector de fórmula (I);

o en donde dicho conector está en el extremo proximal unido a la región Fc del anticuerpo a través de la hidrazida del ácido 4-pentinoico; L2 es un PEG de revestimiento que comprende entre 5 y 7, preferentemente 6 monómeros de óxido de etileno; y

o en donde dicho conector comprende, en el extremo distal, el inactivador oscuro Atto612Q;

• una molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo, que comprende el fluoróforo EuLH.

Debería apreciarse que el compuesto hidrazida del ácido 4-pentinoico incluye L1, que es etilo.

Además, preferentemente, el conector que contiene el PEG tiene una longitud en el intervalo de entre 15 y 45 A, más preferentemente en el intervalo de entre 15 y 40 o de entre 15 y 35 A, lo más preferentemente en el intervalo de entre 15 y 30, de entre 20 y 30 o de entre 20 y 25 A. Los mejores resultados de inactivación podrían conseguirse con una longitud de conector de entre 20 y 30 A, particularmente con una longitud de conector de 25 A.

"Alquino", como se usa en el presente documento, significa un hidrocarburo insaturado que contiene al menos un triple enlace carbono-carbono. Según la invención se prefieren los alquinos acíclicos según la fórmula general (III):

CnH2n-2 (III)

en donde n es un número entero entre 3 y 12, preferentemente entre 4 y 9, más preferentemente entre 4 y 6, lo más preferentemente 4.

La cantidad de moléculas conectoras, preferentemente de moléculas conectoras tales como las moléculas conectoras según la fórmula (I) comprendidas en el conjugado de la invención, depende del tipo de glicosilación. Hay dos cadenas pesadas presentes en los anticuerpos, es decir, la asparagina del sitio de N-glicosilación en la posición 297 o en una posición en estrecha proximidad con la posición 297 está presente dos veces en el anticuerpo. La N-glicosilación de dicha asparagina puede proporcionar uno o dos extremos de cadena de carbohidrato, que son capaces de unirse a moléculas conectoras, tales como las moléculas conectoras según la fórmula (I). Por consiguiente, en una realización preferida, el conjugado de la invención comprende entre 2 y 4 moléculas conectoras, lo más preferentemente entre 2 y 4 moléculas conectoras de fórmula (I).

La invención proporciona adicionalmente métodos para preparar el conjugado de la invención.

Los métodos de la presente invención usan los carbohidratos presentes en el fragmento Fc de los anticuerpos, particularmente en el resto de asparagina de la posición 297 o en una posición en estrecha proximidad con la posición 297, para introducir específicamente en el sitio una química de marcaje uniforme (química de clic).

Después de una reacción de oxidación, estos carbohidratos están presentes como grupos aldehído o cetona. Usando una molécula tal como alquino hidrazida, es posible introducir, sin ninguna reacción enzimática, por ejemplo, un grupo alquino en estos carbohidratos. Los grupos alquino pueden usarse posteriormente para reaccionar específicamente con grupos azida (química de clic), que permiten además un marcaje eficaz y específico de los anticuerpos con proteínas o componentes químicos.

Las condiciones de reacción para realizar las reacciones de química de clic son bien conocidas en la materia, como se describe, por ejemplo, en Presolski, Hong, & Finn, 2011.

Un preferido método comprende las etapas de

i. generar grupos aldehído o cetona reactivos específicamente en el sitio en el residuo de asparagina en la posición 297 o en una posición en estrecha proximidad con la posición 297 de la región Fc del anticuerpo mediante la oxidación del anticuerpo;

ii. hacer reaccionar el anticuerpo oxidado con un compuesto A-L1-B, preferentemente seleccionado entre hidrazida-L1-alquino, hidrazida-L1-azida, hidrazida-L1-tiol, hidrazida-L1-tetrazina, hidrazida-L1-DBCO, hidrazida-L1-TCO, hidrazida-L1-vinilo, hidrazida-L1-metilciclopropeno, aminooxi-L1-alquino, aminooxi-L1-azida, aminooxi-L1-tiol, aminooxi-L1-tetrazina, aminooxi-L1-DBCO, aminooxi-L1-TCO, aminooxi-L1-vinilo, aminooxi-L1-metilciclopropeno, tiosemicarbazida-L1-alquino, tiosemicarbazida-L1-azida, tiosemicarbazida-L1-tiol, tiosemicarbazida-L1-tetrazina, tiosemicarbazida-L1-DBCO, tiosemicarbazida-L1-TCO, tiosemicarbazida-L1-vinilo, tiosemicarbazida-L1-metilciclopropeno; en donde A, B y L1 se definen como se describe en el presente documento para el conjugado de la invención;

iii. preparar un compuesto C-L2-D-E; en donde C, L2, D y E se definen como se describe en el presente documento para el conjugado de la invención;

iv. hacer reaccionar el grupo químico B del anticuerpo de la etapa ii., que comprende el compuesto A-L1-B, con el compuesto C-L2-D-E de la etapa iii. mediante reacciones de química de clic; y

v. capturar una molécula que es capaz de unirse al sitio de unión del anticuerpo del anticuerpo y que comprende una molécula generadora de señal, tal como un fluoróforo.

Debería reconocerse que las ventajas y las realizaciones ventajosas descritas anteriormente para el conjugado según la invención se aplican igualmente a los métodos para preparar dicho conjugado tal como debe ser mencionado anteriormente.

Como para la etapa i., el oxidante más preferido es p-peryodato. La mayoría de los estudios usaron m-peryodato, que es la sal de peryodato más soluble en agua, pero es difícil de disolver a un pH de 5,0 o mayor (es decir, el intervalo de pH usado normalmente en la oxidación del anticuerpo). Para superar este problema puede usarse p-peryodato. El intervalo de pH preferido para las oxidaciones de un anticuerpo que usan peryodato es entre 5,0 y 6,0. Preferentemente, el peryodato se usa a una concentración de 10 mM - 50 mM. El tiempo de reacción no debería exceder de 1 hora.

Como para la etapa ii., los azúcares con el aldehído activado (oxidado) reaccionan preferentemente con hidrazina o alcoxiamina a un pH de 5,0 -7,0. Los aldehídos también reaccionan con aminas primarias para formar bases de Schiff, que pueden ser adicionalmente reducidas para formar un enlace covalente (aminación reductora). Preferentemente, esta reacción se cataliza mediante la adición de anilina en un exceso molar de 50-500. El tiempo de reacción no debería exceder de 1 hora.

Como para la etapa iii., lo más preferentemente, el acoplamiento de D-E se realiza haciendo reaccionar el NHS-éster del grupo químico E con los grupos amino primarios del grupo químico D. La reacción se lleva a cabo a un pH de 8,0­ 9,2 usando un tampón de carbonato-bicarbonato, borato o fosfato. Lo más preferentemente, la reacción se lleva a cabo a 4 dC.

Como para la etapa iv., la reacción de clic se lleva a cabo lo más preferentemente mediante el uso de un catalizador Cu-THPTA a unos intervalos de pH de entre 7,0 y 7,6. Preferentemente, la concentración de los componentes de la reacción debería ser de al menos 10 pM. La reacción debería producirse la temperatura ambiente durante no más de 1 hora.

En una realización preferida, el anticuerpo oxidado se hace reaccionar en la etapa ii. del método de la invención con un compuesto seleccionado entre hidrazida-L1-alquino, hidrazida-L1-tetrazina o aminooxi-L1-azida.

En una realización preferida adicional, en la etapa iv. del método de la invención, un compuesto C-L2-D-E, en donde C se selecciona entre azida, alquino o TCO, se hace reaccionar con el anticuerpo oxidado que comprende el compuesto A-La1-B, en donde B se selecciona entre alquino, tetrazina o azida.

La invención proporciona además un conjugado obtenible mediante el método de preparación descrito más arriba. El conjugado de la invención es especialmente útil en ensayos y métodos de diagnóstico. Por lo tanto, en una realización adicional, la invención proporciona el uso del conjugado de la invención en ensayos de diagnóstico. La invención se refiere además a ensayos y métodos de diagnóstico que comprenden el conjugado de la invención. Se prefieren especialmente los métodos de diagnóstico in vitro.

Normalmente, un método de diagnóstico in vitro para el diagnóstico de una enfermedad o de una afección patológica comprende las siguientes etapas:

i. poner en contacto un conjugado según la invención con una muestra de un sujeto sospechoso de estar afectado por una enfermedad o afección que se va a diagnosticar,

ii. detectar la cantidad de un analito, un antígeno, un biomarcador o similares, o una isoforma de los mismos, en dicha muestra obtenida de dicho sujeto;

iii. comparar la cantidad detectada de dicho analito, antígeno o biomarcador en dicha muestra con una cantidad del analito, antígeno o biomarcador característica de un control normal;

mediante lo cual, un cambio en la cantidad de dicho analito, antígeno o biomarcador en dicha muestra con respecto al control normal es un indicador positivo de la enfermedad o de la afección que se va a diagnosticar.

Un "cambio en la cantidad" del analito, antígeno o biomarcador significa un aumento o una disminución de la cantidad del analito, antígeno o biomarcador. Según la invención se prefiere la detección de una cantidad elevada del analito, antígeno o biomarcador. Sin embargo, existen afecciones en las que la disminución de la cantidad de un analito, antígeno o biomarcador da lugar al desarrollo de una enfermedad o afección patológica. El método de diagnóstico según la invención no está limitado la medición únicamente de cantidades elevadas del analito, antígeno o biomarcador. Por consiguiente, en una realización alternativa, también se prefiere medir una disminución en la cantidad del analito, antígeno o biomarcador.

La detección de la cantidad de un analito, un antígeno, un biomarcador o similares, o una isoforma de los mismos, en una muestra se basa según la invención en la sustitución de la molécula capturada en el sitio de unión del anticuerpo del anticuerpo comprendido en el conjugado de la invención por el analito, un antígeno, un biomarcador o similares, o una isoforma de los mismos, de la muestra analizada. De este modo, la molécula capturada es liberada del sitio de unión del anticuerpo, y el enlace entre la molécula inactivadora E del conector de fórmula (I) y el fluoróforo de la molécula capturada es interrumpido y "desinactivado". Por consiguiente, dependiendo de la cantidad de analito, antígeno o biomarcador en la muestra, se genera y se detecta una señal, preferentemente una señal de fluorescencia. Además, la invención proporciona un método simple para detectar un analito en una muestra (biológica) usando el conjugado según la invención, en donde la presencia del analito en la muestra induce o promueve la sustitución de una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno por el analito, mediante lo cual se genera o cambio una señal detectable.

El método de diagnóstico de la invención también es útil en la monitorización del estado de una enfermedad o una afección patológica, o para monitorizar el efecto terapéutico de un medicamento, basado en la medición de la cantidad de analito, antígeno o biomarcador en una muestra de un sujeto.

Dicho analito, antígeno o biomarcador puede ser cualquier analito, antígeno o biomarcador que sea capaz de unirse al sitio de unión del anticuerpo del conjugado según la invención. Por ejemplo, el analito, antígeno o biomarcador puede seleccionarse entre:

Troponina-I, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

Troponina-T, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

CRP, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Procalcitonina, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Interleucina-6, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Interleucina-8, un marcador clínico para validar el estado de inflamación

Interleucina-11, un marcador clínico para validar el estado de inflamación;

Hormona paratiroidea, un marcador clínico to monitorizar y validar una paratiroidectomía;

Dímero D, un marcador clínico para validar la coagulación sanguínea;

NT-proBNP, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

BNP, un marcador clínico para validar trastornos cardíacos;

Insulina, marcador clínico para validar el síndrome metabólico;

Péptido C, un marcador clínico para validar el síndrome metabólico; y

Cistatina C, un marcador clínico para validar enfermedades renales.

Por consiguiente, la invención proporciona métodos de diagnóstico o de monitorización del estado patológico de, por ejemplo, enfermedades y afecciones como trastornos cardíacos, inflamación, paratiroidectomía, coagulación sanguínea, síndrome metabólico y enfermedades renales.

Los trastornos cardíacos, que pueden diagnosticarse usando el conjugado de la invención, son, por ejemplo, enfermedad cerebrovascular (por ejemplo, ictus), cardiopatía isquémica (por ejemplo, infarto de miocardio), cardiopatía hipertensiva, cardiopatía reumática, cardiopatía inflamatoria, cardiopatía congénita, arritmias cardíacas e insuficiencia cardíaca.

Algunas enfermedades inflamatorias que pueden diagnosticarse usando el conjugado de la invención son, por ejemplo, septicemia, enfermedad de Alzheimer, espondilitis anquilosante, artritis (artrosis, artritis reumatoide (RA), artropatía psoriásica), asma, ateroesclerosis, enfermedad de Crohn, colitis, dermatitis, diverticulitis, fibromialgia, hepatitis, síndrome del intestino irritable (SII), lupus eritematoso sistémico (LES), nefritis, enfermedad de Parkinson y colitis ulcerosa.

Algunas afecciones de la coagulación sanguínea que pueden diagnosticarse usando el conjugado de la invención son, por ejemplo, coagulación intravascular diseminada y el desarrollo de anticoagulantes circulantes.

Algunas enfermedades renales que pueden diagnosticarse usando el conjugado de la invención son, por ejemplo, el síndrome de Abderhalden-Kaufmann-Lignac (cistinosis nefropática), el síndrome compartimental abdominal, nefrotoxicidad inducida por paracetamol, insuficiencia renal aguda/lesión renal aguda, nefritis lobular aguda, nefropatía aguda por fosfato, necrosis tubular aguda, deficiencia en fosforribosiltransferasa de adenina, nefritis por adenovirus, síndrome de Alagille, Síndrome de Alport, amiloidosis, vasculitis asociadas a ANCA relacionada con endocarditis y otras infecciones, angiomiolipoma, nefropatía por analgésicos, anorexia nerviosa y nefropatía, anticuerpos contra la angiotensina y glomeruloesclerosis segmentaria focal, síndrome antifosfolípido, glomerulonefritis relacionada con la terapia anti-TNF-a, mutaciones del APOL1, síndrome sintomático por exceso de mineralocorticoides, nefropatía por ácido aristolóquico, nefropatía por plantas medicinales chinas, nefropatía endémica balcánica, síndrome de Bartter, alcoholismo por cerveza, betacianinuria, nefropatía por talasemia p, nefropatía por cilindros biliares, nefropatía asociada a infección por poliomavirus BK en el riñón natural, rotura vesical, disinergia del esfínter vesical, taponamiento vesical, nefropatía en cruzafronteras, virus de Bourbon y lesión renal aguda, recolección de la caña de azúcar quemada y disfunción renal aguda, Byetta e insuficiencia renal, nefropatía C1q, nefrotoxicidad por inhibidores de la calcineurina, insuficiencia renal aguda por hiperemesis canabinoide, síndrome cardiorrenal, lesión renal inducida por carfilzomib, nefropatía CFHR5, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth con glomerulopatía, concentrado de cereza y lesión renal aguda, émbolos de colesterol, síndrome de Churg-Strauss, quiluria, diuresis inducida por el frío, nefrotoxicidad por colistina, glomerulopatía colagenofibrótica, glomerulopatía colapsante, glomerulopatía colapsante relacionada con CMV, nefropatía relacionada con antirretrovíricos en combinación (cART), anomalías congénitas del riñón y el tracto urinario (CAKUT), síndrome nefrótico congénito, síndrome conorenal (síndrome de Mainzer-Saldino o enfermedad de Saldino-Mainzer), nefropatía por contraste, intoxicación por sulfato de cobre, necrosis cortical, lesión renal aguda relacionada con crizotinib, crioglobuinemia, nefropatía inducida por cristalglobulina, lesión renal aguda inducida por cristales, nefropatía quística, adquirida, cistinuria, proteinuria nefrótica inducida por dasatinib, enfermedad de depósitos densos (MPGN de tipo 2), enfermedad de Dent (nefrolitiasis recesiva ligada al cromosoma X), nefropatía por cristales de DHA, síndrome de desequilibrio por diálisis, diabetes y nefropatía diabética, diabetes insípida, complementos alimenticios e insuficiencia renal, esclerosis mesangial difusa, diuresis, síndrome de Down y nefropatía, drogas y nefropatía, uréter duplicado, síndrome EAST, Ébola y el riñón, riñón ectópico, uréter ectópico, edema, hinchazón, enfermedad de Erdheim-Chester, enfermedad de Fabry, hipercalcemia hipocalciúrica familiar, síndrome de Fanconi, síndrome de Fraser, glomerulopatía por fibronectina, glomerulonefritis fibrilar y glomerulopatía inmunotactoide, síndrome de Fraley, glomeruloesclerosis focal y segmentaria, esclerosis focal, glomeruloesclerosis focal, síndrome de Galloway Mowat, arteritis de células gigantes (temporal) con afectación renal, hipertensión gestacional, síndrome de Gitelman, enfermedades glomerulares, reflujo tubular glomerular, glicosuria, síndrome de Goodpasture, ingestión de tintes para el cabello y lesión renal aguda, podocitopatía por infección por Hantavirus, nefropatía por sobrecarga por calor, hematuria (sangre en la orina), síndrome urémico hemolítico (HUS), síndrome urémico hemolítico atípico (aHUS), síndrome hemofagocítico, cistitis hemorrágica, fiebre hemorrágica con síndrome renal (HFRS, enfermedad renal por Hantavirus, fiebre hemorrágica coreana, fiebre hemorrágica epidémica, nefropatis epidémica), hemosiderinuria, hemosiderosis relacionada con hemoglobinuria paroxística nocturna y anemia hemolítica, glomerulopatía hepática, enfermedad venooclusiva hepática, síndrome de obstrucción sinusoidal, nefropatía asociada a hepatitis C, síndrome hepatorrenal, complementos de plantas medicinales y nefropatía, hipertensión y nefropatía, nefropatía de complejo inmunitario asociada al VIH (HIVICK), nefropatía asociada al VIH (HIVAN), nefropatía tubulointersticial autosómica dominante ligada al HNF1B, riñón en herradura (fusión renal), úlcera de Hunner, hiperaldosteronismo, hipercalcemia, hiperpotasemia, hipermagnesemia, hipernatremia, hiperoxaluria, hiperfosfatemia, hipocalcemia, síndrome de vasculitis urticarial hipocomplementémica, hipopotasemia, disfunción renal inducida por hipopotasemia, parálisis periódica hipopotasémica, hipomagnesemia, hiponatremia, hipofosfatemia, hipofosfatemia en consumidores de marihuana, nefrotoxicidad por ifosfamida, nefropatía por IgA, nefropatía IgG4, diuresis por inmersión, nefritis intersticial relacionada con la terapia de punto de control inmunitario, cistitis intersticial, síndrome de vejiga dolorosa (cuestionario), nefritis intersticial, síndrome de Ivemark, disfunción vesical asociada con ketamina, cálculos renales, nefrolitiasis, toxicidad por té de Kombucha, nefropatía por plomo y nefrotoxicidad relacionada con plomo, deficiencia en aciltransferasa de lecitín-colesterol y (deficiencia en LCAT), nefropatía por leptospirosis, enfermedad por depósito de cadenas ligeras, enfermedad por depósito de inmunoglobulinas monoclonales, síndrome de Liddle, síndrome de Lightwood-Albright, glomerulopatía por lipoproteínas, nefrotoxicidad por litio, las mutaciones de LMX1B causan FSGS hereditaria, hematuria con dolor en fosa lumbar, lupus, lupus eritematoso sistémico, nefropatía lúpica, nefritis lúpica, nefritis lúpica con seropositividad para anticuerpos citoplasmáticos antineutrófilos, podocitopatía lúpica, glomerulonefritis asociada a la enfermedad de Lyme, intolerancia a la proteína lisinúrica, nefropatía por lisozimas, nefropatía malárica, nefropatía paraneoplásica, hipertensión maligna, malacoplaquia, MDMA (Molly; éxtasis; 3,4-metilendioximetanfetamina) e insuficiencia renal, estenosis meatal, nefropatía quística medular, nefropatía asociada a urolodulina, nefropatía hiperuricémica juvenil de tipo 1, riñón esponjoso medular, megauréter, toxicidad por melamina y el riñón, glomerulonefritis membranoproliferativa, nefropatía membranosa, glomerulopatía seudomembranosa con depósitos de IgG Kappa enmascarados, nefropatía mesoamericana, acidosis metabólica, alcalosis metabólica, insuficiencia renal relacionada con metotrexato, poliangeítis microscópica, síndrome de leche y alcalinos, nefropatía de cambios mínimos, toxicidad por enjuague bucal, nefropatía MUC1, displasia renal multiquística, mieloma múltiple, neoplasmas mieloproliferativos y glomerulopatía, síndrome onicorrotuliano, nefrocalcinosis, fibrosis sistémica nefrógena, nefroptosis (riñón flotante, ptosis renal), síndrome nefrótico, vejiga neurógena, glomeruloesclerosis nodular, uretritis no gonocócica, síndrome del cascanueces, oligomeganefronia, síndrome orofaciodigital, aciduria orótica, hipotensión ortostática, proteinuria ortostática, diuresis osmótica, nefrosis osmótica, síndrome de hiperestimulación ovárica, nefropatía por oxalato, riñón de Page, necrosis papilar, síndrome papilorrenal (síndrome renal-coloboma, hipoplasia renal aislada), Parvovirus B19 y el riñón, el síndrome peritoneal-renal, válvula uretral posterior, glomerulonefritis posinfecciosa, glomerulonefritis posestreptocócica, glomerulonefritis posinfecciosa (IgA-dominante), simulación de una nefropatía por IgA, panarteritis nodular, enfermedad renal poliquística, válvulas uretrales posteriores, diuresis posobstructiva, preeclampsia, síndrome por infusión de propofol, glomerulonefritis proliferativa con depósitos de IgG monoclonal (enfermedad de Nasr), insuficiencia renal relacionada con propóleo (resina de abeja), proteinuria (proteínas en la orina), seudohiperaldosteronismo, seudohipobicarbonatemia, seudohipoparatiroidismo, síndrome pulmonar-renal, pielonefritis (infección renal), pionefrosis, nefropatía por radiación, ranolazina y el riñón, síndrome de realimentación, nefropatía por reflujo, glomerulonefritis de progresión rápida, absceso renal, absceso perinefrítico, agenesia renal, lesión renal aguda por microtrombos en la vena arcuata renal, aneurisma en la arteria renal, estenosis en la arteria renal, cáncer de células renales, quiste renal, hipouricemia renal con insuficiencia renal aguda inducida por ejercicio, infarto renal, osteodistrofia renal, acidosis tubular renal, nefropatía por mutaciones de la renina y tubulointersticial autosómica dominante, tumores secretores de renina (tumor de las células yuxtaglomerulares), alteración del osmorreceptor, uréter circuncavo, fibrosis retroperitoneal, rabdomiólisis, rabdomiólisis relacionada con cirugía bariátrica, nefropatía asociada con la artritis reumatoide, nefropatía por sarcoidosis, pérdida de sal, renal y cerebral, esquistosomiasis y enfermedad glomerular, inmunodisplasia ósea de Schimke, crisis renal por esclerodermia, síndrome de peroné en serpentín-riñón poliquístico, síndrome de Exner, nefropatía drepanocítica, nefropatía por exposición a sílice y crónica, nefropatía en granjeros de Sri Lanka, síndrome de Sjogren y nefropatía, uso de canabinoides sintéticos y lesión renal aguda, nefropatía tras un trasplante de células hematopoyéticas, nefropatía relacionada con un trasplante de células madre, hiponatremia euvolémica, enfermedad de la membrana basal delgada, hematuria familiar benigna, trigonitis, tuberculosis, genitourinaria, esclerosis tuberosa, disgenesia tubular, nefritis tubulointersticial de complejo inmunitario debida a anticuerpos contra el borde en cepillo de los túbulos proximales, síndrome de lisis tumoral, uremia, neuropatía óptica urémica, ureteritis quística, ureterocele, carúncula uretral, estenosis uretral, incontinencia urinaria, infección del tracto urinario, obstrucción del tracto urinario, fístula urogenital, nefropatía asociada a uromodulina, nefropatía por cilindros asociada a vancomicina, nefropatía vasomotora, fístula vesicointestinal, reflujo vesicoureteral, anestésicos volátiles y lesión renal aguda, enfermedad de Von Hippel-Lindau, glomerulonefritis macroglobulinémica de Waldenstrom, nefropatía relacionada con warfarina, picaduras de avispa y lesión renal aguda, granulomatosis de Wegener, granulomatosis con poliangitis, nefropatía por el virus del Nilo occidental y crónica, síndrome de Wunderlich, síndrome de Zellweger y síndrome cerebrohepatorrenal.

El término "sujeto" se refiere a un animal, preferentemente un mamífero, que padece o es sospechoso de padecer una enfermedad o una afección patológica. Preferentemente, "sujeto" se refiere a un ser humano. Por consiguiente, el conjugado de la invención es particularmente adecuado para su uso en el diagnóstico de enfermedades humanas. Del mismo modo, el conjugado de la invención también es adecuado para su uso en medicina veterinaria. El sujeto puede ser, por ejemplo, un cerdo, ganado vacuno, caballos, ovejas o aves.

El término "muestra" se refiere a cualquier fuente de material biológico, incluyendo, pero sin limitación, sangre periférica, plasma, linfocitos, líquido cefalorraquídeo, orina, saliva, epitelios, fibroblastos o cualquier otra muestra que comprenda el analito, antígeno o biomarcador.

En una realización preferida, la cantidad del analito, antígeno o biomarcador es detectada en una muestra de líquido corporal obtenida de un mamífero, lo más preferentemente un ser humano. El término "líquido corporal" se refiere a todos los líquidos que están presentes en el cuerpo humano que incluyen, pero no se limitan a, la sangre, la linfa, la orina y el líquido cefalorraquídeo (LCR). La muestra sanguínea puede incluir una muestra de plasma o una muestra de suero, o fracciones derivadas de estas muestras. La muestra puede ser tratada antes de su uso, tal como preparar plasma a partir de la sangre, diluir líquidos viscosos, y similares. Preferentemente, la muestra de plasma se trata con un anticoagulante, tal como EDTA.

Según una realización preferida de la presente invención, la cantidad del analito, antígeno o biomarcador es detectada en una muestra sanguínea tomada del sujeto, más preferentemente una muestra de plasma. Por lo tanto, la presente invención se refiere preferentemente a un método como se ha descrito anteriormente, que comprende las etapas de: obtener una muestra de plasma de dicho sujeto; detectar la cantidad del analito, antígeno o biomarcador en la muestra de plasma; comparar la cantidad detectada del analito, antígeno o biomarcador en la muestra de plasma con la cantidad del analito, antígeno o biomarcador en una muestra de plasma de un control normal, mediante lo cual, una elevada cantidad del analito, antígeno o biomarcador con respecto al control normal es una indicación positiva de la enfermedad o de la afección que se va a diagnosticar. Se ha demostrado que unas cantidades elevadas de los analitos, antígenos o biomarcadores se correlacionan con, y son útiles para ayudar a, el diagnóstico de enfermedades o afecciones.

Una "cantidad elevada" de un analito, antígeno o biomarcador (o una isoforma de los mismos) significa que la cantidad del analito, antígeno o biomarcador detectada en las muestras de los sujetos es mayor que la cantidad media de analito, antígeno o biomarcador característica de un sujeto de control normal más allá del intervalo del error experimental, como se conoce en la técnica. Preferentemente, la cantidad de analito, antígeno o biomarcador detectada en las muestras de los sujetos es un 10% mayor que dicha cantidad media del analito, antígeno o biomarcador característica de una persona de control normal. Más preferentemente, la cantidad de analito, antígeno o biomarcador (o una isoforma de los mismos) detectada en las muestras de los sujetos es un 25 % mayor, o, incluso más preferido un 50 % o un 75 % mayor que dicha cantidad media de analito, antígeno o biomarcador característica de una persona de control normal. Lo más preferentemente, la cantidad de analito, antígeno o biomarcador (o una isoforma de los mismos) detectada en las muestras de los sujetos es varias veces mayor que dicha cantidad media de analito, antígeno o biomarcador característica de una persona de control normal, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más veces mayor.

Un "control normal" es una muestra del mismo tipo obtenida de un sujeto, por ejemplo, que se obtiene de al menos una persona de control normal o del paciente en otro momento, en donde dicha persona o sujeto de control no padece la enfermedad o la afección que se va a diagnosticar. En una realización, el control normal se toma del paciente en un momento anterior. El experto en la materia apreciará que la muestra del sujeto que se va a diagnosticar se evalúa frente a un control normal, y que la determinación de una elevación significativa en la cantidad del analito, antígeno o biomarcador en la muestra del sujeto se basa en la comparación con los controles usados en el ensayo dado.

El ensayo diagnóstico de la invención puede realizarse, por ejemplo,en un formato de HTS en forma de un cribado de alto rendimiento. Por ejemplo, el ensayo diagnóstico puede llevarse a cabo en una placa de pocillos, tal como una placa de 96 o 384 pocillos, en donde cada pocillo estará cargado con una muestra diferente y el conjugado de la invención. Cada placa de pocillos también puede contener muestras de un sujeto de control normal y controles positivos. El ensayo diagnóstico también puede llevarse a cabo en un chip microfluido.

La invención proporciona además un kit de diagnóstico, comprendiendo

• un compuesto A-L1-B, preferentemente seleccionado entre hidrazida-L1-alquino, hidrazida-L1-azida, hidrazida-L1-tiol, hidrazida-L1-tetrazina, hidrazida-L1-DBCO, hidrazida-L1-TCO, hidrazida-L1 -vinilo, hidrazida-L1-metilciclopropeno, aminooxi-L1-alquino, aminooxi-L1-azida, aminooxi-L1-tiol, aminooxi-L1-tetrazina, aminooxi-L1-DBCO, aminooxi-L1-TCO, aminooxi-L1-vinilo, aminooxi-L1-metilciclopropeno, tiosemicarbazida-L1-alquino, tiosemicarbazida-L1-azida, tiosemicarbazida-L1-tiol, tiosemicarbazida-L1-tetrazina, tiosemicarbazida-L1-DBCO, tiosemicarbazida-L1-TCO, tiosemicarbazida-L1-vinilo, tiosemicarbazida-L1-metilciclopropeno; en donde A, B y L1 se definen como se describe en el presente documento para el conjugado de la invención;

• un compuesto C-L2-D-E; en donde C, L2, D y E se definen como se describe en el presente documento para el conjugado de la invención;

• un oxidante para oxidar un anticuerpo,

• un fluoróforo, e

• instrucciones para el uso de los ingredientes de dicho kit.

Un oxidante adecuado es, por ejemplo, peryodato de sodio.

Dicho kit permitiría a la persona experta en la materia preparar un conjugado según la invención usando cualquier anticuerpo conocido o desconocido.

En una realización más preferida, el kit de la invención puede comprender un conjugado de la invención ya ensamblado, que ha sido diseñado contra un analito o biomarcador en particular, e instrucciones para el uso del mismo.

En una realización más preferida, el kit de la invención permite un cribado de alto rendimiento y comprende un conjugado de la invención ya ensamblado, una placa de pocillos, tal como una placa de 96 o 384 pocillos, en donde en cada pocillo de la placa de pocillos se carga el conjugado de la invención, y en donde dicho kit comprende muestras de control negativo y positivo.

Alternativamente, el kit de la invención puede comprender un chip microfluido, que se usa en el método de diagnóstico de la invención usando el conjugado de la invención.

El kit puede comprender además aditivos tales como estabilizantes, controles positivos y negativos y tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse ampliamente para proporcionar unas concentraciones en solución de los reactivos que optimicen sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse en forma de polvos secos, habitualmente liofilizados, incluyendo excipientes que, en disolución, proporcionarán una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.

El kit de diagnóstico de la invención es especialmente útil para el diagnóstico y/o la monitorización del estado patológico de, por ejemplo, enfermedades y afecciones como trastornos cardíacos, inflamación, paratiroidectomía, coagulación sanguínea, síndrome metabólico y enfermedades renales como se ha detallado anteriormente.

El conjugado, los métodos, los usos y el kit descritos en el presente documento tienen numerosas ventajas, especialmente en lo que respecta al estado actual de la técnica en estrategias de marcaje. Pueden producirse conjugados de anticuerpos homogéneos que comprenden entre 2-4 moléculas conectoras de fórmula (I) por anticuerpo (dependiendo del grado de glicosilación), en lugar de los conjugados de anticuerpos no homogéneos que comprenden 0-8 etiquetas por anticuerpo. La afinidad de los anticuerpos acoplados no se ve afectada, sino que se mantiene. No se produce hidrólisis ni una unión no deseada de las moléculas conectoras de fórmula (I) a otras proteínas. No son necesarias estrategias de acoplamiento enzimático. La reacción de acoplamiento del conector, que comprende la molécula inactivadora, al anticuerpo es una reacción química simple y rápida en lugar de una compleja reacción enzimática en dos etapas. Además, no hay necesidad de genomodificar el anticuerpo. Por ejemplo, no es necesario expresar el anticuerpo en un sistema de cultivos celulares optimizados, que finalmente produce unos rendimientos de anticuerpos bajos. Tampoco hay necesidad de glicomodificaciones. El grado de marcaje es independiente de la especie de carbohidrato terminal. Por consiguiente, la invención descrita en el presente documento proporciona una solución para generar interacciones intramoleculares aisladas con el anticuerpo. El conjugado, los métodos, los usos y el kit descritos en el presente documento permiten la cuantificación de biomarcadores a las concentraciones clínicas pertinentes y contribuyen así a la técnica anterior.

La invención se describe adicionalmente mediante las 7 figuras y un ejemplo de trabajo con más detalle.

Figura 1 muestra esquemáticamente un inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia conocido en la técnica anterior. Unión competitiva de un analito marcado con fluoróforo. La aplicación de la muestra da lugar a una reducción en la señal, mediada por un desplazamiento del estado estacionario.

Figura 2 muestra un inmunoensayo de inactivación de la fluorescencia de Kreisig et. al. La muestra se mezcla con un péptido marcado. Posteriormente se añade un anticuerpo conjugado con inactivadores oscuros, dando como resultado tres estados reactivos: Estado 1 - el péptido es unido por el anticuerpo - el fluoróforo está a una distancia próxima a los inactivadores oscuros y queda inactivado. Estado 2 - el analito se une al anticuerpo, el péptido está a una gran distancia (más de 9 nm) del anticuerpo y emite luz. Estado 3 - el analito se une al anticuerpo, el péptido está a una distancia próxima (menos de 9 nm) del anticuerpo y queda inactivado específicamente por los inactivadores oscuros. El estado estacionario global entre los tres estados únicamente da lugar a un cambio menor en la señal en concentraciones equimolares.

Figura 3 muestra esquemáticamente un inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia desarrollado por Kreisig et. al. (Kreisig, Hoffmann, & Zuchner, 2013; Kreisig, Prasse, Zscharnack, Volke, & Zuchner, 2015) en comparación con el (B)

Figura 4 muestra esquemáticamente el inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia aislado según la presente invención.

Figura 5 muestra la representación esquemática de nuestra estrategia de acoplamiento con conector de carbohidrato (clc) según la invención.

Figura 6 muestra el inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia aislado (DFQDI) según la invención. El anticuerpo marcado aislado y el conjugado de péptido-fluoróforo se incuban conjuntamente. Consecuentemente, el fluoróforo está a una distancia próxima a los inactivadores oscuros y queda inactivado. Posteriormente se aplica la muestra con una concentración desconocida de analito al complejo de péptido-anticuerpo. Debido que el complejo de anticuerpo-analito tiene una mayor afinidad, en comparación con el complejo de anticuerpo-péptido, el analito es capaz desplazar el péptido del sitio de unión al antígeno. Como resultado, el conjugado de péptido-fluoróforo está a una gran distancia (más de 9 nm) del inactivador oscuro y emite luz. Por lo tanto, la señal delta (señal 2-señal 1) se correlaciona directamente con la concentración de analito en la muestra aplicada. Con objeto de conseguir una elevada sensibilidad en el ensayo y un gran intervalo dinámico, la señal delta debería ser máxima. Por lo tanto, la longitud del conector conjugado es crítica, tanto para la inactivación de la señal como para la generación de la señal después del desplazamiento. (A) La longitud del conector elegida es corta, dando como resultado una baja eficacia de inactivación. (B) La longitud del conector elegida es demasiado larga, dando fundamentalmente como resultado una inactivación inespecífica del fluoróforo. (C) La longitud del conector elegida es óptima tanto para la inactivación como para la generación de la señal.

Figura 7 muestra la influencia de la longitud del conector (PEG3, PEG6 y PEG10) sobre el inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia aislado. Intensidades de fluorescencia medidas (A) después de la incubación del anticuerpo marcado con el inactivador oscuro con el péptido marcado con el fluoróforo, (B) después de añadir el analito. (C) La señal delta mostrada se calcula restando la señal A de la señal B.

Figura 8 resume las estrategias para el acoplamiento dirigido con conector de carbohidrato de la invención.

Ejemplo: 1 Síntesis del conjugado de anticuerpo-PEG10-inactivador oscuro

1 . ) Unión del grupo alquino en el anticuerpo:

se transfirieron 2 mg de anticuerpo a tampón de acoplamiento (fosfato de sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0). Se añadió peryodato de sodio hasta alcanzar una concentración final de 50 mM. La reacción se mezcló usando una mezcladora vorticial hasta que el peryodato de sodio se había disuelto completamente y se rotó durante 40 min a la temperatura ambiente con un mezclado periódico (20 rotaciones por minuto). La reacción se detuvo añadiendo etilenglicol al 1 % y se dializó contra tampón de acoplamiento.

Al conjugado se añadió un grupo alquino de alquino hidrazina en un acceso molar de 50 veces respaldado por un acceso molar de 1.000 veces de anilina. La reacción se incubó durante 120 minutos a la temperatura ambiente con un mezclado constante. La reacción se detuvo dializando contra fosfato de potasio 100 mM a pH 6,8. La concentración final de anticuerpo se ha determinado usando el Implen NP80-Touch Nano Photometer.

2. ) Unión del inactivador oscuro en el PEG-conector

Se disolvieron 10 mg de conector Azid-PEG-Amin en 1 ml de tampón de marcaje (20 partes en 1xPBS mezcladas con 1 parte en bicarbonato de sodio 0,2 M a pH 9,0) y se mezcló con un exceso molar de 10 veces de inactivador oscuroéster de NHS. La reacción se detuvo después de 1 h y se almacenó a -20 °C.

3. ) Reacción de clic

La reacción de clic se realizó generalmente como se describe (Presolski, Hong, & Finn, 2011).

Con más detalle, para una reacción de 2 ml se mezclan el alquino 25 pM de la etapa 1 con el azida-PEG-inactivador 50 pM. Posteriormente se añaden 30 pl de un complejo de THPTA-Cu 33 mM premezclado (15 pl de una solución de CuSO4 20 mM mezclada con 30 pl de una solución de THPTA 50 mM). Adicionalmente se añaden aminoguanidina 5 mM (solución madre 100 mM) y ascorbato de sodio 5 mM (solución madre 100 mM). La reacción se rota (20 rotaciones por minuto) durante 1 hora a la temperatura ambiente. Es importante proteger la reacción frente al oxígeno. Finalmente, la reacción se dializa contra un gradiente de DMSO en PBS (DMSO al 5 % en PBS, DMSO al 2 % en PBS, DMSO al 1 % en PBS y PBS).

4. ) Adición de la molécula de captura

El anticuerpo marcado aislado y el conjugado de péptido-fluoróforo se incuban conjuntamente. Consecuentemente, el fluoróforo está a una distancia próxima a los inactivadores oscuros y queda inactivado.

5. ) Inmunoensayo de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia aislado

Posteriormente se aplica la muestra con una concentración desconocida de analito al complejo de péptido-anticuerpo. Debido que el complejo de anticuerpo-analito tiene una mayor afinidad, en comparación con el complejo de anticuerpopéptido, el analito es capaz desplazar el péptido del sitio de unión al antígeno. Como resultado, el conjugado de péptido-fluoróforo está a una gran distancia (más de 9 nm) del inactivador oscuro y emite luz. Por lo tanto, la señal delta (señal 2-señal 1) se correlaciona directamente con la concentración de analito en la muestra aplicada.

Con objeto de conseguir una elevada sensibilidad en el ensayo y un gran intervalo dinámico, la señal delta debería ser máxima. Por lo tanto, la longitud del conector conjugado es crítica, tanto para la inactivación de la señal como para la generación de la señal después del desplazamiento. (A) La longitud del conector elegida es corta, dando como resultado una baja eficacia de inactivación. (B) La longitud del conector elegida es demasiado larga, dando fundamentalmente como resultado una inactivación inespecífica del fluoróforo. (C) La longitud del conector elegida es óptima tanto para la inactivación como para la generación de la señal (Figura 6).

Podría demostrarse que es esencial que un conector, con una longitud prudente, sea introducido entre el inactivador oscuro y los grupos carbohidrato, debido fundamentalmente a que la interacción entre el inactivador oscuro y el fluoróforo debería estar restringida a interacciones intramoleculares. Deben considerarse dos aspectos con la misma importancia:

• En primer lugar, la distancia entre el inactivador oscuro y el fluoróforo debería ser óptima para la inactivación. Lo que significa que el conector debería ser lo suficientemente largo como para poner en estrecha proximidad espacial al inactivador oscuro. Este parámetro puede evaluarse midiendo la señal de fluorescencia emitida después de la premezcla del anticuerpo y el péptido.

• En segundo lugar, el conector debería ser lo más corto posible con objeto de reducir las interacciones no específicas entre el inactivador oscuro y los péptidos de difusión libre. Lo que significa que el conector sólo debería permitir interacciones intramoleculares, pero no intermoleculares. Este parámetro puede evaluarse midiendo la señal de fluorescencia emitida después de añadir el analito.

El conjugado de la invención comprende un anticuerpo con una molécula conectora como se describe en el presente documento, que habitualmente está unida covalentemente al anticuerpo. El conjugado comprende adicionalmente el péptido que es capturado en el sitio de unión del anticuerpo, y comprende opcionalmente la molécula conectora. Como tal, el conjugado que comprende estos componentes se define, de conformidad con la invención, como una molécula. A este respecto, el término "interacción intramolecular" significa que la molécula conectora interactúa con el péptido capturado en el sitio de unión del anticuerpo, bien directamente o bien a través de los pares de fluoróforo/inactivador como se describe en el presente documento.

Finalmente, la longitud óptima del conector puede identificarse mediante la generación de la señal delta (señal2-señal1). Una señal delta elevada implica unos grandes cocientes entre señal y ruido, y por lo tanto un aumento en la sensibilidad del ensayo (Figura 7).

Se analizó y comparó el comportamiento de tres conectores de polietilenglicol (PEG) con una longitud molecular de entre 12,5 y 42 A. Todos los conectores se conjugaron usando una estrategia de química de clic de carbohidrato y se compararon en reacciones equimolares a 10 nM. Como inactivador oscuro usamos Atto612Q, y EuLH (Zuchner et al., 2009) como fluoróforo.

Usando los conectores PEG3 en el experimento de inactivación (péptido y anticuerpo premezclados), se detectó una elevada señal de fluorescencia (mayor de 6.500 u.a.), mientras que usando los conectores PEG6 y PEG10 se detectaron menos de 400 unidades de fluorescencia (Figura 6a). Esto sugiere que los conectores de PEG3 no son capaces de facilitar la proximidad espacial entre el inactivador y el fluoróforo requerida para el proceso de inactivación. Por el contrario, los conectores de PEG6 y PEG10 pueden generar la proximidad espacial requerida.

Para analizar si los conectores usados permiten la generación de señal, se añadió el analito y se midió de nuevo la intensidad de la fluorescencia. Los conjugados con los conectores de PEG3 y PEG6 mostraron una señal de fluorescencia elevada (más de 6.500 u.a.), mientras que el conjugado con los conectores de PEG10 mostró menos de 200 unidades de fluorescencia (Figura 6b). Esto significa que, incluso en presencia de un analito, los inactivadores oscuros conjugados con conectores de PEG10 son capaces de inactivar las señales de fluorescencia de los péptidos. Por lo tanto, es probable que los inactivadores oscuros unidos a PEG10 sean capaces de inactivar la fluorescencia intermolecular. Consecuentemente, el conector de PEG10 es demasiado largo para permitir únicamente las interacciones intramoleculares.

Después de calcular la señal delta (señal2-señal1), los conectores PEG6 son los únicos conectores analizados, que muestran una elevada de señal de fluorescencia delta. Esto significa que los conectores de PEG6 (con una longitud de 25 A) son ideales para facilitar la interacción intramolecular en lugar de interacciones intermoleculares, y por lo tanto son óptimos para los inmunoensayos de desplazamiento de la inactivación de la fluorescencia aislados. PEG3, PEG6 y PEG10 se refieren a PEG lineales con 3, 6 y 10 monómeros de óxido de etileno, respectivamente.

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado para inmunoensayos de inactivación de la fluorescencia que comprende un anticuerpo unido a un conector, caracterizado por que en su extremo proximal, el conector está unido a la cadena de carbohidrato de la asparagina del sitio de N-glicosilación en la posición 297 o de la asparagina del sitio de N-glicosilación en una posición en estrecha proximidad con la posición 297 de la cadena Fc del anticuerpo, estando la longitud del conector en el intervalo de entre 5 y 85 A de forma que el terminal distal del conector es capaz de interactuar con una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo; dicho conector es una molécula según la fórmula (I):

A-L1-B-C-L2-D-E (I),

en donde

A es hidrazida, aminooxi o tiosemicarbazida;

L1 y L2 se seleccionan entre un enlace, alquilo C-moo polietilenglicol (PEG);

B es alquino, azida, tiol, tetrazina, DBCO, TCO, vinilo o metilciclopropeno;

C es azida, alquino, maleimida, TCO, vinilo, metilciclopropeno, azida o tetrazina;

D es un grupo seleccionado entre amino y tiol; y

E es un inactivador oscuro seleccionado entre Atto612Q, DABCYL, rojo de metilo, colorantes de QSY-7 diarilrodamina y perclorato de 6-(dimetilamino)-2-[4-[4 (dimetilamino)fenil]- -1,3-butadienil]-1-etil quinolinio, un colorante de rodamina o Cy5, que comprende además un grupo NHS-éster o un grupo maleimida;

y dicha molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo es un antígeno o un fragmento del mismo o un péptido, que es capaz de unirse al sitio de unión al antígeno del anticuerpo.

2. El conjugado de la reivindicación 1, en donde dicha molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo está marcada, tal como con un fluoróforo o una molécula generadora de señal.

3. El conjugado según las reivindicaciones 1 o 2, en donde:

cuando B es alquino, entonces C es azida;

cuando B es azida, entonces C es alquino;

cuando B es tiol, entonces C es maleimida;

cuando B es tetrazina, entonces C es TCO, vinilo o metilciclopropeno;

cuando B es DBCO, entonces C es azida; y

cuando B es TCO, vinilo o metilciclopropeno, entonces C es tetracina.

4. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde L1 y L2 son ambos PEG; o L1 es alquilo C-Moy L2 es PEG; o L1 es Pe G y L2 es alquilo Cmo.

5. El conjugado de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde los grupos químicos A y B forman conjuntamente un grupo hidrazida alquino, en donde dicho grupo hidrazina alquino es un compuesto de fórmula (II):

H2N-NH-(C=O)-L1-CECH (II),

en donde L1 es un enlace o alquilo C-mo.

6. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, consiste esencialmente en o consiste en

• un anticuerpo o un fragmento del mismo,

• un conector de fórmula (I) según la reivindicación 1;

o en donde dicho conector de fórmula (I) está unido al anticuerpo en el extremo proximal a través de un compuesto seleccionado entre

i. el grupo que consiste en hidrazida-alquino-azida, hidrazida-azida-alquino, hidrazida-tiol-maleimida, hidrazida-DBCO-azida, hidrazida-TCO-tetrazina, hidrazida-metilciclopropeno-tetrazina e hidrazina-vinilotetrazina, en donde el grupo hidrazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo;

ii. el grupo que consiste en aminooxi-alquino-azida, aminooxi-azida-alquino, aminooxi-tiol-maleimida, aminooxi-DBCO-azida, aminooxi-TCO-tetrazina, aminooxi-metilciclopropeno-tetrazina y aminooxi-vinilotetrazina, en donde el grupo aminooxi del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo; y

iii. el grupo que consiste en tiosemicarbazida-alquino-azida, tiosemicarbazida-azida-alquino, tiosemicarbazida-tiol-maleimida, tiosemicarbazida-DBCO-azida, tiosemicarbazida-TCO-tetrazina, tiosemicarbazida-metilciclopropeno-tetrazina y tiosemicarbazida-vinilo-tetrazina, en donde el grupo tiosemicarbazida del conector está unido covalentemente a una región Fc del anticuerpo;

o en donde dichos compuestos de los grupos i. a iii. contienen el grupo L1 según la fórmula (I) como se define en la reivindicación 1; y

o en donde dicho conector comprende en el extremo distal un inactivador oscuro seleccionado entre Atto612Q, DABCYL, rojo de metilo, colorantes de QSY-7 diarilrodamina y perclorato de 6-(dimetilamino)-2-[4-[4 (dimetilamino)fenil]-- 1,3-butadienil]-1 -etil quinolinio, un colorante de rodamina o Cy5;

• una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo, que comprende un fluoróforo.

7. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, consiste esencialmente en o consiste en

• un anticuerpo monoclonal,

• un conector de fórmula (I);

o en donde dicho conector está en el extremo proximal unido a la región Fc del anticuerpo a través de un compuesto seleccionado entre:

• hidrazida-alquino-azida;

• hidrazida-tetrazina-TCO; y

• aminooxi-azida-alquino;

o en donde L1 es PEG o alquilo Ci-ioy L2 es PEG

o y en donde dicho conector comprende, en el extremo distal, el inactivador Atto612Q;

• una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo, que comprende el fluoróforo EuLH.

8. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende, consiste esencialmente en o consiste en

• un anticuerpo monoclonal,

• un conector de fórmula (I);

o en donde dicho conector está en el extremo proximal unido a la región Fc del anticuerpo a través de la hidrazida del ácido 4-pentinoico; L2 es un PEG lineal que comprende entre 5 y 7, preferentemente 6 monómeros de óxido de etileno; y

o en donde dicho conector comprende, en el extremo distal, el inactivador oscuro Atto612Q;

• una molécula capturada en el sitio de unión al antígeno del anticuerpo, que comprende el fluoróforo EuLH.

9. El conjugado de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la inactivación con un analito, un antígeno o un biomarcador se realiza intramolecularmente.

10. Un método para preparar el conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, que comprende las etapas de:

i. generar grupos aldehído o cetona reactivos específicamente en el sitio en el residuo de asparagina en la posición 297 o en una posición en estrecha proximidad con la posición 297 de la región Fc del anticuerpo mediante la oxidación del anticuerpo;

ii. hacer reaccionar el anticuerpo oxidado con un compuesto A-L1-B, preferentemente seleccionado entre hidrazida-Ll-alquino, hidrazida-LI-azida, hidrazida-LI-tiol, hidrazida-LI-tetrazina, hidrazida-LI-DBCO, hidrazida-LI-TCO, hidrazida-LI-vinilo, hidrazida-LI-metilciclopropeno, aminooxi-LI-alquino, aminooxi-LI-azida, aminooxi-LI-tiol, aminooxi-LI-tetrazina, aminooxi-LI-DBCO, aminooxi-LI-TCO, aminooxi-LI-vinilo, aminooxi-LI-metilciclopropeno, tiosemicarbazida-LI-alquino, tiosemicarbazida-LI-azida, tiosemicarbazida-LI-tiol, tiosemicarbazida-LI-tetrazina, tiosemicarbazida-LI-DBCO, tiosemicarbazida-LI-TCO, tiosemicarbazida-LI -vinilo, tiosemicarbazida-LI-metilciclopropeno; en donde A, B y L1 son como se define en la reivindicación 1;

iii. preparar un compuesto C-L2-D-E; en donde C, L2, D y E son como se define en la reivindicación 1;

iv. hacer reaccionar el grupo químico B del anticuerpo de la etapa ii., que comprende el compuesto A-L1-B, con el compuesto C-L2-D-E de la etapa iii. mediante reacciones de química de clic; y

v. capturar una molécula que es capaz de unirse al sitio de unión al antígeno del anticuerpo y que comprende una molécula generadora de señal, tal como un fluoróforo.

11. Un método in vitro para el diagnóstico de una enfermedad o una afección patológica que comprende las etapas de:

i. poner en contacto un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 con una muestra obtenida de un sujeto sospechoso de padecer una enfermedad o afección que se va a diagnosticar,

ii. detectar la cantidad de un analito, un antígeno, un biomarcador o similares, o una isoterma de los mismos, en dicha muestra obtenida de dicho sujeto;

iii. comparar la cantidad detectada de dichos analito, antígeno o biomarcador en dicha muestra con una cantidad del analito, antígeno o biomarcador característicos de un control normal;

en donde un cambio en la cantidad, preferentemente una cantidad elevada de dichos analito, antígeno o biomarcador en dicha muestra con respecto al control normal es un indicador positivo de la enfermedad o de la afección que se va a diagnosticar.

12. Un kit de diagnóstico, que comprende

• un compuesto A-L1-B, preferentemente seleccionado entre hidrazida-L1-alquino, hidrazida-L1-azida, hidrazida-L1 -tiol, hidrazida-L1-tetrazina, hidrazida-L1-DBCO, hidrazida-L1-TCO, hidrazida-L1 -vinilo, hidrazida-L1-metilciclopropeno, aminooxi-L1-alquino, aminooxi-L1-azida, aminooxi-L1-tiol, aminooxi-L1-tetrazina, aminooxi-L1-DBCO, aminooxi-L1-TCO, aminooxi-L1-vinilo, aminooxi-L1-metilciclopropeno, tiosemicarbazida-L1-alquino, tiosemicarbazida-L1-azida, tiosemicarbazida-L1-tiol, tiosemicarbazida-L1-tetrazina, tiosemicarbazida-L1-DBCO, tiosemicarbazida-L1-TCO, tiosemicarbazida-L1-vinilo, tiosemicarbazida-L1-metilciclopropeno; en donde A, B y L1 son como se define en la reivindicación 1;

• un compuesto C-L2-D-E; en donde C, L2, D y E son como se define en la reivindicación 2;

• un oxidante para oxidar un anticuerpo,

• un fluoróforo, e

• instrucciones para el uso de los ingredientes de dicho kit para preparar y usar el conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9.

13. Un kit de diagnóstico que comprende un conjugado ya ensamblado según se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, una placa de pocillos, tal como una placa de 96 o de 384 pocillos o un chip microfluido, en donde cada pocillo de la placa de pocillos o del chip microfluido está cargado con el conjugado de la invención, y en donde dicho kit comprende muestras de control negativo y positivo.

14. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 para su uso en el diagnóstico y/o la monitorización del estado de enfermedades o afecciones tales como trastornos cardíacos, inflamación, paratiroidectomía, coagulación sanguínea, síndrome metabólico y enfermedades renales.