ES2775451T3 - Composiciones de microvesículas recubiertas derivadas de plantas comestibles y procedimientos para la utilización de las mismas - Google Patents

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Abstract

Composición, que comprende: una microvesícula derivada de una planta comestible; y una membrana plasmática que recubre la microvesícula, la membrana plasmática derivada de una célula de reconocimiento.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de microvesículas recubiertas derivadas de plantas comestibles y procedimientos para la utilización de las mismas
SOLICITUDES RELACIONADAS CON INTERÉS DEL GOBIERNO
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el número de concesión UH2TR000875 concedido por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.
SECTOR TÉCNICO
La materia divulgada en el presente documento se refiere a composiciones de microvesículas recubiertas derivadas de plantas comestibles y a procedimientos para la utilización de las mismas para el diagnóstico y el tratamiento de una enfermedad. En particular, la materia divulgada en el presente documento se refiere a composiciones que incluyen microvesículas derivadas de plantas comestibles que tienen un recubrimiento de membrana plasmática derivada de células de direccionamiento y que son útiles en el tratamiento de una enfermedad.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La inflamación es una característica de la mayoría de las enfermedades, incluyendo cáncer, enfermedad autoinmune y enfermedad infecciosa. Se necesita con urgencia el desarrollo de sistemas de suministro específicos de diana a los sitios inflamatorios. La atracción de los leucocitos, incluyendo células T, a los sitios de inflamación y la infección es un componente esencial de la respuesta del huésped a la enfermedad, incluyendo enfermedades inflamatorias autoinmunes y crónicas, así como enfermedades infecciosas y cáncer. El reclutamiento de células T circulantes a los sitios de entrada de patógenos o inflamación implica, como mínimo, dos procesos de migración separados, denominados extravasación y quimiotaxis. La adhesión a la cara luminal de los vasos sanguíneos, la migración transendotelial, y la posterior quimiotaxis de los leucocitos son procesos muy complejos. Las quimiocinas y sus receptores desempeñan un papel de coordinación en la circulación homeostática de células T, así como su movimiento a los sitios de inflamación o lesión. Una vez que las células T están dentro del tejido inflamatorio, su respuesta puede verse afectada por las muchas quimiocinas inflamatorias que se sobreexpresan y tienen una amplia selectividad de células diana. El hecho de que haya una redundancia dentro de la red de quimiocinas con respecto a la unión ligando-receptor y que un conjunto de quimiocinas se sobreexprese por una variedad de células en tejidos inflamatorios hace de la utilización de quimiocinas un componente potencial para el desarrollo de agentes de reconocimiento terapéutico.
Para que un agente terapéutico ejerza su efecto deseado necesita (1) alcanzar el sitio deseado y (2) estar en contacto físico con su diana. El desarrollo de sistemas de suministro específicos de diana aún no ha sido ampliamente satisfactorio. A pesar de las muchas ventajas potenciales para la utilización de nanopartículas y liposomas, entre los obstáculos para su utilización se incluyen la citotoxicidad, la inducción de la inflamación crónica, las respuestas inmunitarias del huésped, las dificultades de producción a gran escala a precios asequibles y los riesgos biológicos potenciales para el medio ambiente. A diferencia de la situación con nanopartículas sintetizadas de manera artificial, los exosomas de tamaño nanométrico liberados de forma natural derivados de muchos tipos diferentes de células de mamífero juegan un papel importante en la comunicación intercelular. Los exosomas de tamaño nanométrico liberados de células de mamífero se han utilizado para la encapsulación de fármacos y ARNpi para tratar enfermedades en modelos de enfermedad en ratón sin efectos secundarios. Aunque este enfoque es prometedor, la producción de grandes cantidades de nanopartículas de células de mamíferos y la evaluación de sus potenciales riesgos biológicos han sido un reto. Recientemente, se han identificado nanopartículas similares a exosoma del tejido de plantas comestibles, que incluyen pomelo, uvas y tomates, y se han producido en grandes cantidades. Véase, por ejemplo, la Patente WO2013/070324. Al igual que con los exosomas de mamífero, se demostró que las nanopartículas similares a exosomas de uvas encapsulan de forma natural ARN, proteínas y lípidos pequeños. Mediante la utilización de modelos de cultivo celular in vitro, así como modelos de ratón, se demostró que los GNV de pomelo son muy eficaces en el suministro de una variedad de agentes terapéuticos, que incluyen fármacos, vectores de expresión de ADN, ARNpi y anticuerpos. A pesar de lo prometedor de estos nanovectores, sin embargo, sigue siendo un problema el direccionamiento eficiente y eficaz de los nanovectores a tejido inflamado y/o enfermo.
La Patente WO2013/038734 da a conocer composiciones que comprenden vesículas para suministrar moléculas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad cardiovascular.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La materia divulgada en el presente documento cumple con algunas o todas las necesidades anteriormente identificadas, tal como resultará evidente para un experto en la materia después del estudio de la información dada a conocer en el presente documento.
Estas Características describen varias realizaciones de la materia divulgada en el presente documento y, en muchos casos, enumera variaciones y permutaciones de estas realizaciones. Estas Características incluyen simplemente ejemplos de las numerosas y variadas realizaciones. La mención de una o más características representativas de una realización determinada es igualmente a modo de ejemplo. Dicha realización habitualmente puede existir con o sin la característica o características mencionadas; del mismo modo, estas características se pueden aplicar a otras realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, aparezca o no en estas Características. Para evitar la repetición excesiva, estas Características no enumeran ni sugieren todas las posibles combinaciones de dichas características.
La materia divulgada en el presente documento incluye composiciones de microvesículas recubiertas derivadas de plantas comestibles y la utilización de las mismas para el tratamiento de un trastorno inflamatorio y/o cáncer. En particular, la materia divulgada en el presente documento incluye composiciones que incluyen una microvesícula derivada de una planta comestible; y una membrana plasmática que recubre la microvesícula, la membrana plasmática derivada de una célula de reconocimiento.
En la materia divulgada en el presente documento, se da a conocer una composición que comprende una microvesícula derivada de una planta comestible, en la que la microvesícula, a su vez, está recubierta con una membrana plasmática derivada de una célula de reconocimiento. En algunas realizaciones, la planta comestible es una fruta o un vegetal, tal como, en algunas realizaciones, una uva, un pomelo o un tomate. En algunas realizaciones, la célula de reconocimiento utilizada para derivar la membrana plasmática que recubre la microvesícula es un leucocito activado.
Adicionalmente, con respecto a las composiciones de microvesículas, en algunas realizaciones, la microvesícula encapsula un agente terapéutico. En algunas realizaciones, el agente terapéutico se selecciona entre un agente fitoquímico y un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el agente fitoquímico se selecciona entre curcumina, resveratrol, baicaleína, equol, fisetina y quercetina. En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que comprende ácido retinoico, 5-fluorouracilo, vincristina, actinomicina D, adriamicina, cisplatino, docetaxel, doxorrubicina y taxol. En otras realizaciones, el agente terapéutico comprende una molécula de ácido nucleico, tal como, en algunas realizaciones, un ARNpi, un microARN o un vector de expresión de mamífero. En algunas realizaciones, se dan a conocer adicionalmente composiciones farmacéuticas en las que las composiciones de microvesículas están combinadas con un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se da a conocer, además, en algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, una composición, tal como se ha descrito anteriormente, para la utilización en el tratamiento de un trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, el tratamiento de un trastorno inflamatorio comprende la etapa de administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una composición de microvesículas descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que comprende sepsis, choque séptico, colitis, cáncer de colon y artritis. La composición se puede administrar por vía oral o intranasal. En algunas realizaciones, después de la administración, la composición reduce la cantidad de una citocina inflamatoria en un individuo, tal como, en ciertas realizaciones, factor a de necrosis tumoral, interleucina-1 p, interferón y e interleucina-6.
En algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, la composición, tal como se ha descrito anteriormente, es para la utilización en el tratamiento de un cáncer en un individuo. En algunas realizaciones, el tratamiento de un cáncer en un individuo comprende administrar a un individuo una cantidad eficaz de una composición de microvesículas que se da a conocer en el presente documento. En algunas realizaciones de tratamiento de un cáncer, el agente terapéutico se selecciona entre un agente fitoquímico y un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona entre un cáncer de cerebro, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón y un cáncer de colon.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes para un experto en la materia después del estudio de la descripción, figuras y ejemplos no limitantes en el presente documento.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1A-1D incluyen diagramas esquemáticos, gráficos e imágenes que muestran la caracterización de nanovectores derivados de pomelo GNV recubiertos de membrana plasmática de células inflamatorias (IGNV). La figura 1A es un diagrama esquemático que muestra el proceso de preparación de los IGNV y microvesículas de GNV cargadas con fármaco para el suministro dirigido de agentes terapéuticos a sitios inflamatorios. La figura 1B es un gráfico que muestra la distribución de tamaños y el potencial Zeta de superficie de GNV libres y los GNV recubiertos de membrana plasmática de células EL4 (IGNV) se midieron utilizando un Zetasizer. La figura 1C incluye imágenes que muestran GNV libres (izquierda) e IGNV (derecha) que se visualizaron y se analizaron por imagen mediante microscopía electrónica de barrido. La figura 1D incluye imágenes que muestran la colocalización de las membranas plasmáticas derivadas de células EL4 y núcleos de GNV, donde, para el ensamblaje de IGNV, las membranas plasmáticas derivadas de células EL4 se marcaron con colorante verde PKH67 y los núcleos de GNV se marcaron con colorante rojo PKH26, donde se cultivaron células 4T1 en presencia de GNV (panel superior) o IGNV (panel inferior) durante 12 horas, y donde las imágenes representativas de las células se tomaron, a continuación, utilizando un microscopio confocal con una ampliación de 400 aumentos. La figura 1E es un gráfico que muestra las mediciones basadas en FRET de la formación de IGNV, donde se mezclaron GNV marcados con DiO y vesículas de membrana marcadas con DPA (n=3), donde la mezcla se extruyó posteriormente 20 veces a través de una membrana porosa de policarbonato de 200 nm utilizando una mini extrusora Avanti o se utilizó la mezcla sin extrusión adicional como control, y donde los productos extruidos y los productos mezclados se diluyeron, a continuación, y se midió la intensidad de fluorescencia.
Las figuras 2A-2E incluyen imágenes y gráficos que muestran la capacidad de IGNV para utilizar las vías dependientes de membrana de leucocitos activados y dirigirse de manera eficaz y suministrarse a los sitios inflamatorios. La figura 2A incluye imágenes y gráficos que muestran los resultados de un ensayo con transpocillos para la detección de la quimiotaxis de GNV recubiertos de membrana plasmática de células EL4, donde se cultivaron células HUVEC en la cámara superior y se cultivaron células 4TO7en la cámara inferior de una placa con transpocillos, donde la transmigración de GNV o IGNV marcados con PKH26 se obtuvo en imágenes después de 24 horas y 48 horas en cultivo utilizando un microscopio confocal, y donde se midió la intensidad de la señal fluorescente de los medios en la cámara inferior (n=3) y se expresó como el porcentaje de eficacia en el transpocillo de la intensidad de fluorescencia de GNV o IGNV marcados con PKH26. Las figuras 2B-2E son imágenes y gráficos que muestran la distribución de IGNV marcados con colorante DiR en: modelo de ratón con enfermedad inflamatoria aguda de la piel inducida por LPS (figura 2B); ratones con colitis inducida por DSS (figura 2C); modelo de tumor CT26 (figura 2D); y modelo de tumor 4T1 (figura 2E); donde las imágenes de ratones vivos (izquierda) se recogieron 6 horas y 24 horas después de la inyección I.V. de IGNV marcadas con colorante DiR, donde la piel, colon y los tejidos tumorales se extrajeron 24 horas después de la inyección y se rastrearon las señales de colorante DiR, y donde se muestra una imagen representativa de cada grupo de ratones (paneles de la izquierda) y seguido por figuras gráficas (paneles de la derecha) que se presentan como la intensidad neta promedio (intensidad de la suma/área, n=5) (**p < 0,01 y ***p < 0,001).
Las figuras 3A-3I incluyen imágenes y gráficos que muestran la capacidad de las vías mediadas por quimiocinas de jugar un papel causal en el suministro dirigido eficaz de IGNV a los sitios inflamatorios. La figura 3A incluye imágenes que muestran la expresión de quimiocinas en piel normal (Normal), tejidos de piel inflamatoria aguda inducida por LPS (Piel-LPS), tejidos con CT26 (tumor CT26) y 4T1 (tumor 4T1), donde se determinaron las expresiones utilizando un Proteoma Profiler de R&D Systems, y donde cada punto representa una quimiocina detectada por un anticuerpo de captura e impreso por duplicado en una membrana. La figura 3B incluye gráficos que muestran la expresión de receptores de quimiocinas en IGNV, donde los IGNV se analizaron mediante análisis FACS de IGNV recubiertos sobre perlas de látex con aldehído/sulfato de 4 pmi de diámetro. La figura 3C es un gráfico que muestra la transmigración in vitro de IGNV, donde se cultivaron células HUVEC (n=3) en la cámara superior recubierta de fibronectina como barrera de transmigración, donde se preincubaron IGNV marcados con PKH26 (PKH26-IGNV) con quimiocinas recombinantes, tal como indica en la figura 1C o con el extracto del tumor 4T1, donde, después del lavado, los PKH26-IGNV preincubados se añadieron a la cámara superior y se cultivaron en presencia de quimiocinas recombinantes (CXCL1/2/9/10 más CCL2/5) en la cámara inferior, y donde, después de una incubación de 24 horas, se midió la intensidad de fluorescencia de PKH26 del medio en la cámara inferior (n=3) y se expresó como el % de eficacia en el transpocillo de IGNV con PKH26+. La figura 3D incluye imágenes y un gráfico que muestra IGNV en ratones con enfermedad inflamatoria aguda en la piel inducida por LPS, donde se preincubaron IGNV marcados con colorante DiR durante la noche a 4 °C con extracto de 4T1 (neutralizado) o sin extracto de 4T1 (no neutralizado) antes de una inyección I.V., y donde se muestra (izquierda) una imagen representativa a las 6 horas y 24 horas después de la inyección de cada grupo de ratones (n=5) y seguido de figuras gráficas (derecha) que se presentan como la intensidad neta promedio (intensidad de suma/área, n=5). La figura 3E incluye imágenes que muestran la tinción inmunohistoquímica de quimiocinas (CCL2, CCL5, CXCL9 y CXCL10) expresada en cáncer de mama humano, tejidos de cáncer de colon (paneles inferiores) y tejidos adyacentes apareados (paneles superiores), donde se muestra una imagen representativa (n=20 para cáncer de colon, n=21 para cáncer de mama) de cada muestra. Las figuras 3F-3G son gráficos que muestran los resultados de experimentos donde Ig Nv marcados con colorante DiR se preincubaron a 4 °C durante la noche con quimiocinas recombinantes, tal como se indica en las figuras y, a continuación, se inyectaron I.V. en ratones con enfermedad inflamatoria aguda de la piel inducida por LPS (figura 3F) o ratones portadores del tumor CT26 (figura 3G), donde se determinaron las señales del colorante DiR en tejidos de la piel y tumorales 24 horas después de la inyección. La figura 3H es un gráfico que muestra la transmigración de IGNV con/sin neutralización por LFA-1, donde IGNV marcados con PKH26 se preincubaron durante la noche con anticuerpo contra LFA-1 a 4 °C y, a continuación, se añadieron en la cámara apical, y donde se midió la intensidad de fluorescencia de PKH26 de los medios en la cámara inferior después de 24 horas y 48 horas de incubación y se expresó como el porcentaje de eficacia en el transpocillo de IGNV con PKH26+. La figura 3I incluye una imagen y un gráfico que muestra los resultados de un experimento donde IGNV marcados con colorante DiR se preincubaron con anticuerpos contra LFA-1 funcional a 4 °C durante una noche, se lavaron, se inyectaron I.V. en ratones con enfermedad inflamatoria aguda de la piel inducida por LPS, y se detectaron las señales de DiR después de 24 horas desde la inyección.
Las figuras 4A-4E incluyen imágenes y gráficos que muestran el direccionamiento a cáncer de colon humano mediante el recubrimiento de GNV con la membrana plasmática de leucocitos estimulados con LPS aislados de sangre periférica de individuos humanos sanos (hIGNV) o de ratones (mIGNV). Las figuras 4A-4B incluyen gráficos que muestran los perfiles de receptores de quimiocinas de hIGNV (figura 4A) y mIGNV (figura 4B) basados en el análisis FACS, donde histogramas representativos (n=5) muestran el porcentaje de tinción de los receptores de quimiocinas de los hIGNV y mIGNV y donde se utilizaron tres bandas diferentes de gradientes de sacarosa de la membrana plasmática de leucocitos estimulados con LPS para el recubrimiento de GNV: banda superior (LPS-T), banda media (LPS-M) y banda inferior (LPS-B). La figura 4C incluye imágenes y gráficos que muestran el transporte de hIGNV marcados con colorante DiR en ratones portadores de cáncer de colon SW620, donde los ratones fueron inyectados I.V. con hIGNV marcados con colorante DiR, donde la obtención de imágenes en vivo de ratones completos se llevó a cabo en el día 1 y 5 después de la inyección, donde, en el día 5 después de la inyección, se extrajeron los tumores y se rastrearon, y donde se midió el transporte de mIGNV marcados con colorante DiR en un modelo de ratón con enfermedad inflamatoria aguda de la piel inducida por LPS. Las figuras 4D-4E incluyen imágenes y un gráfico que muestra los resultados de un experimento donde los ratones fueron inyectados I.V. con mIGNV marcados con colorante DiR sin (figura 4D) o con (figura 4E) knockout de CXCR2, donde la piel se extrajo 72 horas (figura 4D) o 24 horas (figura 4E) después de la inyección y se rastreó. Se muestra una imagen representativa (figuras 4C-4D) de cada grupo de ratones y las figuras gráficas se presentan como la intensidad neta promedio (intensidad de la suma/área, n=5) *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001).
Las figuras 5A-5F incluyen gráficos e imágenes que muestran el suministro de fármacos terapéuticos dirigidos para el cáncer de ratón y la terapia para la colitis. La figura 5A es un gráfico que muestra la estabilidad de iGnV circulantes. La figura 5B incluye imágenes que muestran el perfil de liberación in vitro de doxorrubicina de IGNV-DOX en tampón PBS con diferentes valores de pH (5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.2, n=5, **p<0,01). La figura 5C es un gráfico que muestra la biodistribución de doxorrubicina en ratones portadores del tumor 4T1, donde los ratones portadores del tumor 4T1 (n=5) fueron inyectados I.V. con IGNV-DOX o DOX-NP®, y donde se midió la doxorrubicina en los tejidos tumorales 4T1, hígados, pulmones, bazos, riñones, corazones y timo (*p < 0,05). La figura 5D incluye imágenes que muestran la biodistribución de doxorrubicina en los tejidos tumorales CT26 y 4T1, donde la doxorrubicina libre (DOX libre), la doxorrubicina suministrada con GNV (GNV-DOX) y la doxorrubicina suministrada con IGNV (IGNV-DOX) fueron inyectadas I.V. en ratones portadores de tumor CT26 (n=5) y 4T1 (n=5), donde los tejidos tumorales se extrajeron, se fijaron y seccionaron, y donde se observó la doxorrubicina en los tejidos tumorales utilizando un sistema de imágenes confocal. Las figuras 5E-5F incluyen imágenes y gráficos que muestran los resultados de experimentos donde se inyectaron células CT26 y 4T1 por vía subcutánea (CT26) o en una almohadilla de grasa mamaria (4T1) de ratones BALB/c, donde los ratones fueron inyectados I.V. con IGNV-DOX o controles, tal como se indica en la figura cada 3 días durante 30 días a partir de 7 días después de inyectar células tumorales, donde se muestran imágenes representativas de los tumores (figura 5E, panel izquierdo) de cada grupo (n=5), se midió el volumen del tumor cada 5 días, (figura 5E, panel derecho) y donde se calculó la tasa de supervivencia (figura 5F) de ratones (*p < 0,05, y **p < 0,01).
Las figuras 6A-6B incluyen imágenes y gráficos que muestran receptores de quimiocinas expresadas en células EL4 estimuladas con PMA. La figura 6A incluye imágenes que muestran la morfología de células EL4 cultivadas sin estimulación con PMA (izquierda) o con estimulación con PMA (derecha), aumento original x 10. La figura 6B incluye gráficos que muestran los porcentajes de los receptores de quimiocinas expresados en células EL4 con/sin estimulación con PMA, donde se recogieron células EL4 (n=3) a las 24 horas después de la estimulación con PMA y se tiñeron con anticuerpos contra CCR3, CCR4, c Cr5, CCR7, CCR9, CXCR3 y CXCR7 marcados con fluorescencia y se analizó el porcentaje de receptores de quimiocinas mediante FACS.
La figura 7 es una imagen que muestra la separación de la membrana plasmática de EL4 a través de centrifugación discontinua del gradiente de sacarosa, donde se recogieron células EL4 con/sin estimulación con PMA y se homogeneizaron, y donde las muestras homogeneizadas estaban en bandas de sacarosa y se tomaron las imágenes después de la centrifugación.
La figura 8 incluye imágenes que muestran la captación de una mezcla de GNV y vesículas derivadas de membrana, donde las vesículas de membrana plasmática derivada de células EL4 se marcaron con PKH67 y los GNV se marcaron con PKH26, donde se cultivaron células 4T1 en presencia de vesículas de membrana con PKH67 y PKH26-GNV mezcladas de manera simple durante 12 horas, y donde, a continuación, se tomaron imágenes representativas de células (n=3) utilizando un microscopio confocal con un aumento de x 400.
Las figuras 9A-9B incluyen gráficos que muestran la estabilidad de IGNV, donde se analizó la estabilidad de GNV recubiertos de membrana de células EL4 (n=5) a 22 °C durante un período de 5 días (figura 9A) o a 37 °C durante 25 horas (figura 9B) midiendo la distribución de tamaño y el potencial zeta de superficie.
La figura 10 incluye gráficos que muestran la transmigración de GNV e IGNV, donde se cultivaron células HUVEC en la cámara superior recubierta de fibronectina (7,5 |xg/cm2) como una barrera de transmigración, donde se añadieron GNV (paneles superiores) o IGNV marcados con colorante PKH26 (paneles inferiores) a la cámara superior y se incubaron durante 24 horas y 48 horas, y donde se midieron las partículas marcadas con colorante PKH26 en el medio de la cámara inferior, y se expresaron como el porcentaje de la eficacia en transpocillos de IGNV con PKH26+.
La figura 11 incluye gráficos que muestran la expresión de integrinas en células EL4, donde las células EL4 se activaron con PMA y se detectó la expresión de las integrinas (LFA-1 y a4p7) en las células mediante tinción con anticuerpos PE contra LFA-1 y a4p7 y el porcentaje de células positivas de integrina se analizó mediante FACS. La figura 12 incluye gráficos que muestran LFA-1 en Ig Nv , donde los IGNV estaban recién preparados y conjugados con perlas de látex, y donde el porcentaje de IGNV positivos en LFA-1 se cuantificó mediante análisis Fa Cs de IGNV teñidos con anticuerpo PE contra LFA-1.
Las figuras 13A-13B incluye imágenes que muestran la purificación de las membranas plasmáticas de leucocitos, donde se aislaron leucocitos de sangre periférica de seres humanos y ratones y se estimularon in vitro con (+LPS) (100 ng/ml) o PBS como control (-LPS) durante 24 horas, y donde las membranas plasmáticas homogeneizadas de células de ser humano (figura 13a ) y de ratón (figura 13B) se purificaron mediante centrifugación en gradiente de sacarosa (T = banda superior de la membrana purificada en gradiente de sacarosa, M = banda media la membrana purificada en gradiente de sacarosa, B = banda inferior de la membrana purificada en gradiente de sacarosa).
La figura 14 incluye gráficos que muestran quimiocinas en el medio de cultivo de células SW620 humanas, donde se cultivaron células de adenocarcinoma colorrectal humano SW620 en placas de 6 pocillos durante 48 horas y se analizó cuantitativamente la liberación de las quimiocinas CCL2, CCL5 y CXCL10 en los sobrenadantes de cultivo con un ELISA.
Las figuras 15A-15F incluyen imágenes y gráficos que muestran los efectos de IGNV sobre la proliferación celular in vitro y la toxicidad potencial in vivo. La figura 15A es un gráfico que muestra los resultados de un experimento donde se analizó la proliferación de células 4T1 tratadas con IGNV utilizando el ensayo ATPlite 24 horas después de la exposición a diferentes concentraciones de IGNV. La figura 15B es un gráfico que muestra los resultados de un experimento, donde se determinó la cantidad de células 4T1 vivas tratadas con IGNV en el paso número 1 a 5 contando el número de células vivas (sin mancha con azul de tripano). Las figuras 15C-15D incluyen gráficos que muestran los resultados de un experimento donde se analizaron TNF-a, IL-6 e IL-1 p en suero (figura 15C) y ALT, AST (figura 15D) 24 horas después de que los ratones fueron inyectados I.V. con IGNV tres veces o PBS como control (control normal). La figura 15E incluye imágenes de secciones teñidas con H&E de hígados, bazos, riñones y pulmones de ratones inyectados con IGNV, aumento original x 20. La figura 15F incluye gráficos que muestran los pesos del hígado, pulmones, bazo, riñón y corazón de los animales inyectados.
Las figuras 16A-16E incluyen imágenes y gráficos que muestran IGNV cargados con fármacos terapéuticos. La figura 16A es una imagen que muestra la purificación de fármacos terapéuticos (izquierda: doxorrubicina, derecha: curcumina) cargados en IGNV mediante centrifugación en gradiente de densidad discontinuo de sacarosa. Las figuras 16B-16C son gráficos que muestran la distribución de tamaños (figura 16B) y el potencial Zeta (figura 16C) de IGNV-DOX e IGNV-Cur analizados utilizando un ZetaSizer. La figura 16D es un gráfico que muestra la eficacia de carga de doxorrubicina y curcumina detectada mediante espectrometría UV y se expresa como el % = (fármacos total - fármacos libres)/fármacos totales x 100 %. La figura 16E incluye gráficos que muestran el perfil de liberación de la doxorrubicina y la curcumina en tampón PBS a pH 7,2 y 37 °C, tal como se detecta mediante espectrometría de UV a 497 y 426 nm, respectivamente.
Las figuras 17A-17D incluyen gráficos que muestran la caracterización de DOX-NP®y liposomas de control de Avanti. La figura 17A es un gráfico que muestra el perfil de doxorrubicina liberada de dOX-NP® a 37 °C en tampón de PBS a diferentes valores de pH (5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.2). La figura 17B es un gráfico que muestra la proliferación de células 4T1 tratadas con diferentes concentraciones de liposomas de control y se analizó utilizando el ensayo ATPlite. Las figuras 17C-17D son gráficos que muestran los resultados de un experimento donde los ratones fueron inyectados I.V. con liposomas de control diariamente durante 3 días, donde 24 horas después de la última inyección de los liposomas de control, se evaluó TNF-a, IL-6 y IL-1 p en suero (figura 17C) y las enzimas hepáticas AST y ALT (figura 17D) (n=5 ratones por grupo).
La figura 18 incluye gráficos que muestran la biodistribución de DOX en los tejidos tumorales 4T1, donde DOX (200 |xg) se cargó en los GNV (GNV-DOX), a continuación, GNV-DOX se mezcló o extruyó con membranas derivadas de células T EL4 (IGNV-DOX), donde, después de lavado, el GNV-DOX o IGNV-DOX fueron inyectados I.V. en ratones portadores de tumor 4T1, y donde 24 horas después, los ratones se sacrificaron, se extrajeron los tejidos tumorales y se extrajo y detectó la dOx en los tejidos tumorales.
Las figuras 19A-19E incluyen imágenes y gráficos que muestran el efecto terapéutico de IGNV-Cur en la inhibición de la colitis de ratón inducida por DSS, donde los ratones con colitis inducida por DSS fueron inyectados I.V. con PBS, GNV, IGNV, curcumina libre, GNV-Cur o IGNV- Cur cada 2 días durante 10 días, donde en el día 0 después del último tratamiento, se determinó el grado de prolapso rectal y hemorragia intestinal (figura 19A), se midió el peso corporal diariamente (figura 19B), se analizaron las tasas de supervivencia (figura 19C), se tiñeron los tejidos de colon seccionados con H&E (n=5) (figura 19D) y se cuantificó la curcumina en tejidos de colon mediante HPLC (figura 19E).
La figura 20 incluye gráficos que muestran el efecto terapéutico de IGNV-Cur en la inhibición de la inducción por citocinas del tejido de colitis, donde en el día 3 después de haber sido administrado con DSS al 2,5 %, los ratones (n=5 ratones por grupo) fueron inyectados I.V. con PBS, GNV libres (200 nmol), IGNV (200 nmol), Cur libre (50 mg/kg), GNV-Cur (50 mg/kg) o IGNV-Cur (50 mg/kg), cada 2 días 5 veces, y donde 24 horas después de la última inyección, se determinaron TNF-a, IL-6 y IL-1 p en suero mediante ELISA.
La figura 21 es un gráfico que muestra la determinación de la concentración micelar de GNV (cmc), donde se utilizaron diferentes concentraciones de lípidos totales (eje X) extraídos a partir de nanopartículas de pomelo para generar una película de lípidos, y donde, después de un baño de sonicación, se analizaron la formación y la distribución de tamaños de GNV (nm) utilizando un ZetaSizer.
DESCRIPCIÓN DE REALIZACIONES DE EJEMPLO
Los detalles de una o más realizaciones de la materia divulgada en el presente documento se exponen en el presente documento. Las modificaciones a las realizaciones descritas en el presente documento, y otras realizaciones, serán evidentes para un experto en la materia después del estudio de la información dada a conocer en el presente documento. La información dada a conocer en el presente documento y, en particular, los detalles específicos de los ejemplos de realización descritos, se proporciona principalmente para una mayor claridad de comprensión y no deben entenderse limitaciones innecesarias a partir de la misma. En caso de conflicto, la memoria descriptiva del presente documento, incluyendo las definiciones, tendrá prevalencia.
Aunque se cree que los términos utilizados en el presente documento son bien entendidos por un experto en la materia, en el presente documento se exponen definiciones para facilitar la explicación de la materia divulgada en el presente documento.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la materia divulgada en el presente documento. Aunque cualquier procedimiento, dispositivo y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento pueden utilizarse en la práctica o ensayo de la materia divulgada en el presente documento, a continuación, se describen procedimientos, dispositivos y materiales representativos.
Siguiendo la convención de ley de patentes desde hace tiempo, los términos "un", "una" y "el" o “la” se refieren a "uno o una o más" cuando se utilizan en la presente solicitud, incluyendo las reivindicaciones. De este modo, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una pluralidad de dichas células, y así sucesivamente.
A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como condiciones de reacción, y así sucesivamente, utilizados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, se pueden modificar en todos los casos por el término “aproximadamente”. En consecuencia, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos expuestos en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se busca obtener mediante la materia divulgada en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se refiere a un valor o a una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración o porcentaje, se entiende que comprende variaciones, en algunas realizaciones, del ± 20 %, en algunas realizaciones, del ± 10 %, en algunas realizaciones, del ± 5 %, en algunas realizaciones, del ± 1 %, en algunas realizaciones, del ± 0,5 % y, en algunas realizaciones, del ± 0,1 % de la cantidad especificada, ya que dichas variaciones son apropiadas para llevar a cabo el procedimiento descrito.
Tal como se utiliza en el presente documento, los intervalos se pueden expresar como desde "aproximadamente" un valor particular y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. También se entiende que hay un número de valores descritos en el presente documento y que cada valor también está descrito en el presente documento como "aproximadamente" ese valor particular además del propio valor en sí. Por ejemplo, si se describe el valor "10", entonces también se describe "aproximadamente 10". También se entiende que se describe cada unidad entre dos unidades particulares. Por ejemplo, si se describen 10 y 15, entonces también se describen 11, 12, 13, y 14.
La materia divulgada en el presente documento se basa, como mínimo, en parte, en el descubrimiento de que la unión y el recubrimiento de membranas derivadas de células inflamatorias en microvesículas o nanovectores derivados de pomelo (GNV, por sus siglas en inglés) es una estrategia eficaz y eficiente para aprovechar la disponibilidad ilimitada de GNV y para generar vectores de suministro personalizados que reconocerían sitios inflamatorios diana en enfermedades (figura 1A). Tal como se describe en el presente documento a continuación, dichas composiciones tienen, entre otras, dos ventajas, a saber: 1) la membrana plasmática de leucocitos activados se une, de manera preferente, en las microvesículas formadas de nanopartículas de lípidos de fruta; y 2) las microvesículas resultantes son seguras y pueden utilizarse con éxito para el suministro dirigido de agentes terapéuticos a sitios inflamatorios.
Las microvesículas son nanopartículas que existen de forma natural que se encuentran en forma de pequeños ensamblajes de partículas lipídicas, tienen un tamaño de aproximadamente 50 a 1.000 nm y no sólo son secretadas por muchos tipos de cultivos de células in vitro y de células in vivo, sino que habitualmente se encuentran in vivo en fluidos corporales, tales como sangre, orina y ascitis maligna. De hecho, entre las microvesículas se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, partículas, tales como exosomas, epididimosomas, argosomas, vesículas similares a exosomas, micropartículas, promininosomas, prostasomas, dexosomas, texosomas, dex, tex, arqueosomas y oncosomas.
Tal como se ha indicado anteriormente, las microvesículas se pueden formar mediante una variedad de procesos, que incluyen la liberación de cuerpos apoptóticos, la germinación de microvesículas directamente de la membrana citoplasmática de una célula y la exocitosis de cuerpos multivesiculares. Por ejemplo, los exosomas se forman habitualmente mediante su secreción a partir de los compartimentos de membrana endosomal de células como consecuencia de la fusión de los cuerpos multivesiculares con la membrana plasmática. Los cuerpos multivesiculares se forman mediante la germinación hacia el interior de la membrana endosomal y el posterior estrangulamiento de pequeñas vesículas en el espacio luminal. Las vesículas internas presentes en las MVB se liberan, a continuación, en el fluido extracelular como los llamados exosomas.
Como parte de la formación y liberación de microvesículas, las moléculas no deseadas se eliminan de las células. Sin embargo, las proteínas citosólicas y de la membrana plasmática también se incorporan durante estos procesos en las microvesículas, dando lugar a microvesículas que tienen propiedades de tamaño de partícula, propiedades funcionales de las bicapas lipídicas y otras propiedades funcionales únicas que permiten que las microvesículas funcionen potencialmente como portadores en nanopartículas eficaces de agentes terapéuticos. En este sentido, el término "microvesícula" se utiliza en el presente documento de forma intercambiable con los términos "nanopartícula", "liposoma", "exosoma", "partícula similar a exosoma", "nano-vector" y variaciones gramaticales de cada uno de los anteriores. Actualmente se ha descubierto, sin embargo, que plantas comestibles, tales como frutas, no sólo son una fuente viable de grandes cantidades de microvesículas, sino que las microvesículas derivadas de plantas comestibles se pueden recubrir con membranas plasmáticas derivadas de células de reconocimiento, tales como leucocitos, y se utilizan como un vehículo de suministro eficaz para transportar o, en cualquier caso, dirigir las microvesículas, que incluyen cualquiera de los agentes terapéuticos que se pueden incluir dentro de las microvesículas, a los sitios de inflamación y enfermedad.
La materia divulgada en el presente documento, incluye, de este modo, composiciones de microvesículas derivadas de plantas comestibles que están recubiertas con membranas plasmáticas derivadas de células de reconocimiento. La expresión "células de reconocimiento", y variaciones gramaticales de la misma, se utilizan en el presente documento para referirse a aquellas células que, debido a la inclusión de ciertos restos de reconocimiento (por ejemplo, receptores u otras proteínas) en sus membranas plasmáticas, de manera preferente, se dirigen o son transportadas a ciertos tejidos y órganos en el cuerpo de un individuo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células de reconocimiento son células inflamatorias activadas, tales como leucocitos, o macrófagos o neutrófilos que, de manera preferente, reconocen o se dirigen a sitios de inflamación. Como otro ejemplo, en algunas realizaciones, las células de reconocimiento son células tumorales circulantes o células tumorales metastásicas que, de manera preferente, se dirigen a tejidos, tales como cerebro, pulmón, hígado y tejido óseo (es decir, sitios frecuentes de metástasis). Como otro ejemplo adicional, en algunas realizaciones, las células de reconocimiento son células madre (por ejemplo, células madre derivadas de médula ósea) que, de manera preferente, pueden dirigirse a y se utilizan para la regeneración de tejido.
En algunas realizaciones, las composiciones de microvesículas incluyen, además, agentes terapéuticos y son útiles en el tratamiento de diversas enfermedades, que incluyen trastornos inflamatorios y cánceres. En algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, se da a conocer una composición de microvesículas que comprende una microvesícula derivada de una planta comestible y una membrana plasmática que recubre la microvesícula, en la que la membrana plasmática ha sido derivada de una célula de reconocimiento. En algunas realizaciones, se da a conocer una composición en la que un agente terapéutico es encapsulado por la microvesícula derivada de la planta comestible. En algunas realizaciones, el agente terapéutico encapsulado por la microvesícula derivada de la planta comestible se selecciona entre un agente fitoquímico y un agente quimioterapéutico.
La expresión "planta comestible" se utiliza en el presente documento para describir organismos del reino Plantae que son capaces de producir sus propios alimentos, como mínimo, en parte, a partir de materia inorgánica a través de la fotosíntesis, y que son aptos para el consumo por un individuo, tal como define en el presente documento, a continuación. Entre dichas plantas comestibles se incluyen, pero sin limitarse a las mismas, verduras, frutas, frutos secos y similares. En algunas realizaciones de las composiciones de microvesículas descritas en el presente documento, la planta comestible es una fruta. En algunas realizaciones, la fruta se selecciona entre una uva, un pomelo y un tomate.
La frase "derivada de una planta comestible", cuando se utiliza en el contexto de una microvesícula derivada de una planta comestible, se refiere a una microvesícula que, mediante la mano del hombre, existe separado de su entorno nativo y, por lo tanto, no es un producto de la naturaleza. En este sentido, en algunas realizaciones, la expresión "derivada de una planta comestible" se puede utilizar de forma intercambiable con la frase "aislada de una planta comestible" para describir una microvesícula de la materia divulgada en el presente documento que es útil para recubrirse con una membrana plasmática derivada de células inflamatorias y/o para la encapsulación de agentes terapéuticos.
La frase "encapsulado por una microvesícula", o variaciones gramaticales de la misma, se utiliza en el presente documento para referirse a microvesículas cuya bicapa lipídica rodea un agente terapéutico. Por ejemplo, una referencia a "curcumina en microvesícula" se refiere a una microvesícula cuya bicapa lipídica encapsula o rodea una cantidad eficaz de curcumina. En algunas realizaciones, la encapsulación de diversos agentes terapéuticos dentro de microvesículas se puede conseguir mezclando primero el uno o más de los agentes fitoquímicos o agentes quimioterapéuticos con microvesículas aisladas en una solución tamponada adecuada, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de un período de incubación suficiente para permitir que el agente terapéutico sea encapsulado durante el período de incubación, la mezcla de microvesícula/agente terapéutico se somete, a continuación, a un gradiente de sacarosa (por ejemplo, gradiente de sacarosa al 8, 30, 45 y 60 %) para separar el agente terapéutico libre y microvesículas libres de los agentes terapéuticos encapsulados dentro de las microvesículas, y una etapa de centrifugación para aislar las microvesículas que encapsulan los agentes terapéuticos. Después de esta etapa de centrifugación, las microvesículas que incluyen los agentes terapéuticos son observadas como una banda en el gradiente de sacarosa, de manera que, a continuación, se pueden recoger, lavar y disolver en una solución adecuada para la utilización, tal como se describe en el presente documento, a continuación.
Tal como se ha indicado, en algunas realizaciones, el agente terapéutico es un agente fitoquímico. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente fitoquímico" se refiere a un compuesto derivado de plantas no nutritivo, o un análogo del mismo. Entre los ejemplos de agentes fitoquímicos se incluyen, pero sin limitación a los mismos, compuestos, tales como monofenoles; flavonoides, tales como flavonoles, flavanonas, flavonas, flavan-3-oles, antocianinas, antocianidinas, isoflavonas, dihidroflavonoles, chalconas y cumestanos; ácidos fenólicos; ácidos hidroxicinámicos; lignanos; ésteres de tirosol; estilbenoides; taninos hidrolizables; carotenoides, tales como carotenos y xantofilas; monoterpenos; saponinas; lípidos, tales como fitosteroles, tocoferoles y ácidos grasos omega-3,6,9; diterpenos; triterpinoides; betalaínas, tales como betacianinas y betaxantinas; ditioltionas; tiosulfonatos; indoles; y glucosinolatos. Como otro ejemplo de un agente fitoquímico descrito en el presente documento, el agente fitoquímico puede ser un análogo de un compuesto derivado de plantas, tal como oltipraz, que es un análogo de 1,2-ditiol-3-tiona, un compuesto que se encuentra en muchos vegetales crucíferos.
En algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, el agente terapéutico es un agente fitoquímico seleccionado entre curcumina, resveratrol, baicaleína, fisetina y quercetina. En algunas realizaciones, el agente fitoquímico es curcumina. La curcumina es un polifenol natural pleiotrópico con actividad antiinflamatoria, antineoplásica, antioxidante y quimiopreventiva, habiéndose identificado estas actividades tanto a nivel de proteína como molecular. Sin embargo, se ha descrito un progreso limitado con respecto a la utilización terapéutica de la curcumina, ya que la curcumina es insoluble en disolventes acuosos y es relativamente inestable. Además, se sabe que la curcumina tiene una biodisponibilidad sistémica baja después de la dosificación oral, lo que limita aún más su utilización y eficacia clínica. Se ha determinado, sin embargo, que mediante la encapsulación de la curcumina en microvesículas derivadas de plantas comestibles, no sólo se puede aumentar la solubilidad de la curcumina, sino que la encapsulación de la curcumina dentro de las microvesículas protege la curcumina de la degradación y también aumenta la biodisponibilidad de la curcumina en la microvesícula.
Tal como también se ha indicado anteriormente en el presente documento, en algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, el agente terapéutico que se encapsula dentro del exosoma es un agente quimioterapéutico. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos que se pueden utilizar, según la materia divulgada en el presente documento, se incluyen, pero sin limitación a los mismos, compuestos de coordinación de platino, tales como cisplatino, carboplatino u oxaliplatino; compuestos de taxano, tales como paclitaxel o docetaxel; inhibidores de la topoisomerasa I, tales como compuestos de camptotecina, por ejemplo, irinotecán o topotecán; inhibidores de la topoisomerasa II, tales como derivados antitumorales de podofilotoxina, por ejemplo, etopósido o tenipósido; vinca alcaloides antitumorales, por ejemplo, vinblastina, vincristina o vinorelbina; derivados de nucleósidos antitumorales, por ejemplo, 5-fluorouracilo, gemcitabina o capecitabina; agentes alquilantes, tales como mostaza de nitrógeno o nitrosourea, por ejemplo, ciclofosfamida, clorambucil, carmustina o lomustina; derivados de antraciclina antitumorales, por ejemplo daunorrubicina, doxorrubicina, idarrubicina o mitoxantrona; anticuerpos HER2, por ejemplo, trastuzumab; antagonistas de receptores de estrógeno o moduladores de receptores de estrógeno selectivos, por ejemplo, tamoxifeno, toremifeno, droloxifeno, faslodex o raloxifeno; inhibidores de la aromatasa, tales como exemestano, anastrozol, letrazol y vorozol; agentes de diferenciación, tales como retinoides y agentes bloqueantes del metabolismo de ácido retinoico (RAMBA), por ejemplo, accutane; inhibidores de ADN metil transferasa, por ejemplo, azacitidina; inhibidores de quinasa, por ejemplo, flavoperidol, mesilato de imatinib o gefitinib; inhibidores de farnesiltransferasa; inhibidores de HDAC; otros inhibidores de la ruta ubiquitina-proteasoma, por ejemplo, VELCADE® (Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, MA); o YONDELIS® (Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ). En algunas realizaciones, el agente quimioterapéutico que es encapsulado por un exosoma, según la materia divulgada en el presente documento, se selecciona entre ácido retinoico, 5-fluorouracilo, vincristina, actinomicina D, adriamicina, cisplatino, docetaxel, doxorrubicina y taxol.
En otras realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, los agentes terapéuticos incluidos dentro de las composiciones de microvesículas comprenden moléculas de ácido nucleico seleccionadas entre un ARNpi, un microARN y un vector de expresión, tal como un vector de expresión de mamífero. La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma monocatenaria o bicatenaria. A menos que se limite específicamente, la expresión abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico particular abarca también de manera implícita variantes modificadas de manera conservativa de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada explícitamente. De manera específica, las sustituciones de codones degenerados se pueden conseguir mediante la generación de secuencias, en la que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida por residuos de base mixta y/o residuos de desoxiinosina (Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res 19: 5-081; Ohtsuka et al. (1985) J Biol Chem. 260: 2.605-2.608; Rossolini et al (1994) Mol Cell Probes 8: 91-98). Las expresiones "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" también se pueden utilizar de forma intercambiable con gen, marco de lectura abierto (ORF), ADNc, ARNm, ARNpi, microARN y similares.
Las expresiones "ARN pequeño de interferencia", "ARN de interferencia corto", "ARN de horquilla pequeño", "ARNpi" y "ARNh" se utilizan de forma intercambiable en el presente documento para referirse a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de mediar en la interferencia de ARN (ARNi) o el silenciamiento génico. Véanse, por ejemplo, Bass, Nature 411: 428-429, 2001; Elbashir et al., Nature 411: 494-498, 2001a; y las Patentes WO 00/44895, Wo 01/36646, WO 99/32619, WO 00/01846, WO 01/29058, WO 99/07409 y WO 00/44914. En una realización, el ARNpi puede comprender una molécula de polinucleótido de doble cadena que comprende regiones complementarias de sentido y antisentido, en el que la región antisentido comprende una secuencia complementaria a una región de una molécula de ácido nucleico diana. En otra realización, el ARNpi puede comprender un polinucleótido de una cadena que tiene regiones autocomplementarias de sentido y antisentido, en el que la región antisentido comprende una secuencia complementaria a una región de una molécula de ácido nucleico diana. En aún otra realización, el ARNpi puede comprender un polinucleótido de una cadena que tiene una o más estructuras de bucle y un tallo que comprende regiones autocomplementarias de sentido y antisentido, en el que la región antisentido comprende una secuencia complementaria a una región de una molécula de ácido nucleico diana, y en el que el polinucleótido se puede procesar in vivo o in vitro para generar un ARNpi activo capaz de mediar el ARNi. Tal como se utiliza en el presente documento, las moléculas de ARNpi no tienen por qué limitarse a aquellas moléculas que contienen sólo ARN, sino que abarcan, además, nucleótidos y no nucleótidos modificados químicamente.
Los microARN son ARN no codificantes, pequeños, de origen natural, que tienen de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 bases de nucleótidos (nt) de longitud en su forma biológicamente activa. Los ARNmi regulan después de la transcripción la expresión génica mediante la represión de la traducción del ARNm diana. Se cree que los ARNmi funcionan como reguladores negativos, es decir, mayores cantidades de un ARNmi específico se correlacionarán con niveles más bajos de expresión del gen diana. Hay tres formas de ARNmi existentes in vivo, ARNmi primarios (priARNmi), ARNmi prematuros (preARNmi) y ARNmi maduros. Los ARNmi primarios (priARNmi) se expresan como transcripciones estructuradas como tallo-bucle de aproximadamente unos pocos cientos de bases a más de 1 kb. Las transcripciones de priARNmi se escinden en el núcleo por una ARNasa II endonucleasa llamada Drosha que escinde ambas cadenas del tallo cerca de la base del bucle tallo. Drosha escinde el dúplex de ARN con cortes escalonados, dejando un 5’fosfato y saliente de 2 nt en el extremo 3'. El producto de escisión, el ARNmi prematuro (preARNmi) tiene de aproximadamente 60 a aproximadamente 110 nt de longitud con una estructura de horquilla formada en una forma de pliegue inverso. El preARNmi se transporta desde el núcleo al citoplasma por Ran-GTP y Exportin-5. Los preARNmi se procesan posteriormente en el citoplasma por otra ARNasa II endonucleasa llamada Dicer. Dicer reconoce el 5’ fosfato y el saliente 3', y escinde el bucle en la unión tallo-bucle para formar dúplex de ARNmi. El dúplex de ARNmi se une al complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), donde la cadena antisentido, de manera preferente, es degradada y el ARNmi maduro de cadena de sentido dirige el RISC a su sitio diana. Es el ARNmi maduro que es la forma biológicamente activa del ARNmi y tiene de aproximadamente 17 a aproximadamente 25 nt de longitud.
En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico que están encapsuladas o, en cualquier caso, se incorporan en una composición de microvesículas de la materia divulgada en el presente documento que se incluyen en las microvesículas son parte de un vector de expresión. La expresión "vector de expresión" se utiliza de forma intercambiable en el presente documento con las expresiones "casete de expresión" y "secuencia de control de expresión", y se utiliza para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula huésped apropiada, que comprende un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés que está unida operativamente a señales de terminación. También comprende habitualmente secuencias requeridas para la traducción apropiada de la secuencia de nucleótidos. La región codificante habitualmente codifica un polipéptido de interés, pero también puede codificar un ARN funcional de interés, por ejemplo, ARN antisentido o un ARN no traducido, en la dirección de sentido o antisentido, o un ARN no codificante (ARNnc), tal como un ARNnc pequeño o largo. El vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico, lo que significa que, como mínimo, uno de sus componentes es heterólogo con respecto, como mínimo, a uno de sus otros componentes. El vector de expresión también puede ser uno que sea de origen natural, pero se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. En algunas realizaciones, el vector de expresión es un vector de expresión de mamífero que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico particular de interés en una célula de mamífero.
Con respecto a la membrana plasmática que recubre las microvesículas derivadas de plantas comestibles, la frase "que recubre la microvesícula", y variaciones de la misma, se utiliza en el presente documento para referirse al recubrimiento, colocación y/o unión de una membrana plasmática a la bicapa lipídica de una microvesícula de ejemplo de la materia divulgada en el presente documento, o una parte de la misma. En algunas realizaciones, el recubrimiento de una microvesícula con una membrana plasmática derivada de una célula inflamatoria activada, tal como un leucocito, se consigue mediante la exposición inicial de una población de células inflamatorias a un compuesto de activación de células (por ejemplo, forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), un ionóforo de calcio, tal como ionomicina, o un inhibidor del transporte de proteínas) capaz de inducir la expresión de diversas citocinas, quimiocinas, y/o receptores de quimiocinas. Después de un período de incubación de las células inflamatorias con dicho compuesto de activación, las células inflamatorias se lisan, a continuación, y se homogeneizan, y las membranas plasmáticas se recogen mediante centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa. Después de recoger las membranas plasmáticas, las membranas se someten posteriormente a sonicación para formar vesículas. Dichas vesículas se pueden combinar, a continuación, con las microvesículas descritas en el presente documento (por ejemplo, microvesículas que encapsulan un agente terapéutico) y se coextruyen a través de una membrana para recubrir, de ese modo, las microvesículas con las membranas plasmáticas derivadas de las células inflamatorias. A este respecto, y sin desear estar ligado por ninguna teoría particular, se cree que, debido a la utilización de membranas plasmáticas derivadas de células inflamatorias activadas, las composiciones de microvesículas resultantes incluyen un recubrimiento de membrana plasmática que tiene uno o más receptores de quimiocina u otros restos de reconocimiento que son capaces de transportar o, en cualquier caso, dirigir las composiciones al sitio de tejido inflamado o enfermo.
En algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, se da a conocer una composición farmacéutica que comprende una composición de microvesículas derivadas de plantas comestibles descrita en el presente documento y un vehículo, portador, o excipiente farmacéutico. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es farmacéuticamente aceptable en seres humanos. Además, tal como se describe adicionalmente más adelante, en algunas realizaciones, la composición farmacéutica se puede formular como una composición terapéutica para el suministro a un individuo.
Una composición farmacéutica, tal como se describe en el presente documento, comprende, de manera preferente, una composición que incluye un portador farmacéutico, tal como soluciones de inyección estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos, antibióticos bactericidas y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con los fluidos corporales del receptor previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas, que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las composiciones farmacéuticas utilizadas pueden tomar formas, tales como suspensiones, soluciones o emulsiones, en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Adicionalmente, las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas y viales, y pueden almacenarse en un estado congelado o liofilizado o a temperatura ambiente (liofilizado) que requiere sólo la adición del portador líquido estéril inmediatamente antes de la utilización.
En algunas realizaciones, las formulaciones sólidas de las composiciones para administración oral pueden contener portadores o excipientes adecuados, tales como almidón de maíz, gelatina, lactosa, acacia, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, carbonato de calcio, cloruro de sodio o ácido algínico. Entre los disgregantes que se pueden utilizar se incluyen, pero sin limitación a los mismos, celulosa microcristalina, almidón de maíz, glicolato de almidón sódico y ácido algínico. Entre los aglutinantes de comprimido que se pueden utilizar se incluyen acacia, metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, polivinilpirrolidona, hidroxipropil metilcelulosa, sacarosa, almidón y etilcelulosa. Entre los lubricantes que se pueden utilizar se incluyen estearatos de magnesio, ácido esteárico, fluido de silicona, talco, ceras, aceites y sílice coloidal. Además, las formulaciones sólidas pueden estar sin recubrir o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retrasar la disgregación y la absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionar así una acción sostenida/extendida durante un período de tiempo más largo. Por ejemplo, se pueden utilizar monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo para proporcionar una formulación de liberación sostenida/prolongada. Un experto en la materia conoce numerosas técnicas para la formulación de preparaciones de liberación sostenida y se pueden utilizar, según la presente invención, incluyendo las técnicas descritas en las siguientes referencias: Patentes US 4,891,223; 6,004,582; 5,397,574; 5,419,917; 5,458,005; 5,458,887; 5,458,888; 5,472,708; 6,106,862; 6,103,263; 6,099,862; 6,099,859; 6,096,340; 6,077,541; 5,916,595; 5,837,379; 5,834,023; 5,885,616; 5,456,921; 5,603,956; 5,512,297; 5,399,362; 5,399,359; 5,399,358; 5,725,883; 5,773,025; 6,110,498; 5,952,004; 5,912,013; 5,897,876; 5,824,638; 5,464,633; 5,422,123; y 4,839,177 y WO 98/47491.
Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden tomar la forma, por ejemplo, de soluciones, jarabes o suspensiones, o se pueden presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de la utilización. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar mediante técnicas convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, aromatizantes, colorantes y edulcorantes, según sea apropiado. Las preparaciones para administración oral se pueden formular de manera adecuada para proporcionar una liberación controlada del compuesto activo. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de cápsulas, comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
Se pueden preparar también varias formulaciones líquidas y en polvo mediante procedimientos convencionales para la inhalación en los pulmones del individuo a tratar o para la administración intranasal en la nariz y las cavidades de los senos paranasales de un individuo a tratar. Por ejemplo, las composiciones se pueden suministrar de manera conveniente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con la utilización de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. Las cápsulas y cartuchos, por ejemplo, de gelatina para la utilización en un inhalador o insuflador, se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del compuesto deseado y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
Las composiciones también se pueden formular como una preparación para la implantación o inyección. De este modo, por ejemplo, las composiciones se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles (por ejemplo, como una sal poco soluble).
Las formulaciones inyectables de las composiciones pueden contener diversos portadores, tales como aceites vegetales, dimetilacetamida, dimetilformamida, lactato de etilo, carbonato de etilo, miristato de isopropilo, etanol, polioles (glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), y similares. Para las inyecciones intravenosas, se pueden administrar versiones solubles en agua de las composiciones mediante el procedimiento de goteo, mediante el cual, se infunde una formulación que incluye una composición farmacéutica de la materia divulgada en el presente documento y un excipiente fisiológicamente aceptable. Entre los excipientes fisiológicamente aceptables se pueden incluir, por ejemplo, dextrosa al 5 %, solución salina al 0,9 %, solución de Ringer u otros excipientes adecuados. Las preparaciones intramusculares, por ejemplo, una formulación estéril de una forma de sal soluble adecuada de los compuestos, se pueden disolver y administrar en un excipiente farmacéutico, tal como agua para inyección, solución salina al 0,9 % o solución de glucosa al 5 %. Una forma insoluble adecuada de la composición puede prepararse y administrarse como una suspensión en una base acuosa o una base oleosa farmacéuticamente aceptable, tal como un éster de un ácido graso de cadena larga (por ejemplo, oleato de etilo).
Además de las formulaciones descritas anteriormente, las composiciones de microvesículas de la materia divulgada en el presente documento también se pueden formular como composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Además, las composiciones exosomales también se pueden formular como una preparación de depósito mediante la combinación de las composiciones con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
En algunas realizaciones de la materia divulgada en el presente documento, se da a conocer, además, una composición, tal como se describe en el presente documento, para la utilización en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o un cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento de un trastorno inflamatorio comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una composición de microvesículas de la materia divulgada en el presente documento.
Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren a cualquier tratamiento de una afección de interés (por ejemplo, un trastorno inflamatorio o un cáncer), que incluyen, pero sin limitación a los mismos, tratamiento profiláctico y tratamiento terapéutico. Por tanto, los términos "tratamiento" o "tratar" incluyen, pero sin limitación a los mismos: prevenir una afección de interés o el desarrollo de una afección de interés; inhibir la progresión de una afección de interés; detener o prevenir el desarrollo posterior de una afección de interés; reducir la gravedad de una afección de interés; mejorar o aliviar los síntomas asociados con una afección de interés; y provocar una regresión de una afección de interés o de uno o más de los síntomas asociados con una afección de interés.
Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "trastorno inflamatorio" incluye enfermedades o trastornos que son causados, como mínimo, en parte, o exacerbados, por la inflamación, que, en general, se caracteriza por un aumento de flujo sanguíneo, edema, activación de células inmunitarias (por ejemplo, proliferación, producción de citocinas o incremento de la fagocitosis), calor, enrojecimiento, hinchazón, dolor y/o pérdida de función en el tejido u órgano afectados. La causa de la inflamación puede ser debido a daños físicos, sustancias químicas, microorganismos, necrosis de tejido, cáncer u otros agentes o condiciones.
Entre los trastornos inflamatorios se incluyen trastornos inflamatorios agudos, trastornos inflamatorios crónicos y trastornos inflamatorios recurrentes. Los trastornos inflamatorios agudos, en general, son de duración relativamente corta y tienen una duración de desde aproximadamente unos pocos minutos a aproximadamente uno o dos días, aunque pueden durar varias semanas. Entre las características de los trastornos inflamatorios agudos se incluyen el aumento del flujo sanguíneo, la exudación de fluido y proteínas plasmáticas (edema) y la emigración de leucocitos, tales como neutrófilos. Los trastornos inflamatorios crónicos, en general, son de duración más larga, por ejemplo, de semanas a meses a años o más, y se asocian histológicamente con la presencia de linfocitos y macrófagos y con la proliferación de vasos sanguíneos y tejido conectivo. Los trastornos inflamatorios recurrentes incluyen trastornos que se repiten después de un período de tiempo o que tienen episodios periódicos. Algunos trastornos inflamatorios se encuentran dentro de una o más categorías. Entre los trastornos inflamatorios de ejemplo se incluyen, pero sin limitación a los mismos: aterosclerosis; artritis; cánceres provocados por la inflamación; asma; uveítis autoinmune; respuesta inmunitaria adoptiva; dermatitis; esclerosis múltiple; complicaciones de la diabetes; osteoporosis; enfermedad de Alzheimer; malaria cerebral; fiebre hemorrágica; trastornos autoinmunes; y enfermedad inflamatoria intestinal. En algunas realizaciones, el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que comprende sepsis, choque séptico, colitis, cáncer de colon y artritis.
Para la administración de una composición terapéutica, tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, una microvesícula derivada de plantas comestibles que encapsula un agente terapéutico), se pueden llevar a cabo procedimientos convencionales de extrapolación de la dosificación humana basada en dosis administradas a un modelo animal murino utilizando el factor de conversión para la conversión de la dosificación en ratón a la dosificación humana: dosis humana por kg = dosis ratón por kg x 12 (Freireich, et al., (1966) Cáncer Chemother Rep. 50: 219-244). Las dosis también se pueden administrar en miligramos por metro cuadrado de área de superficie corporal porque este procedimiento, en lugar del peso corporal, logra una buena correlación con ciertas funciones metabólicas y excretoras. Además, el área de superficie corporal se puede utilizar como un denominador común para la dosificación de fármacos en adultos y niños, así como en especies animales diferentes, tal como se describe por Freireich, et al. (Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep. 50: 219-244). De manera resumida, para expresar una dosis en mg/kg en cualquier especie determinada como la dosis equivalente en mg/m2, multiplique la dosis por el factor km apropiado. En un humano adulto, 100 mg/kg es equivalente a 100 mg/kg x 37 kg/m2 = 3.700 mg/m2.
Entre los procedimientos adecuados para la administración de una composición terapéutica, según los procedimientos de la materia divulgada en el presente documento, se incluyen, pero sin limitación a los mismos, la administración sistémica, administración parenteral (que incluyen administración intravascular, intramuscular y/o intraarterial), suministro oral, suministro bucal, suministro rectal, administración subcutánea, administración intraperitoneal, inhalación, instilación intratraqueal, implantación quirúrgica, suministro transdérmico, inyección local, suministro intranasal e inyección/bombardeo a hipervelocidad. Cuando sea aplicable, la infusión continua puede mejorar la acumulación de fármaco en un sitio diana (véase, por ejemplo, la Patente US 6,180,082).
Independientemente de la vía de administración, las composiciones de la materia divulgada en el presente documento, se administran habitualmente en una cantidad eficaz para lograr la respuesta deseada. Por tanto, la expresión "cantidad eficaz" se utiliza en el presente documento para referirse a una cantidad de la composición terapéutica (por ejemplo, una microvesícula que encapsula un agente terapéutico y un vehículo, portador o excipiente farmacéutico) suficiente para producir una respuesta biológica medible (por ejemplo, una disminución en la inflamación). Los niveles de dosificación reales de los principios activos en una composición terapéutica de la presente invención pueden variarse a efectos de administrar una cantidad del compuesto o compuestos activos que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un individuo y/o aplicación particular. Naturalmente, la cantidad eficaz en cualquier caso particular dependerá de una variedad de factores, que incluyen la actividad de la composición terapéutica, la formulación, la vía de administración, la combinación con otros fármacos o tratamientos, la gravedad de la afección a tratar, y la condición física y el historial médico previo del individuo que está siendo tratado. De manera preferente, se administra una dosis mínima y la dosis se escala en ausencia de toxicidad limitante de la dosis a una cantidad mínimamente eficaz. La determinación y el ajuste de una dosis terapéuticamente eficaz, así como la evaluación de cuándo y cómo realizar tales ajustes, son conocidos por un experto en la materia.
Para una guía adicional con respecto a la formulación y la dosis, véanse las Patentes US 5,326,902; 5,234,933; Publicación Internacional PCT No. WO 93/25521; Berkow et al., (1997) The Merck Manual of Medical Information, Home ed. Merck Research Laboratories, Whitehouse Station, Nueva Jersey; Goodman et al., (1996) Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, 9a ed. McGraw-Hill Professions Division, Nueva York; Ebadi, (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology. CRC Press, Boca Raton, Florida; Katzung, (2001) Basic & Clinical Pharmacology, 8a ed. Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub. Division, Nueva York; Remington et al., (1975) Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed. Mack Pub. Co., Easton, Pennsylvania; y Speight et al, (1997) Avery's Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choice, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, 4a ed. Adis International, Auckland/Filadelfia; Duch et al., (1998) Toxicol. Lett. 100-101: 255-263.
En algunas realizaciones de los procedimientos terapéuticos dados a conocer en el presente documento, la administración de una composición de microvesículas derivadas de plantas comestibles de la materia divulgada en el presente documento reduce la cantidad de una citocina inflamatoria en un individuo. En algunas realizaciones, la citocina inflamatoria puede ser interleucina-1 p (IL-1P), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a), interferón-y (IFN-y) o interleucina-6 (IL-6).
Se pueden utilizar varios procedimientos conocidos por un experto en la materia para determinar la reducción en la cantidad de citocinas inflamatorias en un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la cantidad de expresión de una citocina inflamatoria en un individuo puede determinarse mediante el sondeo para ARNm del gen que codifica la citocina inflamatoria en una muestra biológica obtenida del individuo (por ejemplo, una muestra de tejido, una muestra de orina, una muestra de saliva, una muestra de sangre, una muestra de suero, una muestra de plasma o subfracciones de las mismas) utilizando cualquier ensayo de identificación de ARN conocido por un experto en la materia. De manera resumida, se puede extraer el ARN de la muestra, se amplifica, se convierte en ADNc, se marca y se deja hibridar con sondas de una secuencia conocida, tal como sondas de hibridación de ARN conocidas inmovilizadas sobre un sustrato, por ejemplo, una matriz o micromatriz, o se cuantifica mediante PCR en tiempo real (por ejemplo, PCR cuantitativa en tiempo real, tal como está disponible en Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Debido a que se conocen las sondas a las que se unen las moléculas de ácido nucleico de la muestra, se pueden identificar las moléculas en la muestra. A este respecto, las sondas de ADN para uno o más de los ARNm codificados por los genes inflamatorios se pueden inmovilizar sobre un sustrato y se proporcionan para la utilización en la práctica de un procedimiento, según la materia divulgada en el presente documento.
Con respecto adicionalmente a la determinación de los niveles de citocinas inflamatorias en las muestras, también se pueden utilizar espectrometría de masas y/o dispositivos y procedimientos de inmunoensayo para medir las citocinas inflamatorias en las muestras, aunque también se pueden utilizar otros procedimientos y son bien conocidos para un experto en la materia. Véanse, por ejemplo, las Patentes US 6,143,576; 6,113,855; 6,019,944; 5,985,579; 5,947,124; 5,939,272; 5,922,615; 5,885,527; 5,851,776; 5,824,799; 5,679,526; 5,525,524 y 5,480,792. Los dispositivos y procedimientos de inmunoensayo pueden utilizar moléculas marcadas en varios formatos de ensayo sándwich, competitivo o no competitivo, para generar una señal que está relacionada con la presencia o cantidad de un analito de interés. Además, se pueden utilizar ciertos procedimientos y dispositivos, tales como biosensores e inmunoensayos ópticos, para determinar la presencia o cantidad de analitos sin la necesidad de una molécula marcada. Véase, por ejemplo, las Patentes US 5,631,171 y 5,955,377.
Puede utilizarse cualquier inmunoensayo adecuado, por ejemplo, inmunoensayos ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos de unión competitiva y similares. La unión inmunológica específica del anticuerpo a la molécula inflamatoria se puede detectar directa o indirectamente. Entre los marcadores directos se incluyen etiquetas fluorescentes o luminiscentes, metales, colorantes, radionucleótidos y similares, unidos al anticuerpo. Entre los marcadores indirectos se incluyen diversas enzimas bien conocidas en la técnica, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y similares.
La utilización de anticuerpos inmovilizados o fragmentos de los mismos específicos para las moléculas inflamatorias también se contempla en la presente invención. Los anticuerpos pueden inmovilizarse sobre una variedad de soportes sólidos, tales como partículas magnéticas o partículas de matriz cromatográfica, la superficie de una placa de ensayo (tal como pocillos de microtitulación), piezas de un material de sustrato sólido (tal como plástico, nylon, papel) y similares. Se puede preparar una tira de ensayo mediante el recubrimiento del anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos en una matriz sobre un soporte sólido. A continuación, esta tira puede entonces sumergirse en la muestra biológica de ensayo y, a continuación, se procesa rápidamente a través de lavados y etapas de detección para generar una señal medible, tal como, por ejemplo, una mancha de color.
El análisis de espectrometría de masas (MS) se puede utilizar, ya sea solo o en combinación, con otros procedimientos (por ejemplo, inmunoensayos), para determinar la presencia y/o cantidad de una molécula inflamatoria en un individuo. Entre los análisis por MS de ejemplo que se pueden utilizar, según la presente invención, se incluyen, pero sin limitación a los mismos: espectrometría de masas-cromatografía líquida (LC-MS); análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser asistida por matriz (MALDI-TOF-Ms ), tal como por ejemplo, análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF “direct-spot” o MALDI-TOF con cromatografía líquida; espectrometría de masas con ionización por electrospray (ESI-MS), tal como, por ejemplo, ESI-MS con cromatografía líquida (LC); y análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo con desorción/ionización por láser mejorada en la superficie (SELDI-TOF-MS). Cada uno de estos tipos de análisis de espectrometría de masas se puede llevar a cabo utilizando espectrómetros disponibles en el mercado, tales como, por ejemplo, espectrómetros de masas de triple cuadrupolo. Los procedimientos para la utilización de análisis de espectrometría de masas para detectar la presencia y cantidad de péptidos, tales como citocinas inflamatorias, en muestras biológicas, son conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las Patentes US 6,925,389; 6,989,100 y 6,890,763.
Con respecto adicionalmente a los diversos procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento, aunque ciertas realizaciones de los procedimientos descritos en el presente documento sólo requieren una evaluación cualitativa (por ejemplo, la presencia o ausencia de la expresión de una citocina inflamatoria en un individuo), otras realizaciones de los procedimientos requieren una evaluación cuantitativa (por ejemplo, la cantidad de aumento en el nivel de una citocina inflamatoria en un individuo). Dichas evaluaciones cuantitativas se pueden realizar, por ejemplo, utilizando uno de los procedimientos mencionados anteriores, tal como entenderá un experto en la materia.
El experto en la materia también entenderá que la medición de una reducción en la cantidad de una determinada característica (por ejemplo, los niveles de citocinas) o una mejora en una determinada característica (por ejemplo, inflamación) en un individuo es un análisis estadístico. Por ejemplo, una reducción en una cantidad de citocinas inflamatorias en un individuo se puede comparar con el nivel de control de citocinas inflamatorias y una cantidad de citocinas inflamatorias menor o igual al nivel de control puede ser indicativa de una reducción en la cantidad de citosinas inflamatorias, tal como se evidencia por un nivel de significación estadística. La significación estadística a menudo se determina mediante la comparación de dos o más poblaciones, y la determinación de un intervalo de confianza y/o un valor de p. Véase, por ejemplo, Dowdy y Weardon, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nueva York, 1983. Los intervalos de confianza preferentes de la presente materia son del 90 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % y 99,99%, mientras que los valores de p preferentes son 0,1, 0,05, 0,025, 0,02, 0,01, 0,005, 0,001 y 0,0001.
En algunas realizaciones, se da a conocer, además, una composición, tal como se describe en el presente documento, para la utilización en el tratamiento de un cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento de un cáncer comprende administrar a un individuo en necesidad del mismo una cantidad eficaz de una composición de microvesículas derivadas de plantas comestibles de la materia divulgada en el presente documento (es decir, cuando una microvesícula recubierta con membrana plasmática encapsula un agente terapéutico). En algunas realizaciones, el agente terapéutico encapsulado dentro de la microvesícula recubierta con membrana plasmática y que se utiliza para tratar el cáncer se selecciona entre un agente fitoquímico y un agente quimioterapéutico, ya que se ha encontrado que dichos agentes son particularmente útiles en el tratamiento del cáncer. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a todos los tipos de cáncer o neoplasma o tumores malignos encontrados en animales, incluyendo leucemias, carcinomas, melanoma y sarcomas.
Por "leucemia" se entiende enfermedades malignas ampliamente progresivas de los órganos que forman la sangre y se caracteriza, en general, por una proliferación y desarrollo distorsionados de los leucocitos y sus precursores en la sangre y la médula ósea. Entre las enfermedades de leucemia se incluyen, por ejemplo, leucemia no linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia granulocítica aguda, leucemia granulocítica crónica, leucemia promielocítica aguda, leucemia de células T en adulto, leucemia aleucémica, una leucemia leucocitémica, leucemia basofílica, leucemia de células básticas, leucemia bovina, leucemia mielocítica crónica, leucemia cutis, leucemia embrionaria, leucemia eosinofílica, leucemia de Gross, leucemia de células pilosas, leucemia hemoblástica, leucemia hemocitoblástica, leucemia histiocítica, leucemia de células madre, leucemia monocítica aguda, leucemia leucopénica, leucemia linfática, leucemia linfoblástica, leucemia linfocítica, leucemia linfógena, leucemia linfoide, leucemia de células de linfosarcoma, leucemia de mastocitos, leucemia megacariocítica, leucemia micromieloblástica, leucemia monocítica, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica, leucemia granulocítica mieloide, leucemia mielomonocítica, leucemia Naegeli, leucemia de células plasmáticas, leucemia plasmacítica, leucemia promielocítica, leucemia de células Rieder, leucemia de Schilling, leucemia de células madre, leucemia subleucémica y leucemia de células no diferenciadas.
El término "carcinoma" se refiere a un nuevo crecimiento maligno compuesto de células epiteliales que tienden a infiltrarse en los tejidos circundantes y dan lugar a metástasis. Entre los ejemplos de carcinomas se incluyen, por ejemplo, carcinoma acinar, carcinoma acinoso, carcinoma adenoquístico, carcinoma adenoide quístico, carcinoma adenomatoso, carcinoma de la corteza suprarrenal, carcinoma alveolar, carcinoma de células alveolares, carcinoma de células basales, carcinoma basocelular, carcinoma basaloide, carcinoma de células basoescamosas, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquiolar, carcinoma broncogénico, carcinoma cerebriforme, carcinoma colangiocelular, carcinoma coriónico, carcinoma coloide, carcinoma comedo, carcinoma corpus, carcinoma cribiforme, carcinoma en coraza, carcinoma cutáneo, carcinoma cilíndrico, carcinoma de células cilíndricas, carcinoma de los conductos, carcinoma duro, carcinoma embrionario, carcinoma encefaloide, carcinoma epienoide, carcinoma epitelial adenoides, carcinoma exofítico, carcinoma ex ulcere, carcinoma fibroso, carcinoma gelatiniforme, carcinoma gelatinoso, carcinoma de células gigantes, carcinoma gigantocelular, carcinoma glandular, carcinoma de células de la granulosa, carcinoma de matriz pilosa, carcinoma hematoide, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células de Hurthle, carcinoma hialino, carcinoma hipemefroide, carcinoma embrionario infantil, carcinoma in situ, carcinoma intraepidérmico, carcinoma intraepitelial, carcinoma de Krompecher, carcinoma de células Kulchitzky, carcinoma de células grandes, carcinoma lenticular, carcinoma lenticulare, carcinoma lipomatoso, carcinoma linfoepitelial, carcinoma medular, carcinoma medular, carcinoma melanótico, carcinoma molle, carcinoma mucinoso, carcinoma muciparum, carcinoma mucocelular, carcinoma mucoepidermoide, carcinoma mucoso, carcinoma de la mucosa, carcinoma mixomatodos, carcinoma nasofaríngeo, carcinoma de células de avena, carcinoma osificante, carcinoma osteoide, carcinoma papilar, carcinoma periportal, carcinoma preinvasivo, carcinoma de células espinosas, carcinoma pultaceo, carcinoma de células renales de riñón, carcinoma de células de reserva, carcinoma sarcomatodes, carcinoma de Schneider, carcinoma escirroso, carcinoma de escroto, carcinoma de células en anillo con sello, carcinoma simplex, carcinoma de células pequeñas, carcinoma solanoide, carcinoma de células esferoidales, carcinoma de células fusiformes, carcinoma esponjoso, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, carcinoma de cadena, carcinoma telangiectásico, carcinoma telangiectodes, carcinoma de células de transición, carcinoma tuberosum, carcinoma tuberoso, carcinoma verrugoso y carcinoma villosum.
El término "sarcoma" se refiere, en general, a un tumor que se compone de una sustancia similar al tejido conectivo embrionario y, en general, se compone de células estrechamente empaquetadas embebidas en una sustancia fibrilar u homogénea. Entre los sarcomas se incluyen, por ejemplo, condrosarcoma, fibrosarcoma, linfosarcoma, melanosarcoma, mixosarcoma, osteosarcoma, sarcoma de Abemethy, sarcoma adiposo, liposarcoma, sarcoma alveolar de parte blanda, sarcoma ameloblástico, sarcoma botrioide, sarcoma cloroma, carcinoma corio, sarcoma embrionario, sarcoma de tumor de Wilns, sarcoma endometrial, sarcoma del estroma, sarcoma de Ewing, sarcoma fascial, sarcoma fibroblástico, sarcoma de células gigantes, sarcoma granulocítico, sarcoma de Hodgkin, sarcoma hemorrágico pigmentado múltiple idiopático, sarcoma inmunoblástico de células B, linfoma, sarcoma inmunoblástico de células T, sarcoma de Jensen, sarcoma de Kaposi, sarcoma de células de Kupffer, angiosarcoma, leukosarcoma, sarcoma mesenquimoma maligno, sarcoma parosteal, sarcoma reticulocítico, sarcoma de Rous, sarcoma seroquístico, sarcoma sinovial y sarcoma telangiectáltico.
El término "melanoma" se entiende que significa un tumor que surge del sistema melanocítico de la piel y otros órganos. Entre los melanomas se incluyen, por ejemplo, melanoma acral-lentiginoso, melanoma amelanótico, melanoma juvenil benigno, melanoma de Cloudman, melanoma S91, melanoma de Harding-Passey, melanona juvenil, melanoma léntigo maligno, melanoma maligno, melanoma nodular, melanoma subungueal y melanoma de extensión superficial.
Entre los cánceres adicionales se incluyen, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores de pulmón de células pequeñas, tumores cerebrales primarios, cáncer de estómago, cáncer de colon, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, lesiones premalignas de la piel, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer cervical, cáncer endometrial y cáncer cortical adrenal. En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que comprende cáncer de piel, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer cerebral y cáncer de pulmón.
Tal como se utiliza en el presente documento, el término "individuo" incluye individuos humanos y animales. De este modo, se dan a conocer utilizaciones terapéuticas veterinarias, según la materia divulgada en el presente documento. Por lo tanto, la materia divulgada en el presente documento da a conocer el tratamiento de mamíferos, tales como seres humanos, así como aquellos mamíferos de importancia debido a que están en peligro de extinción, tales como los tigres de Siberia; de importancia económica, tales como animales criados en granjas para el consumo por los seres humanos; y/o animales de importancia social para los seres humanos, tales como animales mantenidos como mascotas o en zoológicos. Entre los ejemplos de dichos animales se incluyen, pero sin limitación a los mismos: carnívoros, tales como gatos y perros; porcinos, que incluyen cerdos, puercos y jabalíes; rumiantes y/o ungulados, tales como vacas, bueyes, ovejas, jirafas, ciervos, cabras, bisontes y camellos; y caballos. También se da a conocer el tratamiento de aves, que incluye el tratamiento de aquellos tipos de aves que están en peligro de extinción y/o son mantenidas en zoológicos, así como aves de corral y, más particularmente aves de corral domesticadas, es decir, aves de granja, tales como pavos, pollos, patos, gansos, pintadas, y similares, ya que son también de importancia económica para los humanos. Por lo tanto, también se da a conocer el tratamiento de ganado, que incluye, pero sin limitación a los mismos, cerdos domesticados, rumiantes, ungulados, caballos (incluyendo caballos de carreras), aves de granja y similares.
La práctica de la materia divulgada en el presente documento puede utilizar, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante, e inmunología, que están dentro de la capacidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Molecular Cloning A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Ed. por Sambrook, Fritsch y Maniatis, editores, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulos 16 y 17; Patente US 4,683,195; DNA Cloning, Volúmenes I y II, Glover, ed., 1985; Oligonucleotide Synthesis, M.J. Gait, ed., 1984; Nucleic Acid Hybridization, D. Hames y S.J. Higgins, editores, 1984; Transcription and Translation, B.D. Hames y S.J. Higgins, editores, 1984; Culture of Animal Cells, R.I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; véase Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., Nueva York); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.H. Miller y M. P. Calos, editores, Cold Spring Harbor Laboratory, 1987; Methods in Enzymology, volúmenes 154 y 155, Wu et al., editores, Academic Press Inc., NY; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer y Walker, editores, Academic Press, Londres, 1987;. Handbook of Experimental Immunology, volúmenes I-IV, DM Weir y CC Blackwell, editores, 1986. La materia divulgada en el presente documento se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos, pero no limitantes.
EJEMPLOS
La inflamación es una característica distintiva de numerosas enfermedades. Las células inmunitarias activadas son intrínsecamente capaces de dirigirse a los sitios inflamatorios. Utilizando tres modelos de ratón de enfermedad provocada por la inflamación, los siguientes estudios demostraron que se han mejorado nanovectores derivados de pomelo (GNV) recubiertos con membranas de leucocitos activados enriquecidas con receptor de quimiocinas inflamatorias (IGNV) para el transporte a tejidos inflamatorios. El bloqueo de CXCR1 y CXCR2 en los IGNV inhibió significativamente el transporte de IGNV al tejido inflamatorio. El potencial terapéutico de IGNV se demostró adicionalmente mediante la mejora del efecto quimioterapéutico, tal como se muestra mediante la inhibición del crecimiento tumoral en dos modelos de tumores y la inhibición de los efectos inflamatorios de colitis de ratón inducida por DSS. El hecho de que los IGNV sean capaces de dirigirse al tejido inflamatorio y que existe una sobreexpresión de quimiocinas en el tejido humano enfermo proporciona una base para la utilización de IGNV para el suministro más dirigido de agentes terapéuticos a sitios inflamatorios y la utilización de IGNV como medicina personalizada para el tratamiento de enfermedades inflamatorias relacionadas.
Materiales y procedimientos
Ratones. Los ratones C57BL/6J, ratones BALB/c y ratones C.129S2(B6)-Cxcr2tm1Mwm/J de 6-8 semanas de edad se obtuvieron de Jackson Laboratories. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Utilización de Animales de la Universidad de Louisville.
Cultivo celular. Las células EL4 de linfoma T de ratón, 4T1 de ratón, líneas celulares de cáncer de mama 4TO7, células epiteliales de glándula mamaria NMuMG de ratón, cáncer de colon CT26 y células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) se adquirieron de ATCC. Las células CT26 se cultivaron en medio RPMI 1640; las células EL4, 4T1 y 4TO7 se mantuvieron en medio DMEM complementado con FBS al 10 % inactivado por calor. Las HUVEC se cultivaron en medio de crecimiento completo de células endoteliales (ECGM; Promocell #C-22010). Las células NMuMG se cultivaron en medio DMEM completo complementado con insulina 10 pg/ml. Todas las células se mantuvieron en una incubadora humidificada con CO2 a 37 °C.
Reactivos y anticuerpos. La doxorrubicina, la curcumina, el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), lipopolisacárido (LPS, Escherichia coli 0111: B4), PKH67, PKH26 y kits de enlazadores de células fluorescentes se adquirieron de Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Estados Unidos). DOX-NP® (300102S) comercial y sus liposomas de control se adquirieron de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama, Estados Unidos). Los comprimidos de cóctel de inhibidores de proteinasa se obtuvieron de Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Alemania). El colorante DiR se obtuvo de Life Technologies (NY, Estados Unidos). El sulfato de sodio dextrano (DSS, PM: 36.000-50.000) se obtuvo de MP Biomedicals, LLC (Santa Ana, CA). Los reactivos líquidos estables ALT (GPT) y AST (GOT) de Infinitiy® se adquirieron de Thermo Scientific (Pittsburgh, PA, Estados Unidos). El sistema de detección de luminiscencia ATP se obtuvo de PerkinElmer (Waltham, MA, Estados Unidos). Las quimiocinas de ratón recombinantes CXCL1, CXCL2, CXCL9, CXCL10, CXCL11, Cc L2 y CCL5 se adquirieron de Biolegend (San Diego, CA, Estados Unidos). Los anticuerpos conjugados fluorescentes contra CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR2, CXCR3, CXCR7 de ratón o humano, anticuerpos contra CD3, F4/80, CD11b, CD11c, CD19, Ly6G y Gr1 de ratón se adquirieron de eBiosicence (San Diego, CA, Estados Unidos). Los anticuerpos contra CXCL1, CXCL10, CCL2 y CCL5 humano se obtuvieron de LifeSpan BioSciences, Inc. (Seattle, WA, Estados Unidos). Los anticuerpos contra CXCL1, CXCL10, CCL2 y CCL5 de ratón y los kits ELISA con CCL5, CXCL10 se adquirieron de Biolegend (San Diego, CA, Estados Unidos). Los anticuerpos secundarios conjugados a Alexa Fluor 488 nm y 647 nm se obtuvieron de Life Technologies (NY, Estados Unidos). El kit ELISA con CCL2 humana se adquirió de eBiosicence.
Aislamiento y purificación de membranas plasmáticas. Las membranas plasmáticas se aislaron y purificaron utilizando un procedimiento, tal como se ha descrito anteriormente. De manera resumida, se cultivaron células EL4 de la línea celular de linfoma de ratón con/sin estimulación con PMA (100 ng/ml) durante 12 horas. Las células (2 x 108), a continuación, se recogieron y se centrifugaron a 500 x g durante 10 minutos a 4 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 ml de tampón de homogeneización a una concentración final de Tris HCl 10 mM, D-sacarosa 25 mM, MgCl2 1 mM, KCl 1 mM, ARNasa 10 pg/ml, ADNasa 10 pg/ml y 1 x cóctel de inhibidores de proteinasa. La suspensión de células se homogeneizó en hielo mediante 100 pases utilizando un homogeneizador Dounce de mano. El sobrenadante se recogió después de la centrifugación a 500 xg durante 10 minutos. Para una purificación adicional, los sobrenadantes recogidos se sometieron a una centrifugación en gradiente de densidad discontinuo de sacarosa a 28.000 g durante 45 minutos a 4 °C en una solución de sacarosa al 30 %, 40 % y 55 % en una solución salina al 0,9 %. Para el aislamiento de la membrana plasmática a partir de leucocitos de ratones o de sangre periférica humana, se recogió sangre periférica tratada con anticoagulante y se centrifugó a 3.000 xg durante 10 minutos a 4 °C. Los leucocitos se recogieron y los glóbulos rojos se lisaron mediante incubación con tampón de lisis ACK (NH4Cl 8,024 g/l, KHCO31 g/l, EDTA-2Na 3,722 mg/l) durante 5 minutos a 22 °C. El procedimiento para la lisis de los glóbulos rojos se repitió una vez. A continuación, los leucocitos se cultivaron en medio RPMI 1640 con LPS (100 ng/ml) durante 12 horas antes de aislar y purificar las membranas plasmáticas de leucocitos de ratones o humano con/sin la estimulación con LPS utilizando un procedimiento de centrifugación en gradiente de densidad discontinuo de sacarosa, tal como se ha descrito anteriormente.
Preparación de vesículas derivadas de membrana plasmática. Las membranas plasmáticas purificadas a partir de células EL4 y leucocitos de sangre periférica de ratones o humana se trataron con ultrasonidos en un vial de vidrio con 200 pl de ddH2O durante 10 minutos utilizando un baño de ultrasonidos FS30D (Fisher Scientific). Las vesículas resultantes se extruyeron posteriormente a través de membranas porosas de policarbonato de 100 nm utilizando una miniextrusora Avanti (Avanti Polar Lipids).
Preparación de GNV recubiertos con membrana plasmática. Se prepararon nanopartículas derivadas de lípidos de pomelo (GNV) según el protocolo descrito anteriormente. Para preparar los GNV recubiertos con membrana plasmática, se mezclaron 400 nmol de GNV con vesículas derivadas de membrana plasmática (de aproximadamente 5 x 105 células) y se extruyeron 20 veces a través de una membrana porosa de policarbonato de 200 nm utilizando una miniextrusora Avanti. Los GNV recubiertos con membranas plasmáticas derivadas de EL4 o de leucocitos de ratón o humano se denominaron, a continuación, GNV pseudoinflamatorios (IGNV).
Cuantificación del fósforo. Se cuantificó el fosfato en GNV utilizando una solución de fósforo estándar (0,65 mM, P3869-25 ml de Sigma). En primer lugar, se prepararon diferentes cantidades de soluciones estándar de fosfato (50, 25, 10, 5 y 0 nmol) en 100 pl de ddH2O, a continuación, se añadieron 30 pl de Mg(NO3)2 y la mezcla se calentó a la llama hasta sequedad. La muestra seca se disolvió en 300 pl de HCl y se calentó a 100 °C durante 15 minutos, se enfrió y se centrifugó a 1.000 rpm durante 2 minutos. Se añadieron 700 pl de tampón de reacción (1 parte de ácido ascórbico al 10 % y 6 partes de molibdato de amonio al 0,42 % en H2SO41 N) y la mezcla se incubó a 45 °C durante 20 minutos. La absorción se leyó a DO280.
Concentración micelar crítica (cmc) de GNV. La concentración micelar crítica (CMC) se define aproximadamente como la concentración de monómero lipídico en la que cantidades apreciables de agregados micelares comienzan primero a aparecer en equilibrio. Dado que los GNV no son monómeros y están compuestos de un conjunto de lípidos extraídos de nanopartículas de pomelo, fue difícil determinar la CMC para cada uno de los lípidos derivados de nanopartículas de pomelo que contribuyen a la formación de los GNV. Por lo tanto, a diferencia del enfoque habitual utilizado para la determinación de la CMC, se tomó un enfoque alternativo para determinar la concentración de lípidos totales de GNV por encima de la cual se forman los GNV. De manera resumida, los lípidos totales extraídos de nanopartículas de pomelo se determinaron utilizando el ensayo de fosfato, tal como se ha descrito anteriormente. Se pipetearon diferentes volúmenes de lípidos totales (0-100 p.l, 200 uM en solución madre) en cloroformo en tubos de vidrio, y se extrajo el disolvente bajo una corriente de nitrógeno, y las películas lipídicas se mantuvieron posteriormente en condiciones de vacío durante 2 horas. Las películas lipídicas secas se hidrataron a 60 °C durante 30 minutos en tampón HEPES 20 mM (pH 7.0). Después de un baño de ultrasonidos (baño de ultrasonidos FS60, Fisher Scientific, Pittsburg, PA) durante 5 minutos, se añadió un volumen igual de tampón HEPES (pH 7.0) y se sometió a ultrasonidos durante otros 5 minutos.
Análisis de la distribución de tamaños y del potencial Zeta. Se analizaron la distribución de tamaños y el potencial zeta de las partículas mediante un nano Zs Zetasizer (Malvern Instruments Ltd., Southborough, MA). Para la medición del tamaño, se diluyeron muestras de partículas en PBS y se dispersaron mediante tratamiento con ultrasonidos durante 5 segundos antes de la medición. Para determinar el potencial Zeta de las partículas, se lavaron GNV o GNV recubiertos con una membrana plasmática en ddH2O mediante centrifugación a 100.000 xg durante 45 minutos a 4 °C. Se volvieron a suspender las muestras en 1 ml de ddH2O para medir el potencial zeta de las partículas.
Análisis FACS de los receptores de quimiocinas, integrinas en células EL4 e IGNV. Para probar la expresión de receptores de quimiocinas e integrinas, se lavaron las células EL4 recogidas y se bloquearon con bloqueante Fc (2.4G2) a 4 °C durante 15 minutos y, a continuación, se tiñeron con anticuerpos contra CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, Cc R9, CXCR2, CXCR3, CXCR7, a4b7 y LFA-1 marcados con PE a 4 °C durante 45 minutos. Los receptores de quimiocinas y LFA-1 en los IGNV se analizaron de manera cuantitativa utilizando un procedimiento FACS, tal como se ha descrito anteriormente. De manera resumida, los GNV o IGNV se incubaron con perlas de látex con aldehído/sulfato de 4 mm de diámetro en 400 ml de PBS que contenía FCS al 2 % durante 30 minutos y, a continuación, las mezclas se lavaron y posteriormente se tiñeron con anticuerpos contra CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR2, CXCR3, CXCR7 y LFA-1 marcados con PE a 4 °C durante 45 minutos. Dado que no se detectó a4p7 en las células EL4; no se analizaron los niveles de a4p7 en los IGNV. Todas las muestras se analizaron utilizando un citómetro de flujo Accuri C6.
Detección de quimiocinas en tejidos de la piel y tumorales. Se detectaron quimiocinas en tejido normal de la piel, piel inflamatoria inducida por LPS y los tejidos tumorales CT26 y 4T1 utilizando matrices de anticuerpos Proteoma ProfilerTM (R&D System, Minneapolis, Mn , Estados Unidos) según el protocolo del fabricante. De manera resumida, se extirparon los tejidos y se homogeneizaron en PBS con 1x inhibidores de proteasa y una concentración final del 1 % de Triton X-100. Las muestras se congelaron a -80 °C. Después de la descongelación, el sobrenadante de las muestras se recogió mediante centrifugación a 10.000 xg durante 5 minutos a 4 °C y la proteína total se cuantificó utilizando un NanoDrop 8000. Después de bloqueo durante 1 hora, las membranas se incubaron con una mezcla de cóctel de anticuerpos de detección del panel A de un grupo de citocinas reconstituido y el sobrenadante durante una noche a 4 °C. Después de lavar tres veces, las membranas se incubaron con estreptavidina-HRP durante 30 minutos a 22 °C. A continuación, después de lavar tres veces más, las membranas se incubaron con 1 ml de mezcla Chemi Regent durante 1 -2 minutos a 22 °C antes de exponerse a una película de rayos X durante 1 -5 minutos.
Obtención de imágenes de los GNV (IGNV) recubiertos con membrana plasmática. Los IGNV purificados se prepararon para microscopía electrónica utilizando un procedimiento convencional y se observaron utilizando un microscopio electrónico F20 FEI Tecnai funcionando a 200 kV con un aumento de 38.000 x y un desenfoque de 2,5 pm. Los GNV preparados frescos también se fijaron y se obtuvieron imágenes como control. Se tomaron microfotografías con una cámara Gatan Ultrascan 4000 CCD.
Para confirmar adicionalmente la colocalización de la membrana plasmática derivada de células EL4 con GNV, se mezclaron vesículas derivadas de membrana marcadas con PKH67 con GNV marcados con PKH26 y, a continuación, se extruyeron 15-20 veces a través de una membrana porosa de policarbonato de 200 nm utilizando una miniextrusora Avanti. Después de lavarse a 100.000 xg durante 30 minutos, las partículas se volvieron a suspender y se incubaron con células 4T1 durante 12 horas en una incubadora con CO2 al 5 %. A continuación, las células se lavaron 3 veces con PBS, se fijaron con PFA al 2 % durante 10 minutos a 22 °C y se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % durante 2 minutos a 22 °C. Después de lavarse 3 veces, las células se tiñeron con DAPI durante 90 segundos. La colocalización de la membrana plasmática derivada de células EL4 con GNV se examinó utilizando un microscopio confocal equipado con un sistema de análisis de imágenes digitales (Pixera, San Diego, CA, Estados Unidos).
Análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Se ha utilizado el sistema DiO/DPA para la detección de cambios del potencial de membrana citoplasmática utilizando el principio de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Este enfoque fue adaptado en los presentes estudios mediante el emparejamiento del colorante trazador común DiO (como donante fluorescente) con dipicrilamina (DPA), un anión lipófilo de bajo peso molecular, como aceptor no fluorescente. Como donante, DiO es un marcador de membrana no tóxico, brillante, que permite la formación de imágenes repetidas de GNV marcados fluorescentes. Sin embargo, si DiO está próximo a la membrana plasmática de células T activadas marcada con colorante DPA, lo cual permite la detención de la fluorescencia, el resultado es una señal no fluorescente detectada. Para probar si los IGNV están recubiertos con membrana plasmática de células T activadas, se prepararon GNV marcados con DiO (5 mM) y vesículas derivadas de membranas plasmáticas de células EL4 marcadas con DPA (5 mM) mediante sonicación utilizando un procedimiento, tal como se ha descrito anteriormente. La extrusión de GNV con vesículas de membranas derivadas de EL4 se llevó a cabo mediante extrusión 20 veces a través de una membrana porosa de policarbonato de 20 nm utilizando una miniextrusora Avanti. La mezcla de GNV marcados con DiO (5 mM) y vesículas derivadas de membranas de células EL4 marcadas con DPA (5 mM) sin extrusión se utilizó como control. Ambas muestras se diluyeron, a continuación, (1:5, 1:10, 1:20, 1:50, 1:100 y 1:150) con ddH2O y se midió la intensidad de fluorescencia del colorante DiO mediante un lector de placas fluorescente (lectores en modo múltiple Biotek HTS). La señal fluorescente no extinguida, expresada como el % de la intensidad de fluorescencia, se determinó de la siguiente manera: [(intensidad de fluorescencia de la muestra diluida - intensidad de fluorescencia de la muestra sin diluir)/intensidad de fluorescencia de la muestra diluida] x 100 %. Los resultados representan la media de tres experimentos independientes (barras de error, errores estándar de las medias).
Ensayo transpocillo. Se sembraron células HUVEC en insertos de transpocillos (“Transwell”) Costar (diámetro de 6,5 mm y tamaño de poro de 5 mm, Corning, Corning Incorporated, NY, Estados Unidos) recubiertos con fibronectina (7,5 mg/cm2) a una densidad celular de 5x104 células/pocillo. Se colocaron quimiocinas en la cámara inferior. Se añadieron GNV marcados con PKH26, IGNV, quimiocinas o IGNV preincubados con anticuerpo contra LFA-1 en la cámara superior y se incubaron con células HUVEC a 37 °C durante 24 y 48 horas. Después de la incubación, se recogió y se diluyó el medio de la cámara inferior. La intensidad de fluorescencia de g Nv o IGNV marcados con PKH26 se midió mediante un lector de placas fluorescentes (lectores en modo múltiple Biotek HTS). La intensidad de fluorescencia de GNV o IGNV marcados con PKH26, expresada como el % de eficacia en transpocillo de la intensidad de fluorescencia de GNV o IGNV marcados con PKH26, se determinó de la siguiente manera: (intensidad de fluorescencia de PKH26 del pocillo inferior en el momento en que las muestras se recogieron/intensidad de fluorescencia de PKH26 total de GNV o IGNV marcados con PKH26 añadidos al pocillo superior de la cámara al principio del cultivo) x 100 %. Se recogió el medio de la cámara inferior y se centrifugó. A continuación, las partículas se volvieron a suspender en ddH2O, se esparcieron sobre un portaobjetos y se tiñeron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). El número de partículas asociadas con células HUVEC en la cámara inferior se estimó contando 10 campos seleccionados al azar (aumento x20) utilizando el software ImageJ. Ninguna de las muestras examinadas fue positiva para la tinción con DAPI.
Tinción con hematoxilina y eosina (H&E) e inmunohistoquímica (IHC). Hígados, pulmones, bazos, riñones de ratones BALB/c tratados con PBS o IGNV (200 nmol y 800 nmol, inyección I.V. tres veces) y tejidos de colon de ratones alimentados con DSS se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4 % y se embebieron en parafina; a continuación, se tiñeron secciones de 5 pm de tejidos con H&E.
Se recogieron tejidos de cáncer de mama y tejidos de cáncer de colon humanos en e1Hospital de First People de Huai'an de China. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento escrito. La utilización de tejidos humanos en este estudio fue aprobada por el comité de revisión institucional del Hospital de First People de Huai'an de China y se llevó a cabo de conformidad con las directrices internacionales para la utilización de tejidos humanos. Secciones de tejido (5 pm) de cáncer de mama, cáncer de colon y adyacentes embebidos en parafina se rehidrataron y se calentaron en una solución de recuperación de antígenos durante 45 minutos. La actividad de peroxidasa endógena se inhibió mediante la incubación con peróxido de hidrógeno al 3 % durante 10 minutos a 22 °C y los sitios no específicos se bloquearon con BSA al 5 % durante 45 minutos. Los tejidos seccionados sobre portaobjetos se incubaron, a continuación, con anticuerpos primarios [(anticuerpo policlonal contra CXCL1 (0,15 pg/ml), anticuerpo policlonal contra CXCL10 (1 pg/ml), anticuerpo contra CCL2 (1 pg/ml) y CCL5 (5 pg/ml)] durante una noche a 4°C. Las secciones se procesaron con un anticuerpo secundario biotinilado apropiado y un kit de amplificación de estreptavidina biotina peroxidasa (Vectastain, Vector Laboratories, Burlingame, cA). La reacción de la peroxidasa finalmente se reveló con diaminobencidina (Dako) y las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Mayer. Los portaobjetos se contratiñeron con una solución de hematoxilina de Mayer débil durante 2 minutos. Los portaobjetos de control negativo se prepararon sin adición de anticuerpo primario. El grado de expresión de quimiocinas se registró independientemente por dos observadores expertos como el porcentaje de células positivas para quimiocina basado en una evaluación visual de la intensidad de producto de reacción marrón dentro de las regiones citoplásmicas de cada imagen en una escala de 0 (sin tinción) a 3+ (tinción intensa). Para cuantificar la intensidad de la tinción, se calculó, a continuación, una puntuación promedio sumando las puntuaciones individuales del nivel de intensidad.
Imagen in vivo. Para evaluar la estabilidad de IGNV circulantes en ratones, se inyectaron 200 nmol de IGNV marcados con colorante DiR en ratones a través de la vena de la cola. Se extrajo sangre en un tubo con anticoagulante en varios puntos de tiempo (3 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas y 120 horas) después de la inyección. La intensidad de las señales de DiR de muestras de sangre de igual volumen se midió, a continuación, utilizando una Kodak Image Station (4000MM Pro system, Carestream, Woodbridge, CT) y se cuantificó utilizando el software Carestream MI.
Para realizar el seguimiento de los IGNV en inflamación aguda de la piel inducida por LPS de ratones, se inyectaron I.V. IGNV marcados con colorantes DiR (20, 40, 150, 300 nmol) en ratones. A las 6 horas y 24 horas después de la inyección, se obtuvieron imágenes de ratones vivos utilizando una Kodak Image Station. A continuación, se extrajo la piel inflamada 24 horas después de la administración de IGNV y se cuantificaron las señales de colorante DiR en la piel.
Para estudiar la administración dirigida de IGNV en ratones con colitis inducida por DSS, se inyectaron I.V. IGNV o GNV marcados con colorante DiR (200 nmol) en ratones normales o ratones con colitis a los que se había proporcionado DSS al 2,5 % en su agua de bebida durante 5 días. 24 horas después de una única inyección I.V., se recogieron los cólones y se rastrearon utilizando una Kodak Image Station y se cuantificaron utilizando el software del vendedor.
Para la biodistribución de IGNV en ratones portadores de tumores, ratones portadores de tumor de colon de ratón (CT26) y tumor de mama de ratón (4T1) fueron administrados I.V. con IGNV (200 nmol) o GNV (200 nmol) marcados con colorante DiR. La formación de imágenes de todo el cuerpo se realizó a las 6 horas y 24 horas después de la inyección. Las señales de colorante DiR en tejidos tumorales CT26 y 4T1 también se midieron cuantitativamente 24 horas después de la inyección.
Para determinar los efectos de las quimiocinas en el transporte de IGNV, se preincubaron con extracto de tejido 200 nmol de IGNV marcados con colorante DiR, o 100 ng de cada una de las quimiocinas recombinantes, es decir, CXCL1, CXCL2, CXCL9, CXCL10, CCL2, CCL5 o combinaciones de CXCL1/2, CXCL9/10, CCL2/5 o CXCL1/2/9/10 plus CCL2/5 durante una noche a 4 °C. A continuación, los IGNV se lavaron a 100.000 g durante 20 minutos a 4 °C, se volvieron a suspender en 100 p.l de PBS y se inyectaron en ratones con inflamación aguda de la piel inducida por LPS o ratones portadores de tumores CT26. 24 horas después de la inyección, se extrajeron la piel o los tumores y las señales de colorante DiR se midieron de manera cuantitativa utilizando una Kodak Image Station y se cuantificaron utilizando el software del vendedor.
Ensayos de citocinas. Para evaluar la toxicidad potencial de IGNV y liposomas comerciales, se inyectaron I.V. 200 nmol y 800 nmol de IGNV o liposomas comerciales como controles en ratones BALB/c diariamente durante 3 días.
24 horas después de la última inyección, se recogió sangre periférica y se midieron las citocinas (TNF-a, IL-6 e IL-1P) utilizando kits de ELISA.
Para determinar el efecto de la curcumina suministrada por IGNV en la inhibición de la inducción de TNF-a, IL-6 e IL-1p, se cultivaron ex vivo tejidos de colon de ratones con colitis inducida por DSS y se cuantificaron TNF-a, IL-6 e IL-1 p. Los tejidos de colon de ratones con colitis inducida por DSS a los que se habían inyectado previamente I.V. PBS, GNV (200 nmol), IGNV (200 nmol), curcumina (50 mg/kg), GNV-Cur (50 mg/kg) o IGNV-Cur (50 mg/kg) cada 2 días 5 veces se recogieron para el cultivo ex vivo. De manera resumida, se lavó el más distal 2 cm del colon con PBS que contenía penicilina/estreptomicina y, a continuación, se cortó adicionalmente en secciones de 1 cm2. Las secciones de colon se cultivaron en medio RPMI 1640 sin suero complementado con penicilina/estreptomicina. Después de 24 horas de cultivo, los sobrenadantes libres de células se recogieron y se analizó la secreción de citocinas utilizando kits de ELISA (eBioscience).
Para medir las quimiocinas humanos liberados en sobrenadantes de cultivo de células de cáncer de colon humano SW620, se cultivaron 2 x 105 células/pocillo en placas de 6 pocillos. Después de 48 horas en cultivo, se recogió el medio y se analizaron CCL2, CCL5 y CXCL10 utilizando el equipo “deluxe” ELISA MAX®de Biolegend.
Inducción de la inflamación local de la piel. Se indujo inflamación dérmica de ratones C57BL/6j (peso corporal = 25 a 30 g) mediante una única inyección intradérmica en la región de flanco de 30 pg de LPS (Escherichia coli 0111 :B4) en 50 pl de solución salina isotónica. 6 horas después de la inyección, los ratones con una respuesta inflamatoria local de la piel visible fueron reclutados para este estudio.
Modelo de colitis inducida por DSS. Se indujo colitis utilizando dextrano sulfato de sodio al 2,5 % (p/v) que se había añadido al agua de beber. La solución de DSS se preparó fresca cada dos días. Para evaluar los efectos terapéuticos de la curcumina suministrada mediante Ig Nv en colitis, comenzando en el día 3 después de que los ratones fueron provistos con DSS al 2,5 % en su agua de beber, los ratones fueron inyectados I.V. con PBS, GNV libres (200 nmol), IGNV (200 nmol), curcumina libre (50 mg/kg), GNV cargados con curcumina (50 mg/kg) o IGNV cargados con curcumina (50 mg/kg) cada 2 días durante un total de 5 inyecciones. El peso corporal y la presencia de sangre en las heces se controlaron diariamente.
Medición de la concentración de curcumina en los tejidos de colon de ratones. Ratones con colitis inducida por DSS fueron inyectados I.V. con PBS, GNV, IGNV, curcumina libre, GNV-Cur o IGNV-Cur cada 2 días, la curcumina en tejidos de colon se analizó de manera cuantitativa utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), tal como se ha descrito previamente. De manera resumida, se recogieron tejidos de colon 6 horas después de la última inyección, se pesaron y se colocaron en 1 ml de PBS y se homogeneizaron. Se añadieron cincuenta pl de solución tampón de citrato a 0,8 ml de alícuotas de las muestras homogeneizadas y se agitaron con vórtex durante 30 segundos, seguido de la adición de 2 ml de acetato de etilo. Los sobrenadantes se recogieron, a continuación, después de centrifugación a 1.000 xg durante 5 minutos y se secaron bajo una corriente de gas nitrógeno. Las muestras sólidas obtenidas se volvieron a disolver en 100 pl de metanol y se centrifugaron a 10.000 x g durante 10 minutos. Se utilizaron veinte pl de sobrenadante para el análisis de HPLC. La curcumina se detectó mediante HPLC de fase inversa con un detector DAD (Agilent 1100, Estados Unidos) a un caudal de 1 ml/min. El sistema disolvente fue (A) ddH2O y (B) acetonitrilo que contenía TFA al 0,1 %. Se utilizaron los siguientes gradientes de fase móvil B para desarrollar la columna: 10-50 % durante 0-18 minutos, 50-90 % durante 18-25 minutos, 90 % durante 25-30 minutos y 90-10 % durante 30-35 minutos.
Modelos de ratones con tumores CT26 y 4T1. Se utilizaron modelos de crecimiento tumoral de xenoinjerto para demostrar el suministro dirigido mediado por IGNV de fármacos de quimioterapia a tumores frente a doxorrubicina libre (DOX libre) o GNVDOX. En la primera serie de experimentos, se inyectaron subcutáneamente ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad con la línea celular CT26 de cáncer de colon murino (5,0 x 105 células/ratón en 50 pl de PBS). En un segundo conjunto de experimentos, se inyectaron ratones BALB/c hembra de seis semanas de edad en una almohadilla de grasa mamaria con la línea celular 4T1 de tumor de mama murino (5,0 x 105 células/ratón en 50 pl de PBS). Cuando los tumores alcanzaron aproximadamente 60 mm3 en volumen, los ratones fueron asignados al azar a diferentes grupos de tratamiento y fueron inyectados I.V. con GNV libres, IGNV, doxorrubicina (DOX, 100 pg), GNV cargados con DOX (GNV-DOX, 100 pg DOX) o IGNV cargados con DOX (IGNV-DOX, 100 pg DOX). Los ratones se trataron cada 3 días durante 30 días. El crecimiento de los tumores se midió utilizando un procedimiento, tal como se ha descrito anteriormente.
Eficacia de carga. Para evaluar la eficacia de carga de doxorrubicina y curcumina en IGNV, se prepararon partículas de GNV-DOX o GNV-Cur mediante la adición de 200 pg de doxorrubicina o curcumina en una película de lípidos de pomelo y posteriormente se sometieron a ultrasonidos utilizando un procedimiento, tal como se ha descrito anteriormente. Para fabricar posteriormente IGNV-DOX o IGNV-Cur, las partículas de GNV-DOX o GNV-Cur formadas mediante ultrasonidos, tal como se ha descrito anteriormente, se mezclaron con vesículas derivadas de membrana plasmática de células EL4 y, a continuación, se extruyeron 15-20 veces a través de una miniextrusora Avanti con una membrana porosa de policarbonato de 200 nm. La suspensión resultante se centrifugó a 100.000 x g durante 30 minutos. Los sobrenadantes se recogieron y se midió el contenido de doxorrubicina o curcumina residual utilizando un espectrofotómetro UV-Visible CARY 100 Bio a una longitud de onda de 497 y 426 nm, respectivamente. La eficacia de carga se calculó de la siguiente manera: Eficacia de carga = (fármaco total -fármaco libre)/fármaco total x 100 %.
Perfil de liberación de fármacos de quimioterapia. Para probar el perfil in vitro de la doxorrubicina liberada de IGNV-DOX o DOX-NP® adquirido de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama, Estados Unidos), se suspendieron IGNV-DOX o DOX-NP® con 200 pg de doxorrubicina en 1 ml de solución tampón de PBS a diferentes valores de pH de 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.2. Cada suspensión se colocó a 37 °C con agitación. En un momento predeterminado (0,5, 1, 2, 3, 6 y 24 horas), las suspensiones se centrifugaron a 100.000 x g durante 30 minutos. La cantidad de doxorrubicina liberada de IGNVDOX o DOX-NP® se midió espectrofotométricamente a 497 nm. La liberación de curcumina de IGNV-Cur también se analizó utilizando un conjunto de espectrofotómetros UV-Visible a 426 nm.
Ensayo ATPlite. Para probar la citotoxicidad potencial de los IGNV y los liposomas de control comerciales DOX-NP®, se cultivaron células 4T1 en placas de cultivo de 24 pocillos durante 24 horas con diferentes dosis (0, 10, 20, 40, 80, 160 nmol) de IGNV o liposomas de control de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama, Estados Unidos). La citotoxicidad celular de los IGNV se midió utilizando un sistema de ensayo de detección de luminiscencia ATP (PerkinElmer, MA, Estados Unidos). De manera resumida, se añadieron 200 pl de tampón de lisis celular de mamífero en cada pocillo y la placa se agitó durante 5 minutos. Se dispensaron 50 pl de lisis celular en una OptiPlate, se mezclaron con 50 pl de solución de sustrato, la placa se agitó a 700 rpm durante 5 minutos y se midió la luminiscencia utilizando un lector de microplacas con multidetección BioTek Synergy® HT con el software de análisis de datos Gen 5 versión 1.08 (Winooski, VT, Estados Unidos).
Análisis estadístico. Se utilizó un análisis de varianza de una cola (ANOVA) seguido por pruebas de Turkey Post Hoc para determinar las diferencias que tenían lugar entre los grupos y se utilizó la prueba T para determinar la diferencia entre dos grupos (*p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0,001).
Ejemplo 1 - Caracterización de GNV recubiertos con fracción de membrana de células T activadas enriquecida en receptor de quimiocinas inflamatorias (IGNV).
Se generaron IGNV mediante la unión de membranas derivadas de células T EL4 activadas con PMA a GNV. Se analizó la morfología de IGNV (figura 6A) y la cantidad de receptores de quimiocinas (figura 6B) de células T EL4 estimuladas con/sin PMA en los IGNV. Se prepararon vesículas de la banda media purificada de un gradiente de sacarosa (figura 7) mediante extrusión y posteriormente se unieron con GNV. A continuación, se analizaron el potencial Zeta y la distribución de tamaño de IGNV (figura 1B). La obtención de imágenes por microscopía electrónica de transmisión (TEM) (figura 1C) indicó que los IGNV compartían una morfología similar con GNV. Los IGNV fueron internalizados por las células de cáncer de colon CT26 de una manera similar a los GNV (figura 1D) y se colocalizaron con la membrana de EL4 (figura 1D, última columna). El análisis de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) confirmó adicionalmente que más del 83 ± 2,2 % de los GNV estaban recubiertos con la membrana plasmática de las células T EL4 activadas (IGNV) (figura 1E). Después de la preparación y a lo largo de cinco días a 22 °C (figura 9A) o 25 horas a 37 °C (figura 9B), los IGNV eran estables sin cambios significativos en el tamaño o carga.
Ejemplo 2 - Migración dirigida de IGNV a sitios inflamatorios.
A continuación, para determinar si los IGNV dejarían la circulación periférica y se dirigirían a tejidos inflamatorios, se probaron tres modelos inflamatorios de ratón. Se buscó primero para determinar si los IGNV transmigraban a través de una monocapa de HUVEC con una mayor eficacia que los GNV mediante la utilización de un ensayo de transpocillos in vitro. Los datos demostraron que un mayor número de HUVEC transfectadas con IGNV (DAPI+PKH26+) migraban a la parte inferior del transpocillo (panel derecho) que los GNV (panel izquierdo) durante un período de 48 horas (figura 2A). La adición de quimiocinas (CXCL1/2/9/10, CCL2/5) en la parte inferior del transpocillo mejoró adicionalmente la eficacia de transmigración de IGNV (figura 2A, panel derecho, 4a columna, **p<0,01). La migración dirigida mejorada de IGNV a sitios inflamatorios en comparación con GNV se confirmó adicionalmente en diferentes modelos inflamatorios, dos modelos de inflamación aguda (una inflamación de la piel inducida por LPS (figura 2B) y la colitis inducida por DSS (figura 2C, **p<0,01)) y dos modelos de cáncer de inflamación crónica (cáncer de colon CT26 (figura 2D, ***p<0,001) y cáncer de mama 4T1 (figura 2E, ***p<0,001)).
Ejemplo 3 - La quimiocina y los receptores de quimiocinas desempeñan un papel en la migración dirigida de IGNV.
El reclutamiento de leucocitos en el tejido inflamado sigue una cascada bien definida de sucesos, comenzando con la captura de leucocitos que fluyen libremente a la pared del vaso, seguido de enrollamiento, adhesión a células endoteliales, fortalecimiento después de la adhesión, arrastre y, finalmente, transmigración a través de uniones endoteliales en los sitios de inflamación. Durante estas etapas, las quimiocinas/receptores de quimiocinas desempeñan un papel clave en la última etapa, la transmigración. Por lo tanto, se analizaron los perfiles de quimiocinas de los extractos de tejidos inflamatorios y los tipos de receptores de quimiocinas que recubren los IGNV. Los datos de grupos de quimiocinas (figura 3A) indicaron que las quimiocinas identificadas están en concentraciones mucho más elevadas en los extractos de los modelos de inflamación que se probaron que los extractos de glándula mamaria no tumoral (figura 3A, normal). También se observó, en general, que se detectaron señales de quimiocinas más fuertes en los extractos de tumor de mama 4T1 que de la piel de inflamación de la piel inducida por LPS o de tumor de colon CT26. Los datos del análisis FACS indicaron que se detectaron los correspondientes receptores de quimiocinas en los IGNV (figura 3B). Para determinar qué quimiocina o quimiocinas en los tejidos inflamatorios desempeñan un papel causal en el reclutamiento de IGNV en el tejido inflamatorio, se realizó un ensayo de transpocillos in vitro. Los resultados indicaron que la transmigración de IGNV estaba notablemente afectada por la adición de quimiocinas en la parte inferior de los transpocillos; mientras que no hubo ningún cambio en la migración de GNV con la adición de quimiocinas. La adición de CXCL1 o CXCL2 dio lugar a más IGNV detectados en la parte inferior del pocillo 48 horas después de la adición y la combinación de quimiocinas, CXCL1/2/9/10, CCL2/5, condujo a la mayor eficacia en la transmigración de IGNV (figura 10). Los efectos de las quimiocinas en la transmigración de Ig Nv se confirmaron, a continuación, mediante los resultados generados a partir de un ensayo de neutralización de quimiocinas. Aunque la preincubación con quimiocina recombinante contra cada receptor de quimiocina atenuó parcialmente la migración de IGNV, la neutralización de los seis receptores de quimiocinas que se indican o la preincubación con extracto de tumor 4T1 condujo a una reducción máxima de la transmigración de IGNV (figura 3C, *p<0,05 **p<0,01 y ***p<0,001). Esta reducción también se confirmó en un modelo de inflamación de la piel inducida por LPS en ratones, en el que los ratones fueron inyectados I.V. con IGNV marcados con colorante DiR que habían sido preincubados con extracto de tumor 4T1 (figura 3D, **p<0,01).
Los datos generados a partir de un análisis de imágenes in vivo de 24 horas (la evolución con el tiempo se determinó en base a los datos de la figura 3D) confirmaron adicionalmente que aunque CXCL1, CCL2 y CCL5 tienen un efecto, CXCL2 juega un papel clave en la migración dirigida de IGNV a los sitios inflamatorios, incluyendo inflamación aguda en la piel inducida por LPS (figura 3F, *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001) y el modelo de cáncer de colon CT26 (figura 3G, *p<0,05, **p<0,01 y *“ p<0,001).
Las integrinas, incluyendo LFA-1 y a4p7, tienen múltiples funciones en el proceso de reclutamiento de leucocitos desde la adhesión adhiera inicial a las paredes de los vasos hasta el arrastre antes de la etapa final, la transmigración. Los datos de FACS indicaron que aunque no se detectó a4p7, LFA-1 se expresó de forma elevada en células EL4 activadas con PMA (figura 11) y estaba presente en los Ig Nv (figura 12). La transmigración de los IGNV se redujo drásticamente in vitro (figura 3H, ***p<0,001) e in vivo (figura 3I, *p<0,05) cuando se neutralizó LFA-1 en los IGNV. Dado que múltiples factores, incluyendo LFA-1, desempeñan un papel en el proceso de migración dirigida de leucocitos y nanopartículas a los sitios inflamatorios, y se conoce que las quimiocinas/receptores de quimiocinas desempeñan papeles importantes en la última etapa (transmigración) del transporte de leucocitos al tejido inflamatorio, en general, se utilizaron ensayos relacionados con quimiocinas como un determinante principal de la función sin análisis adicional del papel de LFA-1 en IGNV.
Se determinó, además, si las quimiocinas de interés eran reguladas por incremento en tejidos de cáncer humano. Los resultados de tinción inmunohistoquímica de quimiocinas en cáncer de colon humano (tabla 1) y cáncer de mama (tabla 2) sugirieron una expresión mucho más elevada de CXCL1, CXCL10, CCL2 y CCL5 en tejidos tumorales que en los tejidos no tumorales adyacentes (figura 3E, tablas 3, 4).
Tabla 1. Características de 20 pacientes con cáncer de colon
Figure imgf000023_0001
Sexo
macho 13
hembra 7
Edad
macho 59,85±3,027
hembra 56,88±4,129
Diferenciación
buena/moderada 14
mala 6
Implicación de nódulos linfáticos
sí 14
no 6
Tabla 2. Características de 21 pacientes con cáncer de mama
1 Características
Figure imgf000023_0002
\
Casos
Edad 54,81 ±2,126
Implicación de nódulos linfáticos
sí 9
no 12
Tabla 3. Puntuaciones IHC de quimiocinas (CXCL1, CXCL10, CCL2 y CCL5) en tejidos de cáncer de colon humano.
Quimiocinas
Figure imgf000023_0004
Niveles de expresión
Figure imgf000023_0003
CXCL1 + ++
Adyacente 8
Tejido tumoral 2 6 12
CXCL10
Figure imgf000023_0005
Tejido tumoral 12 8
Tabla 4. Calificaciones IHC de quimiocinas (CXCL1, CXCL10, CCL2 y CCL5) en tejidos de cáncer de mama humano
Quimiocinas
Figure imgf000023_0007
Niveles de expresión
Figure imgf000023_0006
CXCL1 + ++
Adyacente 8
Tejido tumoral 3 6 12
CXCL10
Adyacente 18 3
Tejido tumoral 2 10 9
CCL2
Adyacente 13 8
Tejido tumoral 5 16
CCL5
Adyacente 18 3
Tejido tumoral 8 12
Para demostrar adicionalmente si el enfoque descrito anteriormente se podría aplicar para el tratamiento de pacientes de una manera personalizada, se purificaron GNV recubiertos con la membrana de leucocitos estimulados con LPS aislados de la sangre periférica de individuos humanos sanos (figura 13A) o de ratones (figura 13B) utilizando un gradiente de sacarosa. Los receptores de quimiocinas en los IGNV se analizaron de manera cuantitativa (figuras 4A-4B). A continuación, se determinó si los IGNV eran capaces de migrar de forma dirigida a un tumor humano utilizando el modelo de tumor SW620 de colon humano, ya que las quimiocinas de interés se sobreexpresan en el cáncer de colon humano, así como en el tejido de tumor de mama, y también se liberan de las células de cáncer de colon SW620 (figura 14). Los resultados de los análisis de obtención de imágenes in vivo indicaron que los ratones portadores de tumor SW620 humano (figura 4C, **p<0,01) o ratones expuestos localmente con LPS (figura 4D, *p<0,05 y ***p<0,001) atrajeron más IGNV que GNV, y los IGNV recubiertos con membranas purificadas de leucocitos estimulados con LPS tienen la intensidad de fluorescencia más elevada en el día 5 después de inyección I.V. Los resultados de un ensayo de transpocillos in vitro (figura 3C) provocaron una determinación adicional de si CXCR2 juega un papel dominante en la migración dirigida de IGNV al sitio inflamatorio. Los resultados generados a partir del análisis de la obtención de imágenes in vivo indicaron que los IGNV recubiertos con la membrana de leucocitos estimulados con LPS aislados de la sangre periférica de ratones knockout de CXCR2 habían atenuado significativamente la migración de IGNV al sitio inflamatorio (figura 4E), lo que sugiere que CXCR2 en IGNV desempeña un papel clave en la migración dirigida de IGNV.
Ejemplo 4 - Efectos terapéuticos in vivo de los fármacos transportados por IGNV.
Dado que no se han observado efectos secundarios adversos con una inyección I.V. de IGNV (figuras 15A-15F), se probó si los IGNV se pueden utilizar como un vehículo de suministro de fármaco terapéutico. Los IGNV son capaces de cargarse con diferentes fármacos, que incluyen fármacos para quimioterapia, tales como doxorrubicina, y agentes antiinflamatorios, tales como la curcumina (figura 16A). Ambos IGNV cargados con doxorrubicina y curcumina tienen un potencial Zeta y una distribución de tamaño similares (figura 16B, 16C), aunque la capacidad de carga (figura 16D) y la liberación de un agente (figura 16E) es diferente para diferentes tipos de agentes. Un análisis adicional de la estabilidad de los IGNV indicó que los IGNV circulantes fueron estables y detectables hasta el día 5 (figura 5A) después de una inyección I.V., que a su vez proporciona un periodo de tiempo más largo para que los IGNV migren de forma dirigida a donde se está produciendo la inflamación. Además, IGNV-DOX fueron estables sin liberar doxorrubicina hasta que estuvieron en un pH de 5.5 (figura 5B, **p<0,01) que es el pH en el tejido tumoral. En cambio, un pH tan bajo como 5.0 no dio lugar a la liberación de la doxorrubicina desde los liposomas disponibles en el mercado cargados con doxorrubicina (figura 17A), aunque no se observaron diferencias en la citotoxicidad celular (figura 17B), la inducción in vivo de citocinas proinflamatorias (figura 17C) y la liberación de enzimas hepáticas (figura 17D) entre IGNV (figura 14) y liposomas de control. A continuación, se determinó la distribución tisular de la doxorrubicina encapsulada en IGNV. La concentración de doxorrubicina fue mayor en el tumor y menor en el hígado de ratones portadores de tumor inyectados I.V. con IGNV-DOX cuando se comparó con ratones tratados con DOX-NP® (figura 5C, *p<0,05). Este resultado se confirmó adicionalmente mediante la intensidad mucho más fuerte de las señales de doxorrubicina detectadas en ratones portadores del tumor CT26, así como ratones portadores del tumor de mama 4T1 inyectados I.V con IGNV-DOX en comparación con los ratones tratados con GNV-DOX o doxorrubicina libre (figura 5D). La inyección de GNV-DOX mezclado con vesículas de membrana derivada de células EL4 presentó niveles significativamente más bajos de doxorrubicina detectada en el tumor 4T1 que en IGNV-DOX (figura 18), lo que sugiere que la extrusión de GNV con las membranas de leucocitos activados, que conduce a la formación de IGNV, es necesaria para un suministro con mayor eficacia de DOX a los sitios inflamatorios. Los efectos biológicos de IGNV-DOX en los modelos de tumor de colon CT26 y de mama 4T1 también fueron significativos en comparación con los otros tratamientos. El tratamiento con IGNV-DOX condujo a una inhibición significativa en el crecimiento del tumor CT26 y el tumor 4T1 (figura 5E, *p<0,05, **p<0,01 y ***p<0,001) y amplió la supervivencia de ratones portadores de tumor (figura 5F, *p<0,05, **p<0,01). Los resultados del tratamiento con IGNV-Cur de ratones con colitis inducida por DSS indicaron que los IGNV que contenían curcumina tenían un mejor efecto terapéutico sobre la inhibición de la colitis que los GNV que contenían curcumina o la curcumina sola. Esta conclusión está apoyada por el hecho de que había menos sangre en las heces (figura 19A), se observaron menos leucocitos infiltrando tejido de colon de ratón teñido con HE (figura 19B), hubo menos pérdida de peso (figura 19C) y hubo una tasa de supervivencia significativamente mejorada (figura 19D) en ratones con colitis inducida por dSS inyectados I.V. con IGNV-Cur que los grupos de control indicados. Estos resultados también fueron consistentes con una mayor concentración de curcumina detectada en los tejidos de colon de ratones tratados con IGNV-Cur (figura 19E). El análisis ELISA indicó, además, que se detectaron significativamente menos TNF-a, IL-6 y IL-1P en los extractos de tejido de colon de ratones con colitis inducida por DSS inyectados I.V. con IGNV-Cur que con PBS/DSS, Cur libre o GNV-Cur (figura 20).
Discusión de los Ejemplos 1 - 4.
El estudio anterior describe un enfoque para el suministro dirigido de agentes terapéuticos a sitios inflamatorios en los que se reconocen las células apropiadas; promoviendo de este modo muchos más beneficios terapéuticos sustanciales sin inducir efectos secundarios adversos. Se demostró que los IGNV pueden ser un enfoque eficaz, personalizado, para tratar potencialmente pacientes con una variedad de afecciones inflamatorias. La utilización de IGNV evita varios de los problemas que han surgido con vectores de terapia convencionales, tales como la falta de especificidad en el reconocimiento del tejido, la inmunogenicidad, la dificultad en la escalabilidad y la producción, la necesidad de un seguimiento toda la vida de la tumorigénesis y otros resultados clínicos adversos. Dado que los IGNV no causan estos problemas, tienen un gran potencial como vehículos de suministro dirigidos, en particular, porque la producción de GNV se escala fácilmente y los GNV pueden recubrirse con membranas de leucocitos de un individuo, haciendo que este enfoque sea personalizado y económicamente viable para el tratamiento de pacientes en países con ingresos bajos y medios que no cuentan con instalaciones completas para fabricar vectores terapéuticos sintéticos.
Para reconocer con éxito un tejido específico, deben cumplirse, como mínimo, cuatro objetivos: 1) circulación extendida del vector de suministro, 2) penetración del tejido por el vector, 3) especificidad del tejido y 4) liberación de la carga útil, es decir, el agente terapéutico. Los tejidos tumorales tienen una dinámica de transporte molecular y de fluidos anormal, en especial para fármacos macromoleculares. Este fenómeno se conoce como "permeabilidad y efecto de retención (EPR) mejorados" de macromoléculas y lípidos en tumores sólidos. Por lo tanto, cuanto más largo es el vector en la circulación, mayor es la oportunidad que tiene para penetrar el tejido tumoral mediante la utilización del efecto EPR. Trabajos publicados anteriormente muestran que un nanovector compuesto de lípidos de nanopartículas de pomelo circula en la sangre periférica más de 5 días en ratones portadores de tumor. Los GNV son estables en el sistema circulatorio y, de este modo, tienen una mayor oportunidad para entrar en el tejido tumoral. Además, la concentración crítica de lípidos derivados de nanopartículas de pomelo para la formación de GNV fue de 1,5 |jMI (figura 21) y los GNV no aumentan de tamaño con concentraciones crecientes de lípidos totales de hasta 5 mM. El diámetro de los GNV a una concentración de 25 mM-50 mM y a 25 °C aumenta hasta 200 nm, y se mantiene en 200 nm, mientras que la concentración de lípidos aumentó adicionalmente hasta 100 mM. Se creía que este hallazgo no sólo proporciona una guía para la selección de concentraciones de lípidos derivados de nanopartículas de pomelo para fabricar GNV de tamaño deseado (50 - 200 nm), sino también se puede seleccionar un amplio intervalo de concentraciones de lípidos derivados de nanopartículas de pomelo para la fabricación de GNV sin conducir a un aumento adicional del tamaño de GNV. Esta última característica tiene una ventaja en caso de que se necesite una gran cantidad de lípidos derivados de nanopartículas de pomelo para fabricar el GNV, lo que permite mayores concentraciones de agentes terapéuticos para ser encapsulados por el GNV. Sin embargo, esta característica de los GNV por sí sola puede no ser suficiente para suministrar un agente amplio al tejido diana para tener un efecto terapéutico. Conseguir un suministro específico y seguro de un fármaco a través de las células endoteliales es esencial si se trata de alcanzar el tejido diana. Sin embargo, debido al hecho de que la mayoría de los vectores de suministro carecen de una afinidad por el endotelio, sólo una pequeña fracción de los agentes terapéuticos pueden suministrarse al tejido diana mediante la utilización del efecto EPR. En el estudio anterior, los IGNV fueron modificados para que pudieran aprovechar la vía de los leucocitos activados que está impulsada principalmente por las quimiocinas/receptores de quimiocinas mediante el recubrimiento de los IGNV con las membranas de leucocitos activados. Esta modificación de los IGNV mejoró de forma significativa su capacidad de transmigración en células endoteliales, de manera que los IGNV podían entrar en los tejidos inflamatorios. Tal como se demostró en este estudio, esta estrategia no sólo puede aplicarse al cáncer de mama y al cáncer de colon, sino que existe la posibilidad de que los IGNV puedan ser utilizados para tratar muchos tipos diferentes de enfermedades, ya que el proceso inflamatorio es una característica de muchas enfermedades crónicas, que incluyen cáncer, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes. Tal como se muestra en este estudio, el fármaco de quimioterapia doxorrubicina y el agente antiinflamatorio curcumina pueden ser suministrados con éxito por los IGNV para alcanzar el sitio inflamatorio deseado y lograr un efecto terapéutico mediante la modificación de los GNV con membranas de leucocitos activados de individuos. De manera específica, se demostró que la inyección I.V. de IGNV-DOX o IGNV-Cur mejora de manera significativa la inhibición del crecimiento del tumor de mama y el tumor de colon, y atenúa la colitis inducida por DSS, respectivamente. Esta respuesta fue debida al reclutamiento mejorado de IGNV en el tumor, así como el tejido de colon inflamado. Se requirió que las membranas de leucocitos activados obtuvieran esta ventaja, ya que permite el suministro de IGNV en el lugar preciso donde se está produciendo la inflamación.
Se pensó también que otros factores, además de las quimiocinas/receptores de quimiocinas, pueden desempeñar un papel en el transporte de los IGNV a un sitio inflamatorio. Estudios previos han sugerido que la LFA-1 desempeña un papel en el transporte de nanopartículas a un sitio inflamado. Los presentes estudios utilizaron LFA-1 (CD11a-CD18) como un ejemplo y los datos anteriores también mostraron que CXCR2 y LFA-1 desempeñaron un papel en la transmigración de los IGNV, tal como se demostró en un ensayo in vitro de bloqueo transpocillo y un modelo de ratón inflamatorio de la piel in vivo. Por lo tanto, el papel de los receptores de quimiocinas IGNV, tal como se demuestra en este estudio, no excluye un conjunto de otros factores de IGNV, tales como CXCR2 y LFA-1, que también desempeñan un papel en el proceso de reclutamiento de IGNV en el tejido inflamado. Esto también es una razón por la que se creía que los IGNV recubiertos con membranas de leucocitos totales pueden tener un mayor potencial para ser aplicados en la medicina personalizada para el suministro dirigido a los sitios inflamatorios que la utilización de los IGNV recubiertos de receptores de quimiocinas individuales. Fue concebible, además, que los perfiles de quimiocinas e integrinas asociados a la membrana de células inflamatorias circulantes de pacientes con enfermedades inflamatorias crónicas diferentes pueden ser diferentes en su composición. Además, los GNV recubiertos de receptores de quimiocinas individuales pueden ser potencialmente difíciles de optimizar en combinaciones o como un conjunto o grupo personalizado de receptores de quimiocinas que son más adecuados para el suministro dirigido a un paciente individual. Además, puede haber un mayor coste para la producción de receptores de quimiocinas recombinantes y la producción recombinante requeriría la aprobación de la FDA para la utilización clínica. Por último, podrían surgir posibles problemas de bioseguridad debido a la utilización de receptores de quimiocinas recombinantes sintetizados.
Un vehículo de suministro adecuado debe ser susceptible a la manipulación, de manera que el fármaco terapéutico suministrado puede ser liberado en el tejido diana. La evidencia acumulada en las últimas décadas ha demostrado que el pH en un tumor humano evaluado con electrodo es, en promedio, menor que el pH de los tejidos normales. Los resultados presentados en el estudio anterior muestran que la doxorrubicina encapsulada en los IGNV es estable hasta que el pH cae a 6.0 o por debajo. Esta característica de los IGNV permite que el fármaco encapsulado se libere selectivamente en el tejido tumoral y, por lo tanto, reduce los efectos secundarios observados cuando el tratamiento de quimioterapia afecta de manera no discriminativa a los órganos y tejidos sanos, que es uno de los principales obstáculos para la quimioterapia para el tratamiento de pacientes con cáncer.
En las últimas décadas, la evidencia sustancial experimental y clínica apoya la conclusión de que uno de los mecanismos más importantes que operan en la progresión tumoral implica quimiocinas y sus receptores. Las quimiocinas y sus receptores no sólo desempeñan un papel en la inflamación relacionada con el cáncer, sino que han sido implicados en la invasión y la metástasis de diversos tipos de cáncer. Sin desear estar ligado por ninguna teoría particular, se cree que los receptores de quimiocinas pseudoinflamatorios suministrados mediante GNV también pueden actuar como receptores solubles para bloquear la vía o vías mediadas por receptores de quimiocinas expresados en las células tumorales u otras células asociadas a tumores.
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Se entenderá que varios detalles de la materia divulgada en el presente documento se pueden cambiar sin apartarse del alcance de la materia divulgada en el presente documento. Además, la descripción anterior es para el propósito de ilustración solamente y no con el propósito de limitación.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Composición, que comprende:
una microvesícula derivada de una planta comestible; y
una membrana plasmática que recubre la microvesícula, la membrana plasmática derivada de una célula de reconocimiento.
2. Composición, según la reivindicación 1, en la que la microvesícula encapsula un agente terapéutico y/o en la que la célula de reconocimiento es un leucocito activado, y/o en la que la planta comestible es una fruta o un vegetal, en el que, de manera opcional, la fruta se selecciona entre una uva, un pomelo y un tomate.
3. Composición, según la reivindicación 2, en la que el agente terapéutico se selecciona entre un agente fitoquímico y un agente quimioterapéutico, en la que, cuando el agente terapéutico es un agente fitoquímico, el agente fitoquímico se selecciona, de manera opcional, entre curcumina, resveratrol, baicaleína, equol, fisetina y quercetina, y en la que, cuando el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, el agente quimioterapéutico se selecciona, de manera opcional, del grupo que comprende ácido retinoico, 5-fluorouracilo, vincristina, actinomicina D, adriamicina, cisplatino, docetaxel, doxorrubicina y taxol.
4. Composición, según la reivindicación 1, en la que el agente terapéutico comprende una molécula de ácido nucleico seleccionada entre un ARNpi, un microARN y un vector de expresión de mamífero.
5. Composición farmacéutica, que comprende una composición, según la reivindicación 1, y un vehículo, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. Composición, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la utilización en el tratamiento de un trastorno inflamatorio.
7. Composición para la utilización, según la reivindicación 6, en la que el trastorno inflamatorio se selecciona del grupo que comprende sepsis, choque séptico, colitis, cáncer de colon y artritis.
8. Composición para la utilización, según la reivindicación 6, en la que la composición se administra por vía oral o intranasal.
9. Composición para la utilización, según la reivindicación 6, en la que la administración de la composición reduce la cantidad de una citocina inflamatoria en un individuo, en la que, de manera opcional, la citocina inflamatoria se selecciona del grupo que comprende factor de necrosis tumoral-a, interleucina-1 p, interferón y e interleucina-6.
10. Composición para la utilización, según la reivindicación 6, en la que el agente terapéutico es un agente fitoquímico, tal como la curcumina.
11. Composición para la utilización, según la reivindicación 6, en la que el trastorno inflamatorio es colitis.
12. Composición, según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la utilización en el tratamiento de un cáncer en un individuo.
13. Composición para la utilización, según la reivindicación 12, en la que el agente terapéutico se selecciona entre un agente fitoquímico y un agente quimioterapéutico.
14. Composición para la utilización, según la reivindicación 12, en la que el cáncer se selecciona entre un cáncer de cerebro, un cáncer de mama, un cáncer de pulmón y un cáncer de colon.
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