ES2763442T3 - Inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 y diabetes - Google Patents

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Abstract

Un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, en donde dicho inhibidor es un fragmento del receptor TMEM219, comprendiendo dicho fragmento un dominio extracelular de TMEM219.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 y diabetes
Campo técnico
La presente invención se refiere al papel del eje IGFBP3/TMEM219 en el inicio de la diabetes y el uso relacionado de inhibidores del eje IGFBP3/TMEM219 para el tratamiento y/o prevención de la diabetes.
Antecedentes de la técnica
Los trastornos gastrointestinales, que consisten en gastroparesia, distensión abdominal, síndrome del intestino irritable e incontinencia fecal, son comunes en personas con diabetes tipo 1 (T1D) (1993). De hecho, hasta 80% de las personas con T1D de larga duración, que en general se ven afectadas por varias complicaciones diabéticas, incluyendo enfermedad renal en etapa terminal (ESRD) (1993; Atkinson et al, 2013; Fiorina et al., 2001), muestran síntomas intestinales. La presencia de estos síntomas gastrointestinales, conocidos como enteropatía diabética (DE), reducen significativamente la calidad de vida (1993; Atkinson et al., 2013; Camilleri, 2007; Talley et al., 2001) y tienen una patogénesis en gran medida desconocida (Feldman y Schiller, 1983). Los estudios preclínicos mostraron una alteración significativa de la morfología de la mucosa intestinal en roedores diabéticos (Domenech et al., 2011; Zhao et al, 2003), lo que sugiere que en la T1D la homeostasis intestinal puede estar alterada; sin embargo, hay pocos datos disponibles en seres humanos. El epitelio intestinal es mantenido por células madre intestinales y su nicho, que responden al estrés fisiológico y al daño ambiental (Barker, 2014; Medema y Vermeulen, 2011). Las células madre del colon (CoSC), que se encuentran en la base de las criptas del intestino grueso y que expresan el receptor 2 de efrina B (EphB2), receptor 5 acoplado a proteínas G que contiene repetición rica en leucina (LGR5), h-TERT y aldehído deshidrogenasa (Aldh), entre otros marcadores (Carlone y Breault, 2012; Carpentino et al., 2009; Jung et al., 2011; Sato y Clevers, 2013), constituyen con el microentorno local el nicho de los CoSC (van der Flier y Clevers, 2009; Zeki et al., 2011). Estudios recientes han establecido condiciones que recapitulan muchas características de la homeostasis intestinal y la generación de organoides de las criptas grandes de autorrenovación in vitro, o los llamados "mini intestinos" (Sato y Clevers, 2013). Queda por establecer si los factores sistémicos, tales como las hormonas circulantes, sirven para controlar las CoSC (Stange y Clevers, 2013).
El tratamiento de trastornos gastrointestinales, en particular la enteropatía diabética, incluye fármacos sintomáticos y fármacos para aliviar la diarrea, dolor abdominal, estreñimiento y dispepsia. Hasta la fecha no hay un tratamiento específico disponible para la enteropatía diabética.
El diagnóstico de trastornos gastrointestinales, en particular la enteropatía diabética incluye endoscopia de colon, endoscopia gástrica, manometría anorrectal, manometría esofágica y análisis de muestras fecales, evaluación de marcadores de cáncer periférico (es decir CEA, Ca 19.9, alfa-fetoproteína, Cal25) y de marcadores celíacos. Ninguno de los métodos mencionados antes es capaz de proporcionar un diagnóstico seguro de enteropatía diabética.
Las publicaciones internacionales WO 2011133886 y WO2007024715 describen un compuesto terapéutico en forma de un anticuerpo que se une a IGFBP3.
La publicación internacional WO0187238 se refiere a una composición farmacéutica contra el cáncer que comprende un TMEM219 terapéuticamente eficaz, en particular para el tratamiento del cáncer de colon.
La publicación internacional WO 2014089262 describe el uso de IGFBP3 como un marcador de diagnóstico de trastornos de inflamación crónica (obesidad) (en particular, enfermedad inflamatoria intestinal como CU y enfermedad de Crohn y cáncer de colon).
El documento US6066464 se refiere a un inmunoensayo para la detección de IGFBP3 en un soporte sólido que es papel.
La publicación internacional WO2013152989 se refiere al uso de IGFBP3 como un biomarcador de cáncer colorrectal.
La publicación internacional WO0153837 describe un método para vigilar o diagnosticar enfermedades que implican medir una combinación de marcadores tumorales y al menos un componente del eje IGF. Se propone IGFBP3 como un marcador de tumores de colon.
La diabetes tipo 1 (T1D) se ha considerado históricamente como una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T, que produce la destrucción de células beta pancreáticas productoras de insulina (Bluestone et al., 2010; Eisenbarth, 1986). Según esta perspectiva, un factor iniciador desencadena la respuesta inmunitaria contra autoantígenos, y las posteriores células T autorreactivas recién activadas se dirigen y destruyen aún más los islotes pancreáticos y las células beta productoras de insulina (Bluestone et al., 2010). Si la destrucción de las células beta está determinada únicamente por el ataque autoinmunitario o si otros mecanismos tales como la modulación paracrina, desregulación metabólica, apoptosis de células beta no inmunitaria y la regeneración de células beta detenida contribuyen a la patogénesis de la T1D ahora es un tema de debate (Atkinson y Chervonsky, 2012; Atkinson et al, 2015). Recientemente, se ha observado que se requieren factores ambientales para iniciar la respuesta autoinmunitaria en la T1D, en particular infecciones virales (Filippi y von Herrath, 2008), y los estudios del impacto de la microbiota intestinal han puesto de manifiesto que los enterovirus están implicados en la activación de las células T autorreactivas (McLean et al., 2015). Los estudios en curso también se centran en otros factores de riesgo ambientales tales como la dieta, la exposición neonatal a la leche y al gluten y la edad de cese de lactancia, lo que sugiere que está surgiendo un nuevo enfoque para estudiar la patogénesis de la T1D (McLean et al., 2015), de modo que ya no se considera que los factores genéticos son el único determinante de la T1D (Alper et al., 2006) (Oilinki et al., 2012). Además, ahora se está cuestionando la eficacia de las estrategias inmunoterapéuticas, que en la última década se ha considerado que son la principal perspectiva para establecer una cura para la T1D (Ben Nasr et al., 2015a). Aunque se mostró que dirigirse a la respuesta autoinmunitaria usando un tratamiento inmunosupresor o un régimen pro-regulador era satisfactorio en roedores, por el contrario, dichas estrategias lograron la independencia de la insulina en un número insignificante de individuos con T1D (Atkinson et al., 2015). Además de subrayar la diferencia entre los modelos animales y humanos, estos datos también arrojan luz sobre el hecho de que la investigación de la respuesta inmunitaria examinaba principalmente los sucesos inmunitarios que ocurrían en la periferia, mientras que se sabe poco con respecto al proceso de la enfermedad que ocurre dentro de los islotes y en particular en las células beta. En este sentido, el descubrimiento de nuevos factores implicados en el inicio/facilitación de la pérdida de células beta en la T1D será de gran valor. Dichos descubrimientos pueden allanar el camino para nuevos enfoques terapéuticos capaces de detener o retrasar la primera fase de la enfermedad. Entonces, todavía existe la necesidad de un tratamiento alternativo para la T1D y T2D.
La publicación internacional WO2008153788 reivindica un método para inhibir o reducir los niveles de IGFBP3 para tratar la resistencia a la insulina o TD2, en donde el inhibidor es un ácido nucleico complementario al ARNm de IGFBP3 o un anticuerpo que se une a IGFBP3, anti-IGFBP-3. El documento no dice nada sobre el eje IGFBP3/TMEM219. Muzumdar et al. (Muzumdar et al., 2006) describen que IGFBP3 actúa como un antagonista de la insulina a través de un mecanismo central que conduce a una absorción de glucosa periférica reducida. Este documento no describe la inhibición del eje IGFBP3/TMEM219.
La publicación internacional WO9739032 reivindica el uso de un inhibidor de IGFBP3 para tratar la diabetes, en donde el inhibidor evita la unión de IGFBP-3 a IGF-1. La inhibición del eje IGFBP3/TMEM219 no está contemplada. D'Addio et al. (2015) indican que eco-TEM219 normaliza los niveles de IGF-I/IGFBP3 en la circulación. La publicación internacional WO2007024715 se refiere al uso de proteínas de unión multivalentes y multiespecíficas genéticamente modificadas, en concreto inmunoglobulinas de doble dominio variable, que se unen a dos antígenos o péptidos diana diferentes usando un único conector medio y son biespecíficos. El documento menciona entre las numerosas proteínas objetivo, IGFBP3 en combinación con otros miembros de la familia.
La publicación internacional WO2011133886: se refiere a un método para generar anticuerpos y otros complejos de proteínas multiméricos, en concreto proteínas heteromutliméricas, capaces de unirse específicamente a más de un objetivo. IGFBP3 puede representar un objetivo potencial.
Compendio de la invención
Sigue sin estar claro si los factores sistémicos sirven para controlar la homeostasis del epitelio colónico y de las células madre de colon (CoSC). Los autores de la invención plantean la hipótesis de que una díada "hormonal" circulante controla las CoSC y está alterada en la diabetes tipo 1 (T1D) de larga duración conduciendo a la enteropatía diabética (DE). Las personas con T1D de larga duración presentaban anomalías de la mucosa intestinal y CoSC, y fallo en la generación de mini intestinos in vitro. El perfil proteómico del suero puso de manifiesto niveles circulantes alterados del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-I) y su proteína de unión 3 (IGFBP3) en individuos con diabetes tipo 1 de larga duración, con evidencias de una mayor liberación hepática de IGFBP3 mediada por hiperglucemia. IGFBP3 prevenía el crecimiento de mini intestinos in vitro a través de un efecto independiente de IGF-I dependiente de TMEM219/mediado por caspasa y alteraba las CoSC en modelos preclínicos in vivo. La restauración de la normoglucemia en T1D de larga duración, con trasplante de riñón-páncreas, y el tratamiento con una proteína recombinante ecto-TMEM219 en ratones diabéticos, restablecía las CoSC restaurando los niveles circulantes adecuados de IGF-I/IGFBP3. La díada periférica IGF-I/IGFBP3 controla las CoSC y es disfuncional en la DE.
Aquí los autores de la invención demuestran que los individuos con T1D de larga duración y DE tienen las CoSC alteradas y muestran niveles aumentados de IGFBP3. La administración de IGFBP3 altera las propiedades regenerativas de las CoSC y la morfología de la mucosa in vitro e in vivo, en un modelo preclínico de, inactivando el IGF-I circulante y ejerciendo un efecto tóxico dependiente de TMEM219/mediado por caspasa en las CoSC. Finalmente, se generó una nueva proteína recombinante ecto-TMEM219, basada en el dominio extracelular del receptor de IGFBP3 (TMEM219). ecto-TMEM219 inactiva IGFBP3 periférico y evita su unión al receptor de IGFBP3, TMEM219. Después, dirigirse a IGFBP3 con dicha proteína recombinante ecto-TMEM219, expresada en CoSC, anula los efectos perjudiciales de IGFBP3 in vitro e in vivo.
La presente invención proporciona datos convincentes que muestran que la liberación de IGFBP3 es mayor en individuos con riesgo alto de T1D y T2D. Es interesante que los autores de la invención han descubierto que el receptor de IGFBP3, TMEM219, se expresa en una línea de células beta y en islotes murinos/humanos, y que su ligadura por IGFBP3 es tóxica para las células beta, aumentando la posibilidad de la existencia de una toxina endógena de células beta. Esto sugiere que la o las toxinas de células beta [betatoxina(s)] pueden estar implicadas en la patogénesis de la TD1, en particular en la fase temprana, cuando las lesiones de los islotes/células beta pueden facilitar la exposición de los autoantígenos a las células inmunitarias, creando así un entorno inflamado local y una reacción inmunitaria sostenida. Es interesante que los autores también han observado niveles elevados de IGFBP3 en individuos pre-T2D y en T2D, lo que sugiere que también es evidente un papel potencial para este eje en la T2D.
Los autores de la invención también han observado que IGFBP3 puede inducir la apoptosis de células beta y de islotes murinos/humanos in vitro de una manera dependiente de caspasa 8. Finalmente, la proteína ecto-TMEM219 recombinante recién generada, basada en el dominio extracelular de TMEM219, capaz de inactivar IGFBP3, previene su señalización a través de TMEM219 en las células beta pancreáticas. El tratamiento con ecto-TMEM219 reduce la pérdida de células beta, mejora el contenido de insulina de los islotes y el control glucometabólico en modelos murinos de diabetes (T1D y T2D) in vivo, mientras que in vitro protege los islotes y las células beta de la apoptosis inducida por IGFBP3. Los autores de la invención demuestran que IGFBP3 es una toxina endógena de células beta periféricas (o betatoxina) que es liberada progresivamente en individuos con riesgo alto de diabetes (T1D y T2D). La expresión concomitante del receptor de IGFBP3 (TMEM219) en las células beta inicia/facilita la muerte de las células beta, favoreciendo así la aparición/progresión de la diabetes.
En otras palabras, la invención se basa en el descubrimiento de que TMEM219, el receptor de IGFBP3 que media los efectos perjudiciales independientes de IGFBP3/IGF1, se expresa en islotes pancreáticos y células beta; además, dirigirse al eje IGFBP3/TMEM219 con ecto-TMEM219 restablece la señalización de IGFBP3 adecuada en ratones diabéticos y previene la pérdida de células beta y preserva la morfología de los islotes, confirmando así la función crítica del eje IGFBP3/TMEM219 en favorecer la pérdida de células beta en la diabetes.
El presente enfoque terapéutico, basado en la inhibición del eje IGFBP3/TMEM219, puede superar los límites de las terapias actuales para la T1D y T2D, ya que podría prevenir el daño de las células beta y la consecuente reducción o eliminación de la secreción de insulina que conduce al desarrollo de diabetes.
Por lo tanto, las ventajas de la presente invención frente a los tratamientos de la técnica anterior son:
- Prevención de la destrucción de células beta e islotes
- Protección de la masa de células beta y de las células productoras de insulina
- Prevención de complicaciones mayores de la diabetes
- Limitación del ataque autoinmunitario contra islotes pancreáticos en la T1D
- Prevención de la resistencia a la insulina en la T2D y
- No se requiere inmunoterapia en la T1D.
Por lo tanto, la invención proporciona un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, en donde dicho inhibidor es un fragmento del receptor TMEM219, comprendiendo dicho fragmento un dominio extracelular de TMEM219.
Preferiblemente dicho inhibidor es
un polinucleótido que codifica el fragmento del receptor TMEM219 como se ha definido antes o un vector que comprende o expresa el polinucleótido o una célula hospedante genéticamente modificada que expresa el fragmento del receptor TMEM219 como se ha definido antes o el polinucleótido
En una realización preferida, el inhibidor es ecto-TMEM219. Preferiblemente el inhibidor es soluble o está pegilado. Preferiblemente dicho inhibidor es una proteína de fusión TMEM219-Ig, preferiblemente dicha proteína de fusión inactiva la IGFBP3 circulante y evita su unión a TMEM219.
En una realización preferida, la diabetes es diabetes tipo 1 o tipo 2.
Aún preferiblemente, el sujeto se selecciona del grupo que consiste en: un sujeto en riesgo de desarrollar diabetes tipo 1 y/o tipo 2, un sujeto con diabetes tipo 1 y/o tipo 2 en etapa temprana.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes que comprende el inhibidor como se ha definido antes y vehículos farmacéuticamente aceptables. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende además un agente terapéutico.
Preferiblemente, el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: insulina en cualquier forma, pramlintida (Symlin), inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) o bloqueadores del receptor de angiotensina II (ARB), aspirina, fármacos reductores del colesterol, metformina (Glucophage, Glumetza, otros), sulfonilureas (gliburida (DiaBeta, Glynase), glipizida (Glucotrol) y glimepirida (Amaryl), meglitinidas (por ejemplo, repaglinida (Prandin) y nateglinida (Starlix)), tiazolidinadionas (rosiglitazona (Avandia) y pioglitazona (Actos) por ejemplo), inhibidores de DPP-4 (sitagliptina (Januvia), saxagliptina (Onglyza) y linagliptina (Tradjenta)), agonistas del receptor de GLP-1 (exenatida (Byetta) y liraglutida (Victoza)), inhibidores de SGLT2, los ejemplos incluyen canagliflozina (Invokana) y dapaglifiozina (Farxiga).
En la presente invención, la inhibición del eje IGFBP3/TMEM219 significa bloquear la unión de IGFBP3 a TMEM219, por ejemplo inactivando la IGFBP3 de la circulación, también significa bloquear el sitio de unión a IGFBP3 de TMEM219, bloquear el sitio de unión de IGFBP3 en TMEM219. Significa además inhibir la función y/o expresión y/o señalización de TMEM219, esto se puede lograr por ejemplo silenciando la expresión de TMEM219, en particular con ARNip u oligonucleótidos. También significa inhibir la función y/o expresión de IGFBP3.
Según la invención, un inhibidor de la unión de IGFBP3 a TMEM219 puede ser una de las siguientes moléculas: - Ecto-TMEM219 soluble (parte extracelular de TMEM219) que neutraliza la IGFBP3 circulante;
- Proteína de fusión TMEM219-Ig, una proteína de fusión basada en Fc compuesta de un dominio Fc de inmunoglobulina que está directamente ligado al péptido TMEM219 o a su parte extracelular, que inactiva la IGFBP3 circulante y evita su unión a TMEM219 expresado en las células beta;
En la presente invención, el paciente que puede ser tratado son individuos que están en riesgo de desarrollar T1D (diabetes autoinmunitaria, basada en la presencia de autoanticuerpos anti-islotes periféricos o predisposición genética o predisposición familiar o función de las células beta alterada) o T2D (diabetes no autoinmunitaria basada en la evidencia de una tolerancia alterada a la glucosa en ayunas y/o tolerancia alterada a la glucosa sin cumplir los criterios para el diagnóstico de diabetes), o individuos que desarrollan T1D o T2D en cualquier etapa de la enfermedad, en particular un sujeto con diabetes tipo 1 y/o tipo 2 en etapa temprana, con el propósito de proteger las células beta de una mayor destrucción. La presencia de cualquier grado de células beta conservadas es el único requisito para evaluar la terapia con éxito.
La expresión de IGFBP3 se puede medir por medio de RT-PCR en tejidos y células, transferencia Western en tejidos y células, inmunohistoquímica en tejidos, inmunofluorescencia en tejidos y células. Los niveles de IGFBP3 en fluidos biológicos se pueden medir mediante ensayos inmuno-dirigidos y análisis proteómicos.
La función de IGFBP3 se puede medir mediante la detección de la expresión de caspasas 8 y 9 en células diana usando RT-PCR, micromatrices, cocultivando células/estructuras diana con inhibidor de pan-caspasa, inhibidores de caspasas 8 y 9 y midiendo las células/estructuras vivas.
En la presente invención, "inhibir o bloquear la interacción de IGFBP3 con su receptor TMEM219" significa inactivar la IGFBP3 circulante y evitar su unión al receptor TMEM219 expresado en islotes pancreáticos y células beta. La unión de IGFBP3-TMEM219 se podría prevenir también mediante el uso de un anticuerpo bloqueador de IGFBP3. Además, un anticuerpo bloqueador de TMEM219 podría unirse al receptor TMEM219, haciendo que el receptor no esté disponible cuando IGFBP3 viene de la circulación.
El inhibidor de la invención puede ser un fragmento de TMEM219 que comprende un dominio extracelular de TMEM219 (ecto-TMEM219), en particular el fragmento comprende la secuencia:
THRTGLR5PDIPQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHWGLLTTLNFGDGPDR NKT RTF QATVL G SQ MGLKG S SA GQ LVLITARV TTERTAGTC LYF S AVPGILPSSQPPISC SEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR<SEQ ID NO:2).
Preferiblemente, el fragmento de TMEM219 es un dominio extracelular de TMEM219, en particular, el fragmento comprende la secuencia:
SFLLTH RTGLRSPDIPQD W VSFLRSFGQLTLCPRN GT VTGK WRGSH V VGLLTTLNFGDG PDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTEKTAGTCLYFSAVPGILPSSQPP ISCSEEG AGN ATI.SPRMGEECVSVWSHEGL VLTKLLTSEEL ALCGSR (SEQ ID NO:3) Preferiblemente, el fragmento de TMEM19 consiste en:
THRTGLR5PDIPQDWVSFLRSF0QLTLCPRNGTVTGKWRGSHWGLLTTLNFGDGPDR NKT RTF QATVL G SQ MGLKG S SA GQ LVLITARV TTERTAGTC LYF S AVPGILPSSQPPISC SEEGAGNATLSPRMGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR<SEQ ID N0:2).
Preferiblemente, el fragmento de TMEM19 consiste en:
SFLLTH RTGLRSPDIPQD W VSFLRSFGQLTLCPRN GT VTGK WRGSH V VGLLTTLNFGDG PDRNKTRTFQATVLGSQMGLKGSSAGQLVLITARVTTERTAGTCLYFSAVPGILPSSQPP ISCSEEG AGN ATI.SPRMGEECVSVWSHEGL VLTKLLTSEEL ALCGSR (SEQ ID NO:3) En la presente invención, TMEM219 es preferiblemente TMEM219 eucariota, preferiblemente un TMEM219 de mamífero, todavía preferiblemente TMEM219 humano.
La interacción de IGFBP3 con TMEM219 se puede medir mediante la evaluación indirecta de los efectos de IGFBP3 en las células diana (aumento de la expresión de Caspasa 8 y 9 con RT-PCR), evaluación directa de la unión IGFBP3-IGFBP3-receptor (TMEM219) con ensayos de unión a ligando en fase sólida o líquida (es decir, inmunoprecipitación, RT-PCR, inmunoensayos) y ensayos de unión a ligando no radiactivos.
En la presente invención, "T1D de larga duración" significa una historia de diabetes tipo 1 de más de 15 años asociada con el desarrollo de complicaciones diabéticas.
En una realización preferida, el vector anterior es un vector de expresión seleccionado del grupo que consiste en: plásmidos, partículas virales y fagos.
Preferiblemente, dicha célula hospedante se selecciona del grupo que consiste en: células bacterianas, células fúngicas, células de insectos, células animales, células vegetales, siendo preferiblemente una célula animal, más preferiblemente una célula humana.
En una realización preferida, el inhibidor como se ha definido antes (a) se combina con al menos un agente terapéutico (b) para definir una combinación o preparación combinada. El agente terapéutico puede ser un agente antidiabético, un agente usado para prevenir la diabetes, un agente antiapoptótico, los modelos antidiabetes y los efectos vistos en el hombre sugieren sinergia en animales que se puede demostrar, p. ej., en los modelos descritos en los ejemplos a continuación.
Las composiciones farmacéuticas anteriores son preferiblemente para administración sistémica, oral, local, preferiblemente rectal o tópica.
La cantidad de control es la cantidad medida en un control adecuado.
Se pueden usar medios de control para comparar la cantidad o el aumento de la cantidad del compuesto como se ha definido antes respecto a un control adecuado. El control adecuado se puede obtener, por ejemplo, con respecto a la referencia conocida, ya sea de un sujeto normal o de una población normal.
El método de diagnóstico anterior también puede comprender una etapa de tratamiento del sujeto, en particular el tratamiento puede ser un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 como se define en la presente invención o un tratamiento existente para la diabetes tal como se ha indicado antes.
Los medios para medir la cantidad de IGFBP3 como se ha definido antes son preferiblemente al menos un anticuerpo, análogo funcional o derivados de los mismos. Dicho anticuerpo, análogo funcional o derivados de los mismos son específicos para dicho compuesto.
En una realización preferida, el kit de la invención comprende:
- un anticuerpo adherido a fase sólida específico para dicho compuesto;
- medios de detección del complejo de ligando específico-biomarcador.
Los kits de acuerdo con la invención pueden comprender además auxiliares habituales, tales como tampones, vehículos, marcadores, etc. y/o instrucciones de uso.
El control adecuado puede ser una muestra tomada de un paciente sano o de un paciente afectado por un trastorno distinto de la diabetes.
En el caso de un método o un kit para vigilar la evolución de la diabetes, se vigila la evolución de la enfermedad y el control adecuado puede ser una muestra tomada del mismo sujeto en diferentes tiempos o de otro paciente, y la cantidad de control adecuada puede ser la cantidad de la misma proteína o polinucleótido medida en una muestra tomada del mismo sujeto en diferentes tiempos o de otro paciente.
En el caso de un método o un kit para vigilar la eficacia o la respuesta a un tratamiento terapéutico, el control adecuado puede ser por una muestra tomada del mismo sujeto antes del inicio de la terapia o tomada en diferentes tiempos durante el curso de la terapia y la cantidad de control adecuada puede ser la cantidad de la misma proteína o polinucleótido medida en una muestra tomada del mismo sujeto antes del inicio de la terapia o tomada en varios momentos durante el curso de la terapia. La terapia puede ser la terapia con el inhibidor de la presente invención.
En la presente invención, la expresión "medir la cantidad" se puede concebir como medir la cantidad o concentración o nivel de la respectiva proteína y/o su ARNm y/o su ADN, preferiblemente semicuantitativo o cuantitativo. La medición de una proteína se puede llevar a cabo directa o indirectamente. La medición directa se refiere a la cantidad o concentración medida del biomarcador, basada en una señal obtenida directamente de la proteína, y que está directamente correlacionada con el número de moléculas de proteína presentes en la muestra. Esta señal, que también se puede denominar señal de intensidad, se puede obtener, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física del biomarcador. Las mediciones indirectas incluyen la medición obtenida de un componente secundario (p. ej., un componente diferente del producto de expresión génica) y un sistema de medición biológica (p. ej., la medición de respuestas celulares, ligandos, "marcadores" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad", como se usa en la descripción, se refiere pero no se limita a la cantidad absoluta o relativa de proteínas y/o su ARNm y/o su ADN, y cualquier otro valor o parámetro asociado con las mismas o que pueda resultar de estas. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenida de las propiedades físicas o químicas de la proteína, obtenidas por medición directa, por ejemplo, valores de intensidad en un inmunoensayo, espectroscopía de masas o resonancia magnética nuclear. Además, estos valores o parámetros incluyen los obtenidos por medición indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medición descritos en la presente memoria. Los métodos para medir ARNm y ADN en muestras son conocidos en la técnica. Para medir niveles de ácidos nucleicos, las células en una muestra de ensayo se pueden lisar, y se pueden medir los niveles de ARNm en los lisatos o el ARN de lisatos purificados o semipurificados, por cualquier variedad de métodos familiares para los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen ensayos de hibridación que usan sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable (es decir, transferencia Northern) o metodologías de RT-PCR cuantitativas o semicuantitativas que usan cebadores oligonucleótidos adecuados. Alternativamente, se pueden llevar a cabo ensayos de hibridación in situ cuantitativos o semicuantitativos usando, por ejemplo, secciones de tejido o suspensiones celulares no lisadas, y sondas de ADN o ARN marcadas de forma detectable (p. ej., fluorescentes o marcadas con enzimas). Los métodos adicionales para cuantificar el ARNm incluyen ensayo de protección de ARN (RPA), micromatrices de ADNc y oligonucleótidos, análisis de diferencia de representación (RDA), presentación diferencial, análisis de secuencia EST y análisis en serie de la expresión génica (SAGE).
Si al comparar la cantidad medida de la proteína IGFBP3 o del polinucleótido que codifica dicha proteína con la cantidad obtenida de una muestra de control, la cantidad de dicho compuesto en la muestra aislada del sujeto corresponde a un valor mayor, el sujeto puede presentar la enfermedad o ir hacia un agravamiento de dicha enfermedad.
Si al comparar la cantidad medida de la proteína IGFBP3 o del polinucleótido que codifica dicha proteína con la cantidad obtenida de una muestra de control, la cantidad de dicho compuesto en la muestra aislada del sujeto corresponde a un valor similar o inferior, el sujeto puede no estar afectado por la enfermedad o ir hacia una mejora de la enfermedad, respectivamente.
Alternativamente, la expresión "detección" o "medición de la cantidad" se concibe como la medición de la alteración de la molécula. Dicha alteración puede reflejar un aumento o una disminución en la cantidad de los compuestos como se ha definido antes. Un aumento de la proteína IGFBP3 o del polinucleótido que codifica dicha proteína se puede correlacionar con un agravamiento de la enfermedad. Una disminución de la proteína IGFBP3 o del polinucleótido que codifica dicha proteína se puede correlacionar con una mejora de la enfermedad o con la recuperación del sujeto.
La expresión "proteína IGFBP3" o "IGFBP3" o "TMEM219" se pretende que incluya también la proteína correspondiente codificada a partir de genes ortólogos u homólogos de IGFBP3 o TMEM, mutantes funcionales, derivados funcionales, fragmentos funcionales o análogos, isoformas de los mismos. La expresión "gen de IGFBP3" o "IGFBP3" o "gen de TMEM19" o "TMEM219" se pretende que incluya también los genes ortólogos u homólogos correspondientes, mutantes funcionales, derivados funcionales, fragmentos funcionales o análogos, isoformas de los mismos.
En la presente invención, los "mutantes funcionales" de la proteína son mutantes que se pueden generar mutando uno o más aminoácidos en sus secuencias y que mantienen su actividad para el tratamiento de la diabetes. De hecho, la proteína de la invención, si se requiere, se puede modificar in vitro y/o in vivo, por ejemplo por glicosilación, miristoilación, amidación, carboxilación o fosforilación, y se puede obtener, por ejemplo, por técnicas sintéticas o recombinantes conocidas en la técnica. La proteína de la invención "IGFBP3" o "TMEM219" se puede modificar para aumentar su biodisponibilidad o semivida por un método conocido en la técnica. Por ejemplo, la proteína se puede conjugar con un polímero, se puede pegilar etc.
En la presente invención, los ingredientes activos también pueden estar atrapados en una microcápsula preparada, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en la 16a edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, Osol, A. Ed. (1980).
Las formulaciones que se van a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos conformados, p. ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de EE.UU. N° 3773919), copolímeros de ácido L-glutámico y [gamma]-L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida, y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque los polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante mucho tiempo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, produciendo una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden idear estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio tio-disulfuro, la estabilización se puede lograr modificando los restos de sulfhidrilo, liofilizando las soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.
En la presente invención, "funcional" se concibe, por ejemplo, como "mantener su actividad", p. ej. tratamiento terapéutico de la diabetes.
El término "análogo" como se usa en la presente memoria en referencia a una proteína significa un péptido modificado en donde uno o más restos de aminoácidos del péptido se han sustituido por otros restos de aminoácidos y/o en donde uno o más restos de aminoácidos se han eliminado del péptido y/o en donde uno o más restos de aminoácidos se han eliminado del péptido y/o en donde se han añadido uno o más restos de aminoácidos al péptido. Dicha adición o eliminación de restos de aminoácidos puede tener lugar en el extremo N-terminal del péptido y/o en el C-terminal del péptido.
El término "derivado" como se usa en la presente memoria en relación con una proteína, significa un péptido modificado químicamente o un análogo del mismo, en donde al menos un sustituyente no está presente en el péptido no modificado o un análogo del mismo, es decir, un péptido que se ha modificado covalentemente. Las modificaciones típicas son amidas, carbohidratos, grupos alquilo, grupos acilo, ésteres y similares. Como se usa en la presente memoria, el término "derivados" también se refiere a polipéptidos más largos o más cortos que tienen p. ej. un porcentaje de identidad de al menos 41%, preferiblemente al menos 41.5%, 50%, 54.9%, 60%, 61.2%, 64.1%, 65%, 70% o 75%, más preferiblemente de al menos 85%, como ejemplo de al menos 90%, e incluso más preferiblemente de al menos 95% con IGFBP3, o con una secuencia de aminoácidos de la región correspondiente codificada a partir de un gen ortólogo u homólogo de IGFBP3.
Como se usa en la presente memoria, "fragmentos" se refiere a polipéptidos que tienen preferiblemente una longitud de al menos 10 aminoácidos, más preferiblemente al menos 15, al menos 17 aminoácidos o al menos 20 aminoácidos, incluso más preferiblemente al menos 25 aminoácidos o al menos 37 o 40 aminoácidos, y más preferiblemente de al menos 50, o 100, o 150 o 200 o 250 o 300 o 350 o 400 o 450 o 500 aminoácidos.
De acuerdo con la presente invención, una "cantidad eficaz" de una composición es una que es suficiente para lograr un efecto biológico deseado, en este caso una mejora o el tratamiento de la diabetes.
Se entiende que la dosis eficaz dependerá de la edad, sexo, salud y peso del receptor, el tipo de tratamiento concurrente, si lo hay, frecuencia del tratamiento la naturaleza del efecto deseado. Los intervalos proporcionados de dosis eficaces del inhibidor o molécula de la invención (p. ej., de 1 mg/kg a 1000 mg/kg, en particular administrados por vía sistémica) no se pretende que limiten la invención y representan intervalos de dosis preferidos. Sin embargo, la dosificación preferida se puede adaptar al sujeto individual, como se entiende y la puede determinar un experto en la técnica, sin experimentación excesiva.
La administración de oligonucleótidos de la presente invención se puede llevar a cabo por métodos conocidos, en los que se introduce un ácido nucleico en una célula diana deseada in vitro o in vivo.
Un aspecto de la presente invención comprende una construcción de ácido nucleico comprendida dentro de un vehículo de suministro. Un vehículo de suministro es una entidad mediante la cual una secuencia de nucleótidos puede ser transportada de al menos un medio a otro. Los vehículos de suministro se pueden usar en general para la expresión de las secuencias codificadas dentro de la construcción de ácido nucleico y/o para el suministro intracelular de la construcción. Está dentro del alcance de la presente invención que el vehículo de suministro puede ser un vehículo seleccionado del grupo de vehículos basados en ARN, vehículos/vectores basados en ADN, vehículos basados en lípidos, vehículos basados en virus y vehículos basados en células. Los ejemplos de dichos vehículos de suministro incluyen: microesferas poliméricas biodegradables, formulaciones basadas en lípidos tales como portadores de liposomas, aplicar la construcción como recubrimiento sobre partículas de oro coloidales, lipopolisacáridos, polipéptidos, polisacáridos, pegilación de vehículos virales.
En una realización de la presente invención, puede comprender un virus como vehículo de suministro, donde el virus se puede seleccionar de: adenovirus, retrovirus, lentivirus, virus adeno-asociados, herpesvirus, virus vaccinia, espumavirus, citomegalovirus, virus del bosque Semliki, poxviru, vector de virus de ARN y vector de virus de ADN. Dichos vectores virales son bien conocidos en la técnica.
Las técnicas de transferencia génica usadas habitualmente incluyen fosfato de calcio, DEAE-dextrano, transfección, electroporación y microinyección y métodos virales. Otra técnica para la introducción de ADN en las células es el uso de liposomas catiónicos. Las formulaciones de lípidos catiónicos disponibles en el mercado son, p. ej. Tfx 50 (Promega) o Lipofectamin 2000 (Life Technologies).
Las composiciones de la presente invención pueden estar en forma de una solución, p. ej. una solución inyectable, una crema, ungüento, comprimido, suspensión o similar. La composición se puede administrar de cualquier manera adecuada, p. ej., por inyección, en particular por inyección intraocular, por aplicación oral, tópica, nasal, rectal, etc. El vehículo puede ser cualquier vehículo farmacéutico adecuado. Preferiblemente, se usa un vehículo, que es capaz de aumentar la eficacia de las moléculas de ARN para entrar en las células diana. Ejemplos adecuados de dichos vehículos son liposomas, en particular liposomas catiónicos. El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y se puede usar para transformar o transfectar cualquier hospedante adecuado. Los vectores adecuados incluyen los diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambos, tales como plásmidos y virus. Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante estándar. Las construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, se pueden preparar para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedante procariota o eucariota. Los sistemas de replicación se pueden obtener, p. ej., de ColEl, plásmido de 2 |j, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.
De forma conveniente, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como los codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicas del tipo de hospedante (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, adecuadas y teniendo en cuenta si el vector se basa en ADN o ARN. El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de hospedantes transformados o transfectados. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedante auxotrófico para proporcionar prototrofía, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina. El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor natural o normativo operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica el inhibidor de PCYOX1 (incluyendo las partes funcionales y sus variantes funcionales), o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el ARN. La selección de promotores, p. ej., fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos de desarrollo, se basa en la experiencia del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también depende de la experiencia del experto. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.
Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para expresión transitoria, para expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden hacer para expresión constitutiva o para expresión inducible.
En las composiciones de IGFBP3 anteriores, se pueden proponer materiales adicionales, así como técnicas de procesamiento y similares de la Parte 5 de Remington's Pharmaceutical Sciences, 20a edición, 2000, Marck Publishing Company, Easton, Pensilvania, que se incorpora en la presente memoria por referencia.
Los compuestos de esta invención también se pueden administrar en formas de liberación sostenida o de sistemas de suministro de fármacos de liberación sostenida. También se puede encontrar una descripción de materiales de liberación sostenida representativos en los materiales incorporados en Remington's Pharmaceutical Sciences. Además, las formulaciones farmacéuticas se pueden preparar usando un procedimiento, que es generalmente conocido en la técnica farmacéutica.
En la presente invención, cuando la molécula de la invención se administra con otro agente terapéutico, se puede administrar simultánea o secuencialmente.
Secuencias
Secuencia de aminoácidos de IGFBP3:
MQRARFTLWAAALTLLVURGPPVARAGASSAGLGPWRCEPCDARALAQCAPPPAV CAELVREPGCGCCLTC ALSEGQPOGIYTERCG SGLRCQPSPDHARPLQALLDORGLCVN AS A v Sr l r a y llp a p pa p g e p p a p o n as e s e e d r s a g S v e spSv s St h r v S d p k fhplhS KIIIIÍCKGHAKDSQRYÍÍVDYESQSTDTQNFSSESKRETEYGPCRREMEDTLNHLKFLNVL SPRGVHIPNCDKKGFYKKKQCRPSK.GRKRGFCWCVDKYGQPLPGYTTKGKEDVHCYS MQSK (SEQ I NO:4)
Secuencia de nucleótidos de IGFBP3: proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3 de Homo sapiens (IGFBP3), RefSeqGene en el cromosoma 7, secuencia de referencia de NCBI: NG_011508.1 Secuencia de ARNm de IGFBP3: proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3 de Homo sapiens (IGFBP3), variante de transcripción 1, ARNm, secuencia de referencia de NCBI: NM_001013398.1 Secuencia de aminoácidos de TMEM219:
MGNCQAGHNLHLC LAHHP PLVCATUL LLIGLSGLGLGSFLL THRT GLRS P DI PQD WV S F LRS F GQLTL CPRN GTVTGKWRG S HWOLL TT LNF GDG P DRNKTRTF QATVLG S Q M GL KGS5AGQLVLITARVTTERTAGTCIYFSAVPGILPSSQPPISCSEEGAGNATLSPRMGEEC V S VWSHEG LVLTKL LT S EELALCG SRL LVLGS FLLLFCGLLC CVT AMCF H PRRE SHWSR TRL (SEQ ID NO:2).
Secuencia de nucleótidos de TMEM219: proteína transmembrana 219 TMEM219 [Homo sapiens (humano)], ID de gen: 124446.
Secuencia de ARNm de TMEM219: proteína transmembrana 219 de Homo sapiens (TMEM219), variante de transcripción 1, ARNm, secuencia de referencia NCBI: NM_001083613.1
La presente invención se ilustrará mediante ejemplos no limitantes que se refieren a las siguientes figuras.
Figura 1. La enteropatía diabética en la T1D de larga duración se caracteriza por anomalías de la mucosa intestinal y deterioro en las células madre de colon. A, B, C. Las gráficas de barras representan la puntuación de diarrea, dolor abdominal y estreñimiento de acuerdo con la administración del cuestionario de GSRS en sujetos sanos (CTRL) y en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). El área gris indica el intervalo normal para el parámetro. D, E, F. Las gráficas de barras dan las mediciones del tono de contracción del esfínter anorrectal (mmHg), la respuesta refleja (ml) y el volumen de urgencia (ml) por manometría anorrectal en sujetos sanos (CTRL) y en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). El área gris indica el intervalo normal para el parámetro. Se incluyeron en la evaluación N=20 CTRL y n=60 T1D+ESRD. G1-G2, I1-12, K1-K2, M1-M2, O1-O2, Q1-Q2. Imágenes representativas de tinción histológica con hematoxilina y eosina (HyE), células MIB1 inmunoteñidas, análisis ultraestructural de estructuras neurales con flechas rojas que indican la localización y presencia de vesículas neuroendocrinas, células 5HT+ inmunoteñidas, células aldehído deshidrogenasa (Aldh)+, y expresión de EphB2+, en muestras biópticas obtenidas de sujetos sanos (CTRL) e individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). Barra de escala de análisis ultraestructural: 2000 nm. Aumento original: 100X en G1-G2; 400X en I1-I2, K1-K2; 40X en O1-O2; 200X, en Q1-Q2. Barra de escala 80 micrómetros. H, J, L, N, P, R. Gráficas de barras que dan la medición de criptas, células MIB1+, de vesículas neuroendocrinas de terminales nerviosos (número de casos con> 3 vesículas NE detectadas por terminal nervioso), de células 5HT+, Aldh+, y de expresión de EphB2+ (puntuación de intensidad 0-5) en sujetos de CTRL y T1D de larga duración (T1D+ESRD). Se incluyeron N=20 cTrL y n=60 T1D+ESRD individuos en la evaluación. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: GSRS, Escala de Evaluación de Síntomas Gastrointestinales; CoSC, células madre intestinales; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; HyE, hematoxilina y eosina; MIB1, anticuerpo contra Ki67; EphB2, receptor 2 de efrina B; Aldh, aldehído deshidrogenasa; 5HT, serotonina; NE, vesículas neuroendocrinas.
Figura 2. La enteropatía diabética en T1D de larga duración se asocia con un defecto en CoSC. A, B. Diagramas de puntos de flujo representativos de células EphB2bajo, EphB2medio y EphB2alto en sujetos sanos (CTRL) e individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). C, D, E. Las gráficas de barras representan los resultados del análisis de citometría de flujo de las células EphB2hi+, EphB2hi+ LGR5+ y EphB2+h-TERT+ en criptas recién aisladas (n=10 CTRL y n=10 T1D+ESRD). F, G, H. Las gráficas de barras representan datos de expresión de marcadores de CoSC EphB2, LGR5, h-TERT como expresión de ARNm normalizada medida por RT-PCR cuantitativa en criptas intestinales aisladas. Todas las muestras se experimentaron por triplicado y se normalizaron respecto a la expresión del gen de mantenimiento ACTB (AACt). I. El diagrama de dispersión representa los marcadores de firma de CoSC y el perfil de transcriptoma de células madre examinado en criptas intestinales recién aisladas de n=10 sujetos sanos (CTRL) y n=10 individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). J1-J2. Imágenes representativas de mini intestinos cultivadas in vitro durante 8 días obtenidos de criptas previamente aisladas de individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) y sujetos sanos (CTRL). Aumento 10X. Barra de escala 50 micrómetros. K. La gráfica de barras muestra el % de mini intestinos desarrollados del total a los 8 días de cultivo de criptas intestinales recién aisladas de n=10 CTRL y n=10 T1D+ESRD individuos. L1-L4. Imágenes representativas de mini intestinos obtenidos de criptas previamente aisladas de sujetos sanos (CTRL) y cultivadas durante 8 días en las siguientes condiciones: L1=suero normal (FBS) glucosa normal (5 mM); L2= suero de T1D+ESRD glucosa normal; L3=suero normal alto contenido en glucosa (35 mM); L4= suero de T1D+ESRD alto contenido en glucosa. Aumento 10X. Barra de escala 50 micrómetros. M. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados del total a los 8 días de cultivo de criptas intestinales recién aisladas cultivadas con las siguientes condiciones: suero normal (FBS) glucosa normal (5 mM); suero de T1D+ESRD glucosa normal; suero normal alto nivel de glucosa (35 mM); suero de T1D+ESRD alto contenido en glucosa. La significación estadística se ha calculado dentro de cada grupo (glucosa normal suero normal, medio alto nivel de glucosa, medio suero de T1D de larga duración, alto nivel de glucosa suero de T1D de larga duración) comparando diferentes condiciones de cultivo. La comparación en la gráfica de barras se refiere a todas las condiciones frente a suero normal glucosa normal. N. Perfil de transcriptoma que representa la expresión de marcadores de firma de CoSC en criptas aisladas obtenidas de sujetos sanos y cultivadas con/sin alto nivel de glucosa y/o suero de T1D de larga duración. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; EphB2, receptor 2 de efrina B; LGR5, receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repetición rica en leucina; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina; FBS, suero fetal bovino.
Figura 3. El IGF-I y la IGFBP3 circulantes están alterados en la T1D de larga duración y su manipulación in vitro induce efectos profundos sobre el crecimiento y la autorrenovación de CoSC. A. El mapa de calor representa el perfil proteómico en la T1D de larga duración (T1D+ESRD) en comparación con sujetos sanos (CTRL). El conjunto de datos completo de proteínas identificadas y cuantificadas se sometió a análisis estadístico (p <0.01). Las proteínas expresadas significativamente de forma diferencial se analizaron adicionalmente mediante agrupamiento jerárquico. Se analizaron sueros de n=10 CTRL y n=10 T1D+ESRD individuos. B. La gráfica de barras representa la intensidad de LFQ para una proteína única extrapolada del análisis proteómico no dirigido, la proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3 (IGFBP3). C1-C2. Imágenes representativas (aumento 40X) de la expresión de IGFBP3 en el hígado. IGFBP3 se expresa de forma leve y difusa en el parénquima hepático de sujetos sanos (C1), mientras que es más positivo por zonas en individuos diabéticos de larga duración (C2). D. La gráfica de barras representa los niveles de IGFBP3 medidos por ELISA en los líquidos sobrenadantes de la línea celular de hepatoma humano inmortalizada (HuH-7) cultivada durante 5 días con diferentes concentraciones de glucosa (35 mM: glucosa alta; 20 mM: glucosa intermedia; 5 mM: glucosa normal). Los experimentos se realizaron por triplicado. E. La gráfica de barras representa los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1 (IGF-I) medidos por ELISA en suero de sujetos sanos y T1D de larga duración (T1D+ESRD). F. El análisis de transferencia Western (transferencias recortadas) confirmó la expresión de IGF-IR y TMEM219 en la superficie de la cripta intestinal. La evaluación de la expresión total de IGF-IR por WB incluye la detección de IGF-IRa, una subunidad de la proteína completa de IGF-IR. Imágenes representativas de hibridación in situ de TMEM219 (G1 control negativo, G2 tinción de TMEM219) realizadas en muestras de biopsia de mucosa rectal obtenidas de CTRL. Aumento 20X. G1-G2. Imágenes representativas de la hibridación in situ de TMEM219 (G1 control negativo, G2 tinción de TMEM219) realizadas en muestras de biopsia de mucosa rectal obtenidas de CTRL. Aumento 400X. H. La gráfica de barras representa la expresión normalizada de ARNm de TMEM219 (receptor de IGFBP3) usando el método de AACt. Se evaluaron N=5 sujetos por grupo. I. La gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados del total obtenidos de individuos con T1D de larga duración en diferentes condiciones y que muestra el efecto de IGF-I, IGFBP3 y anti-IGF-IR. Los valores de p son relativos a las condiciones basales y la adición de IGF-I al cultivo. J. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de Caspasa 8 y 9 en criptas aisladas de sujetos sanos cultivadas en presencia de IGFBP3 e IGF-I IGFBP3, realizado por triplicado. K. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados del total a los 8 días de cultivo, obtenidos de sujetos sanos y cultivado en presencia de un inhibidor de Pan-Caspasa, inhibidores selectivos de Caspasa 8, 9 y 3, y IGFBP3. El ensayo se realizó por triplicado. L. Gráficas de barras que agrupan el % de mini intestinos desarrollados del total obtenidos de sujetos sanos y cultivados en diferentes condiciones (glucosa normal suero normal, alto contenido el glucosa suero normal, suero de T1D+ESRD glucosa normal, suero de T1D+ESRD alto contenido en glucosa) y muestran el efecto de IGF-I, IGFBP3 y anti-IGF-IR. Los valores de p son relativos a las condiciones basales (medio solo, medio alto nivel de glucosa, medio suero de T1D de larga duración, alto nivel de glucosa suero de T1D de larga duración). Se han calculado valores de p adicionales para comparar la diferencia en el crecimiento del mini intestino entre las siguientes condiciones: medio solo frente a medio alto nivel de glucosa, frente a medio alto nivel de glucosa suero de T1D de larga duración). El ensayo se llevó a cabo por triplicado. M. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados del total obtenidos de sujetos sanos, cultivados durante 8 días, expuestos a TMEM219 reconocido con ARNip y finalmente comparados con criptas que expresan TMEM219 en medio solo y en medio alto nivel de glucosa suero de T1D de larga duración. El ensayo se llevó a cabo por triplicado. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; "p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IGF-IR, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, betaactina; LFQ, cuantificación sin marcaje; SEM, error estándar de la media; ARNip, ARN interferente pequeño; inhib, inhibidor
Figura 4. Efectos de la díada periférica IGF-I/IGFBP3 en mini intestinos in vitro derivados de una célula individual y en la cascada de caspasas. La manipulación de la díada periférica IGF-I/IGFBP3 altera la evolución de la enteropatía diabética en un modelo preclínico de enteropatía diabética, mientras que el tratamiento de la T1D de larga duración con trasplante simultáneo de páncreas-riñón (SPK) mejora los síntomas intestinales, la motilidad y la morfología. A. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de TMEM219, LRP1, TGF-p tipo I y II, en células individuales separadas EphB2+ obtenidas de criptas de sujetos sanos. Los experimentos se realizaron por triplicado. B. Gráficas de barras que muestran el % de mini intestinos derivados de células individuales desarrollados (del total) obtenidos de células EphB2+ separadas de criptas recién aisladas de sujetos sanos y cultivadas en diferentes condiciones (glucosa normal suero normal, alto nivel de glucosa suero normal, suero de T1D+ESRD glucosa normal, suero de T1D+ESRD alto nivel de glucosa) y mostrando el efecto de IGF-I e IGFBP3. Los valores de p son respecto a las condiciones basales. C, D. Diagrama de dispersión que representa el perfil de transcriptoma de apoptosis examinado en criptas intestinales recién aisladas de sujetos sanos (CTRL) e individuos conTID de larga duración (T1D+ESRD) cultivadas con/sin IGFBP3 e IGF-I. Los experimentos se realizaron por triplicado. E. Intento esquemático de representar el efecto de IGF-I y IGFBP3 circulantes en las CoSC. F, G, I. Gráficas de rectas que dan el número de criptas (B), la profundidad de las criptas (C) y el ancho de las criptas (E) evaluadas en las secciones del tracto intestinal inferior recolectadas al inicio y después de 8 semanas de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética (B6+STZ), B6 naive (WT) y B6 naive tratados con IGFBP3 (WT+IGFBP3). WT: genéticamente intactos, STZ: tratado con estreptozoticina. Se evaluaron N=3 ratones por grupo. H1-H3. Imágenes representativas de criptas intestinales en secciones de HyE de ratones WT, B6+STZ que desarrollan enteropatía diabética, y naive B6 tratados con IGFBP3 (WT+IGFBP3). Aumento de la histología, 400X. J. Gráfica de barras que representa el número de células Aldh+/mm2 en secciones inmunoteñidas de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética, WT y B6 naive tratados con IGFBP3 (WT+IGFBP3). K1-K3. Imágenes representativas de células Aldh+ en secciones inmunoteñidas del tracto intestinal inferior recogidas de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética, WT y B6 naive tratados con IGFBP3 (WT+IGFBP3). Aumento de histología, 400X. L, N, P. Las gráficas de barras dan la medición de las células MIB1+ y Aldh+, y la expresión de EphB2+ (puntuación de intensidad 0-5) en los cuatro grupos de sujetos (n=20 CTRL, n=30 SPK, n=K+T1D y n=60 T1D+Es Rd ). M1-M2, O1-O2, Q1-Q2. Imágenes representativas de células MIB1+ y Aldh+ y expresión de EphB2+ en muestras biópticas de mucosa rectal inmunoteñida de T1D+ESRD que se sometieron solo a trasplante de riñón (K+T1D) o simultáneo de páncreas-riñón (SPK) a los 8 años de seguimiento. Histología 400 X en M1-M2 y O1-O2, 20X en Q1-Q2. Barra de escala 80 micrómetros. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: WT, genéticamente intacto; STZ, tratado con estreptozoticina; B6, ratones C57BL/6J; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IGF-IR, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; SPK, trasplante simultáneo de riñón y páncreas; K+T1D, solo trasplante renal en diabetes tipo 1; HyE, hematoxilina y eosina; MIB1, anticuerpo contra Ki67; EphB2, receptor 2 de efrina B; Aldh, aldehído deshidrogenasa; SEM, error estándar de la media.
Figura 5. El tratamiento de la T1D de larga duración con SPK repone las CoSC y restablece el perfil de firma de CoSC y el desarrollo del mini intestino a través del restablecimiento de IGF-I e IGFBP3 circulantes. A, B, C. Las gráficas de barras representan los resultados del análisis de citometría de flujo de células EphB2hi+, EphB2hi+ LGR5+, EphB2+h-TERT+ obtenidas de criptas aisladas en T1D de larga duración (basal), T1D+ESRD que se sometieron a trasplante de riñón y páncreas (SPK) o solo de riñón (K+T1D) a los 8 años de seguimiento. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. D, E, F. Las gráficas de barras representan la expresión normalizada de ARNm de marcadores de células madre intestinales EphB2, LGR5, h-TERT, medidos por RT-PCR cuantitativa en criptas intestinales aisladas obtenidas de T1D de larga duración (basal), T1D+ESRD que se sometieron a trasplante de riñón y páncreas (SPK) o riñón solo (K+T1D) a los 8 años de seguimiento. Todas las muestras se experimentaron por triplicado y se normalizaron respecto a la expresión del gen de mantenimiento ACTB usando el método de AACt. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. G. El análisis de transferencia Western representa la expresión de EphB2, LGR5, h-TERT en criptas intestinales aisladas de los cuatro grupos a los 8 años de seguimiento. Se evaluaron N=5 sujetos por grupo. H. La gráfica de barras muestra el % de mini intestinos desarrollados del total a los 8 días de cultivo de criptas intestinales recién aisladas obtenidas de individuos con T1D de larga duración (basal), sujetos SPK y K+T1D a los 8 años de seguimiento. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. I. El mapa de calor representa el perfil transcriptómico del marcador de firma de CoSC examinado en criptas intestinales recién aisladas de individuos CTRL, T1D de larga duración (T1D+ESRD), sujetos SPK y K+T1D a los 8 años de seguimiento. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. J. La gráfica de barras representa los niveles de IGF-I medidos por ELISA en suero de los cuatro grupos de sujetos a los 8 años de seguimiento. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. K. La gráfica de barras representa los niveles de IGFBP3 medidos por ELISA en suero de los cuatro grupos de sujetos. Se evaluaron N=20 sujetos por grupo. L, M Correlación entre los niveles en el suero de IGFBP3 y los síntomas intestinales evaluados usando el cuestionario de GSRS (0-7) en n=20 sujetos de los grupos K+T1D (L) y SPK (M). El análisis se realizó usando ANOVA (p <0.05) al comparar todos los grupos. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; SPK, trasplante simultáneo de riñón y páncreas; EphB2, receptor 2 de efrina B; LGR5, receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repetición rica en leucina; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina; K+T1D, trasplante renal solo en diabetes tipo 1; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; SEM, error estándar de la media.
Figura 6 El tratamiento con la proteína recombinante recientemente generada ecto-TMEM219 (ecto-TMEM219) anula la destrucción del mini intestino mediada por IGFBP3 y preserva las CoSC en el modelo preclínico. A. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados del total obtenidos de sujetos sanos en diferentes condiciones y que muestra el efecto de ecto-TMEM219 en diferentes concentraciones (relación molar 1:2, 1:1 y 2:1 en comparación con IGFBP3) en mini intestinos tratados con IGFBP3 y en los expuestos a alta cantidad de glucosa. Los valores de p son relativos a las condiciones basales. B. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de EphB2 en criptas aisladas de sujetos sanos cultivados en presencia de IGFBP3 y ecto-TMEM219 IGFBP3, realizados por triplicado. C. D. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de Caspasa 8 y 9 en criptas aisladas de sujetos sanos cultivadas en presencia de IGFBP3 y ecto-TMEM219 IGFBP3, realizados por triplicado. E, F, G. Gráficas de rectas que dan el número de criptas (E), la profundidad de las criptas (F) y el ancho de las criptas (G) evaluados en las secciones del tracto intestinal inferior recogidas al inicio y después de 8 semanas, de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética (B6+STZ), B6 naive (WT) y STZ-B6 tratados con ecto-TMEM219. WT: genéticamente intactos, STZ: tratado con estreptozoticina. Se evaluaron N=3 ratones por grupo. H. Gráfica de recta que da el peso al inicio y después de 8 semanas de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética (B6+STZ), B6 naive (WT) y ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética tratados con ecto-TMEM219. WT: genéticamente intactos, STZ: tratado con estreptozoticina. Se evaluaron N=3 ratones por grupo. I. Gráfica de barras que representa los resultados del análisis de citometría de flujo de células EphB2+aisladas de muestras intestinales recogidas de ratones B6 naive, ratones B6 tratados con STZ y en ratones STZ-B6 tratados con ecto-TMEM219 a las 8 semanas. J. Histogramas de flujo representativos de células EphB2+ aisladas de criptas aisladas de ratones B6 naive, ratones B6 tratados con STZ y ratones STZ-B6 tratados con ecto-TMEM219 a las 8 semanas. Se evaluaron N=3 a 5 ratones por grupo. K. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de EphB2 en muestras intestinales recogidas de ratones naive B6, ratones B6 tratados con STZ y en ratones STZ-B6 tratados con ecto-TMEM219 a las 8 semanas. L, M. Gráfica de barras que representa la expresión de ARNm normalizada de Caspasa 8 (K) y Caspasa 9 (L) en muestras intestinales recogidas de ratones B6 naive, ratones B6 tratados con STZ y en ratones STZ-B6 tratados con ecto- TMEM219 a las 8 semanas. N. Gráfica de barras que representa los niveles de IGFBP3 circulantes medidos en ratones B6 naive (WT) y ratones B6 tratados con STZ (B6+STZ) y en ratones B6+STZ tratados con ecto-TMEM219 a las 8 semanas. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: WT, genéticamente intactos; StZ, tratado con estreptozoticina; B6, ratones C57BL/6J; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; CoSC, células madre de colon; HyE, hematoxilina y eosina; EphB2, receptor 2 de efrina B; SEM, error estándar de la media, T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, betaactina.
Figura 7. Evaluación de los niveles de IGFBP3 en el suero (A) y orina (B) de individuos de CTRL, T1D y T1D+ESRD. (C) Correlación entre los niveles de IGFBP3 en suero y orina en todos los sujetos de la cohorte evaluada para este estudio. (D-E) Correlación entre los niveles en el suero de IGFBP3 y eGFR calculado con la fórmula MDRD en sujetos con T1D+ESRD en diálisis (D) y con T1D con eGFR> 15 ml/min/m2 (E). (F) Correlación entre los niveles de IGFBP3 en suero y orina en todos los sujetos de la cohorte evaluada para este estudio. El área gris indica el intervalo normal dentro de los niveles de IGFBP3 en orina y suero.
Figura 8. Perfil de CoSC, generación in vitro de mini intestinos, expresión de IGFBP3 en el hígado y de IGF-IR en CoSC en T1D de larga duración y sujetos sanos. A-B. Diagrama de puntos de flujo representativo de la estrategia de activación de células Pr en sujetos sanos (CTRL) y en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). C. Las gráficas de barras muestran los resultados del análisis de citometría de flujo de células PI- en criptas recién aisladas (n=10 CTRL y n=10 T1D+ESRD). D-E. Diagrama de puntos de flujo representativo de células EphB2hiLGR5+ (D) y EphB2+h-TERT+ en sujetos sanos (CTRL) y en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). F. El análisis de transferencia Western (transferencias recortadas) confirma la expresión baja de EphB2, LGR5, h-TERT en criptas intestinales aisladas in vitro de individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). Las manchas de longitud completa se presentan en la figura 5. Se evaluaron N=5 sujetos por grupo. G. Diagrama de dispersión que representa el perfil del transcriptoma de células madre examinado en criptas intestinales recién aisladas de sujetos sanos (CTRL) y de individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD). Una tabla resume los genes y las rutas analizadas (Tabla S1). Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. H-I. Imágenes representativas de criptas recién aisladas obtenidas de sujetos sanos y de individuos con T1D de larga duración teñidas con DAPI. Aumento 20X. J. Gráfica de barras que representa el porcentaje de mini intestinos de formación eficaz de criptas cultivadas en placa obtenidas de sujetos sanos y de individuos con T1D de larga duración a las 12 horas. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. K. Gráfica de barras que representa la puntuación combinada calculada de intensidad/difusión de IGFBP3 (0­ 6) tras la evaluación inmunohistoquímica en muestras de hígado obtenidas de sujetos sanos y de individuos con T1D de larga duración. Se evaluaron N=3 sujetos por grupo. L1-L6. Imágenes representativas (aumento 63X) de la expresión de IGFBP3 en el hígado. La inmunofluorescencia confirmó la colocalización de células Hep Par-1 y la expresión de IGFBP3 (L1-L3), mientras que no se observó colocalización entre IGFBP3 y las células CD163+ (L4-L6). M. La gráfica de barras representa la expresión de ARNm normalizada del receptor de IGF-I (IGF-IR) medida por RT-PCR cuantitativa en criptas intestinales aisladas. Todas las muestras se procesaron por triplicado y se normalizaron respecto al gen de mantenimiento ACTB usando el método de AACt. N1-N2. Imágenes representativas de células IGF-IR+ en muestras de mucosa rectal obtenidas de individuos de CTRL y con T1D+ESRD. La flecha negra indica células positivas en la base de la cripta. Aumento 200X. O1-O2. Imágenes representativas de hibridación in situ de TMEM219 realizadas en muestras de biopsia de mucosa rectal obtenidas de individuos de CTRL y con T1D+ESRD. Ampliación 400X. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01. Abreviaturas: PI, yoduro de propidio; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IGF-IR, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; EphB2, receptor 2 de efrina B; LGR5, receptor 5 acoplado a proteína G que contiene repeticiones ricas en leucina; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina; SEM, error estándar de la media.
Figura 9 La expresión de caspasas en mini intestinos cultivados con IGF-I/IGFBP3 y la falta de efecto de otros factores circulantes confirmaron el efecto pro-apoptótico principal de IGFBP3 en el desarrollo de mini intestinos. A. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de la Caspasa 8 en criptas aisladas de individuos con T1D+ESRD cultivadas en presencia de IGFBP3, IGF-I+IGFBP3 y IgF-I, realizadas por triplicado. B. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de la Caspasa 9 en criptas aisladas de individuos con T1D+ESRD cultivadas en presencia de IGFBP3, IGF-I+IGFBP3 y IgF-I, realizadas por triplicado. C, D. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados a partir de sujetos sanos (C) y de individuos con T1D de larga duración (D), cultivados en presencia de medio con FBS y medio con suero obtenido de sujetos sanos, "suero de CTRL". El ensayo se realizó por triplicado. E. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados del total obtenidos de sujetos sanos, cultivados durante 8 días, expuestos a TMEM219 reconocido con ARNip y anti-IGF-IR, y finalmente comparados con criptas que expresan TMEM219 en medio solo y en medio+ alto nivel de glucosa+suero de T1D de larga duración. El ensayo se realizó por triplicado. F, G. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados a los 8 días de cultivo, obtenidos de sujetos sanos (F) y de individuos con T1D de larga duración (G), cultivados en presencia de medio solo y varias moléculas identificadas con análisis proteómico (Tabla S7). El ensayo se realizó por triplicado. H. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos obtenidos de sujetos sanos y cultivados en presencia de medio solo, medio+alto nivel de glucosa, medio+alto nivel de glucosa y suero de T1D de larga duración, IGF-I, IGFBP3 con/sin insulina. El ensayo se realizó por triplicado. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001. Abreviaturas: IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IGF-IR, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina; SEM, error estándar de la media; ARNip, ARN interferente pequeño; ALDOA, fructosa-bisfosfato aldolasa A; RNASA, ribonucleasa pancreática; MASP, serina proteasa 1 asociada a lectina de unión a manano.
Figura 10. Efecto de la díada IGF-I/IGFBP3 en mini intestinos derivados de células individuales, en el perfil de transcriptoma de células madre y en rutas apoptóticas. A1-A3. Imágenes representativas de mini intestinos derivados de células individuales, cultivados durante 8 días in vitro obtenidos de células separadas EphB2+ previamente aisladas de sujetos sanos y cultivadas con medio solo, medio+IGFBP3, medio+Glucosa 35 mM+suero de T1D de larga duración. Las imágenes se muestran con un aumento 10X. Barra de escala 50 micrómetros. B, C, D. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de Caspasa 8, Caspasa 9 y Ki67 en mini intestinos derivados de células individuales cultivados a partir de células EphB2+ separadas por citometría de flujo aisladas de sujetos sanos y cultivadas en diferentes condiciones. El ensayo se realizó por triplicado. E, F. Diagrama de dispersión que representa el perfil de transcriptoma de células madre examinado en criptas intestinales recién aisladas de sujetos sanos (CTRL) y de individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) cultivadas con/sin IGFBP3 y IGF-I. Los ensayos se realizaron por triplicado. G, H. Gráfica de dispersión que representa el perfil de transcriptoma de apoptosis examinado en criptas intestinales recién aisladas de sujetos sanos (CTRL) y de individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) cultivadas con/sin IGF-I. Una tabla resume los genes y las rutas analizadas (Tabla S3). Los ensayos se realizaron por triplicado. I, J. Gráfica de barras que agrupa el % de mini intestinos desarrollados a partir de criptas obtenidas de sujetos sanos (I) y T1D de larga duración (J) y después cultivadas en presencia de medio solo, ligando Fas (FasL), peróxido de hidrógeno (H2O2 ) y factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a). El ensayo se realizó por triplicado. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; CoSC, células madre de colon; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina; SEM, error estándar de la media; FasL, Ligando Fas; H2O2 , peróxido de hidrógeno; TNF-a, factor de necrosis tumoral alfa.
Figura 11. Manipulación de la diada IGF-I/IGFBP3 en modelos preclínicos de enteropatía diabética. A. Gráfica de barras que representa los niveles circulantes de IGFPB3 medidos en ratones B6 naive (WT) y ratones B6 tratados con STZ (B6+STZ). B. Gráfica de barras que representa los niveles circulantes de IGF-I medidos en ratones B6 naive (WT) y ratones B6 tratados con STZ (B6+STZ). C. Gráfica de barras que representa los niveles en el suero de insulina medidos en ratones B6 naive (WT) y ratones B6 tratados con STZ (B6+STZ). D, E, F: Gráficas de rectas que dan el número de criptas (D), profundidad de las criptas (E) y ancho de las criptas (F) evaluados en secciones del tracto intestinal inferior recogidas al inicio y después de 8 semanas, de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética (B6+STZ), B6 naive (WT) y ratones STZ-B6 tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3) o con IGF-I (B6+STZ+IGF-I). WT: genéticamente intactos, STZ: tratado con estreptozoticina. Se evaluaron N=3 ratones por grupo. G. Gráfica de barras que representa el número de células Aldh+/mm2 en secciones inmunoteñidas de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética, WT y ratones STZ-B6 tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3) o con IGF-I (B6+STZ+IGF-I). H1-H2: Imágenes representativas de criptas intestinales en secciones de HyE de ratones STZ-B6 tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3), (H1) o con IGF-I (B6+STZ+IGF-I), (H2). Aumento de histología, 400X. I. Gráfica de rectas que da el peso de ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética (B6+STZ), B6 naive (WT), ratones B6 tratados con STZ que desarrollan enteropatía diabética tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3). WT: genéticamente intactos, STZ: tratado con estreptozoticina. Se evaluaron N=3 ratones por grupo. J. Gráfica de barras que representa los resultados del análisis de citometría de flujo de células EphB2+ en muestras intestinales recogidas de ratones B6 naive, ratones B6 tratados con STZ y en ratones STZ-B6 tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3). K, L. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de EphB2 (K) y LGR5 (L) en muestras intestinales recogidas de ratones B6 naive, ratones B6 tratados con STZ y en ratones sTz-B6 tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3). M, N. Gráfica de barras que representa la expresión normalizada de ARNm de Caspasa 8 (M) y Caspasa 9 (N) en muestras intestinales recogidas de ratones B6 naive, ratones B6 tratados con STZ y en ratones STZ-B6 tratados con IGFBP3 (B6+STZ+IGFBP3). Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) a menos que se indique de manera diferente. *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Abreviaturas: WT, genéticamente intactos; StZ, tratado con estreptozoticina; B6, ratones C57BL/6J; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; CoSC, células madre de colon; HyE, hematoxilina y eosina; EphB2, receptor 2 de efrina B; Aldh, aldehído deshidrogenasa; SEM, error estándar de la media.
Figura 12. El tratamiento de T1D de larga duración con SPK mejora la enteropatía diabética. A, B, C. Las gráficas de barras representan la puntuación de dolor abdominal, diarrea y estreñimiento de acuerdo con el cuestionario de GSRS en sujetos sanos (CTRL), individuos con T1D de larga duración (basal), T1D+ESRD que se sometieron a trasplante de riñón y páncreas (SPK) o de riñón solo (K+T1D). El área gris indica un intervalo normal para todos los parámetros. Las estadísticas se expresan como media ± SEM. D1-D2, E1-E2, G1-G2, J1-J2. Imágenes representativas de tinción con hematoxilina y eosina (HyE) y análisis ultraestructural de estructuras neurales (las flechas rojas indican localización y presencia de vesículas neuroendocrinas), células de Schwann (las flechas rojas indican alteraciones del citoplasma) y células 5HT+, llevado a cabo en muestras de biopsia de mucosa rectal obtenidas de T1D+ESRD que se sometieron a trasplante de riñón y páncreas (SPK) o de riñón solo (K+T1D) a los 8 años de seguimiento. Ampliación 400X. F, H, I, K. Las gráficas de barras dan las mediciones de vesículas neuroendocrinas (% de casos con >3 vesículas NE detectadas por terminal nervioso), % de células de Schwann con núcleos picnóticos y alteraciones del citoplasma (% de casos positivos) usando microscopía electrónica, células 5HT+, llevadas a cabo en muestras biópticas obtenidas de la mucosa rectal de individuos de CTRL, con T1D de larga duración (basal), T1D+ESRD que se sometieron a trasplante de riñón y páncreas (SPK) o riñón solo (K+T1D) durante un período de seguimiento de 8 años. Las estadísticas se expresan como media ± SEM. Se evaluaron N=20 CTRL, n=30 SPK, n = 30 K+T1D y n=60 T1D+ESRD individuos. Las estadísticas se expresan como media ± SEM. Todos los parámetros examinados eran estadísticamente significativamente diferentes cuando se comparaban diferentes grupos como sigue: *p<0.01; **p<0.001; ***p<0.0001. Se evaluaron N=10 sujetos por grupo. Abreviaturas: GSRS, Escala de Evaluación de Síntomas Gastrointestinales; SPK, trasplante simultáneo de riñón y páncreas; K+T1D, trasplante solo de riñón en diabetes tipo 1; CTRL, sujetos sanos; T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; 5HT, serotonina; H&E, hematoxilina y eosina; NGF, factor de crecimiento neural; SEM, error estándar de la media; NE, vesículas neuroendocrinas.
Figura 13. Análisis de células madre de colon, IGF-IR y perfil proteómico de factores circulantes en la enteropatía diabética en grupos SPK y K+T1D. A1-A6. Imágenes representativas de mini intestinos, cultivados durante 8 días in vitro obtenidos de criptas aisladas previamente de individuos con T1D de larga duración, T1D+ESRD que se sometieron a trasplante de riñón y páncreas (SPK) o riñón solo (K+T1D) a los 8 años de seguimiento. Las imágenes se muestran con aumento 5X y 10X. Barra de escala de 10 micrómetros. B. Diagrama de dispersión que representa el perfil del transcriptoma de células madre examinado en criptas intestinales recién aisladas de individuos SPK. Se evaluaron N=3 sujetos. C. Las gráficas de barras representan los niveles de expresión relativa del receptor de IGF-I (IGF-IR) en criptas aisladas de sujetos sanos (CTRL), individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD), SPK y K+T1D medidos por RT-PCR cuantitativa. Todas las muestras se experimentaron por triplicado y se normalizaron respecto al nivel de expresión relativa de ACTB usando el método de AACt. Los resultados se expresan como media ± SEM. D. El mapa de calor representa el perfil proteómico de T1D de larga duración en comparación con los sujetos CTRL y SPK a los 8 años de seguimiento. El conjunto de datos completo de proteínas identificadas y cuantificadas se sometió a análisis estadístico (p<0,05). Las proteínas expresadas significativamente de forma diferencial se analizaron adicionalmente por agrupación jerárquica. Las estadísticas se expresan como media ± SEM. Se evaluaron sueros de n=10 sujetos por grupo. Todos los parámetros examinados eran estadísticamente significativamente diferentes cuando se comparaban diferentes grupos como sigue: *p <0.01. Abreviaturas: T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; SPK, trasplante simultáneo de riñón y páncreas; K+T1D, trasplante solo de riñón en diabetes tipo 1; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IGF-IR, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; SEM, error estándar de la media.
Figura 14. Correlación de los síntomas intestinales con los niveles de insulina, HbA1C y glucosa en sangre en los grupos SPK y K+T1D. A, B. Correlación entre los niveles de insulina en suero y los síntomas intestinales evaluados usando el cuestionario de GSRS y considerando el ítem con la puntuación más alta (0-7) en n=20 sujetos del grupo K+T1D (A) y SPK (B). El análisis se realizó usando ANOVA (p <0.05) al comparar todos los grupos. C. Niveles de insulina en suero medidos usando el método de insulina libre en n=20 sujetos del grupo K+T1D (A) y SPK (B). Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM). D, E. Correlación entre los niveles en suero de glucohemoglobina (HbA1C) y los síntomas intestinales evaluados usando el cuestionario de GSRS (0-7) en n=20 sujetos del grupo K+T1D (A) y SPK (B). El análisis se realizó usando ANOVA (p<0.05) al comparar todos los grupos. F, G. Correlación entre los niveles de glucosa en sangre (glucemia) y los síntomas intestinales evaluados usando el cuestionario de GSRS (0-7) en n=20 sujetos del grupo K+T1D (A) y SPK (B). El análisis se realizó usando ANOVA (p<0.05) al comparar todos los grupos. Abreviaturas: T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; SPK, trasplante simultáneo de riñón y páncreas; K+T1D, trasplante solo de riñón en diabetes tipo 1; iGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 15. Expresión de marcadores de linajes celulares en mini intestinos expuestos a diferentes condiciones de cultivo. A1-A4, B1-B4, C1-C4, D1-D4, E1-E4. Imágenes representativas (aumento 10X) de la expresión de citoqueratina 20 (KRT20), vimentina, sinaptofisina y aldehído deshidrogenasa (ALDH) en mini intestinos obtenidos de criptas aisladas de sujetos sanos, individuos de CTRL (A1-A4) y T1D+ESRD (B1-B4), cultivados con IGFBP3 (C1-C4), glucosa 35 mM (Dl-D4) y glucosa 35 mM) suero de T1D de larga duración (suero de T1D+ESRD) IGF-I (E1-E4). La inmunofluorescencia confirmó que la expresión de todos los marcadores de linaje se reduce en los mini intestinos obtenidos de individuos con T1D+ESRD en comparación con CTRL (A1-A4, B1-B4), siendo la ALDH el marcador menos expresado (B4). También se detectó una disminución de la expresión de ALDH en mini intestinos tratados con IGFBP3 (C4), mientras que los mini intestinos expuestos a suero con alto nivel de glucosa y T1D de larga duración y tratados con IGF-I mostraron una recuperación evidente de la expresión de la ALDH. F. Gráfica de barras que representa la expresión de TMEM219, KRT20, molécula de adhesión celular epitelial (EpCam) y cromogranina A (CHGA) en células no madre (células EphB2‘) medidas por RT-PCR cuantitativa. Todas las muestras se experimentaron por triplicado y normalizaron respecto al nivel de expresión relativa de ACTB usando el método de AACt. Los resultados se expresan como media ± SEM. Abreviaturas: T1D, diabetes tipo 1; ESRD, enfermedad renal en etapa terminal; CTRL, sujetos sanos; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IF, inmunofluorescencia; KRT20, citoqueratina 20, ALDH, aldehído deshidrogenasa, EpCam, molécula de adhesión celular epitelial; CHGA, cromogranina A; RT-PCR, reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real; ACTB, beta-actina.
Figura 16. Estrategia de selección para probar proteínas candidatas en un ensayo de mini intestinos in vitro.
Diagrama de flujo que representa la estrategia usada para seleccionar proteínas candidatas basada en el perfil proteómico para probar en el ensayo in vitro de mini intestinos.
Figura 17. Análisis de mini intestinos desarrollados usando los criterios cuantitativos del dominio de cripta. A-P. Gráficas de barras que agrupan el % de mini intestinos desarrollados con al menos 1 dominio de cripta detectable en diferentes condiciones ya indicadas a lo largo del artículo.
Figura 18. Los niveles de IGFBP3 periférico aumentan en individuos con enfermedad inflamatoria intestinal en comparación con sujetos sanos.
Figura 19. Los niveles de IGFBP3 periférico aumentan en condiciones pre-diabéticas y diabéticas en sujetos humanos con T1D (A) y T2D (B). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; CTRL, sujetos sanos; T1D, diabetes tipo 1; T2D, diabetes tipo 2; AutoAb positivo: sujetos no diabéticos en riesgo de desarrollar T1D con detección positiva de anticuerpos contra péptidos de islotes; IGT: tolerancia a la glucosa alterada medida en la OGTT (prueba de tolerancia a la glucosa oral) en ayunas y sin ayuno. NGT: tolerancia a la glucosa normal medida en la OGTT. IFG: tolerancia a la glucosa en ayunas alterada medida en la OGTT y que resulta positiva solo en ayunas.
Figura 20. Los niveles de IGFBP3 periférico aumentan en condiciones pre-diabéticas y diabéticas en modelos murinos de T1D (A) y T2D (B). *p<0.05, **p<0.01, <*> "p <0.001. Abreviaturas: C57BL6/J, ratones B6; B6, ratones naive; NOD, ratones diabéticos no obesos; HFD, dieta alta en grasas, IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 21. La producción de IGFBP3 en hepatocitos humanos primarios aumenta durante la exposición a la glucosa (11 mM, 20 mM, 35 mM) (A) y la inflamación (IFNy 1000 U/ml, más Il-1p 2 ng/ml) (B). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: INF, inflamación (IFNy+Il-1 p); mM, milimolar; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 22. TMEM219 se expresa en islotes humanos (A-C). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: p-ACT, beta-actina.
Figura 23. TMEM219 se expresa en islotes murinos (A) y en una línea celular beta murina (B-D). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: p-TC, línea celular beta murina; p-ACT, beta-actina.
Figura 24. IGFBP3 (50 ng/ml) aumenta la apoptosis y la expresión de caspasa 8 (AB) y reduce la liberación y expresión de insulina (C, D1-D2, E) en mayor medida en comparación con los estímulos proinflamatorios (IFNy+Il-1p) en una línea celular beta murina in vitro. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: IFNy, interferón gamma; lL-1 p, interleucina beta; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; p-TC, línea celular beta murina.
Figura 25. IGFBP3 (50 ng/ml) aumenta la apoptosis (A) y expresión de caspasa 8 en islotes murinos (B con una reducción de insulina (C) in vitro. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0,001.
Figura 26. IGFBP3 (50 ng/ml) aumenta la apoptosis y la expresión de caspasa 8 en islotes humanos (A-B y C1-C2) y reduce la expresión de insulina (D1-D2, E) in vitro. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: Pi, yoduro de propidio; M30, anticuerpo monoclonal M30 que reconoce la citoqueratina 18 escindida por caspasa; INS, insulina, IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 27. La inyección de IGFBP3 (150 pg/día durante 15 días) en ratones C57BL/6 altera la morfología de los islotes in vivo después de 8 semanas de diabetes (A1-A6). Abreviaturas: STZ, estreptozotocina; B6, ratones C57BL6/J naive.
Figura 28. Ecto-TMEM219 (130 ng/ml) previene los efectos apoptóticos asociados con IGFBP3 en la línea celular beta murina (A-B, C1-C3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: p-TC, línea celular beta murina; INS, insulina, IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 29. El tratamiento con Ecto-TMEM219 (130 ng/ml) casi normaliza la expresión de caspasa 8 y de insulina en islotes murinos in vitro. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: IGfBp3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 30. Ecto-TMEM219 (130 ng/ml) previene los efectos apoptóticos asociados a IGFBP3 en islotes humanos (A-B, C1-C3). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001. Abreviaturas: m30, anticuerpo monoclonal M30 que reconoce la citoqueratina 18 escindida por caspasa; INS, insulina; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3.
Figura 31. El tratamiento con Ecto-TMEM219 (130 ng/ml) en ratones diabéticos rescata la insulina sérica (A, C) y los niveles de glucosa en sangre (B). *p<0-05, **p<0.01, ***p<0,001.
Figura 32. Hipótesis de trabajo. Abreviaturas: IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3; IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGF-IR, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1.
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1
Materiales y métodos
Se incluyeron en este estudio 60 individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) registrados en la lista de espera para trasplante simultáneo de páncreas-riñón (SPK) y se compararon con 20 sujetos sanos de edad y sexo semejantes (CTRL). La evaluación de síntomas gastrointestinales, motilidad intestinal y patología de la mucosa intestinal definían la DE. Las CoSC se identificaron en criptas de colon purificadas basadas en la expresión de marcadores específicos de CoSC (citometría de flujo, RT-PCR, transferencia Western, perfil de transcriptoma). Las propiedades de autorrenovación de las CoSC se valoraron mediante la evaluación del % de mini intestinos desarrollados in vitro y caracterización de su expresión de marcadores de linajes celulares en diferentes condiciones (Fig. 15). Se usó proteómica sérica amplia para detectar factores circulantes que pueden regular las CoSC y después los factores candidatos se probaron en el ensayo de mini intestino in vitro (Fig. 16). Los métodos detallados y el análisis estadístico se describen a continuación. El estudio fue aprobado por el Comité Ético Independiente del Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico Ospedale San Raffaele, Milano, Italia (Enteropathy-Pancreas KidneyTransplantation/ 01 Secchi/Fiorina).
Pacientes y diseño del estudio.
Se incluyeron en este estudio 60 individuos con T1D+ESRD registrados en la lista de espera para trasplante simultáneo de páncreas-riñón (SPK) emparejados por (edad de 41 a 43 años), sexo y duración de la T1D (29.4 ± 1.8 años). También se estudiaron 20 sujetos sanos emparejados por edad y sexo (CTRL), con función renal normal y parámetros glucometabólicos normales. Los sujetos con T1D+ESRD recibían todos tratamiento intensivo con insulina en el momento de la inclusión en el estudio, mientras que al grupo de CTRL no se le estaba administrando ningún medicamento. Todos los sujetos con T1D+ESRD recibían el mismo tratamiento que la terapia antiplaquetaria (ASA) y antihipertensión (inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina), mientras que 40 de los 60 recibían estatinas cuando se incluyeron en el estudio. No se incluyeron sujetos con signos claros de enfermedades inflamatorias intestinales, así como enfermedad celíaca.
Se hizo el seguimiento de los individuos con T1D+ESRD durante 8 años (seguimiento medio: 8.6+1.1 años) después de recibir trasplante SPK (n=30) o K+T1D (n=30) de acuerdo con la evaluación quirúrgica macroscópica en el momento del trasplante. No se incluyeron individuos que tomaran un agente anticoagulante oral. Los individuos SPK eran todos independientes de la insulina durante todo el período de seguimiento, mientras que los individuos K+T1D recibían tratamiento intensivo de insulina subcutánea. Todos los sujetos dieron el consentimiento informado antes de la inclusión en el estudio. Los estudios no incluidos en el seguimiento clínico rutinario fueron tratados por una aprobación adecuada del Comité Ético Independiente (Enteropatiatrapianto/01 Secchi/Fiorina).
Trasplante e inmunosupresión
Los órganos para el trasplante se obtuvieron de donantes fallecidos a través del consorcio de obtención de órganos "Trasplante del Norte de Italia" (NITp, Milán). Después de inducción con ATG (timoglobulina, IMTIX, SANGSTAT), la inmunosupresión se mantuvo usando ciclosporina (mediante niveles entre 100-250 ng/ml) o FK506 (mediante niveles entre 10-15 ng/ml), micofenolato de mofetilo (500-2000 mg/día) y metilprednisolona (10 mg/día). Los esteroides se retiraron en el plazo de 3-6 meses después del trasplante. Todos los pacientes incluidos en los grupos T1D+ESRD y SPK recibían tratamiento antiplaquetario (80% de ASA y 20% de ticlopidina) para prevenir la trombosis del injerto o la fístula. Se examinaron el estado metabólico, función renal y presión arterial durante la inclusión y después del trasplante cada 2 años a partir de entonces. La tasa de filtración glomerular estimada (eGFR) se calculó usando la fórmula de Modificación de la dieta en la enfermedad renal (MDRD, por sus siglas en inglés Modification of Diet in Renal Disease) (Levey et al, 1999).
La escala de evaluación de síntomas gastrointestinales (GSRS)
Los síntomas gastrointestinales se evaluaron mediante el cuestionario de GSRS en sujetos sanos, en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) y en grupos SPK y K+T1D a los 2, 4 y 8 años después del trasplante. La escala de evaluación de síntomas gastrointestinales (GSRS) es un cuestionario que consiste en 15 ítems con una escala de Likert de siete niveles definida por anclas descriptivas (Svedlund et al., 1988). El cuestionario se construyó originalmente como una escala de calificación basada en entrevistas diseñada para evaluar una amplia gama de síntomas gastrointestinales y después se modificó para convertirse en un cuestionario autoadministrado. Cuanto más altas son las puntuaciones, más graves son los síntomas: la escala varía de un valor mínimo de 1 a un valor máximo de 7. Si se interrumpe la participación de un individuo en el estudio, se considerará el valor en la última observación disponible en el análisis. Los ítems se pueden agrupar en cinco dimensiones previamente identificadas basadas en un análisis de factores: síndrome de dolor abdominal (tres ítems), síndrome de reflujo (dos ítems), síndrome de indigestión (cuatro ítems), síndrome de diarrea (tres ítems) y síndrome de estreñimiento (tres ítems). Manometría anorrectal
Los datos sobre la manometría anorrectal ya estaban disponibles en sujetos sanos, y se compararon con los obtenidos llevando a cabo la manometría anorrectal en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) usando una sonda de PVC de 14 Fr de diámetro, punta abierta y diseño personalizado con siete lúmenes y un balón de látex de 4 cm unido al final de la sonda (Bioengineering Laboratories Pic, Milán, Italia) (Carrington et al, 2014; Remes-Troche et al, 2010). La longitud del esfínter se midió después de un período de preinclusión de 10 minutos, se registró la presión anal durante 15 minutos en condiciones de reposo. Después se instruyó a los sujetos para que apretaran el ano lo más fuerte posible y durante el mayor tiempo posible, durante al menos 20 segundos. El estudio de los autores de la invención evaluó los siguientes ítems: tono de reposo, tono de contracción, respuesta refleja y respuesta de urgencia.
Patología, inmunohistoquímica y microscopía electrónica.
El procedimiento de endoscopia colorrectal se llevó a cabo en sujetos sanos, en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD) al inicio y en grupos SPK y K+T1D a los 2, 4 y 8 años después del trasplante usando un sigmoidoscopio óptico de Welch Allyn. Las muestras de la mucosa intestinal se fijaron en formalina tamponada (formaldehído al 4% p/v y tampón de acetato 0,05 M) y se procesaron rutinariamente en cera de parafina. Se tiñeron secciones de 3 |jm de espesor de cada caso incluido, con hematoxilina y eosina (HyE) para las evaluaciones morfológicas. Para la inmunohistoquímica, se montaron secciones de 3 jm de espesor en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se desparafinaron y se hidrataron a través de alcoholes graduados hasta agua. Después de la recuperación del antígeno, llevada a cabo sumergiendo secciones en tampón de citrato 0.01 M, pH 6 durante 10 minutos en un horno microondas a 650 W, así como inhibición de la actividad de peroxidasa endógena, llevada a cabo sumergiendo secciones en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, se llevó a cabo incubación con anticuerpos primarios a 4°C durante 18-20 horas, seguido del procedimiento del complejo de avidina-biotina (Hsu et al, 1981). Las inmunorreacciones se desarrollaron usando tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina al 0.03%, y después las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Harris. Se usaron los siguientes anticuerpos: Ki67 (monoclonal, clon MIB1, dilución 1:100, Dako, Carpinteria, CA, EE.UU.), aldehído deshidrogenasa (monoclonal, clon 44/ALDH, dilución 1:1000, Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ, EE.UU.), EphB2 (monoclonal, clon 48CT12.6.4, dilución 1:200, Lifespan Biosciences, Seattle, WA, EE.UU.), LGR5 (monoclonal, clon 2A2, dilución 1:100, Origene Technologies, Rockville, MD, EE.UU.), hTERT (monoclonal, clon Y182, dilución 1:500, Millipore, Billerica, MA, EE.UU.), glicentina (policlonal, dilución 1:1250, Milab, Malmo, Suecia), polipéptido pancreático (policlonal, dilución 1:500, Península, Belmont, CA, EE.UU.), PYY (policlonal, dilución 1:1000, Biogenesis, Bournemouth, Reino Unido), serotonina (monoclonal, clon YC5, dilución 1:50, Biogenesis), somatostatina (policlonal, dilución 1:550, Dako), IGF-I (policlonal, 1:500, Abcam) e IGF-1R (policlonal, 1:100, Cell Signaling Technologies), (Fiorina et al, 2003). Para estudios ultraestructurales, las muestras se fijaron durante 2 horas a 4°C en una mezcla de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2% en tampón de cacodilato 0.05 M, pH 7.3. Se fijaron posteriormente en tetraóxido de osmio al 1% durante 1 hora a temperatura ambiente, después se deshidrataron y se insertaron en Epon-Araldite. Se cortaron secciones ultrafinas con un cuchillo de diamante y se montaron en rejillas de níquel de n° malla 200, previamente recubiertas con una película Formvar. Las secciones ultrafinas se tiñeron con acetato de uranilo acuoso y soluciones de citrato de plomo de Reynold, y posteriormente se examinaron con un microscopio electrónico Philips Morgagni 268D. Los casos se agruparon según el número de vesículas neuroendocrinas (n >3 y n <3) para el análisis estadístico. Para el aislamiento de criptas, el tejido se recogió en una muestra que contenía una mezcla de antibióticos y se procesó como se describe en el siguiente párrafo. La intensidad de inmunotinción para EphB2 se calificó como de 1 (gradiente de EphB2 negativo a algunas células positivas por cripta por campo) a 5 (gradiente de EphB2 fuerte en todas las criptas longitudinales). Se probó inmunohistoquímicamente un anticuerpo primario anti-IGFBP3 (policlonal, dilución 1:50, Sigma Aldrich) en biopsias hepáticas de pacientes con diabetes tipo 1. Se usaron biopsias hepáticas sin hallazgos patológicos como controles. Todas estas muestras de tejido provienen de los archivos almacenados en la Unidad de Patología del Department of Biomedical, Biotechnological, and Translational Sciences, Universidad de Parma, Parma, Italia. La intensidad de la inmunotinción se calificó como 1 (leve), 2 (moderada) y 3 (fuerte), mientras que su difusión como 1 (focal), 2 (zonal) y 3 (difusa).
Inmunofluorescencia
Las muestras de inmunofluorescencia obtenidas de biopsias hepáticas se observaron usando un sistema confocal (cabezal de barrido LSM 510 Meta integrado con el microscopio invertido Axiovert 200 M; Carl Zeiss, Jena, Alemania) con un objetivo en aceite 63x. Las imágenes se adquirieron en modo multipista, usando caminos ópticos consecutivos e independientes. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: IGFBP3 de conejo (1:10, Sigma) Hep Par-1 de ratón (1:20, monoclonal, Dako), CD163 de ratón (1:10, cloneMRQ26, CellMarque).
Los mini intestinos cocultivados con/sin IGFBP3, con/sin suero de T1D de larga duración alto nivel de glucosa (glucosa 35 mM) y los obtenidos de criptas de individuos con T1D+ESRD, se tiñeron con vimentina, citoqueratina 20, aldehído deshidrogenasa y sinaptofisina para el análisis de inmunofluorescencia para evaluar la expresión de marcadores de linajes celulares (Fig. 15: A1-A4, B1-B4, C1-C4, D1-D4, E1-E4). Se usaron los siguientes anticuerpos primarios: vimentina de ratón (1:80, monoclonal, clon: V9 Dako) aldehído de ratón (1:1000, monoclonal, clon: 44, BD), citoqueratina 20 de ratón (1:100, monoclonal, clon: Ks20.8, Dako) y sinaptofisina (1:100, monoclonal, clon: syn88, BioGenex).
Hibridación in situ
Las secciones en parafina de la mucosa del colon humano se desparafinaron y rehidrataron de acuerdo con procedimientos convencionales. Después del tratamiento de las secciones usando HCl 0.2 M durante 15 minutos a temperatura ambiente, las secciones se lavaron 3 veces en PBS y se incubaron durante 15 minutos a 37°C en proteinasa K (30 jg/ml en PBS). Se añadió glicina al 0.2% en PBS durante 1 minuto con el fin de neutralizar la actividad de la proteinasa K, y las muestras se lavaron dos veces en PBS. Después de la fijación posterior en PFA al 4% durante 10 min a temperatura ambiente y 3 lavados en PBS, se logró la acetilación de histonas incubando las muestras dos veces durante 5 min en una solución acuosa que contenía trietanolamina al 1,5%, HCl al 0,15% y anhídrido acético al 0,6%. Después, las muestras se lavaron y prehibridaron durante 1 hora a 68°C en solución de hibridación (formamida al 50%, 5X SSC, pH 4.5, reactivo de bloqueo al 2% (Roche), CHAPS al 0.05% (Sigma), EDTA 5 mM, heparina 50 jg/ml (Sigma) y 50 jg/ml de ARN de levadura. Para TMEM219, la sonda marcada con digoxigenina se diluyó a 750 ng/ml en solución de hibridación y se incubó durante 24 horas a 65°C. Se llevaron a cabo lavados posteriores a la hibridación 3X 20 min en formamida al 50%/2XSSC a 65°C. Las secciones se aclararon en tampón de TBS-T (TrisHCl 0,1 M a pH 7,5, NaCl 0,15 M, Tween20 al 0,1%) y se bloquearon durante 30 minutos a temperatura ambiente en solución de bloqueo (reactivo de bloqueo al 0,5%, suero de oveja al 10% en TBS-T). El anticuerpo anti-DIG de oveja (fragmento Fab, Roche) se diluyó 1/2000 en solución de bloqueo y se incubó durante la noche a 4°C. Después de esto, las muestras se lavaron en TBS-T y luego en tampón de NTM (Tris 0.1 M a pH 9.5, NaCl 0.1 M, MgCl20.05 M) y se revelaron en solución de NBT/BCIP (Roche) durante 24 horas. Caracterización de CoSC
Purificación de criptas
Se eliminaron cuidadosamente la capa muscular y la submucosa de muestras de biopsia rectal humana recientes, y la mucosa se incubó con una mezcla de antibióticos (normocina, [Invivogen, San Diego, California 92121, EE.UU.], gentamicina [Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.] y fungizona (Invitrogen)) durante 15 minutos a temperatura ambiente (TA). A continuación, el tejido se cortó en trozos pequeños y se incubó con ditiotreitol (DTT) 10 mM (Sigma, St. Louis, MO 63103, EE.UU.) en PBS 2-3 veces durante 5 minutos a TA. Las muestras después se transfirieron a EDTA 8 mM en PBS y se rotaron lentamente durante 60-75 minutos a 4°C. El líquido sobrenadante se reemplazó por PBS de nueva aportación, y la agitación enérgica de la muestra produjo líquidos sobrenadantes enriquecidos en criptas de colon. Se añadió suero bovino fetal (FBS, Sigma) a una concentración final de 5%, y las fracciones se centrifugaron a 40xg durante 2 minutos con el fin de eliminar células individuales. Este procedimiento de lavado se repitió 3 veces con medio avanzado DMEM/F12 (ADF, Gibco) complementado con GlutaMax 2 mM (Invitrogen), HEPES 10 mM (Sigma) y FBS al 5% (Sigma).
Se mezclaron 200-300 unidades de criptas de colon humano aisladas con 50 |jl de matrigel y se pusieron en placas de cultivo de 24 pocillos precalentados como ya se ha descrito. Después de la solidificación (15-20 minutos a 37°C), las criptas se recubrieron con 600 j l de medio de cultivo de cripta completo [medio condicionado con Wnt3a y DMEM/F12 avanzado (Life Technologies, Grand Island, NY) 50:50, complementado con Glutamax, HEPES 10 mM, N-2 [1x], B-27 sin ácido retinoico [1x], nicotinamida 10 mM, N-acetil-L-cisteína 1 mM, EGF humano 50 ng/ml (Life Technologies, Grand Island, NY), RSPO1 1 jg/ml (Sino Biological, Beijing, China), nogina humana 100 ng/ml (Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.), gastrina 1 jg/ml (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), LY2157299 500 nM (Axon MedChem, Groningen, Países Bajos), SB202190 10 jM (Sigma) y PGE20.01 jM (Sigma)]. El medio se reemplazó cada dos días. Se añadió el inhibidor de Rock Y-27632 (10 jM, Sigma) a los cultivos durante los primeros 2-3 días. Las criptas purificadas se cultivaron directamente durante 8 días. Los marcadores de linajes celulares para enterocitos y células enteroendocrinas se evaluaron en los mini intestinos y en las células individuales separadas EphB2+ y EphB2- con RT-PCR mediante ensayo: CHGA, KRT20 y EPCAM (Life Technologies, Grand Island, NY). Se evaluó la eficacia de formación de colonias (%) en criptas recién aisladas con el fin de excluir que el procedimiento bióptico y el procesamiento de aislamiento pudieran haber comprometido su eficacia en la formación de mini intestinos en cultivo in vitro. Se llevó a cabo la tinción con DAPI para confirmar el número de núcleos en criptas recién aisladas de sujetos de CTRL y T1D+ESRD. También se contaron los mini intestinos desarrolladas con al menos 1 dominio de cripta y se calculó el porcentaje con el fin de añadir un criterio más cuantitativo para medir los mini intestinos desarrolladas (Fig. 17: A-P). Los niveles de insulina y glucosa medidos en T1D de larga duración (T1D+ESRD) y suero de CTRL se dan a continuación:
Niveles de glucosa (T1D+ESRD frente a CTRL, 178+47.5 frente a 90+5.5 mg/dl, p0.0001);
Niveles de insulina (T1D+ESRD frente a CTRL, 12.9+4.6 frente a 5.8+1.6 jUI/ml, p=0.009).
Citometría de flujo
La expresión de los marcadores de CoSC EphB2 (anticuerpo anti-EphB2 humano APC, R&D, Minneapolis, MN) y LGR5 (anti-LGR5 humano PE, Origene, Rockville, MD) se determinó por citometría de flujo excluyendo células positivas para CD45 y CD11b (anti-CD45 y CD11b humano V450, BD Biosciences, San José, Ca ). Se añadió yoduro de propidio (PI) (10 jg/ml) para excluir las células muertas. Las células EphB2+ también se separaron por citometría de flujo para obtener una suspensión de células individuales para fines de cultivo. La detección intracelular de tert humano (hTERT) se realizó por permeabilización de las células y tinción con anticuerpo anti-hTERT humano primario (GeneTex, Irvine, CA) seguido del anticuerpo secundario anti-IgG de cabra DAPI (Life Technologies). Con respecto al análisis, todas las células primero se activaron como PI' antes de la evaluación de otros marcadores de superficie o intracelulares. Las muestras se procesaron en un BD LSR-Fortessa y se analizaron por FSC Express 3.0 (DeNovo Software, Los Ángeles, CA, EE.Uu.).
Estudio de generación de mini intestinos in vitro
Las criptas se aislaron de muestras de biopsias rectales de sujetos sanos y se cultivaron como se ha descrito previamente para generar mini intestinos. Para crear condiciones hiperglucémicas, el medio de cultivo se modificó añadiendo glucosa en diferentes concentraciones (35 mM: alto nivel de glucosa; 5 mM: glucosa normal). Para imitar las condiciones urémicas, se añadió a las criptas suero urémico humano obtenido de individuos con T1D de larga duración con ESRD, que se cultivaron como se describe en la sección de métodos de cultivo de criptas. Después de 8 días, se recogieron las criptas, y la morfología, el crecimiento de mini intestinos, la expresión de marcadores de firma intestinales (EphB2, LGR5, h-TERT), IGF-IR y TMEM219 (Life Technologies), y Caspasa 9 (Life Technologies) se examinaron usando RT-PCR. Se usaron un inhibidor de la pan-caspasa (inhibidor de caspasa Z-VAD-FMK, 20 mM, Promega, Madison, WI), un inhibidor selectivo de la caspasa 8 (Z-IETD-FMK, BD Pharmingen), un inhibidor selectivo de la caspasa 9 (Z-LEHD-FMK, BD Pharmingen), un inhibidor de caspasa3 Z-DEVD-FMK (BD Pharmingen) in vitro en mini intestinos para confirmar el efecto antiapoptótico de IGFBP3.
Para cultivar criptas aisladas con medio de cultivo de criptas que contiene suero humano de sujetos sanos, en concreto, suero de CTRL, en lugar de FBS normal, se cultivaron células L-Wnt3 en suero de CTRL al 10% para generar medio condicionado que se añadió adicionalmente 50:50 a medio DMEM/F12 avanzado con el fin de obtener el medio de cultivo de criptas como se ha descrito previamente (véase Purificación de criptas).
Para evaluar las propiedades de las células EphB2+ separadas en la generación de mini intestinos, se mezclaron 2000 células separadas con 50 |jl de matrigel y se sembraron en placas de cultivo de 24 pocillos precalentados. Después de la solidificación del matrigel (10-15 min a 37°C), las células se recubrieron con "medio de crecimiento de células individuales" (= medio de cultivo de cripta completo inhibidor de Rock Y-27623 10 M). El medio se reemplazó con medio de crecimiento de células individuales cada dos días. El inhibidor Rock se incluyó en el medio de cultivo durante siete a nueve días.
Inmunotransferencia
Las proteínas totales de las muestras biópticas intestinales se extrajeron en tampón Laemmli (Tris-HCl 62.5 mmol/l, pH 6.8, glicerol al 20%, SDS al 2%, p-mercaptoetanol al 5%) y se midió su concentración (Lowry et al., 1951). Se sometieron a electroforesis 35 jg de proteína total en geles de SDS-PAGE al 7% y se transfirieron a nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Después las manchas se tiñeron con Ponceau S. Las membranas se bloquearon durante 1 h en TBS (Tris [10 mmol/l], NaCl [150 mmol/l]), Tween-20 al 0,1%, leche en polvo sin grasa al 5%, pH 7.4 a 25°C, se incubaron durante 12 h con 200 mg/ml de un anticuerpo anti-EphB2 de cabra policlonal o anticuerpo anti-LGR5 de cabra policlonal (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) o IGF-IR monoclonal (Santa Cruz Biotechnology) y TMEM219 policlonal (R&D, Minneapolis, MN) diluido 1:200 o con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-p-actina (Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:1000 en TBS-leche al 5% a 4°C, se lavaron cuatro veces con TBS-Tween-20 al 0.1%, después se incubaron con un anticuerpo secundario de conejo anti-IgG de cabra marcado con peroxidasa (o de conejo anti-IgG de ratón para p-actina) diluido 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology) en TBS-leche al 5%, y finalmente se lavaron con TBS-Tween-20 al 0.1%. Las bandas resultantes se visualizaron usando quimioluminiscencia mejorada (SuperSignal; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Imágenes en vivo del crecimiento de criptas intestinales
Se llevó a cabo la obtención de imágenes en vivo de mini intestinos, obtenidos por purificación y cultivo de criptas intestinales de individuos de CTRL, T1D+ESRD y SPK, en un Zeiss Axiovert S100 equipado con control de entorno (de Oko-Lab, Italia) con una cámara en la que se infundió un gas premezclado humidificado que consistía en 5% de CO2 y 95% de aire, y toda la configuración se ajustó a 37°C. Las imágenes se adquirieron a intervalos de 20 minutos durante 72 horas. Las imágenes se adquirieron y procesaron usando Time Lapse (Oko-Lab, Italia) y, si era necesario, la edición de imágenes se realizó con Adobe Photoshop Elements 7.0.
Análisis de imágenes de morfología
Las imágenes de mini intestinos se tomaron los días 0, 5 y 8 días mediante microscopio invertido Leica DH/RB y se adquirieron con Axio Vision AC Release 4.3. Las fotografías que se dan en las figuras representan mini intestinos en el día 5, aumento 10X.
Perfil de transcriptoma
El ARN total se aisló de la suspensión de criptas intestinales purificadas usando el kit RNEasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) con digestión con DNasa I en columna. A continuación, se llevó a cabo la transcripción inversa de 3 jg de ARN total de cada muestra usando el kit RT2 First Strand kit (C-03; SABiosciences, Frederick, MD). Los autores de la invención usaron las matrices RT2 Profiler PCR Arrays de células madre humanas (PAHS-405Z), las matrices Signaling PCR Array de células madre humanas (PAHS-047Z) y una matriz personalizada con los siguientes genes: AXIN2, OLFM4, BMI1, RNF43, CDCA7, SLC12A2, CDK6, SOX9, DKC1, ZNRF3, ETS2, EPHB2, FAM84A, LGR5, GPX2, ACTB (SABiosciences). Las matrices PCR Profiler miden cuantitativamente la expresión de un panel de genes usando PCR en tiempo real basada en SYBR Green (Kosinski et al, 2007). Para evaluar el perfil del transcriptoma de los marcadores apoptóticos y los marcadores de estrés oxidativo, se usaron las matrices de PCR de apoptosis humana (PAHS-012Z, SABiosciences) y las matrices de PCR de estrés oxidativo humano (PAHS-065Z, SABiosciences).
Análisis de qRT-PCR
El ARN de las criptas intestinales purificadas se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen), y el análisis de qRT-PCR se llevó a cabo usando ensayos TaqMan (Life Technologies, Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de expresión normalizados se determinaron usando el método de AACt. Los datos de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) se normalizaron para la expresión de ACTB, y se calcularon los valores de AACt. El análisis estadístico comparó la expresión génica en todas las poblaciones celulares para cada paciente mediante ANOVA de una vía seguido de prueba a poateriori de Bonferroni para comparaciones múltiples entre la población de interés y todas las demás poblaciones. El análisis estadístico se realizó también usando el software disponible de RT2 profiler PCR Array Data Analysis (Qiagen). Para la comparación de dos grupos se empleó la prueba t de Student. El análisis se realizó por triplicado después del aislamiento de criptas recientes y/o después de 8 días de cultivo de mini intestinos. La Tabla I-B da las principales características de los cebadores usados.
Tabla I-B: Cebadores
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Ensayo ELISA
Los niveles de IGF-I y IGFBP3 en los sueros/plasma mezclados de todos los grupos de sujetos y en todos los grupos de ratones tratados y no tratados se evaluaron usando kits de ELISA disponibles en el mercado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D y Sigma).
La línea celular de hepatoma inmortalizada humana HuH-7 se cultivó durante 5 días en DMEM FBS al 10% con diferentes concentraciones de glucosa: 5.5 mM, 20 mM y 35.5 mM. Se recogió el líquido sobrenadante del cultivo y se evaluó la IGFBP3 usando un kit de ELISA de IGFBP3 (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células recogidas se separaron mediante tripsina y se contaron con un hemocitómetro.
Los niveles de insulina se analizaron con un inmunoensayo enzimático de micropartículas (Iso-Insulin ELISA de Mercodia) con coeficientes de variación (CV) intra e inter-ensayo de 3.0% y 5.0%.
Proteínas recombinantes y estudios de intervención.
Se añadieron IGF-I humano recombinante (Sigma, 13769), (IGF-I), IGFBP3 humana recombinante (Life Technologies, 10430H07H5), (IGFBP3) y anti-IGF-IR (Selleckchem, Boston, OSI-906) a criptas cultivadas en el día 2 desde el aislamiento. IGFBP3 (Reprokine, Valley Cottage, NY) se administró a ratones B6 naive y tratados con STZ en 0,3 mg/ratón/día durante 15 días; IGF-I (Reprokine) y ecto TMEM219 se administraron in vivo a ratones B6 tratados con STZ después de 2 semanas de diabetes en una dosis de 5 pg/ratón/día durante 20 días y 100 pg/ratón/día durante 15 días respectivamente.
Otras moléculas probadas en el ensayo in vitro de mini intestinos y añadidas a cultivos de criptas el día 2 desde el aislamiento: adiponectina (R&D), timosina p4 (Abcam), proteína C reactiva (Merck Millipore), cistatina C (Cell Signaling Technologies), cromogranina A (Life Technologies), fructosa-bisfosfato aldolasa (Novoprotein), osteopontina (R&D), ribonucleasa pancreática (RNASE, Novoprotein), proteína amiloide A sérica (Abcam), serina proteasa 1 asociada a lectina de unión a manano (MASP1, Novoprotein), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa, R&D), Ligando FaS (FasL, R&D). El peróxido de hidrógeno (H2O2, 50 |jM) también se probó en el ensayo de mini intestinos.
Generación de ecto TMEM219 humano recombinante
El ecto-TMEM219 humano recombinante se generó usando E. Coli como hospedante de expresión para la síntesis. Brevemente, se obtuvo la secuencia génica de TMEM219 extracelular:
THRTGLRSPDIFQDWVSFLRSFGQLTLCPRNGTVTGKWRGSHWGLLTTLNFGDGPDR N KTRTFQA' IV LGSQM G L KGS S A G Q L V L1LA K VITE RTAGTCLY FSAVPGIL PS SQPPJ SC SEEGAGNATLSPRNiGEECVSVWSHEGLVLTKLLTSEELALCGSR(SEQ ID NO:2),
La secuencia de ADN de TMEM219 extracelular se clonó en un plásmido de número de copias alto que contiene el promotor lac, que después se transforma en la bacteria E. coli. La adición de IPTG (un análogo de lactosa) activaba el promotor lac y provocaba que las bacterias expresaran TMEM219 extracelular (ecto TMEM219). Se usaron SDS-PAGE y transferencia Western para confirmar una pureza mayor de 90%. El peso molecular de la nueva proteína generada ecto TMEM219 humana recombinante era de 80 kda.
Las criptas de sujetos sanos se aislaron y cultivaron como se ha descrito previamente y se añadió ecto-TMEM219 al cultivo en tres concentraciones (260 ng/ml, 130 ng/ml y 75 ng/ml) en comparación con la concentración de IGFBP3 usada (2:1, 1:1 y 1:2) y se establecieron controles adecuados para cada concentración. Después de 8 días de cultivo, se evaluaron adicionalmente la expresión de caspasa 8 y 9, la expresión de marcadores de firma de CoSCSC (EphB2 y LGR5), número de mini intestinos desarrollados.
ARN interferente pequeño
Las criptas aisladas obtenidas de sujetos sanos se cultivaron para generar mini intestinos in vitro en medio completo y en medio de cultivo modificado por adición de alto nivel de glucosa y suero de T1D de larga duración como se ha descrito previamente (véase, estudio de generación de mini intestino in vitro en métodos en línea). Después de 72 h de cultivo, que permitió que las criptas se recuperaran, se incubaron 750 ng de ARN interferente pequeño (ARNip; Flexitube siRNA SI04381013, Qiagen, Valencia, CA) en 100 j l de medio de cultivo sin suero y con 6 j l de reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen) a temperatura ambiente para permitir la formación de complejos de transfección. Las criptas se incubaron con estos complejos de transfección en sus condiciones normales de crecimiento durante 6 h. El análisis del silenciamiento génico se realizó a las 24, 48 y 72 h evaluando el porcentaje de desarrollo normal de mini intestinos. Se usó ARNip de control como un control negativo para confirmar el efecto del silenciamiento génico. Análisis proteómico
Se agotaron 8 j l de suero mezclado de 10 pacientes por grupo usando una columna de centrifugación ProteoPrep 20 (Sigma), permitiendo así la eliminación de las 20 proteínas muy abundantes. El procedimiento se repitió dos veces con el fin de obtener un agotamiento de ~99%, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El líquido sobrenadante recuperado se analizó para determinar la concentración de proteínas total usando el espectrofotómetro de IR Direct Detect y BSA como una referencia. Con el fin de obtener suficiente proteína para el análisis proteómico, se procesaron 32 j de cada mezcla como se ha descrito antes. Se digirieron 40 jg de proteína total de cada muestra en solución usando el protocolo de Preparación de Muestra Ayudada por Filtro (FASP) como se describe en la bibliografía (Wisniewski et al., 2009). Las muestras se desalaron usando columnas de punta de pipeta C18 hechas en el laboratorio (membrana Empore C18, 3M) y se inyectaron en un sistema cromatográfico capilar (EasyLC, Proxeon Biosystems, Thermo Scientific). Las separaciones de péptidos se llevaron a cabo en una columna capilar de sílice fundida de pulverización, de fase inversa de 25 cm hecha en el laboratorio, empaquetada con 3 jm de ReproSil Pur 120 C18-AQ. Se usó un gradiente de eluyentes A (agua pura con 2% en v/v de ACN, 0.5% en v/v de ácido acético) y B (ACN con 20% en v/v de agua pura con 0.5% en v/v de ácido acético) para lograr la separación (caudal de 0.15 jl/minuto) (de 10 a 35% de B en 230 minutos, de 35 a 50% de B en 5 minutos y de 50 a 70% de B en 30 minutos). El análisis de espectrometría de masas se llevó a cabo usando un espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific, Waltham, MA) equipado con una fuente de iones de nanoelectropulverización (Proxeon Biosystems). Los espectros de masas de barrido completo se adquirieron con la opción de bloqueo de masas (lockmass) y la resolución ajustada a 60000. El intervalo de masa de adquisición para cada muestra era de m/z 300 a 1750 Da. Los diez iones con carga doble y triple más intensos se seleccionaron y fragmentaron en la trampa de iones usando una energía de colisión normalizada de 37%. Los iones objetivo ya seleccionados para MS/MS se excluyeron dinámicamente durante 120 segundos. Todas las muestras de MS/MS se analizaron usando el motor de búsqueda Mascot (v.2.2.07, Matrix Science, Londres, Reino Unido) para buscar el UniProt_Human Complete Proteome_cp_hum_2013_12. Se realizaron búsquedas con especificidad de tripsina, dos escisiones omitidas permitidas, carbamidometilación de cisteína como modificación fija, acetilación en el extremo N de la proteína y oxidación de metionina como modificación variable. La tolerancia de masa se ajustó a 5 ppm y 0,6 Da para iones precursores y fragmentos, respectivamente. Para cuantificar las proteínas, los datos en bruto se cargaron en el software MaxQuant versión 1.3.0.5 (Cox et al., 2011). La cuantificación de proteínas sin marcador se basó en las intensidades de los precursores. Se aceptaron péptidos y proteínas con una FDR inferior a 1%, dos péptidos por proteína mínimo. Los experimentos se realizaron por triplicado técnico. El conjunto de datos completo de proteínas, obtenido mediante análisis proteómico (Tabla I-C), se analizó mediante la prueba t de Student usando el software MeV v. 4_8_1. 47 de proteínas, que eran significativamente diferentes (valor de p<0.01) en la mezcla de control frente a la mezcla de T1D-ESDR, se sometieron a análisis de agrupamiento jerárquico.
Tabla I-C. Lista de proteínas cuantificadas identificadas por análisis proteómico. La tabla da la correspondencia entre números y nombres de proteínas detectadas por análisis proteómico y se muestra como un mapa de calor en la Figura 10.
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Estrategia para seleccionar proteínas candidatas
Entre los 46 factores que se segregaron por separado en sujetos con T1D de larga duración y controles sanos, los autores de la invención primero seleccionaron aquellos con una diferencia más significativa en la intensidad de LFQ al comparar los dos grupos (p> 0.005), conduciendo a la exclusión de 12 factores (Fig. 16). Después, los autores de la invención evaluaron si los factores alterados pueden estar asociados con trastornos intestinales y/o con el desarrollo de diabetes mediante la búsqueda de estudios y publicaciones ya descritos en el campo. Esto los llevó a excluir otros 12 factores. Los autores de la invención también excluyeron aquellos factores relacionados principalmente con el compartimento linfoide (n=5). Los autores de la invención terminaron con 17 factores. Los autores de la invención excluyeron las proteínas de membrana celular (n=4) y procedieron a probar el resto (n=13) en el ensayo de mini intestino. Dos factores no estaban disponibles para ser probados in vitro. Los autores de la invención probaron n=11 proteínas en total.
Estudios en animales
Se obtuvieron ratones C57BL/6 (B6) del Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine. Todos los ratones se atendieron y usaron de acuerdo con las directrices institucionales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard. Los ratones se volvieron diabéticos con inyección de estreptozotocina (225 mg/kg, administrados por vía i.p.; Sigma). La diabetes se definió como niveles de glucosa en sangre >250 mg/dl durante 3 medidas consecutivas. La enteropatía diabética se evaluó de la siguiente manera: brevemente, se extrajo todo el intestino de los ratones sacrificados y se lavaron con chorro de PBS. Después se cortó la parte extrema del colon y se dividió en dos partes. Una parte de tejido de colon se sumergió directamente en formalina mientras que la otra se cortó longitudinalmente para exponer la luz y la mucosa interna y después se sumergió en formalina. Después el tejido se insertó en parafina y se procesó para HyE e inmunotinción. Además, también se cortó tejido del colon y se llevó a cabo el aislamiento de las células madre del colon como se ha descrito antes (Merlos-Suarez et al., 2011). Brevemente, el colon se cortó en trozos de 2-4 mm y los fragmentos se lavaron en 30 ml de PBS helado. Los fragmentos se transfirieron a tubos de 50 ml que contenían EDTA-PBS 20 mM precalentado y se incubaron a 37°C durante 30 minutos. Después de la incubación, el tejido suspendido se transfirió a un tubo que contenía 30 ml de PBS frío y se centrifugó. Las criptas se resuspendieron en 13 ml de DMEMF12 frío, se lavaron con PBS y se digirieron en 5-10 ml de disolución de tripsina/DNAsa a 37°C durante 30 minutos. Las criptas se resuspendieron en DMEMF12/EDTA, se filtraron en un filtro de 40 micrómetros dos veces y se lavaron. Finalmente, las criptas se resuspendieron en medio de flujo (DMEM+FBS+EDTA) y se tiñeron para anti EphB2-APC (RyD), anti-CD45-PeRCP de ratón y anti-CD11b-PE de ratón (gen BD Pharmigen). Las muestras se ejecutaron usando un analizador FACSCalibur y los datos se analizaron con FlowJo. Parte del tejido también se congeló rápidamente y se almacenó en Tryzol para llevar a cabo estudios de RT-PCR para los siguientes marcadores:
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Finalmente, se recogieron plasma y suero para llevar a cabo el análisis de IGF-I (kit de ELISA IGF-I, R&D), IGFBP3 (kit de IGFBP3 ELISA, R&D) y los niveles de insulina (kit Mercodia Mouse Insulin ELISA). La glucosa en sangre se controló dos veces por semana durante las 8 semanas con el fin de confirmar la aparición y permanencia de la diabetes.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media y error estándar de la media (SEM) y se analizaron la distribución normal con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la homogeneidad de las variaciones con la prueba de Levene. La significación estadística de las diferencias se analizó con la prueba t de dos colas y las pruebas de chi cuadrado (x2). La significación entre los dos grupos se determinó por la prueba t de Student de dos colas para datos no pareados. Para comparaciones múltiples, se usó la prueba ANOVA con corrección de Bonferroni. Todos los datos se introdujeron en el Paquete Estadístico para Ciencias Sociales (SPSS®, IBM®, SPSS Inc., Chicago, IL) y se analizaron. Las gráficas se generaron usando GraphPad Prism versión 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Todas las pruebas estadísticas se realizaron al nivel de significación de 5%.
Resultados
La disfunción intestinal y los síntomas clínicos están presentes en la T1D de larga duración.
Los autores de la invención primero caracterizaron la morfología y función intestinal en una población de individuos con T1D de larga duración y enfermedad renal en etapa terminal (T1D+ESRD) y en sujetos sanos (CTRL). Los síntomas intestinales graves, tales como diarrea, dolor abdominal y estreñimiento, eran evidentes en individuos con T1D+ESRD según se evaluó mediante el cuestionario de la Escala de Evaluación de Síntomas Gastrointestinales (GSRS) (Fig. 1: A-C). Los síntomas se asociaron con anomalías en la función del esfínter anorrectal (Fig. 1: D-F). La mucosa intestinal estaba alterada en individuos con T1D+ESRD en comparación con sujetos sanos, con menor número de criptas, distorsión y esclerosis zonal de la lámina propia (Fig. 1: G1-G2, H). Se observó una reducción significativa en la proliferación de células epiteliales evaluado por la tinción con Ki67 (anticuerpo MIB1) (Fig. 1: 11­ 12, J), signos de degeneración neural (Fig. 1: K1-K2, L) y reducción en la expresión de serotonina en células neuroendocrinas intestinales (Fig. 1: M1-M2, N), confirmando la presencia de en estos individuos.
Las CoCs están alteradas en la T1D de larga duración
La caracterización de las criptas de colon puso de manifiesto una reducción significativa en la expresión de EphB2+ y en el número de células inmunorreactivas para la aldehído deshidrogenasa (Aldh)+, ambos marcadores de células madre locales (Carpentino et al., 2009; Jung et al., 2011), en individuos T1D+ESRD en comparación con sujetos sanos (Fig. 1: O1-O2, P, Q1-Q2, R). Se puso de manifiesto una disminución profunda tras activación en células Pr en el análisis FACS (Fig. 8: A-C), en el porcentaje de células EphB2hi, EphB2hi+LGR5+ y EphB2+h-TERT aisladas de criptas intestinales obtenidas de individuos T1D+ESRD en comparación con sujetos sanos (Fig. 2: A-B, C-E, Fig. 8: D-E) y se confirmó por RT-PCR (Fig. 2: F-H) y transferencia Western (WB) (Fig. 8F). El perfil de transcriptoma de las criptas obtenidas de T1D+ESRD documentó una disminución de la expresión de los genes de la ruta Notch (Notch1 y 2, JAG1, Dll1, Sox1 y 2), ruta Wnt (APC, FZD1, DKC1, ETS2, FAM84A, GPX2, RNF43) y la ruta BMP (BMP1, BMP2, BMP3), rutas previamente conocidas que controlan las CoSC, en comparación con la expresión de estos genes en sujetos sanos (Fig. 8G y Tabla II).
Tabla II. Lista de genes objetivo de células madre regulados por aumento y disminución identificados por perfiles transcriptómicos en criptas de colon recién aisladas de CTRL frente a T1D+ESRD (al menos p <0.05).
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El análisis de los genes firma de CoSC puso de manifiesto que LGR5, EphB2 (Gracz et al., 2013; Merlos-Suarez et al., 2011), h-TERT (Breault et al., 2008) y otros genes marcadores de células madre intestinales (Hughes et al., 2011; Muñoz et al., 2012; Ziskin et al., 2013) estaban significativamente subexpresados en T1D+ESRD en comparación con sujetos sanos también (Fig. 2I), lo que confirma que las CoSC están alteradas en individuos con DE.
La generación in vitro de mini intestinos está alterada en T1D de larga duración.
Con el fin de evaluar las propiedades de autorrenovación de las CoSC, los autores de la invención usaron el ensayo in vitro de mini intestinos. De hecho, las criptas aisladas de individuos con T1D+ESRD y cultivadas in vitro durante 8 días formaron pequeños intestinos esferoides que no pudieron crecer en comparación con sujetos sanos (Fig. 2: J1, J2, K), a pesar de una viabilidad (Fig. 8: H-I) y eficacia de formación de mini intestinos comparable en ambos grupos (Fig. 8J) Para comenzar a dilucidar el efecto de los factores circulantes y el alto nivel de glucosa en CoSC, los autores de la invención cultivaron criptas intestinales aisladas obtenidas de sujetos sanos en suero con/sin alto nivel de glucosa obtenido de individuos T1D de larga duración in vitro durante 8 días (Fig. 2: L1- L4, M). El alto nivel de glucosa evitó parcialmente la generación de mini intestinos completamente maduros y tuvo efecto sinérgico con el suero de individuos con diabetes tipo 1 de larga duración en la alteración de las propiedades de autorrenovación de CoSC, de modo que los mini intestinos parecían colapsados (Fig. 2: L2-L4). El análisis de la expresión génica también puso de manifiesto cambios en la firma de CoSC (Fig. 2N), sugiriendo que la hiperglucemia y los factores circulantes actúan juntos para alterar las propiedades regenerativas de CoSC en T1D de larga duración.
El perfil proteómico no sesgado del suero puso de manifiesto mayores niveles de IGFBP3 en T1D de larga duración
Con el fin de identificar potenciales factores circulantes que pueden servir como hormonas enterotróficas y pueden tener una función en la regulación de las CoSC, los autores de la invención compararon el proteoma del suero de sujetos sanos con individuos con T1D+ESRD usando una matriz proteómica no sesgada. Un claro perfil proteómico era evidente en individuos con T1D+ESRD en comparación con sujetos sanos, con más de 50% de las proteínas detectadas separándose en un grupo u otro (Fig. 3A). Algunas proteínas estaban asociadas con la diabetes, y algunas eran factores de crecimiento o proteínas relacionadas con las células madre o estaban potencialmente implicadas en funciones intestinales (Fig. 3A). En particular, los niveles de proteínas de unión a IGF-I (IGFBP2 y 3) eran detectables en individuos con T1D de larga duración en comparación con sujetos sanos, con IGFBP3 casi 5 veces mayor (Fig. 3B), mientras que IGFBP1, 4, 5 y 6 permanecieron casi indetectables. Es interesante que en el hígado de individuos con T1D de larga duración, los hepatocitos, pero no las células de Kuppfer, mostraban una mayor expresión inmunohistoquímica de IGFBP3 en comparación con sujetos sanos (Fig. 3: C1-C2, Fig. 8: L1-L6), lo que sugiere un aumento en la síntesis hepática de IGFBP3 y liberación. El efecto del alto nivel de glucosa en la liberación hepática de IGFBP3 se confirmó por la detección de niveles aumentados de IGFBP3 en el líquido sobrenadante de hepatocitos humanos inmortalizados expuestos a alto nivel de glucosa (Fig. 3D). Finalmente, los niveles séricos de IGF-I libre aparecieron significativamente reducidos en T1D de larga duración en comparación con sujetos sanos (Fig. 3E), lo que indica que los niveles circulantes de IGF-I e IGFBP3 están alterados en la T1D de larga duración.
IGFBP3 e IGF-I periféricos controlan CoSC
Para elucidar más la función de IGF-I y IGFBP3 circulantes en la regulación de las CoSC y de la proliferación epitelial intestinal, los autores de la invención demostraron la expresión de IGF-IR y del receptor de IGFBP3 (TMEM219) en criptas aisladas (Fig. 3: F, H, Fig. 8: M, N1-N2) usando RT-PCR y WB (Fig. 3: F, H, Fig. 8M), y confirmaron la expresión de IGF-IR en CoSC con inmunotinción (Fig. 8: N1-N2), y de TMEM219 con hibridación in situ (Fig. 3: G1-G2). Con el fin de confirmar mecánicamente la función de IGF-I e IGFBP3 en CoSC, los autores de la invención probaron el efecto de varias moléculas, identificadas por el perfil proteómico, en su ensayo in vitro de mini intestinos. La estrategia de los autores de la invención para seleccionar potenciales objetivos se describe en la Información complementaria. Los mini intestinos gravemente alterados generados a partir de muestras intestinales obtenidas de individuos con T1D+ESRD fueron rescatados por adición de IGF-I humano recombinante (IGF-I) al medio de cultivo (Fig. 3I), mientras que la adición de IGFBP3 humana recombinante (IGFBP3) dio como resultado la anulación del efecto positivo observado con IGF-I, con un desarrollo reducido de mini intestinos y mayor formación de organoides colapsados y distorsionados (Fig. 3I). Debido a que recientemente se ha mostrado que IGFBP3 actúa independientemente de IgF-I (Williams et al., 2007) a través del receptor de IGFBP3 (TMEM219) (Baxter, 2013), era necesario aclarar si IGFBP3 ejerce sus efectos en CoSC al unir IGF- I o dirigiéndose directamente a TMEM219 en CoSC. Los autores de la invención confirmaron primero que IGFBP3 tiene un efecto pro apoptótico directo sobre las CoSC demostrando una mayor expresión de Caspasa 8 y 9 en mini intestinos obtenidos de sujetos sanos e individuos con T1D de larga duración y cultivados con IGFBP3 (Fig. 3J, Fig. 9: A-B), mientras que la adición de un inhibidor Pan-Caspasa (Z-VAD-FMK) o la adición de ambos inhibidores selectivos de caspasas 8 y 9, pero no el de otros inhibidores de la cascada de caspasas (inhibidor de Caspasa 3) anuló el efecto de IGFBP3 (Fig. 3K). Después, los autores de la invención demostraron que la adición de IGF-I no rescató el desarrollo de mini intestinos obtenidos de sujetos sanos y expuestos a IGFBP3 (Fig. 3L), confirmando que IGFBP3 puede actuar a través de un mecanismo de IGF-I tanto directo como indirecto. Es interesante que el alto nivel de glucosa no era capaz de alterar completamente el crecimiento de mini intestinos, y el anti-IGF-IR no empeoró el crecimiento y la morfología de los mini intestinos formados de sujetos sanos (Fig. 3l). La adición de IGF-I a mini intestinos generados a partir de sujetos sanos, pero cultivados con alto nivel de glucosa y suero de individuos con T1D de larga duración, rescató la morfología del mini intestino, mientras que IGFBP3 anuló el efecto positivo del IGF-I cuando se añadía al cultivo de mini intestinos (Fig. 3L). Es interesante que el uso de suero "CTRL" de sujetos sanos en el cultivo de criptas obtenidas de T1D de larga duración casi restauró el desarrollo/morfología de los mini intestinos, indicando que los factores circulantes, y en particular la díada IGF-I/IGFBP3, controlan las CoSC (Fig. 9: C-D). Los autores de la invención después modularon genéticamente la expresión de TMEM219 mediante el uso de ARNip in vitro en mini intestinos obtenidos de sujetos sanos. La reducción de la expresión de TMEM219 en mini intestinos conservó su capacidad de crecimiento y autorrenovación, a pesar de la adición de IGFBP3 y alto nivel de glucosa con suero de T1D de larga duración (Fig. 3M). El bloqueo concomitante de TMEM219 por el ARNip e IGF-IR mediante anticuerpo de bloqueo no dio como resultado ningún efecto beneficioso adicional en el desarrollo de mini intestinos a pesar de usar suero de sujetos sanos o de T1D de larga duración (Fig. 9E).
Otras proteínas circulantes, que aparecían alteradas en el proteoma sérico de individuos con T1D de larga duración, se analizaron en el ensayo in vitro de mini intestinos y no mostraban ningún efecto significativo sobre el crecimiento de mini intestinos (Fig. 9: F-G). Se analizaron también el péptido C y la insulina, cuyos niveles se alteran habitualmente en la T1D y que pueden interferir con la díada IGF-I/IGFBP3 al unirse al IGF-IR (Fig. 9H), y no mostraron ningún efecto.
Para confirmar más que la díada IGF-I/IGFBP3 se dirige eficazmente a las CoSC y no solo a las criptas, los autores de la invención probaron su efecto en los mini intestinos derivados de células individuales. Los autores de la invención separaron por citometría de flujo células EphB2+ a partir de criptas aisladas y establecieron que TMEM219 era altamente expresado en su superficie (Fig. 4A). Después, los autores de la invención cultivaron células EphB2+ en el ensayo de mini intestinos derivados de células individuales in vitro y confirmaron que la exposición a suero de T1D de larga duración y alto nivel de glucosa, así como la adición de IGFBP3 anula significativamente el crecimiento de mini intestinos derivados de células individuales, recapitulando así las características principales descritas en sus observaciones previas sobre mini intestinos derivados de criptas (Fig. 4B, Fig. 10: A1-A3). Además, la expresión de Caspasa 8 y 9 era regulada por aumento en los mini intestinos tratados con IGFBP3 y en los expuestas a nivel alto de glucosa y suero de T1D de larga duración, mientras que Ki67, marcador de proliferación, era significativamente subexpresado (Fig. 10: B-D).
Efecto de la díada IGF-I/IGFBP3 en las rutas previamente conocidas que controlan CoSC
Con el fin de aclarar los efectos de la díada IGF-I/IGFBP3 en las rutas que se sabe previamente que están implicadas en la función de nicho de las CoSC (es decir, Wnt/Notch/BMP), los autores de la invención obtuvieron de su perfil de transcriptoma de células madre la expresión de transcritos de genes específicos de nicho. IGF-I restablece significativamente la expresión de algunos factores asociados con las rutas de señalización Wnt/Notch en mini intestinos obtenidos de criptas de T1D+ESRD (Fig. 10E, Tabla III), mientras que IGFBP3 afecta poco a la expresión del gen de Wnt/Notch/BMP en mini intestinos obtenidos de criptas de sujetos sanos o de los de T1D+ESRD (Fig. 10F, Tabla III).
Tabla III. Lista de genes diana de células madre regulados por aumento y por disminución identificados por perfiles transcriptómicos en criptas de colon obtenidas de CTRL y de T1D+ESRD y cultivadas con/sin IGFBP3 e IGF-I (al menos p<0.05).
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Esto confirma que IGF-I preserva la expresión de algunos genes implicados en la señalización de Wnt/Notch/BMP, pero también que IGFBP3 actúa independientemente en CoSC, sin alteraciones importantes en la expresión de genes diana clave de las otras rutas previamente conocidas.
Efecto de la díada IGF/IGFBP3 en las rutas apoptóticas en CoSC
Un extenso análisis de transcriptoma realizado para aclarar el efecto mediado por caspasa de IGFBP3 en mini intestinos, (Fig. 4: CD, Fig. 10: G-H, Tabla IV), mostró que la adición de IGFBP3 a mini intestinos cultivados a partir de criptas de sujetos sanos, estaba asociado con una regulación por aumento significativa de los activadores de la cascada de caspasa (Caspasas 8 y 9) y genes proapoptóticos, mientras que el gen antiapoptótico Bcl2 estaba regulado por disminución (Fig. 4C).
Tabla IV. Lista de genes diana pro/antiapoptóticos regulados por aumento y disminución identificados por perfiles transcriptómicos en criptas de colon recién aisladas de CTRL frente a T1D+ESRD y en las cultivadas con IGFBP3 e IGF-I (al menos p <0.05).
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Es interesante que los genes antiapoptóticos (Bcl2, Fas, Nol3) eran subexpresados significativamente en mini intestinos cultivados a partir de criptas de T1D+ESRD también, en comparación con sujetos sanos, mientras que la mayoría de los genes relacionados con caspasas (Caspasa 1, 5, 7, 8, 9, 14) eran sobreexpresados (Fig. 10G). Además, la expresión de genes implicados en otras rutas proapoptóticas o no se alteraban (es decir, Ligando Fas, FADD, TNF) o eran inhibidas (TRADD) en mini intestinos de T1D+ESRD. Se observó el efecto contrario al añadir IGF-I (Fig. 4D, Fig. 10H). La ausencia de alteraciones en la expresión de genes diana del estrés oxidativo (Tabla V) y de cualquier efecto de los factores de estrés oxidativo (Figura 10: I-J), confirmó el mecanismo principal de IGFBP3 mediado por caspasas relacionadas con apoptosis, por el cual el IGFBP3 circulante controla directamente las CoSC (Fig. 4E).
Tabla V. Lista de genes diana de estrés oxidativo regulados por aumento y por disminución identificados por el perfil transcriptómico en criptas de colon recién aisladas de CTRL frente a T1D+ESRD y en las cultivadas con IGFBP3 e IGF-I (al menos p <0.05).
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Abreviaturas: IGF-I, factor de crecimiento similar a la insulina tipo 1; IGFBP3, proteína de unión al factor de crecimiento similar a la insulina tipo 3, CTRL, sujetos sanos, T1D, diabetes tipo 1, ESRD, enfermedad renal en etapa terminal.
La manipulación de la díada IGF-I/IGFBP3 circulante altera el curso de la enteropatía diabética en un modelo preclínico
Para demostrar mejor la relevancia de los factores circulantes IGF-I/IGFBP3 in vivo, los autores de la invención ensayaron los efectos de la administración de IGF-I e IGFBP3 en un modelo preclínico de. Después de 8 semanas de diabetes inducida químicamente (usando estreptozotocina [STZ]), ratones C57BL/6 (B6) mostraron un número reducido de criptas en el tejido colorrectal (Fig. 4F), que mostraba mayor profundidad y anchura en más de 70% de los casos (Fig. 4: G, H1-H2, I) y un número reducido de células Aldh+ (Fig. 4: J, K1-K2). Es interesante que esos ratones mostraron niveles séricos mayores de IGFBP3 y niveles bajos de IGF-I, con niveles más bajos de insulina murina en comparación con B6 naive (Fig. 11: A-C). La administración intraperitoneal (i.p.) de IGFBP3 en ratones B6 naive dio como resultado una reducción en el número de criptas locales (Fig. 4: F, H3), mostrando la mayoría de las criptas mayor profundidad y anchura (Fig. 4: G, H3, I) y una reducción significativa en las células Aldh+ en comparación con los ratones no tratados (Fig. 4: J, K3). Esas características estaban agravadas por la administración de IGFBP3 a ratones B6 tratados con STZ (Fig. 11: D-G, H1-H2), con evidencias de disminución de peso (Fig. 11J), pérdida de CoSCs (Fig. 11: J-L) y expresión regulada por aumento de Caspasa 8 y 9 (Fig. 11: M-N). La administración de IGF-I i.p en ratones B6 tratados con STZ solo mejoró parcialmente la morfología de la mucosa aumentó el número de criptas normales, que permanecieron anormales (Fig. 11D), y solo restableció parcialmente el número de celdas Aldh+ (Fig. 11: G, H1-H2).
El tratamiento de T1D de larga duración con trasplante simultáneo de páncreas-riñón (SPK) revierte las características clínicas y morfológicas de la DE
El tratamiento de referencia para la T1D de larga duración es el SPK, que proporciona control glucometabólico estable, factores de riesgo casi normalizados y supervivencia prolongada (Tabla VI) (Fiorina et al., 2004; Fiorina et al, 2005; Folli et al, 2010; Secchi et al., 1998; Smets et al., 1999).
Tabla VI. El restablecimiento de la normoglucemia y la función renal normal en SPK se asocia con un metabolismo estable de la glucosa/lípidos y el control de la presión arterial a lo largo del tiempo hasta 8 años de seguimiento en comparación con K+T1D (los datos se muestran a los 8 años de seguimiento).
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Sin embargo, los individuos con T1D+ESRD también se tratan con trasplante renal solo, pero siguen siendo diabéticos (K+T1D) (Fiorina et al., 2001). Era evidente una mejora significativa en los síntomas gastrointestinales con el tiempo después de SPK en la cohorte de los autores de la invención de individuos trasplantados, mientras que el grupo de K+T1D no describió ningún beneficio (Fig. 12: A-C), lo que sugiere que la DE es reversible.
El tratamiento de la T1D de larga duración con SPK restablece la morfología de la mucosa intestinal y las propiedades locales de autorrenovación.
El análisis de muestras de mucosa intestinal mostraba una recuperación significativa en la estructura del compartimento epitelial, con hiperplasia epitelial compensatoria en el grupo de SPK (Fig. 12: D1-D2). La recuperación de la histología y el número de criptas normales era evidente en el grupo de SPK cuando la T1D de larga duración era tratada con éxito, mientras que ninguna de estas características era evidente en individuos que recibieron solo trasplante de riñón y permanecían diabéticos (Fig. 12: D1-D2). La proliferación de células epiteliales (células MIB1+) aumentó después del SPK con el tiempo en comparación con el valor basal y con K+T1D en cada tiempo de medición (Fig. 4: L, M1-M2), con casi normalización de la morfología intestinal, renovación epitelial y características neurales (Fig. 12: E1-E2, F, G1-G2, H-I, J1-J2, K). Esto demuestra que el tratamiento de la T1D de larga duración con SPK promovía la recuperación de la reparación del epitelio intestinal y de las propiedades de autorrenovación.
El tratamiento de la T1D de larga duración promueve la restauración de CoSC
El tratamiento de la T1D de larga duración con SPK se asocia con un aumento en las células Aldh+ (Fig. 4: N, O1-O2) y expresión de EphB2+ en la cripta intestinal (Fig. 4: P, Q1-Q2) y casi normaliza el porcentaje de células EphB2+, EphB2+hTERT+ y EphB2hi+LGR5+ en criptas intestinales aisladas en comparación con el valor basal (Fig. 5: A-C). La expresión de marcadores de CoSC (Fig. 5: D-G) y el crecimiento/morfología de los mini intestinos obtenidos de individuos de SPK también se casi normalizaron (Fig. 5H, Fig.13: A1-A6). El análisis del transcriptoma puso de manifiesto que el SPK casi restablecía la expresión de los marcadores de células madre y CoSC y de rutas implicadas en la preservación de CoSC (Fig. 51, Fig. 13B, Tabla VII).
Tabla VII. Lista de genes diana de células madre regulados por aumento y disminución identificados por el perfil transcriptómico en SPK en comparación con las criptas de colon recién aisladas de T1D+ESRD (al menos p <0.05).
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Se concluye que el tratamiento de la T1D de larga duración con SPK promueve el restablecimiento de CoSC.
El tratamiento de la T1D de larga duración con SPK restablece el IGF-I e IGFBP3 circulantes
El amplio análisis proteómico y el inmunoensayo dirigido pusieron de manifiesto una casi normalización de los niveles séricos de IGFBP3 e IGF-I después de SPK (Fig. 5: J-K) en asociación con una expresión casi restablecida de IGF-IR (Fig. 13C). Estos resultados no eran evidentes en el grupo de K+T1D, que mostraba niveles bajos de IGF-I (Fig. 5J) y expresión de IGF-IR (Fig. 13C) y solo una recuperación parcial en su perfil de IGFBP (Fig. 13D). Una correlación significativa entre los niveles séricos de IGFBP3 y los síntomas intestinales tanto en los grupos de SPK como de K+T1D, pero más evidente en este último, confirmó que el restablecimiento de los niveles de IGFBP3 está asociado con una mejora en la enteropatía diabética (Fig. 5: L-M, Fig.14: A-G). El tratamiento de la T1D de larga duración con SPK mejora la enteropatía diabética a través de un restablecimiento asociado con la glucosa de la díada IGF-I/IGFBP3 circulante.
La proteína recombinante ecto-TMEM219 anula la destrucción de mini intestinos mediada por IGFBP3 in vitro y conserva las CoSC in vivo en un modelo murino de.
Para demostrar más los efectos perjudiciales mediados por IGFBP3 en las CoSC, los autores de la invención generaron una proteína recombinante basada en el dominio extracelular de TMEM219 (ecto-TMEM19). La adición de ecto-TMEM219 (relación molar 2:1 con IGFBP3) a las criptas obtenidas de CTRL y cultivadas con IGFBP3 anuló el efecto pro-apoptótico de IGFBP3 en mini intestinos y conservó las propiedades regenerativas de las criptas para generar mini intestinos (Fig. 6A). La expresión de los marcadores de firma de las CoSC, EphB2 y LGR5, se recuperó significativamente en mini intestinos cultivados con IGFBP3 y ecto-TMEM219, enfatizando un efecto favorable en la preservación de CoSC (Fig. 6B), que también se confirmó en mini intestinos cultivados con alto nivel de glucosa (Fig. 6A). Además, el análisis de Caspasa 8 y 9 por RT-PCR dio una disminución neta en su expresión cuando se añadió ecto-TMEM219 a mini intestinos cultivados con IGFBP3 en comparación con IGFBP3 solo (Fig. 6: C-D). Después, los autores de la invención trataron ratones STZ-B6 con ecto-TMEM219 y observaron una morfología de la mucosa mejorada con número, profundidad y anchura de las criptas recuperados (Fig. 6: E, F, G). La administración de ecto-TMEM219 se asoció con un aumento en el peso corporal de los ratones en comparación con B6 tratados con STZ (Fig. 6H), con una recuperación significativa de CoSC (Fig. 6: I-K), una expresión disminuida de caspasa 8 y 9 (Fig. 6: L-M) y un restablecimiento de los niveles circulantes de IGFBP3 (Fig. 6N).
Discusión
La enteropatía diabética representa una complicación clínicamente relevante en individuos con T1D, ya que se asocia con una menor calidad de vida, desnutrición y malabsorción (Bytzer et al., 2002; Faraj et al, 2007; Talley et al., 2001). Particularmente, en individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD), se producen trastornos intestinales con frecuencia alta y gravedad (Cano et al., 2007; Wu et al, 2004), lo que da como resultado pérdida de masa corporal y caquexia (Pupim et al., 2005), indicando que la enteropatía es una complicación importante de la T1D de larga duración (Atkinson et al., 2013; Pambianco et al., 2006). Los resultados de los autores de la invención demuestran que los individuos con T1D de larga duración experimentaban trastornos intestinales graves (Tabla VIII) y que estas afecciones clínicas están asociadas con alteraciones de la mucosa intestinal, con una proliferación reducida de células epiteliales intestinales y con signos de degeneración neural.
Tabla VIII. Esquema general de los resultados de la evaluación de enteropatía diabética en individuos con T1D+ESRD en comparación con CTRL y SPK.
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También se han descrito características similares en modelos de roedores de T1D y DE (Domenech et al., 2011). Los datos de los autores de la invención, por primera vez, vinculan la DE con un defecto en las CoSC e implican a la IGFBP3 que tiene una función importante en el mantenimiento de la homeostasis del epitelio intestinal. Aunque la hiperglucemia es una característica destacada de la T1D, los estudios in vitro de los autores de la invención sugieren que esta característica no puede explicar completamente la DE y que los factores circulantes pueden tener una función importante. El análisis proteómico conducía a la identificación de IGF-I como un factor enterotrófico implicado en la homeostasis de CoSC. Después, los autores de la invención confirmaron que IGF-I e IGFBP3 controlan las CoSCs y que este eje es disfuncional en la T1D de larga duración. Los datos de los autores de la invención indican que el IGF-I actúa como un factor enterotrófico circulante que promueve el crecimiento de las criptas y controla las CoSC a través del IGF-IR, mientras que IGFBP3 puede bloquear la señalización de IGF-I uniendo el IGF-I circulante y reduciendo su biodisponibilidad. Además, y lo más importante, los autores de la invención demostraron que IGFBP3 actúa a través de un mecanismo proapoptótico independiente de IGF-I en las CoSC, que los autores de la invención demostraron que expresaban TMEM219 (el receptor de IGFBP3), induciendo de esta forma el fallo del crecimiento de mini intestinos. Este último efecto es mediado por la Caspasa 8 y 9 y depende de TMEM219; de hecho, la ausencia del receptor de IGFBP3 (TMEM219) en CoSC disminuía en gran medida las lesiones de CoSC asociadas con alto nivel de glucosa. La T1D junto con el ayuno prolongado y la caquexia se caracterizan por bajos niveles circulantes de IGF-I (Bondy et al., 1994; Giustina et al., 2014) debido a la liberación hepática reducida de IGF-I, que es controlada y estimulada por la insulina endógena (Le Roith, 1997; Sridhar y Goodwin, 2009). Lo que es más importante, la hiperglucemia parecía tener un efecto directo en la síntesis hepática y la liberación de IGFBP3. La IGFBP3 puede por lo tanto actuar como una hormona hepática que reduce la capacidad de absorción intestinal durante la hiperglucemia. Es interesante que el SPK proporcionaba una prueba de concepto de la hipótesis de los autores de la invención y apoyaba sus hallazgos con respecto a la existencia de factores circulantes que controlan las CoSC. La notable mejora de las características clínicas y funcionales de la DE que los autores de la invención observaron en su estudio, asociada con la reposición de las CoSC y con el restablecimiento de los IGF-I e IGFBP3 circulantes, fortalece la hipótesis de los autores de la invención. Finalmente, la proteína recombinante ecto-TMEM219 recientemente generada mejoró la DE en ratones diabéticos in vivo y restableció la capacidad de los mini intestinos para crecer normalmente in vitro, confirmando así la función de la IGFBP3 en el control de las CoSC y allanando el camino para una nueva estrategia terapéutica potencial. En resumen, el estudio de los autores de la invención muestra que una alteración mediada por IGFBP3 de las CoSC vinculadas a la hiperglucemia es evidente en la DE. Los autores de la invención sugieren que los IGF-I/IGFBP3 circulantes representan una díada hormonal que controla las CoSC y un nuevo objetivo terapéutico para las personas con trastornos intestinales, en particular causados por diabetes mellitus de larga duración (Bondy et al., 1994; Bortvedt y Lund, 2012; Boucher et al., 2010).
Ejemplo 2
Materiales y métodos
Pacientes y diseño del estudio
Se incluyeron en este estudio 60 individuos con T1D+ESRD registrados en la lista de espera para trasplante simultáneo de páncreas-riñón (SPK) coincidentes en (edad de 41 a 43 años), sexo y duración de la T1D (29.4+1.8 años). También se incluyeron 20 sujetos afectados por diabetes tipo 1 (T1D) de 10 a 20 años. También se estudiaron 20 sujetos sanos coincidentes por edad y sexo (CTRL), con función renal normal y parámetros glucometabólicos normales. Los sujetos con T1D+ESRD recibían todos tratamiento con insulina intensivo en el momento de la inclusión en el estudio, mientras que al grupo de CTRL no se le estaba administrando ningún medicamento. Todos los sujetos con T1D+ESRD recibían el mismo tratamiento que la terapia antiplaquetaria (ASA) y antihipertensión (inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina), mientras que 40 de 60 recibían estatinas cuando se incluyeron en el estudio. No se incluyeron sujetos con signos claros de enfermedades inflamatorias intestinales, así como enfermedad celíaca.
Se hizo el seguimiento de los individuos con T1D+ESRD durante 8 años (seguimiento medio: 8.6+1.1 años) después de recibir el trasplante de SPK (n=30) o K+T1D (n=30) de acuerdo con la evaluación quirúrgica macroscópica en el momento del trasplante. No se incluyeron individuos que tomaban un agente anticoagulante oral. Los individuos de SPK fueron todos independientes de insulina durante todo el período de seguimiento, mientras que los individuos con K+T1D recibían terapia intensiva de insulina subcutánea. Todos los sujetos proporcionaron consentimiento informado antes de la inclusión en el estudio. Los estudios no incluidos en el seguimiento clínico rutinario fueron tratados por una aprobación adecuada del Comité Ético Independiente (Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina). Evaluación de IGFBP3 en orina y suero
Se recogió suero de 3 ml de sangre reciente después de centrifugación. Las muestras de orina se recogieron recientes, se centrifugaron y se almacenaron a -80°C. Los niveles de IGFBP3 de todos los grupos de sujetos se evaluaron en muestras congeladas de suero y orina usando kits ELISA disponibles en el mercado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D).
Análisis estadístico
El análisis de correlación y las gráficas se realizaron con el software Prism Graphpad. El análisis de correlación incluía la evaluación de los niveles de IGFBP3 en suero frente a orina de los individuos evaluados, los niveles de IGFBP3 en suero frente la tasa de filtración glomerular estimada (eGFR). La significación estadística se consideró cuando el valor de p era <0.05.
Medición de la función renal y parámetros glucometabólicos.
Se usó la fórmula MDRD para evaluar la tasa de filtración glomerular estimada (eGFR) en ml/min/m2. Los análisis de sangre incluyeron la evaluación de creatinina, glucosa en sangre, hemoglobina glicada en todos los sujetos incluidos en el estudio centrándose en comparar individuos de CTRL con los de T1D e individuos con T1D de larga duración (T1D+ESRD).
Resultados
Los niveles en suero de IGFBP3 se correlacionan con los niveles en orina de IGFBP3
El análisis de los niveles en suero y orina de IGFBP3 en todos los sujetos incluidos en el estudio mostró un aumento significativo de los niveles tanto en suero (Fig.7A) como en orina (Fig. 7B) de IGFBP3 en sujetos con T1D+ESRD en comparación con el CTRL y, en menor medida, con individuos con T1D. Se observó una correlación significativa entre los niveles en orina y los niveles en suero de IGFBP3 en todos los sujetos evaluados (Fig. 7C). Los niveles más altos en suero de IGFBP3 se correlacionan con niveles más altos de IGFBP3 en orina. Con el fin de excluir que esto pueda estar relacionado con la función renal, se llevó a cabo una correlación entre los niveles en suero de IGFBP3 y la función renal (eGFR). Los niveles en suero de IGFBP3 eran significativamente mayores en sujetos con ESRD (eGFR <15 ml/min/m2) (Fig. 7D). Sin embargo, los sujetos con una eGFR > 15 ml/min/m2, por lo tanto no afectados por ESRD, independientemente de la presencia y antecedentes de T1D, no mostraron ninguna correlación estadística significativa entre las concentraciones en suero de eGFR e IGFBP3 (Fig. 7E). Considerando la correlación entre los niveles de IGFBP3 en orina frente a suero en CTRL y comparando sus valores medios y medianos dentro de los percentiles 25° y 75°, los autores de la invención pueden establecer un intervalo para la IGFBP3 urinaria de la siguiente manera:
<350 pg/ml: niveles normales (niveles observados en sujetos sanos)
350-500 pg/ml: niveles alterados (niveles observados en T1D con antecedentes de enfermedad <5 años) > 500 pg/ml: indicativo de enteropatía (niveles observados en T1D de larga duración, sujetos con T1D con otras complicaciones de T1D, antecedentes de T1D> 5 años).
Los autores de la invención también pueden identificar un intervalo normal de niveles de IGFBP3 en orina (<350 pg/ml) considerando su correlación con los niveles de IGFBP3 en suero como se representa en el área gris en la Figura 7F.
Ejemplo 3
Se incluyeron cinco individuos con enfermedad inflamatoria intestinal de larga duración (EII) y se seleccionaron según los niveles periféricos de IGFBP3, IGF-1 y la proporción de IGFBP-3/IGF-1, de acuerdo con el mismo método descrito anteriormente para el análisis de muestras diabéticas.
Se encontró que aunque IGFBP3 aumentaba ligeramente, los niveles de IGF1 se reducían gravemente con una alteración general de la relación IGFBP3/IGF1 (Figura 18). Por lo tanto, en la enfermedad inflamatoria intestinal, está libre una gran cantidad de IGFBP3 y está disponible para ejercer su efecto tóxico en las células madre intestinales.
Por consiguiente, un inhibidor de IGFBP3 también es beneficioso para el tratamiento y/o prevención de enfermedades inflamatorias del intestino.
Ejemplo 4
Material y métodos
Pacientes y diseño del estudio.
Se obtuvieron sesenta muestras de suero de individuos con tipo 1 (T1D), con T1D de larga duración (> 15 años) (T1D de larga duración) y voluntarios sanos (CTRL) emparejados por edad y sexo, de la extracción de sangre en el Hospital San Raffaele. Se recogieron veinte muestras de suero de individuos con resultados positivos de la prueba de autoanticuerpos de islotes en el sitio colaborador de Gainsville (Florida). Se recogieron 235, 200 y 81 muestras de suero de individuos con tolerancia a la glucosa normal (NGT), tolerancia alterada a la glucosa ( iGt ) y diabetes tipo 2 (T2D) de la Universidad de Pisa (Italia) en el estudio del protocolo Genfiev. Se determinó NGT, IGT y T2D basándose en los resultados de la prueba de OGTT de acuerdo con los criterios de ADA 2003.
Los sujetos con T1D y T1D de larga duración recibían todos tratamiento intensivo con insulina en el momento de la inclusión en el estudio, mientras que al grupo de CTRL no se le estaba administrando ningún medicamento. Todos los sujetos con T1D recibían el mismo tratamiento que la terapia antiplaquetaria (AAS) y de antihipertensión (inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina). El tratamiento concomitante, los criterios de inclusión y exclusión ya se han descrito (Diabetes Care 2015) y se describen en el siguiente sitio web https://clinicaltrials.gov/ct2/show/record/NCT008798017teriTFGENFIEV.
Todos los sujetos dieron su consentimiento informado antes de la inclusión en el estudio. Los estudios no incluidos en el seguimiento clínico rutinario fueron tratados por una aprobación apropiada de la Junta de Revisión Institucional (Enteropatia-trapianto/01 Secchi/Fiorina).
Islotes pancreáticos
Los islotes humanos usados en este estudio se aislaron de donantes de órganos de cadáver de acuerdo con el procedimiento ya descrito (Petrelli et al., 2011) de conformidad con los requisitos éticos aprobados por el Comité de Ética de Niguarda Ca Granda. Brevemente, los islotes se aislaron usando el método automatizado ya descrito (D'Addio et al, 2014). Se usaron dos tipos de enzimas: colagenasa tipo P (1-3 mg/ml) y liberasa (0.5-1.4 mg/ml) (Roche, Indianapolis, IN, EE.UU.). Los islotes se purificaron por gradiente discontinuo en jeringas (gradiente de densidad: 1 108; 1096; 1037: Euroficoll, (Sigma-Aldrich, Milán, Italia), o por gradiente continuo con procesador COBE refrigerado como se ha descrito previamente (Nano et al., 2005). Después del aislamiento, los islotes se cultivaron a 22°C en una atmósfera humidificada (5% de CO2 ), en medio M199 (Euroclone, Celbio, Milán, Italia) o CMRL (Mediatech, Cellgro, VA, EE.UU.) complementado con FCS al 10%, penicilina 100 U/ml, sulfato de estreptomicina 100 |j/ml (Euroclone, Celbio) y glutamina 2 mmol/l (Mediatech, Cellgro, VA, EE.UU.). La caracterización in vitro y el cultivo de islotes se llevó a cabo en material de islotes procesado dentro de las 72 h posteriores al aislamiento. Los islotes se cultivaron en CMRL FCS al 10%, complementado con sulfato de estreptomicina 100 jg/ml (Euroclone, Celbio) y glutamina 2 mmol/l (Mediatech, Cellgro, VA, EE.UU.) con una concentración de glucosa 5 mM durante 4 días. Los islotes murinos fueron amablemente proporcionados por el Prof. James Markmann (Unidad de Trasplante, Departamento de Cirugía, Hospital General de Massachusetts, Harvard Medical School, Boston) (Ben Nasr et al., 2015b; Vergani et al., 2010). Los islotes pancreáticos se aislaron de ratones C57B16/J por digestión con colagenasa seguida de separación por gradiente de densidad y después selección manual, como se ha descrito previamente (Forbes et al, 2010). Los islotes se sembraron en placas y se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con L-glutamina, penicilina y 10% como ya se ha descrito, con una concentración de glucosa 5 mM durante 4 días.
Líneas celulares beta
Las células pTC3 y aTC1 de ratón fueron amablemente proporcionadas por Carla Perego, Universidad de Milán, con el permiso del Prof. Douglas Hanahan (Departamento de Bioquímica y Biofísica, Universidad de California, San Francisco, CA) (Di Cairano et al., 2011). Las pTC3 se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) que contenía ácido glutámico 0,1 mM y se complementaron con glutamina 0,7 mM como se ha descrito (Di Cairano et al., 2011). La concentración de glucosa era 11 mM para las líneas celulares.
Patología e inmunohistoquímica
Las muestras se fijaron en formalina tamponada (formaldehído al 4% en p/v y tampón de acetato 0,05 M) y se procesaron rutinariamente en cera de parafina. Se tiñeron secciones de 3 jM de espesor de cada caso incluido con hematoxilina y eosina (HyE) para evaluaciones morfológicas. Para la inmunohistoquímica, se montaron secciones de 3 |jm de espesor en portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina, se desparafinaron e hidrataron a través de alcoholes graduados hasta agua. Después de la recuperación del antígeno, realizada sumergiendo secciones en tampón de citrato 0,01 M, pH 6 durante 10 minutos en un horno microondas a 650 W, así como inhibición de la actividad de peroxidasa endógena, realizada sumergiendo secciones en peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos, la incubación con anticuerpos primarios se llevó a cabo a 4°C durante 18-20 horas, seguido del procedimiento de complejo de avidina-biotina. Las inmunorreacciones se desarrollaron usando tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina al 0,03%, y luego las secciones se contratiñeron con hematoxilina de Harris. Se usaron los siguientes anticuerpos: insulina (Dako, A0564), anticuerpo primario anti-IGFBP3 (policlonal, dilución 1:50, Sigma Aldrich HPA013357) y anticuerpo primario anti-TMEM219 (policlonal, 1:100, Sigma HPA059185). Se hizo el ensayo inmunohistoquímico de tejidos pancreáticos de sujetos sanos, ratones B6 y NOD y en biopsias hepáticas de pacientes con T1D/T2D, pacientes con trasplante de islotes que no lograron la independencia de la insulina. Los tejidos sin hallazgos patológicos se usaron como controles. Todas estas muestras de tejido provienen de los archivos almacenados en la Unidad de Patología del Department of Biomedical, Biotechnological, and Translational Sciences, Universidad de Parma, Parma, Italia. La intensidad de inmunotinción se calificó como 1 (leve), 2 (moderada) y 3 (fuerte), mientras que su difusión era 1 (focal), 2 (zonal) y 3 (difusa).
Inmunoflurescencia
Las muestras de inmunofluorescencia se observaron usando un sistema confocal (Leica TCS SP2 Laser Scanning Confocal). Las imágenes se adquirieron en modo multipista, usando caminos ópticos consecutivos e independientes. Se usaron los siguientes anticuerpos primarios para la tinción de células/tejidos humanos: producto de escisión de citoqueratina monoclonal anti-caspasa de ratón 18 M30 (clon M30, Hoffmann-LaRoche, Basilea, Suiza), IGFBP3 policlonal de conejo (1:250, Sigma, HPA013357), policlonal de conejo para TMEM219 (1:250, Sigma, HPA059185) e insulina policlonal de cobayo (1:50, DAKO, A0564). Los siguientes anticuerpos primarios se usaron para la tinción de tejidos/células murinas: policlonal de conejo para IGFBP3 (1:250, Sigma, SAB4501527), policlonal de cabra para t Me M219 (1:50, Santa Cruz, 244405), policlonal de cobayo para insulina (1:50, DAKO, A0564). Los siguientes anticuerpos secundarios se usaron para la tinción de tejidos/células humanas: de burro anti-IgG de conejo-FITC (Jackson) y de burro anti-IgG de cobayo-TRITC (Jackson). El siguiente anticuerpo se usó para la tinción de tejidos/células murinas: de burro anti-IgG de cabra-FITC (Jackson).
Islotes pancreáticos humanos y murinos cocultivados con/sin IGFBP3 (Life Technologies, 10430H07H5), con/sin ecto-TMEM219 (generado por los autores de la invención en colaboración con Genscript, 130 ng/ml), con/sin alto nivel de glucosa (glucosa 20 mM), con/sin IFN-y e IL-1 p (R&D Systems, Minneapolis, MN 201-LB-005, 2 ng/ml y PeProTech, 300-02, 1 000 U/ml), se tiñeron con TMEM219, insulina y M30 para la inmunofluorescencia para estudios de co-localización. Las células beta murinas cocultivadas en las mismas condiciones que los islotes pancreáticos, se fijaron en tampón neutro al 10% durante 30 min, se lavaron con PBS tres veces y se permeabilizaron con PBS - BSA al 2% triton x100 al 0.3% durante 20 min, se bloquearon con suero al 10%, y finalmente se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche a 4°C y posteriormente se marcaron con anticuerpos secundarios fluorescentes durante 2 horas a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios y secundarios se seleccionaron como se ha descrito antes.
Estudios in vitro de islotes y células beta y caracterización
Condiciones de cultivo
Se cultivaron islotes humanos y murinos en diferentes concentraciones de glucosa (5 mM, 20 mM, Sigma), con/sin estímulos inflamatorios/cóctel (IFN-y + IL-1 p, 2 ng/ml R&D Systems y Peprotech de 1000 U/ml, respectivamente), con/sin IGFBP3 (Life Technologies, 50 ng/ml), con/sin ecto-TMEM219 (130 ng/ml, véase Recombinant proteins and interventional studies) y se recogieron islotes para estudios de inmunofluorescencia, extracción de ARN, detección de apoptosis y análisis de proteínas. Se recogieron los líquidos sobrenadantes para evaluar la secreción de insulina, IGFBP3 e IGF-I.
Las p-TC se cultivaron como se ha descrito previamente, con/sin estímulos inflamatorios/cóctel (IFN-y+IL-1 p), sin IGFBP3, con/sin ecto-TMEM219 (véase Recombinant proteins and interventional studies) y las células se recogieron como para los estudios de islotes.
Inmunotransferencia
Las proteínas totales de las muestras biópticas intestinales se extrajeron en tampón de Laemmli (Tris-HCl 62.5 mmol/l, pH 6.8, glicerol al 20%, SDS al 2%, b-mercaptoetanol al 5%) y se midió su concentración. Se sometieron a electroforesis 35 mg de proteína total en geles de SDS-PAGE al 7% y se transfirieron a nitrocelulosa (Schleicher & Schuell, Dassel, Alemania). Después las manchas se tiñeron con Ponceau S. Las membranas se bloquearon durante 1 h en TBS (Tris [10 mmol/l], NaCl [150 mmol/l]), Tween-20 al 0,1%, leche en polvo sin grasa al 5%, pH 7,4 a 25°C, incubado durante 12 h con un anticuerpo policlonal para IGFBP3 de conejo (Sigma, HPA013357) diluido 1:250, o policlonal de cabra para TMEM219 (Santa Cruz Biotechnology, 244404 o 244405) diluido 1:200 o con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-b-actina (Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:500 en TBS-leche al 5% a 4°C, se lavó cuatro veces con TBS-Tween-20 al 0.1%, después se incubó con un anticuerpo secundario de ratón anti-IgG de conejo marcado con peroxidasa (DAKO) (para IGFBP3) o de conejo anti-IgG de cabra (para TMEM219) o de conejo anti-IgG de ratón para b-actina, diluido 1:1000 (Santa Cruz Biotechnology) en TBS-leche al 5% y finalmente se lavó con TBS-Tween-20 al 0.1%. Las bandas resultantes se visualizaron usando quimioluminiscencia mejorada (SuperSignal; Pierce, Rockford, IL, EE.UU.).
Análisis de qRT-PCR
El ARN de las criptas intestinales purificadas se extrajo con reactivo Trizol (Invitrogen), y el análisis de qRT-PCR se llevó a cabo usando ensayos TaqMan (Life Technologies, Grand Island, NY) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los valores de expresión normalizados se determinaron usando el método de AACt. Los datos de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) se normalizaron para la expresión de ACTB y se calcularon los valores de ACt. El análisis estadístico comparó la expresión génica en todas las poblaciones celulares para cada paciente por ANOVA de una vía seguido de prueba a posteriori de Bonferroni para comparaciones múltiples entre la población de interés y todas las demás poblaciones. El análisis estadístico se realizó también mediante el uso del software RT2 profiler PCR Array Data Analysis (Qiagen) disponible. Para la comparación de dos grupos se empleó la prueba t de Student. El análisis se llevó a cabo por triplicado antes/después de 3 días de cultivo. A continuación se presentan las principales características de los cebadores usados para genes humanos:
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A continuación, se presentan las principales características de los cebadores usados para genes murinos:
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Ensayo ELISA
Los niveles de IGF-I e IGFBP3 en los sueros/plasma mezclados de todos los grupos de sujetos y en todos los grupos de ratones tratados y no tratados se evaluaron usando kits de ELISA disponibles en el mercado, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D SG300 y Sigma RAB0235).
Se cultivaron hepatocitos primarios humanos (HEP10™ Pooled Human Hepatocytes, ThermoFisher Scientific) durante 3 días en medio Williams según las instrucciones del fabricante en diferentes concentraciones de glucosa: 11 mM, 20 mM y 35 mM. Se recogió el líquido sobrenadante del cultivo y se evaluó la IGFBP3 usando un kit de ELISA de IGFBP3 (Sigma, RAB0235) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células recogidas se separaron mediante tripsina y se contaron con un hemocitómetro.
Los niveles de insulina se analizaron con un inmunoensayo enzimático de micropartículas (Mercodia Iso-Insulin ELISA, 10-1113-01) con coeficientes de variación (CV) intra e inter-ensayo de 3.0% y 5.0%.
Proteínas recombinantes y estudios de intervención.
Se añadieron IGF-I humano recombinante (Sigma, 13769), 100 ng/ml (IGF-I), IGFBP3 humano recombinante (Life Technologies, 10430H07H5), 50 ng/ml (iGf BP3), anti-IGF-IR (Selleckchem, Boston, OSI-906), 1 |jM/l y ecto-TMEM219 (D'Addio et al., 2015), 130 ng/ml a cultivos de islotes/células el día 1 desde la recogida de islotes/cultivo celular. Los islotes pancreáticos y las células beta también se expusieron a condiciones diabetogénicas complejas: glucosa 20 mM, la mezcla de IL-I p humana recombinante 2 ng/ml (R&D Systems, Minneapolis, M 201-LB-005) y IFN-y humano recombinante 1000 U/ml (PeProTech, 300-02) durante 72h.
Se administró IGFBP3 (Reprokine, Valley Cottage, NY) a ratones B6 naive en 150 jg/ratón/día durante 15 días por vía intraperitoneal (i.p.); se administró ecto-TMEM219 in vivo a ratones B6 tratados con STZ, a NOD de 10 semanas de edad y a B6 alimentados con una dieta alta en grasas (HFD-B6) por vía intraperitoneal (ip) con una dosis de 150 jg/ratón/día durante 15 días en B6 tratados con STZ y en NOD, y 100 jg/ratón cada dos días durante 8 semanas en ratones HFD-B6.
Estudios en animales
Se obtuvieron ratones C57BL/6 (B6) machos y ratones hembra diabéticas no obesas (NOD) (4 semanas y 10 semanas de edad) del Laboratorio Jackson, Bar Harbor, Maine. Todos los ratones se atendieron y usaron de acuerdo con las pautas institucionales aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina de Harvard. Los ratones B6 se hicieron diabéticos usando un enfoque químico con inyección de estreptozotocina (STZ) (225 mg/kg, administrados i.p.; Sigma S0130) este modelo es aceptado y validado como modelo de diabetes T1D (Carvello et al, 2012; Petrelli et al., 2011; Vergani et al., 2013). La diabetes se definió tanto en B6 tratados con STZ como en NOD como niveles de glucosa en sangre>250 mg/dl durante 3 medidas consecutivas.
Para estudiar el inicio y la evolución de la T2D, los ratones B6 (6 semanas de edad) se alojaron en una casa de animales libre de gérmenes de acuerdo con los Principios de Cuidado de Animales de Laboratorio (Publicación NIH N° 85-23, revisada 1985) y recibieron agua y alimentos a voluntad. El protocolo de estudio fue aprobado por el comité de ética local. Los ratones se alimentaron con una dieta alta en grasas (HFD) (dieta DIO D12492, 60% del total de calorías provenientes de grasas) o una dieta normal en grasas (NFD; dieta DIO D12450B; 10% del total de calorías provenientes de grasas), compradas en Research Diets (Mucedola, Settimo Milanese, Italia). Cada grupo de tratamiento o control consistía en 10 animales. Después de 16 semanas, se midió la glucemia y se llevó a cabo la prueba de tolerancia a la glucosa IV (IVGTT). Al día siguiente, los ratones se anestesiaron y después se obtuvo una muestra de sangre y se recogió el páncreas para estudios histológicos. Una porción del tejido también se congeló rápidamente y se almacenó en Trizol para realizar estudios por RT-PCR.
Finalmente, se recogieron plasma y suero para realizar análisis de IGF-I (IGF-I ELISA kit, R&D MG100), IGFBP3 (IGFBP3 ELISA kit, R&D MGB300) y niveles de insulina (Mouse Insulin ELISA kit, Mercodia, 10-1247-01). La glucosa en sangre se controló dos veces por semana hasta 12 semanas en HFD-B6 para confirmar el inicio y la permanencia de la diabetes.
Análisis estadístico
Los datos se presentan como media y error estándar de la media (SEM) y se analizaron la distribución normal con la prueba de Kolmogorov-Smirnov y la homogeneidad de las variaciones con la prueba de Levene. La significación estadística de las diferencias se analizó con la prueba t de dos colas y las pruebas de chi cuadrado (x2). La significación entre los dos grupos se determinó por la prueba t de Student de dos colas para datos no pareados. Para comparaciones múltiples, se usó la prueba ANOVA con corrección de Bonferroni. Todos los datos se introdujeron en el Paquete Estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS®, IBM®, SPSS Inc., Chicago, IL) y se analizaron. Las gráficas se generaron usando GraphPad Prism versión 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA). Todas las pruebas estadísticas se realizaron al nivel de significación de 5%.
Resultados
Los niveles periféricos de IGFBP3 son mayores en ratones prediabéticos y diabéticos
Con el fin de identificar factores circulantes potenciales que pueden tener una función en la inducción de la muerte de las células beta, los autores de la invención realizaron el perfil del proteoma sérico de sujetos sanos y de individuos con riesgo de T1D, basándose en la presencia de uno o más autoanticuerpos anti-islotes, usando un enfoque proteómico sin sesgo. Las proteínas, que eran significativamente diferentes (valor de p <0.01) en la mezcla de control frente a los individuos con riesgo para el grupo de T1D, se sometieron además a un análisis de agrupamiento jerárquico. Era evidente un perfil proteómico claro en individuos con riesgo de T1D (y también manifiestamente en T1D) en comparación con sujetos sanos, segregándose más de 50% de las proteínas detectadas en un grupo o el otro. En particular, los niveles de proteínas de unión a IGF-I 3 (IGFBP3) eran mayores en individuos con riesgo de T1D usando un ensayo inmunodirigido (Fig. 19A), y por lo tanto precedía el inicio de la hiperglucemia. Es interesante que los niveles de IGFBP3 también estaban alterados en las muestras obtenidas del Estudio Genfiev, que incluía a más de 800 individuos, y los clasificaba en función de los resultados de la prueba de OGTT en tres categorías principales: sujetos con tolerancia a la glucosa normal (NGT), tolerancia a la glucosa alterada (IGT) ) e individuos con T2D (T2D). Los autores de la invención observaron que los niveles de IGFBP3 aumentaron en sujetos IGT y T2D en comparación con los NGT, lo que confirma que los altos niveles periféricos de IGFBP3 caracterizaban principalmente afecciones pre-diabéticas (Fig. 19B). Para demostrar el efecto perjudicial de IGFBP3 en los islotes y las células beta, los autores de la invención primero demostraron que ratones NOD pre­ diabéticos, así como ratones NOD diabéticos y ratones C57BL/6 con diabetes inducida por estreptozotocina (STZ-B6) presentaban mayores niveles de IGFBP3 periférico en comparación con B6 naive (Fig. 20A). Los autores de la invención confirmaron esto en un modelo murino de T2D, el modelo HFD. Los ratones C57B16/J (B6) alimentados con una dieta alta en grasas, que desarrollan T2D en 16 semanas, mostraron niveles mayores de IGFBP3 periférico en comparación con los ratones B6 alimentados con una dieta normal en grasas (Fig. 20B).
Aumento de la producción de IGFBP3 por hepatocitos en entorno inflamado y en T1D.
Se sabe que el hígado es un sitio de producción de IGFBP3. Con el fin de explorar si los estímulos inflamatorios podrían influir en la producción hepática de IGFBP3, los autores de la invención cultivaron hepatocitos primarios humanos con diversas citoquinas y con diferentes concentraciones de glucosa (11, 20 y 35 mM) y demostraron que los niveles de IGFBP3 en los líquidos sobrenadantes aumentaban rápidamente después de diferentes estímulos proinflamatorios y mayores niveles de glucosa (Fig. 21: A-B).
TMEM219 se expresa en islotes humanos.
Con el fin de evaluar el efecto del eje IGFBP3/TMEM219 en los islotes y las células beta, los autores de la invención primero evaluaron la expresión de TMEM219 usando inmunofluorescencia y su localización conjunta con insulina en la microscopía confocal (Fig. 22: A1-A2). Se estudiaron islotes humanos obtenidos de donantes cadáveres cuyo páncreas no era adecuado para la donación de órganos. TMEM219 (tinción verde) se expresa de manera difusa dentro de los islotes y se co-localiza con insulina (tinción roja) (Fig. 22: A1-A2). Los autores de la invención evaluaron además la expresión de los otros receptores conocidos para IGFBP3 (es decir, LPR1, TGF-pR1 y TGF-pR2) pero ninguno aparecía expresado (Fig. 22B). Después, los autores de la invención confirmaron la expresión de TMEM219 usando RT-PCR y WB (Fig. 22: B-C). Los autores de la invención probaron además la expresión de TMEM219 en islotes murinos usando RT-PCR y excluyeron la de otros receptores de IGFBP3 conocidos (LRP1, TGF-beta tipo 1 y TGF-beta tipo 2) ya descritos en otras células y modelos (Baxter, 2013; Forbes et al., 2010) (Fig. 23A). Finalmente, los autores de la invención hicieron uso de la disponibilidad de líneas celulares beta y alfa murinas (aTC y pTC), y determinaron por RT-PCR que la expresión de TMEM219 está restringida a las células beta, mientras que otras células de los islotes, como las células alfa, no los expresan (Fig. 23B) y confirmaron además la expresión de TMEM219 por WB (Fig. 23C). La tinción de inmunofluorescencia de TMEM219 (verde) y su colocalización con insulina también se confirmó en la línea de células beta en el microscopio confocal (Fig. 23D).
IGFBP3 daña una línea de células beta in vitro.
Para demostrar que IGFBP3 se dirige a células beta dentro de los islotes, los autores de la invención cultivaron una línea de células beta (pTC) durante 3 días con/sin IGFBP3. Mediante el uso de un ensayo de viabilidad/apoptosis, los autores de la invención pudieron demostrar un porcentaje reducido de células beta viables en afecciones tratadas con IGFBP3 en comparación con las no tratadas (Fig. 24A). Es interesante que las células beta tratadas con IGFBP3 también mostraron un aumento significativo de la expresión de caspasa 8 (Fig. 24B) y una reducción de la expresión de insulina tanto por inmunofluorescencia como por RT-PCR (Fig. 24: C, D1-D2, E). Es interesante que la apoptosis inducida por IGFBP3 era notablemente más alta que la inducida por los estímulos proinflamatorios de IL-lp e IFN-y (Fig. 24: A-B) y la expresión y liberación de insulina se reducían solo ligeramente (Fig. 24: C-E).
IGFBP3 daña los islotes murinos in vitro.
Para demostrar además el efecto perjudicial mediado por IGFBP3 en los islotes, los autores de la invención cultivaron islotes murinos aislados de ratones C57BL/6 durante 4 días con/sin IGFBP3. La aparición de apoptosis extensa evaluada por FACS (Anexina V+7AAD') mostró que los islotes tratados con IGFBP3 sufrían apoptosis temprana (87±2 frente a 67±2%, p=0.004), asociada con un aumento en la expresión de caspasa 8 y con una disminución en la expresión de insulina por RT-PCR (Fig. 25 : A-C).
IGFBP3 daña los islotes humanos in vitro.
Los autores de la invención finalmente confirmaron los efectos perjudiciales mediados por IGFBP3 en islotes humanos al demostrar que los islotes humanos cultivados in vitro, obtenidos de donantes cadáveres cuyos páncreas no eran adecuados para la donación de órganos, expuestos a IGFBP3 durante 4 días sufrían una gran apoptosis (Fig. 26A), mostraba un aumento de la expresión de caspasa 8 (Fig. 26B) y una mayor expresión de M30 (Fig. 8: C1-C2), un marcador de apoptosis, asociado con una disminución de la expresión de insulina en la inmunotinción (Fig. 26: D1-D2) y usando RT-PCR (Fig. 26E).
La inyección de IGFBP3 en ratones C57BL/6 altera la morfología de los islotes in vivo.
Con el fin de confirmar que IGFBP3 altera la morfología de los islotes, los autores de la invención inyectaron IGFBP3 recombinante (Reprokine) en ratones B6 no tratados previamente y B6 tratados con STZ (150 |jg cada día durante 15 días). El análisis de histología (HyE) de los páncreas recogidos demostró un aumento de la alteración en los islotes de ratones STZ-B6 tratados con IGFBP3 en comparación con los islotes de ratones no tratados previamente y STZ-B6 , confirmado por la expresión de insulina dispersa tras la inmunotinción (Fig. 27: A1-A6).
La proteína recombinante ecto-TMEM219 previene el daño asociado a IGFBP3 en una línea de células beta in vitro. Para demostrar que ecto-TMEM219 previene los efectos perjudiciales asociados con IGFBP3 específicamente en las células beta, los autores de la invención cultivaron una línea de células beta con IGFBP3 y ecto-TMEM219 y observaron que la apoptosis de las células beta se reducía en gran medida por la adición de ecto-TMEM219. El efecto también se confirmó por el análisis de la expresión de caspasa 8 que aparecía reducida en células beta tratadas con IGFBP3+ecto-TMEM219 en comparación con las cultivadas solo con IGFBP3 (Fig. 28: A-B). La expresión de insulina, evaluada por RT-PCR e inmunofluorescencia (rojo), aumentaba consistentemente por la adición de ecto-TMEM219 a las células beta cultivadas con IGFBP3 (Fig. 2 8 : C1-C3).
La proteína recombinante ecto-TMEM219 previene los efectos perjudiciales asociados a IGFBP3 en islotes murinos in vitro.
Con el fin de confirmar aún más las propiedades terapéuticas de ecto-TMEM219 en la prevención del daño asociado a IGFBP3, los autores de la invención probaron el efecto de ecto-TMEM219 en islotes murinos cultivados in vitro. La adición de ecto-TMEM219 (relación molar con IGFBP3 2:1) a islotes C57BL/6 aislados cocultivados con IGFBP3 anulaba el efecto pro-apoptótico de IGFBP3. Además, la expresión de caspasa 8 era significativamente menor en islotes cultivados con IGFBP3 y ecto-TMEM219 (Fig. 29A). La expresión de insulina aumentaba por la adición de ecto-TMEM219 a islotes murinos cultivados con IGFBP3 (Fig. 29B), enfatizando un efecto favorable de ecto-TMEM219 en la preservación de la función de los islotes.
La proteína recombinante ecto-TMEM219 previene los efectos perjudiciales de IGFBP3 en islotes humanos in vitro. Para demostrar los efectos beneficiosos de ecto-TMEM219 en la prevención de la destrucción de islotes, los autores de la invención cultivaron islotes humanos con IGFBP3 y ecto-TMEM219 durante 4 días y los autores de la invención demostraron un rescate del daño de islotes mediado por IGFBP3 por ecto-TMEM219, asociado con un aumento de la expresión de insulina y una disminución de la expresión de caspasa 8 en RT-PCR (Fig. 30: A-B).
Es interesante que la tinción conjunta de insulina (rojo) y M30 (verde), un marcador de apoptosis, confirmaba que las células productoras de insulina estaban protegidas por ecto-TMEM219 durante el cocultivo con IGFBP3 (Fig. 30: C1-C3).
La proteína recombinante ectoTMEM219 previene las alteraciones de islotes asociadas a IGFBP3.
Con el fin de probar el efecto de ecto-TMEM219 en el tratamiento de la diabetes, los autores de la invención midieron los niveles de insulina en suero en ratones diabéticos tratados con STZ a las 8 semanas y observaron que la insulina aumentaba significativamente en aquellos ratones que eran tratados con ecto-TMEM219 (i.p. 150 jg en días alternos durante 2 semanas) en comparación con los STZ-B6 no tratados (Fig. 31A). Finalmente, en otro modelo de lesión de islotes in vivo, ratones B6 alimentados con una dieta alta en grasas (B6 -HFD) mostraron niveles alterados de glucosa e insulina en sangre, mientras que los B6 -HFD tratados con ecto-TMEM219 (i.p. 100 jg en días alternos durante 6 semanas) mantenían niveles de glucosa e insulina casi normales (Fig. 31B), lo que sugiere un efecto curativo de ecto-TMEM219 en la diabetes tipo 1 y tipo 2.
Discusión
La diabetes tipo 1 (T1D) se ha considerado históricamente como una enfermedad autoinmunitaria mediada por células T, que da como resultado la destrucción de las células beta pancreáticas productoras de insulina (Bluestone et al., 2010; Eisenbarth, 1986). Según esta perspectiva, un factor iniciador desencadena la respuesta inmunitaria contra autoantígenos, y las células T autorreactivas posteriormente recién activadas se dirigen y además destruyen las células beta productoras de insulina (Bluestone et al., 2010). Si la destrucción de las células beta está determinada únicamente por el ataque autoinmunitario o si otros mecanismos tales como la modulación paracrina, desregulación metabólica y la apoptosis de células beta no inmunitarias contribuyen a la patogénesis de la T1D ahora es un tema de debate (Atkinson y Chervonsky, 2 0 1 2 ; Atkinson et al, 2015). Recientemente, se ha observado que pueden ser necesarios factores del entorno (p. ej., infecciones víricas, dieta, exposición neonatal a la leche y la microbiota) para iniciar la respuesta autoinmunitaria en la diabetes tipo 1 (Filippi y von Herrath, 2008; McLean et al., 2015). Por lo tanto, está surgiendo gradualmente un nuevo enfoque para estudiar la patogénesis de la T1D (McLean et al., 2015), de modo que los factores inmunológicos y genéticos ya no se consideran el único determinante de la T1D (Alper et al., 2006; Oilinki et al., 2012). Además, ahora se cuestiona la eficacia de las estrategias inmunoterapéuticas, que en la última década se ha considerado que son la principal esperanza para establecer una cura para la T1D (Ben Nasr et al., 2015a). Aunque se mostró que dirigirse a la respuesta autoinmunitaria usando un tratamiento inmunosupresor o un régimen pro-regulador era satisfactorio en roedores, dichas estrategias, al contrario, lograron la independencia de la insulina en un número insignificante de individuos con T1D (Atkinson et al., 2015). Además de subrayar la diferencia entre los modelos animales y humanos, estos datos también arrojan luz sobre el hecho de que la investigación de la respuesta inmunitaria examinaba principalmente los sucesos inmunitarios que ocurren en la periferia, mientras que se sabe poco con respecto al proceso de la enfermedad que ocurre dentro de los islotes y particularmente en las células beta. En este sentido, el descubrimiento de nuevos factores implicados en el inicio/facilitación de la pérdida de células beta en la T1D será de gran valor. Dichos descubrimientos pueden allanar el camino para nuevos enfoques terapéuticos capaces de detener o retrasar la primera fase de la enfermedad. En la presente invención se encontró que en individuos con riesgo alto de T1D y en aquellos con T1D sintomática, los niveles periféricos de IGFBP3 están aumentados. Es interesante que también se observó un patrón similar en individuos con riesgo de desarrollar T2D (IGT, IFG), donde la intolerancia a la glucosa ya era detectable, y en aquellos con T2D establecida, confirmando que, a pesar de una etiología diferente, el mediador de la pérdida de células beta, que ocurre en ambos tipos de diabetes, puede ser el mismo, una betatoxina llamada IGFBP3. De hecho, tanto la T1D como la T2D se caracterizan por una pérdida de células beta, que da como resultado una secreción reducida de insulina, falta de control de los niveles de glucosa en sangre e hiperglucemia (Brennand y Melton, 2009; Yi et al., 2014). A pesar de los diferentes mecanismos etiológicos, la respuesta autoinmunitaria en la T1D o la resistencia a la insulina/inflamación en la T2D, conducen a una reducción progresiva de la masa de células beta. Actualmente hay varios enfoques disponibles para tratar la T1D y la T2D, pero ninguno de ellos tiene como objetivo dirigirse a la pérdida de células beta, proteger frente a la lesión de las células beta y preservar la masa de células beta, previniendo así la aparición de diabetes. IGFBP3 también puede ser un mecanismo para explicar la descompensación observada en pacientes con T2D, que pierden lenta pero constantemente su función de células beta y dejan de producir insulina. La sobreproducción crónica de IGFBP3 observada en T2D puede favorecer la destrucción de las células beta y conducir al fallo, por ejemplo, del agente antidiabético oral. Los autores de la invención también han observado que el receptor de IGFBP3 (TMEM219) se expresa en islotes murinos/humanos, y que su unión por IGFBP3 es tóxica para las células beta, lo que aumenta la posibilidad de la existencia de una toxina de células beta endógena (betatoxina) que puede estar implicada en la fase temprana de la T1D y en la diabetes en general. Un factor no inmunológico puede determinar lesiones de los islotes/células beta y facilitar la exposición de los autoantígenos a las células inmunitarias, creando así un entorno inflamado local y una reacción inmunitaria sostenida. Ya se ha descrito que el hígado es la fuente principal de IGFBP3, y su exposición a la inflamación y los altos niveles de glucosa aumentan significativamente la liberación de IGFBP3 en la circulación. Como resultado, la IGFBP3 se dirige a los islotes y las células beta favoreciendo así su daño y pérdida. Por lo tanto, la neutralización de la lesión de células beta mediada por IGFBP3 mediante el uso de inhibidores recién generados del eje IGFBP3/TMEM219, tal como el ecto-TMEM219 recombinante, puede prevenir la pérdida de células beta inactivando la IGFBP3 periférica, bloqueando así su señalización a través de TMEM219 y deteniendo/retrasando el avance de la T1D (Fig. 32). Esto puede conducir a la aplicación clínica en el campo de la prevención de la diabetes, dando como resultado el uso de ecto-TMEM219 en individuos con riesgo alto de T1D y finalmente T2D. Por lo tanto, los inhibidores del eje IGFBP3/TMEM219 pueden prevenir lesiones tempranas de células beta asociadas con la fase temprana de la T1D, por la inhibición de la unión de IGFBP3 a TMEM219 expresado en el tejido diana. Teniendo en cuenta su función en la prevención de la pérdida temprana de células beta, los inhibidores del eje IGFBP3/TMEM219 también pueden considerarse beneficiosos en el tratamiento temprano de la T2D. Por lo tanto, los inhibidores del eje IGFBP3/TMEM219 pueden representar una estrategia terapéutica que previene la aparición de diabetes y protege a las células beta de la pérdida y el daño, convirtiéndose así en una opción clínica relevante para individuos con riesgo de desarrollar diabetes, tanto T1D como T2D, y en aquellos con diabetes en las primeras etapas. Las personas con riesgo de desarrollar T1D se caracterizan principalmente por la detección temprana en el suero de múltiples autoanticuerpos contra péptidos de islotes, que normalmente están ausentes en sujetos sanos (Ziegler et al., 2013). Estos individuos en general son parientes (hermanos, hermanas) de personas con T1D, pero no tienen ningún signo o síntoma relacionado con la T1D. La probabilidad de evolución a la T1D en estos sujetos en el espacio de 10 años es alta, desarrollando la mayoría de ellos (70%) T1D en los siguientes 15 años, pero a menudo se subestiman (Ziegler et al, 2013). Los individuos con riesgo de desarrollar T2D son difíciles de identificar, especialmente en la fase temprana. La prevención consiste principalmente en modificaciones del estilo de vida, que pueden retrasar la aparición de la enfermedad, pero no pueden prevenirla (Schwarz et al, 2012). Están en marcha varios métodos de detección (análisis genético, perfil metabolómico, evaluación de obesidad y factores de riesgo) para detectar alteraciones tempranas en el metabolismo de la glucosa, pero los agentes terapéuticos capaces de prevenir o proteger frente a la aparición de la T2D no están disponibles y las opciones actuales solo incluyen agentes antidiabéticos que controlan la hiperglucemia y retrasan la evolución a la diabetes tipo 2 (metformina), o agentes que controlan otros factores de riesgo (agentes hipolipemiantes y reductores de la presión) (Nathan, 2015). Por lo tanto, los tratamientos destinados a reducir la carga de diabetes en la población general, tanto T1D como T2D, deberían centrarse en estas poblaciones de riesgo alto. Esta invención está destinada a ser un nuevo agente terapéutico clínico para ser usado en individuos con riesgo de desarrollar diabetes para prevenir su aparición y en aquellos que se encuentran en las primeras etapas de la enfermedad (nueva aparición) para proteger frente a la evolución a diabetes establecida, contrarrestando la pérdida de células beta y preservando la masa de células beta. Dada su función en la prevención de la pérdida y el daño de células beta, los inhibidores del eje IGFBP3/TMEM219 son útiles en individuos con riesgo de desarrollar T1D o T2D, y en aquellos con la enfermedad en etapas tempranas.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, en donde dicho inhibidor es un fragmento del receptor TMEM219, comprendiendo dicho fragmento un dominio extracelular de TMEM219.
2. El inhibidor para usar según la reivindicación 1, que es ecto-TMEM219.
3. El inhibidor para usar según una cualquiera de las reivindicaciones previas, que es soluble.
4. El inhibidor para usar según una cualquiera de las reivindicaciones previas, que está pegilado.
5. El inhibidor para usar según una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde dicho inhibidor es una proteína de fusión basada en Fc.
6. Un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, en donde dicho inhibidor es un polinucleótido que codifica el fragmento del receptor TMEM219 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
7. Un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, en donde dicho inhibidor es un vector que comprende o expresa el polinucleótido como se define en la reivindicación 6.
8. Un inhibidor del eje IGFBP3/TMEM219 para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes en un sujeto, en donde dicho inhibidor es una célula hospedante genéticamente modificada que expresa el fragmento del receptor TMEM219 como se define en una cualquiera de la reivindicación 1 a 3, o el polinucleótido como se define en la reivindicación 6.
9. El inhibidor para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la diabetes es diabetes tipo 1 o tipo 2.
10. El inhibidor para usar de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde el sujeto se selecciona del grupo que consiste en: un sujeto con riesgo de desarrollar diabetes tipo 1 y/o tipo 2, un sujeto con diabetes tipo 1 y/o tipo 2 en etapa temprana.
11. Una composición farmacéutica para usar en el tratamiento y/o prevención de la diabetes, que comprende el inhibidor según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y vehículos farmacéuticamente aceptables.
12. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 11, que además comprende un agente terapéutico.
13. La composición farmacéutica para usar según la reivindicación 12, en donde el agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en: insulina en cualquier forma, pramlintida (Symlin), inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) o bloqueadores del receptor de angiotensina II (ARB), aspirina, fármacos reductores del colesterol, metformina (Glucophage, Glumetza, otros), sulfonilureas (gliburida (DiaBeta, Glynase), glipizida (Glucotrol) y glimepirida (Amaryl), meglitinidas (por ejemplo, repaglinida (Prandin) y nateglinida (Starlix)), tiazolidinadionas (rosiglitazona (Avandia) y pioglitazona (Actos) por ejemplo), inhibidores de DPP-4 (sitagliptina (Januvia), saxagliptina (Onglyza) y linagliptina (Tradjenta)), agonistas del receptor de GLP-1 (exenatida (Byetta) y liraglutida (Victoza)), inhibidores de SGLT2, los ejemplos incluyen canagliflozina (Invokana) y dapaglifiozina (Farxiga).
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