ES2758424T3 - Método de diagnóstico de los trastornos causados por alcoholización fetal - Google Patents

Abstract

Método in vitro de diagnóstico de trastorno de la alcoholización fetal (TCAF) en un sujeto, que comprende unas etapas de: a) medir la cantidad de Placental growth factor (PlGF) en una muestra biológica de dicho sujeto; y b) comparar la cantidad de PlGF de la etapa a) con una referencia, y c) determinar un TCAF en dicho sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de diagnóstico de los trastornos causados por alcoholización fetal.

Introducción

El alcohol es un teratógeno físico y conductual. En el ser humano, la exposición prenatal al alcohol puede conducir a alteraciones del desarrollo cerebral. Así, el consumo de alcohol durante el embarazo (alcoholización fetal) constituye la primera causa de discapacidad y en particular de retraso mental de origen no genético en el mundo, pero también en Francia.

Los daños varían según el periodo en el que el feto haya estado expuesto, las tasas de alcoholemia, los factores genéticos y medioambientales, el modo de consumo (crónico, borracheras).

El síndrome de alcoholización fetal (SAF) constituye la manifestación más extrema e incapacitante de los trastornos causados por alcoholización fetal (TCAF). Asocia anomalías físicas como la hipotrofia (retraso de crecimiento), la dismorfia craneofacial y anomalías neuroconductuales que se manifiestan por unos trastornos de las funciones cognitivas (trastornos de la atención, de la motricidad, del aprendizaje o también de la memoria). El diagnóstico de los niños SAF es relativamente fácil. En base a anomalías morfológicas, se pueden establecer en el útero o en el nacimiento.

Por el contrario, numerosos niños con TCAF no presentan las anomalías morfológicas de los niños con SAF, lo cual compromete el diagnóstico precoz. Sin embargo, estos niños no están exentos de enfermedades. Estas incapacidades/discapacidades se detectarán en los primeros años de vida (hiperactividad, trastornos de la atención) mientras que se hubieran podido aprovechar meses importantes de tratamientos a partir del primer año de vida. Estos déficits se asociarán, a largo plazo, a incapacidades sociales, profesionales y familiares. El futuro de estos niños y su inserción profesional están, por lo tanto, seriamente hipotecados. Un diagnóstico a partir del nacimiento permitiría un tratamiento precoz de estos niños esencial para reducir al máximo las incapacidades asociadas a la alcoholización fetal.

Hasta la fecha, se han llevado a cabo unos esfuerzos significativos para identificar los biomarcadores de exposición a la alcoholización fetal, es decir marcadores que permitan responder a la pregunta: ¿ha sido expuesto el niño al alcohol durante su vida fetal?

Ahora bien, esta información, aunque importante, no puede mejorar por sí sola el tratamiento de los recién nacidos y por varias razones. En primer lugar, no existe umbral de toxicidad del alcohol. Dicho de otra manera, una exposición demostrada no se asociará necesariamente a trastornos del desarrollo del niño. En contrapartida, una exposición episódica a un momento clave del neurodesarrollo no estará exenta de consecuencias y el concepto de ventana de vulnerabilidad está ahora claramente admitido. Además, los modos de consumo han cambiado considerablemente. Así, en los adolescentes, el consumo episódico, como la embriaguez asociada a los fines de semana, aumenta claramente tanto en las chicas como en los chicos. Finalmente, dado que los biomarcadores de exposición desarrollados hasta ahora se dirigen con mayor frecuencia a una exposición crónica, existe un riesgo real de falsos negativos.

El documento US2010/0311067 describe la detección de biomarcadores para detectar una exposición al alcohol in utero y los trastornos de la alcoholización fetal. Rosenberg et al. describe que la expresión placentaria de, entre otros, el Factor de Crecimiento Placentario, se reduce después del consumo moderado de alcohol durante el embarazo en las ratas (Rosenberg, Alcohol, 44: 673-690, 2010).

Por lo tanto, existe la necesidad de elaborar unos biomarcadores que permitan seguir los efectos de la alcoholización in utero.

Descripción

La presente invención ofrece la oportunidad de desarrollar un biomarcador placentario de lesión cerebral de la alcoholización fetal. Este tipo de biomarcador no se ha desarrollado nunca hasta la fecha. En efecto, los biomarcadores actuales de la alcoholización fetal son unos biomarcadores denominados de exposición, que permiten determinar si la madre ha consumido alcohol durante el embarazo o si el niño estuvo expuesto in utero. Pero, salvo los casos más graves (Síndrome de alcoholización Fetal, SAF), un biomarcador de exposición no permite deducir un impacto cerebral de una alcoholización in utero. Hasta la fecha, la mayoría de los niños con TCAF se libran de un diagnóstico precoz. Por otro lado, y por razones económicas evidentes, no se puede considerar tratar todos los niños cuyas madres hayan consumido alcohol durante el embarazo.

La presente invención permite, a diferencia de los biomarcadores de la técnica anterior, controlar los efectos de la alcoholización fetal. En efecto, los inventores han mostrado que la evaluación de PlGF permite identificar, en los niños expuestos in utero al alcohol, aquellos que han sufrido lesiones cerebrales. En particular, el nivel de PlGF indica cuáles son los niños cuyo sistema vascular cerebral está alterado, como resultado de una angiogénesis cerebral alterada. Ahora bien, estos niños, hasta la fecha, escapan de un diagnóstico precoz. La presente invención palia, por lo tanto, el déficit de diagnóstico precoz observado para los niños con TCAF, que representan en Francia 9 casos por 1000 nacimientos y cuyos síntomas clínicos (hiperactividad, trastornos de la atención, etc.) se detectan sólo tardíamente (por ejemplo entre 4 y 5 años, durante la escolarización). La presente invención permite, por lo tanto, realizar precozmente un tratamiento adecuado de estos niños. Este tratamiento consistirá en estimular las funciones motoras, sensoriales y cognitivas del niño en un periodo (niñez) en el que la plasticidad cerebral es máxima.

En un estudio anterior, (Pia Vuorela et al. Alcoholism: Clinical and Experimental Research., 2002) se midió la tasa de PlGF en la sangre periférica de las mujeres embarazadas que consumieron alcohol y se comparó con la de las mujeres embarazadas abstinentes. Según este estudio, la concentración de PlGF en el suero aumenta en las mujeres embarazadas que consumen alcohol durante el segundo y el tercer trimestre del embarazo con respecto a las mujeres abstinentes. Contrariamente a lo que se ha descrito por Pia Vuorela et al., los inventores de la presente invención han demostrado que el consumo de alcohol durante el embarazo provoca la disminución de la expresión de PlGF a nivel fetal. La disminución de la tasa de PlGF está asociada a una disminución de la expresión de receptores pro-angiogénicos cerebrales del feto y a una reducción de la angiogénesis cerebral fetal. Los efectos moleculares de la reducción de la tasa PlGF, que imitan a los de la alcoholización fetal, demuestran la validez fisiológica de la presente invención.

Según un primer aspecto, la invención tiene por objeto un método in vitro de diagnóstico de trastornos de la alcoholización fetal (TCAF) en un sujeto, comprendiendo dicho método unas etapas de:

a) medir la cantidad de PlGF en una muestra biológica, y

b) comparar la cantidad de PlGF de la etapa a) con una referencia, y

c) determinar un trastorno de la alcoholización fetal.

Se entiende por “PlGF” o “factor de crecimiento placentario” o “Placental growth factor” (todas estas expresiones son sinónimas) una proteína de la familia de los factores de crecimiento del endotelio vascular (VEGF). Más particularmente, el PlGF, en el sentido de la invención, es una proteína de 149 aminoácidos muy similar a VEGF-A que está reconocida por el mismo receptor que este último, el VEGF-R1. El PlGF es expresado fuertemente por la placenta, pero no por el cerebro fetal. El PlGF glicosilado en N-terminal se segrega y funciona en forma de dímero para estimular la angiogénesis. El término “PlGF” se refiere en particular al conjunto de las 4 isoformas PlGF1-4: PlGF-1 y PlGF-3 son unas isoformas que no se unen a la heparina, mientras que PlGF-2 y PlGF-4 contienen unos dominios suplementarios que permiten fijar la heparina. Aún más preferentemente, se entiende por PlGF una proteína murina cuya secuencia está disponible bajo el número de acceso NP_001258634 o una proteína humana cuya secuencia está disponible bajo el número de acceso NP_001193941.1.

Se entiende por “Trastornos Causados por Alcoholización Fetal (TCAF)” el conjunto de los trastornos en el niño que resultan de la exposición al alcohol durante la gestación. Esta expresión comprende, entre otros, el conjunto de los trastornos conductuales que se revelarán progresivamente con la edad. Los niños que presentan estos trastornos se denominan “niños TCAF”. En su versión más grave, los TACF corresponden al síndrome de alcoholización fetal (SAF). Éste se traduce por una dismorfia craneofacial (que comprende fisuras palpebrales acortadas, un surco naso-labial liso, alargado, difuminado y un labio superior delgado); un retraso de crecimiento no específico (tamaño o peso o perímetro del cráneo) prenatal o postnatal o los dos; y unos trastornos del desarrollo neurológico que se expresan a veces por un retraso mental y más frecuentemente por dificultades de aprendizaje. Los niños que padecen SAF son denominados “niños SAF”.

Los inventores han demostrado que la exposición al alcohol causa enfermedades vasculares cerebrales. Por “enfermedad vascular cerebral” se entiende en la presente memoria cualquier alteración del sistema vascular cerebral, en particular una alteración que provoca un funcionamiento alterado, incluso defectuoso de dicho sistema. Una enfermedad vascular cerebral en el sentido de la invención puede ser en particular una desorganización del sistema vascular cerebral. Más particularmente, la alcoholización fetal induce una orientación aleatoria de los vasos cerebrales. Según un modo de realización particular, el trastorno de la alcoholización fetal está relacionado con una enfermedad vascular cerebral. Aún más particularmente, dicho trastorno de la alcoholización fetal está relacionado con una desorganización del sistema vascular cerebral.

Se entiende por “sujeto” un humano, y preferentemente un embrión, un feto o un niño. Un “embrión” tal como se entiende en la presente memoria, corresponde a un ovocito fecundado de menos de tres meses. Por “feto” se entiende en la presente memoria un individuo antes del nacimiento y cuya edad gestacional está comprendida entre 3 y 9 meses. Después del parto, el sujeto se convierte en un niño. Por “niño” se entiende un individuo cuya edad es inferior a 3 años. Están así comprendidos en la categoría de los niños, los recién nacidos, cuya edad está comprendida entre 0 y 1 mes, los lactantes, que tienen entre 1 mes y 2 años, y los niños propiamente dichos, que tienen por lo menos 2 años de edad. Un “recién nacido”, como se entiende en la presente memoria, puede haber nacido tanto a término como prematuro.

La expresión “un sujeto con trastornos de alcoholización fetal” o “sujeto TCAF” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un embrión, un feto o un sujeto, en particular humano, que está expuesto al alcohol in utero y que sufre trastornos de alcoholización fetal o que está en peligro de desarrollar, debido al consumo materno de alcohol, una de las condiciones relacionadas con los trastornos de alcoholización fetal, incluyendo los efectos descritos anteriormente. En particular, un sujeto TCAF posee una red vascular cerebral desorganizada, estando dicha desorganización en particular relacionada con una orientación aleatoria de los vasos cerebrales.

El método de la invención es particularmente útil por que permite predecir de manera no invasiva las deficiencias cerebrales. Permite, en efecto, detectar a partir de una muestra biológica, en particular una muestra placentaria, los sujetos que tienen el riesgo de padecer TCAF, lo que permite tratarlos.

Se entiende por “muestra biológica” según la invención, cualquier muestra que puede ser extraída a partir de un sujeto. Alternativamente, la muestra biológica es una muestra que procede de la placenta, en particular del cordón umbilical. En efecto, el PlGF se expresa por células de la placenta durante el embarazo. Esto permite analizar el PlGF sin comprometer la integridad del sujeto, en particular cuando éste es un embrión o un feto. De manera general, la muestra biológica debe permitir la determinación del nivel de expresión del marcador biológico utilizado en la invención.

La muestra a ensayar se puede utilizar como se obtiene directamente a partir de la fuente biológica o después de un pretratamiento para modificar el carácter de la muestra. Por ejemplo, este pretratamiento puede incluir la preparación de plasma a partir de sangre, la dilución de fluidos viscosos y así continuamente. Los procedimientos de pretratamiento pueden implicar también la filtración, la precipitación, la dilución, la destilación, la mezcla, la concentración, la inactivación de componentes perturbadores, la adición de reactivos, una lisis, etc. Además, puede ser beneficioso modificar una muestra de ensayo sólida para formar un medio líquido o para liberar el analito.

La proteína PlGF es una proteína segregada (DeFalco, Exp Mol Med. 44(1): 1-9, 2012). Las muestras biológicas preferidas para la determinación del nivel de expresión de dichos biomarcadores comprenden en particular las muestras de sangre, de plasma, o de linfa. Preferentemente, la muestra biológica es una muestra de sangre. De manera aún más preferida, la muestra biológica es una muestra de sangre de la placenta o de sangre de cordón umbilical. Ésta se recoge, en efecto, habitualmente durante el parto. La sangre de los vasos placentarios se puede obtener entonces para medir el nivel de PlGF en la sangre. Esto permite así un diagnóstico no invasivo de un trastorno de la alcoholización fetal, en particular de un daño cerebral. En efecto, la simple evaluación de PGIF en la sangre permite determinar si la exposición in utero al alcohol provoca unos TCAF, en particular a causa de una desorganización vascular cerebral.

Los inventores han demostrado así que el PlGF permite determinar que se ha producido un daño cerebral, a diferencia de los biomarcadores de la técnica anterior, que detectaban solo la exposición del feto al alcohol. El PlGF es, por lo tanto, un biomarcador fiable de TCAF. Por “biomarcador” se entiende, en el sentido de la presente invención, una característica que se mide y se evalúa objetivamente como indicador de procesos biológicos normales, de procesos patogénicos, o de respuestas farmacológicas a una intervención terapéutica. Un biomarcador designa, por lo tanto, cualquier gama de sustancias y de parámetros diversos. Por ejemplo, un biomarcador puede ser una sustancia cuya detección indica un estado patológico particular (por ejemplo la presencia de la proteína C activada como marcador de una infección), o, por el contrario, una sustancia cuya detección indica un estado fisiológico específico. El biomarcador según la solicitud es preferentemente un gen, los productos de un gen tales como sus transcritos y los péptidos procedentes de sus transcritos, un lípido, un azúcar o un metabolito.

Según un aspecto de la presente solicitud, el biomarcador es un gen, los productos de un gen tales como unos transcritos o unos péptidos, un lípido, un azúcar o un metabolito cuyos cambios de expresión, en particular de nivel de expresión, se correlacionan con un estado fisiológico del niño que resulta de una exposición in utero al alcohol. Según un aspecto particular, el biomarcador es un péptido que tiene una actividad de factor de crecimiento.

El biomarcador candidato es preferentemente un marcador génico, un marcador proteico, un marcador lipídico o un marcador metabólico. Para cada uno de estos tipos de marcadores, existen numerosos métodos a disposición del experto en la materia para medir la expresión de dicho biomarcador e identificar así una diferencia de expresión entre los niños expuestos in utero al alcohol y los niños sanos, es decir que no han estado expuestos al alcohol. El biomarcador utilizado en el método de la invención es el PlGF.

En un primer modo de realización, dicho marcador es un marcador génico o un marcador proteico.

En este caso, el método de la invención puede comprender una o varias etapas intermedias entre la extracción de la muestra de células cutáneas y la medición de la expresión de PGLF, correspondiendo dichas etapas a la extracción a partir de dicha muestra de placenta de una muestra de ARNm (o del ADNc correspondiente) o de una muestra de proteína. Este puede utilizarse después directamente para medir la expresión de PGLF. La preparación o la extracción de ARNm (así como la retrotranscripción de este en ADNc) o de proteínas a partir de una muestra celular son sólo unos procedimientos de rutina bien conocidos por el experto en la materia. Una vez obtenida una muestra de ARNm (o de ADNc correspondiente) o de proteína, se puede medir la expresión de PGLF, a nivel o bien de los ARNm (es decir en el conjunto de los ARNm o de los ADNc presentes en la muestra), o bien de las proteínas (es decir en el conjunto de las proteínas presentes en la muestra). El método utilizado para hacer esto depende entonces del tipo de transformación (ARNm, ADNc o proteína) y del tipo de muestra disponible.

Cuando la expresión de PGLF se mide a nivel del ARNm (o ADNc correspondiente), se puede utilizar cualquier tecnología utilizada habitualmente por el experto en la materia. Estas tecnologías de análisis del nivel de expresión de los genes, como por ejemplo el análisis de transcriptoma, incluyen unos métodos bien conocidos tales como la PCR (reacción en cadena de polimerasa, si se parte de ADN), la RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa, si se parte de ARN) o la RT-PCR cuantitativa o también los chips de ácidos nucleicos (de los cuales los chips de ADN y los chips de oligonucleótidos) para un caudal más alto.

Por “chip de ácidos nucleicos” se entienden en la presente memoria varias sondas de ácidos nucleicos diferentes que están unidas a un sustrato, el cual puede ser un microchip, una lámina de cristal, o una bola del tamaño de una microesfera. El microchip puede estar constituido por polímeros, por plásticos, por resinas, por polisacáridos, por sílice o por un material a base de sílice, de carbono, de metales, de vidrio inorgánico, o de nitrocelulosa.

Las sondas pueden ser unos ácidos nucleicos tales como los ADNc (“chip a ADNc”), los ARNm (“chip a ARNm”) o unos oligonucleótidos (“chip a oligonucleótidos”), pudiendo dichos oligonucleótidos típicamente tener una longitud comprendida entre aproximadamente 25 y 60 nucleótidos.

Para determinar el perfil de expresión de un gen particular, se marca un ácido nucleico que corresponde a la totalidad o a parte de dicho gen, y después se pone en contacto con el chip en condiciones de hibridación, lo cual conduce a la formación de complejos entre dicho ácido nucleico diana marcado y las sondas unidas a la superficie del chip que son complementarias de este ácido nucleico. Se detecta después la presencia de complejos hibridados marcados.

Estas tecnologías permiten seguir el nivel de expresión de un gen en particular o de varios genes, incluso de todos los genes del genoma (full genome o full transcriptome) en una muestra biológica (células, tejidos, etc.). Estas tecnologías son utilizadas rutinariamente por el experto en la materia, por lo tanto no es necesario detallarlas ahora. Unos ejemplos de realización de la invención basados en el análisis de expresión génica (chips a ADNc) y sobre la PCR cuantitativa se describen en la sección experimental.

Alternativamente, es posible utilizar cualquier tecnología actual o futura que permita determinar la expresión de los genes en base a la cantidad de ARNm en la muestra. Por ejemplo, el experto en la materia puede medir la expresión de un gen por hibridación con una sonda de ácido nucleico marcada, como por ejemplo por transferencia Northen (para el ARNm) o por transferencia Southern (para el ADNc), pero también unas tecnologías tales como el método de análisis en serie de la expresión génica (SAGE) y sus derivados, tales como LongSAGE, SuperSAGE, DeepSAGE, etc, Es posible también utilizar unos chips de tejido (también conocidos como TMAs: “tissue microarrays”). Los ensayos empleados habitualmente con los chips de tejido comprenden la inmunohistoquímica y la hibridación fluorescente in situ. Para el análisis a nivel del ARNm, los chips de tejido pueden acoplarse con la hibridación fluorescente in situ. Finalmente, es posible utilizar la secuenciación masiva en paralelo para determinar la cantidad de ARNm en la muestra (RNA-Seq o “Whole Transcriptome Shotgun Sequencing”). Para este propósito, están disponibles varios métodos de secuenciación masiva en paralelo. Dichos métodos se describen, por ejemplo, en los documentos, US 4,882,127, U.S. 4,849,077; U.S. 7,556,922; U.S. 6,723,513; WO 03/066896; WO 2007/111924; US 2008/0020392; WO 2006/084132; US 2009/0186349; US 2009/0181860; US 2009/0181385; US 2006/0275782; EP-B1-1141399; Shendure & Ji, Nat Biotechnol., 26(10): 1135-45. 2008; Pihlak et al., Nat Biotechnol., 26(6): 676- 684, 2008; Fuller et al., Nature Biotechnol., 27(11): 1013-1023, 2009; Mardis, Genome Med., 1(4): 40, 2009; Metzker, Nature Rev. Genet., 11(1): 31-46, 2010.

Cuando se mide a nivel proteico la expresión del marcador, es posible emplear unos anticuerpos específicos, en particular en tecnologías bien conocidas tales como la inmunoprecipitación, la inmunohistología, la transferencia western, la transferencia dot, ELISA o ELISPOT, los ensayos inmunológicos por electroquimioluminiscencia (ECLIA), los chips de proteínas, los chips de anticuerpos, o los chips de tejido acoplados a la inmunohistoquímica. Entre las otras técnicas que se pueden utilizar están comprendidas las técnicas de FRET o de BRET, los métodos de microscopía o de histoquímica, incluyendo en particular los métodos de microscopía confocal y de microscopía electrónica, los métodos basados en la utilización de una o varias longitudes de onda de excitación y de un método óptico adaptado, como un método electroquímico (las técnicas voltametría y de amperometría), el microscopio de fuerza atómica, y los métodos de radiofrecuencia, como la espectroscopía de resonancia multipolar, confocal y no confocal, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia, y birrefringencia o índice de refracción (por ejemplo, por resonancia de los plasmones superficiales, o “Surface plasmon resonance” en inglés, por elipsometría, por método de espejo resonante, etc.), citometría de flujo, tratamiento de imágenes por resonancia radioisotópica o magnética, análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE); por espectrofotometría HPLC-Mass, por cromatografía líquida/espectrofotometría de masa/espectrometría de masa (LC-MS/MS). Todas estas técnicas son bien conocidas por el experto en la materia y no es necesario detallarlas en la presente memoria.

Preferentemente, la expresión de PIGF se mide a nivel proteico. Más preferentemente, la expresión del PIGF se mide con la ayuda de un ensayo que emplea unos anticuerpos específicos que reconocen dicho biomarcador, en particular en tecnologías bien conocidas tales como la inmunoprecipitación, la inmunohistología, la electroquimioluminiscencia (ECLIA), la transferencia western, la transferencia dot, ELISA o ELISPOT, los chips de proteínas, los chips de anticuerpos, o los chips de tejido acoplados a la inmunohistoquímica. Unos anticuerpos dirigidos contra PlGF están disponibles comercialmente (véase, por ejemplo, R&D Systems, Danta Cruz, Abcam, etc.) y pueden utilizarse en los métodos de la invención. Aún más preferentemente, la expresión de PlGF se mide por transferencia Western o por ELISA.

En un aspecto preferido de la solicitud, puede ser útil comparar el nivel de PlGF obtenido en la etapa a) del método con un nivel de referencia. Por “nivel de expresión de referencia de un marcador biológico” se entiende, en el sentido de la presente solicitud, cualquier nivel de expresión de dicho marcador utilizado a título de referencia. Por ejemplo, un nivel de expresión de referencia puede obtenerse midiendo el nivel de expresión del marcador de interés en una muestra biológica de un sujeto sano, por ejemplo una placenta de un sujeto sano, es decir un sujeto que no ha estado expuesto al alcohol in utero. En este caso, un nivel de PlGF de la etapa a) inferior al nivel de referencia indica un TCAF. En particular, los inventores han mostrado que un nivel de PlGF inferior al de un sujeto sano señala una organización vascular cerebral defectuosa.

Según un modo ventajoso de realización de la presente invención, la expresión del marcador candidato se normaliza con respecto a la expresión de un marcador control. Un “marcador control” es un marcador cuya expresión es idéntica, sea cual sea el tipo celular considerado y la edad del donante. Según un modo de realización particular, cuando el biomarcador candidato es un marcador génico o un marcador proteico, el marcador control es un gen que se expresa en todos los tipos celulares, independientemente de la edad del sujeto, o su producto proteico. En un modo de realización más particular, dicho marcador control es un gen doméstico o el producto proteico de dicho gen doméstico. Un gen doméstico es un gen que se expresa en todos los tipos celulares y que proporciona una función básica que es necesaria para la supervivencia de la célula. Se puede encontrar una lista de genes domésticos humanos, por ejemplo, en Eisenberg et al. (Trends in Genetics 19: 362-365, 2003). Un gen doméstico preferido para ser utilizado en la invención es un gen seleccionado de entre el grupo constituido por B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 y HMBS.

El método de la invención es particularmente útil por que permite efectuar un diagnóstico no invasivo a partir de una edad precoz. Los niños diagnosticados como que han sufrido daños cerebrales tras una exposición uterina al alcohol pueden así tratarse precoz y rápidamente. Ahora bien, se ha mostrado que cuanto más precoz sea el tratamiento, mejor es la recuperación funcional y cognitiva (Toutain et al., Pychotropes, 13: 49-68, 2007).

Según otro aspecto, la solicitud tiene por objeto un método de tratamiento de trastornos de la alcoholización fetal en un sujeto. Dicho método comprende unas etapas de:

a) diagnóstico de TCAF en dicho sujeto por uno cualquiera de los métodos anteriores; y

b) tratamiento de dicho sujeto si la etapa a) concluye que dicho sujeto presenta unos TCAF.

Por “tratamiento” se entiende aquí cualquier acción que permite disminuir o erradicar los síntomas o las causas de TCAF. Un tratamiento puede comprender la administración de una sustancia farmacológica y/o un seguimiento psicoterapéutico.

La invención se describirá más precisamente mediante los ejemplos siguientes. Dichos ejemplos se proporcionan aquí a título ilustrativo y no están, salvo que se indique lo contrario, destinados a ser limitativos.

Leyendas de las figuras

Figura 1. Efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la angiogénesis cortical en los embriones E20 de ratones. A,B: Efectos de la exposición alcohólica fetal de GD15 a GD20 sobre la organización de los microvasos corticales en animales control (A) y expuestos al alcohol (B). Los microvasos del cerebro se visualizaron por inmunohistoquímica contra CD31. Las flechas indican los microvasos del cerebro que presentan una orientación radial en el grupo “control”. Cabe señalar una pérdida de la organización radial en el grupo “Alcohol”. I-VI: Capas corticales; CC: Corpus callosum. C: Distribución de la orientación (categorías de ángulos) de los microvasos croticales en la corteza inmadura de fetos FD20. El análisis estadístico se ha realizado con la ayuda del ensayo X2. D: Cuantificación por transferencia Western de los efectos de la exposición alcohólica fetal durante la última semana de gestación sobre la expresión cortical de CD31 a GD20. Ns frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 2. Efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la expresión de los miembros de la familia VEGF/PlGF en los embriones E20 de ratones. A-E: Cuantificación por transferencia Western de los niveles proteicos de VEGFA (A), PlGF (B), sVEGF-R1 (C), mVEGF-R1 (D) y VEGF-R2 en la corteza de los grupos “control” y “alcohol”. F: Comparación por transferencia Western de los niveles proteicos de PIGF en la corteza y la placenta de los embriones E20 del grupo “control”. ***p<0,001 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 3. Efectos de la exposición alcohólica in utero sobre las características ultraestructurales de la placenta en los ratones GD20. A: Observación por marcación con violeta de Cresyl del efecto de la exposición alcohólica sobre la estructura laminar de la placenta. El lado materno de la placenta se orienta hacia arriba. El alcohol afecta la segregación de las zonas de unión y del laberinto (líneas de puntos). B: Cuantificación por análisis de imágenes de los efectos del alcohol sobre el grosor de la membrana de Reichert. C,D: Observación con bajo aumento de la capa de los trofoblastos gigantes en los grupos “control” (C) y “alcohol” (D). Las flechas indican los trofoblastos gigantes. Estos tienen una forma rectangular típica en la placenta del grupo “control” mientras que en el grupo “alcohol”, tienen una forma circular. E-H: Imágenes adquiridas por microscopía electrónica de aumento medio (E,F) y fuerte (G,H) que muestran la morfología celular de los trofoblastos gigantes y la presencia de Zonula occludens (flechas) en los grupos “control” (E,G) y “alcohol” (F,H). La zonula occludens (estrellas) no es ya visible en los animales tratados con alcohol. Los insertos en E y F indican la zona observada con mayor aumento en G y H, respectivamente. D: decidua materna; J: zona de unión; L: zona de laberinto; Tg: capa de trofoblastos gigantes. ***p<0,001 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 4. Efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la expresión de las proteínas que participan en la barrera placentaria y en el metabolismo energético placentario A,B: Observación por inmunohistoquímica de la proteína ZO-1 en la zona del laberinto de la placenta de ratones de los grupos “control” (A) y “alcohol” (B). La proteína ZO-1 aparece como formando unos grupos de puntos (flechas) en el grupo “control” mientras que el marcado es difuso en el grupo “alcohol”. Las capas de trofoblastos se pusieron en evidencia por inmunorreactividad con el transportador de glucosa Glut-1. Los núcleos se marcaron con Hoechst. C: Doble marcación con unos anticuerpos contra los transportadores de minocarboxilato MCT-1 y de glucosa en la zona del laberinto de una placenta “control”. Por contraste con Glut-1, la expresión de MCT-1 está asociada con la capa material del sincitiotrofoblasto. Los núcleos se marcaron con Hoechst. D: Cuantificación por transferencia Western de los niveles de expresión de las proteínas ZO-1 y MCT-1 en las placentas de los grupos “control” y “alcohol”. *p<0,05, **p<0,01 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 5. Efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la expresión de los miembros de la familia VEGF/PlGF en placentas murinas. A-F: Cuantificación por transferencia Western de los efectos de la exposición al alcohol durante la última semana de gestación sobre la expresión placentaria de VEGF-A (A), PlGF (B), sVEGF-R1 (C), mVEGF-R1 (D), VEGF-R2 (E) y CD31 (F) a GD20. G.H; marcación por inmunohistoquímica que muestra la distribución de VEGF-R2 (G) en las capas del sincitiotrofoblasto de la placenta marcadas con Glut-1 (H). Los núcleos se marcaron con Hoechst. *p<0,05 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 6. Difusión del azul Evans inyectado in utero de la placeta en el cerebro del feto. A,B: Visualización a lo largo del tiempo del azul Evans administrado por microinyección en la placenta de un ratón preñado a GD15. La fluorescencia se detectó por iluminación con UV (A) y se representa con la ayuda de una escala de colores artificiales (B). C,D: Visualización a lo largo del tiempo de la fluorescencia del azul Evans en el cerebro de los fetos después de una microinyección placentaria a GD15. La fluorescencia se detectó por iluminación con UV (C) y se representa con la ayuda de una escala de colores artificiales (D). E,F: Cuantificación a lo largo del tiempo por espectrofotometría de la absorbancia a 595 nm de la señal del azul Evans inyectado en las placentas (E) y del seguimiento en los cerebros de los fetos correspondientes (F). G: Cuantificación por ELISA del PlGF humano en el cerebro de feto de ratón 30 minutos después de la inyección del hPlGF en las placentas de los ratones preñados a GD15. *p<0,05 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 7: Efecto de la represión de PlGF placentario por transfección in utero sobre los niveles de VEGF-R1 del cerebro. A: Microfotografía que muestra la expresión de eGFP 48 horas después de la transfección in utero de un plásmido que codifica eGFP en unas placentas de ratones preñados a GD15. B,C: Triple marcación eGFP/Glut-1/Hoechst que muestra que la fluorescencia de eGFP (B) se asocia esencialmente con la capa trofoblástica fetal marcada con Glut-1 (C; cabezas de flechas). La capa trofoblástica materna que está también marcada por Glut-1 no se transfecta. La capa trofoblástica fetal se identifica por la presencia de glóbulos rojos nucleados característicos de la circulación fetal (flecha). D: Visualización por transferencia Western de las proteínas PlGF, GFP y actina en las placentas de animales no transfectadas (shVGFP-), transfectadas por GFP (shVGFP+) y transfectadas por shPlGF/GFP (sh+/GFP+). E,F: Cuantificación por transferencia Western de los niveles de expresión de PlGF (E) y de GFP(F) en las placentas de animales no transfectadas (sh'/GFP'), transfectadas por GFP (shVGFP+) y transfectadas por shPlGF/GFP (sh+/GFP+). G: Cuantificación por transferencia Western de los niveles de expresión de VEGF-R1 en el cerebro de fetos que provienen de placentas no transfectadas (shVGFP-), transfectadas por GFP (shYGFP+) y transfectadas por shPlGF/GFP (sh+/GFP+). *p<0,05 frente al grupo “sh-/GFP-” con la ayuda del ensayo ANOVA seguido de un ensayo de comparaciones múltiples HSD de Tukey.

Figura 8. Caracterización morfométrica de los efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la placenta humana de las semanas de gestación 20 a 25. A,B: Marcación inmunohistoquímica realizada contra CD31 y contra-coloración con azul de toluidina para visualizar los microvasos (marrones) presentes en las vellosidades placentarias (azul) de los grupos “control” (A) y “FAS/pFAS” (B) a edades de gestación [20-25 WG]. C: Porcentaje de vellosidades clasificados por tamaño en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-25 WG]. D: Distribución de los vasos por tamaño de las vellosidades en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-25 WG]. E: Superficie vascular por tamaño de vellosidades en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-25 WG]. *p<0,05 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 9. Caracterización morfométrica de los efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la placenta humana de semanas de gestación 25 a 35. A,B: Marcación inmunohistoquímica realizada contra CD31 y marcación con azul de toluidina para visualizar los microvasos (marrones) presentes en las vellosidades placentarias (azul) de los grupos “control” (A) y “FAS/pFAS” (B) a edades de gestación [20-35 WG]. C: Porcentaje de vellosidades clasificados por tamaño en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-35 WG]. D: Distribución de los vasos por tamaño de las vellosidades en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-35 WG]. E: Superficie vascular por tamaño de vellosidades en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-35 WG]. *p<0,05 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 10. Caracterización morfométrica de los efectos de la exposición alcohólica in utero sobre la placenta humana de semanas de gestación 35 a 42. A,B: Marcación inmunohistoquímica realizada contra CD31 y marcación con azul de toluidina para visualizar los microvasos (marrones) presentes en las vellosidades placentarias (azul) de los grupos “control” (A) y “FAS/pFAS” (B) a edades de gestación que van de [35-42 WG]. La región luminal de los microvasos se reduce considerablemente en el grupo “FAS/pFAS”. C: Porcentaje de vellosidades clasificados por tamaño en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [35-42 WG]. D: Distribución de los vasos por tamaño de las vellosidades en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [35-42 WG]. E: Superficie vascular por tamaño de vellosidades en las placentas de los grupos “control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación que van de [35-42 WG]. *p<0,05 frente al grupo “control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 11. Efectos a lo largo del tiempo de la exposición alcohólica in utero sobre las densidades de vellosidades y de vasos en unas placentas humanas y caracterización por transferencia Western de proteínas pro-angiogénicas y del metabolismo energético. A: Evolución de las densidades de vellosidades en las placentas de los grupos “Control” (A) y “FAS/pFAS” (B) a edades de gestación [20-25 WG], [25-35 WG] y [35­ 42 WG]. B: Evolución de las densidades de vasos en las placentas de los grupos “Control” y “FAS/pFAS” a edades de gestación [20-25 WG], [25-35 WG] y [35-42 WG]. #p<0,05, ##p<0,01 frente al grupo “Control” como se indica en el gráfico. *p<0,05, ***p<0,001 para los grupos “Control” frente a “alcohol” para una clase dada de edad de gestación. C-H: Cuantificación por transferencia Western de los niveles proteicos de ZO-1 (C), MCT-1 (D), PlGF (E), VEGFA (F), VEGF-R1 (G) y VEGF-R2 (H) en las placentas de los grupos “Control” y “FAS/pFAS”. *p<0,05 frente al grupo “Control” con la ayuda de un ensayo t no emparejado.

Figura 12. Comparación de los daños cerebrales y placentarios observados en los fetos humanos e inducidos por exposición alcohólica in utero y correlación estadística. A-H: Organización vascular en los cerebros (A,D) y las placentas (E,H) de pacientes del grupo “Control” a WG22 (A,E) y WG31 (C,G) y organización vascular en los cerebros (B,D) y las placentas (F,H) de los pacientes del grupo “FAS/pFAS” a W g 21 (B,F) y WG33 (D,H). I,J: Correlación estadística entre la desorganización vascular y la densidad vascular en los pacientes de los grupos “Control” (I) y FAS/pFAS (J).

Ejemplos

Anomalías de la angiogénesis cerebral tras una alcoholización in utero

Efectos de una exposición in utero al alcohol sobre el desarrollo de la red vascular cerebral

Los presentes inventores han demostrado anteriormente que una alcoholización prenatal con alcohol induce a una desorganización vascular cerebral. En particular, el efecto del alcohol está asociado a una disminución significativa del número de vasos corticales que presentan una orientación radial en favor del número de microvasos que poseen una orientación aleatoria (figura 1). Paralelamente al estudio efectuado en el ratón, un análisis del sistema microvascular cerebral en el ser humano ha mostrado que, como en el ratón, los microvasos corticales que tienen una orientación radial en el grupo “control” están totalmente desorganizados en el grupo “FAS/pFAS” (figura 12 y Jegou et al., 2012).

Efectos de una exposición in utero al alcohol sobre la expresión de genes representativos del sistema vascular en el ratón

Los estudios de RT-PCR cuantitativa (ARNm) y de transferencia Western (proteína) han revelado una desregulación marcada de los porcentajes de receptores VEGF-R1 y VEGF-R2 que unían los efectos proangiogénicos de factores como el VEGFA o también el PlGF. Las anomalías de la red vascular cerebral están por lo tanto asociadas a una desregulación de la expresión de receptores pro-angiogénicos cerebrales (figura 2 y Jegou et al., 2012).

Anomalías de la angiogénesis placentaria tras una alcoholización in utero

Se han estudiado diferentes parámetros placentarios en el ratón (figuras 3-5) y en el ser humano (figuras 8-10) por un enfoque inmunohistoquímico acoplado a un análisis morfométrico que comprende en particular la densidad y el tamaño de las vellosidades placentarias, la densidad y la superficie vascular o también la proporción de vasos por vellosidad. En el ser humano, estos parámetros se midieron y compararon entre 34 placentas de individuos control y 36 placentas que provienen de individuos expuestos in utero al alcohol. Las placentas dividieron en tres clases de edades comparables a las del estudio cerebral (Jegou et al, 2012). Se presentan en este documento los resultados para las clases de edad [20-25GW], [25-35GW] y [35-42GW].

En particular, el análisis morfométrico indica que la distribución de los vasos placentarios por tamaños de vellosidades y la superficie vascular se ven significativamente afectadas por la alcoholización (figura 11). Además, un análisis longitudinal de la densidad vascular que tiene en cuenta el factor “edad” indica que en el grupo “control” la angiogénesis placentaria aumenta considerablemente entre las clases de edad [20-25GW] y [25-35GW]. Esta fuerte vascularización placentaria se explica por un desarrollo importante del cerebro durante el tercer trimestre del embarazo que necesita unas necesidades incrementadas de oxígeno y de nutrimientos. Sin embargo, la alcoholización fetal induce a un estancamiento, incluso una bajada de la densidad vascular placentaria (figura 11).

En conclusión, los presentes resultados indican que existen tanto en la placeta humana como en la corteza cerebral unas anomalías vasculares en los sujetos que han estado expuestos al alcohol. Estos resultados refuerzan por lo tanto la hipótesis de una correlación entre trastornos cerebrales y déficits placentarios de la angiogénesis.

Demostración de una correlación entre las anomalías vasculares placentarias y cerebrales

La anomalías vasculares placentarias y cerebrales observadas en el ser humano tras una alcoholización in utero pueden ser el resultado de procesos totalmente independientes sin relación causa efecto o, por el contrario, estrechamente intrincados. El hecho de que la fuente de PlGF sea única y de origen placentario aboga en favor de la segunda hipótesis. Sin embargo, con el fin de demostrar una relación entre los daños vasculares cerebrales y placentarios, se ha efectuado un estudio de correlación por una parte en los sujetos del grupo “control” y, por otro lado, en los individuos del grupo “FAS/pFAS” (figura 12).

Los resultados demuestran que, en el grupo “control”, el incremento de la vascularización placentaria no afecta a la organización radial de los vasos corticales (R20,4719). En cambio, la falta de vascularización placentaria observada en el grupo “FAS/pFAS” está estrechamente correlacionada con la orientación aleatoria de los vasos corticales (R20,9995). Por lo tanto, existe una interacción muy significativa entre las alteraciones vasculares placentarias y cerebrales.

Demostración de una relación funcional entre PlGF placentario y su receptor cerebral

La administración in utero de una molécula fluorescente a nivel placentario en el ratón gestante (GD15) se vuelve a encontrar después de 20-30 minutos en el cerebro del feto (figura 6). Además, un PlGF recombinante humano inyectado en el ratón a nivel de la placenta se detecta después de 30 minutos por ELISA a nivel del cerebro fetal (figura 6). Estos datos indican que unas moléculas placentarias y en particular PlGF pueden alcanzar el cerebro del feto.

La invalidación por transfección in utero placentario de PlGF murino por shRNA se traduce por una represión de los niveles proteicos de PlGF placentario después de 48 horas (figura 7). Este efecto se asocia con el nivel cerebral por una caída de los niveles proteicos del receptor VEGF-R1 (figura 7). Estos resultados indican que i) la represión específica de PlGF placentario afecta directamente a la expresión del receptor cerebral, ii) la represión específica de PlGF placentario imita los efectos del alcohol sobre la expresión de VEGF-R1 cerebral (figuras 2 y 7).

Identificación de los factores placentarios biomarcadores de un daño cerebral

El estudio de correlación anterior demuestra por primera vez que los daños vasculares placentarios inducidos por la alcoholización fetal están en relación directa con las alteraciones vasculares cerebrales. En consecuencia, unos factores placentarios, cuyo papel sobre la angiogénesis está demostrado se convierten en unos candidatos biomarcadores de daños vasculares cerebrales.

Los niveles de expresión de proteínas conocidos por ser o bien unos actores de la angiogénesis o bien unas proteínas específicas del sistema vascular se han cuantificado por transferencia Western. Este trabajo se ha efectuado en el animal (ratón; placenta/cerebro) y en el ser humano (placenta).

En el ratón, la cuantificación de los porcentajes de expresión de VEGF^a y de PlGF placentarios demuestra una disminución significativa únicamente de PlGF (cuya placenta es la única fuente en el organismo; figura 5). Paralelamente, la cuantificación de los receptores a VEGF^a y a PlGF indica que la expresión de VEGFR1 (único receptor de PlGF) disminuye tanto en la placenta como en el cerebro (figuras 2 y 5). Esta disminución, muy marcada, es del orden del 50%. Por lo tanto, la expresión de VEGFR2 a nivel cerebral no está afectada. Además, la cuantificación de la proteína vascular ZO-1, implicada en el establecimiento de la barrera placentaria y hematoencefálica se ve considerablemente disminuida en la placenta (figura 4).

Paralelamente a los trabajos llevados a cabo en el ratón, el análisis de expresión proteica se realizó sobre placentas humanas cuya alcoholización materna se comprobó y niños vivos. Se recogieron 7 placentas “control” y 6 placentas “alcohol” y se cuantificaron por transferencia Western los marcadores candidatos identificados en el ratón. Los resultados indican que en el grupo “alcohol” las expresiones de PlGF y de ZO-1 se ven disminuidos muy considerablemente como en el ratón (figura 11). Estos datos indican que los efectos de la alcoholización fetal observados a niveles placentario y cerebral se vuelven a encontrar en dos especies diferentes, el ratón y el ser humano.

Evaluación de las concentraciones de PlGF en la sangre del cordón umbilical, la placenta y la sangre materna a partir de dos grupos de pacientes (control frente a in utero expuestos al alcohol)

El objetivo principal de este estudio clínico es comparar las concentraciones de PlGF en el cordón umbilical y la placenta entre dos grupos de pacientes y efectuar un seguimiento a 2 y 6 años de neurodesarrollo de los dos grupos de pacientes. En el primer grupo, los pacientes se han expuesto al alcohol in utero. El segundo grupo es un grupo control constituido por pacientes que no se han expuesto al alcohol in utero.

Este estudio clínico tiene en particular los objetivos siguientes:

- comparación de las concentraciones de PlGF en la sangre materna;

- examen clínico neurológico en el nacimiento del niño;

- seguimiento a la edad de 2 años en consulta de pediatría para evaluación del neurodesarrollo, en particular mediante un cuestionario ASQ (Ages and Stages Questionnaire), y

- seguimiento a la edad de 6 años en consulta pediátrica para evaluación del neurodesarrollo y mediante un cuestionario parental y resultado neuropsicológico.

En este estudio clínico, se han seguido 30 mujeres que han consumido alcohol durante su embarazo y 30 mujeres embarazadas abstinentes (grupo control). Todas las mujeres seguidas tienen más de 18 años de edad, y han firmado un protocolo de consentimiento.

El consumo documentado de alcohol durante el embarazo es un consumo crónico de por lo menos 30 g de alcohol por semana o consumo agudo de tipo “borrachero” durante el embarazo (sabiendo que una unidad de 10 g de alcohol puro corresponde a 25 cl de cerveza 4°5, 10 cl de vino a 12°, 3 cl de whisky, 7 cl de oporto, etc.).

En el grupo control, no se documenta ningún consumo de alcohol durante el embarazo.

Treinta pacientes en cada grupo son necesarios para evidenciar una diferencia de porcentaje de PlGF de 4,7 pg/dl con una potencia de ensayo del 80%.

El análisis del PlGF en la sangre del cordón umbilical y la placenta se efectúa por un análisis inmunológico por electroquimioluminiscencia (robot de análisis ECLIA de PlGF (Cobas e411 Analyzer) puesto a disposición por la compañía Roche Diagnostic) sobre extracciones de sangre de cordón y de placentas (grupo control frente a grupo expuesto al alcohol).

Se efectúan unas extracciones de tejidos de sangre de cordón y de placentas y después se congelan y conservan a -80°C. Después se realizar una cuantificación sobre extractos tisulares de PlGF sanguíneo y placentario.

Se realiza un examen clínico a la visita de salida de maternidad (peso, tamaño, perímetro del cráneo, tonicidad axial y periférica, reactividad, reflejos arcaicos, adaptaciones posturales, dismorfia facial evocadora de SAF, malformaciones eventuales).

Un seguimiento de los niños con 2 y 6 años de edad se efectúa con el objetivo del desarrollo cognitivo y los trastornos conductuales.

Durante la visita a los 2 años de edad, se miden el peso, el tamaño y el perímetro del cráneo (PC). Se rellena un cuestionario ASQ y se efectúan un examen neurológico (IRM cerebral para la búsqueda de malformaciones cerebrales) y búsquedas de signos de dismorfia facial. Se efectúa también una búsqueda de rigidez vascular de los vasos retinianos por un oftalmólogo.

Durante la visita a los 6 años de edad, se miden el tamaño y e PC y se realizan un examen neurológico y neuropsicológico con la ayuda de escalas de neurodesarrollo (WISC IV y NEPSY). Se rellenan también durante esta visita unos cuestionarios de Conners destinados a los padres y a los profesores (para la detección de la hiperactividad) y unos cuestionarios SCQ destinados a los padres (en relación con el comportamiento).

En los dos grupos, al nacimiento, a la edad de 2 años y de 6 años, se realizan unos exámenes clínicos (comportamiento, seguimiento ocular-fijación, tonicidad axial y periférica, resultado neuromotor, reflejos osteotendinosos, exámenes físico completo para la búsqueda de malformaciones) y unos exámenes paraclínicos (fondo del ojo, IRM cerebral, cuestionario parental ASQ, escalas de desarrollo WISC IV y NEPSY, cuestionarios parentales y profesores de Conners y SCQ).

La comparación de los 2 grupos de pacientes se realiza por el ensayo no paramétrico de Mann Withney. Se fija un umbral de significación del 5%.

Los resultados obtenidos son conformes a lo que se esperaba.

Conclusión

A la vista de los diferentes resultados obtenidos por los inventores en el ratón y en el ser humano, parece que i) la alcoholización fetal afecta a la angiogénesis cerebral y a la organización de la red vascular cerebral, ii) estas alteraciones cerebrales están correlacionadas con anomalías vasculares de la placenta, iii) un factor pro-angiogénico placentario puede alcanzar el cerebro fetal,

iv) las anomalías de neurodesarrollos de la angiogénesis cerebral en los niños TCAF están asociadas a una desregulación del sistema PlGF placentario/VEGF-R1 cerebral,

v) una invalidez placentaria de PlGF reproduce los efectos de la alcoholización fetal en VEGF-R1 cerebral, vi) una desregulación de los porcentajes placentarios de PlGF tras una alcoholización fetal permite predecir un daño cerebral,

vii) un factor proteico placentario, el PlGF, se ha identificado como un biomarcador de daño cerebral inducido por una alcoholización in utero.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Método in vitro de diagnóstico de trastorno de la alcoholización fetal (TCAF) en un sujeto, que comprende unas etapas de:

a) medir la cantidad de Placental growth factor (PlGF) en una muestra biológica de dicho sujeto; y b) comparar la cantidad de PlGF de la etapa a) con una referencia, y

c) determinar un TCAF en dicho sujeto.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la referencia es una medición de la cantidad de PlGF en un individuo sano.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que una cantidad de PlGF de la etapa a) inferior a la referencia indica que el sujeto padece TCAF.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que una cantidad de PlGF de la etapa a) inferior a la referencia indica una desorganización vascular cerebral en el sujeto.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha muestra biológica procede de la placenta, en particular de la sangre de cordón umbilical.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que la cantidad de PlGF se determina midiendo la cantidad de ácido nucleico PlGF.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la cantidad de PlGF se mide mediante un método seleccionado de entre la transferencia Northern, la transferencia Southern, la PCR, la RT-PCR, la RT-PCR cuantitativa, el SAGE y sus derivados, los chips de ácidos nucleicos, en particular los chips a ADNc, los chips de oligonucleótidos y los chips de ARNm, los chips de tejido y el RNA-Seq.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que la cantidad de PlGF se determina midiendo la cantidad de polipéptido.

9. Método según la reivindicación 8, caracterizado por que se mide la cantidad de PlGF mediante un método seleccionado de entre la inmunohistología, la inmunoprecipitación, la transferencia western, la transferencia dot, ELISA o ELISPOT, ECLIA, los chips de proteínas, los chips de anticuerpos, o los chips de tejido acoplados con inmunohistoquímica, las técnicas de FRET o de BRET, los métodos de microscopia o de histoquímica, de los cuales en particular los métodos de microscopia confocal y de microscopia electrónica, los métodos basados en la utilización de una o varias longitudes de onda de excitación y de un método óptico adaptado, como un método electroquímico (las técnicas de voltametría y de amperometría), el microscopio de fuerza atómica, y los métodos de radiofrecuencia, como la espectroscopía de resonancia multipolar, confocal y no confocal, detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia, y birrefringencia o índice de refracción (en particular por resonancia de los plasmones de superficie, por elipsometría o por el método de espejo resonante), citometría de flujo, tratamiento de imágenes por resonancia radioisotópica o magnética, análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE); por espectrofotometría HPLC-Mass, por cromatografía líquida/espectrofotometría de masa/espectrometría de masa (LC-MS/MS).

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado por que se determina la cantidad de PlGF mediante un método seleccionado de entre la inmunoprecipitación, la inmunohistología, la transferencia western, la transferencia dot, ELISA o ELISPOT, ECLIA, los chips de proteínas, los chips de anticuerpos, o los chips de tejido acoplados con la inmunohistoquímica.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, caracterizado por que se determina la cantidad de PlGF mediante transferencia western o mediante ELISA.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que la cantidad de PlGF se normaliza con respecto a un marcador control.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado por que el marcador control es un gen seleccionado de entre el grupo constituido por B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 y HMBS, o un polipéptido seleccionado de entre el producto de dichos genes.