ES2748390T3 - Método para la detección del cáncer - Google Patents

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Abstract

Un método para detectar un cáncer (o cánceres), que se aplica a una muestra separada de un cuerpo vivo y que comprende medir una expresión de calmegina; en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma seruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para la detección del cáncer
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método nuevo para la detección de un cáncer (o cánceres).
Técnica anterior
Los cánceres son la causa más común de muerte entre todas las causas de muerte, y las terapias principales para ellos son los tratamientos paliativos en los que el tratamiento quirúrgico se combina con la radioterapia y la quimioterapia. En virtud del avance en la tecnología médica, los cánceres se han convertido en enfermedades tales que pueden muy posiblemente curarse si se encuentran en una fase temprana. Por lo tanto, se demanda un método de detección del cáncer que se pueda llevar a cabo de forma fácil analizando suero, orina o similares, sin carga física y económica para los pacientes.
Recientemente, se han utilizado ampliamente como métodos diagnósticos métodos que utilizan sangre u orina, en los que se miden productos tumorales tales como marcadores tumorales. Los ejemplos de producto tumoral incluyen antígenos relacionados con tumor, enzimas, proteínas específicas, metabolitos, genes tumorales, productos de genes tumorales y genes supresores tumorales. En algunos cánceres se utilizan como marcadores tumorales en el diagnóstico del cáncer el antígeno carcinoembrionario ACE, las glucoproteínas CA19-9 y CA125, el antígeno prostático específico APE, la calcitonina, que es una hormona peptídica producida en la tiroides y similares. Sin embargo, en la mayoría de los tipos de cánceres no existen marcadores tumorales útiles para el diagnóstico del cáncer. Además, dado que la mayoría de los marcadores tumorales actualmente conocidos solo existen en muy pequeñas cantidades (por ejemplo, en el orden de pg/ml) en el fluido corporal, su detección requiere un método de medición elevadamente sensible o una técnica especial. En tales circunstancias, si se proporciona un método de prueba para el cáncer nuevo mediante el cual se puedan detectar diversos cánceres mediante operaciones simples, se espera que se desarrolle su uso para el diagnóstico de diversos cánceres.
El método sería muy útil si adicionalmente permite el diagnóstico de cánceres que se desarrollan en partes invisibles, la evaluación de la fase de la evolución del cáncer, la evaluación del grado de malignidad del cáncer, el seguimiento de los pacientes posquirúrgicos, el diagnóstico de reaparición, el diagnóstico de metástasis, el control de la terapia y similares, además de la detección de los cánceres.
De forma más particular, si se proporciona un método que permita el diagnóstico de cánceres que se desarrollan en partes invisibles, esto sería útil para la detección temprana de cánceres en partes donde los cánceres se detecten difícilmente, por ejemplo en el interior de la cavidad abdominal. Además, incluso en los casos en donde el tumor es demasiado pequeño para encontrarlo de forma visual, también se hace posible la detección de tales cánceres que no pueden encontrarse mediante ecografía, TC (tomografía computarizada) o RM (por resonancia magnética).
La fase de la evolución del cáncer se clasifica a base del alcance de la expansión del tumor en el sitio primario y si se ha producido o no metástasis en un ganglio linfático regional o en un órgano distante. En general, la fase de la enfermedad se clasifica en 5 fases, en las que un número grande indica un estado más avanzado. Sin embargo, estrictamente hablando, la definición varía dependiendo de los órganos, la fase 0 de la enfermedad indica un cáncer que se aloja en el epitelio y la fase IV indica un cáncer con metástasis a distancia. Si la fase de la evolución del cáncer se puede determinar como se describe anteriormente, se hace posible la determinación de una estrategia terapéutica apropiada y, además, la evaluación de los efectos terapéuticos de los fármacos antineoplásicos. Con respecto a la determinación de la estrategia terapéutica, por ejemplo, algunos cánceres de próstata son de baja malignidad y difícilmente evolucionan, por lo tanto no necesitan tratamiento; y otros son progresivos y producen metástasis en los huesos y/o similares, provocando dolor y la muerte de los pacientes. Dado que la hormonoterapia y la cirugía extirpativa están acompañadas de efectos secundarios, es necesario juzgar y determinar de forma apropiada la estrategia terapéutica. Además, si se puede juzgar de forma apropiada si el fármaco antineoplásico seleccionado es apropiado o no, cuando finalizar la administración del fármaco antineoplásico y similares, se puede reducir también la carga física y económica sobre el paciente. Por lo tanto, es importante que se pueda evaluar la fase de la evolución.
Una de las características de las células cancerosas es la blastogénesis, es decir la desdiferenciación. Excepto para una parte de los cánceres, las células cancerosas menos diferenciadas tales como las poco diferenciadas o las no diferenciadas, crecen de forma más rápida tras la metástasis y el pronóstico es malo. Se dice que tales cánceres que son elevadamente malignos. Por el contrario, las células cancerosas elevadamente diferenciadas, es decir, las que muestran un grado elevado de diferenciación celular, mantienen los rasgos estructurales y funcionales del órgano a partir del que se originaron, y se puede decir que son menos malignas. Si tal malignidad del cáncer se puede determinar, se hace posible asegurar un mayor margen de escisión del tumor en los casos en donde su malignidad es elevada aun cuando el tamaño del tumor sea pequeño, así como para dar seguimiento al paciente, prestado atención a áreas más grandes en los tejidos circundantes.
En los casos en donde es posible el diagnóstico de la evolución posquirúrgica, incluyendo reaparición y metástasis, se hace posible el diagnóstico de si el tumor se ha escindido de forma completa mediante la cirugía. Dado que es probable que se produzca reaparición en los casos en donde la escisión fue incompleta, esto puede utilizarse como una base para juzgar si es necesario un seguimiento más cuidadoso del paciente a intervalos cortos, y en algunos casos, para decidir si debería llevarse a cabo una recirugía temprana. Además, puede hallarse cáncer recurrente en su fase temprana con una elevada posibilidad. En el caso de las metástasis a distancia, su detección es probable que sea tardía, pero si se proporciona un método que permita el diagnóstico de la metástasis, se puede obtener una base para decidir si la región a vigilar debería extenderse además al sitio donde se extirpó el tumor y a la vecindad del mismo.
Si el control de la terapia es posible, para optimizar la terapia puede seleccionarse entre diversos métodos terapéuticos un método terapéutico apropiado o una combinación de métodos terapéuticos. Si se pueden observar los efectos terapéuticos de los agentes antineoplásicos, la selección de los períodos de dosificación y de los tipos y dosis de los agentes antineoplásicos puede hacerse de forma más fácil. Además, tras la escisión del tumor, se puede conocer la presencia/ausencia del tumor restante y, durante el seguimiento del paciente, se puede tener un indicio para encontrar metástasis o reaparición tan pronto como sea posible, de forma que sea posible el inicio del tratamiento temprano. Si es posible el control de un efecto terapéutico, puede determinarse si la estrategia terapéutica fue apropiada y si la estrategia terapéutica debería cambiarse por otra.
Se sabe que los perros envejecen 7 veces más rápido que los seres humanos. Hoy en día un animal de compañía se mantiene como un miembro de la familia y con frecuencia tiene un estilo de vida similar al de su dueño. Por lo tanto, si el animal de compañía padece cáncer, es posible predecir que el propietario tiene un elevado riesgo de desarrollar cáncer en el futuro. Si el diagnóstico preciso del cáncer en animales de compañía es posible, se espera que sea útil como un indicio para la profilaxis del cáncer en sus dueños.
Se dice que actualmente se tienen aproximadamente 6.390.000 perros en el Japón y aproximadamente 17.640.000 en los Estados Unidos. Desde que, además de la vacunación contra la rabia se han hecho populares las vacunas de combinación tales como las vacunas pentavalente, heptavalente y octavalente, la aparición de enfermedades infecciosas elevadamente letales tales como la infección por parvovirus canino, ha disminuido la infección por virus del moquillo canino, la parainfluenza canina (tos de las perreras), la infección por adenovirus canino de tipo II (tos de las perreras), la hepatitis infecciosa canina, la infección por coronavirus canino y la leptospirosis. Por lo tanto, la esperanza de vida promedio de los perros ha aumentado, y los perros de 7 años de edad o mayores representan el 35,5 % de la cantidad total de perros. Como causas de muerte están aumentando de forma consistente, como en el hombre, el cáncer, la hipertensión, las enfermedades cardíacas y similares. En los Estados Unidos se diagnostican con cáncer aproximadamente 4.000.000 de perros/año y también se dice que aproximadamente 1.600.000 perros en el Japón tienen de forma potencial un determinado tumor.
Sin embargo, no existen hasta ahora agentes de diagnóstico simples para los cánceres animales y, en el campo de la sanidad animal, no se utilizan de forma habitual los métodos de prueba tales como la fotografía mediante rayos X, la TC y la RM. Su diagnóstico se lleva a cabo mediante palpación, análisis de sangre simple y una prueba mediante radiografía, que depende en gran medida de la experiencia del veterinario. Aunque algunos veterinarios han comenzado a emplear un método de prueba utilizando suero, se utilizan en el método marcadores tumorales humanos dado que no se han encontrado aún marcadores tumorales caninos.
El diagnóstico preciso del cáncer requiere una intervención quirúrgica abdominal, y hay grandes problemas respecto a la carga física para un perro y la carga económica para su dueño. Si el diagnóstico de los cánceres se puede llevar a cabo de forma conveniente en animales de compañía tales como los perros y los gatos, se hace posible la detección temprana y el diagnóstico preciso de los cánceres, lo que es útil para el tratamiento de los cánceres en los animales de compañía. Además, si se proporciona un método que permita tal diagnóstico simple de los cánceres utilizando suero, se espera que el método no solo haga posible diagnosticar cánceres sino también que contribuya en gran medida al reconocimiento médico periódico, el diagnóstico prequirúrgico y la determinación de la estrategia terapéutica.
A diferencia de lo que sucede con los seres humanos, el examen médico no es popular en los animales de compañía. Por lo tanto, en muchos casos, un tumor en un animal de compañía se encuentra en una fase tardía, y el dueño se da cuenta del tumor y lleva a su animal al examen médico solo después de que el tumor se ha hecho más grande. En los casos en donde el tumor desarrollado es maligno, la terapia quirúrgica tal como la intervención quirúrgica y la administración de un agente antineoplásico, o similares, a menudo son muy tardías. Por lo tanto, en los casos en donde un veterinario determinó que el cáncer era maligno, en general la terapia farmacológica antineoplásica se lleva a cabo sin intervención quirúrgica. Incluso en los casos en donde se lleva a cabo una intervención quirúrgica, la intervención quirúrgica debe controlarse de forma estricta para asegurar el margen y evitar la dispersión de sangre y de células durante la operación. Es conveniente iniciar la terapia farmacológica antineoplásica inmediatamente después de la intervención quirúrgica y seguir al paciente a intervalos cortos. Se espera que la detección temprana de los cánceres se haga más fácil si se adopta el diagnóstico anteriormente descrito en el examen médico para la denominada caudectomía canina ("dog dock'), que últimamente se está popularizando.
Por otro lado, en el caso de un tumor benigno, se puede decidir llevar a cabo una intervención quirúrgica incluso si el tumor es grande. Todo lo que se necesita es cuidar el área extirpada, y no hay necesidad de tratamiento con ningún fármaco antineoplásico caro ni debe estar nervioso acerca del seguimiento.
A la vista de las circunstancias anteriormente descritas, si se proporciona un medio simple para la detección de los cánceres con una elevada sensibilidad que se pueda aplicar al diagnóstico del cáncer en animales, se hace posible una terapia precisa y eficaz, lo cual es elevadamente ventajoso tanto para los dueños como para los veterinarios.
Bibliografía no de patente 1: Investigación del Ministerio de salud, trabajo y bienestar, 2004
Bibliografía no de patente 2: Nikkei Science, marzo de 2007, pág. 80-88
Bibliografía no de patente 3: Clinical Tests, diciembre de 2003, vol. 47, n.° 13, p. 1641-1654
Bibliografía no de patente 4: Estadísticas sobre enfermedades de perros y gatos, enero de 2005 Bibliografía no de patente 5: Companion Animal Health Products: Edición de 2006 por Tim Wesley, ANIMAL PHARM REPORTS
Bibliografía no de patente 6: Expansión y fase de evolución del cáncer. Hideaki Tsukuma, Departamento de control y estadística del cáncer, Centro Medico de Osaka para el cáncer y las enfermedades cardiovasculares.
Bibliografía no de patente 7: Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, vol. 50, n.° 11, p. 1405-1412
Bibliografía no de patente 8: J Cell Sci. 115: 1825-35
Bibliografía no de patente 9: Blood. 95: 1788-96
Bibliografía no de patente 10: Mol Endocrinol. 9: 243-54 (1995)
Bibliografía no de patente 11: J Cell Biol. 145: 83-98 (1999)
Divulgación de la invención
Problemas a resolver mediante la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar medios para la detección de un cáncer (cánceres) que sea útil en el diagnóstico de un cáncer (cánceres).
Medios para resolver el problema
Los presentes inventores investigaron de forma intensiva para obtener mediante el método SEREX un ADNc que codifica una proteína que se une a un anticuerpo que existe en suero obtenido de un cuerpo vivo portador de un tumor, utilizando una biblioteca de ADNc obtenida de testículo canino y suero de un perro portador de un tumor, cuyo ADN se utiliza para preparar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, una proteína calmegina canina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16, una proteína centrosómica canina (que puede abreviarse en lo sucesivo en este documento como CEP) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26 y la proteína de interacción con el receptor tiroideo 11 canina (que puede describirse en lo sucesivo en este documento como “TRIP11”) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45. Además, a base de un gen humano homólogo al gen obtenido, se prepararon un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 4, una proteína calmegina humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18, una CEP humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 28 y una TRIP11 humana que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 47. Los inventores encontraron que los genes que codifican estas proteínas se expresan de forma específica en testículo canino y humano, y en células cancerosas malignas (véanse los Ejemplos A-1, B-1, C-1 y D-1), y que las proteínas recombinantes preparadas a base de las secuencias de aminoácidos de estas proteínas reaccionan de forma específica con el suero en un cuerpo vivo portador de cáncer, así como que cada uno de los polipéptidos mencionados anteriormente y los factores homólogos de los mismos se pueden detectar de forma específica en un cuerpo vivo portador de cáncer mediante un anticuerpo preparado utilizando las respectivas proteínas recombinantes, completando de esta manera la presente invención.
La presente invención proporciona un método como se define en las reivindicaciones para la detección de un cáncer (o cánceres), que se aplica a una muestra separada de un cuerpo vivo y que comprende medir una expresión de al menos calmegina.
La presente invención también proporciona el uso, como se define en las reivindicaciones, de un reactivo para la detección de un cáncer (cánceres), que comprende un polipéptido antigénico que reacciona de forma inmunológica con y se une mediante una reacción antígeno-anticuerpo a un anticuerpo inducido en un cuerpo vivo frente a una calmegina.
La presente invención proporciona adicionalmente el uso, como se define en las reivindicaciones, de un reactivo para la detección de un cáncer (o cánceres), que comprende un anticuerpo que reacciona de forma inmunológica con calmegina o un fragmento de unión a antígeno de la misma. La presente invención proporciona adicionalmente un reactivo que comprende un anticuerpo que reacciona de forma inmunológica con calmegina o un fragmento de unión a antígeno del mismo para su uso en un método in vivo para detectar un cáncer (o cánceres) como se define en las reivindicaciones.
La presente invención aún proporciona adicionalmente el uso, como se define en las reivindicaciones, de un reactivo para la detección de un cáncer (o cánceres), que comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de no menos del 90 % a una región parcial que consiste en no menos de 18 bases consecutivas de SEQ ID NO 15 o 17, o un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a las mismas.
Efectos de la invención
Mediante la presente invención, se proporciona un método nuevo para la detección de un cáncer (o cánceres). Como se describirá de forma concreta en los Ejemplos a continuación, los polipéptidos recombinantes preparados a base de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4, la secuencia de aminoácidos de la calmegina, la secuencia de aminoácidos de la CEP mostrada en la SEQ ID NO: 26, 28 o 42, y la secuencia de aminoácidos de la TRIP11 reaccionan con anticuerpos que existen de forma específica en sueros de pacientes de cáncer. Por lo tanto, los cánceres en un cuerpo vivo pueden detectarse midiendo el anticuerpo en una muestra de acuerdo con el método de la presente invención. Los cánceres en un cuerpo vivo también pueden detectarse midiendo la proteína antigénica per se que reconoce el anticuerpo. Debido a que el método de la presente invención hace posible detectar cánceres pequeños invisibles y cánceres que existen en una parte profunda de un cuerpo, también es útil para la detección temprana de cánceres en los exámenes médicos y similares. Si el método de la presente invención se utiliza en el seguimiento de los pacientes tras la terapia del cáncer, también se puede detectar la reaparición del cáncer en su etapa temprana. Además, el método de la presente invención hace posible evaluar la fase de la evolución del cáncer tal como el crecimiento del tumor, la invasión del tumor en los tejidos circundantes y la metástasis del cáncer en ganglios linfáticos y en órganos distantes. Además, el método de la presente invención hace posible evaluar el grado de la malignidad del cáncer, debido a que los pacientes que padecen un cáncer más maligno tienen en suero más cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente, en comparación con los que padecen un cáncer menos maligno. Además, a base del aumento o disminución en suero del anticuerpo mencionado anteriormente, se puede evaluar qué tan eficaz es el fármaco antineoplásico administrado o si se dejó una porción del tumor en el paciente tras la extirpación del tumor, así como se puede obtener durante el seguimiento un indicio para encontrar metástasis y/o reaparición tan pronto como sea posible. Por lo tanto, mediante el método de la presente invención, se puede lograr el control de la terapia, lo que proporciona una base para la adopción de la estrategia terapéutica, tal como si la estrategia terapéutica aplicada a un paciente es apropiada o no, si la estrategia debe cambiarse a otra o no, o si una terapia debe iniciarse o no. Además, como se muestra en los Ejemplos a continuación, los ARNm que codifican un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en s Eq ID NO: 2 o 4, la calmegina, la CEP que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, 28 o 42, y los que codifican la TRIP11, se expresan de forma elevada de forma específica en el testículo y en células cancerosas. Por lo tanto, los cánceres se pueden detectar midiendo los ARNm.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra el patrón de expresión del gen identificado en el Ejemplo A-1 en tejidos normales y en líneas celulares tumorales. Número de referencia 1: el patrón de expresión del gen identificado; número de referencia 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.
La Fig. 2 muestra la detección mediante tinción de Coomassie de la proteína canina recombinante, que es un ejemplo del polipéptido utilizado en la presente invención, producida en E. coliy purificada en el Ejemplo A. Número de referencia 3: la banda para la proteína canina recombinante.
La Fig. 3 muestra algunos de los resultados del diagnóstico del cáncer en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando la proteína canina recombinante preparada en el Ejemplo A.
La Fig. 4 muestra algunos de los resultados del diagnóstico de cáncer detallado en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando la proteína canina recombinante preparada en el Ejemplo A.
La Fig. 5 muestra el patrón de expresión del gen que codifica la proteína calmegina en tejidos normales y en líneas celulares tumorales. Número de referencia 1: el patrón de expresión del gen que codifica la proteína calmegina; número de referencia 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.
La Fig. 6 muestra la detección por tinción de Coomassie de la calmegina canina, que es un ejemplo del polipéptido utilizado en la presente invención, producido en E. coli y purificado en el Ejemplo B. Número de referencia 3: la banda para la proteína calmegina canina.
La Fig. 7 muestra algunos de los resultados del diagnóstico del cáncer en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando la proteína calmegina canina preparada en el Ejemplo B.
La Fig. 8 muestra algunos de los resultados del diagnóstico del cáncer detallado en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando la proteína calmegina canina preparada en el Ejemplo B.
La Fig. 9 muestra el patrón de expresión del gen que codifica la CEP en tejidos normales y en líneas celulares tumorales. Número de referencia 1: el patrón de expresión para el gen que codifica la CEP; número de referencia 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.
La Fig. 10 muestra la detección mediante tinción de Coomassie del polipéptido obtenido de la CEP canina, que es un ejemplo del polipéptido utilizado en la presente invención, producido en E. coli y purificado en el Ejemplo C. Número de referencia 3: la banda para el polipéptido obtenido de la CEP canina.
La Fig. 11 muestra algunos de los resultados del diagnóstico del cáncer en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando el polipéptido obtenido de la CEP canina preparada en el Ejemplo C.
La Fig. 12 muestra algunos de los resultados del diagnóstico de cáncer detallado en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando el polipéptido obtenido de la CEP canina preparada en el Ejemplo C.
La Fig. 13 muestra el patrón de expresión del gen que codifica la proteína TRIP11 en tejidos normales y en líneas celulares tumorales. Número de referencia 1: el patrón de expresión del gen que codifica la proteína TRIP11; número de referencia 2: el patrón de expresión del gen GAPDH.
La Fig. 14 muestra la detección mediante tinción de Coomassie del polipéptido obtenido de la TRIP11 canina, que es un ejemplo del polipéptido utilizado en la presente invención, producido en E. coli y purificado en el Ejemplo D. Número de referencia 3: la banda del polipéptido obtenido de la TRIP11 canina.
La Fig. 15 muestra algunos de los resultados del diagnóstico del cáncer en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando el polipéptido obtenido de la TRIP11 canina preparado en el Ejemplo D.
La Fig. 16 muestra algunos de los resultados del diagnóstico del cáncer detallado en perros portadores de cáncer, llevado a cabo utilizando el polipéptido obtenido de la TRIP11 canina preparado en el Ejemplo D.
Mejor modo para llevar a cabo la invención
En el método de la presente invención, la expresión de un polipéptido establecido se mide utilizando una muestra separada de un cuerpo vivo. El método para medir la expresión de un polipéptido utilizando la muestra incluye un método en el que se mide mediante inmunoensayo un anticuerpo frente al polipéptido, anticuerpo que está contenido en la muestra (Método 1); un método en que se mide mediante inmunoensayo el polipéptido per se contenido en la muestra (Método 2) y un método en que se mide el ARNm contenido en la muestra que codifica el polipéptido (Método 3). En el método de la presente invención, la expresión del polipéptido se puede medir por cualquiera de estos tres métodos. En la presente invención el término “medición” incluye la detección, cuantificación y semicuantificación.
El polipéptido establecido mencionado anteriormente, cuya expresión se mide en el método de la presente invención está al menos (b) entre los polipéptidos (a) a (d) a continuación:
(a) un polipéptido producido en el cuerpo vivo y que tiene una reactividad para unirse a un anticuerpo frente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4 mediante reacción antígenoanticuerpo;
(b) la calmegina;
(c) un polipéptido que tiene una reactividad para unirse a un anticuerpo frente a una proteína centrosómica que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, 28 o 42 mediante reacción antígeno-anticuerpo; (d) la proteína de interacción con el receptor tiroideo 11.
Como se muestra en los siguientes Ejemplos, los cánceres se detectan de forma satisfactoria incluso midiendo la expresión de solo uno de estos polipéptidos. Por lo tanto, en la presente invención, se puede medir la expresión de solo (b) entre los polipéptidos (a) a (d), así como se pueden medir dos o más de los polipéptidos (a) a (d) en combinación, siempre que se mida la expresión de (b). Los cánceres se pueden detectar con una precisión más elevada cuando se miden dos o más polipéptidos, (véase el ejemplo E a continuación).
El polipéptido (a) es un polipéptido que se produce en un cuerpo vivo y tiene una reactividad para unirse a un anticuerpo frente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4, mediante una reacción antígeno-anticuerpo. En otras palabras, el polipéptido establecido cuya expresión debe medirse es un polipéptido que tiene la misma antigenicidad que un polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2 o que un polipéptido obtenido de ser humano de la SEQ ID NO: 4.
Los ejemplos específicos de tal polipéptido incluyen un polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2 o un polipéptido obtenido de ser humano de la SEQ ID NO: 4. Estos polipéptidos son el antígeno correspondiente de “un anticuerpo frente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4” y por lo tanto incluidos en el polipéptido establecido mencionado anteriormente. Los ejemplos específicos del polipéptido también incluyen un polipéptido que se obtiene de otros mamíferos y que tiene la misma antigenicidad que el polipéptido obtenido de canino o de ser humano mencionado anteriormente (tal polipéptido se denominará en lo sucesivo en este documento como “factor homólogo”, y el polipéptido obtenido de ser humano como se describe anteriormente también puede denominarse como “factor homólogo humano” del polipéptido obtenido de canino).
La SEQ ID NO: 2 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido con función desconocida identificado en los Ejemplos a continuación como un polipéptido que se une a un anticuerpo que existe de forma específica en suero obtenido de un perro portador de cáncer (el anticuerpo también puede denominarse en lo sucesivo en este documento como “anticuerpo específico de cáncer” de perros), cuya identificación se llevó a cabo mediante el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc obtenida de testículo canino y suero de perros portadores de cáncer (véase el Ejemplo A-1). Por lo tanto, en perros pueden detectarse los cánceres midiendo este anticuerpo específico de cáncer frente a un polipéptido de la s Eq ID NO: 2 en conformidad con el Método 1 anterior (véanse los Ejemplos A-3 y A-4). También se pueden detectar los cánceres en perros midiendo el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 per se, que es el antígeno, en conformidad con el Método 2 anterior (véanse los Ejemplos A-5 y A-6). Además, dado que la expresión del ARNm que codifica el polipéptido antigénico es significativamente elevada en el testículo y las células cancerosas, como se muestra en los siguientes Ejemplos (véase el Ejemplo A-1), en perros también pueden detectarse los cánceres midiendo el ARNm. Cabe señalar que, aunque la secuencia de aminoácidos del polipéptido canino mostrada en la SEQ ID NO: 2 está registrada en la base de datos del NCBI con el n.° de Referencia XP_535343 (proteína) y el n.° de Referencia XM_535343 (gen codificante), su función no se ha informado aún.
La SEQ ID NO: 4 muestra la secuencia de aminoácidos del factor homólogo humano del polipéptido obtenido de canino descrito anteriormente, el cual se encontró mediante búsqueda de homología mediante BLAST. La secuencia de bases que codifica el factor homólogo humano y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestran en las SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente, y también están registradas en la base de datos del NCBI con el n.° de Referencia NP_689873 (proteína) y el n.° de Referencia NM_152660 (gen codificante). De forma similar al polipéptido obtenido de canino descrito anteriormente, no se ha informado ninguna función del factor homólogo humano. Como se muestra de forma concreta en los siguientes Ejemplos, de forma similar al polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, el nivel de expresión del ARNm que codifica el factor homólogo humano es significativamente elevado en testículo y células cancerosas humanos y en seres humanos sanos no se detecta un anticuerpo frente al factor homólogo humano. Por lo tanto, en los seres humanos pueden detectarse los cánceres determinando la expresión de un polipéptido de la SEQ ID NO: 4 en los seres humanos.
Los ejemplos específicos del factor homólogo en otros mamíferos que tienen la misma antigenicidad que el polipéptido obtenido de canino mencionado anteriormente o que el factor homólogo humano del mismo incluyen, por ejemplo, el polipéptido que existe de forma específica en gatos portadores de cáncer, como se muestra en los siguientes Ejemplos. El polipéptido felino reacciona de forma inmunológica no solo con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2 sino también con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el factor homólogo humano de la SEQ ID NO: 4 (véanse los Ejemplos A-5 y A-6). Por lo tanto, este polipéptido felino es el factor homólogo felino que tiene la misma antigenicidad que los polipéptidos obtenidos de canino y de ser humano descritos anteriormente, e incluidos en el ámbito de un polipéptido “que tiene una reactividad para unirse a un anticuerpo frente a un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4 mediante reacción antígeno-anticuerpo”, cuya expresión se va a medir en la presente invención. Como se describe de forma concreta en los Ejemplos a continuación, un anticuerpo inducido en gatos frente al factor homólogo felino se detecta solo en gatos portadores de cáncer y no se detecta en gatos sanos. El factor homólogo felino per se, que es el antígeno, también se detecta solo en gatos portadores de cáncer y no se detecta en gatos sanos. Por lo tanto, se pueden detectar los cánceres en mamíferos midiendo la expresión del factor homólogo en mamíferos que no sean gatos y seres humanos.
El polipéptido (a) descrito anteriormente preferentemente es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SeQ ID NO: 2 en el LISTADO DE SECUENCIAS, o un polipéptido que tiene una homología de no menos del 95 % con ella, y que se produce en un cuerpo vivo. La homología entre el polipéptido obtenido de canino (SEQ ID NO: 2) y el factor homólogo humano del mismo (SEQ ID NO: 4) es del 93 % en términos de secuencia de bases y del 99 % en términos de secuencia de aminoácidos. Aunque los perros y los seres humanos son genéticamente distantes, el factor homólogo en tales especies genéticamente distantes comparte una homología muy elevada del 99 % al nivel de aminoácidos. Por lo tanto, se cree que el factor homólogo en mamíferos que no sean el ser humano también comparte una homología elevada de no menos del 95 % con el polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2
El polipéptido anteriormente descrito (b), la Calmegina, se identificó como una proteína que se expresa de forma específica en el momento de la diferenciación de la espermátide, y tiene una actividad de chaperona in vitro. Dado que se expresa solo en testículo y desaparece en el espermatozoide maduro, la calmegina se considera que tiene la función de plegar proteínas implicadas en diferenciación de la espermátide (bibliografía no de patente 7: Naokazu Inoue, Ryo Yamaguchi y Masahito Ikawa, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, vol. 50, n.° 11, 1405 -1412). Sin embargo, no ha habido informes que muestren que la proteína se expresa en un cáncer y que sea útil para el diagnóstico del cáncer y similares.
La SEQ ID NO: 16 muestra la secuencia de aminoácidos de la calmegina canina. La calmegina canina que tiene esta secuencia de aminoácidos se identificó como un polipéptido que se une a un anticuerpo que existe de forma específica en suero obtenido de un perro portador de cáncer, cuya identificación se llevó a cabo mediante el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc obtenido de testículo canino y suero de perros portadores de cáncer (véase el Ejemplo B-1). Es decir, en perros portadores de cáncer se induce de forma específica un anticuerpo frente a la calmegina que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16. Por lo tanto, en perros se pueden detectar cánceres midiendo el anticuerpo mencionado anteriormente frente a la calmegina que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16, en conformidad con el Método 1 anterior (véanse los Ejemplos B-3 y B-4). En perros también pueden detectarse cánceres midiendo la calmegina de la SEQ ID NO: 16 per se, que es el antígeno, en conformidad con el Método 2 anterior (véanse los Ejemplos B-5 y B-6). Además, dado que la expresión del ARNm que codifica la calmegina es significativamente elevada en testículo y en células cancerosas, como se muestra en los siguientes Ejemplos (véase el Ejemplo B-1), también pueden detectarse cánceres en perros midiendo el ARNm.
En el método de la presente invención puede medirse no solo calmegina canina de la SEQ ID NO: 16 sino también la calmegina en otros mamíferos (denominada en lo sucesivo en este documento como “factor homólogo” de la calmegina canina; en los casos en donde se utilice el término simple “calmegina”, se denomina mediante este término no solo a la calmegina canina sino también a la calmegina de otros mamíferos). Como se describe de forma concreta en el Ejemplo a continuación, de forma similar a la calmegina canina de la SEQ ID NO: 16, el nivel de expresión del ARNm que codifica la calmegina humana es también significativamente elevado en testículo y células cancerosas humanos, y no se detecta en humanos sanos un anticuerpo frente a la calmegina humana. El anticuerpo frente a la calmegina felina se detecta solo en gatos portadores de cáncer y no se detecta en gatos sanos. Por lo tanto, midiendo la expresión de la calmegina en mamíferos que no sean perros se pueden detectar también cánceres en los mamíferos. Además de la calmegina canina, los ejemplos de la calmegina a medir en el método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la calmegina humana, la calmegina felina y similares. La secuencia de bases que codifica la calmegina humana y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestran en las SEQ ID NO: 17 y 18 en el LISTADO DE SECUENCIAS, respectivamente, y la homología entre la calmegina humana y la calmegina canina es del 90 % en términos de la secuencia de bases y del 89 % en términos de la secuencia de aminoácidos. Aunque los perros y los seres humanos son genéticamente distantes, la calmegina en tales especies genéticamente distantes comparte una homología elevada del 89 % al nivel de aminoácidos. Por lo tanto, se cree que la calmegina en mamíferos que no sean seres humanos comparte una elevada homología de no menos de aproximadamente el 80 % con la calmegina canina. Es decir, la calmegina a medir en el método de la presente invención preferentemente tiene una homología de no menos del 80 %, más preferentemente no menos del 85 % con la calmegina canina mostrada en la SEQ ID NO: 16, aunque no se restringe a estos.
El polipéptido (c) descrito anteriormente es un polipéptido que tiene una reactividad para unirse a un anticuerpo frente a la proteína centrosómica (CEP) que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, 28 o 42, mediante reacción antígeno-anticuerpo. En otras palabras, el polipéptido (c) descrito anteriormente es un polipéptido que tiene la misma antigenicidad que la CEP obtenida de canino de la SEQ ID NO: 26 o 42 o la CEP obtenida de ser humano de la SEQ ID NO: 28.
Los ejemplos específicos de tal CEP establecida incluyen la CEP obtenida de canino de la SEQ ID NO: 26 o 42, y la CEP obtenida de ser humano de la SEQ ID NO: 28. Estas CEP son el antígeno correspondiente de “un anticuerpo frente a la CEP que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, 28 o 42”, y por lo tanto están incluidas en una CEP establecida como se menciona anteriormente. Los ejemplos específicos de la CEP también incluyen la CEP obtenida de otros mamíferos que tiene la misma antigenicidad que la CEP obtenida de canino o de ser humano mencionada anteriormente (tal CEP se denomina en lo sucesivo en este documento como “factor homólogo” y una CEP obtenida de ser humano mencionada anteriormente también puede denominarse como “factor homólogo humano” de la CEP obtenida de canino).
La SEQ ID NO: 26 muestra la secuencia de aminoácidos de la CEP canina identificada como un polipéptido que se une a un anticuerpo que existe de forma específica en suero obtenido de un perro portador de cáncer (también denominado en lo sucesivo en este documento como un “anticuerpo específico de cáncer” canino), cuya identificación se llevó a cabo mediante el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc obtenida de testículo canino y suero de perros portadores de cáncer (véase el Ejemplo C-1). Por lo tanto, en perros se pueden detectar los cánceres midiendo el anticuerpo mencionado anteriormente frente a la CEP canina que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, en conformidad con el Método 1 anterior (véanse los Ejemplos C-3 y C-4). También se pueden detectar los cánceres en perros midiendo la CEP de la SEQ ID NO: 26 per se, que es el antígeno, en conformidad con el Método 2 anterior (véanse los Ejemplos C-5 y C-6). Además, dado que la expresión del ARNm que codifica la CEP de la SEQ ID NO: 26 es significativamente elevada en testículo y las células cancerosas, como se muestra en los siguientes Ejemplos (véase el Ejemplo C-1), también pueden detectarse cánceres en perros midiendo el ARNm. La CEP es una proteína que el centrosoma necesita para controlar los microtúbulos y que también está implicada en la maduración del centrosoma. La frecuente aparición de translocaciones cromosómicas se conoce en una parte de los trastornos mieloproliferativos, y dado que el gen CEP está presente en el punto en donde se produce la translocación, se considera que tiene una determinada relación con los trastornos. Sin embargo, no ha habido informes que muestren que la proteína se exprese en un cáncer y sea útil para el diagnóstico del cáncer (bibliografía no de patente 8: J Cell Sci. 115: 1825-35, bibliografía no de patente 9: Blood 95: 1788- 96).
La SEQ ID NO: 42 muestra la secuencia de aminoácidos de una CEP canina conocida registrada en una base de datos, que se encontró como una proteína que comparte una homología muy elevada con la CEP canina obtenida mediante la búsqueda por BLAST mencionada anteriormente (véase el Ejemplo C-1). La secuencia de bases de esta CEP canina conocida se muestra en la SEQ ID NO: 41. De forma similar a la CEP canina de la SEQ ID NO: 26, la CEP canina de la SEQ ID NO: 42 también se considera que se expresa de forma elevada en perros portadores de cáncer, y en perros los cánceres se pueden detectar determinando la expresión de esta CEP canina conocida, como se describe de forma concreta en los siguientes Ejemplos.
La SEQ ID NO: 28 muestra la secuencia de aminoácidos de un factor homólogo humano de la CEP obtenida de canino mencionado anteriormente, cuya secuencia de aminoácidos se encontró mediante búsqueda de homología por BLAST. La secuencia de bases que codifica el factor homólogo humano y la secuencia de aminoácidos del mismo, se muestra en las SEQ ID NO: 27 y 28 en el LISTADO DE SECUENCIAS, respectivamente. Como se describe de forma concreta en los Ejemplos a continuación, de forma similar a la CEP obtenida de canino de la SEQ ID NO: 26, el nivel de expresión del ARNm que codifica el factor homólogo humano es significativamente elevado en testículo o células cancerosas humanos, y en seres humanos sanos no se detecta un anticuerpo frente al factor homólogo humano. Por lo tanto, en seres humanos pueden detectarse cánceres determinando la expresión de la CEP de la SEQ ID NO: 28 en los seres humanos.
Los ejemplos específicos del factor homólogo en otros mamíferos que tiene la misma antigenicidad que la CEP obtenida de canino descrita anteriormente o que el factor homólogo humano del mismo incluyen, por ejemplo, la CEP que existe de forma específica en gatos portadores de cáncer, como se muestra en los siguientes Ejemplos. La CEP felina reacciona de forma inmunológica no solo con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno la CEP obtenida de canino de la SEQ ID NO: 26 o 42, sino también con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el factor homólogo humano de la SEQ ID NO: 28 (véanse los Ejemplos C-5 y C-6). Por lo tanto, esta CEP felina es un factor homólogo felino que tiene la misma antigenicidad que las CEP obtenidas de canino y de ser humano mencionadas anteriormente, y por lo tanto están incluidas en el ámbito de una CEP “que tiene una reactividad para unirse a un anticuerpo frente a la CEP que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, 28 o 42 mediante reacción antígeno-anticuerpo”, cuya expresión se medirá en la presente invención. Como se describe de forma completa en los Ejemplos a continuación, el anticuerpo inducido en gatos frente al factor homólogo felino se detecta solo en gatos portadores de cáncer y no se detecta en gatos sanos. El factor homólogo felino per se, que es el antígeno, también se detecta solo en gatos portadores de cáncer y no se detecta en gatos sanos. Por lo tanto, también se pueden detectar cánceres en mamíferos midiendo el factor homólogo en mamíferos que no sean perros y seres humanos.
Preferentemente, la CEP cuya expresión debe medirse en el método de detección de la presente invención es una CEP que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26 o 42 en el LISTADO DE SECUENCIA, o un polipéptido que tiene una homología de no menos del 80 % con el mismo y se produce en un cuerpo vivo. La homología entre la CEP obtenida de canino y el factor homólogo humano del mismo es del 87 % en términos de secuencia de bases y del 84 % en términos de secuencia de aminoácidos. Aunque los perros y los seres humanos son genéticamente distantes, el factor homólogo en tales especies genéticamente distantes comparte una homología muy elevada del 84 % a nivel de aminoácidos. Por lo tanto, se cree que el factor homólogo en mamíferos que no sean seres humanos también comparte una elevada homología de no menos del 80 % con la CEP canina.
El polipéptido descrito anteriormente (d), TRIP 11 (proteína que interacciona con el receptor tiroideo 11), se identificó primero como un factor que interactúa con el receptor de la hormona tiroidea p y también se hizo evidente su unión al aparato de Golgi y a los microtúbulos, de forma que se considera que desempeña un papel en el mantenimiento de las formas de estos orgánulos haciendo uniones entre los cisternas de Golgi, los microtúbulos y similares. Sin embargo, no ha habido informes que muestren que la proteína se exprese en un cáncer y sea útil para el diagnóstico del cáncer y similares (bibliografía no de patente 10: Mol Endocrinol 9: 243-54 (1995); bibliografía no de patente 11: J Cell Biol.
145: 83-98 (1999)).
La SEQ ID NO: 45 muestra la secuencia de aminoácidos del TRIP11 canino. El TRIP11 canino que tiene esta secuencia de aminoácidos se identificó como polipéptido que se une a un anticuerpo que existe de forma específica en suero obtenido de un perro portador de cáncer, cuya identificación se llevó a cabo mediante el método SEREX utilizando una biblioteca de ADNc obtenida de testículo canino y suero de perros portadores de cáncer (véase el Ejemplo D-1). Es decir, en perros portadores de cáncer, se induce de forma específica un anticuerpo frente al TRIP11 que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45. Por lo tanto, en perros se pueden detectar cánceres midiendo el anticuerpo mencionado anteriormente frente al TRIP 11 que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45, en conformidad con el Método 1 anterior (véanse los Ejemplos D-3 y D-4). También se pueden detectar cánceres en perros midiendo el TRIP11 de la SEQ ID NO: 45 per se, que es el antígeno, en conformidad con el Método 2 anterior (véanse los Ejemplos D-5 y D-6). Además, dado que la expresión del ARNm que codifica al TRIP 11 es significativamente elevada en el testículo y en células cancerosas, como se muestra en los Ejemplos siguientes (véase el Ejemplo D-1), también pueden detectarse cánceres en perros midiendo el ARNm.
En el método de la presente invención, puede medirse no solo el TRIP11 canino de la SEQ ID NO: 45 sino también el TRIP 11 de otros mamíferos (también denominado en lo sucesivo en este documento como “factor homólogo” del TRIP11 canino; en los casos en donde se utilice el término simple “TRIP11”, se denomina mediante el término no solo el TRIP11 canino sino también otros TRIP11 de mamífero). Como se describe de forma concreta en el Ejemplo a continuación, de forma similar al TRIP11 canino de la SEQ ID NO: 45, el nivel de expresión del ARNm que codifica el TRIP11 humano también es significativamente elevado en el testículo y células cancerosas humanos, y no se detecta en humanos sanos un anticuerpo frente al TRIP11 humano. El anticuerpo frente al TRIP11 felino se detecta solo en gatos portadores de cáncer y no se detectan en gatos sanos. Por lo tanto, también pueden detectarse cánceres en los mamíferos midiendo la expresión del TRIP11 en mamíferos que no sean perros. Además del TRIP 11 canino, los ejemplos del TRIP11 a medir en el método de la presente invención incluyen, pero sin limitación, TRIP11 humano, TRIP11 felino y similares. La secuencia de bases que codifican el TRIP11 humano y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestran en las SEQ ID NO: 46 y 47 en el LISTADO DE SECUENCIAS, respectivamente, y la homología entre el TRIP11 canino y el TRIP11 humano es del 88 % en términos de la secuencia de bases y del 86 % en términos de la secuencia de aminoácidos. Aunque los perros y los seres humanos son genéticamente distantes, los TRIP11 en tales especies genéticamente distantes comparten entre sí una homología muy elevada del 86 % al nivel de aminoácidos. Por lo tanto, se cree que el TRIP11 en mamíferos que no sean seres humanos también comparte una homología elevada de no menos de aproximadamente el 75% con el TRIP11 canino. Es decir, el TRIP11 cuya expresión debe medirse en el método de la presente invención preferentemente tiene una homología de no menos del 75 %, más preferentemente no menos del 80 % con la secuencia de aminoácidos del TRIP11 canino mostrada en la SEQ ID NO: 45, aunque no se restringe a estos.
Cabe señalar que la expresión “que tiene la secuencia de aminoácidos” en la presente invención significa que los restos de aminoácidos se alinean en ese orden. Por consiguiente, por ejemplo “un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2” significa un polipéptido que tiene un tamaño de 306 restos de aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos es Met Ala Ala Leu ... (...)... Ile Thr Ser Pro como se muestra en la SEQ ID NO: 2. Además, “un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2” puede abreviarse como “un polipéptido de la SEQ ID NO: 2”. Esto también se aplica a la expresión “que tenga la secuencia de bases”. Cabe señalar que el término “polipéptido” en la presente invención significa una molécula formada por el enlace peptídico de una pluralidad de aminoácidos, e incluye no sólo moléculas de polipéptido constituidas por un gran número de aminoácidos, sino también moléculas de bajo peso molecular que tengan un pequeño número de aminoácidos (oligopéptidos) y proteínas de longitud completa. Por lo tanto, en la presente invención también están incluidas en “polipéptido” las proteínas que consisten en la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, 4, 16, 18, 26, 28, 42, 45 o 47.
En el Método 1 anterior, la medición del anticuerpo específico de cáncer que puede existir en la muestra, se puede llevar a cabo de forma fácil mediante inmunoensayo utilizando una sustancia antigénica que reacciona de forma inmunológica con el anticuerpo. El inmunoensayo per se es un método convencional bien conocido, como se explica con detalle a continuación. Los ejemplos de la sustancia antigénica que puede utilizarse en el inmunoensayo incluyen un polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, que induce el anticuerpo en perros portadores de cáncer. Dado que los anticuerpos tienen reactividad cruzada, una molécula puede unirse a un anticuerpo que se induce frente a otro inmunógeno, siempre que la molécula tenga alguna estructura en ella que sea similar al epítopo del inmunógeno. Por ejemplo, los polipéptidos que tienen entre sí elevada homología de secuencia de aminoácidos, a menudo tienen epítopos con estructuras similares, y en tales casos ambos polipéptidos pueden tener la misma antigenicidad. Como se describe de forma concreta en los Ejemplos a continuación, el polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45 reacciona de forma inmunológica no solo con un anticuerpo frente al polipéptido inducido en perros portadores de cáncer, sino también con un anticuerpo inducido frente a un factor homólogo felino en gatos portadores de cáncer. El factor homólogo humano reacciona de forma inmunológica con los anticuerpos descritos anteriormente inducidos en gatos y perros portadores de cáncer. Por lo tanto, en el Método 1 de la presente invención, en el inmunoensayo puede utilizarse como antígeno cualquiera de los factores homólogos de mamífero.
Las sustancias antigénicas que tienen un gran peso molecular y una estructura compleja, tales como las proteínas, habitualmente tienen una pluralidad de sitios con distintas estructuras en su superficie. Por lo tanto, tal sustancia antigénica compleja grande induce en un cuerpo vivo una pluralidad de tipos de anticuerpos que reconocen respectivamente cada uno de los sitios. Es decir, un anticuerpo inducido en un cuerpo vivo frente a una sustancia antigénica tal como una proteína es un anticuerpo policlonal, que es una mezcla de una pluralidad de tipos de anticuerpos. Los anticuerpos específicos de cáncer que encontraron los presentes inventores, que existen de forma específica en el suero procedente de cuerpos vivos portadores de cáncer, y que se unen de forma específica a un polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o factores homólogos de los mismos, mediante reacción antígenoanticuerpo, también son un anticuerpo policlonal. Cabe señalar que, en la presente invención, la expresión “anticuerpo policlonal” significa un anticuerpo que existe en el suero procedente de un cuerpo vivo que tiene una sustancia antigénica en él y que se induce en el cuerpo vivo frente a la sustancia antigénica.
En el Ejemplo A a continuación, se prepararon como un antígeno para el inmunoensayo del anticuerpo específico de cáncer, el polipéptido que consiste en la región entera de la SEQ ID NO: 2 y un polipéptido que consiste en la región entera de la SEQ ID NO: 4, que es el factor homólogo humano, y se confirmó la reactividad de estos polipéptidos con el anticuerpo en el suero obtenido de un cuerpo vivo portador de cáncer. En el Ejemplo B a continuación, se prepararon un polipéptido que consiste en la región entera de la SEQ ID NO: 16 (calmegina canina) y un polipéptido que consiste en la región entera de la SEQ ID NO: 18 (calmegina humana), que es el factor homólogo humano del mismo, y se confirmó la reactividad de estos polipéptidos con el anticuerpo en el suero obtenido de un cuerpo vivo portador de cáncer. En el Ejemplo C a continuación, se prepararon un polipéptido que consiste en una región de los aminoácidos 1514 a 2339 de la SEQ ID NO: 26 (CEP canino) y un polipéptido que consiste en una región de los aminoácidos 1513 a 2325 de la SEQ ID NO: 28 (CEP humano), y se confirmó la reactividad de estos polipéptidos con el anticuerpo en el suero obtenido de un cuerpo vivo portador de cáncer. En el Ejemplo D a continuación, se prepararon un polipéptido que consiste en una región de los aminoácidos 237 a 1023 de la SEQ ID NO: 45 (TRIP11 canino) y un polipéptido que consiste en una región de los aminoácidos 236 a 1023 de la SEQ ID NO: 47 (TRIP11 humano), y se confirmó la reactividad de estos polipéptidos con el anticuerpo en el suero obtenido de un cuerpo vivo portador de cáncer. Sin embargo, dado que los anticuerpos mencionados anteriormente son policlonales, un polipéptido que consiste en la longitud completa de las SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45 o un factor homólogo del mismo, por supuesto se une al anticuerpo. Además, un fragmento del polipéptido se puede unir al anticuerpo contenido en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer, dado que el anticuerpo policlonal puede incluir anticuerpos que reconocen la estructura del fragmento. Es decir, en la medición del anticuerpo policlonal contenido de forma específica en el suero de un cuerpo vivo portador de cáncer, se puede utilizar no solo un polipéptido que consiste en la longitud completa de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o un factor homólogo del mismo, sino también un fragmento del mismo, y es útil para la detección de un cáncer (o cánceres).
Por lo tanto, un polipéptido utilizado como un antígeno para el inmunoensayo del Método 1 de la presente invención no se restringe a un polipéptido que consiste en la longitud completa de la s Eq ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o a un factor homólogo del mismo (por ejemplo la SEQ ID NO: 4, 18, 28, 47, etc.), e incluye un fragmento de polipéptido que consiste en no menos de 7 aminoácidos consecutivos, preferentemente no menos de 10 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o de un factor homólogo del mismo, y que reacciona de forma inmunológica con un anticuerpo policlonal frente a un polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o un factor homólogo del mismo (el fragmento de polipéptido también se puede denominar en lo sucesivo en este documento como “polipéptido parcial reactivo de forma específica” según conveniencia). Cabe señalar que, como se conoce en la técnica, un polipéptido que tenga no menos de aproximadamente 7 restos de aminoácidos puede ejercer su antigenicidad.
Sin embargo, en los casos donde el número de restos de aminoácidos sea demasiado pequeño, está aumentada la posibilidad de que el polipéptido antigénico pueda reaccionar de forma cruzada con anticuerpos frente a proteínas que existen en la muestra y sean distintas del polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o el factor homólogo del mismo. Por lo tanto, a la vista de lograr una alta precisión en el inmunoensayo, es preferente como el antígeno utilizado en el inmunoensayo un fragmento de polipéptido que consiste en un gran número de restos de aminoácidos. Por ejemplo, en el caso de un polipéptido de la s Eq ID NO: 2, o un factor homólogo del mismo, se desea que el número de restos de aminoácidos del fragmento de polipéptido utilizado deba ser preferentemente de no menos de 30, más preferentemente de no menos de 100, aún más preferentemente de no menos de 200, aún más preferentemente de no menos de 250. En el caso de la calmegina canina de la SEQ ID NO: 16, o un factor homólogo de la misma, se desea que el número de restos de aminoácidos deba ser preferentemente de no menos de 30, más preferentemente de no menos de 100, aún más preferentemente de no menos de 200, aún más preferentemente de no menos de 400, aún más preferentemente de no menos de 550. En el caso del CEP canino de la SEQ ID NO: 26 o 42, o de un factor homólogo del mismo, se desea que el número de restos de aminoácidos deba ser preferentemente de no menos de 30, más preferentemente de no menos de 100, aún más preferentemente de no menos de 300, aún más preferentemente de no menos de 600, y el número de restos de aminoácidos puede ser de no menos de 1000, no menos de 1500 o no menos de 2000. En el caso del TRIP11 canino de la SEQ ID NO: 45, o de un factor homólogo del mismo, se desea que el número del resto de aminoácidos deba ser preferentemente de no menos de 30, más preferentemente de no menos de 100, aún más preferentemente de no menos de 300, aún más preferentemente de no menos de 600, y el número de restos puede ser de no menos de 1000 o no menos de 1500.
Los ejemplos específicos del polipéptido utilizado como un antígeno incluyen los siguientes polipéptidos:
(e) un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o 4;
(f) un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16 o 18;
(g) un polipéptido que consiste en no menos de 500 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26 y que comprende no menos de 500 aminoácidos consecutivos emplazados en la región de los aminoácidos 1514 a 2339 de la SEQ ID NO: 26, o un polipéptido que consiste en no menos de 500 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 28 y que comprende no menos de 500 aminoácidos consecutivos emplazados en la región de los aminoácidos 1513 a 2325 de la SEQ ID NO: 28;
(h) un polipéptido que consiste en no menos de 500 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45 y que comprende no menos de 500 aminoácidos consecutivos emplazados en la región de los aminoácidos 237 a 1023 de la SEQ ID NO: 45, o un polipéptido que consiste en no menos de 500 aminoácidos consecutivos de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 47 y que comprende no menos de 500 aminoácidos consecutivos emplazados en la región de los aminoácidos 236 a 1023 de la SEQ ID NO: 47.
Los ejemplos preferentes del polipéptido (g) anterior (un polipéptido de la SEQ ID NO: 26 o un fragmento del mismo, o un polipéptido de la SEQ ID NO: 28 o un fragmento del mismo) incluyen un fragmento que comprende una región de los aminoácidos 1514 a 2339 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26 y consiste en no más de 1000 aminoácidos, y un fragmento que comprende una región de los aminoácidos 1513 a 2325 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 28 y que consiste en no más de 1000 aminoácidos. Los ejemplos más preferentes de los mismos incluyen un fragmento que consiste en una región de los aminoácidos 1514 a 2339 (SEQ ID NO: 35) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 26, y un fragmento que consiste en una región de los aminoácidos 1513 a 2325 (SEQ ID NO: 36) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 28.
Los ejemplos preferentes del polipéptido (h) anterior (un polipéptido de la SEQ ID NO: 45 o un fragmento del mismo, o un polipéptido de la SEQ ID NO: 47 o un fragmento del mismo) incluyen un fragmento que comprende una región de los aminoácidos 237 a 1023 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45 y consiste en no menos de 1000 aminoácidos, y un fragmento que comprende una región de los aminoácidos 236 a 1023 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 47 y consiste en no más de 1000 aminoácidos. Los ejemplos más preferentes del mismo incluyen un fragmento que consiste en una región de los aminoácidos 237 a 1023 (SEQ ID NO: 54) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 45, y un fragmento que consiste en una región de los aminoácidos 236 a 1023 (SEQ ID NO: 55) de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 47.
Se sabe bien en la técnica que, en general, hay casos en donde un antígeno de proteína conserva sustancialmente la misma antigenicidad que el original incluso si la secuencia de aminoácidos de la proteína se modifica de forma que se sustituye, deleciona y/o inserta un pequeño número de aminoácidos. Por lo tanto, también puede utilizarse para la detección de los cánceres cada uno de los polipéptidos que tienen la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o que el factor homólogo del mismo, excepto que esté sustituido, delecionado y/o insertado un pequeño número de aminoácidos, cuya secuencia tiene una homología de no menos del 80 %, preferentemente no menos del 90 %, más preferentemente no menos del 95 %, aún más preferentemente no menos del 98 % con la secuencia del polipéptido original, y cuyo polipéptido se une de forma específica a un anticuerpo policlonal frente a un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o a un factor homólogo del mismo, mediante reacción antígeno-anticuerpo (los polipéptidos también pueden denominarse en lo sucesivo en este documento como “polipéptido modificado reactivo de forma específica” para conveniencia). Preferentemente, el polipéptido modificado reactivo de forma específica tiene la misma secuencia de aminoácidos que el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o que un factor homólogo del mismo (preferentemente que tenga la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 4, 18, 28 o 47), excepto que estén sustituidos, delecionados y/o insertados uno o varios restos de aminoácido.
Como se utiliza en el presente documento, el término “homología” de secuencias de aminoácidos significa un valor expresado en porcentaje que se calcula alineando dos secuencias de aminoácidos a comparar, de forma que el número de restos de aminoácidos que coinciden sea máximo y dividiendo el número de restos de aminoácidos que coinciden por el número total de restos de aminoácidos. Cuando el alineamiento descrito anteriormente se lleva a cabo, se inserta (o insertan) un hueco (o huecos) según se necesite en una o ambas de las dos secuencias a comparar. Tal alineamiento de secuencias se puede llevar a cabo utilizando un programa bien conocido tal como BLAST, FASTA y CLUSTAL W. Cuando se inserta (o insertan) un hueco (o huecos), el número total de restos de aminoácidos descrito anteriormente se calcula contando un hueco como un resto de aminoácidos. Cuando los así contados números de restos de aminoácidos totales son distintos entre las dos secuencias a comparar, la homología (%) se calcula dividiendo el número de restos de aminoácido que coinciden por el número total de restos de aminoácidos en la secuencia más larga. Los 20 tipos de aminoácidos que constituyen las proteínas de origen natural se pueden clasificar en grupos, cada uno de los cuales tiene propiedades similares, por ejemplo, en aminoácidos neutros con cadenas laterales que tienen baja polaridad (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), aminoácidos neutros que tienen cadenas laterales hidrófilas (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), aminoácidos ácidos (Asp, Glu), aminoácidos básicos (Arg, Lys, His) y aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp). Se sabe que, en la mayoría de los casos, las sustituciones de aminoácidos dentro del mismo grupo no cambian las propiedades de los polipéptidos. Por lo tanto, en los casos en donde el resto (o restos) de aminoácido del polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o de un factor homólogo del mismo, se sustituya (o sustituyan), la probabilidad de que la capacidad de unión al correspondiente anticuerpo puede mantenerse puede hacerse más alta realizando la sustitución (o sustituciones) dentro del mismo grupo.
También pueden utilizarse para la detección de los cánceres los polipéptidos que contienen el polipéptido descrito anteriormente utilizado en la presente invención como una secuencia parcial (es decir, los polipéptidos utilizados en la presente invención que tienen otro (poli)péptido (o polipéptidos) añadido en uno o ambos extremos del mismo) y que se unen de forma específica a un anticuerpo policlonal frente a un polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o a un factor homólogo del mismo (los polipéptidos también pueden denominarse en lo sucesivo en este documento como “polipéptido añadido reactivo de forma específica” para conveniencia).
Los polipéptidos descritos anteriormente utilizados en la presente invención pueden prepararse mediante síntesis química, tal como el método de Fmoc (método del fluorenilmetiloxicarbonilo), el método tBoc (método del tbutiloxicarbonilo) o similar, o prepararse mediante un método convencional utilizando un sintetizador de péptidos disponible de forma comercial. Además, los polipéptidos pueden prepararse fácilmente mediante un método de ingeniería genética conocido. Por ejemplo, los polipéptidos deseados pueden obtenerse extrayendo los ARN de un tejido que expresa un gen que codifica un polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o un factor homólogo del mismo, preparando ADNc del gen mediante RT-PCR, insertando la longitud completa o una parte deseada del ADNc en un vector de expresión, y después introduciendo el vector en una célula hospedadora. Las secuencias de bases de los ADNc que codifican el polipéptido canino de la SEQ ID NO: 2, la calmegina canina de la SEQ ID NO: 16, los CEP caninos de las SEQ ID NO: 26 y 42, y el TRIP11 canino de la SEQ ID NO: 45, se muestran en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 15, las SEQ ID NO: 25 y 41, y la SEQ ID NO: 44, respectivamente, y las secuencias de bases de los ADNc que codifican los factores homólogos humanos de los polipéptidos anteriores se muestran en la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 17 (calmegina humana), la SEQ ID NO: 27 (el CEP humano) y la SEQ ID NO: 47 (el TRIP11 humano), respectivamente. Por lo tanto, en referencia a estas secuencias de bases, los cebadores utilizados en la RT-PCR pueden diseñarse de forma fácil. Además, como se explica a continuación, los genes que codifican un factor homólogo en mamíferos que no sean un ser humano, pueden amplificarse utilizando cebadores diseñados en referencia a las secuencias de bases de los polipéptidos caninos y a los factores homólogos humanos. Por lo tanto, los ADNc que codifican por ejemplo un factor homólogo felino pueden prepararse fácilmente de la misma manera que se describe anteriormente. La extracción de los ARN, la RT-PCr , la inserción del ADNc en un vector y la introducción de un vector en una célula hospedadora, pueden realizarse mediante un método bien conocido como se describe a continuación. Los vectores y las células hospedadoras que pueden utilizarse son bien conocidos, y están disponibles de forma comercial diversos vectores y células hospedadoras.
Las células hospedadoras descritas anteriormente no están restringidas siempre que puedan expresar el polipéptido descrito anteriormente, y los ejemplos de las mismas incluyen células procariotas tales como E. coli; y células eucariotas tales como células cultivadas de mamífero que incluyen células de riñón de mono COS 1 y células de ovario de hámster Chino CHO, levaduras de gemación, levadura de fisión, células del gusano de seda y oocitos de Xenopus laevis.
En los casos en que se utilizan como células hospedadoras células procariotas, se utiliza como el vector de expresión un vector de expresión que tenga el origen que permita su replicación en una célula procariota, un promotor, un sitio de unión al ribosoma, un sitio de clonación de ADN, un terminador y similares. Los ejemplos del vector de expresión para E. coli incluyen el sistema pUC, pBluescriptII, el sistema de expresión pET y el sistema de expresión pGEX. Incorporando el ADN que codifica el polipéptido descrito anteriormente en tal vector de expresión y transformando células hospedadoras procariotas con el vector, seguido del cultivo de los transformantes obtenidos, se puede expresar el polipéptido que codifica el ADN descrito anteriormente en células procariotas. En este caso, el polipéptido también puede expresarse como una proteína de fusión con otra proteína. El ADN que codifica el polipéptido descrito anteriormente puede obtenerse preparando ADNc mediante r T-PCR, como se describe anteriormente, o puede sintetizarse mediante un método convencional utilizando un sintetizador de ácidos nucleicos disponible de forma comercial como se explica a continuación. Cabe señalar que las secuencias de bases de los ADNc que codifican los polipéptidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 16, 18, 26, 28, 42, 45 y 47 se muestran en las SEQ ID NO: 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41,44 y 46 en el LISTADO DE SECUENCIAS, respectivamente.
En los casos en donde se utilizan como células hospedadoras células eucariotas, se utiliza como el vector de expresión un vector de expresión para células eucariotas que tenga un promotor, un sitio de corte y empalme, un sitio de adición de poli(A) y similares. Los ejemplos de tal vector de expresión incluyen pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, el vector e Bv , pRS, pcDNA3, pMSG y pYES2. De la misma manera que se describe anteriormente, incorporando el ADN que codifica el polipéptido utilizado en la presente invención en tal vector de expresión y transformando células hospedadoras eucariotas con el vector, seguido del cultivo del transformante obtenido, se puede expresar en las células hospedadoras eucariotas el polipéptido que codifica el ADN descrito anteriormente. En los casos en donde se utilizó como vector de expresión pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1 o pEGFP-C1, se puede expresar el polipéptido descrito anteriormente como una proteína de fusión que tenga diversas etiquetas añadidas tales como la etiqueta His, la etiqueta FLAG, la etiqueta myc, la etiqueta HA o la GFP.
La introducción del vector de expresión en las células hospedadoras se puede llevar a cabo utilizando un método bien conocido tal como electroporación, el método de fosfato de calcio, el método de liposomas o el método de DEAE dextrano.
El aislamiento y la purificación de un polipéptido de interés a partir de las células hospedadoras se pueden llevar a cabo mediante una combinación de operaciones de separación conocidas. Los ejemplos de las operaciones incluyen el tratamiento mediante un desnaturalizante tal como urea o mediante un tensioactivo; el tratamiento por ultrasonidos; la digestión enzimática; la desalación y la precipitación fraccional con disolventes; la diálisis; la centrifugación; la ultrafiltración; la filtración por gel; SDS-PAGE; el isoelectroenfoque; la cromatografía de intercambio iónico; la cromatografía hidrófoba; la cromatografía de afinidad y la cromatografía en fase inversa.
Los polipéptidos obtenidos mediante el método anterior incluyen aquellos en la forma de una proteína de fusión con otra proteína arbitraria. Los ejemplos de los mismos incluyen proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) y con una etiqueta His. Tal polipéptido en forma de una proteína de fusión también está incluido en el polipéptido reactivo de forma específica añadido descrito anteriormente, y puede utilizarse en el Método 1 de la presente invención. Además, en algunos casos, un polipéptido expresado en una célula transformada se modifica en la célula de diversos modos, tras la traducción del mismo. Tal polipéptido que tiene una modificación postraduccional también puede utilizarse en el Método 1 de la presente invención, siempre que tenga la capacidad de unirse a un anticuerpo policlonal frente a un polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o 4. Los ejemplos de tal modificación postraduccional incluyen la eliminación de la metionina del extremo N, la acetilación del extremo N, la glucosilación, la degradación limitada mediante una proteasa intracelular, la miristoilación, la isoprenilación y la fosforilación.
La medición del anticuerpo en una muestra se puede llevar a cabo de forma fácil mediante inmunoensayo, utilizando como antígeno el polipéptido descrito anteriormente. Los inmunoensayos per se son bien conocidos en la técnica, e incluyen, cuando se clasifican a base del modo de reacción, el método de tipo sándwich, el método de competición, el método de aglutinación, el método por transferencia de Western y similares. Cuando se clasifican en base al marcador, los inmunoensayos incluyen el radioinmunoensayo, el inmunoensayo de fluorescencia, el inmunoensayo enzimático, inmunoensayo de biotina y similares, y el inmunoensayo del anticuerpo descrito anteriormente se puede llevar a cabo mediante cualquiera de estos inmunoensayos. Aunque no está restringido, pueden utilizarse preferentemente como un inmunoensayo del anticuerpo anterior en la presente invención el ELISA de tipo sándwich y el método de competición, dado que estos métodos son simples y no necesitan aparatos a gran escala. En los casos en donde se utilizan enzimas como un marcador de anticuerpos, la enzima utilizada no está restringida de forma particular, siempre que satisfaga condiciones tales como que el número de renovación sea grande, que la enzima sea estable incluso cuando esté unida a un anticuerpo, que coloree de forma específica su sustrato y similares. Por ejemplo, se pueden utilizar las enzimas utilizadas en un inmunoensayo enzimático ordinario tales como la peroxidasa, la p-galactosidasa, la fosfatasa alcalina, la glucosa oxidasa, la acetilcolinesterasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa y la malato deshidrogenasa. También pueden utilizarse inhibidores enzimáticos, coenzimas y similares. La unión de estas enzimas con un anticuerpo se puede llevar a cabo mediante un método conocido utilizando un agente de entrecruzamiento, tal como un compuesto de maleimida. Como sustrato, pueden utilizarse sustancias conocidas que dependen del tipo de enzima utilizada. Por ejemplo, en los casos en donde se utilice como la enzima la peroxidasa, se puede utilizar 3,3',5,5'-tetrametilbencidina y en los casos en donde se utilice como la enzima la fosfatasa alcalina, puede utilizarse paranitrofenol, o similares. Como radioisótopo, pueden utilizarse los utilizados en un radioinmunoensayo ordinario, tales como 125I y 3H. Como colorante fluorescente, puede utilizarse uno utilizado en una técnica de anticuerpos fluorescente ordinaria, tal como el isotiocianato de fluoresceína (FITC), el isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC) o similar.
Estos inmunoensayos per se son bien conocidos en la técnica y, de tal modo, no es necesario explicarlos en la presente memoria descriptiva. Brevemente, en los inmunoensayos de tipo sándwich, por ejemplo, el polipéptido mencionado anteriormente utilizado como antígeno se inmoviliza en una fase sólida y después se hace reaccionar con una muestra tal como un suero. Tras el lavado de la fase sólida, el resultante se hace reaccionar con un anticuerpo secundario apropiado. Tras el lavado de la fase sólida se mide el anticuerpo secundario unido a la fase sólida. En el método para la detección de un cáncer (o cánceres) de acuerdo con la presente invención, es preferente inmovilizar un polipéptido antigénico en una fase sólida, debido a que la inmovilización en una fase sólida hace posible retirar de forma fácil el anticuerpo secundario no unido. Como el anticuerpo secundario, por ejemplo, en los casos en donde la muestra se obtenga a partir de perros puede utilizarse anticuerpo anti IgG de perro. El anticuerpo secundario unido a una fase sólida puede medirse mediante el marcaje del anticuerpo secundario con una sustancia marcadora ejemplificada anteriormente. La cantidad así medida del anticuerpo secundario corresponde a la cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente en una muestra de suero. En los casos en donde se utilice una enzima como sustancia marcadora, la cantidad del anticuerpo se puede medir añadiendo un sustrato que se descompone mediante la actividad enzimática para desarrollar un color, y después midiendo de forma óptica la cantidad de sustrato descompuesto. En los casos en donde se utiliza un radioisótopo como una sustancia marcadora, puede medirse la cantidad de radiación procedente del radioisótopo con un contador de centelleo o similar.
En el Método 2 de la presente invención se mide al menos la Calmegina entre el grupo que consiste en el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un factor homólogo del mismo, la calmegina, el CEP de la SeQ ID NO: 26 o 42 o un factor homólogo del mismo, y el TRIP11. Como se explica anteriormente, la abundancia del anticuerpo específico de cáncer que reacciona de forma inmunológica con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un factor homólogo del mismo, la calmegina en perros, seres humanos o similares, el CEP de la SEQ ID NO: 26 o 42 o un factor homólogo del mismo, o el TRIP11 en perros, seres humanos o similar, es significativamente elevada en los pacientes de cáncer, lo que indica que la producción de estos polipéptidos o los factores homólogos de los mismos, que son el antígeno del anticuerpo específico de cáncer, sea significativamente elevada en los pacientes de cáncer. Como se describe de forma concreta en los Ejemplos a continuación, los cánceres pueden también detectarse midiendo el antígeno per se. Por lo tanto, de forma similar al Método 1 anterior, los cánceres en un cuerpo vivo pueden detectarse midiendo per se al menos la Calmegina entre el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un homólogo del mismo, la calmegina, el CEP de la SEQ ID NO: 26 o 42 o un factor homólogo del mismo, o el TRIP11.
La medición del polipéptido en una muestra puede llevarse a cabo de forma fácil mediante un inmunoensayo bien conocido. De forma específica, por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45 o un factor homólogo del mismo, que puede existir en una muestra, se puede medir preparando un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reaccione de forma inmunológica con el polipéptido de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o con un factor homólogo del mismo, y después llevar a cabo un inmunoensayo utilizando el anticuerpo preparado o fragmento del mismo. Debido a que, como se explica anteriormente, los anticuerpos tienen reactividad cruzada, puede medirse no solo un polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45 sino también un factor homólogo en otro mamífero, por ejemplo, un factor homólogo humano de la SEQ ID NO: 4, 18, 28 o 47, o un factor homólogo felino, utilizando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que reacciona de forma inmunológica con el polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45. Los inmunoensayos per se son métodos convencionales bien conocidos, como se describe anteriormente.
La expresión “fragmento de unión a antígeno” en el presente documento significa el fragmento que presenta la propiedad de unión al antígeno del anticuerpo, tal como el fragmento Fab o el fragmento F(ab')2 del anticuerpo. Aunque el anticuerpo puede ser ya sea un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, es preferente para los inmunoensayos un anticuerpo monoclonal y similares, debido a que la reproducibilidad es alta. Los métodos para preparar un anticuerpo policlonal o monoclonal utilizando un polipéptido como inmunógeno son bien conocidos, y pueden llevarse a cabo fácilmente mediante un método convencional. Por ejemplo, los anticuerpos frente al polipéptido pueden inducirse inmunizando un animal con un inmunógeno, el polipéptido puede conjugarse a una proteína transportadora tal como la hemocianina de lapa californiana (HLC) o la caseína, junto con un adyuvante. Después, las células que producen anticuerpos, tales como células esplénicas o los linfocitos, se recolectan a partir del animal inmunizado y se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas. Entre los hibridomas, se selecciona y prolifera uno que produce el anticuerpo que se une a la proteína de la SEQ ID NO: 2, 16, 26, 42 o 45, o un factor homólogo de la misma, y después se puede recolectar a partir del sobrenadante del cultivo el anticuerpo cuyo antígeno correspondiente es la proteína mencionada anteriormente. El método descrito anteriormente es un método convencional bien conocido.
En el Método 3 de la presente invención, se mide el ARNm que puede estar contenido en una muestra obtenida de un cuerpo vivo, que codifica al menos la Calmegina entre el grupo que consiste en el polipéptido de la SEQ ID NO: 2 o un factor homólogo del mismo, la calmegina, el CEP de la SEQ ID NO: 26 o 42 o un factor homólogo del mismo, y el TRIP 11. Como se describe de forma concreta en los Ejemplos a continuación, el nivel de expresión del ARNm que codifica el polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2 o el factor homólogo del mismo mostrado en la SEQ ID NO: 4; el ARNm que codifica la calmegina canina de la SEQ ID NO: 16 o la calmegina humana de la SEQ ID NO: 18; el ARNm que codifica el CEP canino de la SEQ ID NO: 26 o 42 o el factor homólogo del mismo mostrado en la SEQ ID NO: 28; y el ARNm que codifica el TRIP11 canino de la SEQ ID NO: 45 o el TRIP11 humano de la SEQ ID NO: 47, es significativamente elevado en las células cancerosas. Por lo tanto, en un cuerpo vivo pueden detectarse los cánceres midiendo el ARNm en una muestra.
Por ejemplo, en una muestra puede cuantificarse el ARNm utilizando un método convencional tal como RT-PCR de detección en tiempo real, utilizando como molde el ARNm y también puede cuantificarse en líneas generales a base de la intensidad de la tinción en una transferencia de Northern convencional. La secuencia de los ADNc que codifican los polipéptidos de las SEQ ID NO: 2, 4, 16, 18, 26, 28, 42, 45 y 47 se muestran en las SEQ ID NO: 1, 3, 15, 17, 25, 27, 44 y 46, respectivamente. Con referencia a estas secuencias, se puede preparar un polinucleótido que hibride de forma específica con una región parcial de la secuencia de bases mostrada en las SEQ ID NO: 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 o 46 (denominado en lo sucesivo en este documento como “polinucleótido para la detección del cáncer”) y, utilizando el polinucleótido como una sonda o como un cebador para la amplificación de ácidos nucleicos, se puede medir la cantidad del ARNm en una muestra. Como se explica a continuación, también puede medirse el ARNm que codifica los factores homólogos en mamíferos que no sean perros o seres humanos, utilizando un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1 o 3. De forma similar, también puede medirse el ARNm que codifica la calmegina en mamíferos que no sean perros y seres humanos, utilizando un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 15 o 17; también puede medirse el ARNm que codifica los factores homólogos en mamíferos que no sean perros o seres humanos, utilizando un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 25, 27 o 41; y también puede medirse el ARNm que codifica el TRIP11 en mamíferos que no sean perros o seres humanos, utilizando un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 44 o 46. En la presente invención, el polinucleótido puede ser ARN o ADN.
La expresión “hibridar de forma específica” utilizada en el presente documento significa que una determinada secuencia hibrida solo con la región parcial objeto y sustancialmente no hibrida con las otras regiones en condiciones de hibridación ordinarias.
La expresión “condición de hibridación ordinaria” se refiere a una condición utilizada para el apareamiento en la PCR ordinaria o en la detección ordinaria con sondas. Por ejemplo, en el caso de la PCR con polimerasa Taq, la expresión se refiere a una condición de reacción a una temperatura de apareamiento apropiada de aproximadamente 54 °C a 60 °C, utilizando un tampón común tal como uno que contiene KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,3 a 9,0) y MgCh 1,5 mM. En el caso de la hibridación de Northern, la expresión se refiere a una condición de reacción a una temperatura de hibridación apropiada de 42 °C a 65 °C, utilizando una solución de hibridación común tal como una que contiene SSPE 5 x, formamida al 50 %, solución de Denhardt 5 x y SDS del 0,1 al 0,5 %. Sin embargo debe señalarse que la temperatura de apareamiento y la temperatura de hibridación apropiadas no están restringidas a las ejemplificadas anteriormente, y pueden determinarse a base de la Tm del cebador o de la sonda, y de las reglas empíricas. Los expertos en la materia pueden determinar fácilmente la temperatura apropiada.
La expresión “no hibrida sustancialmente” significa que una hibridación no se produce en absoluto o, incluso si se produce, el grado de hibridación con regiones que no son la región parcial objeto es considerablemente inferior que el de la hibridación con la región objeto, de forma que la hibridación con otras regiones se puede ignorar de forma relativa. Los ejemplos del polinucleótido que hibrida de forma específica en tales condiciones incluyen los que tienen una determinada homología con la región parcial objeto, por ejemplo los que tienen una homología de no menos del 70 %, preferentemente no menos del 80 %, más preferentemente no menos del 90 %, aún más preferentemente no menos del 93 %, aún más preferentemente no menos del 95 %, aún más preferentemente no menos del 98 % con la región parcial objeto. Muy preferentemente, el polinucleótido tiene la misma secuencia de bases que la región parcial objeto. La definición para la homología de secuencias de aminoácidos es la misma que se aplica a la homología de las secuencias de bases. Incluso si un polipéptido para la detección del cáncer comprende en su extremo alguna región que no hibrida con la región objeto, puede utilizarse para la detección de cánceres una sonda que consista en tal polinucleótido, siempre que la región que hibrida con la región objeto ocupe aproximadamente la mitad o más de la sonda entera. De forma similar, un cebador que consiste en tal polinucleótido normalmente puede aparearse con la región objeto, para dejar que se produzca la reacción de extensión y, así, puede utilizarse para detección de cánceres, siempre que la región que hibrida con la región objeto ocupe aproximadamente la mitad o más del cebador entero y se emplace en el extremo 3' del cebador. Cabe señalar que, en los casos en donde los polinucleótidos para la detección del cáncer comprenden alguna región que no híbrida con la región objeto en su extremo, la homología de la secuencia de bases objeto se calcula a base solo de la región que hibrida con la región objeto, ignorando la región que no hibrida.
En la presente invención, la expresión “región parcial” se refiere a una región que consiste en una parte de la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 o 46. Una “región parcial” consiste preferentemente en no menos de 18 bases consecutivas. Se entiende que “ la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1” como se utiliza en el presente documento incluye no solo la secuencia de bases escrita de forma expresa en la SEQ ID NO: 1, sino también la secuencia complementaria de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, la frase “un polinucleótido que tiene la secuencia de bases mostrada en la SEQ ID NO: 1” incluye un polinucleótido monocatenario que tiene la secuencia de bases escrita de forma expresa en la SEQ ID NO: 1, un polinucleótido monocatenario que tiene la secuencia complementaria a la misma, y un polinucleótido bicatenario compuesto de estos polinucleótidos monocatenarios. Cuando se preparan los polinucleótidos utilizados en la presente invención o los polinucleótidos que codifican los polipéptidos utilizados en la presente invención, debería seleccionarse de forma apropiada una cualquiera de estas secuencias de bases y los expertos en la materia pueden llevar a cabo fácilmente la selección.
En vista de asegurar la especificidad, el número de bases del polinucleótido para la detección del cáncer preferentemente no es de menos de 18 bases. En los casos en donde el polinucleótido se utiliza como una sonda, el tamaño preferentemente no es de menos de 18 bases, más preferentemente no es de menos de 20 bases, y no más de la longitud completa de la región codificante. En los casos en donde el polinucleótido se utiliza como un cebador, el tamaño es preferentemente de no menos de 18 bases, y preferentemente de no más de 50 bases. Los ejemplos preferentes del polinucleótido para la detección del cáncer incluyen los que consisten en no menos de 18 bases consecutivas de la secuencia de bases mostrada en las SEQ ID NO: 1, 3, 15, 17, 25, 27, 41, 44 o 46.
Es obvio para los expertos en la materia a los que se refiere la presente memoria descriptiva que un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la SEQ ID NO: 1, 15, 25 o 44 se utiliza para la medición del ARNm que codifica el polipéptido canino de la SEQ ID NO: 2, 16, 26 o 45, respectivamente; y que un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la SEQ ID NO: 3, 17, 27 o 46 se utiliza para una medición del ARNm que codifica un factor homólogo humano de la SEQ ID NO: 4, 18, 28 o 47, respectivamente. Debe señalarse que los factores homólogos habitualmente comparten alta homología entre sí, incluso al nivel de secuencia de bases. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 1 y 3 comparten el 93 % de homología, las SEQ ID NO: 15 y 17 comparten el 90 % de homología, las SEQ ID NO: 25 y 27 comparten el 87 % de homología y las SEQ ID NO: 44 y 46 comparten el 88 % de homología, que son homologías muy elevadas. Por lo tanto, un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la SEQ ID NO: 1, 15, 25 o 44 también puede hibridar de forma específica con la región parcial correspondiente de la SEQ ID NO: 3, 17, 27 o 46, respectivamente. Como se demuestra de forma práctica en los Ejemplos a continuación, por ejemplo utilizando un conjunto de cebadores que tengan las secuencias de bases mostradas en las SEQ ID NO: 7 y 8, respectivamente, pueden medirse tanto los ARNm que codifican el polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2 como el ARNm que codifica el factor homólogo humano de la SEQ ID NO: 4, debido a que los cebadores respectivos hibridan de forma específica no solo con una región parcial de la SEQ ID NO: 1 sino también con una región parcial de la SEQ ID NO: 3 (Ejemplo A). Utilizando un conjunto de cebadores que tenga las secuencias de bases mostradas en las SEQ ID NO: 19 y 20, respectivamente, pueden medirse el ARNm que codifica la calmegina canina de la SEQ ID NO: 16 y el ARNm codifica el factor homólogo humano, la calmegina humana de la SEQ ID NO: 18, debido a que los cebadores respectivos hibridan de forma específica no solo con una región parcial de la SEQ ID NO: 15 sino también con una región parcial de la SEQ ID NO: 17 (Ejemplo B). Utilizando un conjunto de cebadores que tengan las secuencias de bases mostradas en las SEQ ID NO: 29 y 30, respectivamente, pueden medirse el ARNm que codifica el CEP canino de la SEQ ID NO: 26 o 42 y el ARNm que codifica el factor homólogo humano, el CEP humano de la SEQ ID NO: 28, debido a que los cebadores específicos hibridan de forma específica con una región parcial de la SEQ ID NO: 25, con una región parcial de la SEQ ID NO: 27 y también con una región parcial de la SEQ ID NO: 41 (Ejemplo C). Utilizando un conjunto de cebadores que tengan las secuencias de bases mostradas en las SEQ ID NO: 48 y 49, respectivamente, pueden medirse el ARNm que codifica el TRIP11 canino de la SEQ ID NO: 45 y el ARNm que codifica el factor homólogo humano, el TRIP11 humano de la SEQ ID NO: 47, debido a que los cebadores respectivos hibridan de forma específica no solo con una región parcial de la SEQ ID NO: 44 sino también con una región parcial de la SEQ ID NO: 46 (Ejemplo D). Por lo tanto, por ejemplo utilizando el polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial de la secuencia de bases canina mostrada en la SEQ ID NO: 1; la SEQ ID NO: 15; la SEQ ID NO: 25 o la SEQ ID NO: 44, pueden medirse no solo el ARNm que codifica el polipéptido canino de la SEQ ID NO: 2; la SEQ ID NO: 16; las SeQ ID NO: 26 y 42 o las SEQ ID NO: 45 sino también el ARNm que codifica el factor homólogo de los mismos, el polipéptido de la SEQ ID NO: 4; la SEQ ID NO: 18; la SEQ ID NO: 28 o la SEQ ID NO: 47, respectivamente. Además, también puede medirse utilizando los mismos polinucleótidos el ARNm que codifica el factor homólogo en otros mamíferos tales como gatos.
En el diseño de un polinucleótido para la detección del cáncer, es más conveniente seleccionar una región parcial en la cual la homología entre las SEQ ID NO: 1 y 3; las SEQ ID NO: 15 y 17; las SEQ ID NO: 25 y 27 o las SEQ ID NO: 44 y 46 sea especialmente elevada (preferentemente una región parcial que tenga la misma secuencia). Se espera que una región especialmente homóloga de forma elevada entre perro y ser humano también comparta una homología muy elevada con una determinada región parcial de los genes homólogos en otras especies animales. Por lo tanto, seleccionando una región parcial de tal manera se puede mejorar la precisión de la medición del ARNm que codifica factores homólogos en especies animales que no sean perro y ser humano.
Son bien conocidos los métodos per se para la medición de un ácido nucleico de prueba que utilizan un polinucleótido que hibrida de forma específica con una región parcial del ácido nucleico de prueba, como un cebador para un método de amplificación de genes tal como PCR o como una sonda, e incluyen transferencia de Northern, hibridación in situ y similares, así como RT-PCR como se describe en detalle en los siguientes Ejemplos. Pueden utilizarse para medir el nivel de ARN en la presente invención cualquiera de estos métodos de medición bien conocidos.
Son bien conocidos en la técnica los métodos de amplificación de ácidos nucleicos per se, tales como la PCR, y también están disponibles de forma comercial los kits de reactivos y los aparatos, de modo que pueden llevarse a cabo fácilmente. Es decir, por ejemplo un ácido nucleico de prueba que sirve como un molde (por ejemplo, ADNc del gen que codifica la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2, 4, 16, 18, 26, 28, 45 o 47) y una pareja de polinucleótidos para la detección del cáncer (cebadores) se mezclan en un tampón conocido en presencia de la polimerasa Taq y los dNTP, y se llevan a cabo las etapas de desnaturalización, apareamiento y extensión cambiando la temperatura de la mezcla de reacción. Habitualmente, la etapa de desnaturalización se lleva a cabo a entre 90 y 95 °C, la etapa de apareamiento se lleva a cabo a una Tm de entre el molde y los cebadores o una vecindad de la misma (preferentemente dentro de ±4 °C) y la etapa de extensión se lleva a cabo a 72 °C, que es la temperatura óptima de la polimerasa Taq. El tiempo de reacción de cada etapa se selecciona de entre aproximadamente 30 segundos a 2 minutos. Repitiendo este ciclo térmico durante aproximadamente 25 a 40 veces, se amplifica la región entre una pareja de cebadores. El método de amplificación de ácidos nucleicos no se restringe a la PCR, y también pueden emplearse otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos bien conocidos en la técnica. Llevando a cabo el método de amplificación de ácidos nucleicos para la detección del cáncer, utilizando como cebadores una pareja de los polinucleótidos descritos anteriormente y utilizando como molde el ácido nucleico de prueba, se amplifica el ácido nucleico de prueba. Por el contrario, en los casos en donde el ácido nucleico de prueba no está contenido en la muestra, la amplificación no se produce. Por lo tanto, detectando el producto de amplificación se puede determinar si el ácido nucleico de prueba existe o no en la muestra. La detección del producto de amplificación puede llevarse a cabo mediante un método en el que la solución de reacción se somete tras la amplificación a electroforesis y después se tiñen las bandas con bromuro de etidio o similar, o mediante un método en el que tras la electroforesis se inmoviliza el producto de amplificación en una fase sólida tal como una membrana de nylon; una sonda marcada que hibrida de forma específica con el ácido nucleico de prueba se hibrida con el ácido nucleico de prueba y después se detecta el marcador tras el lavado. Como alternativa, el ácido nucleico de prueba se puede cuantificar en la muestra mediante la denominada PCR de detección en tiempo real, utilizando un colorante fluorescente extintor y un colorante fluorescente indicador. Dado que los kits para la PCR de detección en tiempo real también están disponibles de forma comercial, la PCR de detección en tiempo real también puede llevarse a cabo de forma fácil. El ácido nucleico de prueba también puede semicuantificarse a base de la intensidad de la banda electroforética. El ácido nucleico de prueba puede ser ARNm o ADNc transcrito de forma inversa a partir de ARNm. En los casos en los que se amplifica ARNm como ácido nucleico de prueba también puede utilizarse el método NASBA (método 3 SR, método TMA) utilizando la pareja de cebadores descrita anteriormente. El método NASBA per se es bien conocido, y están disponibles de forma comercial los kits para el mismo, de forma que el método NASBa puede llevarse a cabo fácilmente utilizando la pareja de cebadores descrita anteriormente.
Para la detección del cáncer puede utilizarse como sonda una sonda marcada obtenida marcando el polinucleótido descrito anteriormente con un marcador fluorescente, un marcador radiactivo, un marcador de biotina o similar. Los métodos per se para el marcaje de un polinucleótido son bien conocidos. Se puede determinar si el ácido nucleico de prueba existe o no en la muestra inmovilizando el ácido nucleico de prueba o el producto de amplificación del mismo en una fase sólida, hibridando a él la sonda marcada, y midiendo el marcador unido a la fase sólida tras el lavado. Como alternativa, se puede inmovilizar el polinucleótido para la detección del cáncer en una fase sólida para hibridar a él el ácido nucleico de prueba y detectar el ácido nucleico de prueba unido a la fase sólida mediante una sonda marcada o similar. En tal caso, también se denomina como sonda el polinucleótido para la detección del cáncer inmovilizado en la fase sólida. Los métodos para medir un ácido nucleico de prueba utilizando una sonda de polinucleótido son bien conocidos en la técnica, y pueden lograrse poniendo en contacto una sonda de polinucleótido con el ácido nucleico de prueba, en un tampón a la Tm o en la vecindad de la misma (preferentemente dentro de ±4 °C) de modo que hibriden, y después midiendo la sonda marcada hibridada o el ácido nucleico de prueba unido a la sonda inmovilizada. Tal método incluye métodos bien conocidos tales como la transferencia de Northern y la hibridación in situ, y la transferencia de Southern. Puede utilizarse en la presente invención cualquiera de tales métodos conocidos.
En el método de detección de la presente invención, se determina si el cuerpo vivo objeto padece cáncer o no, o similar, a base del nivel de expresión del polipéptido medido como se describe anteriormente. Aunque la detección del cáncer puede lograrse simplemente midiendo la expresión del polipéptido en el cuerpo vivo objeto, es preferente obtener el valor de referencia normal determinando el nivel de expresión del polipéptido (la cantidad del anticuerpo, polipéptido o ARNm) en una o más muestras procedentes de individuos sanos, para comparar el valor medido en el cuerpo vivo objeto con el valor de referencia normal, en vista de aumentar la precisión de la medición. Para aumentar adicionalmente la precisión de la medición, se puede obtener el valor de referencia del cáncer determinando el nivel de expresión del polipéptido en las muestras obtenidas a partir de muchos pacientes que se ha revelado que padecen cáncer, para comparar el valor medido del cuerpo vivo objeto con los valores de referencia normales y para el cáncer.
Los valores de referencia mencionados anteriormente se pueden determinar expresando el nivel de expresión del polipéptido en cada muestra en valores y calculando el valor promedio de los mismos. Los valores de referencia normales y para el cáncer se pueden determinar de antemano midiendo el nivel de expresión del polipéptido en muchos sujetos sanos y con cáncer. Por lo tanto, los valores de referencia predeterminados también pueden utilizarse cuando se compara el valor medido con los valores de referencia en la presente invención.
En los casos en donde la detección de cáncer se lleva a cabo a base de los niveles de expresión de dos o más de los cuatro polipéptidos descritos anteriormente, se puede determinar que el cuerpo vivo objeto padece cáncer cuando el nivel de expresión de uno cualquiera de los polipéptidos indica cáncer (véase el Ejemplo E a continuación).
El método de detección de la presente invención puede llevarse a cabo en combinación con el diagnóstico utilizando otros antígenos para cáncer y/o marcadores para cáncer, de forma que se pueda mejorar más la precisión de la detección de los cánceres. Por ejemplo, en la medición del anticuerpo específico para cáncer mencionado anteriormente de acuerdo con la presente invención, puede utilizarse como un antígeno otro polipéptido (o polipéptidos) expresado de forma elevada en tejidos cancerosos, de la misma manera que los polipéptidos descritos anteriormente. El método de la presente invención también puede llevarse a cabo en combinación con el diagnóstico utilizando marcadores de cáncer conocidos.
Mediante el método de detección de la presente invención, se pueden detectar cánceres en un cuerpo vivo. En especial, como se describe en los siguientes Ejemplos, el método de la presente invención puede detectar incluso un cáncer pequeño invisible o un cáncer que existe en una parte profunda de un cuerpo, y así el método es útil para la detección temprana de los cánceres. Además, aplicando el método de detección de la presente invención a pacientes en el período de seguimiento tras la terapia para el cáncer, puede detectarse el cáncer recurrente, si lo hay, en su fase temprana.
Si en un cuerpo vivo portador de cáncer proliferan más células cancerosas que expresan el polipéptido establecido a medir en la presente invención, se acumulan en el cuerpo más polipéptidos y ARNm que los codifican, lo que provoca el aumento de la cantidad de anticuerpos frente a los polipéptidos mencionados anteriormente en el suero. Por otro lado, cuanto más disminuyan las células cancerosas, más disminuyen los polipéptidos y los ARNm que los codifican acumulados en el cuerpo, lo que provoca la disminución de la cantidad de los anticuerpos frente a los polipéptidos mencionados anteriormente en el suero. Por lo tanto, si el nivel de expresión del polipéptido establecido es elevado, se puede determinar que se produce crecimiento tumoral y/o metástasis del cáncer, es decir, la fase de evolución del cáncer es avanzada. De hecho, como se describe de forma concreta en los Ejemplos a continuación, se observó que la cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente aumenta en el suero del cuerpo portador de cáncer junto con la evolución del cáncer tal como crecimiento tumoral o metástasis. Por lo tanto, mediante el método de la presente invención se puede detectar la fase de la evolución del cáncer.
Además, como se muestra en el Ejemplo a continuación, cuando se compara entre el mismo tipo de tumores, uno maligno produce significativamente más cantidad de anticuerpos que uno benigno. Por lo tanto, si el nivel de expresión de los polipéptidos establecidos es elevado, se puede determinar que el grado de malignidad del cáncer es elevado. Es decir, mediante el método de la presente invención también puede detectarse el grado de malignidad del cáncer.
Además, el efecto de la terapia para el cáncer se puede controlar a base del aumento o disminución del nivel de expresión de los polipéptidos establecidos. Como se describe en el Ejemplo a continuación, en comparación con el estado portador de cáncer, los individuos que reciben un fármaco antineoplásico para la prevención de la reaparición tras la extirpación del tumor muestran expresión disminuida de los polipéptidos. Esto se aplica a los tumores benignos. Es decir, en los casos en donde se puede observar la expresión de los polipéptidos, la expresión disminuida de los polipéptidos se observa cuando se logra la extirpación completa del tumor benigno. Por lo tanto, observando el nivel de expresión de los polipéptidos mencionados anteriormente en individuos durante o tras la terapia para el cáncer, se puede lograr un indicio para evaluar que tan eficaz fue el fármaco antineoplásico administrado, o si se ha dejado en el paciente una porción del tumor tras la extirpación del mismo, así como puede lograrse durante el seguimiento un indicio para hallar metástasis y/o reaparición tan pronto como sea posible. Si el cáncer se trata de forma apropiada en un paciente, el nivel de expresión de los polipéptidos se hace más bajo en el paciente tras la terapia que antes de la terapia. En tal caso, se puede determinar que el efecto de la terapia que se realizó (o se está realizando) en el paciente es bueno. En los casos en donde el nivel de expresión de los polipéptidos aumenta o se sostiene, o una vez que se reduce y después aumenta, se puede determinar que el efecto de la terapia no es los suficientemente bueno. Por lo tanto, puede obtenerse una base útil para la adopción de la estrategia terapéutica. Por ejemplo, a base del cambio del nivel de expresión descrito anteriormente, se puede determinar si la estrategia terapéutica debería cambiarse a otra, si (o como) se debe cambiar la dosis del fármaco antineoplásico, y así.
Los cánceres a detectar mediante el método de la presente invención son los que expresan calmegina. El cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: tumores de cerebro; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de la glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de los órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de las glándulas sebáceas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma idiopático; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma. Los cuerpos vivos a los que se aplica el método de la presente invención son mamíferos, preferentemente seres humanos, perros y gatos.
La muestra sujeta al método de la presente invención incluye fluidos corporales tales como sangre, suero, plasma, ascitis y efusión pleural, y tejidos y células. En particular, en el Método 1 y el Método 2 anteriores pueden usarse preferentemente suero, plasma, ascitis y efusión pleural. En el caso del Método 3 anterior en el que se mide ARNm son preferentes una muestra de tejido y una muestra de células.
Pueden proporcionarse como un reactivo para la detección de un cáncer (o cánceres) los polipéptidos utilizados como antígeno para el inmunoensayo del Método 1 (es decir, un polipéptido obtenido de canino de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 26 o 42, o la SeQ ID NO: 45, y los factores homólogos de los mismos, los polipéptidos parciales reactivos de forma específica, los polipéptidos modificados reactivos de forma específica y los polipéptidos añadidos reactivos de forma específica). El reactivo puede consistir solo en el polipéptido mencionado anteriormente, o puede contener diversos aditivos útiles para estabilizar el polipéptido y similares. Además, el reactivo puede proporcionarse en forma que esté inmovilizado en una fase sólida, tal como una placa o una membrana.
Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que reaccionan de forma inmunológica con el polipéptido canino de la SEQ ID NO: 2, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 26 o 42, o la SEQ ID NO: 45, o un factor homólogo de los mismos, que se utilizan para medir el polipéptido canino o el factor homólogo del mismo mediante inmunoensayo, también pueden proporcionarse como un reactivo para la detección de un cáncer (o cánceres). El reactivo también puede consistir solo en el anticuerpo mencionado anteriormente o en los fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o puede contener diversos aditivos útiles para estabilizar el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo y similares. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo también puede estar en forma de estar conjugado con un metal tal como manganeso o hierro. Dado que tal anticuerpo conjugado con metal o fragmento de unión al antígeno del mismo, cuando se administra a un cuerpo se acumula en un sitio en que existe una gran cantidad de proteína antigénica, la existencia de células cancerosas que producen la proteína antigénica se puede detectar midiendo el metal mediante RM o similar.
Además, los polinucleótidos descritos anteriormente para la detección del cáncer, utilizados para medir el ARNm en el Método 3, también pueden proporcionarse como un reactivo para la detección de un cáncer (o cánceres). El reactivo puede consistir solo en el polinucleótido, o puede contener diversos aditivos útiles para estabilizar el polinucleótido y similares. El polinucleótido para la detección del cáncer contenido en el reactivo es preferentemente un cebador o una sonda. Las condiciones y los ejemplos preferentes del polinucleótido para la detección del cáncer son como ya se ha descrito anteriormente.
Ejemplos
La presente invención se describirá ahora de forma más concreta mediante los Ejemplos.
Ejemplo A-1: adquisición de una proteína antigénica para el cáncer nueva mediante el método SEREX
(1) Preparación de la biblioteca de ADNc
Se preparó ARN total a partir de tejido testicular de un perro sano mediante el método de tiocianato de guanidinafenol-cloroformo y se purificó el ARN poli(A) utilizando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), en conformidad con el protocolo adjunto al kit.
Utilizando el ARNm obtenido (5 |jg) se sintetizó una fagotecas de ADNc de testículo de perro. La preparación de la fagotecas de ADNc se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis de ZAP-ADNc y el kit de clonación ZAP-ADNc Gigapack III Gold (fabricados por STRATAGENE), en conformidad con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la fagoteca de ADNc preparada fue de 1,3 x 106 ufp/ml.
(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero
Se llevó a cabo la inmunoexploración utilizando la fagotecas de ADNc obtenida de testículo de perro preparada como se describe anteriormente. De forma más particular, se infectaron células hospedadoras de E. coli (XL1-Blue MRF') con la biblioteca de forma que debían aparecer 2.340 clones sobre una placa de agarosa NZY que tenía el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm, y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para dejar que el fago forme placas. La placa se cubrió con membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricado por GE Healthcare BioScience) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar las proteínas, que se transfirieron así a la membrana. Posteriormente, la membrana se recubrió y se empapó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, seguido de su agitación a 4 °C durante una noche para suprimir reacciones no específicas. Se dejó que el filtro reaccionara con el suero de paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.
Como el suero de los pacientes caninos descrito anteriormente se utilizó suero recolectado de pacientes caninos que padecían carcinoma de células escamosas. El suero se almacenó a -80 °C y se pretrató inmediatamente antes de su uso. El método de pretratamiento del suero fue como sigue. A saber, se infectaron células hospedadoras E. coli (XL1-Blue MRF') con fago A ZAP Express en el que no se había insertado ningún gen extraño, y después se cultivaron en placas de medio NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa tampón de NaHCO30,2 M, pH 8,3 que contenía NaCl 0,5 M, y se dejó la placa reposar a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recolección del sobrenadante como un extracto de E. coli/fago. Después de eso, se dejó que el extracto recolectado de E. coli/fago fluyera a través de una columna de NHS (fabricada por GE Healthcare BioScience) para inmovilizar proteínas obtenidas de E. coli/fago en ella. Se dejó que el suero procedente de pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna de proteína inmovilizada para eliminar anticuerpos adsorbidos en E. coli y/o el fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración.
La membrana sobre la que el suero así tratado y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron se lavó 4 veces con TBS-T (Tween 20 al 0,05 %/TBS), y se dejó que reaccionara con cabra anti IgG de perro (cabra anti IgG h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5.000 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 % como el anticuerpo secundario, a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la detección mediante la reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones en donde se observó una reacción de coloración positiva se recuperaron a partir de la placa de agarosa NZY que tenían el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm y se disolvieron en 500 pl de tampón s M (NaCl 100 mM, MgClSO410 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %; pH 7,5). La exploración se repitió como segunda y tercera exploración de la misma manera que se describe anteriormente, hasta que se obtuvo una única colonia positiva para la reacción de coloración, aislando de este modo un clon positivo tras la exploración de 30.940 clones de fago reactivos con las IgG en el suero.
(3) Búsqueda de homología del gen del antígeno aislado
Para someter el único clon positivo aislado mediante el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo un procedimiento de conversión del vector de fago a un vector plasmídico. De formas más particular, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener un hospedador E. coli (XL1-Blue MRF') de forma que la absorbancia DO600 debía ser de 1,0 con 100 pl de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 pl de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se dejó que la reacción transcurra a 37 °C durante 15 minutos. Se añadieron 3 ml de medio LB a la mezcla de reacción, y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido de la incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. Después, la mezcla se centrifugó a 4 °C a 1.000 x g durante 15 minutos y se recuperó el sobrenadante como una solución de fagémido. Posteriormente, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener un E. coli hospedador de fagémido (SOLR) de forma que la absorbancia DO600 debía ser de 1,0 con 10 pl de una solución de fago purificado, y se dejó transcurrir la reacción a 37 °C durante 15 minutos. Después de eso, se sembraron en placas 50 pl de la mezcla de reacción en medio de agar LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml), y se cultivó a 37 °C durante una noche. Se recuperó una única colonia de SOLr transformada y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) a 37 °C, seguido de la purificación del ADN plasmídico que tenía un inserto de interés utilizando el plásmido kit QIAGEN Miniprep plasmid (fabricado por Qiagen).
El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia entera del inserto mediante el método de cebador en avance utilizando el cebador de T3 descrito en la SEQ ID NO: 5 y el cebador de T7 descrito en la SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia se obtuvo la secuencia génica descrita en la SEQ ID NO: 1. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo la búsqueda de homología frente a genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen (n.° de Referencia XM_535343) que codifica una proteína (n.° de Referencia XP_535343) cuya función es desconocida. El factor homólogo humano de este gen fue el gen (n.° de Referencia NM_152660) que codifica una proteína (n.° de Referencia NP_689873) cuya función también es desconocida (homología: secuencia de bases, el 93 %; secuencia de aminoácidos, el 99 %). La secuencia de bases del factor homólogo humano se muestra en la SEQ ID NO: 3, y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 4.
(4) Análisis de la expresión en cada tejido
La expresión del gen que se obtuvo mediante el método descrito anteriormente, en tejidos normales y diversas líneas celulares de perro y de ser humano se investigó mediante el método de RT-PCR (transcripción inversa-PCR). La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo como sigue. A saber, se extrajo ARN total a partir de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen) en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total se sintetizó ADNc mediante el sistema de síntesis de la primera cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Como los ADNc procedentes de tejidos normales de ser humano (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizó ADNc Gene Pool (fabricado por Invitrogen), ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADNc de inserto grande (fabricado por CLONTECH). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como sigue, utilizando cebadores (descritos en las s Eq ID NO: 7 y 8) específicos para el gen canino obtenido y su gen homólogo humano. A saber, los reactivos respectivos y el tampón adjunto se mezclaron de forma que la mezcla debía contener 0,25 |jl de la muestra preparada mediante la reacción de transcripción inversa, cada uno de los cebadores anteriores 2 jM , cada uno de los dNTP 0,2 mM y polimerasa ExTaq 0,65 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 jl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos para el gen que tenían las secuencias de bases mostradas en las SEQ ID NO: 7 y 8 descritas anteriormente fueron los que amplifican las regiones de las bases 87 a 606 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 1 y las bases 173 a 695 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 3, y que pueden utilizarse para la investigación de la expresión tanto del gen canino como de su gen homólogo humano. Como un control para la comparación, se utilizaron de forma simultánea cebadores específicos (descritos en las SEQ ID NO: 9 y 10) para GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 1, se observó en testículo, entre los tejidos normales de perro, una fuerte expresión del gen canino obtenido, y por otro lado, se observó una fuerte expresión en la línea celular de cáncer de mama canina. Se confirmó la expresión del gen homólogo humano, como es el caso con el gen canino, solo en testículo entre los tejidos normales humanos, pero entre las líneas celulares de cáncer humanas se detectó expresión en células de tumor cerebral, leucemia, cáncer de mama y cáncer de pulmón. Por lo tanto, también se confirmó que el gen homólogo humano se expresa de forma específica en células de testículo y cancerosas.
En la Fig. 1, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen identificado anteriormente, y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como un control para la comparación.
Ejemplo A-2: preparación de las proteínas antigénicas de cáncer nuevas
(1) Preparación de la proteína recombinante
A base del gen de la SEQ ID NO: 1 obtenido en el Ejemplo A-1, se preparó una proteína recombinante mediante el siguiente método. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 j l del vector que se preparó a partir de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo A-1 y que se sometió al análisis de secuencia, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción NdeI y XhoI (descritos en las SEQ ID NO: 11 y 12) 0,4 jM , dNTP 0,2 mM y la polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara shuzo Co., Ltd.) 1,25 U, en un volumen total de 50 jl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 1 minuto, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente, se obtuvo la región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 2. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 %, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 930 pb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante, y después de eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción NdeI y XhoI y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET16b (fabricado por Novagen) que se había tratado con NdeI y XhoI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Se transformó con este plásmido la E. coli la para expresión, BL21 (DE3) y se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés con IPTG 1 mM.
Por otro lado, a base del gen de la SEQ ID NO: 3 se preparó mediante el siguiente método una proteína recombinante del gen homólogo humano. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 j l del ADNc preparado en el Ejemplo A-1 cuya expresión en diversos tejidos/células pudo confirmarse mediante el método de RT-PCR, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción EcoRV y EcoRI (descritos en las SEQ ID NO: 13 y 14) 0,4 j M, dNTP 0,2 mM y polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) 1,25 U, en un volumen total de 50 jl, y la PCR se llevó a cabo con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 1 minuto, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente se obtuvo la región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 4. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando un gel de agarosa al 1 %, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 930 pb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de expresión pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante, y después de eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincide con la secuencia de interés. El plásmido que coincide con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción EcoRV y EcoRI y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con EcoRV y EcoRI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Se transformó con este plásmido la E. coli para la expresión, BL21 (DE3), y se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés con IPTG 1 mM.
(2) Purificación de la proteína recombinante
Las células E. coli recombinantes obtenidas anteriormente que expresan la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3, respectivamente, se cultivaron en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 100 jg/m l) a 37 °C hasta que se alcanzó la absorbancia a 600 nm de aproximadamente 0,7, y después se añadió IPTG al mismo de forma que su concentración final debía ser de 1 mM, seguido de su cultivo a 37 °C durante 4 horas. Posteriormente, las células se recolectaron mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El sedimento de las células se suspendió en solución salina tamponada con fosfato y para lavar las células se sometió adicionalmente a una centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos.
Las células se suspendieron en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y se trataron con ultrasonido en hielo. La solución de E. coli tratada con ultrasonido se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como la fracción soluble y el precipitado como la fracción insoluble.
La fracción insoluble se suspendió en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) y se centrifugó a 6.000 rpm durante 15 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces y se llevó a cabo un procedimiento de eliminación de proteasas.
El residuo se suspendió en hidrocloruro de guanidina 6M (fabricado por Sigma Aldrich Japón), tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,15 M, y la suspensión resultante se dejó reposar a 4 °C durante 15 horas para desnaturalizar las proteínas. Después de eso se centrifugó la suspensión a 6.000 rpm durante 30 minutos, y la fracción soluble obtenida se colocó en una columna quelante de níquel preparada mediante un método convencional (transportador: Chelating Sepharose (marca registrada) Fast Flow (GE Health Care); volumen de la columna: 5 ml; tampón de equilibrado: hidrocloruro de guanidina 6 M, tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 0,15 mM, seguido por dejarlo reposar a 4 °C durante una noche para dejar la adsorción al transportador quelado con níquel. El sobrenadante se recuperó mediante centrifugación de este transportador de columna a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el transportador de columna se suspendió en solución salina tamponada con fosfato, seguido del relleno de la columna con la suspensión resultante.
La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón acetato 0,1 M (pH 4,0) que contenía cloruro de sodio 0,5 M, e inmediatamente se llevó a cabo la elución con tampón acetato 0,1 M (pH 3,0) que contenía cloruro de sodio 0,5 M. En cada etapa de elución se recolectaron seis volúmenes de columna de la fracción eluida. La elución de las proteínas de interés se confirmó mediante tinción de Coomassie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. A base del resultado, las fracciones eluidas se desalaron y concentraron para obtener el material para ser la fase sólida para el diagnóstico.
Ejemplo A-3: diagnóstico del cáncer utilizando proteína canina recombinante
(1) Diagnóstico del cáncer en perros
Se recolectaron muestras de sangre procedentes de 486 pacientes caninos en los que se encontraron tumores malignos o benignos y de 6 perros sanos, y se separaron los sueros de ellas. Utilizando la proteína canina recombinante preparada en el Ejemplo A-2 y anticuerpo anti IgG de perro, se midió mediante ELISA el título de los anticuerpos IgG de los sueros que reaccionan de forma específica con la proteína recombinante.
Del mismo modo que para la inmovilización de la proteína preparada en una fase sólida, se añadieron 100 jl/pocillo de una solución de la proteína recombinante diluida hasta 50 jg/m l con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc), y se dejó reposar la placa a 4 °C durante una noche. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de tampón bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón), (en lo sucesivo denominado en este documento como solución de bloqueo), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El suero se diluyó 500 veces con la solución de bloqueo, y se añadieron a la placa 100 pl/pocillo del suero diluido, seguido de la agitación de la placa a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que transcurra la reacción. Tras 3 lavados de los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (en lo sucesivo denominado en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de anticuerpo de IgG de perro conjugado con HRP (cabra anti IgG-h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 3.000 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (TMB (tetrametilbencidina) 1-Step Turbo, fabricado por PIERCE), y se dejó que transcurra la reacción enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso, se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón), y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midieron de la misma manera que anteriormente una placa en la que la proteína recombinante preparada no estaba inmovilizada y una placa con la que el suero procedente de un perro portador de cáncer no reaccionó.
Entre el total de 486 muestras utilizadas en el diagnóstico del cáncer descrito anteriormente, 311 muestras se diagnosticaron de forma definitiva como malignas mediante el diagnóstico patológico utilizando el tejido tumoral extirpado.
De forma específica, las muestras se diagnosticaron como cáncer tal como melanoma maligno; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de las glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándulas mamarias; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; carcinoma de células escamosas; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de las células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de las glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma idiopático; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II); liomiosarcoma o similares.
Como se muestra en la Fig. 3, los sueros procedentes de estos perros portadores de cáncer mostraron un título de anticuerpo significativamente elevado frente a la proteína recombinante. Se reveló que, mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de caninos, se pudieron diagnosticar de forma satisfactoria como malignas 192 muestras, es decir el 61,7 % de los casos malignos. Los detalles de estas 192 muestras de cáncer son como sigue. Cabe señalar que el siguiente número de cada caso de cáncer es un total acumulativo dado que algunas muestras contienen primarios múltiples.
Melanoma maligno, 10 casos; linfoma, 9 casos; feocromocitoma, 1 caso; tumor de las células de la granulosa, 1 caso; carcinoma hepatocelular, 3 casos; angioma, 1 caso; tumor testicular maligno, 9 casos; tumor intraoral, 4 casos; adenocarcinoma perianal, 7 casos; osteosarcoma, 3 casos; fibrosarcoma, 8 casos; carcinoma ductal, 19 casos; condrosarcoma, 1 caso; adenocarcinoma mamario, 35 casos; adenocarcinoma mamario combinado, 24 casos; cáncer de pulmón, 1 caso; adenocarcinoma sebáceo, 2 casos; adenocarcinoma nasal, 2 casos; mastocitoma, 26 casos; tumor adrenomedular, 1 caso; liomiosarcoma, 2 casos; carcinoma de células escamosas, 7 casos; leucemia linfocítica crónica, 1 caso; sarcoma indiferenciado, 1 caso; tumor mixto maligno, 2 casos; hemangiopericitoma, 1 caso; tumor en la articulación de la rodilla izquierda, 1 caso; tumor en el segmento posterior del lóbulo izquierdo del pulmón, 1 caso; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales), 1 caso; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes), 1 caso; adenocarcinoma ceruminoso, 1 caso; linfoma multicéntrico, 2 casos; liposarcoma, 1 caso; sarcoma sinovial, 1 caso; tricoepitelioma invasivo, 1 caso; adenocarcinoma de la glándula anal, 1 caso.
El método de diagnóstico descrito anteriormente también se llevó a cabo utilizando muestras de efusión pleural y muestras de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero, y por lo tanto se pudo lograr el diagnóstico del cáncer de forma satisfactoria.
Además, se confirmó que las estrategias de diagnóstico tales como el diagnóstico de cánceres que existen en una parte invisible del cuerpo, la evaluación de la fase y el grado del cáncer, el seguimiento de pacientes posquirúrgicos, el diagnóstico de la reaparición y metástasis, y similares también puede lograrse mediante la aplicación del método de diagnóstico descrito anteriormente. Los siguientes son varios de los ejemplos prácticos del diagnóstico detallado mostrado en la Fig. 4.
(2)-1 Diagnóstico de tumores invisibles
En el Paciente Canino 1 (Cobrador de pelo liso), el 7 de junio de 2007no se encontró ningún tumor. Pero aproximadamente 20 días más tarde, el 24 de junio de 2007, se encontró un tumor pedunculado con un diámetro de 2 mm en la encía en la base del colmillo. El día que se lo encontró se ligó el tumor en su parte pedunculada y se escindió. La absorbancia a 450 nm observada antes de que el tumor se hiciera visible a simple vista era de 0,32, lo que era significativamente elevado y no muy diferente de la absorbancia en el momento del hallazgo del tumor, 0,37. El resultado indica que mediante el método de la presente invención es posible diagnosticar cánceres incluso en una parte invisible, tal como una parte intraperitoneal.
Se observó una elevación del valor antes de que el tumor se hiciera visible a simple vista, lo que se considera que fue un signo de desarrollo tumoral. Por lo tanto, el método de la presente invención es útil en los exámenes médicos tales como las revisiones médicas periódicas.
2 semanas tras la escisión tumoral, se examinó otra vez al Paciente Canino 1 mediante serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm disminuyó enormemente, hasta 0,07. Por lo tanto, también se confirmó que el tumor que expresaba antígeno de cáncer que había provocado el título de anticuerpos aumentado se había eliminado de forma completa (véase, (2)-4, Seguimiento de pacientes posquirúrgicos).
(2)-2 Evaluación de la fase de la evolución del cáncer
La fase de la evolución del cáncer se determinó a base del tamaño o de la profundidad del tumor, en qué medida el tumor ejerce influencia en los tejidos circundantes, si el tumor produce metástasis o no, y similares. Se reveló en el presente documento que el valor detectado es más elevado que antes de que se produjera la metástasis, es decir, el cáncer ha avanzado. El siguiente es otro ejemplo de la evaluación de la fase de un determinado caso de cáncer, el cual recibió terapia con fármaco antineoplásico.
El 13 de octubre de 2006 se sometió al Paciente Canino 2 (raza mixta) a la extirpación del tumor amputando la pata trasera derecha. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, este era un mastocitoma elevadamente maligno de Grado II, más bien cercano al Grado III. El 12 de marzo de 2007 se encontró metástasis y reaparición en la ingle derecha y el hígado, y se inició la terapia con fármaco antineoplásico (vinblastina y prednisolona) sin intervenciones quirúrgicas. La administración de fármacos antineoplásicos se inició en el momento del hallazgo de la metástasis y la reaparición, y los fármacos se administraron después de eso otra vez a las 1, 2, 4 y 8 semanas. Cada vez que se administraron los fármacos se llevó a cabo el serodiagnóstico, para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,36, 0,37, 0,26, 0,20 y 0,29, respectivamente. Con los fármacos antineoplásicos administrados a intervalos cortos desde el inicio hasta la 4a semana el valor disminuyó de forma gradual, lo que indica que pudo suprimirse la evolución del cáncer. Sin embargo, el valor aumentó otra vez en la 8a semana, cuando había pasado un mes desde la anterior administración, lo que indica que el cáncer comenzó a avanzar otra vez. También se confirmó de forma clínica que esta vez el tumor creció más grande. El resultado obtenido en el Paciente Canino 2 reveló también que mediante este método puede evaluarse la fase de la evolución del cáncer, y que el efecto de la terapia con fármacos antineoplásicos también puede evaluarse como se muestra anteriormente.
(2)-3 Evaluación del grado de malignidad del cáncer
Los basaliomas incluyen el tipo maligno y el tipo benigno. Desde hace un tiempo de acuerdo con la clasificación de la OMS, los basaliomas malignos se llaman carcinomas de células basales y los basaliomas benignos se llaman tricoblastomas.
Se diagnosticó con carcinoma de células basales (maligno) al Paciente Canino 3 (Beagle). En el momento de la cirugía se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,35 mm. Por otro lado, se diagnosticó al Paciente Canino 4 (raza mixta) con tricoblastoma (benigno), el serodiagnóstico llevado a cabo en el momento de la cirugía reveló que la absorbancia a 450 nm era de 0; no se detectó en absoluto. Por lo tanto, incluso en el caso de los mismos basaliomas, el carcinoma de células basales maligno y el tricoblastoma benigno pueden diagnosticarse de forma distintiva.
El próximo ejemplo es en tumores de la glándula mamaria. Los tumores de glándula mamaria incluyen tumores malignos tales como el adenocarcinoma mamario y el tumor mixto maligno de glándula mamaria, y tumores mamarios benignos que no muestran síntomas malignos. El 17 de mayo de 2006 se sometió al Paciente Canino 5 (Yorkie) a la extirpación de un tumor mixto maligno de la glándula mamaria y de un adenocarcinoma mamario. En general, la escisión completa de los tumores mixtos en la glándula mamaria es fácil debido a que son poco invasivos de los tejidos circundantes incluso, si son malignos y, así, el transcurso posquirúrgico de los pacientes habitualmente no tiene incidentes. Sin embargo, se diagnosticó al Paciente Canino 5 con un tumor elevadamente maligno, debido a que el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que algunos componentes de la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 5 mostraban una naturaleza invasiva. Por otro lado, el adenocarcinoma mamario es un tumor elevadamente invasivo debido a que, con frecuencia, reaparece y produce metástasis. Aunque no se observó invasión de células tumorales en la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 5, se ha señalado que los componentes elevadamente malignos posiblemente proliferaron a otras regiones fuera de la muestra de ensayo. Por lo tanto, los hallazgos en el diagnóstico patológico claramente mostraron que el Paciente Canino 5 padecía cáncer mamario elevadamente maligno. Durante la cirugía se recolectó una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,39. El 28 de enero de 2007 se sometió al Paciente Canino 6 (Yorkshire Terrier) a la extirpación de un tumor mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, la atipia de las células era baja y, por lo tanto, el Paciente Canino 6 se diagnosticó con adenoma mamario benigno sin hallazgos malignos. Durante la cirugía se recolectó una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,05. En los dos casos revelados anteriomente los tumores elevadamente malignos muestran un valor más elevado que los tumores de baja malignidad y los benignos.
(2)-4 Seguimiento de los pacientes posquirúrgicos
El Paciente Canino 7 (Shih Tzu) acudió al hospital debido a un tumor intraoral y el 22 de marzo de 2007 se sometió a la extirpación. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,40. Además, a base del diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, se diagnosticó al Paciente Canino 7 con epulis acantomatoso maligno. Este tipo de tumor con frecuencia reaparece si la escisión es insuficiente, aunque raramente se produce metástasis a distancia. Por lo tanto, es importante si el tumor se puede escindir de forma completa mediante cirugía o no. De acuerdo con el seguimiento el 18 de mayo de 2007, la absorbancia a 450 nm era de 0,25, y por lo tanto el título de anticuerpos disminuyó. La reaparición no se halló hasta agosto de 2007. Por lo tanto, se considera que el valor obtenido en el serodiagnóstico se hizo más bajo que el obtenido en el momento de la cirugía debido a que en el Paciente Canino 7 el tumor pudo escindirse de forma completa.
(2)-5 Diagnóstico de reaparición
El 8 de mayo de 2007 se sometió al Paciente Canino 8 (Husky) a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. En el momento de la cirugía se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,08. El diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que proliferaron células epiteliales atípicas y que principalmente formaron estructuras ductales y, así, este paciente se diagnosticó con adenocarcinoma de mama primario. Dado que muchas células cancerosas ya habían entrado en los vasos linfáticos en ese momento, se dijo que el paciente estaba en elevado riesgo de reaparición o metástasis en los ganglios linfáticos u órganos a distancia. El 28 de junio de 2007, aproximadamente 1 mes y medio tras la cirugía, se encontró metástasis en el mismo sitio. El valor detectado mediante el serodiagnóstico llevado a cabo después era de 0,08, el que no disminuyó en absoluto. Así, se considera que en el Paciente Canino 8 el valor del serodiagnóstico se mantuvo invariable desde principios de mayo hasta fines de junio debido a que no había podido escindirse de forma completa el tumor o a que se habría producido reaparición.
(2)-6 Diagnóstico de metástasis
Se diagnosticó al Paciente Canino 9 (Scottish Terrier), que de forma repetida había experimentado metástasis y reaparición, con tumor mamario en febrero de 2003; melanoma maligno intraoral en agosto de 2003; melanoma maligno en el labio en enero de 2005 y melanoma intraoral el 13 de abril de 2005, todos los cuales se escindieron mediante cirugía. Este paciente acudió al hospital otra vez el 17 de diciembre de 2006, para el seguimiento tras la reaparición del melanoma intraoral en abril de 2005 y en ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,3. Medio año más tarde, el 20 de junio de 2007, el paciente acudió otra vez al hospital debido a la hipertrofia de los ganglios linfáticos cervicales y malares. En el caso de los linfomas, se observa de forma sistemática la hipertrofia de los ganglios linfáticos. Debido a que el Paciente Canino 9 tenía sólo dos ganglios linfáticos inflamados, se diagnosticó de forma clínica a este paciente como con probable linfoma metastásico. El diagnóstico de acuerdo con la presente invención también reveló que era un tumor que había metastatizado a partir del tumor que había existido previamente en este paciente, dado que la absorbancia a 450 nm aumentó enormemente, hasta 0,75.
(2)-7 Control de la terapia
El 19 de abril de 2007 se sometió al Paciente Canino 11 (Dachshund miniatura) a extirpación tumoral. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, el paciente padecía adenocarcinoma mamario combinado moderadamente maligno, con una elevada probabilidad de desarrollo invasivo y metastásico. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para revelar que la absorbancia a 450 nm era de 0,26. El 3 de junio de 2008, aproximadamente 1 año tras la extirpación, se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm aumentó enormemente hasta 0,13. Aunque a simple vista no se encontró ningún tumor recurrente, se administró un fármaco antineoplásico (INTERCAT) una vez por semana durante 2 meses para prevenir la reaparición. A las 2, 4 y 6 semanas tras comenzar la administración del fármaco antineoplásico, se llevó a cabo el serodiagnóstico para revelar que la absorbancia a 450 nm era de 0,09, 0,07 y 0,08, respectivamente. Estos resultados obtenidos en el Paciente Canino 11 confirmaron que el valor se hace más bajo que el detectado en un estado portador de cáncer si los tumores se pueden retirar de forma completa, así como que el valor no aumenta si el tratamiento con fármaco antineoplásico previene de forma satisfactoria la metástasis del cáncer y, así, puede seguirse el cambio en los pacientes tratados. Además, también puede llevarse a cabo el diagnóstico de reaparición como se muestra en el Paciente Canino 8, lo que confirma que también puede hacerse posible el control de la terapia.
(2)-8 Diagnóstico de la malignidad del tumor recurrente
El 27 de abril de 2007 se sometió al Paciente Canino 12 (Chihuahua) a extirpación tumoral. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, este paciente padecía carcinoma ductal originado a partir del epitelio ductal mamario, es decir, cáncer de mama maligno. El 29 de junio de 2008, aproximadamente 1 año tras eso, el tumor se encontró otra vez y se extirpó. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, aunque las células tumorales que se originaron a partir del epitelio ductal mamario formaron cavidades glandulares irregulares y se desarrollaron para reduplicarse hacia el lumen, las células constituyentes tenían un núcleo casi uniformemente ovalado y la atipia de las células era bajo y, por lo tanto, el tumor se diagnosticó como adenocarcinoma mamario benigno. Se llevó a cabo el serodiagnóstico pero la absorbancia a 450 nm era de 0,02, casi no se detectó. Los resultados observados en los Pacientes Caninos 8 y 12 confirmaron que el valor del serodiagnóstico no disminuye o se sostiene en los casos en donde el tumor recurrente es maligno, y casi no se detecta en los casos en donde el tumor es benigno.
(2) -9 Pronóstico del paciente canino portador de un tumor benigno
El 9 de octubre de 2007 se sometió al Paciente Canino 13 (Caniche Toy) a extirpación tumoral. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que las células del epitelio mamario y las células mioepiteliales proliferaron para formar el tumor, pero que ninguna de las dos mostró algún hallazgo maligno y, por lo tanto, este paciente se diagnosticó con tumor mixto benigno. De acuerdo con el serodiagnóstico llevado a cabo en ese momento, la absorbancia a 450 nm era de 0,07, detectada ligeramente. Ocho meses tras eso, el 5 de junio de 2008, se recolectó otra vez una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico, para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. En ese momento no se encontró reaparición de forma clínica. Estos resultados indican que, incluso en el caso en donde el tumor es benigno, la extracción completa del tumor da como resultado el valor disminuido del serodiagnóstico si se puede observar en el estado portador de cáncer un valor detectable, y por lo tanto se puede lograr el pronóstico.
(3) Diagnóstico en gatos
A continuación, se diagnosticaron gatos que portaban cáncer y gatos sanos. Utilizando la proteína canina recombinante descrita anteriormente y el anticuerpo anti IgG de gato, se midió el título de los anticuerpos IgG de suero felino que reaccionan de forma específica con el polipéptido, de la misma manera que se describe anteriormente. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG de gato conjugado con HRP (FRACCIÓN IgG de CABRA para IgG de GATO CONJUGADO CON PEROXIDASA (MOLÉCULA COMPLETA): fabricado por CAPPEL RESERCH REAGENTS) diluido 8.000 veces con la solución de bloqueo.
El 17 de agosto de 2005 se sometió al Paciente Felino 1 (Chinchilla) a extirpación tumoral de un adenocarcinoma mamario. La absorbancia a 450 nm fue de 0,32. En el Paciente Felino 2 (Himalayo), al que se sometió a extirpación de carcinoma ductal el 17 de octubre de 2006, la absorbancia a 450 nm fue de 0,18. Por otro lado, no se detectó en absoluto ninguna absorbancia en gatos sanos.
Por lo tanto, de forma similar a los perros, se detectó el valor de absorbancia en muestras procedentes de gatos que padecían cáncer, aunque en muestras procedentes de gatos sanos el valor de absorbancia no se detectó en absoluto. Por lo tanto, de forma similar a los perros, utilizando una proteína canina recombinante también pueden detectarse por este método cánceres en gatos.
(4) Diagnóstico en seres humanos sanos
Utilizando la proteína canina recombinante descrita anteriormente y el anticuerpo anti IgG de ser humano anterior, se midió del mismo modo que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de suero de ser humano sano, que reaccionan de forma específica con el polipéptido. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG de ser humano conjugado con HRP (cabra anti IgG (H+L) de ser humano conjugado con HRP: fabricado por Zymed Laboratories) diluido 10.000 veces con la solución de bloqueo. Como control positivo se utilizó un antígeno de ovoalbúmina inmovilizado preparado mediante la inmovilización de ovoalbúmina 50 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato en una fase sólida. Como resultado, en el Ser Humano Sano 1, se observó que la absorbancia a 450 nm en un antígeno de ovoalbúmina era de 0,25, mientras que se observó que la absorbancia a 450 nm en la proteína recombinante era de 0, no se detectó en absoluto. De forma similar, en el Ser Humano Sano 2, la absorbancia a 450 nm observada en un antígeno de ovoalbúmina fue de 0,18, mientras que la absorbancia a 450 nm observada en la proteína recombinante fue de 0, no se detectó en absoluto.
Ejemplo A-4: diagnóstico del cáncer utilizando proteína humana recombinante
Utilizando la proteína humana recombinante preparada en el Ejemplo A-2, se midió el título de anticuerpos IgG que reaccionan con la proteína de sueros humanos, caninos y felinos, de la misma manera que en el Ejemplo A-3.
El diagnóstico se llevó a cabo utilizando suero de ser humano sano. Del mismo modo que en el Ejemplo A-3 (4), se utilizó como control positivo antígeno de ovoalbúmina. Como resultado, se detectó el valor de absorbancia en el caso en donde la ovoalbúmina estaba inmovilizada sobre una fase sólida, mientras que el valor de absorbancia casi no se detectó en el caso en donde estaba inmovilizada sobre una fase sólida la proteína calmegina humana.
De forma similar, en perros y gatos sanos la absorbancia a 450 nm casi no se detectó en el caso en donde la proteína estaba inmovilizada sobre una fase sólida.
Por otro lado, el 21 de junio de 2007 se sometió al Paciente Canino 10 (Shih Tzu) a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, el tejido de glándula mamaria contenía células invasivas elevadamente atípicas y creció para formar hiperplasia adenomatosa que mostraba estructuras masivas grandes y pequeñas. Por lo tanto, se diagnosticó este paciente como con tumor maligno. En este Paciente Canino 10, la absorbancia a 450 nm era de 0,29. El diagnóstico de malignidad se llevó a cabo utilizando 310 muestras de suero adicionales que se habían diagnosticado como malignas a base del diagnóstico patológico. Como resultado, diagnosticando como maligna una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de canino, se pudieron diagnosticar de forma satisfactoria como malignas 189 muestras, es decir el 60,8 % de los casos malignos. Además, en el Paciente Felino 3 (raza mixta), que el 3 de abril de 2007 se sometió a extirpación de un adenocarcinoma mamario, la absorbancia a 450 nm era de 0,14.
Los resultados descritos anteriormente indican que el diagnóstico se puede lograr de forma similar en seres humanos, perros y gatos, incluso utilizando la proteína humana recombinante.
Además, las muestras de efusión pleural y de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal se sometieron a diagnóstico utilizando la proteína humana recombinante de la misma manera que la proteína canina recombinante. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero y, por lo tanto, se pudo lograr de forma satisfactoria el diagnóstico del cáncer.
Ejemplo A-5: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (1)
Se inmunizaron ratones y conejos con el polipéptido canino recombinante preparado en el Ejemplo A-2 para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. Utilizando este anticuerpo policlonal, se llevó a cabo mediante ELISA de tipo sándwich la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer. Se midió mediante ELISA de tipo sándwich, utilizando anticuerpo anti IgG de ratón, la cantidad de la proteína en el suero que reacciona de forma específica con el anticuerpo policlonal preparado específico para la proteína.
Del mismo modo que para la inmovilización de un anticuerpo primario en una fase sólida, se añadieron 100 pl/pocillo del antisuero de conejo diluido 20 veces con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc) y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de tampón de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón), (en lo sucesivo denominada en este documento como solución de bloqueo), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta placa se añadieron 100 pl/pocillo del suero procedente del cuerpo portador de cáncer diluido con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que la reacción transcurra. Del mismo modo que para el suero diluido, se prepararon diluciones en serie con factor 10 que variaban de 10 a 1.000 veces. Tras 3 lavados de los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (en lo sucesivo denominado en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de antisuero de ratón diluido 200 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que la reacción transcurra. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, como anticuerpo terciario se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de anticuerpo de IgG de ratón conjugado con HRP (cabra anti ratón conjugado con HRP estabilizado: fabricado por PIERCE) diluido 2.000 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que la reacción transcurra. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de sustrato de HRP, TMB (TMB (tetrametilbencidina) 1-Step Turbo, fabricada por PIERCE), y se dejó que transcurra la reacción enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso, la reacción se finalizó añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón), y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midieron del mismo modo que se describe anteriormente una placa en la que no se inmovilizó antisuero de conejo y una placa con la que no se hizo reaccionar el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer.
Como resultado, se detectó el polipéptido en perros y gatos que portaban cáncer que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno y similares, mientras que no se detectó el polipéptido en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por lo tanto, los cánceres pudieron diagnosticarse también mediante este método en el que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido canino recombinante.
Ejemplo A-6: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (2)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína humana recombinante preparada en el Ejemplo A-2 para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. Del mismo modo que en el Ejemplo 5, la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer se llevó a cabo mediante ELISA de tipo sándwich utilizando este anticuerpo policlonal.
Como resultado, se detectó el polipéptido en perros y gatos que portaban cáncer que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno y similares, mientras que no se detectó el polipéptido en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por lo tanto, también podrían diagnosticarse cánceres mediante este método en el que se detectó el polipéptido antigénico con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido humano recombinante.
Ejemplo B-1: adquisición de proteínas antigénicas de cáncer nuevas mediante el método SEREX
(1) Preparación de la biblioteca de ADNc
Se preparó ARN total de tejido testicular de un perro sano mediante el método de guanidina-fenol-cloroformo, y se purificó el ARN poli(A) utilizando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) en conformidad con el protocolo adjunto al kit.
Utilizando el ARNm obtenido (5 |jg) se sintetizó una fagotecas de ADNc de testículo de perro. La preparación de la fagotecas de ADNc se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis de ZAP-ADNc y el kit de clonación ZAP-ADNc Gigapack III Gold (fabricado por STRATAGENE) en conformidad con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la fagotecas de ADNc preparada era de 1,3 x 106 ufp/ml.
(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero
Se llevó a cabo la inmunoexploración utilizando la fagotecas de ADNc obtenida de testículo de perro preparada como se describe anteriormente. De forma más particular, se infectaron células E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF') con la biblioteca de forma que pudieran aparecer 2.340 clones en una placa de agarosa NZY que tuviera el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para dejar que los fagos formaran placas. La placa se recubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar proteínas, las cuales se transfectaron así a la membrana. Posteriormente, la membrana se recuperó y se empapó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, seguido de la agitación a 4 °C durante una noche para suprimir reacciones no específicas. Se dejó que este filtro reaccionara con suero de paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.
Al igual que el suero de paciente canino descrito anteriormente, se utilizó suero recolectado de pacientes caninos que padecían tumor próximo al ano. El suero se almacenó a -80 °C y se pretrató inmediatamente antes de su uso. El método de pretratamiento del suero fue como sigue. A saber, se infectaron células E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF') con fago A ZAP Express en el que no se había insertado gen extraño, y después se cultivaron en medio de placa NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa el tampón de NaHCO30,2 M, pH 8,3 que contenía NaCl 0,5 M, y la placa se dejó reposar a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recolección del sobrenadante como un extracto de E. coli/fago. Después de eso, se dejó fluir al extracto de E. coli/fago recolectado a través de una columna de NHS (fabricada por GE Healthcare BioScience) para inmovilizar en ella las proteínas obtenidas de E. coli/fago. Para eliminar anticuerpos adsorbidos en E. coli y/o el fago se dejó que el suero procedente de pacientes caninos fluyera y reaccionara con esta columna de proteínas inmovilizadas. La fracción de suero que pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 % y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración.
La membrana sobre la que el suero así tratado y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron se lavó 4 veces con TBS-T (Tween 20 al 0,05 %/TBS), y se dejó que reaccionara con cabra anti IgG de perro (cabra anti IgG h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 5.000 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 % como anticuerpo secundario, a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la detección mediante la reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones en donde se observó una reacción de coloración positiva se recuperaron a partir de la placa de agarosa NZY que tenía el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm, y se disolvieron en 500 j l de tampón SM (NaCI 100 mM, MgClSO4 10 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %; pH 7,5). La exploración se repitió como una segunda y tercera exploración de la misma manera que se describe anteriormente, hasta que se obtuvo una única colonia positiva para la reacción de coloración, aislando de este modo un clon positivo tras la exploración de 30.940 clones de fagos reactivos con las IgG en el suero.
(3) Búsqueda de homología de los genes de antígeno aislados
Para someter al único clon positivo aislado mediante el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo un procedimiento de conversión del vector de fago a un vector plasmídico. De formas más particular, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener una E. coli hospedadora (XL1-Blue MRF') de forma que la absorbancia DO600 debía ser de 1,0, con 100 pl de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 pl de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se dejó transcurrir la reacción a 37 °C durante 15 minutos. Se añadieron 3 ml de medio LB a la mezcla de reacción y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido de la incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. Después, se centrifugó la mezcla a 4 °C a 1.000 x g durante 15 minutos, y se recuperó el sobrenadante como una solución de fagémido. Posteriormente, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener un E. coli hospedador de fagémido (SOLR), de forma que la absorbancia DO600 debía ser de 1,0, con 10 pl de una solución de fago purificado, y se dejó que transcurra la reacción a 37 °C durante 15 minutos. Después de eso se sembraron en placas 50 pl de la mezcla de reacción en medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml), y se cultivó a 37 °C durante una noche. Se recuperó una única colonia de SOLR transformada y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) a 37 °C, seguido de la purificación del ADN plasmídico que tenía el inserto de interés utilizando el kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen).
El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia del inserto entera mediante el método del cebador en avance, utilizando el cebador T3 descrito en la SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en la SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia génica descrita en la SEQ ID NO: 15. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo la búsqueda de homología frente a genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen de la calmegina. El factor homólogo humano del gen de la calmegina canina fue la calmegina humana (homología: secuencia de bases, el 90 %; secuencia de aminoácidos, el 89 %). La secuencia de bases de la calmegina humana se muestra en la SEQ ID NO: 17, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en la SEQ ID NO: 18.
(4) Análisis de la expresión en cada tejido
Se investigó mediante el método de RT-PCR (Transcripción Inversa-PCR) la expresión del gen, que se obtuvo mediante el método descrito anteriormente, en tejidos normales y diversas líneas celulares de perro y ser humano. La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo como sigue. A saber, se extrajo ARN total a partir de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen), en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total se sintetizó ADNc mediante el sistema de síntesis de la primera cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen), en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Como con los ADNc procedentes de tejidos normales de ser humano (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta) se utilizaron ADNc de Gene Pool (fabricado por Invitrogen), ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADNc de inserto grande (fabricada por CLONTECH). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como sigue, utilizando cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 19 y 20) específicos para el gen obtenido. A saber, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 0,25 pl de la muestra preparada mediante la reacción de transcripción inversa, los cebadores anteriores 2 pM, cada uno de los dNTP 0,2 mM y polimerasa ExTaq 0,65 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), en un volumen total de 25 pl, y se llevó a cabo la reacción con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1 minuto, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos de gen descritos anteriormente fueron los que amplifican las regiones de las bases 755 a 1318 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 15 (gen de la calmegina canina) y las bases 795 a 1358 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 17, y pueden utilizarse para la investigación de la expresión tanto del gen de la calmegina canina como del gen de la calmegina humana. Como control para la comparación, se utilizaron de forma simultánea cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 9 y 10) específicos para GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 5, se observó una fuerte expresión en testículo entre los tejidos de perro normales, y por otro lado, se observó una fuerte expresión en las líneas celulares de tumor caninas. Se confirmó la expresión del gen de la calmegina humana solo en testículo entre los tejidos normales, como es el caso con el gen de la calmegina canina, pero se detectó expresión en células de tumor cerebral, de leucemia y de cáncer de esófago, entre las líneas celulares de cáncer. Por lo tanto, también se confirmó que el gen de la calmegina humana se expresa de forma específica en células de testículo y de cáncer.
En la Fig. 5, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen de la calmegina y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control para la comparación.
Ejemplo B-2: preparación de las proteínas calmegina canina y humana
(1) Preparación de la proteína recombinante
A base del gen de la SEQ ID NO: 15 obtenido en el Ejemplo B-1, se preparó una proteína recombinante mediante el siguiente método. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 |jl del vector que se preparó a partir de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo B-1 y que se sometió al análisis de secuencia, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción de BamHI y EcoRI (descritos en las SEQ ID NO: 21 y 22) 0,4 jM , dNTP 0,2 mM y polimerasa PrimeSTAR HS 1,25 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), en un volumen total de 50 jl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 2 minutos utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente se obtuvo la región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 16. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,9 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de expresión pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante y tras eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción BamHI y EcoRI y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con BamHI y EcoRI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Con este plásmido se transformó E. coli para expresión, BL21 (DE3), y se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés con IPTG 1 mM.
A base del gen de la SEQ ID NO: 17 se preparó mediante el siguiente método una proteína recombinante del gen homólogo de ser humano. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 j l del ADNc preparado en el Ejemplo B-1 cuya expresión pudo confirmarse en diversos tejidos/células mediante el método de RT-PCR, cada uno de los dos tipos de cebadores con los sitios de restricción EcoRI y XhoI (descritos en las SEQ ID NO: 23 y 24) 0,4 jM , dNTP 0,2 mM y la polimerasa PrimeSTAR HS 1,25 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), en un volumen total de 50 jl, y la p Cr se llevó a cabo con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 15 segundos y 72 °C durante 2 minutos, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente se obtuvo la región codificante de la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 18. Tras la PCR se sometió el ADN amplificado a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,9 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
El fragmento de ADN purificado se ligó en un vector de expresión pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante, y después de eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción EcoRI y XhoI y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con EcoRI y XhoI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante etiquetada con His. Con este plásmido se transformó E. coli para la expresión, BL21 (DE3), y se indujo la expresión de la proteína de interés en E. coli con IPTG 1 mM.
(2) Purificación de la proteína recombinante
Las células de E. coli recombinantes obtenidas anteriormente que expresaban la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 17, respectivamente, se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina (concentración final: 30 jg/m l) a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó aproximadamente 0,7, y después se añadió IPTG al mismo de forma que su concentración final debía ser de 1 mM, seguido de su cultivo a 37 °C durante 4 horas. Posteriormente, las células se recolectaron mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. Se suspendió el sedimento de las células en solución salina tamponada con fosfato y para lavar las células se sometió adicionalmente a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos.
El sedimento de células E. coli obtenido se suspendió en tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) y se trató con ultrasonido en hielo. La solución de E. coli tratada con ultrasonido se centrifugó a 6.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como la fracción soluble y el precipitado como la fracción insoluble.
La fracción soluble se colocó en una columna de intercambio catiónico (transportador: Sepharose SP (marca registrada) Fast Flow (GE Health Care); volumen de columna: 5 ml, tampón de equilibrado: tampón fosfato 20 mM (pH 7,0)). La columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) e inmediatamente después se llevó a cabo la elución con un gradiente de densidad de sales mediante tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 0,3 M-1,0 M. Se recolectaron en cada etapa de la elución seis volúmenes de columna de la fracción eluida.
Entre estas fracciones eluidas, se combinaron todas las fracciones eluidas con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 0,3 M y la primera fracción eluida con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 1,0 M, y la solución resultante se sometió a purificación adicional mediante una columna secundaria.
Para la columna secundaria se utilizó un transportador de columna Bio gel HT Tipo II (BioRad). El volumen de la columna era de 5 ml. La columna se equilibró con 10 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 0,3 M y las fracciones eluidas descritas anteriormente se colocaron en la columna. Las fracciones que no se adsorbieron en la columna se lavaron con 10 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM (pH 7,0) que contenía cloruro de sodio 0,3 M y tampón fosfato 0,1 M (pH 7,0). Inmediatamente después de eso se llevó a cabo la elución con tampón fosfato 0,2 M (pH 7,0). Se recolectaron en cada etapa de elución seis volúmenes de columna de la fracción eluida. La elución de las proteínas de interés se confirmó mediante tinción de Coomassie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. A base del resultado, las fracciones eluidas se desalaron y concentraron para obtener el material para la fase sólida para el diagnóstico.
Ejemplo B-3: diagnóstico del cáncer utilizando la proteína calmegina canina
(1) Diagnóstico del cáncer en perros
Se recolectaron muestras de sangre procedentes de 486 pacientes caninos en los que se encontraron tumores malignos o benignos y de 6 perros sanos, y se separaron los sueros a partir de ellas. Utilizando la proteína calmegina canina preparada en el Ejemplo B-2 y el anticuerpo anti IgG de perro, se midió mediante ELISA el título de anticuerpos IgG de los sueros que reaccionaban de forma específica con la proteína.
Del mismo modo que para la inmovilización de la proteína preparada en una fase sólida, se añadieron 100 pl/pocillo de una solución de la proteína recombinante diluida a 50 pg/ml con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc), y se dejó reposar la placa a 4 °C durante una noche. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de tampón bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón) (denominado en lo sucesivo en este documento como la solución de bloqueo) y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El suero se diluyó 1.000 veces con la solución de bloqueo, y se añadieron a la placa 100 pl/pocillo del suero diluido, seguido de la agitación de la placa a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que transcurra la reacción. Tras 3 lavados de los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (denominado en lo sucesivo en este documento como PBS-T), se añadieron a la misma 100 pl/pocillo de anticuerpo de IgG de perro conjugado con HRP (cabra anti IgG-h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 3.000 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (TMB 1-Step Turbo (tetrametilbencidina), fabricado por PIERCE), y se dejó que transcurra la reacción enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso, se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón) y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midieron de la misma manera que anteriormente una placa sobre la que no se inmovilizó la proteína recombinante preparada y una placa con la que el suero procedente de un perro que portaba cáncer no reaccionó.
Entre el total de 486 muestras utilizadas en el diagnóstico del cáncer descrito anteriormente, 311 muestras se diagnosticaron de forma definitiva como malignas mediante el diagnóstico patológico utilizando el tejido tumoral extirpado.
De forma específica, las muestras se diagnosticaron como cáncer tal como melanoma maligno; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrocarcinoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; carcinoma de células escamosas; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma idiopático; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II); liomiosarcoma o similares.
Como se muestra en la Fig. 7, los sueros procedentes de estos perros que portaban cáncer mostraron un título de anticuerpo significativamente elevado frente a la proteína recombinante. Se reveló que, mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de caninos sanos, pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 177 muestras, es decir el 56,9% de los casos malignos. Los detalles de estas 177 muestras de cáncer son como sigue. Cabe señalar que el siguiente número de cada caso de cáncer es un total acumulativo, dado que algunas muestras contenían múltiples primarios.
Melanoma maligno, 10 casos; linfoma, 10 casos; feocromocitoma, 1 caso; tumor de células de la granulosa, 1 caso; carcinoma hepatocelular, 4 casos; carcinoma de glándula sudorípara, 5 casos; angioma, 1 caso; tumor testicular maligno, 7 casos; tumor intraoral, 4 casos; adenocarcinoma perianal, 11 casos; osteosarcoma, 4 casos; fibrosarcoma, 7 casos; condrosarcoma, 2 casos; adenocarcinoma mamario, 35 casos; adenocarcinoma mamario combinado, 27 casos; cáncer de pulmón, 2 casos; adenocarcinoma sebáceo, 2 casos; adenocarcinoma nasal, 2 casos; mastocitoma, 25 casos; tumor adrenomedular, 1 caso; liomiosarcoma, 1 caso; carcinoma de células escamosas, 5 casos; leucemia linfocítica crónica, 1 caso; germinoma, 1 caso; histiocitoma fibroso maligno, 1 caso; epitelioma maligno metastásico, 1 caso; carcinoma ductal mamario, 1 caso; angiosarcoma, 1 caso; adenocarcinoma mamario tubular, 1 caso; tricoepitelioma invasivo, 1 caso; cáncer de próstata, 1 caso; adenocarcinoma bronquial, 1 caso.
El método de diagnóstico descrito anteriormente se llevó a cabo utilizando muestras de efusión pleural y muestras de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero, y por lo tanto se pudo lograr de forma satisfactoria el diagnóstico de cáncer.
Además, se confirmó que también se pueden lograr aplicando el método de diagnóstico descrito anteriormente las estrategias de diagnóstico tales como el diagnóstico de cánceres que existen en una parte invisible del cuerpo, la evaluación de la fase y el grado del cáncer, el seguimiento de pacientes posquirúrgicos, el diagnóstico de reaparición y metástasis, y similares. Los siguientes son varios de los ejemplos prácticos del diagnóstico detallado mostrado en la Fig. 8.
(2)-1 Diagnóstico de tumores invisibles
En el Paciente Canino 1 (Cobrador de pelo liso) no se encontró ningún tumor el 7 de junio de 2007. Pero aproximadamente 20 días más tarde, el 24 de junio de 2007, se encontró un tumor pedunculado con un diámetro de 2 mm en la encía en la raíz del colmillo. El tumor se ligó en su parte pedunculada y se escindió el día que se lo encontró. La absorbancia a 450 nm observada antes de que el tumor se hiciera visible a simple vista era de 0,31, la cual fue significativamente elevada y no muy distinta de la absorbancia en el momento del hallazgo del tumor, 0,33. Este resultado indica que mediante el método de la presente invención es posible diagnosticar cánceres incluso en una parte invisible tal como una parte intraperitoneal.
Se observó una elevación del valor antes de que el tumor se hiciera visible a simple vista, lo que se considera que fue un signo del desarrollo tumoral. Por lo tanto, el método de la presente invención es útil en los exámenes médicos tales como la revisión médica periódica.
2 semanas después de la escisión tumoral el Paciente Canino 1 se examinó otra vez mediante serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm se redujo enormemente hasta 0,17. Por lo tanto, también se confirmó que el tumor que expresaba antígeno de cáncer que había provocado el título de anticuerpos aumentado se había eliminado de forma completa (véase, (2)-4, Seguimiento de pacientes posquirúrgicos).
(2)-2 Evaluación de la fase de la evolución del cáncer
La fase de la evolución del cáncer se determina a base del tamaño o la profundidad del tumor, de cuanta influencia ejerce el tumor sobre los tejidos circundantes, si el tumor produce metástasis o no, y similares. Se reveló en el presente documento que el valor detectado es más elevado que antes si se produce metástasis, es decir, el cáncer ha avanzado. El siguiente es otro ejemplo de una evaluación de la fase de un determinado caso de cáncer, el cual recibió terapia con fármaco antineoplásico.
El Paciente Canino 2 (Dachshund miniatura) acudió el 21 de febrero de 2007 al hospital, principalmente con quejas de náuseas y demacración, y se encontraron dos tumores grandes en la cavidad abdominal. El 23 de febrero de 2007 se sometió a este paciente a la extirpación tumoral. El riñón derecho inflamado pesaba 433 g. El nódulo linfático vecino estaba bien vascularizado y pesaba 42 g. A base del diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, se diagnosticó al paciente con linfoma maligno multicéntrico. Se dijo que había una probabilidad de que las células tumorales se propagaran en otros órganos en la cavidad abdominal, dado que se observó propagación diseminada de células tumorales en el tejido adiposo. El 1 de marzo de 2007 se inició la administración de fármaco antineoplásico (Oncovín) de forma posquirúrgica, y se llevó a cabo el serodiagnóstico 3 veces, es decir, el día que se inició la administración, y 2 y 3 meses después de eso. Como resultado, la absorbancia a 450 nm fue 0,18, 0,16, y 0,14, respectivamente. El valor se había reducido de forma gradual desde el inicio de la administración, lo que confirmó que el fármaco antineoplásico tuvo efecto. Por lo tanto, se confirmó que se podía inhibir la evolución del cáncer. Por lo tanto, los resultados en el Paciente Canino 2 confirmaron que también puede evaluarse la fase de la evolución del cáncer. Además, se confirmó que el efecto de la terapia de fármaco antineoplásico también puede evaluarse como se describe anteriormente.
(2)-3 Evaluación del grado de malignidad del cáncer
Los basaliomas incluyen el tipo maligno y el tipo benigno. Desde hace un tiempo, de acuerdo con la nueva clasificación de la OMS, los basaliomas malignos se llaman carcinomas de células basales y los basaliomas benignos se llaman tricoblastomas.
El Paciente Canino 3 (Beagle) se diagnosticó con carcinoma de células basales (maligno). En el momento de la cirugía el serodiagnóstico se llevó a cabo para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0,13. Por otro lado, en el caso del Paciente Canino 4 (raza mixta), diagnosticado con tricoblastoma (benigno), el serodiagnóstico llevado a cabo en el momento de la cirugía reveló que la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. Por lo tanto, incluso en el caso de los mismos basaliomas, se pueden diagnosticar de forma distintiva el carcinoma de células basales maligno y el tricoblastoma benigno.
El próximo ejemplo es de tumores de glándula mamaria. Los tumores de glándula mamaria incluyen tumores malignos tales como el adenocarcinoma mamario y el tumor mixto maligno de glándula mamaria, y tumores mamarios benignos que no muestran síntomas malignos. El 17 de mayo de 2006 el Paciente Canino 5 (Yorkie) se sometió a la extirpación de un tumor mixto maligno de glándula mamaria y de un carcinoma mamario. En general, la escisión completa de los tumores mixtos en la glándula mamaria es fácil debido a que son poco invasivos de los tejidos circundantes, incluso si son malignos y, así, el transcurso posquirúrgico de los pacientes habitualmente es sin incidentes. Sin embargo, se diagnosticó al Paciente Canino 5 con tumor elevadamente maligno, debido a que el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que algunos componentes de la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 5 mostraron una naturaleza invasiva. Por otro lado, el adenocarcinoma mamario es un tumor elevadamente invasivo que a menudo reaparece y produce metástasis. Aunque no se observó invasión de células tumorales en la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 5, se había señalado que los componentes altamente malignos posiblemente proliferaron en otras regiones fuera de la muestra de ensayo. Por lo tanto, los hallazgos en el diagnóstico patológico claramente mostraron que el Paciente Canino 5 padecía cáncer mamario altamente maligno. Se recolectó una muestra de sangre durante la cirugía y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,57. Por otro lado, el 28 de enero de 2007 el Paciente Canino 6 (Yorkshire Terrier) se sometió a la extirpación de un tumor mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, la atipia de las células era baja y, por lo tanto, el Paciente Canino 6 se diagnosticó con adenoma mamario benigno sin hallazgos malignos. Se recolectó durante la cirugía una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0. Los resultados en los dos casos anteriores revelaron que los tumores elevadamente malignos muestran un valor más elevado que los tumores poco malignos, benignos.
(2)-4 Seguimiento de los pacientes posquirúrgicos
El Paciente Canino 7 (Shih Tzu) acudió al hospital debido a un tumor intraoral y el 22 de marzo de 2007 se sometió a la extirpación. Después, se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0,70. Además, a base del diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, se diagnosticó al Paciente Canino 7 con epulis acantomatoso maligno. Este tipo de tumor a menudo reaparece si la escisión es insuficiente, a pesar de que raramente se produce metástasis a distancia. Por lo tanto, es importante si el tumor se puede escindir de forma completa mediante cirugía o no. De acuerdo con el seguimiento del 18 de mayo de 2007, la absorbancia a 450 nm disminuyó a 0,47. No se halló reaparición hasta agosto de 2007. Por lo tanto, se considera que el valor obtenido mediante el serodiagnóstico se hizo más bajo que el valor obtenido en el momento de la cirugía debido a que el tumor pudo escindirse de forma completa del Paciente Canino 7.
(2)-5 Diagnóstico de reaparición
El 8 de mayo de 2007 se sometió al Paciente Canino 8 (Husky) a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. En el momento de la cirugía se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0,11. El diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que las células epiteliales elevadamente atípicas proliferaron y formaron principalmente estructuras ductales, y por lo tanto este paciente se diagnosticó con adenocarcinoma de mama primario. Dado que muchas células cancerosas habían entrado ya en los vasos linfáticos en ese momento se dijo que el paciente tenía un riesgo elevado de reaparición o de metástasis en los ganglios linfáticos o en órganos a distancia. El 28 de junio de 2007, aproximadamente 1 mes y medio después de la cirugía, se encontró metástasis en el mismo sitio. El valor detectado mediante el serodiagnóstico aumentó a 0,12. Por lo tanto, se confirmó que el valor detectado mediante el serodiagnóstico era más elevado a finales de junio que a principios de mayo debido a que el tumor no pudo escindirse de forma completa o a que pudo haberse producido reaparición en el Paciente Canino 8.
El 24 de octubre de 2006 se sometió al Paciente Canino 9 (Sheltie) a la extirpación de un carcinoma ductal. El serodiagnóstico llevado a cabo en ese momento reveló que la absorbancia a 450 nm era de aproximadamente 0, casi no detectado. Aproximadamente 3 meses más tarde, el 31 de enero de 2007, este paciente acudió al hospital debido a la reaparición del cáncer y se sometió otra vez a la extirpación. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, muchas células cancerosas que tenían núcleos atípicos ovalados invadieron los vasos linfáticos y se observó metástasis en el ganglio linfático inguinal y así, el paciente se diagnosticó con carcinoma ductal (cáncer de mama) con probabilidad de metástasis a distancia. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm aumentó a 0,10. Por lo tanto, de forma similar a lo anterior, se reveló que el valor del serodiagnóstico aumentó 3 meses más tarde debido a que el tumor no había podido escindirse de forma completa o a que se había producido reaparición del tumor en el Paciente Canino 9.
(2)-6 Diagnóstico de metástasis
En febrero de 2003 el Paciente Canino 10 (Scottish Terrier), que experimentaba de forma repetida metástasis y reaparición, se diagnosticó con tumor mamario; en agosto de 2003 con melanoma maligno intraoral; en enero de 2005 con melanoma maligno del labio y el 13 de abril de 2005 con melanoma intraoral, todos los cuales se escindieron mediante cirugía. Este paciente acudió al hospital otra vez el 17 de diciembre de 2006 para el seguimiento tras la recurrencia del melanoma intraoral de abril de 2005, y se llevó a cabo el serodiagnóstico en ese momento para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0,39. Medio año más tarde, el 20 de junio de 2007, el paciente acudió otra vez al hospital debido a la hipertrofia de los ganglios linfáticos cervicales y malares. En el caso de los linfomas, se observa de forma sistemática la hipertrofia de los ganglios linfáticos. Debido a que el Paciente Canino 10 tenía sólo dos ganglios linfáticos inflamados, este paciente se diagnosticó de forma clínica con probable linfoma metastásico. El diagnóstico de acuerdo con la presente invención también reveló que era un tumor que había metastatizado a partir del tumor que existía previamente en este paciente, dado que la absorbancia a 450 nm aumentó enormemente hasta 0,80.
El 11 de marzo de 2006 el Paciente Canino 11 (Shiba Inu) se sometió a la extirpación de un melanoma maligno oral en el labio derecho. Este paciente tiene una historia de tratamiento con fármaco antineoplásico (ciclofosfamida) desde el 10 de junio hasta el 26 de septiembre de 2006, y había recibido desde el 23 de mayo de 2006 BIREMO S, que contiene germanio orgánico como principal componente. El 20 de marzo de 2007 este paciente se sometió a la extirpación de un tumor que se consideró que era metástasis procedente del tumor mencionado anteriormente, y se llevó a cabo el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm fue 0,06. La base del diagnóstico patológico en ese momento, utilizando el tejido extirpado, se diagnosticó al Paciente Canino 11 con melanoma maligno metastásico. El 27 de junio de 2007, tres meses tras la extirpación del melanoma metastásico, otra vez se produjo metástasis en este paciente. El tumor que se extirpó el 20 de marzo de 2007 estaba presente en la parte cervical derecha, y esta vez el tumor apareció en el lado contrario. Al igual que la forma del tumor, se formó una masa negra de forma similar al tumor previo. El tumor, que tenía el tamaño de 3,1 x 3,2 x 0,8 cm, también se diagnosticó de forma clínica como metástasis. Se llevó a cabo otra vez el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm aumentó a 0,19, lo que indicó que era un tumor metastásico.
(2)-7 Control de la terapia
El 19 de abril de 2007 el Paciente Canino 11 (Dachshund miniatura) se sometió a extirpación tumoral. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado el paciente padecía adenocarcinoma mamario combinado moderadamente maligno, con una elevada posibilidad de desarrollo invasivo y metastásico. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0,30. El 3 de junio de 2008, aproximadamente 1 año después de la extirpación, se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm disminuyó a 0,25. Aunque a simple vista no se encontró ningún tumor recurrente, para prevenir la reaparición se administró un fármaco antineoplásico (INTERCAT) una vez por semana durante 2 meses. Se llevó a cabo el serodiagnóstico a las 2, 4 y 6 semanas tras el inicio de la administración del fármaco antineoplásico para revelar que la absorbancia a 450 nm era de 0,25, 0,19 y 0,19, respectivamente. Estos resultados obtenidos en el Paciente Canino 11 confirmaron que el valor se hace más bajo que el valor detectado en un estado portador de tumor si los tumores se pueden eliminar de forma completa, así como que el valor no aumenta si el tratamiento con fármaco antineoplásico previene de forma satisfactoria la metástasis del cáncer, y de este modo se puede seguir el cambio en los pacientes tratados. Además, el diagnóstico de reaparición también se puede llevar a cabo como se muestra en el Paciente Canino 8, lo que confirma que también se puede hacer posible el control de la terapia.
(2)-8 Diagnóstico de malignidad del tumor recurrente
El 27 de abril de 2007 el Paciente Canino 12 (Chihuahua) se sometió a extirpación tumoral. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, este paciente padecía carcinoma ductal originado a partir del epitelio ductal mamario, es decir, cáncer de mama maligno. El 29 de junio de 2008, aproximadamente 1 año después de eso, se encontró otra vez tumor y se extirpó. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, aunque las células tumorales que se originaban a partir del epitelio ductal mamario formaban cavidades glandulares irregulares y se desarrollaron para reduplicarse hacia el lumen, las células constituyentes tenían un núcleo casi uniformemente ovalado y la atipia de las células era baja, y por lo tanto el tumor se diagnosticó como adenocarcinoma mamario benigno. El serodiagnóstico se llevó a cabo pero la absorbancia a 450 nm fue 0, no se detectó en absoluto.
Los resultados observados en los Pacientes Caninos 8 y 12 revelaron que el valor del serodiagnóstico no disminuye o se mantiene en los casos en donde el tumor recurrente es maligno, y no se detecta en los casos en donde el tumor es benigno.
(2) -9 Pronóstico de pacientes caninos portadores de tumor benigno
El 9 de octubre de 2007 el Paciente Canino 13 (Caniche Toy) se sometió a extirpación tumoral. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, las células epiteliales mamarias y las células mioepiteliales proliferaron para formar el tumor, pero ninguna de ellas mostró hallazgos malignos, y por lo tanto se diagnosticó como tumor mixto benigno. El serodiagnóstico mostró el resultado de que la absorbancia a 450 nm era de 0,13, se detectó ligeramente. Ocho meses después de eso, el 5 de junio de 2008, se recolectó otra vez una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. En ese momento no se encontró reaparición de forma clínica. Estos resultados confirmaron que, incluso en el caso en donde el tumor es benigno, la eliminación completa de los tumores da como resultado el valor disminuido en el serodiagnóstico, si se puede observar un valor detectable en el estado portador de cáncer, y así se puede lograr el pronóstico.
(3) Diagnóstico en gatos
A continuación, se diagnosticaron gatos portadores de cáncer y gatos sanos. Utilizando la proteína calmegina canina descrita anteriormente y el anticuerpo anti IgG de gato se midió el título de anticuerpos IgG de suero felino que reacciona de forma específica con el polipéptido, de la misma manera que se describe anteriormente. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG de gato conjugado con HRP (FRACCIÓN de IgG de CABRA para IgG de GATO CONJUGADO CON PEROXIDASA (MOLÉCULA COMPLETA): fabricado por CAPPEL RESERCH REAGENTS) diluido 8.000 veces con la solución de bloqueo.
El 17 de agosto de 2005 el Paciente Felino 1 (Chinchilla) se sometió a extirpación tumoral de un adenocarcinoma mamario. La absorbancia a 450 nm era de 0,22. En el Paciente Felino 2 (Himalayo), que experimentó extirpación de carcinoma ductal el 17 de octubre de 2006, la absorbancia a 450 nm era de 0,21. Por otro lado, no se detectó en absoluto absorbancia en gatos sanos.
Por lo tanto, de forma similar a los perros, se detectó valor de absorbancia en muestras procedentes de gatos que padecían cáncer, mientras que no se detectó en absoluto valor de absorbancia en ninguna de las muestras procedentes de gatos sanos. Por lo tanto, de forma similar a los perros, utilizando una proteína calmegina canina también pueden diagnosticarse mediante este método cánceres en gatos.
(4) Diagnóstico en seres humanos sanos
De la misma manera que se describe anteriormente, utilizando la proteína calmegina canina descrita anteriormente y el anticuerpo anti IgG humano anterior se midió el título de anticuerpos IgG de suero de ser humano sano que reaccionan de forma específica con la proteína. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG humanas conjugado con HRP (cabra anti IgG (H+L) humanas conjugado con HRP: fabricado por Zymed Laboratories) diluido 10.000 veces con la solución de bloqueo. Como control positivo se utilizó un antígeno de ovoalbúmina inmovilizado preparado inmovilizando sobre una fase sólida ovoalbúmina 50 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato. Como resultado, en el Ser Humano Sano 1, la absorbancia a 450 nm observada en un antígeno de ovoalbúmina fue de 0,25, mientras que la absorbancia a 450 nm observada en la proteína recombinante fue de 0,03, casi no detectado.
Ejemplo B-4: diagnóstico del cáncer utilizando proteína calmegina humana
Utilizando la proteína calmegina humana preparada en el Ejemplo B-2, se midió de la misma manera que en el Ejemplo B-3 el título de anticuerpos IgG de sueros de ser humano, canino y felino que reaccionaban con la proteína.
El diagnóstico se llevó a cabo utilizando suero de ser humano sano. De la misma manera que en el Ejemplo B-3 (4), se utilizó como control positivo antígeno de ovoalbúmina. Como resultado, se detectó valor de absorbancia en el caso en donde la ovoalbúmina estaba inmovilizada sobre una fase sólida, mientras que el valor de absorbancia casi no se detectó en el caso en donde estaba inmovilizada proteína calmegina humana sobre una fase sólida.
De forma similar, en perros y gatos sanos la absorbancia a 450 nm casi no se detectó en el caso en donde la proteína estaba inmovilizada en una fase sólida.
Por otro lado, el 21 de junio de 2007 el Paciente Canino 12 (Shih Tzu) se sometió a extirpación de un adenocarcinoma mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, el tejido de glándula mamaria contenía células invasivas elevadamente atípicas y creció para formar hiperplasia adenomatosa mostrando estructuras masivas grandes y pequeñas. Por lo tanto, este paciente se diagnosticó con tumor maligno. En este Paciente Canino 12, la absorbancia a 450 nm era de 0,70. El diagnóstico de la malignidad se llevó a cabo utilizando 310 muestras de suero que se habían diagnosticado como malignas a base del diagnóstico patológico. Como resultado, diagnosticando como maligna una muestra que presenta el doble del valor promedio de las muestras de canino sano, pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 171 muestras, es decir el 55,0 % de los casos malignos. Además, en el Paciente Felino 3 (raza mixta), que se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario el 3 de abril de 2007, la absorbancia a 450 nm fue de 0,38.
Los resultados descritos anteriormente indican que el diagnóstico puede lograrse de forma similar en seres humanos, perros y gatos, incluso utilizando una proteína calmegina humana.
Además, se sometieron al diagnóstico muestras de efusión pleural y de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal utilizando la proteína humana recombinante de la misma manera que la proteína canina recombinante. Como resultado, pudieron detectarse valores similares a los detectados en las muestras de suero, y por lo tanto el diagnóstico del cáncer pudo lograrse de forma satisfactoria.
Ejemplo B-5: diagnóstico del cáncer mediante medición del polipéptido antigénico (1)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína canina recombinante preparada en el Ejemplo B-2 para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. Mediante ELISA de tipo sándwich utilizando este anticuerpo policlonal, se llevó a cabo la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer. Utilizando el anticuerpo anti IgG de ratón se midió mediante ELISA de tipo sándwich la cantidad de proteína en el suero que reacciona de forma específica con el anticuerpo policlonal preparado específico para la proteína.
Como para la inmovilización de un anticuerpo primario sobre una fase sólida, se añadieron 100 pl/pocillo del antisuero de conejo diluido 20 veces con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc) y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Como para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de tampón de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón) (denominado en lo sucesivo en este documento como solución de bloqueo), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de suero procedente del cuerpo portador de cáncer diluido con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que transcurra la reacción. Como para el suero diluido, se preparó una dilución en serie con factor 10 que variaba de 10 a 1.000 veces. Tras lavar 3 veces los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (denominado en lo sucesivo en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de antisuero de ratón diluido 200 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de anticuerpo anti IgG de ratón conjugado con HRP (cabra anti ratón conjugado con HRP estabilizado: fabricado por PIERCE) como anticuerpo terciario, diluido 2.000 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (TMB (tetrametilbencidina) 1-Step Turbo, fabricada por PIERCE), y se dejó que transcurra la reacción de enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso, se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón), y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midió de la misma manera que se describe anteriormente una placa sobre la que no se inmovilizó antisuero de conejo y una placa con la que el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer no reaccionó.
Como resultado, se detectó el polipéptido en perros portadores de cáncer y en gatos que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno y similares, mientras que no se detectó el polipéptido en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por lo tanto, los cánceres también podrían diagnosticarse mediante este método en el que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido canino recombinante.
Ejemplo B-6: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (2)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína humana recombinante preparada en el Ejemplo B-2 para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. De la misma manera que en el Ejemplo B-5, utilizando este anticuerpo policlonal se llevó a cabo mediante ELISA de tipo sándwich la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer.
Como resultado, el polipéptido se detectó en perros y gatos portadores de cáncer que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno o similares, mientras que el polipéptido no se detectó en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por lo tanto, los cánceres también podrían diagnosticarse mediante este método en el que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido humano recombinante.
Ejemplo C-1: adquisición de una proteína antigénica de cáncer nueva mediante el método SEREX
(1) Preparación de la biblioteca de ADNc
Se preparó ARN total procedente de tejido testicular de un perro sano mediante el método de guanidina-fenolcloroformo, y se purificó el ARN poli(A) utilizando el Kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd ), en conformidad con el protocolo adjunto al kit.
Utilizando el ARNm obtenido (5 |jg) se sintetizó una fagoteca de ADNc de testículo de perro. La preparación de la fagoteca de ADNc se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc, kit de síntesis ZAP-ADNc y el kit de clonación ZAP-ADNc Gigapack III Gold (fabricados por STRATAGENE), en conformidad con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la fagoteca de ADNc preparada fue 1,3 x 106 ufp/ml.
(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero
Se llevó a cabo la inmunoexploración utilizando la fagoteca de ADNc obtenida de testículo de perro preparada como se describe anteriormente. De forma más particular, se infectaron con la biblioteca células hospedadoras E. coli (XL1-Blue MRF') de forma que debían aparecer 2.340 clones sobre una placa de agarosa NZY que tuviera el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm, y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para dejar al fago que forme placas. La placa se recubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar las proteínas, que se transfirieron así a la membrana. Posteriormente, la membrana se recubrió y empapó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM; pH 7,5) que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, seguido de su agitación a 4 °C durante una noche para suprimir reacciones no específicas. Se dejó que este filtro reaccionara con suero de paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.
Como con el suero del paciente canino descrito anteriormente, se utilizó suero recolectado procedente de pacientes caninos que padecen carcinoma de células escamosas. El suero se almacenó a -80 °C y se pretrató inmediatamente antes de su uso. El método de pretratamiento del suero fue como sigue. A saber, se infectaron células E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF') con fago A ZAP Express al que no se había insertado ningún gen extraño, y después se cultivaron en medio de placa NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente se añadió a la placa el tampón de NaHCO30,2 M, pH 8,3 que contenía NaCl 0,5 M y la placa se dejó que repose a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recolección del sobrenadante como un extracto de E. coli/fago. Después de eso, se dejó que fluya el extracto de E. coli/fago recolectado a través de una columna de NHS (fabricada por GE Healthcare BioScience), para inmovilizar en ella proteínas obtenidas a partir de E. coli/fago. Se dejó que el suero procedente de pacientes caninos fluyera a través de y reaccionara con esta columna de proteína inmovilizada, para eliminar anticuerpos adsorbidos en E. coli y/o el fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 % y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración.
La membrana sobre la que el suero así tratado y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron se lavó 4 veces con TBS-T (Tween 20 al 0,05 %/TBS), y se dejó que reaccionara con anti IgG de perro en cabra (cabra anti IgG-h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETh Yl Laboratories) como anticuerpo secundario, diluido 5.000 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la detección mediante la reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricado por Roche). Se recuperaron a partir de la placa de agarosa NZY que tenía el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm las colonias en las posiciones en donde se observó una reacción de coloración positiva y se disolvieron en 500 j l de tampón SM (NaCl 100 mM, MgClSO4 10 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %; pH 7,5). La exploración se repitió como una segunda y tercera exploración de la misma manera que se describe anteriormente, hasta que se obtuvo una única colonia positiva para la reacción de coloración, aislando de este modo un clon positivo tras la exploración de 30.940 clones de fagos reactivos con las IgG en el suero.
(3) Búsqueda de homología del gen del antígeno aislado
Para someter al único clon positivo aislado mediante el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo un procedimiento de conversión del vector de fago a un vector plasmídico. De forma más particular, se mezclaron 200 j l de una solución preparada para contener una E. coli hospedadora (XL1-Blue MRF') de forma que la absorbancia DO600 debía ser de 1,0, con 100 j l de una solución de fago purificado y adicionalmente con 1 j l de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se dejó que la reacción transcurra a 37 °C durante 15 minutos. Se añadieron a la mezcla de reacción 3 ml de medio LB y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido de la incubación inmediata en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. Después, la mezcla se centrifugó a 4 °C a 1.000 x g durante 15 minutos, y se recuperó el sobrenadante como una solución de fagémido. Posteriormente, se preparó una solución de 200 j l para contener una E. coli hospedadora de fagémido (SOLR) de forma que la absorbancia DO600 debía ser de 1,0 cuando se mezclara con 10 j l de una solución de fago purificado, y la reacción se dejó que transcurra a 37 °C durante 15 minutos. Después de eso, se sembraron en placa 50 j l de la mezcla de reacción en medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/ml), y se cultivó a 37 °C durante una noche. Se recuperó una única colonia de SOLR transformada y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 jg/m l) a 37 °C, seguido de la purificación del ADN plasmídico que tenía el inserto de interés utilizando el Kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen).
El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia entera del inserto mediante el método del cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en la SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en la SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia, se obtuvo la secuencia génica descrita en la SEQ ID NO: 25. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo la búsqueda de homología frente a genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido tenía el 99 % de homología (que se calculó solo en la región solapante) con el gen registrado CEP descrito en la SEQ ID NO: 41, en términos de secuencia de bases y de secuencia de aminoácidos, de forma que se determinó que el gen era el gen CEP. El factor homólogo humano obtenido del CEP canino fue el CEP humano (homología con el gen CEP descrito en la SEQ ID NO: 25: secuencia de bases, el 87 %; secuencia de aminoácidos, el 84 %). La secuencia de bases de la CEP humana se muestra en la SEQ ID NO: 27 y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra en la SEQ ID NO: 28.
(4) Análisis de la expresión en cada tejido
Se investigó mediante el método de RT-PCR (transcripción inversa-PCR) la expresión del gen, que se obtuvo mediante el método descrito anteriormente, en tejidos normales y diversas líneas celulares de perro y de ser humano. La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo como sigue. A saber, se extrajo el ARN total procedente de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen), en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó ADNc mediante el sistema de síntesis de la primera cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen), en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Del mismo modo que con los ADNc procedentes de tejidos normales de ser humano (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta), se utilizaron el ADNc Gene Pool (fabricado por Invitrogen), el ADNc QUICK-Clone (fabricado por CLONTECH) y la biblioteca de ADNc de inserto grande (fabricada por CLONTECH). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como sigue, utilizando cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 29 y 30) específicos para el gen obtenido. A saber, se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 0,25 pl de la muestra preparada mediante la reacción de transcripción inversa, cada uno de los cebadores anteriores 2 pM, cada uno de los dNTP 0,2 mM y polimerasa ExTaq 0,65 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd ), en un volumen total de 25 pl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos de gen descritos anteriormente fueron los que amplifican las regiones de las bases 4582 a 5124 de las secuencias de bases de las SEQ ID NO: 25 y 41 (gen CEP canino) y las bases 4610 a 5152 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 27 (gen CEP humano), y pueden utilizarse para la investigación de la expresión tanto del gen CEP canino como del gen CEP humano. Como control para la comparación, se usaron de forma simultánea cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 9 y 10) específicos para GAPDH. Como resultado, como se muestra en la Fig. 9, se observó en testículo una fuerte expresión del gen CEP canino entre los tejidos de perro normal y, por otro lado, se observó una fuerte expresión en la línea celular de cáncer de mama canina. La expresión del gen CEP humano se confirmó, como es el caso con el gen CEP canino, solo en testículo entre los tejidos normales humanos, pero, entre las líneas celulares de cáncer humanas, se detectó expresión en células de tumor cerebral, de leucemia y de cáncer de esófago y, especialmente, se observó una fuerte expresión en la línea celular de leucemia. Por lo tanto, también se confirmó que el gen CEP humano se expresa de forma específica en testículo y en células cancerosas.
En la Fig. 9, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen CEP y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control para la comparación.
Ejemplo C-2: preparación de los polipéptidos obtenidos de las CEP canina y humana
(1) Preparación de la proteína recombinante
A base del gen de la SEQ ID NO: 25 obtenido en el Ejemplo C-1, se preparó una proteína recombinante mediante el siguiente método. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 pl del vector que se preparó a partir de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo C-1 y que se sometió al análisis de secuencia, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción de BamHI y SalI (descritos en las SEQ ID NO: 31 y 32) 0,4 pM, los dNTP 0,2 mM y polimerasa PrimeSTAR HS 1,25 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 7 minutos utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente se obtuvo una región que codifica una región de aminoácidos (SEQ iD NO: 35) de los aminoácidos 1514 a 2339 de la SEQ ID NO: 26. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 %, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,5 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
De la misma manera, para obtener la región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 26 se llevó a cabo la PCR utilizando dos tipos de cebadores, descritos en las SEQ ID NO: 37 y 38. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 %, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 7,0 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
Además, para obtener la región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 42 se llevó a cabo la PCR utilizando dos tipos de cebadores, descritos en las SEC ID NO: 37 y 43. Tras la PCR, el ADN purificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 %, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 7,8 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
Cada uno de los fragmentos de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante y después de eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación por secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincide con la secuencia de interés. El plásmido que coincide con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción BamHI y SalI, y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con BamHI y SalI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Para la expresión en E. coli, se transformó BL21 (DE3) con este plásmido y se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés con IPTG 1 mM.
Además, a base del gen de la SEQ ID NO: 27, se preparó mediante el siguiente método una proteína recombinante del gen homólogo humano. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 pl del ADNc preparado en el Ejemplo C-1, cuya expresión en diversos tejidos/células pudo confirmarse mediante el método de RT-PCR, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción BamHI y SalI (descritos en las SEQ ID NO: 33 y 34) 0,4 pM, los dNTP 0,2 mM y la polimerasa PrimeSTAR HS 1,25 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), en un volumen total de 50 pl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 7 minutos, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente, se obtuvo una región que codifica una región de aminoácidos (SEQ ID NO: 36) de los aminoácidos 1513 a 2325 de la SEQ ID NO: 28. Tras la PCR, se sometió al ADN amplificado a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 %, y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,5 kpb utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
De la misma manera, para obtener la región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 28 se llevó a cabo la PCR utilizando dos tipos de cebadores, descritos en las SEC ID NO: 39 y 40. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 7,0 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
Cada uno de los fragmentos de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Con el producto de ligamiento resultante se transformó E. coli y después de eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincidía con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción BamHI y SalI, y se purificó utilizando el kit de extracción en gel QIAquick seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30a (fabricado por Novagen) que se había tratado con BamHI y SalI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Se transformó con el plásmido E. coli para expresión, BL21 (DE3) y se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés con IPTG 1 mM.
(2) Purificación de la proteína recombinante
Las células de E. coli recombinantes obtenidas anteriormente que expresaban una parte de la SEQ ID NO: 26 y una parte de la SEQ ID NO: 28, respectivamente, se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina (concentración final: 30 pg/ml) a 37 °C hasta que se alcanzó una absorbancia a 600 nm de aproximadamente 0,7, y después se añadió IPTG al mismo, de forma que su concentración final debía ser 1 mM, seguido de su cultivo a 30 °C durante 20 horas. Posteriormente, se recolectaron las células mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. El sedimento de las células se suspendió en solución salina tamponada con fosfato y, adicionalmente, para lavar las células se sometió a centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos.
Las células se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato y se trataron por ultrasonido en hielo. La solución de E. coli tratada con ultrasonido se centrifugó a 7.000 rpm durante 20 minutos para obtener el sobrenadante como la fracción soluble y el precipitado como la fracción insoluble. La fracción insoluble se suspendió en solución de Tritón X-100 al 4 % y la suspensión resultante se centrifugó a 7.000 rpm durante 20 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces y se llevó a cabo un procedimiento de eliminación de proteasas. El residuo se suspendió en tampón fosfato 100 Mm, Tris-HCl 10 mM, que contenía urea 8 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón) (en lo sucesivo en este documento denominado como solución de urea 8 M) y una solución cóctel inhibidora de proteasas, y la suspensión resultante se dejó reposar a 4 °C durante 15 horas para desnaturalizar proteínas.
Después de eso se centrifugó la suspensión a 7.000 rpm durante 20 minutos y la fracción soluble resultante se colocó en una columna quelante de níquel preparada mediante un método convencional (transportador: Chelating Sepharose (marca registrada) Fast Flow (Ge Health Care), volumen de columna: 5 ml, tampón de equilibrio: solución de urea 8 M), seguido de dejarlo reposar a 4 °C durante una noche. El sobrenadante se recuperó de este transportador de columna mediante centrifugación a 1.500 rpm durante 5 minutos, y el transportador de columna se suspendió en solución salina tamponada con fosfato seguido del relleno de la columna con la suspensión resultante. La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 5 volúmenes de columna de solución de urea 8 M, 10 volúmenes de columna de tampón acetato 0,1 M que contenía cloruro de sodio 0,5 M (pH 5,0) y tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 10 mM, y la elución se llevó a cabo de forma inmediata con un gradiente de densidad de 5 etapas de imidazol 100 mM-500 mM. En cada etapa de elución se recolectaron cinco volúmenes de columna de la fracción eluida. La elución de las proteínas de interés se confirmó mediante tinción de Coomassie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. A base del resultado se desalaron y concentraron las fracciones eluidas para obtener el material para ser la fase sólida para el diagnóstico.
De la misma manera se cultivaron las células de E. coli recombinantes que expresaban respectivamente las SEQ ID NO: 26, 28 y 42 de longitud completa, y se purificaron las proteínas de interés para obtener el material a ser la fase sólida para el diagnóstico.
Ejemplo C-3: diagnóstico del cáncer utilizando el polipéptido obtenido de CEP canina
(1) Diagnóstico del cáncer en perros
Se recolectaron muestras de sangre procedentes de 486 pacientes caninos en los que se encontraron tumores malignos y benignos, y de 6 perros sanos, y se separaron los sueros de las mismas. Utilizando el polipéptido parcial de la CEP canina (Se Q ID n O: 35; región de aminoácidos 1514 a 2339 de la SEQ ID NO: 26) preparado en el Ejemplo C-2 y el anticuerpo anti IgG de perro, se midió mediante ELISA el título de anticuerpo IgG del suero que reaccionaba de forma específica con el polipéptido.
De la misma manera que para la inmovilización de la proteína preparada sobre una fase sólida, se añadieron 100 pl/pocillo de una solución de la proteína recombinante diluida hasta 50 pg/ml con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc), y la placa se dejó reposar a 4 °C durante una noche. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de tampón bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón) (denominado en lo sucesivo en este documento como solución de bloqueo), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La muestra de suero se diluyó 500 veces con la solución de bloqueo y se añadieron a la placa 100 pl/pocillo del suero diluido, seguido de la agitación de la placa a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que transcurra la reacción. Tras 3 lavados de los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (en lo sucesivo denominado en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de anticuerpo anti IgG de perro conjugado con HRP (cabra anti IgG-h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 3.000 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que la reacción transcurra. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (tetrametilbencidina) (TMB 1-Step Turbo, fabricado por PIERCE), y se permitió que transcurra la reacción enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón) y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midió de la misma manera que anteriormente una placa sobre la que no se inmovilizó la proteína recombinante preparada y una placa con la que el suero procedente de un perro portador de cáncer no reaccionó.
Entre el total de 486 muestras utilizadas en el diagnóstico del cáncer descrito anteriormente, 311 muestras se diagnosticaron de forma definitiva como malignas mediante diagnóstico patológico utilizando el tejido tumoral extirpado.
De forma específica, las muestras se diagnosticaron como cáncer, tal como melanoma maligno; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándulas mamarias; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; carcinoma de células escamosas; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linterna de células medianas; linterna multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II); liomiosarcoma o similares.
Como se muestra en la Fig. 11, los sueros procedentes de estos perros portadores de cáncer mostraron un título de anticuerpos significativamente elevado frente a la proteína recombinante. Se reveló que, mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de canino sano, pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 197 muestras, es decir el 63,3% de los casos malignos. Los detalles de estas 197 muestras de cáncer son como sigue. Cabe señalar que el siguiente número de cada caso de cáncer es un total acumulativo, dado que algunas muestras contenían múltiples primarios.
Melanoma maligno, 8 casos; linfoma, 9 casos; feocromocitoma, 1 caso; inflamación supurante, 1 caso; tumor de células de la granulosa, 1 caso; carcinoma hepatocelular, 5 casos; angioma, 1 caso; tumor testicular maligno, 6 casos; tumor intraoral, 5 casos; adenocarcinoma perianal, 12 casos, osteosarcoma, 4 casos; fibrosarcoma, 8 casos; carcinoma ductal, 10 casos; condrosarcoma, 2 casos; adenocarcinoma mamario, 35 casos; adenocarcinoma mamario combinado, 24 casos; cáncer de pulmón, 2 casos; adenocarcinoma sebáceo, 2 casos; adenocarcinoma nasal, 2 casos; mastocitoma, 24 casos; tumor adrenomedular, 1 caso; liomiosarcoma, 1 caso; carcinoma de células escamosas, 4 casos; leucemia linfocítica crónica, 1 caso; sarcoma indiferenciado, 1 caso; tumor mixto maligno, 1 caso; tumor en el segmento posterior del lóbulo izquierdo del pulmón, 1 caso; tumor en la región infra axilar derecha, 1 caso; tumor en el codo de la pata delantera derecha, 1 caso; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales), 1 caso; melanoma maligno metastásico, 3 casos; melanoma maligno amelánico, 1 caso; adenocarcinoma del intestino grueso, 1 caso; plasmocitoma, 1 caso; sarcoma histiocítico, 1 caso; liposarcoma, 1 caso; sarcoma poco diferenciado, 1 caso; sarcoma sinovial, 1 caso; hemangiopericitoma maligno, 1 caso; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrinas, 3 casos; adenocarcinoma bronquial, 1 caso.
El método diagnóstico descrito anteriormente también se llevó a cabo utilizando muestras de efusión pleural y muestras de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero y, por lo tanto, se pudo lograr de forma satisfactoria el diagnóstico del cáncer.
Además, se confirmó que también pueden lograrse aplicando el método diagnóstico descrito anteriormente las estrategias diagnósticas tales como el diagnóstico de cánceres que existen en una parte invisible del cuerpo, la evaluación de la fase y el grado del cáncer, el seguimiento de los pacientes postquirúrgicos, el diagnóstico de reaparición y metástasis, y similares. Los siguientes son varios de los ejemplos prácticos del diagnóstico detallado mostrado en la Fig. 12.
(2)-1 Diagnóstico de tumores invisibles
El 7 de junio de 2007 no se encontró ningún tumor en el Paciente Canino 1 (Cobrador de pelo liso). No obstante aproximadamente 20 días más tarde, el 24 de junio de 2007, se encontró un tumor pedunculado con un diámetro de 2 mm en la encía en la raíz del colmillo. El tumor se ligó en su parte pedunculada y se escindió el día que se lo encontró. La absorbancia a 450 nm observada antes de que el tumor se haga visible a simple vista fue de 0,41, lo que era significativamente elevado y no muy distinta de la absorbancia en el momento del hallazgo del tumor, 0,43. El resultado indica que, mediante el método de la presente invención, es posible diagnosticar cánceres incluso en una parte invisible tal como una parte intraperitoneal.
La elevación del valor se observó antes de que el tumor se haga visible a simple vista, lo que se considera que fue un signo del desarrollo tumoral. Por lo tanto, el método de la presente invención es útil en los exámenes médicos tales como la revisión de salud periódica.
Dos semanas después de la escisión tumoral se exploró otra vez al Paciente Canino 1 mediante serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm se redujo enormemente hasta 0,06. Por lo tanto, también se confirmó que el tumor que expresa antígeno del cáncer que había provocado el título aumentado de anticuerpos se eliminó de forma completa (véase (2)-4, Seguimiento de pacientes postquirúrgicos).
(2)-2 Evaluación de la fase de la evolución del cáncer
La fase de la evolución del cáncer se determina a base del tamaño o profundidad del tumor, de cuanta influencia ejerce el tumor sobre los tejidos circundantes, de si el tumor produce metástasis o no, y similares. Se reveló en el presente documento que el valor detectado es más elevado que antes de que se produzca la metástasis, es decir, el cáncer ha avanzado. El siguiente es otro ejemplo de una evaluación de la fase de un determinado caso de cáncer que recibió terapia con fármaco antineoplásico.
El 21 de febrero de 2007 el Paciente Canino 2 (Dachshund miniatura) acudió al hospital principalmente con quejas de náuseas y de extenuación, y se encontraron dos tumores masivos en la cavidad abdominal. El 23 de febrero de 2007 este paciente se sometió a extirpación tumoral. El riñón derecho inflamado pesaba 433 g. El ganglio linfático vecino estaba bien vascularizado y pesaba 42 g. A base del diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, el paciente se diagnosticó con linfoma maligno multicéntrico. Se dijo que había una probabilidad de que las células tumorales se propagaran en otros órganos en la cavidad abdominal, dado que se observó una propagación diseminada de células tumorales en el tejido adiposo. El 1 de marzo de 2007 se inició la administración de forma posquirúrgica de fármaco antineoplásico (Oncovín) y se llevó a cabo 3 veces el serodiagnóstico, es decir, en el día que se inició la administración, y a los 2 y 3 meses después de eso. Como resultado, la absorbancia a 450 nm fue de 0,15, 0,15, y 0,07, respectivamente. El valor había aumentado de forma gradual desde el inicio de la administración, lo que confirmó que el fármaco antineoplásico tuvo efecto. Por lo tanto se confirmó que podía inhibirse la evolución del cáncer. Por consiguiente, los resultados en el Paciente Canino 2 confirmaron que también puede evaluarse la fase de la evolución del cáncer. Además, se confirmó que también puede evaluarse como se describe anteriormente el efecto de la terapia con fármaco antineoplásico.
(2)-3 Evaluación del grado de la malignidad del cáncer
Los basaliomas incluyen el tipo maligno y el tipo benigno. Desde hace un tiempo, de acuerdo con la nueva clasificación de la OMS, los basaliomas malignos se llaman carcinomas de células basales y los basaliomas benignos se llaman tricoblastomas.
El Paciente Canino 3 (Beagle) se diagnosticó con carcinoma de células basales (maligno). En el momento de la cirugía se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,14. Por otro lado, en el Paciente Canino 4 (raza mixta), diagnosticado con tricoblastoma (benigno), el serodiagnóstico llevado a cabo en el momento de la cirugía reveló que la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. Por lo tanto, incluso en el caso de los mismos basaliomas, se pueden diagnosticar de forma distintiva el carcinoma de células basales maligno y el tricoblastoma benigno.
El próximo ejemplo es en tumores de glándula mamaria. Los tumores de glándula mamaria incluyen tumores malignos tales como el adenocarcinoma mamario y el tumor mixto maligno de glándula mamaria, y tumores mamarios benignos que no muestran síntomas de malignidad. El 17 de mayo de 2006 el Paciente Canino 5 (Yorkie) se sometió a la extirpación de un tumor mixto maligno de glándula mamaria y de adenocarcinoma mamario. En general, la escisión completa de los tumores mixtos en la glándula mamaria es fácil debido a que son poco invasivos de los tejidos circundantes incluso si son malignos y, por lo tanto, habitualmente el transcurso postquirúrgico de los pacientes no tiene incidencias. Sin embargo, se había diagnosticado al Paciente Canino 5 con tumor elevadamente maligno, debido a que el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que algunos componentes de la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 5 mostraban una naturaleza invasiva. Por otro lado, el adenocarcinoma mamario es un tumor altamente invasivo que a menudo reaparece y produce metástasis. Aunque en la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 5 no se observó invasión de células tumorales, se señaló que los componentes elevadamente malignos posiblemente proliferaron a otras regiones fuera de la muestra de ensayo. Por lo tanto, los hallazgos en el diagnóstico patológico muestran claramente que el Paciente Canino 5 padecía cáncer mamario elevadamente maligno. Durante la cirugía se recolectó una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0,57. Por otro lado, el 28 de enero de 2007 el Paciente Canino 6 (Yorkshire Terrier) se sometió a la extirpación de un tumor mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, la atipia de las células era baja y por lo tanto el Paciente Canino 6 se diagnosticó con adenoma mamario benigno, sin hallazgos de malignidad. Durante la cirugía se recolectó una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico, para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0. Los resultados en los dos casos anteriores revelaron que los tumores elevadamente malignos muestran un valor más elevado que los tumores benignos, poco malignos.
(2)-4 Seguimiento de los pacientes posquirúrgicos
En agosto de 2003 y el 9 de agosto de 2009 el Paciente Canino 7 (raza mixta) se sometió a la extirpación de un adenoma perianal. El tumor extirpado el 9 de agosto de 2006 se diagnosticó de forma clínica como reaparición, debido a que en el mismo sitio apareció de nuevo un tumor similar. El diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado la segunda vez reveló que las células tumorales eran elevadamente invasivas y atípicas, mostrando anisocariosis y discariosis, y también que se observaba una gran cantidad de núcleos en división. Por lo tanto, se diagnosticó al paciente con tumor maligno. De acuerdo con la patología diagnóstica, es necesario prestar atención a la reaparición local o a la metástasis, las cuales podrían producirse otra vez. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era de 0,43. El 19 de diciembre de 2006, aproximadamente 4 meses después de la cirugía, en el transcurso del seguimiento se llevó a cabo otra vez el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm disminuyó a 0,32. No se halló ni reaparición ni metástasis hasta agosto de 2007. Por lo tanto, se considera que en el Paciente Canino 7 el valor obtenido en el serodiagnóstico se hizo más bajo que el obtenido en el momento de la cirugía debido a que el tumor pudo extirparse de forma completa.
(2)-5 Diagnóstico de reaparición
El 8 de mayo de 2007 el Paciente Canino 8 (Husky) se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. De acuerdo con el serodiagnóstico llevado a cabo en el momento de la cirugía, la absorbancia a 450 nm era de 0,09. El diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que proliferaron células epiteliales elevadamente atípicas y formaban principalmente estructuras ductales y, así, este paciente se diagnosticó con adenocarcinoma de mama primario. Se dijo que el paciente estaba en elevado riesgo de reaparición o metástasis en los ganglios linfáticos u órganos a distancia, dado que en ese momento ya habían entrado muchas células cancerosas en los vasos linfáticos. El 28 de junio de 2007, aproximadamente 1 mes y medio después de la cirugía, se encontró metástasis en el mismo sitio. En este momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que el valor aumentó a 0,10. Por lo tanto, se confirmó que en el Paciente Canino 8 el valor detectado mediante serodiagnóstico era más elevado hacia finales de junio que a principios de mayo debido que el tumor no había podido escindirse de forma completa o a que se habría producido recurrencia.
El 24 de octubre de 2006 el Paciente Canino 9 (Sheltie) se sometió a extirpación de un carcinoma ductal. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era de 0,02. Aproximadamente 3 meses después, el 31 de enero de 2007, este paciente acudió al hospital debido a la reaparición del cáncer, y se sometió otra vez a la extirpación. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, muchas células cancerosas que tenían núcleos ovalados atípicos invadieron los vasos linfáticos y se observó metástasis en el ganglio linfático inguinal y, así, el paciente se diagnosticó con carcinoma ductal (cáncer de mama) con una probabilidad de metástasis a distancia. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm aumentó a 0,09. Por lo tanto, de forma similar a lo anterior, se confirmó que en el Paciente Canino 9 el valor del serodiagnóstico aumentó 3 meses más tarde debido a que el tumor no pudo escindirse de forma completa o a que se habría producido reaparición del tumor.
(2)-6 Diagnóstico de metástasis
El Paciente Canino 10 (Scottish Terrier), que experimentaba de forma repetida metástasis y reaparición, se diagnosticó en febrero de 2003 con tumor mamario; en agosto de 2003 con melanoma maligno intraoral; en enero de 2005 con melanoma maligno del labio y el 13 de abril de 2005 con melanoma intraoral, todos los cuales se escindieron mediante cirugía. Este paciente acudió al hospital otra vez el 17 de diciembre de 2006 para el seguimiento tras la reaparición del melanoma intraoral en abril de 2005, y en ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era de 0,42. El 20 de junio de 2007, medio año más tarde, el paciente acudió otra vez al hospital debido a la hipertrofia de los ganglios linfáticos cervicales y malares. En el caso de los linfomas la hipertrofia de los ganglios linfáticos se observa de forma sistemática. Debido a que el Paciente Canino 10 tenía sólo dos ganglios linfáticos inflamados, este paciente se diagnosticó de forma clínica con probable linfoma metastásico. El diagnóstico de acuerdo con la presente invención también reveló que era un tumor metastásico procedente de uno que había existido previamente en este paciente, dado que la absorbancia a 450 nm aumentó enormemente a 0,91.
(2)-7 Control de la terapia
El 27 de julio de 2007 el Paciente Canino 12 (raza mixta) se sometió a extirpación tumoral. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que el cáncer de mama creció de forma continua en los ductos mamarios. Por lo tanto, se diagnosticó a este paciente con carcinoma ductal. De acuerdo con el serodiagnóstico llevado a cabo en ese momento, la absorbancia a 450 nm era de 0,24. Hasta ese momento, es decir 13 meses después de la extirpación, no se había encontrado reaparición del cáncer. El serodiagnóstico se llevó a cabo otra vez el 3 de septiembre de 2007, aproximadamente 1 mes después de la extirpación; el 12 de octubre de 2007, dos meses después de la extirpación y el 1 de junio de 2008, 10 meses después de la extirpación. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era de 0,18, 0,18 y 0,12, respectivamente.
Estos resultados obtenidos en el Paciente Canino 12 confirmaron que los valores se hacen más bajos que los detectados en un estado portador de cáncer si los tumores pueden eliminarse de forma completa, así como que el valor no aumenta a menos que reaparezca el cáncer y, por lo tanto, puede seguirse el cambio en los pacientes tratados. Además, también puede llevarse a cabo el diagnóstico de reaparición como se muestra en el Paciente Canino 8, lo que confirma que también puede hacerse posible el control de la terapia.
(2)-8 Diagnóstico de la malignidad del tumor recurrente
El 1 de mayo de 2005 el Paciente Canino 13 (Cobrador dorado) se sometió a extirpación tumoral. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que en este paciente el tumor era una lesión neoplásica maligna originada a partir del epitelio ductal mamario, es decir, carcinoma ductal mamario maligno y carcinoma papilar maligno que crecían de forma continua a través de los ductos mamarios. El 28 de junio de 2008, aproximadamente 3 años después de eso, se encontró otra vez el tumor y, por lo tanto, se llevó a cabo la extirpación. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que no se observaba bajo la piel alrededor de las suturas quirúrgicas nada excepto infiltración grave de células inflamatorias tales como neutrófilos, macrófagos, células plasmáticas y similares, lo que se consideró que era la cicatriz quirúrgica previa y, por lo tanto, se diagnosticó que el paciente no tenía lesiones neoplásicas. De acuerdo con el serodiagnóstico llevado a cabo en ese momento, la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. Los resultados observados en los pacientes caninos 8, 9 y 13 indicaron que el valor del serodiagnóstico no aumenta o se mantiene en los casos en donde el tumor recurrente es maligno, y no se detecta en los casos en donde el tumor es benigno.
(2)-9 Pronóstico de un paciente canino portador de tumor benigno
El 9 de octubre de 2007 el Paciente Canino 14 (Caniche Toy) se sometió a extirpación tumoral. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que para formar el tumor proliferaron tanto células epiteliales mamarias como células mioepiteliales, pero que ninguna de ellas mostraba hallazgo de malignidad y, por lo tanto, este paciente se diagnosticó con tumor mixto benigno. De acuerdo con el serodiagnóstico llevado a cabo en ese momento, la absorbancia a 450 nm era de 0,05, casi no se detectó. Ocho meses tras eso, el 5 de junio de 2008, se recolectó otra vez una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. En ese momento no se encontró reaparición de forma clínica. Estos resultados indicaron que, incluso en el caso en donde el tumor es benigno, la extracción completa del tumor da como resultado el valor reducido del serodiagnóstico si se puede observar un valor detectable en el estado portador de cáncer y, por consiguiente, se puede lograr el pronóstico.
(3) Diagnóstico en gatos
A continuación se diagnosticaron gatos portadores de cáncer y gatos sanos. Utilizando el polipéptido parcial del CEP canino descrito anteriormente y el anticuerpo anti IgG de gato, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de suero de felino que reacciona de forma específica con el polipéptido. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG de gato conjugado con HRP (FRACCIÓN IgG de CABRA para IgG de GATO CONJUGADO A PEROXIDASA (MOLÉCULA COMPLETA): fabricada por CAPPEL RESERCH REAGENTS) diluido 8.000 veces con la solución de bloqueo.
El 17 de agosto de 2005 el Paciente Felino 1 (Chinchilla) se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. La absorbancia a 450 nm era de 0,48. En el Paciente Felino 2 (Himalayo), que había experimentado la extirpación de un carcinoma ductal el 17 de octubre de 2006, la absorbancia a 450 nm era de 0,18. Por otro lado, no se detectó la absorbancia en absoluto en gatos sanos.
Por lo tanto, de forma similar a los perros, en muestras procedentes de gatos que padecían cáncer se detectó absorbancia, mientras que no se detectó en absoluto valor de absorbancia las muestras procedentes de gatos sanos. Por lo tanto, de forma similar a los perros, mediante este método que utiliza un polipéptido obtenido del CEP canino también pueden detectarse los cánceres en los gatos.
(4) Diagnóstico en seres humanos sanos
Utilizando el polipéptido parcial del CEP canino descrito anteriormente y el anticuerpo anti IgG de ser humano anterior, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de suero de ser humano sano que reacciona de forma específica con el polipéptido. Como anticuerpo secundario se utilizó un anticuerpo anti IgG de ser humano conjugado con HRP (cabra anti IgG (H+L) de ser humano conjugado con HRP: fabricado por Zymed Laboratories) diluido 10.000 veces con la solución de bloqueo. Como control positivo se utilizó un antígeno de ovoalbúmina inmovilizado preparado inmovilizando sobre una fase sólida ovoalbúmina 50 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato. Como resultado, en el Ser Humano Sano 1 la absorbancia observada a 450 nm en un antígeno de ovoalbúmina era de 0,25, mientras que la absorbancia a 450 nm observada en la proteína recombinante era de 0,02, casi no detectada. De forma similar, en el Ser Humano Sano 2 la absorbancia observada a 450 nm en un antígeno de ovoalbúmina era de 0,18, mientras que la absorbancia observada a 450 nm en la proteína recombinante era de 0,03, casi no detectada.
Adicionalmente, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente, utilizando un CEP canino de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 26 preparada en el Ejemplo C-2. Como resultado, el diagnóstico se puede lograr de forma similar en seres humanos, perros y gatos.
Adicionalmente, utilizando el CEP canino de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 42 preparado en el Ejemplo C-2 se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente. Como resultado, el diagnóstico se puede lograr de forma similar en seres humanos, perros y gatos.
Ejemplo C-4: diagnóstico del cáncer utilizando el polipéptido obtenido del CEP humano
Utilizando el polipéptido parcial del CEP humano (SEQ ID NO: 36; región de los aminoácidos 1513 a 2325 de la SEQ ID NO: 28) preparado en el Ejemplo C-2, se midió de la misma manera que en el Ejemplo C-3 el título de anticuerpos IgG de sueros de ser humano, canino y felino que reaccionan con el polipéptido.
El diagnóstico se llevó a cabo utilizando suero de ser humano sano. De la misma manera que en el Ejemplo C-3 (4), se utilizó como control positivo antígeno de ovoalbúmina. Como resultado, se detectó valor de absorbancia en el caso en donde la ovoalbúmina estaba inmovilizada en una fase sólida, mientras que el valor de absorbancia casi no se detectó en el caso en donde estaba inmovilizado en una fase sólida el polipéptido parcial del CEP humano.
De forma similar, en perros y gatos sanos la absorbancia a 450 nm casi no se detectó en el caso en donde el polipéptido estaba inmovilizado en una fase sólida.
Por otro lado, el 21 de junio de 2007 el Paciente Canino 11 (Shih Tzu) se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, el tejido de la glándula mamaria contenía células invasivas elevadamente atípicas y creció para formar hiperplasia adenomatosa que mostraba estructuras masivas, grandes y pequeñas. Por consiguiente este paciente se diagnosticó con tumor maligno. En el Paciente Canino 11 la absorbancia a 450 nm era de 0,33. El diagnóstico de malignidad se llevó a cabo utilizando 310 muestras de suero adicionales que se habían diagnosticado como malignas mediante diagnóstico patológico. Como resultado, mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de caninos sanos, pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 185 muestras, es decir el 59,5 % de los casos malignos.
Además, en el Paciente Felino 3 (raza mixta) que se sometió a extirpación de un adenocarcinoma mamario el 3 de abril de 2007, la absorbancia a 450 nm era de 0,15.
Los resultados descritos anteriormente indicaron que utilizando un polipéptido obtenido del CEP humano también se puede llevar a cabo de forma similar el diagnóstico en seres humanos, perros y gatos.
Adicionalmente, se sometieron al diagnóstico muestras de efusión pleural y de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal, utilizando la proteína humana recombinante de la misma manera que la proteína canina recombinante. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero y por consiguiente se pudo lograr de forma satisfactoria el diagnóstico del cáncer.
Además, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describió anteriormente, utilizando un CEP humano de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 28 preparada en el Ejemplo C-2. Como resultado, también pudo llevarse a cabo el diagnóstico de forma similar en seres humanos, perros y gatos.
Ejemplo C-5: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (1)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína canina recombinante que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 35 preparada en el Ejemplo C-2, para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. Utilizando este anticuerpo policlonal, se llevó a cabo mediante ELISA de tipo sándwich la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer. Utilizando el anticuerpo anti IgG de ratón se midió mediante ELISA de tipo sándwich la cantidad de la proteína en el suero que reacciona de forma específica con el anticuerpo policlonal preparado específico para la proteína.
Del mismo modo que para la inmovilización de un anticuerpo primario en una fase sólida, se añadieron 100 pl/pocillo del antisuero de conejo diluido 20 veces con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de tampón bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón) (denominada en lo sucesivo en este documento como solución de bloqueo), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de suero procedente de cuerpo portador de cáncer diluido con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que transcurra la reacción. Del mismo modo que para el suero diluido, se preparó una dilución en serie con factor 10 que variaba de 10 a 1.000 veces. Tras lavar 3 veces los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (denominado en lo sucesivo en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de antisuero de ratón diluido 200 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de anticuerpo de IgG de ratón conjugado con HRP (cabra anti ratón conjugado con HRP estabilizado: fabricado por PIERCE) diluido 2.000 veces con la solución de bloqueo como anticuerpo terciario, y se agitó la placa a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (TMB (tetrametilbencidina) 1-Step Turbo, fabricado por PIERCE), y se permitió que transcurra la reacción enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón), y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midieron de la misma manera que se describe anteriormente una placa sobre la que no se inmovilizó antisuero de conejo y una placa con la que no reaccionó el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer.
Como resultado, se detectó el polipéptido en perros y gatos portadores de cáncer que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno y similares, mientras que no se detectó el polipéptido en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por lo tanto, también pudieron diagnosticarse cánceres mediante este método en el que se detectó el polipéptido antigénico con un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno el polipéptido canino recombinante.
Además, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente, utilizando un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno el CEP canino de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 26 preparada en el Ejemplo C-2.
Como resultado, mediante este método en que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno un CEP canino de longitud completa, también pudieron diagnosticarse cánceres en perros y gatos.
Además, el diagnóstico se llevó a cabo de la misma manera que se describe anteriormente, utilizando un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno el CEP canino de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 42 preparada en el Ejemplo C-2.
Como resultado, también pudieron diagnosticarse cánceres en perros y gatos mediante este método, en que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo que se había preparado utilizando como inmunógeno un CEP canino de longitud completa.
Ejemplo C-6: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (2)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína humana recombinante que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 36 preparada en el Ejemplo C-2 para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. De la misma manera que en el Ejemplo C-5, mediante ELISA de tipo sándwich utilizando este anticuerpo policlonal, se llevó a cabo la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer.
Como resultado, el polipéptido se detectó en perros y gatos portadores de cáncer que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno o similares, mientras que el polipéptido no se detectó en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por consiguiente, también pudieron diagnosticarse cánceres mediante este método en el que se detectó el polipéptido antigénico con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido humano recombinante.
Además, el diagnóstico se llevó a cabo de la misma manera que se describe anteriormente, utilizando un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno el CEP humano de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la s Eq ID NO: 28 preparada en el Ejemplo C-2.
Como resultado, también pudieron diagnosticarse cánceres en perros y gatos mediante este método en el que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno un CEP humano de longitud completa.
Ejemplo D-1: adquisición de una proteína antigénica de cáncer nueva mediante el método SEREX
(1) Preparación de la biblioteca de ADNc
Se preparó ARN total procedente de tejido testicular de un perro sano mediante el método del guanidina-fenolcloroformo y se purificó el ARN poli(A) utilizando el kit de purificación de ARNm Oligotex-dT30 (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) en conformidad con el protocolo adjunto al kit.
Utilizando el ARNm obtenido (5 |jg) se sintetizó una fagoteca de ADNc de testículo de perro. La preparación de la fagoteca de ADNc se llevó a cabo utilizando el kit de síntesis de ADNc, el kit de síntesis de ZAP-ADNc y el kit de clonación de ZAP-ADNc Gigapack III Gold (fabricados por STRATAGENE), en conformidad con los protocolos adjuntos a los kits. El tamaño de la fagoteca de ADNc preparada era de 1,3 x 106 ufp/ml.
(2) Exploración de la biblioteca de ADNc con suero
Se llevó a cabo la inmunoexploración utilizando la fagoteca de ADNc obtenida de testículo de perro preparada como se describe anteriormente. De forma más particular, se infectaron con la biblioteca células E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF'), de forma que debían aparecer 2.340 clones sobre una placa de agarosa NZY que tuvieran el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm y se cultivaron a 42 °C durante 3 a 4 horas para dejar que los fagos formen placas. La placa se cubrió con una membrana de nitrocelulosa (Hybond C Extra: fabricada por GE Healthcare Bio-Science) impregnada con IPTG (isopropil-p-D-tiogalactósido) a 37 °C durante 4 horas para inducir y expresar proteínas, que se transfectaron así a la membrana. Posteriormente, la membrana se cubrió y empapó en TBS (Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM; pH 7,5) que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, seguido de la agitación a 4 °C durante una noche para suprimir reacciones no específicas. Se permitió que este filtro reaccionara con suero de paciente canino diluido 500 veces a temperatura ambiente durante 2 a 3 horas.
Al igual que el suero del paciente canino descrito anteriormente, se utilizó suero recolectado de pacientes caninos que padecían cáncer de mama. Este suero se almacenó a -80 °C y se pretrató inmediatamente antes de su uso. El método del pretratamiento del suero fue como sigue. A saber, se infectaron células E. coli hospedadoras (XL1-Blue MRF') con fago A ZAP Express en el que no se había insertado un gen extraño, y después se cultivaron en medio de placa NZY a 37 °C durante una noche. Posteriormente, se añadió a la placa el tampón de NaHCO30,2 M, pH 8,3, que contenía NaCl 0,5 M, y la placa se dejó reposar a 4 °C durante 15 horas, seguido de la recolección del sobrenadante como un extracto E. coli/fago. Después de eso se dejó que fluya el extracto de E. coli/fago recolectado a través de una columna NHS (fabricada por GE Healthcare BioScience) para inmovilizar en ella proteínas obtenidas de E. coli/fago. Se dejó que el suero procedente de los pacientes caninos fluyera a través y reaccionara con esta columna de proteína inmovilizada para eliminar anticuerpos adsorbidos en E. coli y/o el fago. La fracción de suero que pasó a través de la columna se diluyó 500 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, y el diluyente resultante se utilizó como el material para la inmunoexploración.
La membrana sobre la que el suero así tratado y la proteína de fusión descrita anteriormente se transfirieron se lavó 4 veces con TBS-T (Tween 20 al 0,05 %/TBS) y se permitió que reaccionara con cabra anti IgG de perro (cabra anti IgG-h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) como anticuerpo secundario diluido 5.000 veces con TBS que contenía leche en polvo desnatada al 0,5 %, a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de la detección mediante reacción de coloración enzimática utilizando la solución de reacción NBT/BCIP (fabricada por Roche). Las colonias en las posiciones en donde se observó una reacción de coloración positiva se recuperaron a partir de la placa de agarosa NZY que tenía el tamaño de 90 mm de diámetro x 15 mm, y se disolvieron en 500 pl de tampón SM (NaCl 100 mM, MgClSO4 10 mM, Tris-HCl 50 mM, gelatina al 0,01 %; pH 7,5). La exploración se repitió como una segunda y tercera exploración de la misma manera que se describe anteriormente, hasta que se obtuvo una única colonia positiva para la reacción de coloración, aislando de este modo un clon positivo tras la exploración de 30.940 clones de fagos reactivos con las IgG en el suero.
(3) Búsqueda de homología del gen del antígeno aislado
Para someter al único clon positivo aislado mediante el método descrito anteriormente a un análisis de secuencia de bases, se llevó a cabo un procedimiento de conversión del vector de fago a un vector plasmídico. De forma más particular, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener una E. coli hospedadora (XL1-Blue MRF') de forma que la absorbancia a DO600 debía ser de 1,0, con 100 pl de una solución de fago purificado y además con 1 pl de fago auxiliar ExAssist (fabricado por STRATAGENE), y se dejó que la reacción transcurriera a 37 °C durante 15 minutos. Se añadieron a la mezcla de reacción 3 ml de medio LB y se cultivó la mezcla a 37 °C durante 2,5 a 3 horas, seguido de la inmediata incubación en un baño de agua a 70 °C durante 20 minutos. Después, la mezcla se centrifugó a 4 °C a 1.000 x g durante 15 minutos y el sobrenadante se recuperó como una solución de fagémido. Posteriormente, se mezclaron 200 pl de una solución preparada para contener una E. coli hospedadora de fagémido (SOLR) de forma que la absorbancia a DO600 debía ser de 1,0 cuando se mezclara con 10 pl de una solución de fago purificado, y se dejó que la reacción transcurriera a 37 °C durante 15 minutos. Después de eso, se sembraron en placas 50 pl de la mezcla de reacción en medio LB agar que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) y se cultivó a 37 °C durante una noche. Se recuperó una única colonia de SOLR transformada y se cultivó en medio LB que contenía ampicilina (concentración final: 50 pg/ml) a 37 °C, seguido de la purificación del ADN plasmídico que tenía el inserto de interés, utilizando el Kit QIAGEN plasmid Miniprep (fabricado por Qiagen).
El plásmido purificado se sometió a un análisis de la secuencia entera del inserto mediante el método del cebador en avance utilizando el cebador T3 descrito en la SEQ ID NO: 5 y el cebador T7 descrito en la SEQ ID NO: 6. Mediante este análisis de secuencia se obtuvo la secuencia génica descrita en la SEQ ID NO: 44. Utilizando la secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos de este gen, se llevó a cabo la búsqueda de homología frente a genes conocidos utilizando el programa de búsqueda de homología BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Como resultado, se reveló que el gen obtenido es el gen TRIP11. El factor homólogo humano de TRIP11 era el TRIP11 humano (homología: secuencia de bases, el 88 %; secuencia de aminoácidos, el 86 %). La secuencia de bases del TRIP11 humano se muestra en la SEQ ID NO: 46 y la secuencia de aminoácidos del mismo se muestra en la SEQ ID NO: 47.
(4) Análisis de la expresión en cada tejido
Se investigó mediante el método de RT-PCR (transcripción inversa-PCR) la expresión en tejidos normales y en diversas líneas celulares de perro y de ser humano del gen que se obtuvo mediante el método descrito anteriormente. La reacción de transcripción inversa se llevó a cabo como sigue. A saber, se extrajo ARN total procedente de 50 a 100 mg de cada tejido o de 5 a 10 x 106 células de cada línea celular utilizando reactivo TRIZOL (fabricado por Invitrogen) en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Utilizando este ARN total, se sintetizó ADNc mediante el sistema de síntesis de la primera cadena Superscript para RT-PCR (fabricado por Invitrogen), en conformidad con el protocolo adjunto al kit. Del mismo modo que para los ADNc procedentes de tejidos normales humanos (cerebro, hipocampo, testículo, colon y placenta) se utilizó ADNc Gene Pool (fabricado por Invitrogen), ADNc QUICK-Clon (fabricado por CLONTECH) y una biblioteca de ADNc de inserto grande (fabricada por CLONTECH). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo como sigue, utilizando cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 48 y 49) específicos para el gen obtenido. A saber, se mezclaron los respectivos reactivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 0,25 pl de la muestra preparada mediante la reacción de transcripción inversa, cada uno de los cebadores anteriores 2 pM, cada uno de los dNTP 0,2 mM y polimerasa ExTaq 0,65 U (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) en un volumen total de 25 pl, y la reacción se llevó a cabo con 30 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 1,5 minutos, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Los cebadores específicos de gen descritos anteriormente fueron los que amplifican las regiones de las bases 1519 a 2957 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 44 (gen TRIP11 canino) y las bases 1872 a 3310 de la secuencia de bases de la SEQ ID NO: 46 (gen TRIP11 humano), y pueden utilizarse para investigar la expresión tanto del gen TRIP11 canino como del gen TRIP11 humano. Como control para la comparación se utilizaron de forma simultánea cebadores (descritos en las SEQ ID NO: 9 y 10) específicos para GAPDh . Como resultado, como se muestra en la Fig. 13, se observó en testículo una fuerte expresión del gen TRIP11 canino entre los tejidos de perro normales y, por otro lado, se observó una fuerte expresión en la línea celular de cáncer de mama canina. La expresión del gen TRIP11 humano se confirmó solo en testículo entre los tejidos normales de ser humano, al igual que en el caso del gen TRIP11 canino, no obstante, se detectó la expresión en muchos tipos de líneas celulares de cáncer tales como tumor cerebral, leucemia, cáncer de mama, cáncer de pulmón y líneas de células de cáncer de esófago, entre las líneas celulares de cáncer humano. Por lo tanto, también se confirmó que el gen TRIP11 humano se expresa de forma específica en células de testículo y cancerosas.
En la Fig. 13, el número de referencia 1 en las ordenadas indica el patrón de expresión del gen TRIP11 y el número de referencia 2 indica el patrón de expresión del gen GAPDH como control para la comparación.
Ejemplo D-2: preparación de las proteínas TRIP11 canina y humana
(1) Preparación de la proteína recombinante
Mediante el siguiente método se preparó una proteína recombinante a base del gen de la SEQ ID NO: 44 obtenido en el Ejemplo D-1. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 |jl del vector que se preparó a partir de la solución de fagémido obtenida en el Ejemplo D-1 y que se sometió al análisis de secuencia, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción SalI y Xhol (descritos en las SEQ ID NO: 50 y 51) 0,4 jM , los dNTP 0,2 mM y polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) 1,25 U en un volumen total de 50 jl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 6 minutos, utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente se obtuvo una región que codifica una región de aminoácidos (SEQ ID n O: 54) de los aminoácidos 237 a 1023 de la SEQ ID NO: 45. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,4 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
De la misma manera, se llevó a cabo la PCR utilizando dos tipos de cebadores descritos en las SEQ ID NO: 56 y 57 para obtener una región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 45. Tras la PCR, el ADN amplificado se sometió a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,0 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
Cada uno de los fragmentos de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante, y tras eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincide con la secuencia de interés. El plásmido que coincidía con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción SalI y XhoI y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30b (fabricado por Novagen) que se había tratado con SalI y XhoI. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Se transformó con este plásmido E. coli para la expresión, BL21 (DE3) y se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés con IPTG 1 mM.
Adicionalmente, a base del gen de la SEQ ID NO: 46 se preparó mediante el siguiente método una proteína recombinante del gen homólogo humano. Se mezclaron los reactivos respectivos y el tampón adjunto de forma que la mezcla debía contener 1 j l del ADNc preparado en el Ejemplo D-1, cuya expresión en diversos tejidos/células pudo confirmarse mediante el método de RT-PCR, cada uno de los dos tipos de cebadores que tenían los sitios de restricción de NdeI y KpnI (descritos en las SEQ ID NO: 52 y 53) 0,4 jM , los dNTP 0,2 mM y la polimerasa PrimeSTAR HS (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) 1,25 U, en un volumen total de 50 jl, y se llevó a cabo la PCR con 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 5 segundos y 72 °C durante 6 minutos utilizando un ciclador térmico (fabricado por BIO RAD). Utilizando los dos tipos de cebadores descritos anteriormente, se obtuvo una región que codifica una región de aminoácidos (SEQ ID NO: 55) de los aminoácidos 236 a 1023 de la SEQ ID NO: 47. Tras la PCR se sometió al ADN amplificado a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,4 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
De la misma manera, se llevó a cabo la PCR utilizando dos tipos de cebadores, descritos en las SEC ID NO: 58 y 59, para obtener una región que codifica la secuencia de aminoácidos entera de la SEQ ID NO: 47. Tras la PCR, se sometió al ADN amplificado a electroforesis utilizando gel de agarosa al 1 % y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,0 kpb utilizando el kit de extracción de gel QIAquick (fabricado por QIAGEN).
Cada uno de los fragmentos de ADN purificado se ligó en un vector de clonación pCR-Blunt (fabricado por Invitrogen). Se transformó E. coli con el producto de ligamiento resultante y tras eso se recuperaron los plásmidos, seguido de la confirmación mediante secuenciación de que el fragmento génico amplificado coincide con la secuencia de interés. El plásmido que coincidió con la secuencia de interés se trató con las enzimas de restricción NdeI y KpnI y se purificó utilizando el kit de extracción de gel QIAquick, seguido de la inserción de la secuencia génica de interés en un vector de expresión para E. coli, pET30b (fabricado por Novagen), que se había tratado con Ndel y Kpnl. El uso de este vector permite la producción de una proteína recombinante de fusión etiquetada con His. Se transformó con este plásmido E. coli para la expresión, BL21 (DE3), y con IPTG 1 mM se indujo en E. coli la expresión de la proteína de interés.
(2) Purificación de las proteínas recombinantes
Las células E. coli recombinantes obtenidas anteriormente que expresaban una parte de la SEQ ID NO: 44 y una parte de la SEQ ID NO: 46, respectivamente, se cultivaron en medio LB que contenía kanamicina (concentración final: 30 |jg/ml) a 37 °C hasta que la absorbancia a 600 nm alcanzó aproximadamente 0,7 y después se añadió IPTG al mismo de forma que su concentración final debía ser 1 mM, seguido de su cultivo a 30 °C durante 20 horas. Posteriormente, se recolectaron las células mediante centrifugación a 4.800 rpm durante 10 minutos. Se suspendió el sedimento de las células en solución salina tamponada con fosfato y para lavar las células se sometió adicionalmente a centrifugación a 4.800 rpm durante l0 minutos.
Las células se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato y se trataron con ultrasonido en hielo. La solución de E. coli tratada con ultrasonido se centrifugó a 7.000 rpm durante 15 minutos para obtener el sobrenadante como la fracción soluble y el precipitado como la fracción insoluble.
La fracción insoluble se suspendió en solución de Tritón X-100 al 4 % y la suspensión resultante se centrifugó a 7.000 rpm durante 10 minutos. Este procedimiento se repitió dos veces y se llevó a cabo un procedimiento de eliminación de proteasas. Después de eso se suspendió el residuo en solución salina tamponada con fosfato y se llevó a cabo un procedimiento de eliminación del tensioactivo.
El residuo se suspendió en tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía hidrocloruro de guanidinio (fabricado por Sigma Aldrich Japón) 6 M y la suspensión resultante se dejó reposar a 4 °C durante 15 horas para desnaturalizar las proteínas. Después de eso, se centrifugó la suspensión a 7.000 rpm durante 20 minutos y la fracción soluble obtenida se colocó en una columna quelante de níquel preparada mediante un método convencional (transportador: Chelating Sepharose (marca registrada) Fast Flow (GE Health Care); volumen de columna: 5 ml, tampón de equilibrio: tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía hidrocarburo de guanidinio 6 M). La fracción que no se adsorbió a la columna se lavó con 10 volúmenes de columna de tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía cloruro de sodio 6 M y tampón fosfato 20 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 10 mM, y la elución se llevó a cabo inmediatamente un gradiente de densidad de cuatro etapas de imidazol 50 mM-500 mM. Se recolectaron cinco volúmenes de columna de las fracciones eluidas en cada etapa de elución. La elución de las proteínas de interés se confirmó mediante tinción de Coomassie llevada a cabo de acuerdo con un método convencional. A base del resultado se desalaron y concentraron las fracciones eluidas para obtener el material para la fase sólida para el diagnóstico.
De la misma manera, se cultivaron las células E. coli recombinantes que expresaban respectivamente las SEQ ID NO: 45 y 47 de longitud completa y se purificaron las proteínas de interés para obtener el material para la fase sólida para el diagnóstico.
Ejemplo D-3: diagnóstico del cáncer utilizando el polipéptido obtenido de la TRIP11 canina
(1) Diagnóstico del cáncer en perros
Se recolectaron muestras de sangre procedentes de 486 pacientes caninos en los que se encontraron tumores malignos y benignos y de 6 perros sanos, y se separaron sueros a partir de ellas. Utilizando el polipéptido parcial de la TRIP11 canina (s Eq ID NO: 54; región de los aminoácidos 237 a 1023 de la SEQ ID NO: 45) preparado en el Ejemplo D-2 y el anticuerpo anti IgG de perro, se midió mediante ELISA el título de anticuerpos IgG de los sueros que reaccionan de forma específica con el polipéptido.
Del mismo modo que para la inmovilización de la proteína preparada en una fase sólida, se añadieron 100 jl/pocillo de una solución de la proteína recombinante diluida hasta 50 jg/m l con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Immobilizer Amino (fabricada por Nunc), y se dejó reposar la placa a 4 °C durante una noche. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 jl/pocillo de tampón bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón) (denominado en lo sucesivo en este documento como solución de bloqueo), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se diluyó 1.000 veces la muestra de suero con la solución de bloqueo y se añadieron a la placa 100 jl/pocillo del suero diluido, seguido de la agitación de la placa a temperatura ambiente durante 3 horas para dejar que transcurra la reacción. Después de lavar 3 veces los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (denominado en lo sucesivo en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 jl/pocillo de anticuerpo de IgG de perro conjugado con HRP (cabra anti IgG-h+l de perro conjugado con HRP: fabricado por BETHYL Laboratories) diluido 3.000 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 jl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (tetrametilbencidina) 1-Step Turbo, fabricado por PIERCE), y se dejó que transcurra la reacción enzima-sustrato a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de eso se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricada por Sigma Aldrich Japón) y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control, se midieron de la misma manera que anteriormente una placa sobre la que no se inmovilizó la proteína recombinante preparada y una placa con la que no reaccionó el suero procedente de un perro portador de cáncer.
Entre el total de 486 muestras utilizadas en el diagnóstico del cáncer descrito anteriormente, se diagnosticaron de forma definitiva como malignas 311 muestras mediante el diagnóstico patológico utilizando el tejido tumoral extirpado.
De forma específica, las muestras se diagnosticaron como cáncer, tal como melanoma maligno; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de la glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; carcinoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; carcinoma de células escamosas; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma ceruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II); liomiosarcoma o similar.
Como se muestra en la Fig. 15, los sueros procedentes de estos perros portadores de cáncer mostraron un título de anticuerpo significativamente elevado frente a la proteína recombinante. Se reveló que mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de caninos sanos, pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 78 muestras, es decir el 25,1 % de los casos malignos. Los detalles de estas 78 muestras de cáncer son como sigue. Cabe señalar que el siguiente número de cada caso de cáncer es un total acumulativo, dado que algunas muestras contenían múltiples primarios. Melanoma maligno, 4 casos; linfoma, 5 casos; inflamación supurante, 1 caso; tumor de células de la granulosa, 1 caso; carcinoma hepatocelular, 2 casos; tumor testicular maligno, 2 casos; tumor intraoral, 3 casos; adenoma perianal, 5 casos; osteosarcoma, 2 casos; carcinoma ductal, 6 casos; adenocarcinoma mamario, 16 casos; adenocarcinoma mamario combinado, 8 casos; cáncer de pulmón, 1 caso; adenocarcinoma sebáceo, 2 casos; mastocitoma, 6 casos; liomiosarcoma, 2 casos; carcinoma de células escamosas, 4 casos; tumor mixto maligno, 1 caso; melanoma maligno metastásico, 1 caso; carcinoma ductal mamario, 1 caso; carcinoma apocrino, 1 caso; adenocarcinoma gástrico, 1 caso; linfoma multicéntrico, 1 caso; seminoma, 1 caso; plasmocitoma, 1 caso.
El método de diagnóstico descrito anteriormente también se llevó a cabo utilizando muestras de efusión pleural y muestras de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero, y por consiguiente se pudo lograr de forma satisfactoria el diagnóstico del cáncer.
Adicionalmente, se confirmó que las estrategias de diagnóstico tales como el diagnóstico de cánceres que existen en una parte invisible del cuerpo, la evaluación de la fase y el grado del cáncer, el seguimiento de los pacientes posquirúrgicos, el diagnóstico de reaparición y metástasis y similares, también se puede lograr aplicando el método diagnóstico descrito anteriormente. Los siguientes son varios de los ejemplos prácticos del diagnóstico detallado mostrado en la Fig. 4.
(2)-1 Diagnóstico de tumores invisibles
El 7 de junio de 2007 no se encontró ningún tumor en el Paciente Canino 1 (Cobrador de pelo liso). Pero aproximadamente 20 días más tarde, el 24 de junio de 2007, se encontró un tumor pedunculado con un diámetro de 2 mm en la encía en la base del colmillo. El día que se lo encontró se ligó el tumor en su parte pedunculada y se lo escindió. La absorbancia a 450 nm observada después de que el tumor se hiciera visible a simple vista era de 0,15, lo que era significativamente elevada y no muy distinta de la absorbancia en el momento del hallazgo del tumor, 0,14. El resultado indica que mediante el método de la presente invención es posible diagnosticar cánceres incluso en una parte invisible tal como una parte intraperitoneal.
La elevación del valor se observó antes de que el tumor se haga visible a simple vista, lo que se considera que fue un signo del desarrollo tumoral. Por lo tanto, el método de la presente invención es útil en los exámenes médicos tales como la revisión de salud periódica.
Dos semanas tras la escisión tumoral el Paciente Canino 1 se exploró otra vez mediante el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm fue 0, no se detectó. Por lo tanto, también se confirmó que el tumor que expresaba el antígeno de cáncer que había provocado el título anticuerpos aumentado se eliminó de forma completa (véase (2)-4, Seguimiento de pacientes posquirúrgicos).
(2)-2 Evaluación de la fase de evolución del cáncer
La fase de evolución del cáncer se determina a base del tamaño o la profundidad del tumor, de cuanta influencia ejerce el tumor sobre los tejidos circundantes, de si el tumor produce metástasis o no, y similares. Se reveló en el presente documento que el valor detectado es más elevado que antes de que se produzca la metástasis, es decir, el cáncer ha avanzado.
(2)-3 Evaluación del grado de malignidad del cáncer
Los basaliomas incluyen el tipo maligno y el tipo benigno. Desde hace un tiempo, de acuerdo con la nueva clasificación de la OMS, los basaliomas malignos se llaman carcinomas de células basales y los basaliomas benignos se llaman tricoblastomas.
El Paciente Canino 2 (Beagle) se diagnosticó con carcinoma de células basales (maligno). El serodiagnóstico se llevó a cabo en el momento de la cirugía. Como resultado, la absorbancia a 450 nm fue 0,15. Por otro lado, en el Paciente Canino 3 (raza mixta), diagnosticado con tricoblastoma (benigno), el serodiagnóstico llevado a cabo en el momento de la cirugía reveló que la absorbancia a 450 nm fue 0, no se detectó en absoluto. Por lo tanto, incluso en el caso de los mismos basaliomas, se pueden diagnosticar de forma distintiva el carcinoma de células basales maligno y el tricoblastoma benigno.
El próximo ejemplo es en tumores de glándula mamaria. Los tumores de glándula mamaria incluyen tumores malignos tales como adenocarcinoma mamario y tumor mixto maligno de glándula mamaria, y tumores mamarios benignos que no muestran síntomas de malignidad. El 17 de mayo de 2006 el Paciente Canino 4 (Yorkie) se sometió a la extirpación de un tumor mixto maligno de glándula mamaria y un de carcinoma mamario. En general, la escisión completa de los tumores mixtos en la glándula mamaria es fácil debido a que son poco invasivos de los tejidos circundantes, incluso si son malignos y, por lo tanto, habitualmente el transcurso posquirúrgico de los pacientes no tiene incidencias. Sin embargo, el Paciente Canino 4 se había diagnosticado con tumor elevadamente maligno, debido a que el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que algunos componentes de la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 4 mostraban una naturaleza invasiva. Por otro lado, el adenocarcinoma mamario es un tumor elevadamente invasivo que a menudo reaparece y produce metástasis. Aunque no se observó invasión de las células tumorales de la muestra de ensayo procedente del Paciente Canino 4, se había señalado que los componentes elevadamente malignos posiblemente proliferaron en otra región fuera de la muestra de ensayo. Por lo tanto, los hallazgos en el diagnóstico patológico mostraron claramente que el Paciente Canino 4 padecía cáncer mamario elevadamente maligno. Durante la cirugía se recolectó una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era 0,20. El 28 de enero de 2007 el Paciente Canino 5 (Yorkshire Terrier) se sometió a la extirpación de un tumor mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, la atipia de las células era baja y, por lo tanto, el Paciente Canino 5 se diagnosticó con adenoma mamario benigno sin hallazgos de malignidad. Durante la cirugía se recolectó una muestra de sangre y se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era 0. Los resultados en los dos casos anteriores revelaron que los tumores elevadamente malignos muestran un valor más elevado que los tumores benignos, poco malignos.
(2)-4 Seguimiento de los pacientes posquirúrgicos
El Paciente Canino 6 (Shih Tzu) acudió al hospital debido a un tumor intraoral y se sometió a la extirpación el 22 de marzo de 2007. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era 0,12. Además, a base del diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, se diagnosticó al Paciente Canino 6 con epulis acantomatoso maligno. Este tipo de tumor con frecuencia reaparece si la escisión es insuficiente, a pesar de que la metástasis a distancia raramente se produce. Por lo tanto, es importante si el tumor se puede escindir de forma completa o no mediante cirugía. De acuerdo con el seguimiento el 18 de mayo de 2007, la absorbancia a 450 nm fue de 0,02 y por consiguiente el título de anticuerpos disminuyó. No se encontró reaparición hasta agosto de 2007. Por lo tanto, se considera que el valor detectado mediante el serodiagnóstico se hizo más bajo que el obtenido en el momento de la cirugía debido a que en el Paciente canino 6 el tumor pudo escindirse de forma completa.
El Paciente Canino 7 (Yorkie) se diagnosticó mediante serodiagnóstico utilizando una muestra de suero recolectada el 17 de mayo de 2006, y la absorbancia a 450 nm era de 0,20. Este paciente acudió al hospital el 16 de diciembre de 2006 para el seguimiento, y se llevó a cabo a través del diagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era de 0. No se encontró ni reaparición ni metástasis hasta agosto de 2007. Por lo tanto, se considera que el valor detectado mediante serodiagnóstico se hizo más bajo que el obtenido en el momento de la cirugía debido a que en el Paciente Canino 7 el tumor pudo escindirse de forma completa.
(2)-5 Diagnóstico de reaparición
El 8 de mayo de 2007 el Paciente Canino 8 (Husky) se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. En el momento de la cirugía se llevó a cabo el serodiagnóstico y la absorbancia a 450 nm era de 0,04. El diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado reveló que proliferaron células epiteliales elevadamente atípicas y que principalmente formaron estructuras ductales y, por lo tanto, este paciente se diagnosticó con adenocarcinoma de mama primario. Se dijo que el paciente estaba en riesgo elevado de reaparición o metástasis en los ganglios linfáticos u órganos a distancia, dado que en ese momento ya habían entrado en los vasos linfáticos muchas células cancerosas. El 28 de junio de 2007, aproximadamente 1 mes y medio tras la cirugía, se encontró metástasis en el mismo sitio. Se llevó a cabo el serodiagnóstico en ese momento para hallar que el valor aumentó a 0,07. Por lo tanto, se confirmó que el valor detectado mediante el serodiagnóstico era más elevado hacia finales de junio que a principios de mayo debido a que el tumor no se había escindido de forma completa o a que se había producido reaparición en el Paciente Canino 8.
(2)-6 Diagnóstico de metástasis
El Paciente Canino 9 (Scottish Terrier), que experimentaba de forma repetida metástasis y reaparición, se diagnosticó con tumor mamario en febrero de 2003; con melanoma maligno intraoral en agosto de 2003; con melanoma maligno en el labio en enero de 2005 y con melanoma intraoral el 13 de abril de 2005, todos los cuales se escindieron mediante cirugía. Este paciente acudió al hospital otra vez el 17 de diciembre de 2006 para el seguimiento tras la reaparición del melanoma intraoral en abril de 2005, y en ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico para encontrar que la absorbancia a 450 nm era de 0. Medio año más tarde, el 20 de junio de 2007, el paciente acudió otra vez al hospital debido a la hipertrofia de los ganglios linfáticos cervicales y malares. En el caso de los linfomas, la hipertrofia de los ganglios linfáticos se observa de forma sistemática. Debido a que el Paciente Canino 9 tenía sólo dos ganglios linfáticos inflamados, este paciente se diagnosticó de forma clínica como probable linfoma metastásico. El diagnóstico de acuerdo con la presente invención también reveló que era un tumor que había metastatizado a partir del tumor que existía previamente en este paciente, dado que la absorbancia a 450 nm aumentó enormemente hasta 0,27.
El 11 de marzo de 2006 el Paciente Canino 10 (Shiba Inu) se sometió a la extirpación de un melanoma maligno oral en el labio derecho. Este paciente tiene una historia de tratamiento con fármaco antineoplásico (ciclofosfamida) desde el 10 de junio hasta el 26 de septiembre de 2006, y desde el 23 de mayo de 2006 había recibido BIREMO S, que contiene germanio orgánico como componente principal. El 20 de marzo de 2007 este paciente se sometió a la extirpación de un tumor que se consideró que era metástasis procedente del tumor mencionado anteriormente y se llevó a cabo el serodiagnóstico. Como resultado, la absorbancia a 450 nm era aproximadamente de 0, casi no se detectó. A base del diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado en ese momento, el Paciente Canino 10 se diagnosticó con melanoma maligno metastásico. El 27 de junio de 2007, tres meses después de la extirpación del melanoma metastásico, otra vez se produjo metástasis en este paciente. El tumor que se extirpó el 20 de marzo de 2007 existía en la parte cervical derecha y el tumor que apareció el 27 de junio de 2007 estaba en el lado contrario. Al igual que la forma del tumor, se formó una masa negra de forma similar al tumor previo. El tumor, que tenía el tamaño de 3,1 x 3,2 x 0,8 cm, también se diagnosticó de forma clínica como metástasis. Se llevó a cabo otra vez el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm aumentó a 0,02, lo que indicó que era un tumor metastásico procedente del anterior.
(2)-7 Control de la terapia
El 19 de abril de 2007 el Paciente Canino 12 (Dachshund miniatura) se sometió a extirpación tumoral. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado, el paciente padecía adenocarcinoma mamario combinado moderadamente maligno con una elevada probabilidad de desarrollo invasivo y metastásico. En ese momento se llevó a cabo el serodiagnóstico y la absorbancia a 450 nm era de 0,03. El 3 de junio de 2008, aproximadamente un año tras la extirpación, se llevó a cabo el serodiagnóstico para hallar que la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. Aunque no se encontró a simple vista ningún tumor recurrente, para prevenir la reaparición se administró un fármaco antineoplásico (INTERCAT) una vez por semana durante 2 meses. Tras el inicio de la administración del fármaco anticanceroso se llevó a cabo el serodiagnóstico a las 2, 4 y 6 semanas. Como resultado, la absorbancia a 450 nm fue de 0 en todos los experimentos, no se detectó en absoluto. Estos resultados obtenidos en el Paciente Canino 12 confirmaron que el valor se hace más bajo que el detectado en un estado portador de cáncer si los tumores pueden eliminarse de forma completa, así como que el valor no aumenta si el tratamiento con fármaco antineoplásico previene de forma satisfactoria la metástasis del cáncer y, así, se puede seguir el cambio en los pacientes tratados. Además, el diagnóstico de reaparición también puede llevarse a cabo como se muestra en el Paciente Canino 8, lo que confirma que también puede hacerse posible el control de la terapia.
(2)-8 Diagnóstico de malignidad del tumor recurrente
El 1 de mayo de 2005 el Paciente Canino 13 (Cobrador dorado) se sometió a extirpación tumoral. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que el tumor en este paciente era una lesión neoplásica maligna originada del epitelio ductal mamario, es decir, carcinoma ductal mamario maligno y carcinoma papilar maligno que crecían de forma continua a través de los ductos mamarios. Aproximadamente 3 años después de eso, el 28 de junio de 2008, se encontró tumor otra vez y por lo tanto se llevó a cabo la extirpación. El diagnóstico patológico utilizando el tumor extirpado reveló que alrededor de las estructuras quirúrgicas debajo de la piel no podía observarse nada excepto la infiltración grave de células inflamatorias tales como neutrófilos, macrófagos, células plasmáticas y similares, lo que se consideró que era la cicatriz quirúrgica previa, y así el paciente se diagnosticó como que no tenía lesiones neoplásicas. De acuerdo con el serodiagnóstico llevado a cabo en ese momento, la absorbancia a 450 nm era de 0, no se detectó en absoluto. Los resultados observados en los Pacientes Caninos 8 y 13 indicaron que el valor del serodiagnóstico no disminuye o se mantiene en los casos en donde el tumor recurrente es maligno, y no se detecta en los casos en donde el tumor es benigno.
(3) Diagnóstico en gatos
A continuación, se diagnosticaron gatos portadores de cáncer y gatos sanos. Utilizando el polipéptido parcial de la TRIP11 canina descrito anteriormente y el anticuerpo anti IgG de gato, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de un suero felino que reaccionan de forma específica con el polipéptido. Se utilizó como anticuerpo secundario un anticuerpo anti IgG de gato conjugado a HRP (FRACCIÓN IgG de CABRA para IgG de GATO CONJUGADO A PEROXIDASA (MOLÉCULA COMPLETA): fabricado por CAPPEL RESERCH REAGENTS) diluido 8.000 veces con la solución de bloqueo.
El 17 de agosto de 2005 el Paciente Felino 1 (Chinchilla) se sometió a la extirpación tumoral de un adenocarcinoma mamario. La absorbancia a 450 nm era de 0,05. En el Paciente Felino 2 (Himalayo), que se sometió a extirpación de un carcinoma ductal el 17 de octubre de 2006, la absorbancia a 450 nm era de 0,34. Por otro lado, en gatos sanos no se detectó absorbancia en absoluto.
Por lo tanto, de forma similar a los perros, se detectó valor de absorbancia en muestras procedentes de gatos que padecían cáncer, aunque no se detectó en absoluto valor de absorbancia en muestras procedentes de gatos sanos. Por consiguiente, de forma similar a los perros, también se pueden detectar cánceres en gatos mediante este método.
(4) Diagnóstico en seres humanos sanos
Utilizando el polipéptido parcial de la TRIP11 canina descrito anteriormente y el anticuerpo anti IgG de ser humano anterior, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de suero de ser humano sano que reaccionan de forma específica con el polipéptido. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG humanas conjugado con HRP (cabra anti IgG (H+L) humanas conjugado con HRP: fabricado por Zymed Laboratories) diluido 10000 veces con la solución de bloqueo. Como control positivo se utilizó un antígeno de ovoalbúmina inmovilizado preparado inmovilizando en una fase sólida ovoalbúmina 50 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato. Como resultado, en el Ser Humano Sano 1, la absorbancia a 450 nm observada en un antígeno de ovoalbúmina era de 0,25, aunque la absorbancia a 450 nm observada en la proteína recombinante era de 0, no se detectó en absoluto. De forma similar, en el Ser Humano Sano 2, la absorbancia a 450 nm observada en un antígeno de ovoalbúmina era de 0,18, aunque la absorbancia a 450 nm observada en la proteína recombinante era de 0, no se detectó en absoluto.
Adicionalmente, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente, utilizando una TRIP11 canina de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 45, preparada en el Ejemplo D-2. Como resultado, se reveló que el diagnóstico se puede lograr de forma similar en seres humanos, perros y gatos.
Ejemplo D-4: Diagnóstico del cáncer utilizando el polipéptido obtenido de la TRIP11 humana
Utilizando el polipéptido parcial de la TRIP11 humana (SEQ ID NO: 55; región de aminoácidos 236 a 1023 de la SEQ ID NO: 47) preparada en el Ejemplo D-2, se midió de la misma manera que en el Ejemplo D-3 el título de anticuerpos IgG de los sueros de humano, canino y felino que reaccionan con el polipéptido.
Se llevó a cabo el diagnóstico utilizando suero de ser humano sano. De la misma manera que en el Ejemplo D-3 (4), se utilizó como control positivo antígeno de ovoalbúmina. Como resultado, se detectó el valor de absorbancia en el caso en donde la ovoalbúmina estaba inmovilizada en una fase sólida, mientras que casi no se detectó el valor de absorbancia en el caso en donde estaba inmovilizado en una fase sólida el polipéptido parcial de la TRIP11 humana.
De forma similar, en perros y gatos sanos la absorbancia a 450 nm casi no se detectó en el caso en donde el polipéptido está inmovilizado en una fase sólida.
Por otro lado, el 21 de junio de 2007 el Paciente Canino 11 (Shih Tzu) se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario. De acuerdo con el diagnóstico patológico utilizando el tejido extirpado, el tejido de glándula mamaria contenía células invasivas elevadamente atípicas, que creció para formar hiperplasia adenomatosa que mostraba estructuras masivas grandes y pequeñas. Por consiguiente, este paciente se diagnosticó con tumor maligno.
En el Paciente Canino 11, la absorbancia a 450 nm era de 0,19. El diagnóstico de malignidad se llevó a cabo utilizando 310 muestras de suero adicionales que se habían diagnosticado como malignas mediante el diagnóstico patológico. Como resultado, diagnosticando como maligna una muestra que mostraba el doble del valor promedio de las muestras de canino sano, se pudieron diagnosticar 74 muestras de forma satisfactoria como malignas, es decir el 23,8 % de los casos malignos. Además, en el Paciente Felino 3 (raza mixta), que el 3 de abril de 2007 se sometió a la extirpación de un adenocarcinoma mamario, la absorbancia a 450 nm era de 0,06.
Los resultados descritos anteriormente indican que utilizando un polipéptido obtenido de la TRIP11 humana también se puede lograr de forma similar el diagnóstico en seres humanos, perros y gatos.
Adicionalmente, se sometieron al diagnóstico utilizando la proteína humana recombinante de la misma manera que la proteína canina recombinante, muestras de efusión pleural y de ascitis recolectadas de perros con cáncer terminal. Como resultado, se pudieron detectar valores similares a los detectados en las muestras de suero y, por consiguiente, se pudo lograr de forma satisfactoria el diagnóstico del cáncer.
Además, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente utilizando una TRIP11 humana de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 47 preparada en el Ejemplo D-2. Como resultado, se reveló que el diagnóstico también se puede lograr de forma similar en seres humanos, perros y gatos.
Ejemplo D-5: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (1)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína canina recombinante que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 54 preparada en el Ejemplo D-2, para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. Utilizando este anticuerpo policlonal, se llevó a cabo mediante ELISA de tipo sándwich la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer. Utilizando un anticuerpo anti IgG de ratón, se midió mediante ELISA de tipo sándwich la cantidad de la proteína en suero que reacciona de forma específica con el anticuerpo policlonal específico preparado frente a la proteína preparada.
Del mismo modo que para la inmovilización de un anticuerpo primario en una fase sólida, se añadieron 100 pl/pocillo del antisuero de conejo diluido 20 veces con solución salina tamponada con fosfato a una placa de 96 pocillos Inmovilizer Amino (fabricada por Nunc), y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Del mismo modo que para el bloqueo, se añadieron a la placa 100 pl/pocillo de solución de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,3) que contenía BSA al 0,5 % (seroalbúmina bovina, fabricada por Sigma Aldrich Japón) (denominado en lo sucesivo en este documento como solución de bloqueo) y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadieron a la placa 100 pl/pocillo del suero procedente del cuerpo portador de cáncer diluido con la solución de bloqueo y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, para dejar que transcurra la reacción. Al igual que para el suero diluido, se prepararon diluciones en serie con factor 10 que variaban de 10 a 1.000 veces. Tras lavar 3 veces los pocillos con solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween 20 al 0,05 % (fabricado por Wako Pure Chemicals) (denominado en lo sucesivo en este documento como PBS-T), se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de antisuero de ratón diluido 200 veces con la solución de bloqueo, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar 3 veces los pocillos con PBS-T, se añadieron a los mismos 100 pl/pocillo de anticuerpo para IgG de ratón conjugado a HRP (cabra anti ratón conjugado con HRP estabilizado: fabricado por PIERCE) diluido 2000 con la solución de bloqueo como anticuerpo terciario, y la placa se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora para dejar que transcurra la reacción. Tras lavar los pocillos 3 veces con PBS-T, se añadieron los mismos 100 pl/pocillo de un sustrato de HRP, TMB (TMB (tetrametilbencidina) 1-Step Turbo, fabricado por PIERCE), y se dejó que la reacción enzima-sustrato transcurra a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de eso, se finalizó la reacción añadiendo 100 pl/pocillo de solución de ácido sulfúrico 0,5 M (fabricado por Sigma Aldrich Japón) y después se midió la absorbancia a 450 nm con un lector de microplacas. Como control se midieron de la misma manera que se describe anteriormente una placa en la que no se inmovilizó el anticuerpo de conejo y una placa con la que no reaccionó el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer.
Como resultado, se detectó el polipéptido en perros y gatos portadores de cáncer que padecían liomiaosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno y similares, aunque no se detectó el polipéptido en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por lo tanto, también pueden diagnosticarse cánceres mediante este método en el que se detectó el polipéptido antigénico con un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno el polipéptido canino recombinante.
Además, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente utilizando un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno la TRIP11 canina de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la s Eq ID NO: 45 preparada en el Ejemplo D-2.
Como resultado, también pueden diagnosticarse cánceres en perros y gatos mediante este método en que se detectó el polipéptido antigénico con un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno una TRIP11 canina de longitud completa.
Ejemplo D-6: diagnóstico del cáncer midiendo el polipéptido antigénico (2)
Se inmunizaron ratones y conejos con la proteína humana recombinante que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 55 preparada en el Ejemplo D-2, para obtener un anticuerpo específico para este antígeno. De la misma manera que en el Ejemplo D-5, se llevó a cabo mediante ELISA de tipo sándwich utilizando este anticuerpo policlonal la detección del polipéptido antigénico per se contenido en el suero procedente de un cuerpo portador de cáncer.
Como resultado, se detectó el polipéptido en perros y gatos portadores de cáncer que padecían liomiosarcoma cutáneo, cáncer de mama, melanoma maligno y similares, mientras que no se detectó el polipéptido en perros sanos, gatos sanos y seres humanos sanos. Por consiguiente, también se pudieron diagnosticar cánceres mediante este método en el que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo preparado utilizando como inmunógeno el polipéptido humano recombinante.
Además, se llevó a cabo el diagnóstico de la misma manera que se describe anteriormente utilizando un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno la TRIP11 humana de longitud completa que tenía la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 47 preparada en el Ejemplo D-2.
Como resultado, también pudieron diagnosticarse cánceres en perros y gatos mediante este método en que el polipéptido antigénico se detectó con un anticuerpo que se preparó utilizando como inmunógeno una TRIP11 humana de longitud completa.
Ejemplo E-1: diagnóstico combinado del cáncer utilizando cuatro polipéptidos antigénicos (1)
(1) Diagnóstico del cáncer en perros
Utilizando el polipéptido canino recombinante (SEQ ID NO: 2) preparado en el Ejemplo A-2, la proteína calmegina canina (SEQ ID NO: 16) preparada en el Ejemplo B-2, el polipéptido de la CEP canina preparada en el Ejemplo C-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 26 o 42) o parcial (SEQ iD NO: 35; región de los aminoácidos 1514 a 2339 de la SEQ ID NO: 26), el polipéptido de la TRIP11 canina preparado en el Ejemplo D-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 45) o parcial (s Eq iD NO: 54; región de los aminoácidos 237 a 1023 de la SEQ ID NO: 45) y el anticuerpo anti IgG de perro, se midió el título de anticuerpos IgG del suero que reaccionaban de forma específica con cualquiera de las proteínas o polipéptidos mencionados anteriormente.
Mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que presentaba el doble del valor promedio de las muestras de caninos sanos, pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 272 muestras, es decir 87,5 % de los casos malignos. El cuerpo vivo sujeto se diagnosticó como maligno cuando una cualquiera de las 4 proteínas y polipéptidos indicaron malignidad (lo mismo se aplicará en lo sucesivo en este documento). Los detalles de estas 272 muestras de cáncer son como sigue. Cabe señalar que el siguiente número de cada caso de cáncer es un total acumulativo, dado que algunas mezclas contenían múltiples primarios.
Melanoma maligno, 10 casos; linfoma, 13 casos; feocromocitoma, 1 caso; inflamación supurante, 1 caso; tumor de células de la granulosa, 1 caso; carcinoma hepatocelular, 5 casos; angioma, 1 caso; tumor testicular maligno, 8 casos; tumor intraoral, 4 casos; adenocarcinoma perianal, 14 casos; osteosarcoma, 5 casos; fibrosarcoma, 9 casos; carcinoma ductal, 10 casos; condrosarcoma, 2 casos; adenocarcinoma mamario, 56 casos; adenocarcinoma mamario combinado, 26 casos; cáncer de pulmón, 2 casos; carcinoma sebáceo, 2 casos; adenocarcinoma nasal, 2 casos; mastocitoma, 37 casos; tumor adrenomedular, 1 caso; liomiosarcoma, 2 casos; carcinoma de células escamosas, 11 casos; leucemia linfocítica crónica, 1 caso; sarcoma indiferenciado, 2 casos; tumor mixto maligno, 2 casos; tumor en el segmento posterior del lóbulo izquierdo del pulmón, 1 caso; tumor en la región infra axilar derecha, 1 caso; tumor en el codo de la pata delantera derecha, 1 caso; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales), 1 caso; melanoma maligno metastásico, 3 casos; melanoma maligno amelánico, 1 caso; adenocarcinoma de intestino grueso, 1 caso; plasmocitoma, 1 caso; sarcoma histiocítico, 1 caso; liposarcoma, 1 caso; sarcoma poco diferenciado, 1 caso; sarcoma sinovial, 1 caso; hemangiopericitoma maligno, 1 caso; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino, 3 casos; adenocarcinoma bronquial, 1 caso; germinoma, 1 caso; histiocitoma fibroso maligno, 1 caso; epitelioma maligno metastásico, 1 caso; carcinoma ductal mamario, 1 caso; angiosarcoma, 1 caso; adenocarcinoma mamario tubular, 1 caso; tricoepitelioma invasivo, 1 caso; cáncer de próstata, 1 caso; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes), 1 caso; adenocarcinoma ceruminoso, 1 caso; linfoma multicéntrico, 2 casos; tricoepitelioma invasivo, 1 caso; adenocarcinoma de la cavidad anal, 1 caso; carcinoma apocrino, 1 caso; adenocarcinoma gástrico, 1 caso; seminoma, 1 caso; carcinoma de células basales, 1 caso; hemangiopericitoma, 4 casos; mixosarcoma, 1 caso; epitelioma sebáceo, 1 caso; tumor esplénico, 1 caso.
(2) Diagnóstico del cáncer en gatos
A continuación, se diagnosticaron gatos portadores de cáncer y gatos sanos. Utilizando los 4 tipos de polipéptidos antigénicos caninos descritos anteriormente y el anticuerpo anti IgG de gato, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de un suero felino que reacciona de forma específica con cualquiera de los polipéptidos. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG de gato conjugado con HRP (FRACCIÓN IgG DE CABRA para IgG de GATO CONJUGADO A PEROXIDASA (MOLÉCULA COMPLETA): fabricado por CAPPEL RESERCH REAGENTS) diluido 8.000 veces con la solución de bloqueo.
Entre un total de 17 muestras utilizadas en el diagnóstico del cáncer, mediante el diagnóstico patológico utilizando el tejido tumoral extirpado se diagnosticaron de forma definitiva como malignas 11 muestras. Mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que muestra el doble del valor promedio de las muestras de felinos sanos, se pudieron diagnosticar de forma satisfactoria como malignas 9 muestras, es decir el 81,8 % de los casos malignos.
Ejemplo E-2: diagnóstico combinado del cáncer utilizando cuatro polipéptidos antigénicos (2)
(1) Diagnóstico del cáncer en perros
Utilizando el polipéptido humano recombinante (SEQ ID NO: 4) preparado en el Ejemplo A-2, la proteína calmegina humana (SEQ ID NO: 18) preparada en el Ejemplo B-2, el polipéptido de la CEP humana preparado en el Ejemplo C-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 28 ) o parcial (SEQ ID NO: 36; región de los aminoácidos 1513 a 2325 de la SEQ ID NO: 28), el polipéptido de la TRIP11 humana preparado en el Ejemplo D-2, de longitud completa (SEQ ID NO: 47) o parcial (SEQ D n O: 55; región de los aminoácidos 236 a 1023 de la SEQ ID NO: 47) y el anticuerpo anti IgG de perro, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG del suero que reaccionan de forma específica con cualquiera de las proteínas o polipéptidos mencionados anteriormente.
Mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que muestra el doble del valor promedio de las muestras de caninos sanos, se pudieron diagnosticar de forma satisfactoria como malignas 268 muestras, es decir el 86,2 % de los casos malignos.
(2) Diagnóstico del cáncer en gatos
A continuación se diagnosticaron gatos portadores de cáncer y gatos sanos. Utilizando los 4 tipos de polipéptidos antigénicos caninos descritos anteriormente y el anticuerpo anti IgG de gato, se midió de la misma manera que se describe anteriormente el título de anticuerpos IgG de suero felino que reaccionan de forma específica con cualquiera de los polipéptidos. Como anticuerpo secundario se utilizó anticuerpo anti IgG de gato conjugado con HRP (FRACCIÓN IgG DE CABRA para IgG de GATO CONJUGADO CON PEROXIDASA (MOLÉCULA COMPLETA): fabricado por CAPPEL RESERCH REAGENTS) diluido 8.000 veces con la solución de bloqueo.
Entre un total de 17 muestras utilizadas en el diagnóstico del cáncer, 11 muestras se diagnosticaron de forma definitiva como malignas mediante diagnóstico patológico utilizando el tejido tumoral extirpado. Mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que muestra el doble del valor promedio de las muestras felinos sanos, se pudieron diagnosticar como malignas de forma satisfactoria 7 muestras, es decir el 63,6 % de los casos malignos.
Ejemplo E-3: diagnóstico combinado del cáncer midiendo cuatro polipéptidos antigénicos (1)
Se inmunizaron ratones y conejos con el polipéptido canino recombinante (SEQ ID NO: 2) preparado en el Ejemplo A-2, la proteína de calmegina canina (SEQ ID NO: 16) preparada en el Ejemplo B-2, el polipéptido de la c Ep canina preparado en el Ejemplo C-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 26 o 42) o parcial (SEQ iD NO: 35; región de los aminoácidos 1514 a 2339 de la SEQ ID NO: 26) o el polipéptido de la TRIP11 canina preparado en el Ejemplo D-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 45) o parcial (Se Q ID NO: 54; región de los aminoácidos 237 a 1023 de la SEQ ID NO: 45), para obtener anticuerpos específicos frente a estos antígenos. De la misma manera que en los Ejemplos A, B, C, D-5, los polipéptidos antigénicos per se contenidos en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer se detectaron mediante ELISA de tipo sándwich utilizando los anticuerpos policlonales preparados.
Como resultado, este método en que los polipéptidos antigénicos se detectaron utilizando como inmunógeno los anticuerpos preparados utilizando polipéptidos antigénicos caninos, pudo diagnosticar como malignos de forma satisfactoria 252 muestras, es decir el 81,0 % de los casos malignos, mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que muestra el doble del valor promedio de las muestras de caninos sanos. De forma similar, también en gatos pudieron diagnosticarse de forma satisfactoria como malignas 8 muestras, es decir el 72,7 % de los casos malignos, mediante el diagnóstico como maligna de una muestra que muestra el doble del valor promedio de las muestras de felinos sanos.
Ejemplo E-4: diagnóstico combinado del cáncer midiendo cuatro polipéptidos antigénicos (2)
Se inmunizaron ratones y conejos con el polipéptido humano recombinante (SEQ ID NO: 4) preparado en el Ejemplo A-2, la proteína calmegina humana (SEQ ID NO: 18) preparada en el Ejemplo B-2, el polipéptido de la CEP humana preparado en el Ejemplo C-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 28) o parcial (SEQ ID NO: 36; región de los aminoácidos 1513 a 2325 de la SEQ ID NO: 28) o el polipéptido de la TRIP11 humana preparado en el Ejemplo D-2 de longitud completa (SEQ ID NO: 47) o parcial (SEQ ID n O: 55; región de los aminoácidos 236 a 1023 de la SEQ ID NO: 47), para obtener anticuerpos específicos frente a estos antígenos. De la misma manera que en los Ejemplos A, B, C, D-5, los polipéptidos antigénicos per se contenidos en el suero procedente de un cuerpo vivo portador de cáncer se detectaron mediante ELISA de tipo sándwich, utilizando los anticuerpos policlonales preparados.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un método para detectar un cáncer (o cánceres), que se aplica a una muestra separada de un cuerpo vivo y que comprende medir una expresión de calmegina; en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma seruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho cuerpo vivo es un perro, un ser humano o un gato.
3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho cuerpo vivo es un perro y en el que dicha calmegina tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 16.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho cuerpo vivo es un ser humano y en el que dicha calmegina tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 18.
5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la medición de la expresión de dicha calmegina se lleva a cabo midiendo mediante inmunoensayo un anticuerpo que puede estar contenido en la muestra, induciéndose dicho anticuerpo en el cuerpo vivo frente a dicha calmegina.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, el cual se lleva a cabo mediante inmunoensayo utilizando como antígeno un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ ID NO: 16 o 18.
7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la medición de la expresión de dicha calmegina se lleva a cabo midiendo mediante inmunoensayo dicha calmegina que puede estar contenida en la muestra.
8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra es un suero, plasma, ascitis o una efusión pleural.
9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la medición de la expresión de la calmegina se lleva a cabo midiendo el ARNm (o los ARNm) que codifica(n) dicha calmegina, cuyo ARNm (o cuyos ARNm) pueden estar contenidos en la muestra.
10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, que comprende además detectar un grado de malignidad del cáncer basándose en el nivel de expresión de la calmegina, en donde un nivel de expresión más alto de dicha calmegina indica un grado de malignidad más elevado.
11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende además detectar fase de la evolución del cáncer basándose en el nivel de expresión de la calmegina, en donde un nivel de expresión más alto de dicha calmegina indica una fase más avanzada.
12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende además monitorizar un efecto de tratamiento de dicho cáncer (o cánceres) basándose en si el nivel de expresión de la calmegina disminuye o no.
13. Uso de un reactivo in vitro en un método para detectar un cáncer (o cánceres), en el que el reactivo comprende un polipéptido antigénico que reacciona de forma inmunológica con y se une por reacción de antígeno-anticuerpo a un anticuerpo inducido en un cuerpo vivo frente a la calmegina; en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma seruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma.
14. Uso de un reactivo que comprende un anticuerpo que reacciona in vitro de forma inmunológica con calmegina o un fragmento de unión a antígeno de la misma en un método para detectar un cáncer (o cánceres); en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma seruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma.
15. Un reactivo que comprende un anticuerpo que reacciona in vivo de forma inmunológica con calmegina o un fragmento de unión a antígeno de la misma para su uso en un método para detectar un cáncer (o cánceres); en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma seruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma.
16. Uso in vitro de un reactivo que comprende un polinucleótido que tiene una identidad de secuencia de no menos del 90 % a una región parcial que consiste en no menos de 18 bases consecutivas de SEQ ID NO 15 o 17, o un polinucleótido que tiene una secuencia complementaria a las mismas, en un método para detectar un cáncer (o cánceres); en donde el cáncer es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en tumor cerebral; carcinomas de células escamosas de cabeza, cuello, pulmón, útero y esófago; melanoma; adenocarcinomas de pulmón y útero; cáncer renal; tumor mixto maligno; carcinoma hepatocelular; carcinoma de células basales; epulis acantomatoso; tumor intraoral; adenocarcinoma perianal; tumor de la glándula anal; carcinoma apocrino de la glándula anal; tumor de células de Sertoli; cáncer de vulva; adenocarcinoma sebáceo; epitelioma sebáceo; adenoma sebáceo; carcinoma de glándulas sudoríparas; adenocarcinoma intranasal; adenocarcinoma nasal; cáncer de tiroides; cáncer de colon; adenocarcinoma bronquial; adenocarcinoma; carcinoma ductal; adenocarcinoma mamario; adenocarcinoma mamario combinado; tumor mixto maligno de glándula mamaria; adenocarcinoma papilar intraductal; fibrosarcoma; hemangiopericitoma; osteosarcoma; condrosarcoma; sarcoma de tejidos blandos; sarcoma histiocítico; mixosarcoma; sarcoma indiferenciado; cáncer de pulmón; mastocitoma; liomioma cutáneo; liomioma intra abdominal; liomioma; leucemia linfocítica crónica; linfoma; linfoma gastrointestinal; linfoma de órganos digestivos; linfoma de células pequeñas o de células medianas; tumor adrenomedular; tumor de células de la granulosa; feocromocitoma; cáncer de vejiga (carcinoma de células transicionales); inflamación supurante; tumor de hígado intra abdominal; cáncer de hígado; plasmocitoma; hemangiopericitoma maligno; angiosarcoma; adenocarcinoma de la glándula anal; cáncer oral; melanoma maligno metastásico; melanoma maligno amelánico; melanoma maligno cutáneo; mioepitelioma maligno; seminoma maligno; seminoma; adenocarcinoma del intestino grueso; adenocarcinoma gástrico; carcinoma sebáceo de escasa malignidad; adenocarcinoma seruminoso; carcinoma apocrino; carcinoma de glándulas sudoríparas apocrino poco diferenciado; histiocitoma fibroso maligno; mieloma múltiple; tumor maligno mesenquimatoso; liposarcoma; osteosarcoma; sarcoma de origen desconocido; sarcoma de partes blandas (tumor de células fusiformes); sarcoma poco diferenciado; sarcoma sinovial; angiosarcoma; epitelioma maligno metastásico; adenocarcinoma mamario tubular; carcinoma ductal mamario; cáncer de mama inflamatorio; germinoma; leucemia; tricoepitelioma invasivo; linfoma de células medianas; linfoma multicéntrico; osteosarcoma (glándula mamaria); mastocitoma (de tipo II según Patnaik); mastocitoma (de grado II) y liomiosarcoma.
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