ES2748022T3 - Modulador de la actividad, medicamento que comprende el mismo, uso de ratón deficiente del gen de CD300a y anticuerpo antiCD300a - Google Patents

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Abstract

Un modulador de la actividad para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad alérgica o una enfermedad autoinmunitaria, en el que dicho modulador de la actividad es un anticuerpo neutralizante contra CD300a que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina y suprime la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a.

Description

DESCRIPCIÓN
Modulador de la actividad, medicamento que comprende el mismo, uso de ratón deficiente del gen de CD300a y anticuerpo antiCD300a
Campo técnico
La presente divulgación se refiere a un modulador de la actividad para suprimir o promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, un medicamento que lo comprende, uso de un ratón deficiente del gen de CD300a y un anticuerpo antiCD300a.
Antecedentes técnicos
La invasión de un patógeno (bacteria, virus, parásito o similar) en un hospedador (organismo humano u organismo animal) o la generación de una sustancia inflamatoria endógena causa reacciones inflamatorias en que, por ejemplo, se produce contracción temporal de las arteriolas en el sitio de la invasión del patógeno o en el sitio de generación de la sustancia inflamatoria, y entonces se produce expansión e hiperemia, que da lugar a ralentización local del flujo sanguíneo en el sitio de invasión del patógeno o en el sitio de generación de la sustancia inflamatoria.
Esto causa la adhesión de leucocitos a la pared vascular, y entonces los mediadores químicos liberados de diversos inmunocitos actúan sobre los leucocitos causando que pasen a través de la pared vascular mediante movimiento ameboide y permite su migración. Ejemplos conocidos de los mediadores químicos incluyen histamina, serotonina y linfocinas. Los mastocitos, que producen y liberan histamina y serotonina, son un tipo de linfocitos que desempeñan una función central en la reacción inflamatoria. De forma similar a los mastocitos, los macrófagos también producen y liberan mediadores químicos tales como TNF.
Los leucocitos cuya migración se indujo por la reacción inflamatoria se adhieren por el patógeno o similares, y esto causa eliminación (aclaramiento) del patógeno del organismo por inmunidad humoral acompañada por reacción de antígeno-anticuerpo y por inmunidad mediada por células en que están implicados linfocitos T citotóxicos y similares, provocando la prevención de la propagación de la infección. Por tanto, la reacción inflamatoria y las reacciones inmunitarias que se producen basadas en la reacción inflamatoria, son extremadamente importantes para mantener la homeostasis de un organismo vivo.
Por otro lado, la reacción inflamatoria causa no solamente la defensa biológica descrita anteriormente, sino también signos/síntomas adversos tales como reacciones eritematosas, fiebre, hinchazón, dolor y disfunción. Ejemplos específicos de dichos síntomas incluyen enfermedades alérgicas y diversos tipos de inflamaciones agudas y crónicas. También en enfermedades autoinmunitarias, en que la ausencia de tolerancia inmunológica causa una respuesta autoinmunitaria, se produce lesión tisular debido a la reacción inflamatoria.
Es decir, para la prevención de una enfermedad acompañada por la reacción inflamatoria, es importante destruir el patógeno que causa la reacción inflamatoria usando antibióticos (agentes antimicrobianos) o admistrar un agente que aumente la función inmunitaria en el organismo vivo (inmunoestimulante) para elimiar el patógeno antes de que se produzca una reacción inflamatoria excesiva.
Por otro lado, ejemplos conocidos de métodos para la mejora o el tratamiento para la enfermedad acompañada por la reacción inflamatoria incluyen supresión de la inflamación mediante la administración de un agente (agente antinflamatorio (inmunosupresor)) que disminuye la función inmunitaria excesivamente activada por, por ejemplo, supresión de la liberación de mediadores químicos.
Por ejemplo, el documento de patente 1 divulga, como un inmunoestimulante, un agente activador para la función de células dendríticas, que son células presentadoras de antígeno responsables de la activación de diversos inmunocitos. Más específicamente, el agente comprende como uno o más componentes eficaces al menos un aminoácido de cadena ramificada seleccionado de isoleucina, leucina y valina.
El documento de patente 2 divulga, como un agente antinflamatorio (inmunosupresor), un agente que comprende el péptido SPARC (proteína secretada que es ácida y rica en cisteína) y un vehículo farmacéutico.
Los siguientes enfermedades autoinmunitarias, enfermedades alérgicas y similares son conocidas.
La enfermedad celíaca o celíaca, es una enfermedad autoinmunitaria y es una enteritis progresiva que se activa mediante una reacción autoinmunitaria al gluten, que es una proteína contenida en trigo, cebada, centeno y similares. La incidencia de esta enfermedad en el Reino Unido, Europa y Estados Unidos es de uno o más cada 300 individuos.
El gluten, que una mezcla de dos proteínas gliadina y glutenina, se encuentra en el trigo, la cebada y el centeno. El gluten reacciona con el intestino delgado y activa un sistema inmunitario que ataca al epitelio fino del intestino delgado, que es necesario para la absorción de nutrientes y vitaminas, causando lesión.
Cuando un paciente con enfermedad celíaca toma un alimento o similar que contiene gluten, un péptido derivado de gliadina, que no puede digerirse por las enzimas digestivas del ser humano y está contenido en el trigo como una fracción del gluten de proteína vegetal, se desamina por TG2 en el tejido de la submucosa del duodeno produciendo un antígeno, que entonces causa producción de autoanticuerpos.
La enfermedad celíaca se produce en individuos genéticamente sensibles que tienen cualquiera de: HLA-DQ2 (que se retiene en aproximadamente un 90 % de los individuos), que está codificado por HLA-DQA1 y HLA-DQB1; mutantes de HLA-DQ2; y HLA-DQ8.
Dichos individuos muestran inducción de una respuesta inmunitaria contra péptidos inducidos por proteínas insolubles en agua en harina, gluten y proteínas relacionadas en centeno y cebada, cuya respuesta inmunitaria está limitada a HLA-DQ2 inapropiado y/o d Q8 y mediada por los linfocitos T CD4+.
Esta reacción inmunitaria activa un ataque del sistema autoinmunitario sobre el tejido epitelial del intestino delgado causando inflamación y después lesión de las vellosidades y similares, dando lugar a la destrucción de las propias células epiteliales. Como resultado, no pueden absorberse los nutrientes desde el intestino delgado, y el paciente padece malnutrición independientemente de la ingesta alimenticia y similares.
La colitis ulcerosa, que es una enfermedad inflamatoria del intestino (EII) representativa, es un término colectivo para enfermedades crónicas que causan inflamación de origen desconocido principalmente en el tubo digestivo, y es una enfermedad crónica en que se produce inflamación en el intestino grueso formando úlceras.
La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) es un término colectivo usado para describir dos trastornos gastrointestinales (enfermedad de Crohn (EC) y colitis ulcerosa (CU)) cuyas causas son desconocidas.
En la enfermedad de Crohn, se ve afectada una zona más grande en comparación con la colitis ulcerosa, y la inflamación y las úlceras se encuentran en casi toda la zona del tubo digestivo. La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) se produce en todo el mundo, y se informa de que tantos como dos millones de personas han padecido enfermedad de Crohn. La progresión y pronóstico de EII varía ampliamente.
En enfermedad inflamatoria del intestino (EII), la diarrea y las deposiciones sanguinolentas continúan durante un largo periodo mientras cambia la gravedad de los síntomas con el tiempo. La causa de la enfermedad no se ha dilucidado y, en una hipótesis principal, se cree que la enteritis continua está causada por reacciones inmunitarias a alimentos y enterobacterias debido a trastorno de la tolerancia inmunológica en el tubo intestinal.
Actualmente, no hay método terapéutico fundamental para la enfermedad, y ejemplos de tratamientos para enfermedad inflamatoria del intestino incluyen tratamiento dietético; y uso de un antidiarreico (por ejemplo, anticolinérgico, loperamida o difenoxilato), agente inflamatorio (por ejemplo, fármaco esteroideo tales como ácido aminosalicílico, sulfasalazina, mesalamina, olsalazina, balsalazida o prednisolona; o ácido aminosalicílico) o inmunosupresor (por ejemplo, azatioprina, mercaptopurina o ciclosporina).
Se requieren operaciones quirúrgicas durante un periodo de 10 años de un 10 % a un 15 % de los pacientes con EII, y tienen mayor riesgo de aparición de cáncer intestinal.
En la enfermedad de Crohn, hay bacterias implicadas en la aparición y en la progresión de la enfermedad, y la inflamación intestinal en la enfermedad de Crohn es bien conocida por su frecuente sensibilidad a antibióticos y susceptibilidad a flujo fecal bacteriano. Se ha sugerido que los microorganismos intestinales comunes y los patógenos novedosos tienen asociaciones con enfermedad de Crohn, basándose en la detección directa o en las respuestas inmunitarias antimicrobianas asociadas con la enfermedad.
Además, en varios modelos genéticamente susceptibles de colitis crónica, los microorganismos luminales son cofactores indispensables para la enfermedad, y los animales mantenidos en un entorno sin microbios no desarrollan colitis.
La combinación de factores genéticos, causas exógenas y la microbiota endógena pueden contribuir a la lesión mediada por el sistema inmunitario de la mucosa intestinal encontrada en enfermedad inflamatoria del intestino.
También se sabe que el desarrollo de colitis ulcerosa está asociada con polimorfismos en 3 regiones génicas, es decir, el gen de FCGR2A, que codifica una proteína receptora presente en la superficie de inmunocitos; s8LC26A3, que codifica un transportador de iones de cloro e iones de hidrógeno carbonato; y un gen en la región 13q12 cuya función es desconocida (documento que no es patente 3).
Sin embargo, a pesar de las abundantes evidencias directas e indirectas sobre la función de los microorganismos intestinales en la enfermedad de Crohn, no se ha identificado el organismo patógeno o el antígeno que contribuye a la inmunorregulación alterada encontrada en esta enfermedad. Se han demandado herramientas útiles para dilucidar las patologías de las enfermedades inflamatorias del intestino (enfermedad de Crohn y enteritis inflamatoria) y los medicamentos para el tratamiento y similares de estas enfermedades.
La dermatitis atópica está causada por la entrada de una sustancia alérgica (antígeno) en el organismo seguida de producción de periostina debido a la estimulación por sustancias (interleucinas 4 y 13) secretadas por inmunocitos activados, y después la unión de la periostina a otra proteína "integrina" en la superficie de queratinocitos en la piel, causando inflamación.
La unión de periostina a integrina causa la producción de otras sustancias inductoras de inflamación, y los síntomas continúan incluso en ausencia del antígeno, provocando cronicidad. Se ha demostrado, por un experimento usando ratones, que la inhibición de la unión de periostina a integrina usando un inhibidor evita la aparición de dermatitis atópica (documento que no es patente 4).
Aunque la causa principal de dermatitis atópica ha llegado a ser evidente, se demanda dilucidación adicional de la patología de dermatitis atópica, análisis de la asociación de dermatitis atópica con otras enfermedades inflamatorias y medicamentos para dermatitis atópica que puedan usarse en combinación con el inhibidor anterior.
El asma bronquial es una enfermedad respiratoria en que la inflamación bronquial activada por una reacción alérgica o infección con una bacteria o virus llega a ser crónica, causando de este modo hipersensibilidad aumentada de las vías respiratorias y estrechamiento reversible de las vías respiratorias, dando lugar a síntomas tales como ataques de sibilancia y tos. Además, el asma bronquial se dice que está causado por la combinación de hipersensibilidad de las vías respiratorias, diátesis alérgica y el entorno. Se producen síntomas recurrentes tales como sibilancia, apnea, opresión torácica y tos especialmente por la noche o por la mañana temprano.
Varias células y componentes celulares, especialmente los mastocitos, eosinófilos, linfocitos T, macrófagos, neutrófilos y células epiteliales desempeñan funciones en la inflamación de las vías respiratorias. La inflamación está asociada con exudación plasmática, edema, agrandamiento del músculo liso, taponamiento mucoso y cambios epiteliales. Además, la inflamación causa aumentos asociados en hipersensibilidad bronquial a diversos estímulos.
La inflamación de las vías respiratorias induce atrofia del músculo liso de las vías respiratorias, ruptura microvascular e hipersensibilidad bronquial. Según aumenta la sensibilidad de las vías respiratorias, los síntomas llegan a ser más graves y continuos, y aumenta la variación diaria de la función pulmonar. El mecanismo de implicación de la inflamación de las vías respiratorias en la sensibilidad bronquial es desconocido, y se han demandado herramientas útiles para dilucidar la patología del asma, y medicamentos y similares.
Se sabe que un grupo de moléculas receptoras llamadas MAIR (receptores de tipo Ig asociados mieloides) se expresan en la membrana celular de células mieloides (médula ósea) responsables de la inmunidad natural (documento que no es patente 1). Entre estos, MAIR-I, que también es conocido como CD300a (también mencionado como "LMIR1" o "CLM-8"), se expresa en macrófagos, mastocitos, granulocitos (neutrófilos) y células dendríticas, y se sabe que es un receptor inhibidor que se asocia con fosfatasa mediante la secuencia iT iM (motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptor) en el dominio intracelular para transmitir una señal inhibidora (documento que no es patente 2). Sin embargo, el ligando para este receptor es desconocido, y el receptor se ha denominado receptor huérfano.
Documentos de la técnica anterior
[Documentos de patente]
[Documento de patente 1] JP 2007-297379-A
[Documento de patente 2] JP 2011-516609 A
[Documentos que no son de patente]
[Documento que no es de patente 1] Yotsumoto et al., J Exp Med 198 (2), 223-233, 2003
[Documentos que no son de patente 2] Okoshi Y et al., Int Immunol., 17, 65-72, 2005.
[Documentos que no son de patente 3] Asano K et al., Nature Genetics 41. 1325-1329(2009)
[Documentos que no son de patente 4] Miho Masuoka et al., J Clin Invest. 2012; doi: 10. 1172/JC158978
Se divulga el mecanismo regulador de activación de la respuesta inmunitaria innata mediante la transducción de señales inhibidoras de CD300a, y un medio para regular la actividad de células que expresan CD300a implicadas en la transducción de señales inhibidoras, un medio para tratar o prevenir enfermedades o estados patológicos en que está implicada la actividad y técnicas y similares asociadas con estos.
Para dilucidar el ligando de CD300a y la función de CD300a, los autores de la presente invención estudiaron intensivamente para descubrir lo siguiente.
(i) El ligando de CD300a es fosfatidilserina (PS).
(ii) La unión de PS a CD300a en mastocitos y similares promueve la transducción de señales inhibidoras mediante CD300a, y la activación de los mastocitos y similares también se suprime de este modo.
(iii) La inhibición de la unión de CD300a en mastocitos y similares a Ps por coexistencia de una sustancia de unión a fosfatidilserina o sustancia de unión a CD300a suprime la transducción de señales inhibidoras de CD300a, y el estado activo de los mastocitos y simialres se mantiene.
(iv) Mediante la supresión o el mantenimiento del estado activo, pueden tratarse infecciones inflamatorias, enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunitarias y similares.
(v) Los ratones deficientes del gen de CD300a pueden ser una herramienta para realizar análisis de patología de enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunitarias, y cribar componentes eficaces de medicamentos.
La presente invención proporciona un modulador de la actividad para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad alérgica o una enfermedad autoinmunitaria como se define en las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto, la presente invención proporciona un modulador de la actividad para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad alérgica o una enfermedad autoinmunitaria, en el que dicho modulador de la actividad es un anticuerpo neutralizante contra CD300a que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina y suprime la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a.
También se divulgan:
[1] Un modulador de la actividad para suprimir la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, comprendiendo el modulador de la actividad una sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina.
[2] El modulador de la actividad de acuerdo con [1], en el que la sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina es una sustancia de unión a fosfatidilserina.
[3] El modulador de la actividad de acuerdo con [2], en el que la sustancia de unión a fosfatidilserina es al menos una seleccionada del grupo que consiste en MFG-E8, mutantes de MFG-E8, inmunoglobulina de linfocitos T, TIM-1 soluble, TIM-4 soluble, estabilina soluble e integrina avp3 soluble.
[4] El modulador de la actividad de acuerdo con [1], en el que la sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina es una sustancia de unión a CD300a.
[5] El modulador de la actividad de acuerdo con [4], en el que la sustancia de unión a CD300a es un anticuerpo antiCD300a humano que comprende: una región variable de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos; y una región variable de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos.
[6] El modulador de la actividad de acuerdo con [4], en el que la sustancia de unión a CD300a es un anticuerpo antiCD300a de ratón que comprende: una región variable de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 34 o 5 aminoácidos; y una región variable de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos.
[7] Un modulador de la actividad para promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, comprendiendo el modulador de la actividad una sustancia que promueve la unión de CD300a a fosfatidilserina.
[8] El modulador de la actividad de acuerdo con [7], en el que la sustancia que promueve la unión de CD300a a fosfatidilserina es fosfatidilserina.
[9] Un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o estado patológico en que está implicada la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, comprendiendo el medicamento el modulador de la actividad de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [8].
[10] El medicamento de acuerdo con [9], en el que la enfermedad o el estado patológico en que está implicada la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a es una infección inflamatoria, enfermedad alérgica o enfermedad autoinmunitaria.
[11] El medicamento de acuerdo con [10] para el tratamiento o la profilaxis de peritonitis o septicemia causada por la misma, comprendiendo el medicamento el modulador de la actividad de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6].
[12] El medicamento de acuerdo con [10] para el tratamiento de enfermedad inflamatoria del intestino, comprendiendo el medicamento el modulador de la actividad de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6].
[13] El medicamento de acuerdo con [10] para el tratamiento de enfermedad celíaca, comprendiendo el medicamento el modulador de la actividad de acuerdo con [7] u [8].
[14] El medicamento de acuerdo con [10] para el tratamiento de dermatitis atópica, comprendiendo el medicamento el modulador de la actividad de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6].
[15] El medicamento de acuerdo con [10] para el tratamiento de asma, comprendiendo el medicamento el modulador de la actividad de acuerdo con uno cualquiera de [1] a [6].
[16] Uso de un ratón deficiente del gen de CD300a para realizar análisis de patología de una enfermedad alérgica o enfermedad autoinmunitaria. o para cribar una posible sustancia candidata para un componente eficaz de un agente terapéutico o agente profiláctico para la enfermedad.
[17] El uso de acuerdo con [16], que comprende el uso del ratón deficiente del gen de CD300a como un modelo de ratón en que se induce apenas enfermedad inflamatoria del intestino después de administración de una sustancia que induce enfermedad inflamatoria del intestino.
[18] El uso de acuerdo con [16], que comprende el uso del ratón deficiente del gen de CD300a como un modelo de ratón que desarrolla enfermedad celíaca después de administración de una sustancia que induce enfermedad celíaca.
[19] El uso de acuerdo con [16], que comprende la etapa de: administrar una sustancia candidata para un agente terapéutico para enfermedad celíaca al ratón deficiente del gen de CD300a que desarrolló enfermedad celíaca, y determinar la presencia o la ausencia de un efecto terapéutico; o administrar una sustancia candidata para un agente profiláctico para enfermedad celíaca junto con la sustancia que induce enfermedad celíaca al ratón deficiente del gen de CD300a antes del desarrollo de enfermedad celíaca, y determinar la presencia o la ausencia de un efecto profiláctico.
[20] El uso de acuerdo con [16], que comprende el uso del ratón deficiente del gen de CD300a como un modelo de ratón que desarrolla apenas dermatitis atópica después de administración de una sustancia que induce dermatitis atópica.
[21] El uso de acuerdo con [16], que comprende el uso del ratón deficiente del gen de CD300a como un modelo de ratón que desarrolla apenas asma después de administración de una sustancia que induce asma.
[22] Un anticuerpo antiCD300a humano que comprende: una región variable de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos; y una región variable de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 34 o 5 aminoácidos.
[23] Un anticuerpo antiCD300a de ratón que comprende: una región variable de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 34 o 5 aminoácidos; y una región variable de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1, 2, 34 o 5 aminoácidos.
En cuanto a otros aspectos de las divulgaciones descritas anteriormente, se proporcionan las siguientes divulgaciones.
Con respecto a la divulgación [1], se divulga un método para suprimir la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, cuyo método comprende inhibir la unión de CD300a a fosfatidilserina. Este método es aplicable in vivo o ex vivo/in vitro, y, en caso de aplicación in vivo, la especie del organismo puede ser humana o no humana (por ejemplo, mamífero tal como ratón).
Con respecto a la divulgación [1], se divulga el uso de una sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina en la producción de un modulador de la actividad para suprimir la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a.
En cuanto a la sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina para realizar el método o el uso, puede usarse la sustancia de unión a fosfatidilserina indicada en [2], preferiblemente MFG-E8 o similar indicada en [3]. Asimismo, en cuanto a la sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina para realizar el método, puede usarse la sustancia de unión a CD300a indicada en [4], preferiblemente el anticuerpo antiCD300a humano que comprende una región variable de cadena H y una región variable de cadena L que tiene las secuencias de aminoácidos impuestas indicadas en [5], o el anticuerpo antiCD300a de ratón que comprende una región variable de cadena H y una región variable de cadena L que tiene las secuencias de aminoácidos prescritas indicadas en [6].
Con respecto a la divulgación [7], se divulga un método para promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, cuyo método comprende promover la unión de CD300a a fosfatidilserina. Este método es aplicable in vivo o ex vivo/in vitro, y, en caso de aplicación in vivo, la especie del organismo puede ser humana o no humana (por ejemplo, mamífero tal como ratón).
Con respecto a la divulgación [7], se divulga el uso de una sustancia que promueve la unión de CD300a a fosfatidilserina en la producción de un modulador de la actividad para promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a.
En cuanto a la sustancia que promueve la unión de CD300a a fosfatidilserina para realizar el método o el uso, puede usarse la fosfatidilserina indicada en [8].
Con respecto a la divulgación [9], se divulga un método para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o estado patológico en que está implicada la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, cuyo método comprende inhibir o promover la unión de CD300a a fosfatidilserina, suprimiendo o promoviendo de este modo la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a. Este método es aplicable in vivo o ex vivo/in vitro, y, en casos de aplicación in vivo, la especie del organismo puede ser humana o no humana (por ejemplo, mamífero tal como ratón).
Con respecto a la divulgación [9], se divulga el uso de un modulador de la actividad que inhibe o promueve la unión de CD300a a fosfatidilserina para suprimir o promover de ese modo la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, en la producción de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o estado patológico en que está implicada la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a.
Ejemplos de la enfermedad o estado patológico en el método o uso incluyen infección inflamatoria, enfermedad alérgica y enfermedad autoinmunitaria como se indica en [10], y ejemplos específicos de la enfermedad o estado patológico incluyen la peritonitis o septicemia causada por la misma, enfermedad inflamatoria del intestino, enfermedad celíaca, dermatitis atópica y asma como se indica en [11] a [15].
Con respecto a la divulgación [16], se divulga un método para realizar análisis patológico de una enfermedad alérgica o enfermedad autoinmunitaria, o para cribar una posible sustancia candidata para un componente eficaz de un agente terapéutico o agente profiláctico para la enfermedad, usando un ratón deficiente del gen de CD300a. El ratón deficiente del gen de CD300a usando en el método es un ratón modelo en que se induce apenas enfermedad inflamatoria del intestino, dermatitis atópica o asma, o un ratón modelo que desarrolla enfermedad celíaca, como se indica en [17], [18], [20] o [21] después de la administración de una sustancia que induce cada enfermedad alérgica o enfermedad autoinmunitaria. Especialmente el método es preferiblemente un método para enfermedad celíaca, que comprende las etapas prescritas indicadas en [19].
Se divulga la preparación de un modulador de la actividad que puede suprimir o promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, y la producción de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o estado patológico en que está implicada la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, cuyo medicamento comprende como componente eficaz el modulador de la actividad. Además, se divulga el uso de un ratón deficiente del gen de CD300a como un modelo de ratón o similar, y la producción de un anticuerpo antiCD300a que tiene excelente actividad neutralizante.
Breve descripción de los dibujos
La fig. 1 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 1A.
La fig. 2A muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 1B.
La fig. 2B muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 1B.
La fig. 2C muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 1C.
La fig. 2D muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 1D.
La fig. 2E muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 1D.
La fig. 2F muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia obtenidos en el ejemplo 1E.
La fig. 3A es un diagrama esquemático para ilustrar la estructura del gen de CD300a en el alelo de tipo silvestre, el vector de dirección usado para preparar un ratón deficiente del gen de CD300a y el alelo diana.
La fig. 3B es una fotografía tomada después de la electroforesis de productos de PCR del alelo de tipo silvestre y del alelo mutante.
La fig. 3C muestra los resultados de transferencia de Western usando un ratón de tipo silvestre y un ratón deficiente de CD300a.
La fig. 3D muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de un ratón WT y un ratón deficiente del gen de CD300a.
La fig. 4A muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 2A.
La fig. 4B muestra los resultados del análisis en un microscopio óptico obtenido en el ejemplo 2C.
La fig. 4C muestra los resultados de microscopía confocal de barrido láser obtenidos en el ejemplo 2C.
La fig. 4D muestra los resultados obtenido en el ejemplo 2C que ilustran la relación del número de células de NIH3T3 o cada transfectante que muestra incorporación de un timocito en el citoplasma.
La fig. 5A muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 2B.
La fig. 5B muestra los resultados del análisis RT-PCR obtenidos en el ejemplo 2B.
La fig. 6A muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 3A.
La fig. 6B muestra los resultados del análisis del ensayo de p-hexaminidasa obtenidos en ejemplo 3A.
La fig. 7A muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 3B.
La fig. 7B muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 3C sobre las tasas de aumento en las cantidades de diversas citocinas y quimiocinas liberadas.
La fig. 7C muestra un diagrama que muestra los resultados obtenidos en el ejemplo 3E sobre las tasas de aumento en las cantidades de diversas citocinas y quimiocinas liberadas.
La fig. 7D muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia obtenidos en el ejemplo 3F.
La fig. 7E muestra un diagrama que muestra los resultados del análisis de inmunotransferencia obtenidos en ejemplo 3G.
La fig. 7F muestra un diagrama que muestra la tasa de aumento de TNF-a, obtenido en el ejemplo 3G.
La fig. 8 muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 3D.
La fig. 9A muestra los resultados del análisis densitométrico obtenidos en el ejemplo 4B.
La fig. 9B muestra los resultados del análisis densitométrico obtenidos en el ejemplo 4B.
La fig. 10A muestra un diagrama que muestra los resultados del cálculo de las UFC de bacterias aeróbicas, obtenidos en el ejemplo 4C.
La fig. 10B muestra un diagrama que muestra los números de neutrófilos y macrófagos obtenidos en el ejemplo 4C después de inducción de neutrófilos CD300a.
La fig. 11 muestra un diagrama que muestra la tasa del número de cada tipo de macrófagos que mostraban fagocitosis de E. coli.
La fig. 12A muestra un diagrama que muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en ejemplo 4D.
La fig. 12B muestra un diagrama que muestra la tasa de supervivencia de cada tipo de ratón, obtenidos en el ejemplo 4D.
La fig. 12C muestra un diagrama que muestra la eliminación bacteriana en el intestino en cada tipo de ratón en ejemplo 4D, en términos de UFC bacterianas.
La fig. 12D muestra los resultados del análisis de citometría de flujo obtenidos en el ejemplo 4E.
La fig. 12E muestra un diagrama que muestra la tasa de supervivencia de cada grupo de ratones después de la administración de TX41 en ejemplo 4F.
La fig. 12F muestra un diagrama que muestra la eliminación en el intestino después de la administración de TX41 en el ejemplo 4G.
La fig. 12G muestra un diagrama que muestra el resultado del análisis del cambio en el número de neutrófilos después de la administración de TX41 en ejemplo 4G.
La fig. 13A muestra un diagrama que ilustra el protocolo para la inducción de asma con ovoalbúmina.
La fig. 13B muestra el número de células totales en el líquido de lavado alveolar de cada ratón en el día 25 después de empezar la inducción de asma en ejemplo 5A.
La fig. 13C muestra la relación de eosinófilos en el líquido de lavado alveolar de cada ratón en el día 25 después de empezar la inducción de asma en ejemplo 5B.
La fig. 14 muestra el valor de IgE en suero en cada ratón en el 14 después de empezar la inducción de asma en el ejemplo 5B.
La fig. 15 muestra un diagrama que muestra cambios en el peso corporal con el tiempo debido a la enteritis inducida por DSS en cada grupo de ratones (ejemplo 6A).
La fig. 16A muestra un gráfico que muestra la longitud del intestino grueso en cada tipo de ratón en el día 6 después de empezar la administración de DSS (ejemplo 6B).
La fig. 16B muestra un diagrama que muestra secciones de intestinos gruesos de un ratón WT y CD300a_/- (ejemplo 6C).
La fig. 17 muestra un diagrama par la comparación del grado de daño celular en cada tipo de ratón en el día 6 de administración de DSS, basándose en la puntuación clínica (ejemplo 6D).
La fig. 18A muestra un diagrama que muestra la cantidad de cada citoquina en el intestino grueso de cada ratón en el día 9 de administración de d Ss (ejemplo 6E).
La fig. 18B muestra un diagrama que muestra el número de cada tipo de inmunocitos en el día 0, día 2, día 4 y día 6 después de empezar la administración de DSS en cada tipo de ratón (ejemplo 6F).
La fig. 19 muestra un diagrama que muestra los resultados de citometría de flujo que se realizó para identificar células dendríticas que expresan CD300a (ejemplo 6G).
La fig. 20 muestra un diagrama que muestra los niveles relativos de expresión génica de citocinas en el intestino grueso en cada tipo de ratón (ejemplo 6H).
La fig. 21 muestra un diagrama que muestra los niveles relativos de expresión génica de citocinas en linfocitos T CD4+ (ejemplo 61).
La fig. 22 muestra un diagrama que muestra cambios en el tiempo (cambios diarios) en el número de veces de comportamiento de rascado por 30 minutos en cada tipo de ratón sensibilizado con OVA (ejemplo 7A).
La fig. 23 muestra secciones de la piel cada ratón al final de la 3.a semana después de sensibilización con OVA (ejemplo 7B).
La fig. 24 muestra un diagrama que muestra el resultado de tinción con azul de toluidina de una muestra de piel de cada ratón al final de la 3.a semana después de sensibilización con OVA (ejemplo 7C).
La fig. 25A muestra un gráfico que muestra el número de capas celulares en la epidermis en cada grupo de ratones al final de la 3.a semana después de sensibilización con OVA (ejemplo 7D).
La fig. 25B muestra los números de eosinófilos y mastocitos que mostraron infiltración en la dermis en muestras de piel de cada grupo de ratones al final de la 3.a semana después de sensibilización con OVA (ejemplo 7E). La fig. 26 muestra el resultado de inmunotinción de langerina de una muestra de piel de cada grupo de ratones al final de la 3.a semana después de sensibilización con OVA (ejemplo 7F).
La fig. 27 muestra la tinción con contraste de cada muestra en la fig. 26.
La fig. 28 muestra un diagrama que muestra un estado donde los mastocitos están interactuando con células de piel positivas para langerina (ejemplo 7H).
La fig. 29 es un diagrama que muestra una programación del ensayo para confirmar el efecto terapéutico de TX41. La fig. 30 muestra el nivel total de IgE en suero en ratones WT después de administración de TX74 o TX41, medido por el método de ELISA.
La fig. 31 muestra un diagrama que muestra el número de veces de comportamiento de rascado en ratones WT después de administración de TX74 o TX41.
La fig. 32 muestra un diagrama que muestra el resultado de la tinción con H&E de una sección de piel de un ratón WT después de administración de TX74 o TX41.
La fig. 33 muestra un diagrama que muestra un estado en que una sección de piel de un ratón WT después de administración de TX74 o TX41 se tiñió con contraste por tinción con azul de toluidina.
La fig. 34 muestra un diagrama que muestra cambios en el peso corporal (BW) en el tiempo controlados desde el inicio de la alimentación con una dieta normal o dieta alta en gluten.
La fig. 35 muestra fotografías que muestran cada una el resultado del análisis histopatológico del intestino de un ratón en la semana 20 después de empezar la alimentación con una dieta normal o dieta alta en gluten.
La fig. 36 muestra un diagrama que muestra la puntuación clínica en la semana 20 después de empezar la alimentación con una dieta normal o dieta alta en gluten en cada grupo de ratones.
La fig. 37 muestra un diagrama que muestra el número de linfocitos intraepiteliales por 100 células del epitelio intestinal en la semana 20 después de empezar la alimentación con una dieta normal o dieta alta en gluten en cada grupo de ratones.
La fig. 38 muestra un diagrama que muestra la cantidad de transglutaminasa 2 (TG2) en una suspensión del yeyuno en la semana 20 después de empezar la alimentación con una dieta normal o dieta alta en gluten en cada tipo de ratón.
La fig. 39 muestra un diagrama que muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de expresión de CD11b y CD11c en células de la lámina propia seleccionadas para la población de células CD45+PI-.
La fig. 40 muestra un diagrama que muestra la frecuencia de cada tipo de inmunocitos en la lámina propia del yeyuno en ratones WT y en ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta normal o dieta alta en gluten.
La fig. 41 muestra un diagrama que muestra los niveles de expresión génica de diversas citocinas y quimiocinas en macrófagos de la lámina propia (LP) en cada grupo de ratones.
La fig. 42 muestra un diagrama que muestra el resultado del análisis de la expresión de CD300a (MAIR-I) en cada tipo de inmunocitos por citometría de flujo.
La fig. 43 muestra un diagrama que muestra los niveles relativos de expresión de citocinas y quimiocinas en células dendríticas CD11b+ en la lámina propia (LP) en cada tipo de ratón.
La fig. 44 muestra un diagrama que muestra cambios en los niveles de expresión de citocinas inducidas por gliadina causados por adición de una proteína MFG-E8 recombinante de ratón.
La fig. 45 muestra un diagrama que muestra el resultado del análisis histopatológico del intestino grueso de un ratón Balb/c WT o ratón deficiente del gen de CD300a alimentado con una dieta normal o dieta alta en gluten. La fig. 46 muestra un diagrama que muestra los títulos de anticuerpo IgG e IgA antigliadina en sueros derivados de ratones Balb/c WT o deficientes del gen de CD300a.
La fig. 47 muestra un diagrama que muestra cambios en la tasa de cambio en el peso corporal en el tiempo (cambios semanales) en ratones Wt y ratones deficientes del gen de CD300a alimentados con una dieta sin gluten. La fig. 48 muestra un diagrama que muestra los niveles de expresión de citocinas en células dendríticas CD11b+ y macrófagos en el estado normal en la lámina propia (LP) en ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a. La fig. 49 muestra un diagrama que muestra los niveles de expresión de citocinas en macrófagos en células de exudado peritoneal inducidas por tioglicolato después de estimulación con el péptido de gliadina P31-43.
La fig. 50 es un diagrama que muestra los niveles de expresión de IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p, MCP1 y MCP5 en células dendríticas CD11b+ en la lámina propia.
La fig. 51 muestra un diagrama que muestra los niveles de expresión de IL-6, TNF-a e IFN-p en macrófagos de la lámina propia (LP) en ratones B6 WT o ratones deficientes del gen de CD300a después de estimulación con gliadina.
La fig. 52 muestra un diagrama que muestra la expresión de citocinas y quimiocinas en macrófagos de la lámina propia (LP) (estimulados con gliadina) derivados de ratones con microbiota reducida o ratones deficientes del gen de CD300a.
La fig. 53 muestra un diagrama que muestra la frecuencia de células que expresan fosfatidilserina en macrófagos de la lámina propia (LP) aislados.
La fig. 54 muestra un diagrama que muestra los niveles de expresión génica de las subunidades de integrina av y p3 en macrófagos de la lámina propia (LP) en ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a.
La fig. 55 muestra un diagrama que muestra los niveles de expresión génica de receptores de fosfatidilserina (TIM-1, TIM-4, estabilina-2, SR-PSOX, BAI1 y Mer).
La fig. 56 muestra los resultados del análisis de homología de cada una de la cadena H y cadena L de TX41 y TX49.
Descripción de realizaciones
El modulador de la actividad divulgado, un medicamento que lo comprende, uso de un ratón deficiente del gen de CD300a y un anticuerpo antiCD300a, se describen a continuación en detalle. Los documentos usados para mencionar el conocimiento convencional y un método de ensayo conocido sobre el mecanismo inmunitario, CD300a o similar se enumeran al final de los ejemplos.
[Modulador de la actividad]
El modulador de la actividad incluye aquellos que suprimen la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, así como aquellos que promueven dicha transducción de señales inhibidoras.
La "célula mieloide que expresa CD300a" en este documento incluye un mastocito, macrófago, neutrófilo, célula dendrítica y similares. CD300a es un término colectivo para los expresados en mamíferos tales como seres humanos y ratón, y la especie del organismo no está limitada.
La "transducción de señales inhibidoras" es la transducción de señales que se produce por asociación del receptor inhibidor CD300a con fosfatasa mediante la secuencia ITIM (motivo inhibidor basado en tirosina de inmunorreceptor) en el dominio intracelular.
En la siguiente descripción, como el modulador de la actividad para suprimir la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a puede tener una acción para activar una función inmunitaria como resultado, también se menciona como "inmunoestimulante" (por ejemplo, en casos donde se usa como un componente eficaz de un medicamento para una infección inflamatoria). Por otro lado, como el modulador de la actividad para promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a puede tener una acción para suprimir una función inmunitaria como resultado, también se menciona como "inmunosupresor" (por ejemplo, en casos donde se usa como un componente eficaz de un medicamento para enfermedad celíaca).
<Primer modulador de la actividad>
El primer modulador de la actividad comprende un componente que tiene una acción para suprimir la transducción de señales inhibidoras mediante CD300a. En cuanto a dicho componente, puede usarse una sustancia que inhibe la unión de fosfatidilserina a CD300a, es decir, una sustancia de unión a fosfatidilserina o sustancia de unión a CD300a. El primer modulador de la actividad puede contener uno de estos, o puede contener dos de estos.
(Sustancia de unión a fosfatidilserina)
La sustancia de unión a fosfatidilserina como primer modulador de la actividad no está limitada siempre que se usa a fosfatidilserina (PS), que es un ligando de CD300a, para inhibir la interacción entre (unión) entre la fosfatidilserina y CD300a expresado en una célula mieloide.
Los ejemplos específicos de la sustancia de unión a fosfatidilserina incluyen MFG-E8 (proteína globular de grasa de la leche EGF-8); inmunoglobulina de linfocitos T; y proteínas solubles tales como TIM-1 soluble, TIM-4 soluble, estabilina soluble e integrina avp3 soluble. Entre estas, se prefiere MFG-E8.
La sustancia de unión a fosfatidilserina no está limitada a proteínas nativas tales como MFG-E8, y puede ser una que tiene una secuencia de aminoácidos en que está eliminado, sustituido y/o añadido (mutante) uno o varios aminoácidos (por ejemplo, "D89E MFG-E8" en los ejemplos) siempre que no se pierda la capacidad de unión a fosfatidilserina.
Dicho mutante puede prepararse por un método conocido tal como mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis aleatoria.
La "proteína soluble" descrita anteriormente significa una proteína preparada modificando una proteína nativa, tal como una proteína de membrana, insoluble al diluyente descrito posteriormente o líquido corporal por, por ejemplo, eliminación de un dominio hidrófobo o adición de un péptido hidrófilo por una técnica de recombinación genética conocida de modo que la proteína llegue a ser soluble al diluyente o líquido corporal.
(Sustancia de unión a CD300a)
La sustancia de unión a CD300a como primer modulador de la actividad no está limitada siempre que se una a CD300a para inhibir la interacción (unión) entre el CD300a expresado en una célula mieloide y fosfatidilserina.
Ejemplos específicos de la sustancia de unión a CD300a incluyen anticuerpos neutralizantes contra CD300a. El anticuerpo neutralizante puede ser un único tipo particular de anticuerpo monoclonal, o puede ser una combinación de 2 o más tipos de anticuerpos monoclonales (o anticuerpos policlonales). Además, el anticuerpo neutralizante puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de anticuerpo (fragmento Fab, fragmento F(ab')2 o similar).
El anticuerpo neutralizante puede prepararse por un método conocido. En casos de un anticuerpo monoclonal, en general pueden prepararse anticuerpos monoclonales antiCD300a por, por ejemplo, un procedimiento que comprende inmunización con CD300a, preparación de hibridomas, cribado, cultivo y recuperación. A partir de los anticuerpos así preparados, puede seleccionarse un anticuerpo monoclonal apropiado que tiene una capacidad deseada (acción neutralizante) para inhibir la unión de CD300a a fosfatidilserina y puede ejercer la acción y el efecto divulgados.
(TX41, TX49 y anticuerpos similares a estos)
TX41 es un anticuerpo monoclonal antiCD300a de ratón (IgG2a de rata) y TX49 es un anticuerpo monoclonal antiCD300a humano (IgG1 de ratón). Estos dos son anticuerpos monoclonales preparados y usados en los ejemplos descritos posteriormente, y tienen excelente función de supresión de la transducción de señales por inhibición de la unión de CD300a a fosfatidilserina. Por lo tanto, estos se prefieren como sustancia de unión a CD300a. Sin embargo, los anticuerpos antiCD300a que pueden usarse en la presente invención no se limitan a TX41, TX49 y anticuerpos similares a estos (que tienen una región variable con una secuencia de aminoácidos equivalente).
La región variable en la cadena H de TX41 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17; la región variable en la cadena L de TX41 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18; la región variable en la cadena H de TX49 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19; y la región variable en la cadena L de TX49 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20. Cada una de estas regiones variables contiene 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR) y 4 regiones estructurales. La fig. 56 muestra los resultados del análisis de homología entre las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de TX41 y TX49 (para cada una de la cadena H y cadena L).
La sustancia de unión para CD300a de ratón es preferiblemente un anticuerpo en que la región variable en la cadena H tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17, y la región variable en la cadena L tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18, de acuerdo con TX41.
La sustancia de unión para CD300a humano es preferiblemente un anticuerpo en que la región variable en la cadena H tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19, y la región variable en la cadena L tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20, de acuerdo con TX49.
Además, la sustancia de unión para CD300a de ratón también puede ser un anticuerpo en que la región variable de cadena H tiene una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:17 excepto en que está sustituido, añadido, insertado y/o eliminado 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o un anticuerpo en que la región variable de cadena L tiene una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:18 excepto en que está sustituido, añadido, insertado y/o eliminado 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos (una de la cadena H y de la cadena L puede tener la mutación o mutaciones descritas anteriormente, o las dos pueden tener la mutación o mutaciones descritas anteriormente).
Además, la sustancia de unión para CD300a humano también puede ser un anticuerpo en que la región variable de cadena H tiene una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19 excepto en que está sustituido, añadido, insertado y/o eliminado 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos, o un anticuerpo en que la región variable de cadena L tiene una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:20 excepto en que está sustituido, añadido, insertado y/o eliminado 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos (una de la cadena H y de la cadena L puede tener la mutación o mutaciones descritas anteriormente, o las dos pueden tener la mutación o mutaciones descritas anteriormente).
Los sitios de dichas mutaciones preferiblemente no están en las CDR o en las cercanías de las mismas en las regiones variables. Además, en casos donde un aminoácido está sustituido, la sustitución es preferiblemente sustitución de aminoácido conservativa, en que la sustitución se produce entre aminoácidos que tienen estructuras de cadena lateral y/o propiedades químicas similares.
La forma (secuencia de aminoácidos, longitud de aminoácidos) de la región constante, es decir, la región Fab que excluye la región variable descrita anteriormente, y la región Fc, del anticuerpo antiCD300a pueden diseñarse según lo apropiado siempre que no se inhiba la acción y el efecto dirigidos, ya que la forma de la región constante apenas afecta a la capacidad de unión a CD300a, es decir, la acción neutralizante.
Es decir, el anticuerpo antiCD300a puede prepararse como una proteína de fusión compuesta de la secuencia de aminoácidos indicada anteriormente de la región variable y una secuencia de aminoácidos conocida de la región constante.
Por ejemplo, el uso de una región constante humana para la preparación de un anticuerpo antiCD300a humano como anticuerpo quimérico humano es una de las realizaciones preferidas. Dichos anticuerpo antiCD300a puede prepararse por un método conocido.
Por ejemplo, sintetizando un ADN que codifica la secuencia de aminoácidos indicada anteriormente de la región variable y uniendo el ADN sintetizado a un ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de la región constante y otro u otros ADN necesarios (uno o más factores de transcripción y/o similares), puede construirse un vector de expresión para un gen de anticuerpo antiCD300a. Introduciendo este vector en una célula hospedadora y permitiendo la expresión del gen, puede producirse el anticuerpo antiCD300a de interés.
Los TX41 TX49 mencionados anteriormentey anticuerpos similares a estos pueden usarse potencialmente también para un objetivo distinto de la acción y el efecto divulgados, es decir, la inhibición de la transducción de señales inhibidoras que se produce debido a la unión de fosfatidilserina a CD300a.
Además, suprimiendo la expresión de CD300a en células mieloides en la zona afectada usando un ARNip diseñado basado en una secuencia génica de CD300a (disponible en bases de datos de ADN tales como DDBJ/EMBL/GenBank=INSD), pueden obtenerse efectos terapéuticos para las diversas enfermedades descritas anteriormente como en los casos donde se elimina el gen de CD300a o se inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina. En otras palabras, puede decirse que un ARNip contra el gen de CD300a es la sustancia que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina.
(Uso del primer modulador de la actividad)
El primer modulador de la actividad puede usarse para suprimir la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a. En este caso, la célula mieloide puede ser una célula mieloide presente en el organismo, o una célula mieloide separada del organismo o cultivada in vitro.
Manteniendo o aumentando la señalización de activación mediante CD300a de la célula mieloide por la acción anterior, también puede mantenerse o aumentarse la transducción de señales intracelulares mediante mediadores químicos liberados desde la célula mieloide, y también puede influir en la inflamación, reacción alérgica y similares que están causadas por transducción de señales intercelulares adicionales que se produce después de ello. Por lo tanto, el primer modulador de la actividad puede usarse como un componente eficaz (por ejemplo, como un inmunoestimulante) de los medicamentos específicos descritos posteriormente. Además, por ejemplo, el primer modulador de la actividad puede usarse también como un componente eficaz de un agente a usarse como herramienta de análisis comparativo para análisis comparativo realizado después de mejorar el estado patológico de asma, dermatitis atópica, enfermedad inflamatoria del intestino o septicemia en un animal de laboratorio.
Los expertos en la materia pueden presumir suficientemente de que las sustancias de unión a CD300a (anticuerpos neutralizantes tales como TX41 y TX49) y sustancias de unión a fosfatidilserina (MFG-E8 y similares) pueden ser agentes terapéuticos para enfermedades que se ha descubierto que muestran mejora de los síntomas por eliminación del gen de CD300a (es decir, por prevención completa de la unión de CD300a a fosfatidilserina), tal como dermatitis atópica y similares descritos en los ejemplos.
Por otro lado, los expertos en la materia también pueden presumir suficientemente de que la fosfatidilserina puede ser un agente terapéutico para enfermedades que se ha descubierto que muestran desarrollo o exacerbación de los síntomas por eliminación del gen de CD300a (es decir, por prevención completa de la unión de CD300a a fosfatidilserina), tal como enfermedad celíaca descrita en los ejemplos.
<Segundo modulador de la actividad>
El segundo modulador de la actividad contiene un componente que tiene una acción para promover la transducción de señales inhibidoras mediante CD300a (es decir, para suprimir la señalización de activación de CD300a). Dicho componente puede ser una sustancia que promueve la unión de fosfatidilserina a CD300a. La sustancia es especialmente fosfatidilserina, que es un ligando de CD300a.
Además, realizando el cribado usando los ratones deficientes del gen de CD300a, pueden descubrirse agonistas (compuestos de bajo peso molecular, anticuerpos y similares) para CD300a que tienen la misma acción que la fosfatidilserina, y dichos agonistas también pueden usarse como sustancias que promueven la unión de fosfatidilserina a CD300a.
(Fosfatidilserina)
La fosfatidilserina (PS) es un ligando de CD300a expresado en células mieloides, y la interacción (unión) entre PS y CD300a promueve la señalización inhibidora de células que expresan CD300a. Por ejemplo, en mastocitos, las actividades asociadas a la reacción inflamatoria que causan la liberación de mediadores químicos tales como histamina, citocinas y quimiocinas se suprimen mediante esta señal inhibidora. PS se produce de forma industrial, y puede obtenerse fácilmente.
Para células mieloides que expresan CD300a colocadas in vitro (en un entorno de ensayo), células apoptóticas que presentan PS (se sabe que PS está presente dentro de la célula (en la capa del lado del citoplasma de la bicapa lipídica) en una célula normal, pero presentado fuera de la célula tras la aparición de apoptosis) también puede ser un segundo modulador de la actividad. Además, los liposomas y similares que tienen una membrana lipídica que contiene PS formada en el exterior pueden usarse potencialmente como segundos moduladores de la actividad.
(Sal de calcio)
Como la interacción entre PS y CD300a en mastocitos requiere iones de calcio, el segundo modulador de la actividad preferiblemente contiene una sal de calcio que genera un ion de calcio por ionización (por ejemplo, cloruro de calcio).
El contenido de la sal de calcio en el segundo modulador de la actividad puede determinarse apropiadamente considerando la concentración de iones de calcio en el sitio de administración, la cantidad de PS contenida en el segundo modulador de la actividad, y similares.
(Uso del segundo modulador de la actividad)
El segundo modulador de la actividad puede usarse para promover la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a. En este caso, la célula mieloide puede ser una célula mieloide presente en el organismo, o una célula mieloide separada del organismo o cultivada in vitro.
Suprimiendo la señalización de activación mediante CD300a de la célula mieloide por la acción anterior, también se suprime la transducción de señales intracelulares mediante mediadores químicos liberados desde la célula mieloide, y la inflamación, reacción alérgica y similares que están causadas por transducción de señales intercelulares adicionales que se producen después de ello. Por lo tanto, el segundo modulador de la actividad puede usarse como un componente eficaz (por ejemplo, como un inmunosupresor) de los medicamentos específicos descritos posteriormente. Además, por ejemplo, el segundo modulador de la actividad puede usarse también como un componente eficaz de un agente a usar como herramienta de análisis comparativo para análisis comparativo realizado después de mejora de la enfermedad celíaca en un animal de laboratorio.
[Medicamento]
El medicamento (composición farmacéutica) contiene el modulador de la actividad como se describe anteriormente como componente eficaz (por ejemplo, inmunoestimulador o inmunosupresor) y puede contener además diversos aditivos farmacéuticamente aceptables (por ejemplo, un vehículo), si fuera necesario.
Dicho medicamento puede formularse para el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad o síntoma (especialmente reacción de inflamación) en que está implicada la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a, tal como una infección inflamatoria, enfermedad alérgica o enfermedad autoinmunitaria.
El "tratamiento" incluye no solamente curar una enfermedad o síntoma, sino también mejorar (aliviar) una enfermedad o síntoma. La "profilaxis" incluye no solamente la prevención de una enfermedad o síntoma por anticipado, sino también la prevención de recidiva de una enfermedad o síntoma después de curar la enfermedad o síntoma.
Más específicamente, mezclando el primer modulador de la actividad como componente eficaz, puede prepararse un medicamento o similar para el tratamiento o la profilaxis de peritonitis bacteriana o septicemia causada por la misma, enfermedad inflamatoria del intestino, dermatitis atópica o asma.
Además, mezclando el segundo modulador de la actividad como componente eficaz, puede prepararse un medicamento o similar para el tratamiento o la profilaxis de enfermedad celíaca.
El sitio de administración del medicamento no está limitado, y puede ser un sitio donde se está produciendo función inmunitaria excesiva (reacción de inflamación), dependiendo de la enfermedad o del estado patológico al que se aplica el medicamento. Ejemplos del sitio incluyen sitios intraperitoneal, intratraqueal, subcutáneo, intradérmico e intraurogenital.
Como las células mieloides que expresan CD300a están habitualmente presentes en tejidos submucosos y tejidos conjuntivos en mamíferos, el medicamento preferiblemente se administra directamente al tejido submucoso o tejido conjuntivo en el sitio descrito anteriormente, o en las cercanías del mismo. La administración puede realizarse por inyección tal como inyección intravenosa, inyección intrarterial, inyección subcutánea, inyección intradérmica, inyección intramuscular o inyección intraperitoneal. Por ejemplo, en casos de tratamiento o profilaxis de una infección inflamatoria (por ejemplo, peritonitis bacteriana), se prefiere inyección intraperitoneal.
La dosis por administración y el número de dosis del medicamento (o el componente eficaz contenido en el mismo) varían dependiendo de la edad, sexo y peso corporal del paciente; los síntomas; el grado del efecto terapéutico requerido; el método de administración; el periodo de tratamiento; el tipo del componente eficaz; y similares; y pueden controlarse apropiadamente. El número de dosis es, por ejemplo, de 1 a varias dosis al día.
En casos donde el medicamento contiene como componente eficaz una sustancia de unión a fosfatidilserina como primer modulador de la actividad, el medicamento puede formularse de modo que la dosis por administración de la sustancia de unión a fosfatidilserina sea habitualmente de 3 a 15 mg, preferiblemente de 5 a 10 mg por 1 kg del ser humano o animal sometido a la administración.
En casos donde el medicamento contiene como componente eficaz una sustancia de unión a CD300a como primer modulador de la actividad, el medicamento puede formularse de modo que la dosis por administración de la sustancia de unión a CD300a sea habitualmente de 50 a 150 mg, preferiblemente de 50 a 100 mg por 1 kg del ser humano o animal sometido a la administración.
En casos donde el medicamento contiene como componente eficaz un segundo modulador de la actividad, el medicamento puede formularse de modo que la dosis por administración de fosfatidilserina sea habitualmente de 3 a 150 mg, preferiblemente de 5 a 100 mg por 1 kg del ser humano o animal sometido a la administración en vista del aumento adicional del efecto inmunosupresor.
(Vehículo farmacéuticamente aceptable)
El medicamento puede contener un vehículo farmacéuticamente aceptable, si fuera necesario.
El vehículo farmacéuticamente aceptable no está limitado siempre que no deteriore el propósito del medicamento, y ejemplos del vehículo incluyen diluyentes tales como diluyentes acuosos y diluyentes no acuosos; estabilizantes/conservantes tales como antioxidantes (por ejemplo, sulfito); tampones tales como fosfatos; emulsionantes tales como tensioactivos; agentes colorantes; espesantes; anestésicos locales tales como lidocaína; solubilizantes tales como glicoles; agentes isotónicos tales como cloruro de sodio y glicerina; y otros aditivos.
Por ejemplo, en casos donde la forma de dosificación del medicamento es una solución de inyección, el componente eficaz se disuelve o dispersa preferiblemente en un diluyente mezclando el diluyente de modo que se consiga una viscosidad deseada y concentraciones deseadas de los componentes.
Ejemplos de dicho diluyente incluyen diluyentes acuosos tales como solución salina fisiológica y agua destilada para inyección disponible en el mercado; y diluyentes no acuosos tales como polietilenglicol y alcoholes incluyendo etanol.
El medicamento cuya forma de dosificación es una solución de inyección puede esterilizarse por filtración a través de un filtro o puede esterilizarse mezclando un microbicida o similar, de acuerdo con un método convencional.
En casos donde el modulador de la actividad se administra como una solución de inyección, puede estar en forma de una solución de inyección a preparar en el momento de su uso. Por ejemplo, una forma sólida de dosificación que contiene el modulador de la actividad puede prepararse por liofilización o similar, y después puede disolverse o dispersarse en un diluyente para preparar una solución de inyección en el momento de la administración.
<Medicamento para infección inflamatoria>
La inhibición de la unión de fosfatidilserina a células que expresan CD300a (mastocitos) posibilita el mantenimiento o la mejora de la actividad de los mastocitos. Esto aumenta el número de neutrófilos y activa el ataque de los neutrófilos a los patógenos (bacterias, parásitos y similares), mejorando de ese modo la función de suprimir el crecimiento de patógenos y la función de eliminación del patógeno. Por tanto, usando el primer modulador de la actividad (sustancia de unión a fosfatidilserina o sustancia de unión a CD300a) como componente eficaz (inmunoestimulante), puede obtenerse un medicamento para una infección inflamatoria.
<Medicamento para enfermedad inflamatoria del intestino>
La inhibición de la unión de fosfatidilserina a células que expresan CD300a (células dendríticas CD11 b positivas en la lámina propia del intestino grueso) aumenta la producción, mediante células CD4+ y similares, de IL-10, que se sabe que suprime la inducción del crecimiento de linfocitos T inflamatorios. Esto suprime la activación de linfocitos T inflamatorios y permite el mantenimiento de la homeostasis del sistema inmunitario intestinal. Por tanto, usando el primer modulador de la actividad como componente eficaz, puede obtenerse un medicamento para enfermedad inflamatoria del intestino.
<Medicamento para dermatitis atópica>
La inhibición de la unión de fosfatidilserina a células que expresan CD300a puede suprimir la infiltración celular de eosinófilos, mastocitos (que se sabe que interactúan con células dendríticas de la piel positivas a langerina en la dermis para activar linfocitos T CD4 positivos) y monocitos; suprime la hiperplasia de la epidermis (fibroblastos); y disminuye la concentración total en suero de IgE. Por tanto, usando el primer modulador de la actividad como componente eficaz, puede obtenerse un medicamento para dermatitis atópica.
<Medicamento para asma>
La inhibición de la unión de fosfatidilserina a células que expresan CD300a puede suprimir la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias, y disminuye la concentración total en suero de IgE. Por tanto, usando el primer modulador de la actividad como componente eficaz, puede obtenerse un medicamento para asma.
<Medicamento para enfermedad celíaca>
En casos donde se mantiene la unión de fosfatidilserina a células que expresan CD300a (macrófagos en la lámina propia del intesnio grueso), las rutas de señalización de gliadina inhibidoras mediadas por MyD88 y TRIF desempeñan funciones protectoras en la progresión de la enfermedad celiaca. Por tanto, usando el segundo modulador de la actividad como componente eficaz (inmunosupresor), puede obtenerse un medicamento para enfermedad celíaca.
[Uso del ratón deficiente del gen de CD300a]
<Usos relacionados en enfermedad celíaca>
De acuerdo con un descubrimiento obtenido por los autores de la presente invención, la inducción de la enfermedad celíaca por administración de un péptido de gliadina derivado del gluten, que se sabe que es una sustancia que induce la enfermedad celíaca, a ratones deficientes del gen de CD300a causa síntomas más graves de enfermedad celíaca que la administración a ratones de tipo silvestre.
Es decir, puede usarse un ratón deficiente del gen de CD300a como ratón modelo que desarrolla enfermedad celíaca mediante la administración de una sustancia que induce enfermedad celíaca.
El ratón modelo de enfermedad celíaca es un ratón en que el gen de CD300a está inactivado y la liberación de citocinas antinflamatorias desde los mastocitos y los macrófagos está sin reprimir.
El ratón muestra síntomas de enfermedad celíaca (inflamación del intestino delgado) en casos donde el ratón se alimenta desde una fase temprana (desde final de la mediana edad) con una sustancia que induce enfermedad celíaca. Por tanto, el ratón es útil para dilucidar la causa de la enfermedad celíaca y desempeña una función importante en el desarrollo de un agente terapéutico para enfermedad celíaca.
Los síntomas de enfermedad celíaca pueden confirmarse por, por ejemplo, un método conocido en que se administra una sustancia inductora de inflamación al ratón, y después se observa una sección del epitelio del intestino delgado del ratón al microscopio.
El ratón modelo de enfermedad celíaca puede usarse también para cribar agentes terapéuticos para enfermedad celíaca. En particular, como el ratón muestra de forma segura síntomas de enfermedad celíaca, el ratón es útil para el desarrollo no solamente de agentes terapéuticos a aplicar después de la aparición de los síntomas de enfermedad celíaca, sino también agentes profilácticos para enfermedad celíaca.
Además, el ratón modelo también es útil para la evaluación de agentes terapéuticos para enfermedad celíaca que ya han demostrado ser terapéuticamente eficaces.
Por ejemplo, el ratón modelo es útil para estudiar la concentración óptima de un agente terapéutico que tiene un efecto terapéutico dentro de un determinado intervalo de concentración, pero no tiene el efecto a una concentración inferior al intervalo y muestra toxicidad a una concentración mayor que el intervalo.
Más específicamente, los ratones modelo de enfermedad celíaca se dividen en un grupo de ratones de ensayo y un grupo de ratones de control, y se administra un agente terapéutico a ensayar al grupo de ratones de ensayo. Comparando la secciones del epitelio del intestino delgado entre los grupos, puede evaluarse el efecto del agente terapéutico.
Además, dando el agente terapéutico al grupo de ratones de ensayo a diferentes concentraciones, puede estudiarse una cantidad terapéuticamente eficaz y óptima del agente terapéutico.
Es decir, el ratón deficiente del gen de CD300a puede emplearse para usos en que se administra una sustancia candidata para un agente terapéutico para enfermedad celíaca al ratón deficiente del gen de CD300a con enfermedad celíaca para observar si el agente es terapéuticamente eficaz o no; usos en que se administra una sustancia candidata para un agente profiláctico para enfermedad celíaca junto con la sustancia que induce enfermedad celíaca al ratón deficiente del gen de CD300a antes del desarrollo de la enfermedad celíaca para observar su el agente es profilácticamente eficaz o no; y usos para analizar la patología de la enfermedad celíaca.
El receptor de CD300a (MAIR-I) está ubicado después de la transducción de señales para suprimir la producción de citocinas antinflamatorias. Por lo tanto, mediante la administración de un agonista de CD300a (MAIR-I) o transductor de señales que mantiene o promueve la transducción de señales para suprimir la producción de citocinas antinflamatorias, se espera mejorar los síntomas de enfermedad celíaca.
Por tanto, el ratón deficiente del gen de CD300a también puede usarse preferiblemente en cribado para hallar agonistas; para hallar transductores de señales que complementen la transducción de señales posterior al receptor MAIR-I, y sustancias que induzcan dichos transductores de señales; y para hallar genes implicados en la producción de dichos transductores de señales y similares.
Este cribado puede realizarse por análisis diferencial entre los ratones deficientes del gen de CD300a y ratones WT mediante análisis de micromatriz de ADN, electroforesis bidimensional de proteínas o similares.
<Usos relacionados con dermatitis atópica>
La dermatitis atópica es hipersensibilidad asociada con reacción alérgica, y acompañada por inflamación cutánea (eczema o similares).
La dermatitis atópica está causada por la entrada de una sustancia alérgica (antígeno) en el organismo seguida de producción de periostina debido a la estimulación por sustancias (interleucinas 4 y 13) secretadas por inmunocitos activados, y después la unión de la periostina a otra proteína "integrina" en la superficie de queratinocitos en la piel, causando inflamación.
La unión de periostina a integrina causa la producción de otras sustancias inductoras de inflamación, y los síntomas continúan incluso en ausencia del antígeno, provocando cronicidad. Se ha demostrado, por un experimento usando ratones, que la inhibición de la unión de periostina a integrina evita la aparición de dermatitis atópica (documento 31 enumerado a continuación).
De acuerdo con un descubrimiento obtenido por los autores de la presente invención, la administración de una sustancia que induce dermatitis atópica (antígeno de ácaros, ovoalbúmina o similares) a ratones deficientes del gen de CD300a causa síntomas más leves de dermatitis atópica que la administración a ratones silvestres.
Es decir, el ratón deficiente del gen de CD300a puede usarse como ratón modelo que apenas desarrolla dermatitis atópica. Además, el ratón deficiente del gen de CD300a puede usarse para el análisis de rutas de señalización implicadas en dermatitis atópica, análisis patológico de dermatitis atópica y similares en relación a la producción de IL-4 e IL-13.
<Usos relacionados con asma>
El asma bronquial es una enfermedad respiratoria en que la inflamación bronquial activada por una reacción alérgica o infección con una bacteria o virus llega a ser crónica, causando hipersensibilidad aumentada de las vías respiratorias y estrechamiento reversible de las vías respiratorias, que da lugar a ataques de sibilancias, tos y similares. Además, el asma bronquial se dice que está causado por la combinación de hipersensibilidad de las vías respiratorias, diátesis alérgica y el entorno.
De acuerdo con un descubrimiento obtenido por los autores de la presente invención, la administración de una sustancia que induce asma (antígeno de ácaros, ovoalbúmina o similares) a ratones deficientes del gen de CD300a para inducir asma causa síntomas más leves de asma que la administración a ratones silvestres.
Es decir, el ratón deficiente del gen de CD300a puede usarse como ratón modelo que apenas desarrolla asma después de administración de una sustancia que induce asma, y también puede usarse para dilucidar las rutas de señalización implicadas en asma, análisis patológico del asma y similares.
<Usos relacionados con enfermedad inflamatoria del intestino>
De acuerdo con un descubrimiento obtenido por los autores de la presente invención, la inducción de enfermedad inflamatoria del intestino en ratones deficientes del gen de CD300a mediante un método conocido tal como la administración de una sustancia inductora de inflamación (por ejemplo, DSS) causa síntomas más leves de enfermedad inflamatoria del intestino que en ratones de tipo silvestre.
Es decir, el ratón deficiente del gen de CD300a puede usarse como un ratón modelo que apenas desarrolla una enfermedad inflamatoria después de la administración de una sustancia que induce enfermedad inflamatoria del intestino, y también puede usarse para el análisis patológico y similares de la enfermedad inflamatoria del intestino en relación con el gen causante de la enfermedad.
(Método para preparar ratón deficiente del gen de CD300a)
El ratón deficiente del gen de CD300a es un ratón en que el gen de CD300a en el cromosoma se remplaza por un gen de CD300a inactivo y, por tanto, la función de la proteína CD300a es deficiente.
El "gen de CD300a inactivo" significa un gen que no puede expresar la proteína CD300a normal debido a, por ejemplo, eliminación parcial del gen de CD300a, inserción de otra secuencia de bases a la región codificante del gen de CD300a, una o más mutaciones puntuales en el gen de CD300a o mutación en una región reguladora para la expresión del gen de CD300a. Ejemplos del gen deficiente de CD300a incluyen, aunque sin limitación, genes en que se elimina al menos uno de los exones 1 a 6 contenidos en el gen de CD300a.
La expresión "la función de la proteína CD300a es deficiente" significa que al menos una parte de la función de la proteína CD300a implicada en la transducción de señales inhibidoras se pierde (por ejemplo, la función de la proteína CD300a se pierde parcialmente por remplazo de uno de los alelos por una forma inactiva, como en un ratón con genes inactivados heterocigótico), preferiblemente significa que la función se pierde completamente.
Un método habitual para obtener un ratón deficiente del gen de CD300a usando un casete génico es el siguiente. Sin embargo, el ratón deficiente del gen de CD300a no se limita a los obtenidos por este método.
Se prepara un vector de dirección que tiene un alelo dirigido (alelo mutante) en que los exones del alelo de tipo silvestre del gen de CD300a están remplazados por un gen de resistencia a antibiótico (gen marcador). De acuerdo con un método convencional, se obtiene un ratón quimérico usando el vector de dirección y células ES. El ratón quimérico se cruza con un ratón de tipo silvestre para obtener ratones F1 (heterocigóticos (+/-)), y los ratones F1 se cruzan entre sí para obtener ratones f2.
El ADN genómico se extrae de los ratones F2 y el ADN genómico de cada ratón se somete a PCR para investigar la presencia/ausencia del alelo de tipo silvestre y el alelo mutante en el ADN genómico, para obtener un ratón F2 que tenga únicamente el alelo mutante (homocigótico (-/-)). Además, para confirmar la ausencia de expresión de CD300a, las células derivadas del ratón se someten a confirmación por transferencia de Western usando un anticuerpo antiCD300a, para proporcionar un ratón deficiente del gen de CD300a.
Ejemplos
La presente invención se describe a continuación más concretamente a modo de ejemplos. Sin embargo, la presente invención no se limita por los ejemplos siguientes.
1. Ejemplo de preparación
(1) Preparación de proteína de fusión de CD300a-Fc, MFG-E8 y D89E MFG-E8
(1-1) Se preparó una proteína de fusión de CD300a que tiene la región Fc de IgG (CD300a-Fc) como se describe en el documento 25 enumerado a continuación a partir de un ADNc quimérico que contiene un ADNc de un gen que codifica el dominio extracelular completo de CD300a de ratón o humano y un ADNc de un gen que codifica IgG1Fc humano. La proteína de fusión en que el dominio extracelular de CD300a se obtiene de ratón se menciona como "CD300a-Fc de ratón" y la proteína de fusión en que el dominio extracelular de CD300a se obtiene de ser humano se menciona como "CD300a-Fc humano".
(1-2) MFG-E8 se proporcionó por Mr. Masato Tanaka (RCAI, Yokohama, Japón).
(1-3) D89E MFG-E8 es un mutante de MFG-E8 obtenido por mutagénesis dirigida al sitio en el motivo RGD de MFG-E8 como se describe en el documento 4 a continuación.
En el D89E MFG-E8 obtenido, el 89.° aminoácido contado desde el extremo amino se sustituye de ácido aspártico a ácido glutámico. MFG-E8 (nativo) se une tanto a fosfatidilserina (PS) como a integrina avp3 para entrecruzar de ese modo células apoptóticas con fagocitos que expresan integrina avp3 (documento 4 enumerado a continuación). Por otro lado, D89E MFG-E8 no se une a integrina avp3 aunque se une a fosfatidilserina (PS).
(2) Ratones y ligamiento y punción cecal (LPC)
Los ratones con genes inactivados usados en los ejemplos se prepararon o proporcionaron de la siguiente manera.
(i) Ratón deficiente del gen de CD300a (Cd300a-/-)
Usando un sistema de cromosoma artificial bacteriano (BAC), se remplazaron los exones 1 a 6 del alelo de tipo silvestre del gen de Cd300a por un casete de gen de resistencia a neomicina (PGK-GB2-neo) para preparar un alelo dirigido (alelo mutante) (fig. 3A). Posteriormente, se obtuvo un ratón quimérico de acuerdo con un método convencional, y el ratón quimérico se cruzó con un ratón de tipo silvestre para obtener ratones F1 (heterocigótico (+/-)). Los ratones F1 se cruzaron entre sí para obtener ratones F2.
Para seleccionar ratones deficientes del gen de CD300a (Cd300a'/‘) de los ratones F2, se extrajo el ADN genómico de la cola de cada ratón F2, y el ADN genómico se sometió a PCR para investigar la presencia/ausencia del alelo WT y el alelo mutante en el ADN genómico.
Como se muestra en la fig. 3B, el producto de PCR correspondiente al alelo WT y el producto de PCR correspondiente al alelo mutante se detectan como una banda de aproximadamente 540 pb y una banda de aproximadamente 700 pb, respectivamente.
Además, para confirmar la ausencia de expresión de CD300a en los ratones deficientes del gen de CD300a, las células derivadas de los ratones deficientes del gen de CD300a se sometieron a análisis de transferencia de Western usando un anticuerpo antiCD300a. Como se muestra en la fig. 3C, un ratón de tipo silvestre mostró una banda de aproximadamente 50 kDa derivada de CD300a, pero esta banda no se detectó en un ratón deficiente del gen de CD300a.
(ii) Ratón C57BL/6J-kitW'sh/W-sh
Los ratones C57BL/6J-kitW'sh/W'sh (a partir de ahora en este documento mencionados como "ratones kitW'sh/W'sh" o "ratones deficientes de mastocitos") se proporcionaron del RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japón). Estos ratones se sabe que muestran deficiencia de mastocitos (documento 21 enumerado a continuación) y muestran incorporación de ADN por fagocitos sin fragmentación de ADN apoptótico, seguido de degradación de ADN en los fagocitos (documento 12 enumerado a continuación).
(iii) Ratón deficiente de CAD
Se usó el ratón deficiente de CAD (DNasa activada por caspasa) descrito en el documento 12 enumerado a continuación.
(v) Eliminación in vivo de macrófagos y neutrófilos
De acuerdo con la descripción del documento 30 enumerado a continuación, se prepararon liposomas de clodronato y liposomas de PBS de control (Encapsula NanoSciences). Posteriormente, en la hora 24 después LPC, se inyectaron 0,5 ml de los liposomas en la cavidad abdominal del ratón para eliminar los macrófagos.
Además, en la hora 24 después LPC, se inyectó un anticuerpo antiGr-1 en la cavidad abdominal del ratón para eliminar los neutrófilos.
Todas las operaciones de preparación usando ratones y los ensayos de evaluación en los ejemplos se realizaron de acuerdo con las directrices preparadas por el comité sobre cuidado y uso de animales del centro de recursos de animales de laboratorio, universidad de Tsukuba.
(3) Anticuerpos
El fabricante, o el método para la preparación de cada anticuerpo se muestra en la tabla a continuación.
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(continuación)
Figure imgf000019_0001
(4) Preparación de células
Las células se prepararon de la siguiente manera.
(i) Mastocitos derivados de médula ósea (BMMC)
En medio RPMI 1649 completo complementado con un factor de crecimiento celular (SCF) (10 ng/ml), IL-3 (4 ng/ml) y suero bovino fetal (FBS) (10 %) colocado en una placa de 10 cm, se cultivaron 2 x 108 células de médula ósea de ratón durante no menos de 5 semanas para preparar mastocitos derivados de médula ósea (BMMC). Los BMMC se subcultivaron cada semana con medio fresco. El análisis de citometría de flujo mostró más de un 95 % de los BMMC eran células c-Kit+Fc£RI+.
(ii) Macrófagos derivados de médula ósea (BMM9)
En medio RPMI 1649 complementado con M-CSF (10 ng/ml) y suero bovino fetal (FBS) (10 %) colocado en una placa de 10 cm, se cultivaron 2 x 106 células de médula ósea de ratón durante 1 semana para preparar macrófagos derivados de médula ósea (BMM9).
(iii) Transfectante celular NIH3T3
De acuerdo con un método convencional, se preparó un plásmido de vector retrovírico pMX-neo que contenía un ADNc de CD300a marcado con Flag o ADNc de cD300d marcado con Flag.
Se transfectaron células NIH3T3 con el plásmido así preparado, para obtener un transfectante que expresa de forma estable CD300a o CD300d. El transfectante que expresa de forma estable CD300a y el transfectante que expresa de forma estable CD300d obtenidos se mencionan como "transfectante NIH3T3 (cD300a)" y "transfectante NIH3T3 (CD300d)", respectivamente.
El transfectante celular NIH3T3 que expresa de forma estable TIM-4 se proporcionó por Mr. T. Kitamura (Universidad de Tokio). Este transfectante se menciona como "transfectante NIH3T3 (t iM-4)".
[Método de evaluación]
A continuación se describen las condiciones para el método de evaluación. En el ensayo de supervivencia, se usó un ensayo del orden logarítmico de Kaplan-Meier y, en otros ensayos de evaluación, se usó el ensayo de la t de Student para datos independientes para realizar análisis estadístico. La significación estadística se asumió a P < 0,05.
(5) Ensayo de unión Etc.
(i) Ensayo de unión
Las células se tiñeron durante 30 minutos en tampón fosfato complementado con FBS al 2 % en presencia o ausencia de CaCl21 mM usando CD300a o una IgG humana de control, y después se lavaron dos veces con el mismo tampón, seguido de incubación con el fragmento F(ab')2 de un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con FITC. Posteriormente, para la tinción con anexina V, las células se incubaron en tampón HEPES-NaOH 10 mM complementado con NaCl 140 mM y CaCb 2,5 mM junto con anexina V durante 15 minutos a temperatura ambiente. (ii) Ensayo de inhibición de unión
Las células se preincubaron con un anticuerpo monoclonal contra CD300a de ratón (TX41), anticuerpo de isotipo de control o MFG-E8 durante 30 minutos y después se tiñeron con CD300a-Fc como en el ensayo de unión anterior.
Además, para analizar si CD300a-Fc se unía a fosfolípido o no, se realizó un ensayo usando una PIP Strip (fabricada por Echelon Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(6) Medición de UFC (unidades formadoras de colonias) de bacterias aeróbicas
Se sembraron en placa diluciones en serie de perfundido peritoneal de ratón y las diluciones se cultivaron en placas que contenían agar de infusión de cerebro-corazón (BHI) a 37 °C durante 48 horas. Posteriormente, se calcularon las UFC de bacterias aeróbicas midiendo el número de colonias en 1 ml del perfundido peritoneal como se describe en el documento 27 enumerado a continuación.
[Ejemplo 1; identificación del ligando CD300a]
[Ejemplo 1A]
Para confirmar la expresión del ligando CD300a de ratón en líneas de células madre hematopoyéticas y líneas de células tumorales, se realizó el siguiente ensayo.
Los macrófagos derivados de médula ósea (BMM9) obtenidos en "1. ejemplo de preparación", células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) o células de línea celular hematopoyética dependiente de IL-3 (células BaF/3) (2 x 105 células por cada tipo de células) se incubaron en PBS (solución salina tamponada con fosfato) que contenía CD300a-Fc (1 |jg) y cloruro de calcio (1 mM) a 20 °C durante 30 minutos, y después se tiñeron usando un tampón que contenía un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con FITC (0,1 jg ) y yoduro de propidio (PI) (1 jg).
Las células teñidas de cada tipo se sometieron a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133").
Además, se realizó un ensayo de control de la misma manera que en el método de ensayo anterior excepto en que se usó IgG humana de control (1 jg ) en lugar de CD300a-Fc de ratón.
Los resultados del análisis de citometría de flujo para BMM9, BMDC y células BaF/3 se muestran en la fig. 1A, la fig.
1B y la fig. 1C, respectivamente (los resultados del ensayo de control se muestran como "Ig de control").
Como se muestra en la fig. 1A a la fig. 1C, se descubrió que, en casos donde se contenía cloruro de calcio, CD300a-Fc de ratón se une a células PI-(células vivas) pero no se une a células PI+ (células muertas). Es decir, se sugiere que el ligando CD300a de ratón se expresa en células muertas.
[Ejemplo 1B]
Para ensayar si CD300a-Fc de ratón se une a células apoptóticas, que son un tipo de células muertas, se realizó el siguiente ensayo.
Se incubaron timocitos derivados de un ratón C57BL/6 (ratón de tipo silvestre) con dexametasona (fabricada por Sigma) (10 jM ) en medio RPMI para preparar timocitos apoptóticos.
Las células apoptóticas obtenidas (número de células, 2 x 105) se incubaron en un medio (PBS) que contenía CD300a-Fc (1 jg), anexina V conjugada a APC (fabricada por BD Pharmingen) (1 j l ) y cloruro de calcio (1 mM) a 20 °C durante 30 minutos, y se tiñeron usando un tampón que contenía un anti-IgG humana conjugado con FITC (0,1 jg ) y yoduro de propidio (PI) (1 jg).
Las células teñidas de cada tipo se sometieron a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133") (resultados: fig. 2A).
Además, las células se sometieron a análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usó un medio complementado sin cloruro de calcio en lugar del medio complementado con cloruro de calcio (resultados: fig. 2B).
De acuerdo con la fig. 2A, puede observarse que, en presencia de cloruro de calcio, CD300a-Fc de ratón se unía a timocitos que se teñían con anexina V, pero no se unía a timocitos que no se teñían con anexina V (anexina V-). Es decir, se sugiere que CD300a-Fc de ratón se une a timocitos apoptóticos.
Por otro lado, puede observarse, como se muestra en la fig. 2B, que CD300a-Fc de ratón no se unía a timocitos apoptóticos en ausencia de cloruro de calcio.
A partir de estos resultados de ensayo, puede entenderse que CD300a de ratón se une a células apoptóticas de forma dependiente de los iones de calcio.
[Ejemplo 1C]
Las células apoptóticas obtenido en el ejemplo 1B (número de células, 2 x 105) se incubaron en un medio (PBS) complementado con CD300a-Fc (1 |jg), anexina V conjugada con APC (fabricada por BD Pharmingen) (1 jl), IgG1 humana de control (1 jg ) y cloruro de calcio (1 mM) a 20 °C durante 30 minutos, y se tiñeron usando un tampón que contenía un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con FITC (0,1 jg ) y yoduro de propidio (PI) (1 jg).
Las células teñidas de cada tipo se sometieron a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133") (resultados: fig. 2C "HuIgG1").
Además, las células se sometieron a análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en el método de ensayo anterior excepto que se usó "TX41", que es un anticuerpo monoclonal, o "MFG-E8", que es una proteína expresada en el macrófago, en lugar de la IgG1 humana de control (resultados: fig. 2C "TX41" y "MFG-E8").
Como se describe anteriormente, el "TX41" usado en este documento es un anticuerpo monoclonal antiCD300a de ratón y bloquea la unión de CD300a de ratón al ligando.
Se sabe que "MFG-E8" se une tanto a fosfatidilserina (PS) como a integrina avp3 para entrecruzar de ese modo las células apoptóticas con macrófagos que expresan integrina avp3 (documento 4 enumerado a continuación).
Como puede observarse por comparación entre los resultados de la citometría de flujo mostrada en la fig. 2C, CD300a de ratón no se unía a células apoptóticas en presencia de TX41 o MFG-E8.
Desde este punto de vista, se sugiere que CD300a-Fc de ratón tiene capacidad de unión con PS (es decir, el ligando de CD300a es PS).
[Ejemplo 1D]
Para ensayar si CD300a humano se une o no a células apoptóticas de forma similar que CD300a de ratón, se realizó el siguiente ensayo.
En primer lugar, se suspendieron células Jurkat (línea de linfocitos T humanos) en medio RPMI 1640 y el medio resultante se irradió con UV durante 60 minutos para preparar células Jurkat apoptóticas.
Se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones de ensayo que en ejemplo 1A excepto que se usaron las "células apoptóticas derivadas de células Jurkat" como células apoptóticas en lugar de las células apoptóticas derivadas de timocitos de ratón de tipo silvestre, y se usó "CD300a-Fc humano" en lugar del "CD300a-Fc de ratón" (resultados: fig. 2D).
Además, se realizó análisis de citometría en las mismas condiciones de ensayo que en ejemplo 1B excepto que se usaron las "células apoptóticas derivadas de células Jurkat" como células apoptóticas en lugar de las células apoptóticas derivadas de timocitos de ratón de tipo silvestre; se usó "CD300a-Fc humano" en lugar del "CD300a-Fc de ratón"; y se usó "TX49" o "IgG1 humana de control" en lugar de "TX41" (resultados: fig. 2E "TX49" o "HuIgG1"). "TX49" es un anticuerpo antiCD300a humano (anticuerpo monoclonal) y bloquea la unión de CD300a al ligando. Como puede observarse de la fig. 2D a la fig. 2E, CD300a-Fc humano se unía a células anexina V+, pero no se unía a las mismas en presencia del anticuerpo antiCD300a humano.
Es decir, se sugiere que, de forma similar a CD300a-Fc de ratón, CD300a humano también se une a células apoptóticas.
[Ejemplo 1E]
Se depositaron puntualmente líquidos (líquidos de ensayo) que contenían diversos fosfolípidos (PS, PC, PE) (100 pmol) en una membrana (PlP-strip (fabricada por Echelon Bioscience)) para permitir la adsorción de los fosfolípidos en la membrana.
Posteriormente, la membrana se sumergió en tampón TBST (pH 8,0) que contenía CD300a-Fc de ratón (1,5 jg/m l) complementado con cloruro de calcio (1 mM) y BSA a 20 °C durante 2 horas.
Después de ello, la membrana se lavó 3 veces con tampón TBST que no contiene CD300a-Fc de ratón (pH 8,0) para eliminar el CD300a-Fc no unido a los fosfolípidos en la membrana. La detección entonces se realizó usando tampón TBST (pH 8,0) que contenía anticuerpo anti-IgG humana conjugado con HRP (fabricado por Jackson Immun), com con BSA (resultados: fig. 2F).
En la fig. 2F, "PE", "PC" y "PS" indican las posiciones donde se depositaron puntualmente fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina y fosfatidilserina en la membrana, respectivamente, y "Blanco" indica una posición donde no se depositó puntualmente fosfolípido en la membrana.
De acuerdo con la fig. 2F, CD300a no se unió ni a PE ni a PC, y se unió específicamente a PS.
A partir de los resultados de los ejemplos 1A a 1E, puede entenderse que CD300a se une a fosfatidilserina (PS) de forma dependiendo de los iones de calcio (es decir, el ligando de CD300a es PS).
[Ejemplo 2: análisis funcional de CD300a (1)]
Se sabe que algunos receptores de unión a PS se expresan en fagocitos y están implicados en la eliminación de células apoptóticas en condiciones fisiológicas y patológicas (documentos 4 a 9 enumerados a continuación).
Se sabe que PS media la llamada señal de "cómeme" en fagocitos (macrófagos y similares), que son células que expresan CD300a (documentos 10 y 11 enumerados a continuación). En vista de esto, se realizaron los ensayos descritos en los ejemplos 2A a 2C a continuación para ensayar si CD300a está implicado en la fagocitosis de las células apoptóticas o no.
[Ejemplo 2A]
Se trataron timocitos derivados de un ratón deficiente de CAD de la misma manera que en el ejemplo 1B para preparar timocitos apoptóticos.
Posteriormente, se cocultivaron macrófagos (macrófagos peritoneales inducidos por tioglicolato) derivados de un ratón deficiente del gen de CD300a mouse (2 x 105 células) con los timocitos apoptóticos derivados de un ratón deficiente de CAD a una relación de 1:5 (macrófagos:timocitos apoptóticos (números de células)) en un portaobjetos de cámara Lab-TeK II de 8 pocillos (fabricado por Nalge Nunc) a 37 °C durante 1 hora.
Posteriormente, como se describe en los documentos 5 y 26 enumerados a continuación, los macrófagos cocultivados se lavaron con PBS frío y se fijaron con un fijador que contenía paraformaldehído (1 %). Los macrófagos fijados entonces se sometieron a tinción de TUNEL usando un tampón que contenía dUTP marcado con FITC (fabricado por Roche).
No menos de 50 células seleccionadas aleatoriamente de los macrófagos teñidos se analizaron usando un microscopio confocal de barrido con láser ("FV10i", fabricado por Olympus Corporation; número de producto, 1B22358), y se contó el número de células positivas a TUNEL (células apoptóticas) contenidas por un macrófagos. Las relaciones de células apoptóticas que contenían macrófagos en números de 0 a 8 (tasas de fagocitosis) se calcularon como porcentajes con respecto al número total de macrófagos (resultados: fig. 4A "Cd300a-/'").
Además, las tasas de fagocitosis se midieron en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usaron macrófagos derivados de un ratón de tipo silvestre en lugar de los macrófagos derivados de un ratón deficiente del gen de CD300a (resultados: fig. 4A "WT").
Como se muestra en la fig. 4A, no se encontraron diferencias evidentes en la tasa de fagocitosis entre el caso donde los macrófagos se obtenían de un ratón deficiente del gen de CD300a y el caso donde los macrófagos se obtenían de un ratón de tipo silvestre.
[Ejemplo 2B]
Para ensayar si los mastocitos expresan receptores de PS conocidos (TIM-1, TIM-4, estabilina 2 e integrina avp3), se realizó el siguiente ensayo.
Se incubaron mastocitos derivados de médula ósea (BMMC) (número de células, 2 x 105) a 20 °C durante 30 minutos en un medio (PBS) que contenía un anticuerpo monoclonal contra TIM-1 conjugado con PE (ficoeritrina) (0,1 |jg), anticuerpo monoclonal contra TIM-4 conjugado con APC (0,1 jg ) y anticuerpo monoclonal antiCD300a de ratón conjugado con Alexa (TX41) (0,5 jg).
Posteriormente, las células teñidas se lavaron dos veces usando PBS y se sometieron a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133") (resultados: fig. 5A "BMMC").
Además, se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en el método de ensayo anterior excepto que se usaron macrófagos peritoneales o macrófagos derivados de médula ósea en lugar de las BMMC (resultados: fig. 5A "Macrófagos peritoneales" y "macrófagos derivados de médula ósea").
Además, usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (fabricado por Applied Biosystems), se prepararon los ADNc de macrófagos peritoneales y BMMC. Usando cada ADNc preparado, se analizaron los niveles de expresión de estabilina 2, BA1-1, integrina av, Cd300a p-actina (control de carga) por RT-PCR (resultados: fig. 5B).
Como puede observarse de la fig. 5A y de la fig. 5B, a diferencia de los casos de macrófagos, los mastocitos expresaban CD300a e integrina avp3, pero mostraban únicamente niveles bajos de expresión de TIM-1, TIM-4 y estabilina 2, que son receptores de Ps implicados en la fagocitosis.
[Ejemplo 2C]
El transfectanto NIH3T3 (CD300a) (número de células, 6 x 104) se cocultivó con células marcadas con FITC (timocitos apoptóticos o timocitos (células vivas)) durante 2 horas, y se lavaron con PBS, seguido de análisis en un microscopio óptico (BZ-9000, fabricado por Keyence) (resultados: fig. 4B).
Además, las células obtenidas después del cocultivo y el lavado se fijaron con un fijador que contenía paraformaldehído, Vectashield (fabricado por Vector Laboratories) y se analizaron usando un microscopio confocal de barrido por láser (resultados: fig. 4C). En la fig. 4C, las zonas verdes (indicadas por flechas) indican células fagocitadas (timocitos apoptóticos o timocitos (células vivas)).
Además, se realizó análisis usando un microscopio óptico y un microscopio confocal de barrido por láser en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usaron células sin transfectar NIH3T3 (control negativo) o células "transfectantes NIH3T3 (TIM-4)" (control positivo) en lugar del transfectante NIH3T3 (CD300a).
En la fig. 4B y en la fig. 4C, "NIH-3T3" y "NIH-3T3/Tim4" muestran imágenes de "NIH3T3 " (células no transfectadas) y "transfectante NIH3T3(TIM-4)", respectivamente, cuyas imágenes se obtuvieron usando un microscopio óptico y un microscopio confocal de barrido por láser.
Las imágenes obtenidas con el microscopio confocal de barrido por láser se usaron para medir las relaciones del número de células no transfectadas y el número de células de cada transfectante que incorporaba timocitos apoptóticos en el citoplasma (porcentajes con respecto al número de células no transfectadas cocultivadas o al número de células cocultivadas de cada transfectante) (resultados: fig. 4D "apoptóticas").
Además, asimismo, se midieron las relaciones del número de células NIH3T3 y el número de células de cada transfectante que incorporaba timocitos (células vivas) en el citoplasma (porcentajes con respecto al número de células no transfeactas cocultivadas o al número de células cocultivadas de cada transfectante) (resultados: fig. 4D "Vivas").
Como se muestra en la fig. 4B, a diferencia de NIH3T3, ambos transfectantes anteriores se adherían a timocitos apoptóticos. Sin embargo, basándose en la fig. 4C y en la fig. 4D, puede observarse que únicamente el transfectante NIH3T3 (TIM-4) incorporaba timocitos apoptóticos para mostrar fagocitosis.
Aunque no se muestran los datos, el transfectante NIH3T3 (CD300a) no mostraba fagocitosis de células vivas (timocitos), de forma similar a NIH3T3.
A partir de los resultados de los ejemplos 2A a 2C, puede entenderse que CD300a no está implicado en la fagocitosis de las células apoptóticas por macrófagos.
[Ejemplo 3: análisis funcional de CD300a (2)]
Como se muestra en la fig. 5, los mastocitos expresan CD300a, pero, a diferencia de los macrófagos, las células no expresan TIM-1, TIM-4 y estabilina, que son receptores de PS.
Se sabe que PS se une a estos receptores de PS directa o indirectamente, y la contribución de estos receptores a la incorporación de células apoptóticas es conocida (do 13 enumerado a continuación). En vista de esto, los ensayos descritos a continuación en los ejemplos 3A a 3C se realizaron para ensayar si CD300a también tiene dicha función o no (haya solapamiento funcional o no en la incorporación de células apoptóticas).
[Ejemplo 3A]
En medio RPMI 1649 completo complementado con un factor de crecimiento celular (SCF) (10 ng/ml), IL-3 (4 ng/ml) y suero bovino fetal (FBS) (10 %) colocado en una placa de 10 cm, se cultivaron 2 x 108 células de médula ósea (células BM) derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a durante 4 semanas para preparar mastocitos derivados de médula ósea (BMMC) del ratón deficiente del gen de CD300a. Los BMMC se subcultivaron cada semana con medio fresco.
Posteriormente, las BMMC obtenidas se incubaron en medio RPMI1649 que contenía un anticuerpo anti-FcsRI a conjugado con FITC (0,1 |jg) y un anticuerpo anti-c-Kit conjugado con PE (0,1 jg/m l) a 4 °C durante 30 minutos y se analizaron por citometría de flujo (resultados: fig. 6A "CD300'/‘").
Además, se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones de ensayo que en el ensayo anterior excepto que las BMMC se prepararon usando células de médula ósea derivadas de un ratón de tipo silvestre en lugar de las células de médula ósea derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a (resultados: fig. 6A "WT"). Cada número en la fig. 6A indica la relación de las células mostrada en cada recuadro. Cada ensayo se repitió 3 veces independientemente.
Usando cada tipo de BMMC, se realizó un ensayo de liberación de p-hexosaminidasa (ensayo de desgranulación) de la siguiente manera (para las condiciones detalladas véase el documento 29 a continuación).
En primer lugar, se cultivaron de 1 x 105 a 2 x 105 BMMC de cada tipo en la fase de crecimiento logarítmico a 37 °C durante un día y una noche en una placa de 24 pocillos recubierta con gelatina (fabricada por Sigma) y después se incubaron a 37 °C durante 1 hora en un medio que contiene una IgE de ratón antitrinitrofenol conjugada con biotina (0,5 mg/ml), pero no contiene un complemento.
Posteriormente, se añadió estreptavidina al medio para causar el entrecruzamiento entre las moléculas de IgE de ratón anti-trinitrofenol conjugadas con biotina y se realizó cultivo a 37 °C durante 45 minutos, seguido recogida del sobrenadante.
Al sobrenadante recogido, se le añadió un tampón (pH 4,5) que contenía p-nitrofenil-N-acetil-p-D-glucosamida (fabricada por Sigma), ácido cítrico (0,4 M) y fosfato de sodio (0,2 M), y la mezcla resultante se incubó a 37 °C durante 3 horas para permitir la reacción de hidrólisis de p-nitrofenil-N-acetil-p-D-glucosamida mediante p-hexosaminidasa liberada. Esta reacción se detuvo añadiendo glicina-NaOH 0,2 M (pH 10,7) y se midió la absorbancia a una longitud de onda de 415 nm, que aumenta según prosigue la hidrólisis p-nitrofenil-N-acetil-p-D-glucosamida, para cuantificar la cantidad de p-hexosaminidasa liberasa. La tasa (%) de aumento en la cantidad de p-hexosaminidasa liberada con respecto a la cantidad observada con BMMC no tratadas de cada tipo se muestra en la fig. 6B.
La fig. 6B muestra la relación de BMMC que libera p-hexosaminidasa. Como se muestra en la fig. 6A y en la fig. 6B, no se encontró diferencia significativa en la expresión de FcsRIa y c-Kit (proteínas marcadoras de mastocitos) y la tasa de aumento en la cantidad de p-hexosaminidasa liberada entre el caso donde las BMMC se obtenían de un ratón deficiente del gen de CD300a y el caso donde las BMMC se obtenían de un ratón de tipo silvestre.
Es decir, puede observarse que la diferenciación a partir de células médula ósea y la desgranulación mediada por FceRI no se ven influidas por CD300a.
[Ejemplo 3B]
se incubaron BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a y las células apoptóticas obtenidas en el ejemplo 1B (BMMC:células apoptóticas = 10:1 (relación en términos del número de células)) en PBS que contenía cloruro de calcio (1 mM), Anexina V conjugada con APC (1 pl), CD300a-Fc (1 pg/ml) y MFG-E8 (5 |jg) a 20 °C durante 30 minutos, y después se tiñeron usando un tampón que contenía un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con FITC (0,1 pg/ml) y yoduro de propidio (PI) (1 pg).
Las células teñidas se sometieron a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133") (resultados: fig. 7A "MFG-E8").
Además, se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usó una IgG de control en lugar de MFG-E8 (resultados: fig. 7A "Ig de control").
A partir de los resultados mostrados en la fig. 7A, puede observarse que CD300a-Fc se unía a células apoptóticas (anexina V+) en presencia de IgG de control, pero que la unión se inhibía específicamente en presencia de MFG-E8 (sustancia de unión a PS).
Las concentraciones de citocinas y quimiocinas en el sobrenadante de esta mezcla demuestra se cuantificaron usando kits de ELISA fabricados por BD Pharmingen (TNF-a e IL-6) y R&D Systems (MIP-2, MCP-1, IL-13 y MIP-1a). Como resultado, no pudo detectarse ninguna de las citocinas y quimiocinas.
[Ejemplo 3C]
Para ensayar si la estimulación por LPS (lipopolisacárido) cambia las cantidades de citocinas liberadas en la coexistencia de BMMC y células apoptóticas o no, se realizó el siguiente ensayo.
Se incubaron BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a y células apoptóticas (BMMC:células apoptóticas = 10:1 (relación en términos del número de células)) en RPMI que conteía LPS (1 pg/ml) durante 4 horas, y el sobrenadante del medio se recogió después.
Posteriormente, se midieron los niveles de citocinas y quimiocinas 3 veces usando kits de ELISA fabricados por BD Pharmingen (TNF-a e IL-6) y R&D Systems (MIP-2, MCP-1, IL-13 y MIP-1a), y se calculó la tasa de aumento en la cantidad de cada citocina o quimiocina liberada con respecto a la cantidad observada con las BMMC que no se habían sometido al tratamiento con LPS anterior(resultados: fig. 7B "Cd300a'/‘").
Además, la tasa de aumento en la cantidad de cada citocina o quimiocina se calculó en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usaron BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre en lugar de las BMMc derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a (resultados: fig. 7B "WT").
Como se muestra en la fig. 7B, el LPS aumentaba las cantidades de citocinas liberadas en ambos tipos de BMMC. Sin embargo, las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a mostraban aumentos significativamente mayores en las cantidades de TNF-a, IL-13 y MCP-1 que las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre.
[Ejemplo 3D]
Además, se realizó el siguiente ensayo para ensayar las tasas de aumento en citocinas intracelulares y quimiocinas en BMMC.
Se incubaron BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a y las células apoptóticas obtenidas en el ejemplo 1B (BMMC:células apoptóticas = 10:1 (relación en términos del número de células)) en un medio (RPMI) que contenía LPS (lipopolisacárido) (1 pg/ml) durante 4 horas, y las BMMC y las células apoptóticas después de la incubación se incubaron entonces en un medio (FIX & PERM, fabricado por Invitrogen) complementado con anticuerpos marcados de forma fluorescente contra diversas citocinas y quimiocinas y formaldehído a 4 °C durante 20 minutos. Las células teñidas se sometieron a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133") (resultados: fig. 8, flechas (1)). Además, se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usó un anticuerpo de control en lugar de los anticuerpos marcados de forma fluorescente contra diversas citocinas y quimiocinas (ensayo de control (resultados: fig. 8, flechas (2))).
Además, se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en ensayo anterior excepto que se usaron BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre en lugar de las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a (resultados: fig. 8, flechas (3)). Además, se realizó análisis de citometría de flujo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usó un anticuerpo de control en lugar de los anticuerpos marcados de forma fluorescente contra diversas citocinas y quimiocinas (ensayo de control (resultados: fig. 8, flechas (4))).
Cada gráfico en la fig. 8 muestra la cantidad de aumento en la IMF (intensidad media de fluorescencia) observada para cada citocina o quimiocina en cada tipo de BMMC, con respecto a la de BMMC no tratadas con LPS.
De acuerdo con la fig. 8, en ambos tipos de BMMC, las cantidades de citocinas y quimiocinas en el citoplasma aumentaban en comparación con el caso donde no se realizaba el tratamiento con LPS. En particular, puede observarse que las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a mostraban aumentos significativamente mayores en las cantidades de TNF-a y similares en el citoplasma que las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre.
[Ejemplo 3E]
D89E MFG-E8 es una variante (mutante) de MFG-E8 y tiene una mutación puntual (D89E) en el motivo RGD. D89E MFG-E8 se une a PS, pero no se une a integrina avp3.
En vista de esto, se realizó el siguiente ensayo para ensayar si las cantidades de citocinas y quimiocinas liberadas de las BMMC cambian en presencia de D89E MFG-E8 o no.
Se cuantificaron TNF-a, IL-13, MCP-1 e IL-6 de la misma manera que en el ejemplo 3C excepto que se añadió LPS, así como D89E MFG-E8 (5 pg/ml) al medio que contenía BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a y células apoptóticas(resultados: fig. 7C "CD300a'/‘").
Además, se cuantificó TNF-a, IL-13, MCP-1 e IL-6 en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usaron BMMC derivadas de ratón de tipo silvestre en lugar de las BMMCs derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a (resultados: fig. 7C "WT").
Como se muestra en la fig. 7C, en presencia de D89E MFG-E8, no se encontraron diferencias significativas en las concentraciones de citocinas entre el caso donde las BMMC se obtenían de un ratón deficiente del gen de CD300a y el caso donde las BMMC se obtenían de un ratón de tipo silvestre.
[Ejemplo 3F]
se sabe que CD300a tiene un motivo inhibidor basado en tirosina de inmunorreceptor (ITIM) en el dominio intracelular, e induce SHP-1 tras entrecruzamiento por un anticuerpo antiCD300a (documento 14 enumerado a continuación).
En vista de esto, se realizó el siguiente ensayo para ensayar si CD300a interactúa con SHP-1 o no. Como en el ejemplo 3C, se cocultivaron BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a o ratón de tipo silvestre con células apoptóticas en presencia de LPS durante 4 horas, y un homogeneizado de las células se sometió a inmunoprecipitación con un anticuerpo antiCD300a (TX41).
Usando los inmunoprecipitados así obtenidos, se realizó inmunotransferencia con un anticuerpo antiSHP-1 o un anticuerpo antiCD300a como se describe en el documento 14 enumerado a continuación (resultados: fig. 7D).
Como puede observarse a partir de estos resultados, las BMMC respondieron a la estimulación con LPS para inducir (reclutar) SHP-1 cuando se cocultivaban con células apoptóticas. Sin embargo, CD300a no reclutó SHP-1 en presencia de D89E MFG-E8.
Es decir, se cree que la inducción (reclutamiento) de SHP-1 por CD300a en respuesta a estimulación con LPS requiere la unión de PS a CD300a.
[Ejemplo 3G]
Para investigar si SHP-1 está implicado en la señalización mediada por CD300a o no, en primer lugar, se inactivó Ptpn6 (gen de SHP-1) de BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre con un ARNip para preparar BMMC derivadas de ratón de tipo silvestre deficiente de SHP-1 (Ptpn6-KD) en las siguientes condiciones. Además, asimismo, se prepararon BMMC derivadas de ratón deficiente de SHP-1 (Ptpn6-KD) a partir de BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a.
Con 1 ml de reactivo de transfección de ARNip X-treme Gene (fabricada por Roche), se mezcló ARNip (ARNip de SHP-1) 0,5 mM (siGENOME SMARTpool; ThermoScientific Dharmacom) dirigido al gen de SHP-1 (gen Ptpn6) en BMMC, y se transfectaron 5 x 10s BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a con el mismo como se describe e el documento 28 enumerado a continuación, para preparar BMMC con atenuación génica de SHP-1 derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a (BMMC (CD300a_/-Ptpn6-KD)).
Además, se prepararon BMMC con atenuación génica de SHP-1 derivadas de un ratón de tipo silvestre (BMMC (W>tpn6-KD)) en las mismas con que en el ensayo anterior excepto que se usaron BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre en lugar de las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a.
Aquí, para confirmar que las BMMC de cada tipo se transfectaban con el ARNip de SHP-1 y que el nivel de expresión de SHP-1 estaba disminuido, un lisado de BMMC (CD300a'Mpn6-KD) o BMMC (WT^tpn6-KD) se sometió a análisis de inmunotransferencia usando un anticuerpo antiSHP-1, anticuerpo anti-SHP-2 o anticuerpo anti-p-actina (resultados: fig. 7E).
Como puede observarse de la fig. 7E, las BMMC transfectadas con el ARNip de SHP-1 mostraron un nivel de expresión disminuido de SHP-1. "Control" muestra los resultados de análisis de inmunotransferencia usando BMMC transfectadas con un ARNip de control en lugar del ARNip de SHP-1.
Posteriormente, se incubaron BMMC (CD300a_/"tpn6-KD) o BMMC (WT^tpn6-KD) y las células apoptóticas obtenidas en ejemplo 1B (BMMC:células apoptóticas = 10:1 (relación en términos del número de células)) en RPMI complementado con cloruro de calcio (1 mM) y LPS (lipopolisacárido) (1 pg/ml) durante 4 horas, y se midió la cantidad de TNF-a liberado de la misma manera que en el ejemplo 3B (resultados: fig. 7F).
Como se muestra en la fig. 7F (gráfico de la izquierda), las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a produjeron una cantidad significativamente mayor de TNF-a que las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre. Por otro lado, como se muestra en la fig. 7F (gráfico de la derecha), en los casos en que las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre o un ratón deficiente del gen de CD300a se transfectaron con el ARNip de SHP-1, la cantidad de TNF-a liberado fue casi la misma entre las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre y las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a, y no se encontró diferencia significativa entre estas.
Estos resultados sugieren que la unión de PS a CD300a causa que CD300a induzca SHP-1 y medie de este modo la señalización que causa la supresión de la actividad de las BMMC, provocando la supresión de la secreción de TNF-a.
A partir de los resultados del ejemplo 3, puede entenderse que la interacción entre PS y CD300a inhibe la producción de citocinas y quimiocinas inductoras de inflamación (inductoras de LPS) a partir de las BMMC, y que la interacción recluta SHP-1, provocando la supresión de la secreción de TNF-a.
[Ejemplo 4: análisis funcional de CD300a (3)]
TNF-a, IL-3 y MCP-1 producidos por mastocitos son quimioatrayentes para neutrófilos, y se sabe que desempeñan funciones importantes en la eliminación bacteriana en ratones con peritonitis por LPC (documento de patente 15 a 19 enumerados a continuación).
En vista de esto, para estudiar si CD300a tiene una función de eliminación bacteriana o no, se realizaron los ejemplos 4A a 4H siguientes.
[Ejemplo 4A]
Un ratón de tipo silvestre se sometió a incisión en la línea media de 1 a 2 cm en el ciego (región ventral), y se ligó la parte final. Después de realizar dos veces la punción usando una aguja de calibre 27 en la zona ligada, el ciego se devolvió al abdomen. Después de ello, se inyectó por vía subcutánea 1 ml de solución salina fisiológica estéril para la rehidratación, y se cerró por sutura el sitio de incisión. Los detalles del procedimiento y las condiciones para la LPC se describen en el documento 16 enumerado a continuación.
Antes de realizar la LPC y 4 horas después de realizar la LPC, se recogió el perfundido peritoneal. Posteriormente, se añadió anexina V conjugada con APC (1 |jg) y CD300-Fc (1 |jg) al perfundido peritoneal, y se realizó tinción con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con FITC y PI (yoduro de propidio), seguido de realización del análisis por citometría de flujo (resultados: fig. 12A).
Como puede observarse a partir de los resultados mostrados en la fig. 12A, el sitio de peritonitis era un sitio donde varias células estaban experimentando apoptosis, como se describe en el documento 20 enumerado a continuación. Es decir, Se sugiere que la regulación inmunitaria por mastocitos en el sitio de peritonitis está influenciada por CD300a.
[Ejemplo 4B]
Para ensayar la relación entre CD300a y la regulación inmunitaria por mastocitos, se realizó análisis del proteoma de la siguiente manera.
En primer lugar, se realizó LPC de la misma manera que en ejemplo 4A usando un ratón de tipo silvestre y un ratón deficiente de mastocitos (kitW-sh/W-sh).
Cuatro horas después de realizar la LPC, se recogió el perfundido peritoneal de cada ratón, y el perfundido peritoneal recogido se sometió a análisis del proteoma de citocinas y quimiocinas usando la matriz de perfilado de proteoma (fabricado por R&D Systems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La fig. 9A muestra los resultados del análisis de densitometría (análisis del proteoma) usando el perfundido peritoneal de cada uno del ratón de tipo silvestre y el ratón deficiente de mastocitos (ratón kitW-sh/W-sh) (en la fig. 9A, "PC" indica control positivo).
La fig. 9B muestra las densidades de píxeles de las señales para las quimiocinas y citocinas, que se obtuvieron de las imágenes de densitometría mostradas en la fig. 9A.
Como puede observarse a partir de los resultados mostrados en la fig. 9B, en la hora 4 después de la LPC, las concentraciones de quimiocinas eran mayores en el ratón kitW-sh/W-sh que en el ratón de tipo silvestre. Se obtuvieron resultados similares en 2 réplicas del ensayo.
[Ejemplo 4C]
De la misma manera que en el ejemplo 4B, se recogió el perfundido peritoneal de ratones de tipo silvestre y ratones deficientes de mastocitos (ratones kitW-sh/W-sh) (n = 3 por cada tipo de ratón).
Posteriormente, se preparó una serie de dilución de cada perfundido peritoneal, y las diluciones en serie preparadas del perfundido peritoneal se sembraron en placa para realizar cultivo en placas que contenían agar de infusión de cerebro-corazón (BHI) a 37 °C durante 48 horas. Después de ello, se calcularon las UFC de bacterias aeróbicas midiendo el número de colonias en 1 ml del perfundido peritoneal como se describe en el documento 27 enumerado a continuación (resultados: La fig. 10A).
Además, también se contaron los números de neutrófilos y macrófagos en cada perfundido peritoneal. Los resultados se muestran en la fig. 10B como "neutrófilo" y "macrófago", respectivamente.
A partir de un ratón de tipo silvestre y un ratón deficiente de mastocitos (kitW-sh/W-sh), se prepararon macrófagos derivados de médula ósea. Estos macrófagos (número de células: 1 x 106) se cocultivaron durante 1 hora en un medio que contenía E. coli marcada con fluoresceína colocada en una placa de 24 pocillos, y se contó el número de cada tipo de macrófagos que fagocitaban E. coli por citometría de flujo para calcular la relación de macrófagos fagocitantes (resultados: La fig. 11 "macrófagos de médula ósea").
Se realizó un ensayo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usaron macrófagos de PEC derivados de un ratón de tipo silvestre o ratón deficiente de mastocitos (ratón kitW-sh/W-sh) en lugar de los macrófagos derivados de médula ósea derivados de un ratón de tipo silvestre o ratón deficiente de mastocitos (ratón kitW-sh/W-sh), para calcular la relación de macrófagos fagocitantes (resultados: La fig. 11 "macrófagos de PEC").
Como se muestra en la fig. 10A, puede observarse que, en la hora 4 después de la LPC, el ratón deficiente de mastocitos (ratón kitW-sh/W-sh ) mostraba UFC bacterianas intraperitoneales inferiores y un número mayor de neutrófilos que el ratón de tipo silvestre. Por otro lado, como se muestra en la fig. 10B y en la fig. 11, el número de macrófagos y su fagocitosis no eran significativamente diferentes entre los genotipos.
[Ejemplo 4D]
Para ensayar si CD300a está implicado en la inducción (reclutamiento) de neutrófilos o no, se realizó el siguiente ejemplo.
A ratones deficientes de mastocitos (ratones KitW-sh/W-sh), se les administró tampón PBS que contenía BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre (número de células, 1 x 106) por inyección intraperitoneal (n = 20). En el día 28 después de la administración, se realizó LPC de la misma manera que en ejemplo 4A y se midió la tasa de supervivencia de los ratones (resultados: La fig. 12B "BMMC W T ^K itW-sh/W-sh").
Además, se realizó un ensayo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usaron BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a en lugar de las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre, y se midió la tasa de supervivencia de los ratones (resultados: La fig. 12B "BMMC CD300a-/-^ K itW-sh/KitW-sh"). "KitW-sh/KitW-sh" en la fig. 12B indica la tasa de supervivencia de ratones deficientes de mastocitos (ratones KitW-sh/W-sh) sometidos a LPC sin administración de BMMC.
De acuerdo con la fig. 12B, los ratones deficientes de mastocitos (ratones KitW-sh/W-sh) sometidos a administración de BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre mostraban una tasa de supervivencia mayor incluso después de LPC, en comparación con el caso donde no se realizaba administración de BMMC.
Sin embargo, puede observarse que los ratones deficientes de mastocitos (ratones KitW-sh/W-sh) sometidos a administración de BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a mostraban una tasa de supervivencia significativamente mayor incluso después de LPC, en comparación con los ratones sometidos a administración de BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre y los ratones que no se habían sometido a administración de BMMC (fig. 12B).
Además, como resultado de medir las UFC bacterianas de la misma manera que en el ejemplo 4C usando perfundido peritoneal de cada tipo de ratón en la hora 4 de LPC, los ratones deficientes de mastocitos (ratones KitW-sh/W-sh) sometidos a administración de BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a mostraron una eliminación bacteriana significativamente mayor que otros ratones (resultados: La fig. 12C).
[Ejemplo 4E]
Para ensayar si la cantidad de TNF-a liberada aumenta por la administración intraperitoneal de BMMC a un ratón deficiente de mastocitos (ratón KitW-sh/W-sh) o no, se realizó el siguiente ejemplo.
Veinticuatro horas antes de LPC, se administró una mezcla de BMMC marcadas con CFSE (BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a:BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre = 1:1 (relación en términos del número de células)) a ratones deficientes de mastocitos (ratones KitW-sh/W-sh) por inyección intraperitoneal.
Los ratones después de la inyección de la mezcla de BMMC se sometieron a LPC de la misma manera que en el ejemplo 4A, y, en la hora 4 después de la LPC, se recogió el perfundido peritoneal. Cada tipo de BMMC contenido en el perfundido peritoneal se sometió a análisis usando un citómetro de flujo (FACSCalibur, fabricado por Becton Dickinson; número de modelo, "E6133") (resultados: La fig. 12D).
Como se muestra en la fig. 12D, puede observarse que, en la hora 4 después de la LPC, las BMMC derivadas de un ratón deficiente del gen de CD300a (células CD300a-CFSE+) mostraban producción de una cantidad significativamente mayor de TNF-a que las BMMC derivadas de un ratón de tipo silvestre (células CD300a+CFSE+).
[Ejemplo 4F]
Para ensayar la influencia de la administración de un anticuerpo monoclonal antiCD300a (TX41) sobre CD300a, se realizó el siguiente ejemplo.
En primer lugar, se realizó LPC de la misma manera que en el ejemplo 4A excepto que se inyectaron por vía intraperitoneal 500 |jg de un anticuerpo monoclonal antiCD300a (TX4l) (n = 13) a ratones de tipo silvestre 1 hora o 18 horas antes de LPC, y se midió la tasa de supervivencia de los ratones de la misma manera que en el ejemplo 4D (resultados: La fig. 12E "Anticuerpo contra CD300a").
Además, se realizó un ensayo en las mismas condiciones que en el ensayo anterior excepto que se usó un anticuerpo de control de isotipo (n = 1 l) como control en lugar de TX41 (n = 13), y se midió la tasa de supervivencia de los ratones (resultados: La fig. 12E "Anticuerpo de control").
Como se muestra en la fig. 12E, se descubrió que el tiempo de supervivencia de los ratones de tipo silvestre era mayor en los casos donde se realizaba LPC 1 hora o 18 horas después de la administración de TX41 por inyección intraperitoneal, en comparación con los casos de administración del anticuerpo de control.
[Ejemplo 4G]
De cada ratón en la hora 4 después de LPC en el ejemplo 4F, se recogió el perfundido peritoneal. El perfundido peritoneal obtenido se trató de la misma manera que en el ejemplo 4C para medir las UFC bacterianas y el número de neutrófilos (an de control: n = 5 y anticuerpo monoclonal antiCD300a: n = 5) (fig. 12F y fig. 12G, respectivamente).
La administración de TX41 por inyección intraperitoneal no causó daño a las células mieloides, incluyendo los mastocitos en los ratones.
Como se muestra en la fig. 12F y en la fig. 12G, la administración de TX41 a ratones de tipo silvestre por inyección intraperitoneal 1 hora o 18 horas antres de LPC provocaba un aumento significativo en los neutrófilos y una eliminación bacteriana aumentada en la cavidad abdominal.
A partir de los resultados del ejemplo 4, puede entenderse que la inhibición de la interacción entre PS y CD300a por TX41 o similar permite la prevención de septicemia inducida por peritonitis.
En condiciones fisiológicas, varias células experimentan apoptosis. En este proceso, los receptores de PS desempeñan una función central en la incorporación de las células apoptóticas, y son indispensables para prevenir la progresión de enfermedades autoinmunitarias (documento 22 enumerado a continuación).
Por otro lado, se sabe que, en condiciones patológicas tales como infección microbiana, la muerte celular debida a apoptosis aumenta notablemente, y esto causa reacción de inflamación por mastocitos mediante receptores (por ejemplo, receptores de tipo Toll) contra patrones moleculares asociados a patógeno (PAMP) (documentos 15, 23 y 24 enumerados a continuación). Además, se sabe que los mastocitos desempeñan funciones importantes en la reacción inmunitaria contra patógenos.
Por tanto, a partir de los resultados de los ejemplos anteriores, puede entenderse que PS no solamente proporciona una señal de incorporación para fagocitos mediante varios tipos de receptores de PS, sino que también tiene un efecto para suprimir de forma eficaz la reacción de inflamación causada por mastocitos mediante CD300a.
Por lo tanto, puede entenderse que sustancia de unión a fosfatidilserina (por ejemplo, MFG-E8) y sustancia de unión a CD300a (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes contra CD300a) inhiben la interacción entre PS y CD300a en mastocitos para activar de ese modo los mastocitos y mantener dicha actividad.
Es decir, puede entenderse que estas sustancias son útiles como componentes eficaces de inmunoestimulantes usados para la profilaxis de diversas infecciones inflamatorias inducidas por LPS (y septicemia causada por las mismas).
Además, como PS suprime la señalización de activación de CD300a y, por tanto, suprime la activación de mastocitos, puede entenderse que PS es util como, por ejemplo, un componente eficaz de inmunosupresores a usar para suprimir la reacción de inflamación en enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunitarias (por ejemplo, para suprimir la liberación de mediadores químicos tales como histamina) para aliviar o tratar síntomas de las enfermedades alérgicas y enfermedades autoinmunitarias (es decir, para suprimir la función inmunitaria excesiva).
<Asma>
(Materiales y métodos)
(Ratones)
Se adquirieron ratones C57BL/6J de Clea Japan, Inc. Se obtuvieron ratones deficientes del gen de CD300a (ratones CD300a-/-) cruzando ratones deficientes del gen de CD300a Balb/c preparado en el laboratorio de los autores de la invención con los ratones WT C57BL/6J adquiridos durante 12 generaciones, y después realizando retrocruzamiento.
Se usaron ratones macho y hembra que eran de 8 a 10 semanas de edad al inicio de la inducción de asma.
(Asma inducida por OVA)
La fig. 13A muestra el protocolo de inducción de asma con ovoalbúmina. En los días 0, 7 y 14 después del inicio de la inducción de asma, se inyectó por vía intraperitoneal una mezcla de 100 |jg de ovoalbúmina (OVA, albúmina de huevo de pollo, fabricada por Sigma) y 100 j l de gel de hidróxido de aluminio (ALUM, ALhydrogel al 2 %, fabricado por Invitrogen) a cada ratón.
Además, en los días 21, 22 y 23 después del inicio de la inducción de asma, cada ratón se sometió a inhalación de ovoalbúmina al 10 % preparada por dilución con PBS, durante 30 minutos usando un nebulizador ultrasónico (NE-U17, Omuron). En el día 25 después del inicio de la inducción de asma, cada ratón se sometió a lavado broncoalveolar (BAL), y se recogió suero de cada ratón.
[Ejemplo 5A] (fig. 13A, fig. 13B)
(Lavado broncoalveolar BAL)
Después de someter a cada ratón a traqueotomía, se realizó lavado 3 veces con 1 ml de FBS/PBS al 2 %, seguido de recogida del líquido de lavado y medición del número de células. Como se muestra en la fig. 13A y en la fig. 13B, el número de células en el líquido de lavado broncoalveolar (líquido BAL) de cada ratón en el día 25 después del inicio de la inducción de asma, era significativamente menor en los ratones deficientes del gen de CD300a que en los ratones WT en términos tanto de número total de células como de número de eosinófilos. Este resultado indica que CD300a exacerbaba la inflamación eosinofílica de las vías respiratorias causada por ovoalbúmina (OVA), y que los ratones deficientes del gen de CD300a mostraban mejora de los síntomas de inflamación eosinofílica de las vías respiratorias.
[Ejemplo 5B] (Análisis de células en líquido de lavado broncoalveolar) (fig. 13C)
Con CD45.2-FITC, Siglec-F-PE, CD11b-APC Cy7, CD11c-PEC Cy7 y F4/80-Alexa (todos estos se adquirieron; BD), se tiñeron 1 x 106 células en el líquido de lavado broncoalveolar recogido, y se analizó CD45+SiglecF'CD11 b+CD11 c F4/80' como la fracción de eosinófilos por citometría de flujo (FACS).
El análisis de FACS de las células en el líquido de lavado broncoalveolar de los ratones en el día 25 después del inicio de la inducción de asma, mostró la relación de eosinófilos entre células CD45 positivas (CD45+SiglecF'CD11b+CD11c F4/80'). Los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron una relación significativamente menor de eosinófilos infiltrantes en líquido BAL que los ratones WT.
[Ejemplo 5C] (Medición de valor en suero de IgE) (fig. 14)
Se midió IgE en suero por ELISA usando un anticuerpo de rata anti-IgE de ratón (BD) y un anticuerpo anti-IgE de ratón biotinilado (BD).
Como se muestra en la fig. 14, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron valores en suero de IgE significativamente menores durante el periodo de sensibilización para causar asma inducida por ovoalbúmina.
Basándose en la comparación del valor de IgE en suero (índice del grado de alergia) entre los ratones modelo de asma inducida por OVA en el día 14 de la enfermedad, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron valores significativamente menores de IgE en suero que los ratones WT.
Se cree que la administración de un anticuerpo antiCD300a, que suprime la transducción de señales de CD300a, causa supresión significativa de IgE en suero en asma inducida por ovoalbúmina.
<Enteritis>
(Materiales y métodos)
(Ratones)
Se adquirieron ratones C57BL/6 (ratones WT) de Clea. Ratones deficientes del gen de CD300a establecidos a partir de células ES derivadas de Balb/cA en el laboratorio de los autores de la invención se retrocruzaron con C57BL/6, se usaron ratones de la 12.a generación o posterior.
Los ratones usados para el experimento se mantuvieron en un entorno sin patógenos específicos (SPF) en el centro de recursos de animales de laboratorio, universidad de Tsukuba.
(Inducción de enteritis)
Se hizo que ratones C57BL/6 hembra de 10 a 12 semanas de edad bebieran sal sódica de sulfato de dextrano al 2,5 % (p/v), de calidad reactiva (DSS, MP Biomedicals, peso molecular (PM) = 36000 a 50000) continuamente durante 8 días para la inducción de enteritis.
(Anticuerpos)
Se preparó anticuerpo antiCD300a biotinilado de BD (TX41) en el laboratorio de los autores de la invención. Otros anticuerpos, que se describen a continuación, se adquirieron de Bioscience.
Anticuerpo antiTNF-a de ratón purificado
Anticuerpo antiTNF-a de ratón marcado con biotina
IL-6 de ratón purificada
Anticuerpo anti-IL-6 de ratón marcado con biotina
Anticuerpo anti-IL-10 de ratón purificado
Anticuerpo anti-IL-10 de ratón marcado con biotina
Anticuerpo antiCD11b de ratón marcado con aloficocianina-Cy7(APC-Cy7) (M1/70)
Anticuerpo antiCD11c de ratón marcado con ficoeritrina-Cy7(pE-Cy7) (HL3)
Anticuerpo antiCD4 de ratón marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (L3T4)
(Líquido de cultivo tisular de intestino grueso)
Después de retirar el intestino grueso de cada ratón en el día 9 después de la administración de DSS o agua, se lavó el intestino grueso con tampón fosfato para eliminar las heces. Se hizo una incisión longitudinal en el intestino grueso y se cortaron 5 partes de tejido de 3 mm desde la parte 3 mm distante del ano, y las partes de tejido se sometieron a 12 horas de cultivo en RPMI 1640 con FBS al 10 % (fabricado por GIBCO). El sobrenadante entonces se recogió para proporcionar un líquido de cultivo tisular de intestino grueso. Se midieron TNF-a, IL-6 e IL-10 contenidos en el líquido de cultivo por ELISA emparedado.
(Aislamiento de células de la lámina propria del intestino grueso)
Los ratones se sacrificaron y se recogió el intestino grueso de cada ratón. El intestino grueso se cortó en 4 partes con tijeras y después se lavó con tampón fosfato para eliminar las heces. El tejido restante se colocó en DTT1 mM/MEDTA 5 mM/solución salina equilibrada de Hank (fabricado por Sigma), y se incubó en una estufa de incubación (de tipo agitador) a 37 °C durante 30 minutos.
Posteriormente, el tejido se lavó de nuevo con tampón fosfato para eliminar el epitelio desprendido y los contaminantes. El tejido restante se cortó en pequeñas partes con tijeras, y se colocó en 1 mg/ml de colagenasa de tipo 3 (fabricado por Worthington)/0,1 mg/ml de DNasa (fabricada por Worthington)/suero bovino fetal al 5 % /solución salina equilibrada de Hank, y se incubó en una estufa de incubación (de tipo agitador) a 37 °C durante 2 horas para permitir la lisis completa.
La suspensión celular se pasó a través de nailon de 70 pm y después se centrifugó. Las células obtenidas se suspendieron en Percoll al 40 % y se superpusieron sobre Percoll al 70 %. Después de la centrifugación, las células en la capa intermedia se recogieron para usarlas como células de lámina propia del intestino grueso en citometría de flujo.
(Aislamiento de células CD11b+CD11c+ y linfocitos T CD4+)
Las células aisladas de la lámina propia del intestino grueso se marcaron con anticuerpo antiCD11b marcado con APC-Cy7 (M1/70), anticuerpo antiCD11c marcado con PE-Cy7 (HL3) y anticuerpo antiCD4 de ratón marcado con FITC (L3T4). Las células marcadas se clasificaron por FACSAria (BD) para proporcionar las células CD11b+CD11c+ y los linfocitos T CD4+, respectivamente.
(Medición del nivel de ARNm)
Las células clasificadas por FACSAria se lisaron con ISOGEN-LS (Nippon Gene). A partir de las células lisadas, se extrajo el ARNm usando un kit de extracción de ARNm, y se preparó el ADNc usando un kit de transcripción inversa. El ADNc preparado se mezcló con cebadores (véanse las SEQ ID NO:1 a 16 en el listado de secuencias) y Power Cyber Green (Applied Biosystems), y se realizó la medición de los niveles de ARNm usando el sistema de PCR en tiempo real 7500 Fast (Applied Biosysytems).
[Ejemplo 6A] Tasa de corporal del peso corporal (fig. 15)
Se hizo que ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a bebieran sal sódica de sulfato de dextrano (DSS) al 2,5 % (p/v) continuamente durante 8 días para inducir enteritis y se midió el peso corporal de cada ratón cada día.
Los ratones usados eran ratones hembra de 10 a 12 semanas de edad y la tasa de cambio en el peso corporal se observó para 15 ratones WT y 15 ratones deficientes del gen de CD300a. La significación estadística se determinó por ensayo de t de Student (**: p < 0,01, ***: p < 0,001).
Como se muestra en la fig. 15, la pérdida de peso debida a enteritis inducida por beber DSS al 2,5 % fue significativamente más leve en los ratones deficientes del gen de CD300a que no tienen MAIR-I (□) que en los ratones WT (•).
[Ejemplo 6B] Medición de la longitud del intestino grueso (fig. 16A)
Se recogió el intestino grueso de 7 ratones WT y de 7 ratones deficientes del gen de CD300a en el día 6 de la administración de DSS, y se midió la longitud desde la región anal hasta la región del ciego. La significación estadística se determinó por ensayo de t de Student (**: p < 0,01).
Como se muestra en la fig. 16A, los ratones deficientes del gen de CD300a tenían intestinos gruesos más largos, y la atrofia del intestino grueso debida a la enteritis inducida por DSS fue más leve en los ratones deficientes del gen de CD300a que en los ratones WT.
[Ejemplo 6C] Medición de la longitud del intestino grueso (fig. 16B)
Simultáneamente se realizó evaluación histológica del intestino grueso. Como resultado, se observó que los ratones deficientes del gen de CD300a tenían cambios histológicos más leves en el intestino grueso que los ratones WT (fig.
16B).
[Ejemplo 6D] Medición de actividad citotóxica (fig. 17)
Los tejidos de intestino grueso de los ratones WT y de los ratones deficientes del gen de CD300a en el día 6 de la administración de DSS se tiñeron por tinción con HE (hematoxilina-eosina) y se puntuaron de 0 a 5 (0: sin cambio; 1: hipertrofia y cambios estructurales en las criptas; 2: disminución notable en las células caliciformes; 3: se encontraron criptas, pero sus estructuras apenas se mantenían; 4: se encuentra desaparición de criptas, pero no se encuentra desprendimiento del epitelio; 5: se encuentra desaparición de criptas, desprendimiento del epitelio e infiltración celular notable).
Cada uno de los intestinos gruesos de 7 ratones WT y de 7 ratones deficientes del gen de CD300a se fotografió con potenciación del campo visual en 10 zonas desde el lado anal, y las imágenes obtenidas se puntuaron. La significación estadístics se determinó por ensayo de la t de Student (***: p < 0,001). Los resultados se muestran en la fig. 17.
Como se muestra en la fig. 17, la lesión tisular debida a la enteritis por DSS fue leve en los ratones deficientes del gen de CD300a.
[Ejemplo 6E] Medición de IL-10 (fig. 18A)
Se administró DSS o agua (grupo de control), y se retiró el intestino grueso de cada ratón en el día 9 después de la administración de DSS. El intestino grueso se lavó con tampón fosfato y se cortó en partes de 3 mm3 desde el lado anal.
El tejido triturado del intestino grueso se cultivó en RPMI 1640 con FBS al 10 % (GIBCO) durante 12 horas, y después se recogió el sobrenadante. El sobrenadante de cultivo recogido se sometió a medición de los contenidos proteínicos de citocinas (TNF-a, IL-6 e IL-10) por ELISA emparedado. La significación estadístics se determinó por ensayo de la t de Student (*: p < 0,05).
Como se muestra en la fig. 18, en el tejido de intestino grueso con enteritis inducida por DSS, los contenidos de IL-6 y TNF-a no eran diferentes entre los ratones WT y los ratones deficientes del gen de CD300a. Sin embargo, se encontró producción de mayor nivel de IL-10 en los ratones deficientes del gen de CD300a (fig. 18A).
Se sabe que, en células Mreg, IL-10 suprime la expresión de CD80 y de CD86, que son proteínas necesarias para la activación de linfocitos T inflamatorios (documento 33 enumerado a continuación).
Como se muestra en la fig. 18A, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraban una producción aumentada de IL-10 al nivel de significación de un 5 %. Por tanto, se cree que IL-10 suprime la inducción del crecimiento de linfocitos T inflamatorios y la activación de linfocitos T inflamatorios, contribuyendo de ese modo al mantenimiento de la homeostasis del sistema inmunitario intestinal.
[Ejemplo 6F] Medición del número de células de cada tipo (fig. 18B)
En ratones en el día 0, día 2, día 4 y día 6 después de la administración de DSS, se investigaron los cambios en las poblaciones celulares de linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+, linfocitos B, macrófagos y células dendríticas.
Como resultado, como se muestra en la fig. 18B, no se encontraron diferencias en el número de células de cada población celular que se ha movido al intestino grueso entre los ratones WT y los ratones deficientes del gen de CD300a.
[Ejemplo 6G] Análisis de expresión de CD300a (fig. 19)
Células aisladas del intestino grueso se tiñeron con antiCD11b marcado con APC-Cy7 (M1/70), anti-CD11c marcado con PE-Cy7 (HL3) y biotina-antiCD300a (TX41). Las células en la fracción CD11b'CD11c, la fracción CD11b+CD11c , la fracción CD11b'CD11c+ y la fracción CD11b+CD11c+ se sometieron a medición de la expresión de CD300a por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la fig. 19.
Como se muestra en la fig. 19, en la lámina propia del intestino grueso, se encontró expresión de CD300a en células CD11b+CD11c+, que puede decirse que son células especiales.
[Ejemplo 6H] Cuantificación de la expresión en células CD11 b+CD11c+ (fig. 20)
Las células CD11b+CD11c+ aisladas del intestino grueso de cada ratón se clasificaron por FACSAria, y el ARNm entonces se extrajo de las células. Se preparó el ADNc a partir del ARNm extraído y se midieron los niveles de ARNm de IL-10, TNF-a e IL-6 por PCR cuantitativa.
Como resultado, como se muestra en la fig. 20, no pudieron encontrarse diferencias en los niveles de ARNm de IL-10, TNF-a e IL-6 en las células CD11b+CD11c+ entre los ratones WT y los ratones deficientes del gen de CD300a. [Ejemplo 6I] Cuantificación de la expresión en linfocitos T CD4+ (fig. 21)
Los linfocitos CD4+ aislados del intestino grueso de cada ratón después de la administración de DSS se clasificaron por FACSAria, y entonces se extrajo el ARNm de las células. Se preparó el ADNc a partir del ARNm extraído y se midieron los niveles de ARNm de IL-10, Foxp3, TGF-p, T-bet, GATA-3 y RORyt por PCR cuantitativa usando ABI 7500 fast. La significancia estadística se determinó por ensayo de la t de Student (*:p<0,05, **:p<0,01).
Como se muestra en la fig. 21, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron mayores niveles de ARNm de IL-10, Foxp3 y Tgfp en los linfocitos T CD4+.
(Discusión)
Como se muestra por los resultados de los ejemplos 6A a 6I, en ratones con enteritis inducida por DSS, la deficiencia de MAIR-I causa producción de citocinas antinflamatorias tales como IL-10 (fig. 21), que da lugar a mejora del estado patológico de enteritis.
Se cree que el fenómeno anterior no se debe a un aumento en una determinada población celular (fig. 18B), sino que se debe a la regulación de la producción de IL-10 mediante CD300a (MAIR-I) por las células dendríticas CD11bpositivas per se o determinadas células influenciadas por esas células dendríticas.
Es decir, puede predecirse que la supresión o inhibición de la transducción de señales de CD300a (MAIR-I) mediante células dendríticas CD11b-positivas puede dar lugar a mejora del estado patológico de enteritis.
<Dermatitis atópica>
Se investigó la implicación de CD300a en dermatitis atópica. Los materiales y métodos, y los ejemplos se muestran a continuación.
(Animales experimentales)
Se adquirieron ratones Balb/c de Clea Japan, Inc., y se mantuvieron en el laboratorio de los autores de la invención en condiciones de sala de cría aprobadas. Los ratones usados en este estudio era 8 ratones deficientes del gen de CD300a (MAIR-I) y 8 ratones Balb/c de tipo silvestre (WT: Wild Type). Durante el periodo experimental, a cada ratón se le proporcionó alimento y agua ad libitum, y se mantuvieron en condiciones de laboratorio normales.
(Sensibilización percutánea)
Cada ratón se anestesió ligeramente con isoflurano (Mylan, Osaka, Japón), y se afeitó el pelo del lomo con una maquinilla de afeitar. Un área (1 cm2) en la piel del lomo de cada ratón se sometió a al menos 10 veces de abrasión con cinta adhesiva usando cinta adhesiva de celofán.
En la gasa de la cinta adhesiva Band Aid (marca registrada), se pusieron 100 |jg de ovoalbúmina (OVA) en 100 |jl de solución salina tamponada con fosfato, y la cinta adhesiva resultante se aplicó a los cuerpos de 5 ratones en cada grupo sometido a la abrasión con cinta adhesiva. A los 3 ratones restantes, se les aplicó PBS sin cinta adhesiva. La cinta adhesiva se remplazó una vez en el día 2, y la sensibilización con OVA con la cinta adhesiva se realizó cada día durante 1 semana.
Cada ratón se mantuvo sin sensibilización con OVA durante la semana 2. Durante la semana 3, el ratón se sometió de nuevo a sensibilización con OVA de la misma manera que se describe anteriormente. Al final de la semana 3, cada ratón se sacrificó y se recogieron muestras para histología y ELISA.
(Número de veces de comportamiento de rascado)
Se contó el número de veces de comportamiento de rascado mediante observación cuidadosa de cada ratón durante 30 minutos al final de cada una de la semana 1 a semana 3.
(Histología)
Para la observación histológica, se recogió la piel de la zona sensibilizada con OVA en cada ratón. Cada muestra de piel recogida se cortó en pequeños bloques de tejido y se sumergió en paraformaldehído al 4 % a 4 °C durante 24 horas.
Después de esta fijación, se realizó una etapa de deshidratación. Todas las muestras de piel entonces se congelaron rápidamente en acetona en un recipiente que contenía hielo seco. Las muestras se almacenaron a -30 °C hasta su uso.
Las muestras de piel entonces se cortaron en secciones con un grosor de 4 jm usando un aparato de preparación de secciones congeladas, Coldtome HM560E (fabricado por Carl Zeiss, Jena, Alemania), y se colocaron en portaobjetos de vidrio prerrecubiertos con New Silane III (Muto Pure Chemicals, Co., Ltd., Tokio, Japón).
Las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina-eosina (fabricado por Sakura Finetek Japón), y después se tiñeron con azul de toluidina (fabricado por Santa Cruz Biotechnology, Inc.).
Se realizó evaluación de hallazgos histológicos del tejido para la profundidad de la piel (capa celular); infiltración de eosinófilos, monocitos y mastocitos; y el nivel de hiperplasia de fibroblastos.
[Ejemplo 7A] Número de veces de comportamiento de rascado (fig. 22)
La fig. 22 muestra el número de veces de comportamiento de rascado por 30 minutos en cada ratón. El prurito (una enfermedad que causa escozor sin causar erupción) es una afección común de dermatitis atópica. Por lo tanto, la evaluación se realizó contando el número de veces de comportamiento de rascado por observación cuidadosa de cada animal durante 30 minutos durante la sensibilización con OVA.
Como se muestra en la fig. 22, los ratones WT sensibilizados con OVA (♦) mostraron una afección grave de comportamiento de rascado después de la sensibilización con OVA y un mayor número de veces de comportamiento de rascado que los ratones deficientes del gen de CD300a sensibilizados con OVA (A). El número máximo de veces de comportamiento de rascado se observó al final de la 4.a sensibilización con OVA.
Durante la sensibilización con OVA, el síntoma más intenso de comportamiento de rascado se observó en los ratones WT (fig. 22). La aparición de un síntoma intenso de comportamiento de rascado es una de las características patológicas más comunes de dermatitis atópica. Por tanto, la implicación de células CD300a (MAIR-I)-positivas en una función importante en dermatitis atópica podría llegar a estar clara.
[Ejemplo 7B] Observación (véase la fig. 23)
Se observó la piel de cada ratón sensibilizado con OVA.
La fig. 23(A) muestra la piel de un ratón WT que no había experimentado sensibilización con OVA. En ratones WT no tratados, que no se habían sometido a sensibilización con ovoalbúmina, no se encontró infiltración celular en la dermis, y pudo observarse una epidermis delgada. Los paneles inferiores de la fig. 23 muestran vistas ampliadas de las zonas rectangulares en los paneles superiores. La longitud de cada barra gruesa corresponde a 10 jm .
Por otro lado, como se muestra en la fig. 23(B), la piel de los ratones WT sensibilizados con OVA mostraba hiperplasia de la epidermis e hiperplasia de fibroblastos. Se encontró infiltración obvia de eosinófilos (véanse las puntas de flecha blancas) y monocitos en la dermis de la piel en los ratones WT sometidos a sensibilización con ovoalbúmina.
Como se muestra en la fig. 23(C), en la epidermis de los ratones deficientes del gen de CD300a que no se habían sometido a sensibilización con OVA, no se encontró infiltración celular, y pudo observarse una epidermis delgada similar a la de la fig. 23(A).
Sorprendentemente, como se muestra en la fig. 23(D), la piel de los ratones deficientes del gen de CD300a sensibilizados con OVA mostró un grosor aumentado de la epidermis, pero no mostraba hiperplasia de la epidermis. Además, la dermis no mostraba infiltración celular no hiperplasia de fibroblastos.
[Ejemplo 7C] Tinción de mastocitos (véase la fig. 24)
Como se muestra en la fig. 24, todas las muestras de piel de ratón se sometieron a tinción con azul de toluidina. La tinción con azul de toluidina es un método de tinción que tiñe preferentemente gránulos intracelulares en mastocitos.
La fig. 24(A) muestra la piel de un ratón WT que no se había sometido a sensibilización con OVA. La fig. 24(B) muestra la piel de un ratón WT sensibilizado con OVA. La fig. 24(C) muestra la piel de un ratón deficiente del gen de CD300a que no se había sometido a sensibilización con OVA. La fig. 24(D) muestra la piel de un ratón WT sensibilizado con OVA. Los mastocitos teñidos se indican mediante puntas de flecha vacías.
Como se muestra en la fig. 24, después de la sensibilización con OVA, se encontró un número aumentado de mastocitos en la piel del ratón WT. Además, la epidermis en el ratón era más gruesa que en el ratón deficiente del gen de CD300a.
[Ejemplo 7D] Medición del número de capas celulares (fig. 25A)
Todas las muestras de piel de ratón se sometieron a recuento del número de capas celulares en la epidermis (véase la fig. 25A). Después de la sensibilización con OVA, los ratones WT mostraron el número mayor de capas celulares. Por otro lado, en los ratones deficientes del gen de CD300a sensibilizados con OVA, el número de capas celulares fue menor que la mitad de este número.
[Ejemplo 7E] Recuento del número de eosinófilos y del número de mastocitos (fig. 25B)
Como se muestra en la fig. 25B, todas las muestras epidérmicas de ratón se sometieron a recuento del número de eosinófilos y el número de mastocitos que muestran infiltración en la dermis, que son índices de dermatitis atópica. Los mayores números de células se observaron en la epidermis de los ratones WT después de la sensibilización con ovoalbúmina.
Por otro lado, en los ratones deficientes del gen de CD300a sensibilizados con OVA, los aumentos en el número de eosinófilos y el número de mastocitos fueron más suaves que los de los ratones WT. Después de la sensibilización con OVA, apareció hiperplasia de la epidermis e hiperplasia de fibroblastos mucho más intensamente en los ratones WT (fig. 23 y fig. 25A). La hiperplasia de la epidermis y fibroblastos es otra característica patológica principal de dermatitis atópica.
Además, se encontró un alto nivel de infiltración de eosinófilos, mastocitos y monocitos en la piel de los ratones WT sensibilizados con OVA (fig. 23 a fig. 25B). La interacción entre eosinófilos infiltrantes e hiperplasia de fibroblastos causa secreción de IL-31. IL-31 es una citocina que induce escozor (documento 34 enumerado a continuación: Wong CK et al., 2012).
Por lo tanto, después de la sensibilización con OVA, los ratones WT muestran características más intensas de dermatitis atópica que los ratones deficientes del gen de CD300a.
(Inmunohistología)
Para detectar CD300a (MAIR-I) y el antígeno langerina en secciones en serie de piel, se realizó el método de una etapa o dos etapas de inmunohistoquímica enzimática. En primer lugar, todas las secciones se aclararon 3 veces con solución salina tamponada con fosfato complementada con Tween al 0,05 % (TPBS, pH 7,4). Las secciones entonces se sumergieron durante 30 minutos en cada uno de metanol absoluto frío y H2O2 al 0,5 %.
Después de lavar en TPBS, las secciones se sometieron a tratamiento de bloqueo usando el reactivo Blocking One Histo (Nacalai Tesque, Inc., Kioto, Japón) durante 10 minutos, u después se lavaron con TPBS. Las secciones de piel se cultivaron a 4 °C durante 18 horas en presencia de IgG de cabra antilangerina (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, California, EE. UU.) e IgG 2aA de rata antiCD300a (MAIR-I) biotinilado (preparado en el laboratorio de los autores de la invención), y después a temperatura ambiente durante 1 hora en presencia de anticuerpo de burro anti-IgG de cabra biotinilado como anticuerpo secundario para langerina.
Finalmente, estas se cultivaron en presencia de DAB/concentrado de metales (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU.), y se contratiñeron con hematoxilina. Se cultivaron secciones de control negativo en presencia de TPBS o un anticuerpo de control de isotipo en lugar del antisuero primario.
[Ejemplo 7F] Inmunotinción de langerina (fig. 26)
Se investigó la epidermis de cada ratón para observar si es positiva o no para langerina, que es un marcador de células dendríticas en inmunotinción. La langerina es una lectina de tipo C expresada en células de Langerhans, y también se expresa en parte de las células dendríticas dérmicas. La langerina está implicada en el reconocimiento y la incorporación de antígenos, y la formación de gránulos de Birbeck, que son responsables del suministro de antígenos intracelulares.
(Resultados)
La fig. 26(A) muestra la epidermis de un ratón WT sin tratar (ratón con sensibilización con OVA). La fig. 26(B) muestra la epidermis de un ratón WT sensibilizado con OVA. La fig. 26(C) muestra la epidermis de un ratón deficiente del gen de CD300a sin tratar. La fig. 26(D) muestra la epidermis de un ratón deficiente del gen de CD300a sensibilizado con OVA. Los paneles a, b, c y d son vistas ampliadas de las zonas rectangulares en los paneles superiores.
Después de la sensibilización con OVA, se encontró un número significativamente mayor de células positivas a langerina en la epidermis de ratones WT que en la epidermis de ratones deficientes del gen de CD300a. Las puntas de flecha indican células positivas a langerina. Cada barra de escala representa 10 pm.
[Ejemplo 7G] Tinción con contraste después de inmunotinción de langerina (fig. 27)
Se evaluó la inmunopositividad del anticuerpo contra langerina por contratinción con azul de toluidina. La piel del ratón WT mostró un número aumentado de células positivas langerina en la dermis. En la dermis, se encontró interacción de varias células positivas a langerina con mastocitos. Los mastocitos se tiñeron de púrpura. Cada barra de escala representa 10 pm.
Las células de Langerhans y las células dendríticas de la piel son células presentadoras de antígeno principales en la piel.
Las células de Langerhans son positivas para el antígeno langerina en sus membranas celulares, y también hay células positivas a langerina presentes entre las células dendríticas de la piel (documento 35 enumerado a continuación: Nakajima S. et al., 2012).
Las células dendríticas de la piel positivas a langerina interactúan con mastocitos para activar linfocitos T CD4-positivos (documento 36 a continuación: Otsuka A. et al., 2011). En el modelo sensibilizado con OVA, los números de mastocitos (fig. 24 y fig. 25B) y células positivas a langerina (véase la fig. 26) aumentaron en gran medida en la piel de los ratones WT sensibilizados con OVA (véanse las puntas de flecha blancas en la fig. 26 para la comparación).
En la piel de los ratones WT sensibilizados con OVA, se encontró interacción entre mastocitos y células positivas a langerina (fig. 27).
(Discusión)
Por tanto, puede deducirse que la dermatitis atópica aparece más intensamente en la piel de ratones WT que en la piel de ratones deficientes del gen de CD300a. Estos resultados sugieren que CD300a (MAIR-I) desempeña una función importante en la dermatitis atópica.
En la dermis de la piel WT, las células CD300a (MAIR-I)-positivas aumentaban en gran medida después de la sensibilización con OVA (fig. 27). Este resultado confirma además que las células CD300a (MAIR-I)-positivas desempeñan una función importante en la dermatitis atópica.
(Tratamiento de dermatitis atópica)
(Tratamiento con anticuerpo antiCD300a (MAIR-I))
En el presente experimento, se usaron 6 ratones Balb/c de 7 semanas de edad. De acuerdo con el protocolo mostrado en la fig. 29, 3 animales de los 6 animales se sometieron a inyección intravenosa de IgG 2aA de rata antiCD300a (MAIR-I) (TX41), y los 3 animales restantes se sometieron a inyección intravenosa de un anticuerpo de control IgG 2aA de rata (TX74). Estos dos anticuerpos se prepararon y se comprobaron en el laboratorio de los autores de la invención. "TX74" es un anticuerpo de control de isotipo de TX41, y no tiene una acción neutralizante como se describe a continuación. Cada anticuerpo se diluyó con PBS estéril hasta una concentración de anticuerpo de 1600 pg/ml, y se inyectaron 150 pl de la dilución de una vez.
<Bloqueo de antígeno CD300a (MAIR-I) mediante inyección de anticuerpo contra CD300a (MAIR-I)>
La fig. 29 muestra el procedimiento para bloquear el antígeno CD300a (MAIR-I) en un ratón Balb/c WT. Cada línea gruesa indica el periodo de sensibilización con OVA. Las puntas de flecha indican la pauta de inyección de los anticuerpos.
Se evaluó la IgE total en suero al final de cada semana de sensibilización. Se recogieron muestras histológicas después de la sensibilización continua. El anticuerpo IgG 2aA de rata (TX41) anti-CD300a (MAIR-I), y el anticuerpo de control (TX74), que es un isotipo del mismo, se usaron para inyección intravenosa.
(ELISA)
Se recogió sangre periférica de la cavidad retroorbitaria usando un tubo de vidrio de hematocrito sencillo (Drummond Scientific Company, Broomall, Pensilvania, EE. UU.), y se centrifugó a 12000 rpm durante 5 minutos.
Se recogió suero cortando el tubo, y la sangre completa se diluyó con un suero de bloqueo antes de su uso en ELISA. El experimento de ELISA se realizó de acuerdo con el protocolo convencional para IgE total, recomendado por BD Biosciences, California, EE. UU.
[Ejemplo 7H] Inmunorreacción con anticuerpo antiCD300a (Confirmación de la presencia de receptores) (fig. 28)
Se evaluó la inmunopositividad de un anticuerpo antiCD300a con una muestra de piel de cada ratón. La fig. 28(A) muestra epidermis sin tratar de un ratón WT y (B) muestra la epidermis sensibilizada con OVA de un ratón WT.
La epidermis de ratones WT después de sensibilización con OVA mostraba células que son significativamente inmunopositivas. La epidermis de ratones deficientes del gen de CD300a no mostraba reacción inmunopositiva. Las puntas de flecha en (B) indican células CD300a (MAIR-I)-positivas. Cada barra de escala representa 10 pm.
[Ejemplo 7I] Tratamiento por administración de anticuerpo contra CD300a (fig. 30) (ELISA)
Como se muestra en la fig. 29, cada uno de TX41 y TX74 se administró a ratones WT de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, y se midió el nivel de IgE, que es un índice de dermatitis atópica.
La fig. 30 muestra el nivel de IgE total en suero medido por ELISA. El nivel de IgE después de sensibilización con OVA fue mayor en los ratones a los que se inyectó TX74 que en los ratones a los que se inyectó TX41.
[Ejemplo 7J] Tratamiento por administración de anticuerpo antiCD300a (fig. 31)
Como se muestra en la fig. 31, después de la sensibilización con OVA, los ratones WT a los que se inyectó TX74 mostraban una comportamiento de rascado más intenso que los ratones WT a los que se inyectó TX41.
[Ejemplo 7K] Tinción con H&E (fig. 32)
Como se muestra en la fig. 32, secciones de piel de los ratones WT del ejemplo 7I se sometieron a tinción con H&E. Después de la sensibilización con OVA, la piel de los ratones WT a los que se inyectó TX74 mostraba niveles mayores de hiperplasia de la epidermis e infiltración de monocitos que la piel de los ratones WT a los que se inyectó TX41. En la fig. 32, la barra de escala en la esquina inferior derecha de cada fotografía representa 10 pm.
[Ejemplo 7L] Tinción con azul de toluidina (fig. 33)
Como se muestra en la fig. 33, la piel de cada ratón WT se sometió a tinción con azul de toluidina. Después de la sensibilización con OVA, la piel de los ratones WT a los que se inyectó TX71 mostraba más mastocitos que la piel de los ratones WT a los que se inyectó TX41. Cada barra de escala representa 10 pm, de forma similar a la fig. 32.
(Discusión)
La IgE total y el número de comportamiento de rascado fueron mayores en los ratones a los que se inyectó TX74 que en los ratones a los que se inyectó TX41 (véase la fig. 30 y fig. 31). El grosor epidérmico, el número de células infiltrantes, el número de fibroblastos y el número de mastocitos también fueron mayores en los ratones a los que se inyectó TX74 que en los ratones a los que se inyectó TX41 (véase la fig. 32 y fig. 33).
A partir de estos resultados, pudo confirmarse además que CD300a (MAIR-I) desempeña una función importante en la dermatitis atópica, y pudo confirmarse el efecto de TX41, que es un anticuerpo antiCD300a, como un agente terapéutico para dermatitis atópica.
<Enfermedad celíaca>
La enfermedad celíaca (EC) es una enteritis progresiva causada por respuesta inmunitaria a la proteína del gluten alimenticio. La respuesta inmunitaria adaptativa específica para el péptido de gliadina derivado del gluten está implicada en la progresión de la enfermedad celíaca. La respuesta inmunitaria innata como causa fundamental de la enfermedad no se ha dilucidad completamente.
Aquí, se demuestra que CD300a (MAIR-I), que se expresa en macrófagos de la lámina propia (macrófagos en la lámina propia) y es un miembro de la familia de receptores de tipo inmunoglobulina asociados a la médula ósea, desempeña una función reguladora en la progresión de las enfermedades intestinales inducidas por el gluten alimenticio.
Ratones deficientes del gen de CD300a, que carecen de CD300a (MAIR-I), alimentados con una dieta alta en gluten mostraron síntomas parecidos a enfermedad celíaca. En comparación con ratones de tipo silvestre (WT) alimentados con una dieta alta en gluten, cada ratón deficiente del gen de CD300a mostró un aumento leve en el peso corporal, una alta puntuación clínica, una gran cantidad de transglutaminasa 2 y acumulación de macrófagos de la lámina propia en el yeyuno.
En comparación con los ratones alimentados con una dieta alta en gluten, los macrófagos de la lámina propia de cada ratón deficiente del gen de CD300a alimentado con una dieta alta en gluten mostraban mayor expresión de IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p, MCP1 y MCP5.
Después de estimulación in vitro con el péptido tóxico de gliadina (P31-43), los macrófagos de la lámina propia de cada ratón deficiente del gen de CD300a mostraron expresión de mayor nivel de las citocinas descritas anteriormente.
Se produjo expresión potenciada de IL-6, TNF-a e IFN-p en macrófagos de la lámina propia de ratones deficientes del gen de CD300a, que carecen de CD300a (MAIR-I) y tienen un fondo genético deficiente de MyD88 y deficiente de TRIF.
Además, el bloqueo de la unión a fosfatidilserina, que es el ligando de CD300a (MAIR-I) en células apoptóticas, a CD300a (MAIR-I) promovió la producción de citocinas en macrófagos de la lámina propia de ratones WT.
En resumen, estos resultados indican que la interacción entre macrófagos en la lámina propia intestinal y CD300a (MAIR-I) en células apoptóticas desempeña una función protectora en la progresión de la enfermedad celíaca, mediante rutas de señalización de gliadina inhibidoras mediadas por MyD88 y TRIF.
(Materiales y métodos)
(Ratones)
Se proporcionaron ratones macho Balb/c de tipo silvestre (WT) de 9 a 14 semanas de edad, y crías de la misma camada de ratones Balb/c deficientes del gen de CD300a, que no tienen CD300a (MAIR-I). Estos ratones se usaron en un experimento en que se alimentaron con una dieta normal (ND), dieta alta en gluten (HGD) o dieta sin gluten (GFD).
Para experimentos in vitro, se usaron ratones Balb/c WT; y ratones Balb/c o C57BL/6 B6 deficientes del gen de CD300a, que no tienen CD300a (MAIR-I). Estos ratones tenían el mismo sexo y edad. Se adquirieron ratones B6 deficientes del gen de MyD88 y ratones B6 deficientes del gen de TRIF de Oriental BioService, Inc (Kioto, Japón). Todos los ratones se mantuvieron en condiciones sin patógenos específicos.
(Ensayo de alimentación)
Ratones WT y ratones CD300a (MAIR-I) se mantuvieron con dieta en polvo normal que contenía menos de un 2 % de gluten (MF, Oriental Yeast Co., Ltd., Tokio, Japón) (ND). Ratones Wt y ratones deficientes del gen de CD300a se mantuvieron con una dieta alta en gluten (HGD), que es igual a MF excepto que contenía gluten al 30 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri). En varios experimentos, se alimentaron ratones con gránulos de ND (MF) o una dieta sin gluten (GFD; AIN-76A, Research Diets, Inc., New Brunswick, Nueva Jersey).
(Reducción de la microbiota)
Se realizó reducción de la microbiota como en el [documento 37 enumerado a continuación]. La reducción de la microbiota se confirmó observando las unidades formadoras de colonias en las heces de cada ratón usando una placa de agarosa que contenía medio de infusión de cerebro-corazón.
(Análisis histopatológico)
Se observaron cambios histopatológicos en ratones en las semanas específicas descritas posteriores después de alimentarlos con ND, HGD o GFD. Se aislaron muestras del yeyuno y el colon y se fijaron en formol, seguido de tinción con hematoxilina-eosina.
La norma para la puntuación clínica para el yeyuno se definió como en el [documento 38 enumerado a continuación]. En resumen, la puntuación de la relación entre criptas y vellosidades se calculó de acuerdo con el promedio de las profundidades de las criptas y las vellosidades (puntuación de 0 a 3). Además, se calculó la puntuación (puntuación de 0 a 3) de infiltración de monocitos de acuerdo con el promedio de los diámetros de la lámina propia de vellosidades y criptas. La puntuación clínica final se representó como el total de 0 a 6.
Se contó el número de linfocitos intraepiteliales en células epiteliales del intestino (IEL) del yeyuno y se representó como el número de IEL por 100 células epiteliales del intestino ([documento 39 enumerado a continuación]). Se realizó la cuantificación de transglutaminasa 2 (TG2) en el yeyuno usando una suspensión tisular del yeyuno. El ensayo se realizó usando TG2-CovTest (Zedira, Darmstadt, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
(Valoración de anticuerpos IgG e IgA contra gliadina)
Se determinaron los títulos de anticuerpos en suero de IgG e IgA contra gliadina en ratones por un inmunoensayo enzimático. Esto se realizó por el método descrito en el [documento 40 enumerado a continuación] con algunas modificaciones.
Un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano rusticano (HRP) (GE Healthcare, Little Chalfont, R.U.), y un anticuerpo anti-IgA de ratón marcado con HRP (Southern Biotech, Birmingham, Alabama) se usaron como anticuerpos de detección de IgG e IgA antigliadina, respectivamente. Se usó reactivo OPD (Sigma-Aldrich) como sustrato de HRP en análisis colorimétrico.
(Aislamiento de macrófagos de la lámina propia y células dendríticas)
Se aislaron macrófagos de la lámina propia (LP M9) y células dendríticas (DC) de acuerdo con el [documento 41 enumerado a continuación] con algunas modificaciones.
Después de eliminar el mesenterio y las placas de Peyer, se cortó el yeyuno en pequeños trozos. Los trozos se lavaron un total de 3 veces con tampón PBS complementado con EDTA 2 mM (Sigma Aldrich) y FCS al 20 %, con agitación a 37 °C durante 15 minutos.
El tejido restante se homogeneizó y después se digirió en tampón PBS complementado con 1,5 mg/ml de colagenasa de tipo VIII (Sigma-Aldrich) y FCS al 20 %, con agitación a 37 °C durante 20 minutos.
Los macrófagos de la lámina propia y las células dendríticas de la lámina propia que expresaban CD45 en la suspensión tisular se concentraron usando anticuerpo anti-CD45 de ratón biotinilado (30-F11, BD Biosciences, Franklin Lakes, Nueva Jersey) y partículas de estreptavidina plus IMAG (BD Biosciences).
Las células que expresan CD45 en la lámina propia se tiñeron con un anticuerpo anti-CD11b de ratón conjugado con isotiocianato de fluoresceína (M1/70), anticuerpo contra CD11c conjugado con ficoeritrina (HL3), yoduro de propidio, TX41 marcado con Alexa 647 (antiCD300a de ratón (antiMAIR-I de ratón), IgG2a de rata) o TX74 marcado con Alexa 647 (antiFLAG, control de isotipo para TX41), anticuerpo antiCD45 de ratón y estreptavidina aloficoeritrina Cy7 (aloficoeritrina-Cy7).
Todos los anticuerpos marcados de forma fluorescente y estreptavidina aloficoeritrina-Cy7 se adquirieron de BD Biosciences.
Las células CD11b+CD11clow y las células CD11c+ seleccionadas basándose en el número de células CD45+PI' se aislaron como macrófagos de la lámina propia y células dendríticas de la lámina propia usando FACSAria (BD Biosciences).
Un principio importante del análisis de datos de citometría de flujo es visualizar selectivamente las partículas de interés mientras se eliminan las partículas innecesarias (células muertas, residuos y similares). Esta operación se llama selección (seleccionar).
(Análisis de citometría de flujo)
Los macrófagos, células dendríticas CD11b+ y células dendríticas CD11b' entre las células de la lámina propia, que son CD45+PI', se seleccionaron basándose en los números de CD11b+CD11clow, CD11b+CD11c+ y CD11b'CD11c+, respectivamente.
Se obtuvieron linfocitos Intraepiteliales y células epiteliales del intestino lavando trozos pequeños de yeyuno con tampón PBS complementado con EDTA 2 mM y FCS al 20 %. Los linfocitos intraepiteliales y las células epiteliales del intestino contenidas en la suspensión se seleccionaron basándose en el número de células CD45+PI' y el número de células CD45-PI-.
La expresión de CD300a (MAIR-I) en macrófagos, células dendríticas CD11b+ y células dendríticas CD11b- en la lámina propia, los linfocitos intraepiteliales y las células epiteliales del intestino se analizaron con TX41 marcado con Alexa 647 (antiMAIR-I de ratón, IgG2a de rata) o TX74 marcado con Alexa 647 (antiFLAG de TX41, control de isotipo).
Las células apoptóticas que presentan fosfatidilserina (PS) se analizaron usando anexina V conjugada con aloficocianina. Se realizó análisis de citometría de flujo usando FACSAria (BD Biosciences).
(Método de RT-PCR cuantitativa)
En Isogen LS (Nippon Gene, Tokio, Japón), se resuspendieron de 10000 a 20000 macrófagos de la lámina propia y células dendríticas de la lámina propia que se estimularon con o no se estimularon con el péptido tóxico de gliadina P31-43, y se aisló el ARN total de la suspensión resultante de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se sintetizó ADN monocatenario a partir del ARN total usando un kit de transcripción inversa de ADNc (Applied Biosystems, Foster City, California). Los conjuntos de cebadores usados para reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa mediada por transcriptasa inversa (Q-RT-PCR) se diseñaron por PrimerBank (http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/) [documento 42 enumerado a continuación].
La Q-RT-PCR se realizó usando Platinum SYBR Green Super Mix UDG (Invitrogen, Carlsbad, California) y ABI 7500 Fast (Applied Biosystems). Los datos se analizaron por el método de DDCT (delta delta CT).
Se prepararon muestras de control que expresaban todos los genes ensayados en este estudio a partir de esplenocitos estimulados con lipopolisacárido (1000 ng/ml, 6 horas), y eran ADN monocatenario. Los resultados se muestran basándose en la cuantificación comparativa con muestras que mostraban expresión de los genes respectivos.
(Estimulación con gliadina)
El péptido tóxico a-gliadina P31-43 derivado del gluten [documento 43 enumerado a continuación] y el péptido de ovoalbúmina P323-339 como control se sintetizaron por Operon Biotechnologies (Huntsville, Alabama).
Las purezas de estos péptidos eran de no menos de un 95 %, y las unidades de endotoxina/ml eran de menos de 0,001. Esto se confirmó con Limulus Color KY Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka).
Se estimularon macrófagos en las células de exudado peritoneal (PEC) inducidas por tioglicolato preparados a partir de un ratón B6 usando 100 pg/ml de péptido de gliadina P31-43 u ovoalbúmina P323-339 como se describe en el [documento 44 enumerado a continuación].
En los pocillos de una placa de fondo plano de 96 pocillos, se cultivaron de 10000 a 20000 macrófagos de la lámina propia y células dendríticas CD11b+ derivadas de ratones WT o ratones deficientes del gen de CD300a en medio RPMI 1640 complementado con FCS al 10 %, glutamina/estreptomicina/penicilina, HEPES y aminoácidos no esenciales.
Los macrófagos de la lámina propia de ratones Balb/c o ratones B6 se estimularon durante 10 horas o 3 horas con 100 pg/ml de péptido de gliadina P31-43. En varios experimentos, los macrófagos de la lámina propia se trataron o no se trataron con MFG-E8 (concentración final, 5 pg/ml) de un ratón recombinante a 4 °C durante 30 minutos y, además, se estimularon con el péptido de gliadina P31-43 a 37 °C durante 3 horas.
(Análisis estadísticos)
Todos los análisis estadísticos se realizarse usando el ensayo de la U de Mann-Whitney. La significancia estadística se juzgó en P<0,05.
[Ejemplo 8A] Cambio de peso corporal (BW) (fig. 34)
Para investigar si CD300a (MAIR-I) está implicado o no en la progresión de la enfermedad celíaca (EC), ratones Balb/c deficientes del gen de CD300a o ratones de tipo silvestre (WT) se mantuvieron con una dieta normal que contenía menos de un 2 % de gluten (ND) o una dieta alta en gluten que contenía un 30 % de gluten (HGD). Después de empezar la alimentación con la dieta normal o la dieta alta en gluten, se controlaron los cambios en el peso corporal (BW).
"O " representa "ratones WT, n = 7"; " • " representa "ratones deficientes del gen de CD300a, dieta normal, n = 9"; "□" representa "ratones WT, dieta alta en gluten, n = 10"; y "■" representa "ratones deficientes del gen de CD300a, dieta alta en gluten, n = 14".
Los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con la dieta alta en gluten (HGD) mostraron un grado significativamente menor de aumento en el peso corporal (BW) que los ratones WT mantenidos con la dieta alta en gluten (HGD) (fig. 34). Se confirmó que los ratones deficientes del gen de CD300a mostraban progresión de enteropatía de tipo enfermedad celíaca después de alimentarse con la dieta alta en gluten. Estos resultados sugieren que CD300a (MAIR-I) desempeña una función protectora en la progresión de la enfermedad intestinal en el yeyuno después de alimentación con una dieta alta en gluten.
[Ejemplo 8B] Tinción con H&E (fig. 35)
Se realizó análisis histopatológico de los intestinos de ratones en la semana 20 después de alimentarse con una dieta normal o una dieta alta en gluten (HGD). El yeyuno de cada ratón se fijó con formol, seguido de tinción con hematoxilina-eosina. La fig. 35 muestra un resultado representativo obtenido para un ratón en cada grupo.
Los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) mostraron una enfermedad intestinal más avanzada en el yeyuno en comparación con los ratones WT mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) (véase la fig. 35)
[Ejemplo 8C] Número de linfocitos intraepiteliales (fig. 36, La fig. 37)
De acuerdo con el método descrito anteriormente, se hizo recuento de la puntuación clínica y el número de linfocitos intraepiteliales (IEL) por 100 células epiteliales del intestino (IEC) en el yeyuno de cada ratón en la semana 20 después de alimentación con la dieta normal o la dieta alta en gluten. "* y **" representan p<0,05 y p<0,01, respectivamente.
Como se describe anteriormente, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraban atrofia de las vellosidades en el yeyuno (fig. 35) y puntuaciones clínicas significativamente mayores (véase la fig. 36). Además, se encontró un aumento en los linfocitos intraepiteliales (IEL) en células epiteliales del intestino delgado (IEC) en comparación con los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con FD, así como los ratones WT mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) (véase la fig. 37).
[Ejemplo 8D] TG2-CovTest (Análisis colorimétrico para la cuantificación de actividad de entrecruzamiento de TG2 específica) (fig. 38)
Se sabe que la concentración de transglutaminasa 2 (TG2) está influenciada por la inflamación intestinal. TG2 es una enzima clave para la progresión de la enfermedad celíaca. Se alimentaron ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a con una dieta normal o dieta alta en gluten durante al menos 20 semanas, y se cuantificó la concentración de transglutaminasa 2 (TG2) en una suspensión de yeyuno de cada ratón con TG2-CovTest.
Como resultado, la concentración de TG2 en el intestino fue la más alta en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) entre los grupos de ratones (véase la fig. 38).
[Ejemplo 8E] Citometría de flujo (fig. 39)
Se analizó la expresión de CD11b y CD11c en células de la lámina propia seleccionadas para la población de células CD45+PI' por citometría de flujo. Se analizaron las células de la lámina propia (LP) de ratones WT o ratones deficientes del gen de CD300a de la cepa Balb/c alimentados con dieta normal o dieta alta en gluten por citometría de flujo. Las células de LP que expresan CD45 se concentraron usando la tecnología de I-Mag (sistema de separación de células usando microesferas magnéticas).
Las células CD11b+CD11clow son macrófagos de la lámina propia, y las CD11 b+CD11c+ y CD11 b'CD11 c+ son células dendríticas (DC) de la lámina propia (LP).
[Ejemplo 8F] Cambios cuantitativos y cualitativos en inmunocitos (fig. 40)
En cada uno de los ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a, se midió la frecuencia de macrófagos de la lámina propia (LP) (barra vacía), la frecuencia de células dendríticas CD11b+ de la lámina propia (LP) (barra rellena) y la frecuencia de células dendríticas CD11b' de la lámina propia (LP) (barra sombreada).
Es decir, se investigaron los cambios cuantitativos y cualitativos en los inmunocitos de la lámina propia del yeyuno de ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta normal (ND) o dieta alta en gluten (HGD).
La frecuencia de macrófagos de la lámina propia que expresan CD11b+CD11clow (Mf lp) fue significativamente mayor en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) que en los ratones WT mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) o en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta normal (ND) (véanse y compárense las poblaciones celulares de 5,8 en el panel inferior derecho, 2,3 en el panel inferior izquierdo y 2,2 en el panel superior derecho de la fig. 39; y véase la fig. 40).
Los macrófagos de la lámina propia del intestino son células diferenciadas a partir de monocitos inflamatorios que expresan CCR2 en sangre periférica [documento 45 enumerado a continuación].
En vista del hecho de que CCR2 es un receptor de MCP1 y MCP5, la expresión aumentada de estas quimiocinas en macrófagos de la lámina propia después de estimulación con gliadina es coherente con la alta frecuencia de macrófagos de la lámina propia en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) (véase la fig. 40).
[Ejemplo 8H] Niveles de expresión génica de citocinas y quimiocinas (fig. 41)
Los niveles de expresión génica de citocinas y quimiocinas en macrófagos de la lámina propia (LP) aislados de cada ratón se analizaron por RT-PCR cuantitativa. En la fig. 41, el nivel de expresión de cada gen se expresa como el nivel relativo con respecto al nivel en ratones WT alimentados con una dieta normal, que se toma como "1" para usarse como patrón.
Los macrófagos de la lámina propia en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) mostraron niveles significativamente mayores de citocinas inflamatorias (IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-b y MCP1) y algunas quimiocinas tales como MCP5 en comparación con los ratones WT mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) (véase la fig. 41).
Se cree que la expresión potenciada de citocinas inflamatorias y quimiocinas a partir de macrófagos de la lámina propia en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) se debe a la enfermedad intestinal observada en los ratones.
Además, curiosamente, los macrófagos de la lámina propia en los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta normal (ND) mostraron mayor expresión de IL-15 y p19 en comparación con los ratones WT mantenidos con ND (fig. 48).
[Ejemplo 8I] (fig. 42)
La expresión de CD300a (MAIR-I) en macrófagos de la lámina propia, células dendríticas CD11b+, células dendríticas CD11 b', células epiteliales del intestino y linfocitos intraepiteliales se analizó por citometría de flujo.
Se detectó CD300a (MAIR-I) usando TX41 (anticuerpo monoclonal de ratón antiMAIR-I). Los macrófagos de la lámina propia (M9), las células dendríticas CD11b+ y las células dendríticas CD11b‘ se seleccionaron basándose en el número de células de la lámina propia CD45+PI’.
Los linfocitos intraepiteliales (IEL) y las células epiteliales del intestino (IEC) se seleccionaron en las fracciones CD3+CD45+PI’ y CD45-PI’, respectivamente.
CD300a (MAIR-I) se expresa en la mayoría de células de médula ósea incluyendo macrófagos, granulocitos, mastocitos y células dendríticas ([documento 46 enumerado a continuación]).
Como se describe anteriormente, los autores de la presente invención analizaron la expresión de CD300a (MAIR-I) en macrófagos de la lámina propia, células dendríticas inflamatorias CD11b+ de la lámina propia, células dendríticas tolerogénicas CD11 b‘, linfocitos intraepiteliales (IEL) y células epiteliales del intestino (IEC), y macrófagos de la lámina propia, e investigaron además las subpoblaciones que expresan CD300a (MAIR-I) de células dendríticas CD11b+ de la lámina propia y células dendríticas CD11b‘ de la lámina propia. Como resultado, no se encontró expresión de CD300a (Ma IR-I) en los linfocitos intraepiteliales (IEL) y células epiteliales del intestino (IEC) (fig. 42).
[Ejemplo 8J] (fig. 43)
Aunque no se ha identificado el receptor del péptido de gliadina, estudios previos informaron de que el péptido gliadina P31-43 se acumula en endosomas tempranos e inhibe su maduración (documentos 47 y 48 enumerados a continuación).
Se aislaron células dendríticas CD11b+ de la lámina propia (LP) de ratones Balb/c WT o ratones deficientes del gen de CD300a, y se estimularon in vitro con 100 mg/ml de péptido tóxico de gliadina P31-43 durante 10 horas.
Los niveles de expresión génica de citocinas y quimiocinas (IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p, MCP1 y MCP5) en células dendríticas CD11b+ de la lámina propia (LP) en los ratones WT y los ratones deficientes del gen de CD300a después de estimulación con gliadina se analizaron por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se expresa como el nivel relativo con respecto al nivel de ratones WT son tratar, que se toma como "1" para usarse como patrón. Como resultado de la investigación de los niveles de expresión génica, los niveles de expresión de IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p, MCP1 y MCP5 después de estimulación con el péptido de gliadina P31-43 fueron significativamente mayores en macrófagos de la lámina propia de ratones deficientes del gen de CD300a que en macrófagos de la lámina propia de ratones WT (fig. 43).
Las células dendríticas CD11b+ de la lámina propia inflamatorias de ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta normal (ND) mostraron mayor expresión de IL-15 en comparación con ratones WT mantenidos con una dieta normal (ND).
[Ejemplo 8K] Supresión de expresión de citocinas inducida por gliadina (fig. 44)
Los autores de la presente invención ensayaron si la adición de una proteína MFG-E8 de ratón recombinante puede bloquear o no la interacción entre CD300a (MAIR-I) en macrófagos de la lámina propia y fosfatidilserina (PS) presentada en células apoptóticas.
Los macrófagos en las células de la lámina propia derivadas de ratones B6 WT o ratones deficientes del gen de CD300a se pretrataron usando o sin usar 5 mg/ml de MFG-E8 de ratón, y después se estimularon in vitro con el péptido tóxico de gliadina P31-43 durante 10 horas.
La expresión de los genes de IL-6, TNF-a e IFN-p en los macrófagos estimulados entonces se analizaron por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se determinó por cuantificación comparativa en que el nivel de expresión en los ratones WT sin tratar se tomó como "1".
Como resultado, en comparación con los macrófagos de la lámina propia sin tratar de ratones WT, los macrófagos de la lámina propia de los ratones WT tratados con MFG-E8 aumentaron significativamente la expresión de IL-6, TNF-a e IFN-p (fig. 44).
Estos resultados indican que la interacción entre CD300a (MAIR-I) en macrófagos de la lámina propia y fosfatidilserina en células apoptóticas suprime las rutas de señalización de gliadina mediadas por MyD88 y mediadas por TRIF para regular la reacción de inflamación excesiva contra el gluten alimenticio.
Estos resultados sugieren que la interacción entre CD300a (MAIR-I) en macrófagos de la lámina propia y fosfatidilserina en células apoptóticas suprime las rutas de señalización de gliadina mediadas por MyD88 y mediadas por TRIF para regular de ese modo la reacción de inflamación excesiva contra el gluten alimenticio.
[Ejemplo 8L] (fig. 45)
Ratones Balb/c WT y ratones deficientes del gen de CD300a alimentados con una dieta normal o una dieta alta en gluten se sometieron a análisis histopatológico del intestino grueso.
Como resultado, no se observaron cambios atróficos en el intestino de los ratones deficientes del gen de CD300a mantenidos con una dieta alta en gluten (HGD) (fig. 45).
[Ejemplo 8M] (fig. 46)
Sueros derivados de ratones Balb/c WT y ratones deficientes del gen de CD300a alimentados con una dieta normal o una dieta alta en gluten se sometieron a investigación de los títulos de anticuerpos IgG e IgA contra gliadina de acuerdo con el método descrito anteriormente.
En la fig. 46, los paneles superiores muestran datos obtenidos para los ratones individuales, y los paneles inferiores muestran los valores promedio.
Como resultado, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron enteritis después de ingesta de la dieta alta en gluten, pero no se encontró ningún aumento en los títulos de IgG e IgA contra gliadina.
[Ejemplo 8N] Análisis patológico (fig. 47)
Ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a alimentados con una dieta sin gluten se sometieron a análisis patológico.
Se suministró una dieta sin gluten a ratones Balb/c WT y ratones deficientes del gen de CD300a. Desde el inicio de la alimentación con una dieta sin gluten, se controlaron los cambios en el peso corporal (BW) de cada ratón a lo largo del tiempo.
Como resultado, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron una tasa significativamente menor de aumento en el peso corporal que los ratones WT.
[Ejemplo 8O] Niveles de expresión de citocinas (fig. 48)
Se investigaron los niveles de expresión de citocinas en células dendríticas CD11b+ y macrófagos en la lámina propia (LP) de ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a en condiciones normales.
Se aislaron macrófagos de la lámina propia (LP) de ratones Balb/c WT y ratones deficientes del gen de CD300a, y se analizó la expresión de p19 en los macrófagos por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión génica se expresó como el nivel relativo con respecto al nivel en los ratones WT, que se consideró como "1".
Además, asimismo, se aislaron células dendríticas CD11b+ de la lámina propia (LP) de ratones Balb/c, y se analizó la expresión de IL-15 en las células por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión se expresó como el nivel relativo con respecto al nivel en los ratones Wt , que se tomó como "1".
Como se muestra en la fig. 48, los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron niveles de expresión significativamente mayores de los genes de p19 e IL-15 que los ratones WT.
[Ejemplo 8P] (fig. 49)
Se investigó la expresión de citocinas en macrófagos en células de exudado peritoneal inducidas por tioglicolato después de estimulación con el péptido tóxico de gliadina P31-43.
En vista del hecho de que únicamente los macrófagos de la lámina propia en ratones deficientes del gen de CD300a producen una gran cantidad de citocinas inflamatorias después de alimentación con una dieta alta en gluten (HGD), los autores de la presente invención investigaron si el péptido tóxico de gliadina P31-43 derivado de gluten estimula o no la expresión de citocinas inflamatorias en macrófagos.
Se prepararon macrófagos en células de exudado peritoneal (PEC) inducidas por tioglicolato a partir de ratones B6 WT. Los macrófagos entonces se estimularon in vitro durante 3 horas con 100 mg/ml de péptido tóxico de gliadina P31-43, o con el péptido OVA P323-339 para estimulación de control negativo.
La expresión de los genes de IL-6, IL-15, TNF-a e IFN-p en los macrófagos de células de exudado peritoneal estimulados se analizó por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se expresó basándose en la cuantificación relativa en que el nivel de expresión en los macrófagos sensibilizados con el péptido OVA se tomó como "1".
Después de la estimulación con el péptido de gliadina P31-43, los macrófagos de células de exudado peritoneal inducidas por tioglicolato (PEC) mostraron expresión significativamente mayor de IL-6, IL-15, TNF-p e IFN-a en comparación con los macrófagos que se sensibilizaron/estimularon con el péptido de control de ovoalbúmina P323-339 (fig. 49).
[Ejemplo 8Q] (fig. 50)
Se aislaron células dendríticas CD11b+ de ratones Balb/c WT y ratones deficientes del gen de CD300a, y después se estimularon in vitro durante 10 horas con 100 mg/ml de péptido tóxico de gliadina P31-43. Los niveles de expresión de IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p, MCP1 y MCP5 en las células dendríticas CD11b+ de la lámina propia estimuladas se analizaron por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se expresó basándose en la cuantificación relativa en que el nivel de expresión en los ratones WT se tomó como "1".
Las células dendríticas CD11b+ de la lámina propia de los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron mayores niveles de expresión de las citocinas IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p y MCP1 que las células dendríticas CD11b+ de la lámina propia de los ratones WT (fig. 50).
[Ejemplo 8R] (fig. 51)
Se investigó la expresión de citocinas y quimiocinas en macrófagos de la lámina propia (LP) de ratones b6 WT y ratones deficientes del gen de CD300a después de estimulación con gliadina.
Los macrófagos de la lámina propia (LP) derivados de ratones b6 WT y ratones deficientes del gen de CD300a se estimularon in vitro durante 3 horas con 100 mg/ml de péptido tóxico de gliadina P31-43.
La expresión de los genes de IL-6, TNF-a e IFN-p en los macrófagos de la lámina propia (LP) estimulados se analizó por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se expresó basándose en la cuantificación relativa en que el nivel de expresión en los ratones WT se tomó como "1".
Como resultado, los macrófagos de la lámina propia de los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron niveles de expresión significativamente mayores de IL-6, TNF-a e IFN-p que los de los ratones WT (fig. 51).
La interacción entre CD300a (MAIR-I) de macrófagos de la lámina propia y fosfatidilserina en células apoptóticas suprimía las rutas de señalización de gliadina mediadas por MyD88 y mediadas por TRIF.
Después de la estimulación in vitro con el péptido de gliadina P31-43, los macrófagos de la lámina propia de los ratones deficientes del gen de CD300a mostraron alta expresión tanto de citocinas inflamatorias como de IFN de tipo I (fig. 43 y fig. 51).
Estos resultados demuestran que CD300a (MAIR-I) en macrófagos de la lámina propia en el yeyuno suprime la expresión de citocinas inflamatorias y quimiocinas potenciada en respuesta al péptido tóxico de gliadina P31-43 derivado de gluten alimenticio.
[Ejemplo 8S] (fig. 52)
Se investigó la expresión de citocinas y quimiocinas en macrófagos de la lámina propia (LP) derivados de ratones WT o ratones deficientes del gen de CD300a sometidos a reducción de la microbiota (después de estimulación con gliadina).
Se aislaron macrófagos de la lámina propia (LP) de ratones Balb/c WT tratados con antibiótico y ratones deficientes del gen de CD300a, y se estimularon in vitro durante 10 horas con 100 mg/ml de péptido tóxico de gliadina P31-43. La expresión de los genes de IL-6, IL-15, TNF-a, IFN-p, MCP1 y MCP5 en los macrófagos de la lámina propia (LP) estimulados se analizó por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se expresó basándose en la cuantificación relativa en que el nivel de expresión en los ratones WT se tomó como "1".
Se observó alta expresión de TNF-a e IFN-p en los macrófagos de la lámina propia de ratones deficientes del gen de CD300a estimulados con gliadina, P31-43, no solamente en los ratones b6 deficientes del gen de CD300a (fig. 51), sino también en los ratones Balb/c deficientes del gen de CD300a con la microbiota reducida (fig. 52).
[Ejemplo 8T] (fig. 53)
Se investigó la frecuencia de células que expresan fosfatidilserina en macrófagos de la lámina propia (LP) aislados. Los macrófagos de la lámina propia (LP) de ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a se tiñeron o no se tiñeron con anexina V, y se sometieron a detección de macrófagos de la lámina propia (LP) que expresan fosfatidilserina en la población seleccionada para CD45+PI'CD11b+CD11clow. La anexina V posibilita la detección de cambios en la distribución de fosfatidilserina en la membrana celular debido a apoptosis.
Los autores de la presente invención demostraron que CD300a (MAIR-I) es un receptor novedoso para fosfatidilserina (PS), y regula la reacción inflamatoria contra bacterias. Los macrófagos de la lámina propia aislados contenían células anexina V+ en menos de un 10 % (fig. 53).
[Ejemplo 8U] (fig. 54)
Se prepararon macrófagos 0 en células de exudado peritoneal inducidas por tioglicolato (PEC) a partir de ratones WT, y se aislaron macrófagos de la lámina propia (LP) de ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a.
Se investigó la expresión de las subunidades de integrina av y p3 y receptores de fosfatidilserina en los macrófagos de la lámina propia (LP) de ratones WT y ratones deficientes del gen de CD300a.
[Ejemplo 8V] (fig. 55)
Los niveles de expresión de los genes de integrina avp3 y receptores de fosfatidilserina (TIM-1, TIM-4, estabilina-2, SR-PSOX, BAI1 y MER) en estos macrófagos se analizaron por RT-PCR cuantitativa. El nivel de expresión de cada gen se expresó basándose en la cuantificación relativa en que el nivel de expresión en los macrófagos en células de exudado peritoneal inducidas por tioglicolato de ratones WT se tomó como "1".
Los macrófagos de la lámina propia y los macrófagos en células de exudado peritoneal inducidas por tioglicolato (PEC) no mostraron expresión de Tim-1 (fig. 54).
Tim-4, estabilina-2, SR-PSOX, BAI1 y Mar, que se conocen como receptores de PS, tampoco mostraron diferencias significativas entre los macrófagos de la lámina propia de ratones WT y los macrófagos de la lámina propia de ratones deficientes del gen de CD300a (fig. 54, fig. 55).
[Documentos]
1. K. Yotsumoto et al., J Exp Med 198, 223 (21 de julio de 2003).

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un modulador de la actividad para su uso en el tratamiento o la profilaxis de una enfermedad alérgica o una enfermedad autoinmunitaria, en el que dicho modulador de la actividad es un anticuerpo neutralizante contra CD300a que inhibe la unión de CD300a a fosfatidilserina y suprime la transducción de señales inhibidoras de una célula mieloide que expresa CD300a.
2. El modulador de la actividad para el uso de la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo neutralizante contra CD300a es:
a) un anticuerpo antiCD300a humano que comprende:
i) una región variable de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1.2, 34 o 5 aminoácidos; y
ii) una región variable de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1.2, 34 o 5 aminoácidos; o
b) un anticuerpo antiCD300a de ratón que comprende:
i) una región variable de cadena H que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1.2, 34 o 5 aminoácidos; y
ii) una región variable de cadena L que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos excepto que se sustituye, añade, inserta y/o elimina 1.2, 34 o 5 aminoácidos.
3. El modulador de la actividad para el uso de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es enfermedad inflamatoria del intestino.
4. El modulador de la actividad para el uso de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que dicha enfermedad alérgica es dermatitis atópica.
5. El modulador de la actividad para el uso de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el dicha enfermedad alérgica es asma.
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